最終糖化産物生成抑制剤
新たな最終糖化産物生成抑制剤、及びその利用方法を提供する。本発明によって、ピリドキサール５’−リン酸を有効成分とした薬剤が提供される。また、ピリドキサール５’−リン酸を用いた最終糖化産物生成抑制方法、硬化性腹膜炎の治療方法、及び腹膜透析方法などが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は最終糖化産物生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特にグルコースなどの還元糖が反応して褐色色素を生成する反応をメイラード反応という。メイラード反応の最終産物として生成する物質を最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＧＥ」ともいう）という。メイラード反応は、アミノ基とグルコースが非酵素的に反応しシッフ塩基を形成し、ついでアマドリ転位を起こす早期反応、さらに３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのジカルボニル基を有する活性中間体を生成する中期反応、活性中間体がさらにアミノ基と非酵素的に反応し、脱水、縮合反応を繰り返してＡＧＥ形成する後期反応からなる。
ＡＧＥとしてはイミダゾロン（非特許文献１）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）（非特許文献２）、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、メチルグリオキサールリシンダイマー、グリオキサールリシンダイマーなどが同定されている。イミダゾロンは３−ＤＧがアルギニンと反応して生成する（非特許文献１）。
ＡＧＥが発症、進展に関与している病態としては、加齢、糖尿病（腎症、神経症、網膜症、動脈硬化）、腎不全（硬化性腹膜炎、透析アミロイドーシス、動脈硬化）、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどがある（非特許文献１〜５）。
ＡＧＥ生成抑制剤としては、アミノグアニジン、ＯＰＢ−９１９５などがあるが、その副作用のために臨床応用は困難である。最近、ピリドキサミンがＡＧＥの一種であるＣＭＬをトラップするＡＧＥ抑制剤であることが報告された（非特許文献６）。
【０００３】
ＡＧＥの関与が知られている病態の一つに硬化性腹膜炎がある。腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者は、５年を過ぎた長期になると腹膜機能が低下し、腹膜が硬化（繊維化）し被嚢性硬化性腹膜炎のため死亡する例がある。このため早めに腹膜透析を中止して血液透析に移行せざるをえないのが現状である。現在我が国では、腹膜透析患者は約９，０００人おり血液透析患者の約２３万人に比較してその割合は約４％と極めて少ない。腹膜透析の致死的な合併症である被嚢性硬化性腹膜炎を予防することができれば腹膜透析はもっと普及すると思われる。
腹膜硬化症（硬化性腹膜炎）の予防のために、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのグルコース分解産物（ＧＤＰ）が少なく、中性ｐＨの腹膜透析液の開発がなされた。これはＧＤＰによる最終糖化産物（ＡＧＥ）の腹膜への沈着を減少させること、さらに中性液により腹膜に対する刺激を低下させることにより腹膜硬化の発生を予防しようというものである。ＧＤＰは腹膜透析液中に高濃度に存在するグルコースから、滅菌のための加熱処理により生成する（非特許文献７、８）。上記の腹膜透析液では、滅菌処理を加熱ではなくろ過によって行なうことによりＧＤＰの生成を抑制している（非特許文献９、１０）。
腹膜硬化症患者の腹膜には、３−ＤＧ由来のイミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β１、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の沈着とともに繊維化、肥厚、血管数の増加が認められている（非特許文献１１、１２）。繊維化が強い腹膜部位には肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の沈着は認められていない（非特許文献１２）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｉｗａ Ｔ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，Ｉｓｈｉｚａｋｉ Ｙ，Ｈａｙａｓｅ Ｆ，Ｔａｔｅｍｉｃｈｉ Ｎ，Ｔａｋｅｉ Ｙ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｉｎ ｋｉｄｎｅｙｓ ａｎｄ ａｏｒｔａｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９９：１２７２−１２８０，１９９７
【非特許文献２】Ｎｉｗａ Ｔ，Ｓａｔｏ Ｍ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ａｍｙｌｏｉｄ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，５０：１３０３−１３０９，１９９６
【非特許文献３】Ｖｌａｓｓａｒａ Ｈ，Ｂｕｃａｌａ Ｒ，Ｓｔｒｉｋｅｒ Ｌ．：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１３８−１５１，１９９４
【非特許文献４】Ｆｒａｎｋｅ Ｓ，Ｎｉｗａ Ｔ，Ｄｅｕｔｈｅｒ−Ｃｏｎｒａｄ Ｗ，Ｓｏｍｍｅｒ Ｍ，Ｈｅｉｎ Ｇ，Ｓｔｅｉｎ Ｇ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ ｉｎ ｕｒｅｍｉａ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．３００：２９−４１，２０００
【非特許文献５】Ｒｅｄｄｙ ＶＰ，Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃｈ ＭＥ，Ａｔｗｏｏｄ ＣＳ，Ｐｅｒｒｙ Ｇ，Ｓｍｉｔｈ ＭＡ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｉｌｌａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘ Ｒｅｓ．４：１９１−２０９，２００２
【非特許文献６】Ｏｎｏｒａｔｏ ＪＭ，Ｊｅｎｋｉｎｓ ＡＪ，Ｔｈｏｒｐｅ ＳＲ，Ｂａｙｎｅｓ ＪＷ：Ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ，ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ａｌｓｏ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｉｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：２１１７７−２１１８４，２０００
【非特許文献７】Ｋｊｅｌｌｓｔｒａｎｄ Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ Ｅ，Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ Ａ，Ｈｏｌｍｑｕｉｓｔ Ｂ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｘｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄｓ ｆｏｒ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １５：２６−３２，１９９５
【非特許文献８】Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ，Ｐｏｓｔｈｕｍａ Ｎ，ｔｅｎ Ｂｒｉｎｋ ＨＪ，ｔｅｒ Ｗｅｅ ＰＭ，Ｔｅｅｒｌｉｎｋ Ｔ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，２−ｄｉｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ−ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ？ｂａｓｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９：３２５−３３３，１９９９
【非特許文献９】Ｔａｕｅｒ Ａ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｓｃｈａｕｂ ＴＰ，Ｚｉｍｍｅｃｋ Ｔ，Ｎｉｗａ Ｔ，Ｐａｓｓｌｉｃｋ−Ｄｅｅｔｊｅｎ Ｊ，Ｐｉｓｃｈｅｔｓｒｉｅｄｅｒ Ｍ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ＣＡＰＤ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ４１（Ｓ１）：Ｓ５７−Ｓ６０，２００３
【非特許文献１０】Ｔａｕｅｒ Ａ，Ｋｎｅｒｒ Ｔ，Ｎｉｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８０：１４０８−１４１４，２００１
【非特許文献１１】Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，Ｈｉｒａｓａｗａ Ｙ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ ｏｆ ＣＡＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ａ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ３８（Ｓ１）：Ｓ１０７−Ｓ１１０，２００１
【非特許文献１２】Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｔａｃｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｔｏｂｉｔａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｓ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，Ｈｉｒａｓａｗａ Ｙ，Ｗｅｉｇｌｅ Ｂ，Ｐｉｓｃｈｅｔｓｒｉｅｄｅｒ Ｍ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＡＰＤ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ４１（Ｓ１）：Ｓ６１−Ｓ６７，２００３
【非特許文献１３】Ｈｏｎｄａ Ｋ，Ｎｉｔｔａ Ｋ，Ｈｏｒｉｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １４：１５４１−１５４９，１９９９
【非特許文献１４】Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ，Ｋｏｌｂ Ｍ，Ｇａｌｔ Ｔ，Ｈｏｆｆ ＣＭ，Ｓｈｏｃｋｌｅｙ ＴＲ，Ｇａｕｌｄｉｅ Ｊ：Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１ ｔｏ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １２：２０２９−２０３９，２００１
【非特許文献１５】Ｉｎａｇｉ Ｒ，Ｍｉｙａｔａ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃｅｌｌｓ：Ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４６３：２６０−２６４，１９９９
【非特許文献１６】Ｈｉｐｐｅｎｓｔｉｅｌ Ｓ，Ｋｒｕｌｌ Ｍ，Ｉｋｅｍａｎｎ Ａ，Ｒｉｓａｕ Ｗ，Ｃｌａｕｓｓ Ｍ，Ｓｕｔｔｏｒｐ Ｎ：ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４：Ｌ６７８−Ｌ６８４，１９９８
【非特許文献１７】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：Ｒｅｎｏｔｒｏｐｉｃｒｏｌｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５９：２０２３−２０３８，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
新たな最終糖化産物生成抑制剤（ＡＧＥ生成抑制剤）、及びその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新たなＡＧＥ生成抑制剤を探索するために、ＡＧＥ生成の中間体の代表である３−ＤＧをトラップする化合物をスクリーニングした。その結果、ピリドキサール５’−リン酸に濃度依存的な３−ＤＧトラップ作用が認められた。更に検討したところ、ピリドキサール５’−リン酸が、３−ＤＧからＡＧＥの一つであるイミダゾロンの生成を効果的に抑制することが明らかとなった。即ち、ピリドキサール５’−リン酸がＡＧＥ抑制作用を有することが見出された。一方、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用は、ＡＧＥ生成抑制剤として知られるピリドキサミンに比較して強く、ピリドキサール５’−リン酸が優れたＡＧＥ生成抑制剤であることが判明した。
以上の知見を得た後、ピリドキサール５’−リン酸の作用について更に検討を行なった。上でも述べたが、腹膜硬化（硬化性腹膜炎）の発症にＡＧＥが重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１１〜１３）。ＡＧＥが原因となって腹膜機能が低下する経路を図１１に示す。まず、腹膜に沈着したＡＧＥが、繊維芽細胞やマクロファージ細胞表面にあるＲＡＧＥなどのＡＧＥ受容体と結合し、これらの細胞を活性化しＴＧＦ−β１を生成する。ＴＧＦ−β１は繊維芽細胞によるコラーゲンＩ及びＩＩＩ、ＴＩＭＰ−１の産生を亢進させる（非特許文献１４）。その結果、腹膜の繊維化および腹膜中皮の肥厚を来し、腹膜の限外濾過能の低下をもたらす。またＡＧＥは腹膜中皮細胞表面にあるＲＡＧＥなどのＡＧＥ受容体と結合し、ＶＥＧＦを生成する。ＶＥＧＦは血管増生と血管透過性を亢進させ、タンパク質などの大分子物質を漏出し、その結果、腹膜の濾過機能の低下をもたらす（非特許文献１５、１６）。ＨＧＦはＴＧＦ−β１の作用と拮抗し繊維化を抑制する作用がある（非特許文献１７）。ＴＧＦ−β１はＨＧＦの発現を減少させる。このようにＡＧＥは、腹膜の機能低下に関わるキー分子であり、その生成を抑制できれば腹膜機能の低下を未然に防止できる。ここで、上記のように、ピリドキサール５’−リン酸が良好なＡＧＥ抑制作用を有することが見出されている。したがって、ピリドキサール５’−リン酸を使用すればＡＧＥの生成を効果的に抑制でき、その結果として腹膜機能の低下を防止できるものと予想された。かかる予想の下にピリドキサール５’−リン酸の作用を検証したところ、ピリドキサール５’−リン酸が１）ＡＧＥの生成を効果的に抑制すること、２）繊維化を促進するＴＧＦ−β１の発現を抑制するとともに、繊維化を抑制するＨＧＦの発現を促進すること、及び３）血管増殖を促進するＶＥＧＦの発現を抑制して血管数の増加を抑制することが確認された。即ち、ピリドキサール５’−リン酸の抗腹膜硬化作用が確認された。ここで、現行の腹膜透析液においてはＧＤＰとして３−ＤＧが最も高濃度に存在しており、一方で腹膜透析排液中にはイミダゾロンが高濃度で検出されている。これに対して、本発明者らの行なった試験（後述の実施例）によって、イミダゾロンの生成をピリドキサール５’−リン酸が効果的に抑制することが確認された。つまり、腹膜透析において最も大量に生成されるＡＧＥの生成をピリドキサール５’−リン酸が効果的に抑制することが実証された。このことは、腹膜透析の際にピリドキサール５’−リン酸を用いることが、腹膜透析に伴う腹膜機能の低下を防止する上で極めて有効な手段になることを意味する。
【０００７】
以上のように、本発明者らの検討の結果、ピリドキサール５’−リン酸の有するＡＧＥ生成抑制作用が明らかとなり、さらに腹膜機能の低下（特に腹膜硬化）に対してピリドキサール５’−リン酸が極めて有効であることが判明した。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであって以下の構成を提供する。
［１］ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む最終糖化産物生成抑制剤。
［２］ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む抗腹膜硬化剤。
［３］ピリドキサール５’−リン酸を成分の一つとして含む腹膜透析液。
［４］ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む最終糖化産物生成抑制方法。
［５］治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法。
［６］腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む腹膜透析方法。
［７］前記ステップが、以下のａ〜ｃの少なくとも一つ以上の時期に実施される、［６］に記載の腹膜透析方法、
ａ：透析処置の前、
ｂ：透析処置中、
ｃ：透析処理後。
［８］最終糖化産物生成抑制剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
［９］抗腹膜硬化剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は新規のＡＧＥ生成抑制剤及び抗腹膜硬化剤を提供する。本発明の薬剤のＡＧＥ生成抑制作用は、ＡＧＥ生成抑制剤として知られているピリドキサミンのそれよりも高く、少ない用量で高い効果が得られる。また、本発明の薬剤の有効成分はビタミンＢ６リン酸エステル化合物であることから安全性が高く、副作用の恐れの少ない薬剤となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ピリドキサール５’−リン酸（以下、「ＰＬＰ」と略称する）と３−ＤＧをインキュベートした後、３−ＤＧ濃度をＧＣ／ＭＳで測定した結果のグラフである。ＰＬＰによって３−ＤＧがトラップされることが示される。
【図２】図２は、ピリドキサミンと３−ＤＧをインキュベートした後、３−ＤＧ濃度をＧＣ／ＭＳで測定した結果のグラフである。ピリドキサミンの３−ＤＧトラップ作用の程度が示される。
【図３】図３は、３−ＤＧ、ＢＳＡ、及びＰＬＰをインキュベートして生成するイミダゾロンをＥＩＡで測定した結果のグラフである。ＰＬＰが濃度依存的にイミダゾロンの生成を抑制することがわかる。
【図４】図４は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の腹膜厚を測定した結果のグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって腹膜肥厚の増加が抑制されることがわかる。
【図５】図５は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のイミダゾロン陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってイミダゾロン陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図６】図６は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＣＭＬ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＣＭＬ陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図７】図７は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の１型コラーゲン陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって１型コラーゲン陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図８】図８は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＴＧＦ−β１陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＴＧＦ−β１陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図９】図９は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＨＧＦ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＨＧＦ容積面積が増加することがわかる。
【図１０】図１０は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＶＥＧＦ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＶＥＧＦ陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図１１】図１１は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の血管数を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって腹膜血管数の増加が抑制されることがわかる。
【図１２】図１２は、ＡＧＥ生成から腹膜機能低下に至る経路を表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ピリドキサール５’−リン酸（以下、「ＰＬＰ」と略称する）を有効成分として含む薬剤に関する。本発明の薬剤はＡＧＥ生成抑制剤として、又は抗腹膜硬化剤として使用される。本発明における「抗腹膜硬化剤」とは、腹膜硬化を予防するために使用される薬剤、又は腹膜硬化の症状の悪化を阻止若しくは症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤のことをいう。したがって本発明の抗腹膜硬化剤には、腹膜硬化の予防的処置に使用可能な薬剤、及び腹膜硬化（例えば被嚢性硬化性腹膜炎）の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
後述の実施例に示されるように、ピリドキサール５’−リン酸にＡＧＥ生成抑制作用が見出された。ここで、図１１に説明されるようにＡＧＥはＴＧＦ−β１の産生を促し、またこれが原因となってコラーゲンＩ及びＩＩＩの増加及びＴＩＭＰ−１レベルの上昇が生ずる。一方でＡＧＥはＶＥＧＦレベルの上昇を引き起こす。これらの事実は、ＡＧＥ生成抑制作用を有するピリドキサール５’−リン酸を、ＴＧＦ−β１の産生抑制や、コラーゲンＩ又はＩＩＩの増加抑制、ＴＩＭＰ−１レベルの上昇抑制、及びＶＥＧＦレベルの上昇抑制を目的として使用することができることを示唆する。したがって、ピリドキサール５’−リン酸を有効成分とした薬剤を、ＴＧＦ−β１の増加、コラーゲンＩ又はＩＩＩの増加、ＴＩＭＰレベルの上昇、及び／又はＶＥＧＦレベルの上昇を原因とする疾病の予防又は治療にも使用できると予想される。
また、ＡＧＥはＶＥＧＦレベルの上昇を介して血管増生及び血管透過性の亢進を引き起こすことから（図１１）、ピリドキサール５’−リン酸を血管増生又は血管透過性の亢進を抑制する目的に使用することができるといえ、したがってピリドキサール５’−リン酸を有効成分とした薬剤は、血管増生又は血管透過性の亢進を原因とする疾病の予防又は治療にも使用され得ると考えられる。
【００１１】
ここに、本発明の薬剤に使用されるピリドキサール５’−リン酸は以下の化学式で表される。
【化１】
【００１２】
本発明の薬剤においてピリドキサール５’−リン酸は他の化合物と結合した状態で存在していてもよい。また、薬学的に許容可能な塩の形態として存在していてもよい。ここでの他の化合物としてはペプチドやタンパク質を例示することができる。一方、ここでの薬学的に許容可能な塩とは例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩（無機酸塩）や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩（有機酸塩）である。
【００１３】
一般に、ある化合物の一部に修飾を施して得られる化合物が修飾前の化合物と同様の性質や特性を有する場合がある。即ち、修飾が化合物の特定の性質等に影響を及ぼさない場合がある。このことを考慮すれば、ピリドキサール５’−リン酸に修飾を施して得られる修飾体であっても、ＡＧＥ生成抑制作用を維持する限りにおいて、本発明における有効成分として使用され得る。当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いてピリドキサール５’−リン酸を基本とした置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易と考えられる。
【００１４】
ピリドキサール５’−リン酸の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００１５】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分（ピリドキサール５’−リン酸）が含有される。薬剤中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約１μｇ重量％〜約１ｇ重量％とする。
【００１６】
本発明の適用対象が腹膜硬化の予防である場合には、ピリドキサール５’−リン酸を腹膜透析液の成分として使用することもできる。このように、本発明は他の態様としてピリドキサール５’−リン酸を含有する腹膜透析液を提供する。ピリドキサール５’−リン酸を含有する腹膜透析液はその適用（透析への使用）時において腹膜硬化予防作用を奏することとなる。したがって、このような腹膜透析液を利用すれば腹膜硬化症の発生の恐れが少ない透析処置が実現される。
現行の腹膜透析液は一般に、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、乳酸、ブドウ糖などをその成分として含む。本発明の腹膜透析液は、このような各種の成分に加えてピリドキサール５’−リン酸を用いることによって調製することができる。また、市販の腹膜透析液にピリドキサール５’−リン酸を所定量添加して本発明の腹膜透析液を調製することもできる。この場合のピリドキサール５’−リン酸の添加は、腹膜透析液の使用直前に行われてもよい。
腹膜透析液中のピリドキサール５’−リン酸の量は例えば４０ｎＭ（ｍｏｌ／ｌ）〜４０ｍＭ（ｍｏｌ／ｌ）である。
【００１７】
本発明の他の局面では、ピリドキサール５’−リン酸を利用した最終糖化産物生成抑制方法（ＡＧＥ生成抑制方法）が提供される。本発明のＡＧＥ生成抑制方法では、ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップが実施される。ピリドキサール５’−リン酸は単独で或いは他の物質とともに投与される。典型的には、上記の本発明の薬剤の形態で投与される。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。ピリドキサール５’−リン酸の投与量は、期待される作用（ＡＧＥ生成抑制作用）が得られるように設定される。期待される作用が十分に得られるとともに、ピリドキサール５’−リン酸の投与による副作用がないか又は治療上問題とならない程度となるようにピリドキサール５’−リン酸の投与量を設定することが好ましい。投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む薬剤を使用する場合には、成人（体重約６０ｋｇ）を対象として一日当たりの有効成分量が約１０μｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約６０ｍｇとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
本発明のＡＧＥ生成抑制方法による予防又は治療の対象となる疾病ないし病態は、ＡＧＥがその発症や進展などに関与しているものであれば特に限定されない。例えば、加齢、糖尿病、腎症、神経症、網膜症、動脈硬化、腎不全、硬化性腹膜炎、透析アミロイドーシス、動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどが対象となる。中でも硬化性腹膜炎の予防ないし治療に対して本発明の方法は有効であり、本発明はその具体的一態様として以下の各方法、即ち、治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップを含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法、及び腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップを含む腹膜透析方法を提供する。ここでの「治療上有効量」及び「腹膜硬化の予防上有効量」は、患者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
【００１８】
ここに腹膜透析とは、透析液を腹腔内に注入し、一定期間の貯留によって腹膜を介して老廃物や水分等が移行した透析液を体外に取り出すという血液浄化処置である。腹膜透析の方式としては連続携行式腹膜透析（ＣＡＰＤ）及び自動腹膜透析（ＡＰＤ）が知られている。これらいずれの方法にも本発明の腹膜透析方法を適用できる。
【００１９】
本発明の腹膜透析方法における、ピリドキサール５’−リン酸の投与時期は特に限定されないが、例えば、透析処置の前に投与を行なう。透析処置は一般に複数回行なわれるが、この場合には一つ以上の透析処置の前にピリドキサール５’−リン酸の投与が実施されることとなる。
透析処置の前にピリドキサール５’−リン酸を投与する場合、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用を効果的に発揮させるために、投与後できるだけ時間を置かずに透析処置を実施することが好ましい。かかる観点から、透析処理の直前にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施することが好ましい。
一方、ピリドキサール５’−リン酸の投与を透析処置中に実施してもよい。即ち、透析処置に並行してピリドキサール５’−リン酸の投与を行なってもよい。例えば透析液中にピリドキサール５’−リン酸を含有させることとすれば、透析操作を何ら複雑化することなくこのような投与方法を実行することができ、患者及び医師等の負担が少ない。勿論、透析液の注入とは別の経路によってピリドキサール５’−リン酸の投与を実施してもよい。
ピリドキサール５’−リン酸の投与を透析処理後に実施することもできる。但しこの場合には、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用を効果的に発揮させるために、透析処置を終了した後できるだけ時間を置かずにピリドキサール５’−リン酸を投与することが好ましい。かかる観点から、透析処置の直後にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施することが好ましい。
尚、透析処置の前、透析処置中、及び透析処置後のいずれか一つの時期だけでなく、これらの二つ以上の時期にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施してもよい。
【００２０】
インスリンを介さずに細胞内にブドウ糖が受動的に流入する細胞においては、グルコースをソルビトール→フルクトース→フルクトース３リン酸→３−ＤＧに代謝分解し細胞外に排出するポリオール経路がある。ポリオール経路を介して生成した３−ＤＧからもイミダゾロンなどのＡＧＥが生成する（Ｔｓｕｋｕｓｈｉ Ｓ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，Ａｏｙａｍａ Ｉ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，Ｓｈｉｍｏｋａｔａ Ｋ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ３−ＤＧ ａｎｄ ＡＧＥｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｏｌ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５５：１９７０−１９７６，１９９９）。メイラード反応のみならず、ポリオール経路により生成した３−ＤＧもＰＬＰはトラップするため、ＰＬＰはＡＧＥの生成をより強く抑制する。ポリオール経路は赤血球、網膜、レンズ神経、腎糸球体、心臓などに存在し、糖尿病で亢進している。ＰＬＰは、網膜症、神経症、腎症などの糖尿病性合併症におけるポリオール経路を介したＡＧＥの生成を抑制することによりこれらの合併症の進展抑制に効果があることが予想される。
【実施例１】
【００２１】
＜ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用＞
１．方法
１）ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）（０，５，１５ｍＭ）と３−ＤＧ（３５００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で２４時間インキュベートした後、３−ＤＧ濃度をガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）で測定した。ピリドキサミンと３−ＤＧを同様にインキュベートしてその３−ＤＧトラップ作用を比較した。
【００２２】
３−ＤＧ測定法のためのＧＣ／ＭＳは以下の方法で行った。試料溶液１ｍｌに対し内部標準物質として１３Ｃ６−３−ＤＧ２００ｎｇを加えた。エタノール２ｍｌを加えてキャップし軽く震盪した。４℃、３０００回転で１０分間遠心した。上清をネジ口ガラス管に移し、窒素気流でエタノールが残らないように溶媒を飛ばした。エタノールが飛びきって溶液が１ｍｌ以下になったら窒素を止めた。反応物質として２，３−ジアミノナフタレン１００μｇを加えた。蓋をして氷室に一晩置いた。酢酸エチル２ｍｌを加えてしっかり震盪してから静置し、上清を先細ガラス試験管にとった。これを２回行った。窒素気流で酢酸エチルを飛ばした。試験管にＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）２５μｌを入れ、７０℃、３０分でトリメチルシリル（ＴＭＳ）化した。
２μｌをキャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ，０．２５μｍ膜厚；ＳＰＢ−５０、スペルコ社製）を装着したＧＣ／ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００；島津製作所製）を用いて３−ＤＧを定量した。ＧＣはスプリットレス注入方式として、気化室温度は２８０℃、インターフェイス温度２５０℃とした。カラム温度は１００℃で１分間平衡の後、３３０℃まで１０℃／分の昇温にした。イソブタンを反応ガスとした化学イオン化を灯った。１３Ｃ６−３−ＤＧはｍ／ｚ５０７．１５イオン、３−ＤＧはｍ／ｚ５０１．１５イオンを用いた選択イオン検出（ＳＩＭ）により２１．８分に検出され、そのピーク面積比より３−ＤＧを定量した。
【００２３】
２）３−ＤＧ（５０μｇ／ｍｌ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（５０ｍｇ／ｍｌ）およびＰＬＰ（Ｐ５Ｐ）を７日間インキュベートして生成するイミダゾロンをエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）で測定した。３−ＤＧ、ＢＳＡおよびピリドキサミンをインキュベートして、イミダゾロン生成量を同様に測定した。
ＥＩＡは以下の方法に従って測定した。
９６穴蛋白吸着プレートに５０μｌずつＡＧＥ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１Ｍグルコース＋５０ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を３７℃で１カ月間インキュベートして作製、１０μｇ／ｍｌとして使用］を注ぎ、一晩放置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。０．２５％ＢＳＡ ５０μｌにてブロッキングした。標準ＡＧＥ溶液（２００，１７５，１５０，１２５，１００，７５．５０，２５，１０，３μｇ／ｍｌ）と検体２５μｌずつアプライした。ＡＧ−１（抗イミダゾロン抗体）またはＡＧ−１０（抗ＣＭＬ抗体）５０μｌをアプライし３０分間室温に放置した後、溶液を吸引、除去した。反応開始液１５ｍｌにｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）１錠（１３ｍｇ／錠）を混合した溶液１００μｌを添加し、１５分間室温に放置した。
＊反応開始液：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １０．９ｇ
Ｈ２Ｏ２ ２５５μｌ
クエン酸１水和物 １．８３ｇ
Ｈ２Ｏ ３９０ｍｌ（ｐＨ６．２）
【００２４】
反応停止液（０．８Ｍ Ｈ２ＳＯ４）１００μｌをアプライし、マイクロプレートリーダー（Ｅｘ．４９０ｎｍ，Ｅｍ．６３０ｎｍ）を用いてＡＧＥ濃度を測定した。
【００２５】
２．結果
図１に示すように、３−ＤＧとＰＬＰをインキュベートすると、ＰＬＰの濃度依存性に３−ＤＧをトラップし、３−ＤＧ濃度が低下した。ピリドキサミンの３−ＤＧトラップ作用は、同じＰＬＰ濃度に比較して弱かった（図２）。
図３に示すように、３−ＤＧとＢＳＡを７日間インキュベートすると、ＰＬＰ濃度依存性にイミダゾロンの生成を抑制した。５ｍＭ、１５ｍＭではＰＬＰのイミダゾロンの生成はピリドキサミンに比較して強く抑制された。
以上の結果より、ＰＬＰは、３−ＤＧをトラップしイミダゾロンの生成を抑制したことから、ＡＧＥ生成阻害作用を有するといえる。また、ＰＬＰのＡＧＥ生成阻害作用は、同濃度のピリドキサミンより強い。
【実施例２】
【００２６】
＜ピリドキサール５’−リン酸の抗腹膜硬化作用＞
１．方法
正常ラットを３群に分け、各群（ｎ＝７）の腹腔内に１）生理食塩液２０ｍｌ（生食水群）、２）腹膜透析液（２．５％ダイアニール）２０ｍｌ（透析液群）、３）腹膜透析液（２．５％ダイアニール）２０ｍｌ＋ＰＬＰ５０ｍｇ／日（透析液＋ＰＬＰ群）、を１日１回４週間注入した。２．５％ダイアニール（ＰＤ−２）の組成はＮａ＋：１３２ｍＥｑ／ｌ、Ｃａ２＋：３．５ｍＥｑ／ｌ、Ｍｇ２＋：０．５ｍＥｑ／ｌ、Ｃｌ−：９６ｍＥｑ／ｌ、乳酸−：４０ｍＥｑ／ｌ、ブドウ糖：２．２７％、浸透圧：３９６ｍＯｓｍ／ｌ、ｐＨ：４．５〜５．５である。
顕微鏡下（１００倍）で腹膜厚を測定した。また、イミダゾロン、ＣＭＬ、ＴＧＦ−β１、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、１型コラーゲンに対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法に従って行った。
使用抗体：（１）ウサギ抗ヒトＨＧＦ−α抗体（ポリクローナル）；
（２）マウス抗ヒトＶＥＧＦ抗体；
（３）ウサギ抗ＴＧＦ−β１抗体（ポリクローナル）；
（４）マウス抗イミダゾロン抗体（ＡＧ−１）；
（５）マウス抗Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）抗体（ＡＧ−１０）
（６）ウサギ抗ラット１型コラーゲン抗体（ポリクローナル）
【００２７】
キシレン、エタノールを用いて脱パラフィン化し、蒸留水で５分間、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で５分間、アセトンで１０分間、さらに蒸留水、ＰＢＳで洗浄した。プロテナーゼＫ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１０分間処理した。ＰＢＳで３回洗浄、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールで１０分間、ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％血清によるブロッキングを３０分間行った。各抗体を添加し４℃で一晩静置した。ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチンラベル２次抗体を添加し、３０分後、ＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加し、３７℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、ｐ−ジメチルアミノアゾベンゼン（ＤＡＢ）で発色させた。
免疫染色を行った組織を顕微鏡（×１００、ニコン社製、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｅ６００、Ｈ−ＩＩＩ−３５）で観察し、デジタルネットカメラ（ニコン社製、ＤＮ１００）で取り込み、ＮＩＨイメージ（１．６２）ソフトを用い、腹膜長さ３００μｍ当たりの陽性面積（μｍ２）で表示した。またＶＥＧＦ染色組織の顕微鏡観察により、腹膜長さ３００μｍ当たりの血管数を測定した。
【００２８】
２．結果
図４に示すように、透析液群では腹膜壁の肥厚が認められた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して腹膜肥厚の増加は抑制されていた。
図５に示すように、透析液群では腹膜におけるイミダゾロンの陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してイミダゾロンの陽性面積の増加は抑制されていた。
図６に示すように、透析液群では腹膜におけるＣＭＬ陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＣＭＬ陽性面積の増加は抑制されていた。
図７に示すように、透析液群では腹膜における１型コラーゲン陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して１型コラーゲン陽性面積の増加は抑制されていた。
図８に示すように、透析液群では腹膜におけるＴＧＦ−β１陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＴＧＦ−β１陽性面積の増加は抑制されていた。
図９に示すように、透析液＋ＰＬＰ群では、生食水群、透析液群に比較して腹膜におけるＨＧＦ陽性面積が増加していた。
図１０に示すように、透析液群では腹膜におけるＶＥＧＦ陽性面積の増加傾向を示した。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＶＥＧＦ陽性面積の増加は抑制されていた。
図１１に示すように、透析液群では腹膜における血管数の増加が認められた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して腹膜血管数の増加が抑制されていた。
【００２９】
以上の結果をまとめると以下の通りとなる。
１）ＰＬＰは腹膜肥厚の増加を抑制した。
２）ＰＬＰはイミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ生成を抑制した。
３）ＰＬＰは、１型コラーゲンなど腹膜の繊維化を抑制した。
４）ＰＬＰは、繊維化を促進するＴＧＦ−β１の発現を抑制し、繊維化を抑制するＨＧＦの発現を促進した。
５）ＰＬＰは、血管増殖を促進するＶＥＧＦの発現を抑制し、腹膜血管数の増加を抑制した。
６）ＰＬＰは腹膜硬化抑制作用を示した。
【００３０】
以上のように、透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して、イミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ沈着の減少、ＴＧＦ−β１及びＶＥＧＦ発現の減少、ＨＧＦ発現の増加、腹膜血管数の減少、腹膜繊維化及び腹膜肥厚の抑制が認められた。ＰＬＰは３−ＤＧをトラップしイミダゾロンの産生を抑制した。またＰＬＰはＣＭＬの産生も抑制した。その結果、ＴＧＦ−β１発現を減少させ、ＨＧＦ発現を増加させることにより、腹膜繊維化および腹膜肥厚を抑制した。またＶＥＧＦ発現を減少させ腹膜血管数の増加を抑制した。これらの実験事実より、ＰＬＰは腹膜硬化症（硬化性腹膜炎）の発症および進行を抑制し予防する作用を有するといえる。
【００３１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の薬剤は、ＡＧＥが発症、進展に関与している様々な疾病ないし病態の予防ないし治療に利用され得る。本発明の薬剤は特に、腹膜透析に伴い発症することが問題とされている硬化性腹膜炎の予防ないし治療に利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は最終糖化産物生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特にグルコースなどの還元糖が反応して褐色色素を生成する反応をメイラード反応という。メイラード反応の最終産物として生成する物質を最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＧＥ」ともいう）という。メイラード反応は、アミノ基とグルコースが非酵素的に反応しシッフ塩基を形成し、ついでアマドリ転位を起こす早期反応、さらに３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのジカルボニル基を有する活性中間体を生成する中期反応、活性中間体がさらにアミノ基と非酵素的に反応し、脱水、縮合反応を繰り返してＡＧＥ形成する後期反応からなる。
ＡＧＥとしてはイミダゾロン（非特許文献１）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）（非特許文献２）、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、メチルグリオキサールリシンダイマー、グリオキサールリシンダイマーなどが同定されている。イミダゾロンは３−ＤＧがアルギニンと反応して生成する（非特許文献１）。
ＡＧＥが発症、進展に関与している病態としては、加齢、糖尿病（腎症、神経症、網膜症、動脈硬化）、腎不全（硬化性腹膜炎、透析アミロイドーシス、動脈硬化）、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどがある（非特許文献１〜５）。
ＡＧＥ生成抑制剤としては、アミノグアニジン、ＯＰＢ−９１９５などがあるが、その副作用のために臨床応用は困難である。最近、ピリドキサミンがＡＧＥの一種であるＣＭＬをトラップするＡＧＥ抑制剤であることが報告された（非特許文献６）。
【０００３】
ＡＧＥの関与が知られている病態の一つに硬化性腹膜炎がある。腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者は、５年を過ぎた長期になると腹膜機能が低下し、腹膜が硬化（繊維化）し被嚢性硬化性腹膜炎のため死亡する例がある。このため早めに腹膜透析を中止して血液透析に移行せざるをえないのが現状である。現在我が国では、腹膜透析患者は約９，０００人おり血液透析患者の約２３万人に比較してその割合は約４％と極めて少ない。腹膜透析の致死的な合併症である被嚢性硬化性腹膜炎を予防することができれば腹膜透析はもっと普及すると思われる。
腹膜硬化症（硬化性腹膜炎）の予防のために、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのグルコース分解産物（ＧＤＰ）が少なく、中性ｐＨの腹膜透析液の開発がなされた。これはＧＤＰによる最終糖化産物（ＡＧＥ）の腹膜への沈着を減少させること、さらに中性液により腹膜に対する刺激を低下させることにより腹膜硬化の発生を予防しようというものである。ＧＤＰは腹膜透析液中に高濃度に存在するグルコースから、滅菌のための加熱処理により生成する（非特許文献７、８）。上記の腹膜透析液では、滅菌処理を加熱ではなくろ過によって行なうことによりＧＤＰの生成を抑制している（非特許文献９、１０）。
腹膜硬化症患者の腹膜には、３−ＤＧ由来のイミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β１、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の沈着とともに繊維化、肥厚、血管数の増加が認められている（非特許文献１１、１２）。繊維化が強い腹膜部位には肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の沈着は認められていない（非特許文献１２）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｉｗａ Ｔ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，Ｉｓｈｉｚａｋｉ Ｙ，Ｈａｙａｓｅ Ｆ，Ｔａｔｅｍｉｃｈｉ Ｎ，Ｔａｋｅｉ Ｙ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｉｎ ｋｉｄｎｅｙｓ ａｎｄ ａｏｒｔａｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９９：１２７２−１２８０，１９９７
【非特許文献２】Ｎｉｗａ Ｔ，Ｓａｔｏ Ｍ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ａｍｙｌｏｉｄ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，５０：１３０３−１３０９，１９９６
【非特許文献３】Ｖｌａｓｓａｒａ Ｈ，Ｂｕｃａｌａ Ｒ，Ｓｔｒｉｋｅｒ Ｌ．：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１３８−１５１，１９９４
【非特許文献４】Ｆｒａｎｋｅ Ｓ，Ｎｉｗａ Ｔ，Ｄｅｕｔｈｅｒ−Ｃｏｎｒａｄ Ｗ，Ｓｏｍｍｅｒ Ｍ，Ｈｅｉｎ Ｇ，Ｓｔｅｉｎ Ｇ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ ｉｎ ｕｒｅｍｉａ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．３００：２９−４１，２０００
【非特許文献５】Ｒｅｄｄｙ ＶＰ，Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃｈ ＭＥ，Ａｔｗｏｏｄ ＣＳ，Ｐｅｒｒｙ Ｇ，Ｓｍｉｔｈ ＭＡ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｉｌｌａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘ Ｒｅｓ．４：１９１−２０９，２００２
【非特許文献６】Ｏｎｏｒａｔｏ ＪＭ，Ｊｅｎｋｉｎｓ ＡＪ，Ｔｈｏｒｐｅ ＳＲ，Ｂａｙｎｅｓ ＪＷ：Ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ，ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ａｌｓｏ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｉｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：２１１７７−２１１８４，２０００
【非特許文献７】Ｋｊｅｌｌｓｔｒａｎｄ Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ Ｅ，Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ Ａ，Ｈｏｌｍｑｕｉｓｔ Ｂ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｘｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄｓ ｆｏｒ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １５：２６−３２，１９９５
【非特許文献８】Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ，Ｐｏｓｔｈｕｍａ Ｎ，ｔｅｎ Ｂｒｉｎｋ ＨＪ，ｔｅｒ Ｗｅｅ ＰＭ，Ｔｅｅｒｌｉｎｋ Ｔ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，２−ｄｉｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｔ−ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ？ｂａｓｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９：３２５−３３３，１９９９
【非特許文献９】Ｔａｕｅｒ Ａ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｓｃｈａｕｂ ＴＰ，Ｚｉｍｍｅｃｋ Ｔ，Ｎｉｗａ Ｔ，Ｐａｓｓｌｉｃｋ−Ｄｅｅｔｊｅｎ Ｊ，Ｐｉｓｃｈｅｔｓｒｉｅｄｅｒ Ｍ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ＣＡＰＤ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ４１（Ｓ１）：Ｓ５７−Ｓ６０，２００３
【非特許文献１０】Ｔａｕｅｒ Ａ，Ｋｎｅｒｒ Ｔ，Ｎｉｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８０：１４０８−１４１４，２００１
【非特許文献１１】Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，Ｈｉｒａｓａｗａ Ｙ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ ｏｆ ＣＡＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ａ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ３８（Ｓ１）：Ｓ１０７−Ｓ１１０，２００１
【非特許文献１２】Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｔａｃｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｔｏｂｉｔａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｓ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，Ｈｉｒａｓａｗａ Ｙ，Ｗｅｉｇｌｅ Ｂ，Ｐｉｓｃｈｅｔｓｒｉｅｄｅｒ Ｍ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＡＰＤ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ４１（Ｓ１）：Ｓ６１−Ｓ６７，２００３
【非特許文献１３】Ｈｏｎｄａ Ｋ，Ｎｉｔｔａ Ｋ，Ｈｏｒｉｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １４：１５４１−１５４９，１９９９
【非特許文献１４】Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ，Ｋｏｌｂ Ｍ，Ｇａｌｔ Ｔ，Ｈｏｆｆ ＣＭ，Ｓｈｏｃｋｌｅｙ ＴＲ，Ｇａｕｌｄｉｅ Ｊ：Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１ ｔｏ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １２：２０２９−２０３９，２００１
【非特許文献１５】Ｉｎａｇｉ Ｒ，Ｍｉｙａｔａ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ：Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃｅｌｌｓ：Ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４６３：２６０−２６４，１９９９
【非特許文献１６】Ｈｉｐｐｅｎｓｔｉｅｌ Ｓ，Ｋｒｕｌｌ Ｍ，Ｉｋｅｍａｎｎ Ａ，Ｒｉｓａｕ Ｗ，Ｃｌａｕｓｓ Ｍ，Ｓｕｔｔｏｒｐ Ｎ：ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４：Ｌ６７８−Ｌ６８４，１９９８
【非特許文献１７】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：Ｒｅｎｏｔｒｏｐｉｃｒｏｌｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５９：２０２３−２０３８，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
新たな最終糖化産物生成抑制剤（ＡＧＥ生成抑制剤）、及びその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新たなＡＧＥ生成抑制剤を探索するために、ＡＧＥ生成の中間体の代表である３−ＤＧをトラップする化合物をスクリーニングした。その結果、ピリドキサール５’−リン酸に濃度依存的な３−ＤＧトラップ作用が認められた。更に検討したところ、ピリドキサール５’−リン酸が、３−ＤＧからＡＧＥの一つであるイミダゾロンの生成を効果的に抑制することが明らかとなった。即ち、ピリドキサール５’−リン酸がＡＧＥ抑制作用を有することが見出された。一方、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用は、ＡＧＥ生成抑制剤として知られるピリドキサミンに比較して強く、ピリドキサール５’−リン酸が優れたＡＧＥ生成抑制剤であることが判明した。
以上の知見を得た後、ピリドキサール５’−リン酸の作用について更に検討を行なった。上でも述べたが、腹膜硬化（硬化性腹膜炎）の発症にＡＧＥが重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１１〜１３）。ＡＧＥが原因となって腹膜機能が低下する経路を図１１に示す。まず、腹膜に沈着したＡＧＥが、繊維芽細胞やマクロファージ細胞表面にあるＲＡＧＥなどのＡＧＥ受容体と結合し、これらの細胞を活性化しＴＧＦ−β１を生成する。ＴＧＦ−β１は繊維芽細胞によるコラーゲンＩ及びＩＩＩ、ＴＩＭＰ−１の産生を亢進させる（非特許文献１４）。その結果、腹膜の繊維化および腹膜中皮の肥厚を来し、腹膜の限外濾過能の低下をもたらす。またＡＧＥは腹膜中皮細胞表面にあるＲＡＧＥなどのＡＧＥ受容体と結合し、ＶＥＧＦを生成する。ＶＥＧＦは血管増生と血管透過性を亢進させ、タンパク質などの大分子物質を漏出し、その結果、腹膜の濾過機能の低下をもたらす（非特許文献１５、１６）。ＨＧＦはＴＧＦ−β１の作用と拮抗し繊維化を抑制する作用がある（非特許文献１７）。ＴＧＦ−β１はＨＧＦの発現を減少させる。このようにＡＧＥは、腹膜の機能低下に関わるキー分子であり、その生成を抑制できれば腹膜機能の低下を未然に防止できる。ここで、上記のように、ピリドキサール５’−リン酸が良好なＡＧＥ抑制作用を有することが見出されている。したがって、ピリドキサール５’−リン酸を使用すればＡＧＥの生成を効果的に抑制でき、その結果として腹膜機能の低下を防止できるものと予想された。かかる予想の下にピリドキサール５’−リン酸の作用を検証したところ、ピリドキサール５’−リン酸が１）ＡＧＥの生成を効果的に抑制すること、２）繊維化を促進するＴＧＦ−β１の発現を抑制するとともに、繊維化を抑制するＨＧＦの発現を促進すること、及び３）血管増殖を促進するＶＥＧＦの発現を抑制して血管数の増加を抑制することが確認された。即ち、ピリドキサール５’−リン酸の抗腹膜硬化作用が確認された。ここで、現行の腹膜透析液においてはＧＤＰとして３−ＤＧが最も高濃度に存在しており、一方で腹膜透析排液中にはイミダゾロンが高濃度で検出されている。これに対して、本発明者らの行なった試験（後述の実施例）によって、イミダゾロンの生成をピリドキサール５’−リン酸が効果的に抑制することが確認された。つまり、腹膜透析において最も大量に生成されるＡＧＥの生成をピリドキサール５’−リン酸が効果的に抑制することが実証された。このことは、腹膜透析の際にピリドキサール５’−リン酸を用いることが、腹膜透析に伴う腹膜機能の低下を防止する上で極めて有効な手段になることを意味する。
【０００７】
以上のように、本発明者らの検討の結果、ピリドキサール５’−リン酸の有するＡＧＥ生成抑制作用が明らかとなり、さらに腹膜機能の低下（特に腹膜硬化）に対してピリドキサール５’−リン酸が極めて有効であることが判明した。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであって以下の構成を提供する。
［１］ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む最終糖化産物生成抑制剤。
［２］ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む抗腹膜硬化剤。
［３］ピリドキサール５’−リン酸を成分の一つとして含む腹膜透析液。
［４］ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む最終糖化産物生成抑制方法。
［５］治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法。
［６］腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む腹膜透析方法。
［７］前記ステップが、以下のａ〜ｃの少なくとも一つ以上の時期に実施される、［６］に記載の腹膜透析方法、
ａ：透析処置の前、
ｂ：透析処置中、
ｃ：透析処理後。
［８］最終糖化産物生成抑制剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
［９］抗腹膜硬化剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は新規のＡＧＥ生成抑制剤及び抗腹膜硬化剤を提供する。本発明の薬剤のＡＧＥ生成抑制作用は、ＡＧＥ生成抑制剤として知られているピリドキサミンのそれよりも高く、少ない用量で高い効果が得られる。また、本発明の薬剤の有効成分はビタミンＢ６リン酸エステル化合物であることから安全性が高く、副作用の恐れの少ない薬剤となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ピリドキサール５’−リン酸（以下、「ＰＬＰ」と略称する）と３−ＤＧをインキュベートした後、３−ＤＧ濃度をＧＣ／ＭＳで測定した結果のグラフである。ＰＬＰによって３−ＤＧがトラップされることが示される。
【図２】図２は、ピリドキサミンと３−ＤＧをインキュベートした後、３−ＤＧ濃度をＧＣ／ＭＳで測定した結果のグラフである。ピリドキサミンの３−ＤＧトラップ作用の程度が示される。
【図３】図３は、３−ＤＧ、ＢＳＡ、及びＰＬＰをインキュベートして生成するイミダゾロンをＥＩＡで測定した結果のグラフである。ＰＬＰが濃度依存的にイミダゾロンの生成を抑制することがわかる。
【図４】図４は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の腹膜厚を測定した結果のグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって腹膜肥厚の増加が抑制されることがわかる。
【図５】図５は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のイミダゾロン陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってイミダゾロン陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図６】図６は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＣＭＬ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＣＭＬ陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図７】図７は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の１型コラーゲン陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって１型コラーゲン陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図８】図８は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＴＧＦ−β１陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＴＧＦ−β１陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図９】図９は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＨＧＦ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＨＧＦ容積面積が増加することがわかる。
【図１０】図１０は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群のＶＥＧＦ陽性面積を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによってＶＥＧＦ陽性面積の増加が抑制されることがわかる。
【図１１】図１１は、ラットを用いた腹膜透析試験において、各試験群の血管数を比較したグラフである。腹膜透析液にＰＬＰを添加することによって腹膜血管数の増加が抑制されることがわかる。
【図１２】図１２は、ＡＧＥ生成から腹膜機能低下に至る経路を表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ピリドキサール５’−リン酸（以下、「ＰＬＰ」と略称する）を有効成分として含む薬剤に関する。本発明の薬剤はＡＧＥ生成抑制剤として、又は抗腹膜硬化剤として使用される。本発明における「抗腹膜硬化剤」とは、腹膜硬化を予防するために使用される薬剤、又は腹膜硬化の症状の悪化を阻止若しくは症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤のことをいう。したがって本発明の抗腹膜硬化剤には、腹膜硬化の予防的処置に使用可能な薬剤、及び腹膜硬化（例えば被嚢性硬化性腹膜炎）の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
後述の実施例に示されるように、ピリドキサール５’−リン酸にＡＧＥ生成抑制作用が見出された。ここで、図１１に説明されるようにＡＧＥはＴＧＦ−β１の産生を促し、またこれが原因となってコラーゲンＩ及びＩＩＩの増加及びＴＩＭＰ−１レベルの上昇が生ずる。一方でＡＧＥはＶＥＧＦレベルの上昇を引き起こす。これらの事実は、ＡＧＥ生成抑制作用を有するピリドキサール５’−リン酸を、ＴＧＦ−β１の産生抑制や、コラーゲンＩ又はＩＩＩの増加抑制、ＴＩＭＰ−１レベルの上昇抑制、及びＶＥＧＦレベルの上昇抑制を目的として使用することができることを示唆する。したがって、ピリドキサール５’−リン酸を有効成分とした薬剤を、ＴＧＦ−β１の増加、コラーゲンＩ又はＩＩＩの増加、ＴＩＭＰレベルの上昇、及び／又はＶＥＧＦレベルの上昇を原因とする疾病の予防又は治療にも使用できると予想される。
また、ＡＧＥはＶＥＧＦレベルの上昇を介して血管増生及び血管透過性の亢進を引き起こすことから（図１１）、ピリドキサール５’−リン酸を血管増生又は血管透過性の亢進を抑制する目的に使用することができるといえ、したがってピリドキサール５’−リン酸を有効成分とした薬剤は、血管増生又は血管透過性の亢進を原因とする疾病の予防又は治療にも使用され得ると考えられる。
【００１１】
ここに、本発明の薬剤に使用されるピリドキサール５’−リン酸は以下の化学式で表される。
【化１】
【００１２】
本発明の薬剤においてピリドキサール５’−リン酸は他の化合物と結合した状態で存在していてもよい。また、薬学的に許容可能な塩の形態として存在していてもよい。ここでの他の化合物としてはペプチドやタンパク質を例示することができる。一方、ここでの薬学的に許容可能な塩とは例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩（無機酸塩）や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩（有機酸塩）である。
【００１３】
一般に、ある化合物の一部に修飾を施して得られる化合物が修飾前の化合物と同様の性質や特性を有する場合がある。即ち、修飾が化合物の特定の性質等に影響を及ぼさない場合がある。このことを考慮すれば、ピリドキサール５’−リン酸に修飾を施して得られる修飾体であっても、ＡＧＥ生成抑制作用を維持する限りにおいて、本発明における有効成分として使用され得る。当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いてピリドキサール５’−リン酸を基本とした置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易と考えられる。
【００１４】
ピリドキサール５’−リン酸の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００１５】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分（ピリドキサール５’−リン酸）が含有される。薬剤中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約１μｇ重量％〜約１ｇ重量％とする。
【００１６】
本発明の適用対象が腹膜硬化の予防である場合には、ピリドキサール５’−リン酸を腹膜透析液の成分として使用することもできる。このように、本発明は他の態様としてピリドキサール５’−リン酸を含有する腹膜透析液を提供する。ピリドキサール５’−リン酸を含有する腹膜透析液はその適用（透析への使用）時において腹膜硬化予防作用を奏することとなる。したがって、このような腹膜透析液を利用すれば腹膜硬化症の発生の恐れが少ない透析処置が実現される。
現行の腹膜透析液は一般に、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、乳酸、ブドウ糖などをその成分として含む。本発明の腹膜透析液は、このような各種の成分に加えてピリドキサール５’−リン酸を用いることによって調製することができる。また、市販の腹膜透析液にピリドキサール５’−リン酸を所定量添加して本発明の腹膜透析液を調製することもできる。この場合のピリドキサール５’−リン酸の添加は、腹膜透析液の使用直前に行われてもよい。
腹膜透析液中のピリドキサール５’−リン酸の量は例えば４０ｎＭ（ｍｏｌ／ｌ）〜４０ｍＭ（ｍｏｌ／ｌ）である。
【００１７】
本発明の他の局面では、ピリドキサール５’−リン酸を利用した最終糖化産物生成抑制方法（ＡＧＥ生成抑制方法）が提供される。本発明のＡＧＥ生成抑制方法では、ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップが実施される。ピリドキサール５’−リン酸は単独で或いは他の物質とともに投与される。典型的には、上記の本発明の薬剤の形態で投与される。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。ピリドキサール５’−リン酸の投与量は、期待される作用（ＡＧＥ生成抑制作用）が得られるように設定される。期待される作用が十分に得られるとともに、ピリドキサール５’−リン酸の投与による副作用がないか又は治療上問題とならない程度となるようにピリドキサール５’−リン酸の投与量を設定することが好ましい。投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む薬剤を使用する場合には、成人（体重約６０ｋｇ）を対象として一日当たりの有効成分量が約１０μｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約６０ｍｇとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
本発明のＡＧＥ生成抑制方法による予防又は治療の対象となる疾病ないし病態は、ＡＧＥがその発症や進展などに関与しているものであれば特に限定されない。例えば、加齢、糖尿病、腎症、神経症、網膜症、動脈硬化、腎不全、硬化性腹膜炎、透析アミロイドーシス、動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどが対象となる。中でも硬化性腹膜炎の予防ないし治療に対して本発明の方法は有効であり、本発明はその具体的一態様として以下の各方法、即ち、治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップを含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法、及び腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップを含む腹膜透析方法を提供する。ここでの「治療上有効量」及び「腹膜硬化の予防上有効量」は、患者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
【００１８】
ここに腹膜透析とは、透析液を腹腔内に注入し、一定期間の貯留によって腹膜を介して老廃物や水分等が移行した透析液を体外に取り出すという血液浄化処置である。腹膜透析の方式としては連続携行式腹膜透析（ＣＡＰＤ）及び自動腹膜透析（ＡＰＤ）が知られている。これらいずれの方法にも本発明の腹膜透析方法を適用できる。
【００１９】
本発明の腹膜透析方法における、ピリドキサール５’−リン酸の投与時期は特に限定されないが、例えば、透析処置の前に投与を行なう。透析処置は一般に複数回行なわれるが、この場合には一つ以上の透析処置の前にピリドキサール５’−リン酸の投与が実施されることとなる。
透析処置の前にピリドキサール５’−リン酸を投与する場合、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用を効果的に発揮させるために、投与後できるだけ時間を置かずに透析処置を実施することが好ましい。かかる観点から、透析処理の直前にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施することが好ましい。
一方、ピリドキサール５’−リン酸の投与を透析処置中に実施してもよい。即ち、透析処置に並行してピリドキサール５’−リン酸の投与を行なってもよい。例えば透析液中にピリドキサール５’−リン酸を含有させることとすれば、透析操作を何ら複雑化することなくこのような投与方法を実行することができ、患者及び医師等の負担が少ない。勿論、透析液の注入とは別の経路によってピリドキサール５’−リン酸の投与を実施してもよい。
ピリドキサール５’−リン酸の投与を透析処理後に実施することもできる。但しこの場合には、ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用を効果的に発揮させるために、透析処置を終了した後できるだけ時間を置かずにピリドキサール５’−リン酸を投与することが好ましい。かかる観点から、透析処置の直後にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施することが好ましい。
尚、透析処置の前、透析処置中、及び透析処置後のいずれか一つの時期だけでなく、これらの二つ以上の時期にピリドキサール５’−リン酸の投与を実施してもよい。
【００２０】
インスリンを介さずに細胞内にブドウ糖が受動的に流入する細胞においては、グルコースをソルビトール→フルクトース→フルクトース３リン酸→３−ＤＧに代謝分解し細胞外に排出するポリオール経路がある。ポリオール経路を介して生成した３−ＤＧからもイミダゾロンなどのＡＧＥが生成する（Ｔｓｕｋｕｓｈｉ Ｓ，Ｋａｔｓｕｚａｋｉ Ｔ，Ａｏｙａｍａ Ｉ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，Ｓｈｉｍｏｋａｔａ Ｋ，Ｎｉｗａ Ｔ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ３−ＤＧ ａｎｄ ＡＧＥｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｏｌ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５５：１９７０−１９７６，１９９９）。メイラード反応のみならず、ポリオール経路により生成した３−ＤＧもＰＬＰはトラップするため、ＰＬＰはＡＧＥの生成をより強く抑制する。ポリオール経路は赤血球、網膜、レンズ神経、腎糸球体、心臓などに存在し、糖尿病で亢進している。ＰＬＰは、網膜症、神経症、腎症などの糖尿病性合併症におけるポリオール経路を介したＡＧＥの生成を抑制することによりこれらの合併症の進展抑制に効果があることが予想される。
【実施例１】
【００２１】
＜ピリドキサール５’−リン酸のＡＧＥ生成抑制作用＞
１．方法
１）ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）（０，５，１５ｍＭ）と３−ＤＧ（３５００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で２４時間インキュベートした後、３−ＤＧ濃度をガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）で測定した。ピリドキサミンと３−ＤＧを同様にインキュベートしてその３−ＤＧトラップ作用を比較した。
【００２２】
３−ＤＧ測定法のためのＧＣ／ＭＳは以下の方法で行った。試料溶液１ｍｌに対し内部標準物質として１３Ｃ６−３−ＤＧ２００ｎｇを加えた。エタノール２ｍｌを加えてキャップし軽く震盪した。４℃、３０００回転で１０分間遠心した。上清をネジ口ガラス管に移し、窒素気流でエタノールが残らないように溶媒を飛ばした。エタノールが飛びきって溶液が１ｍｌ以下になったら窒素を止めた。反応物質として２，３−ジアミノナフタレン１００μｇを加えた。蓋をして氷室に一晩置いた。酢酸エチル２ｍｌを加えてしっかり震盪してから静置し、上清を先細ガラス試験管にとった。これを２回行った。窒素気流で酢酸エチルを飛ばした。試験管にＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）２５μｌを入れ、７０℃、３０分でトリメチルシリル（ＴＭＳ）化した。
２μｌをキャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ，０．２５μｍ膜厚；ＳＰＢ−５０、スペルコ社製）を装着したＧＣ／ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００；島津製作所製）を用いて３−ＤＧを定量した。ＧＣはスプリットレス注入方式として、気化室温度は２８０℃、インターフェイス温度２５０℃とした。カラム温度は１００℃で１分間平衡の後、３３０℃まで１０℃／分の昇温にした。イソブタンを反応ガスとした化学イオン化を灯った。１３Ｃ６−３−ＤＧはｍ／ｚ５０７．１５イオン、３−ＤＧはｍ／ｚ５０１．１５イオンを用いた選択イオン検出（ＳＩＭ）により２１．８分に検出され、そのピーク面積比より３−ＤＧを定量した。
【００２３】
２）３−ＤＧ（５０μｇ／ｍｌ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（５０ｍｇ／ｍｌ）およびＰＬＰ（Ｐ５Ｐ）を７日間インキュベートして生成するイミダゾロンをエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）で測定した。３−ＤＧ、ＢＳＡおよびピリドキサミンをインキュベートして、イミダゾロン生成量を同様に測定した。
ＥＩＡは以下の方法に従って測定した。
９６穴蛋白吸着プレートに５０μｌずつＡＧＥ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１Ｍグルコース＋５０ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を３７℃で１カ月間インキュベートして作製、１０μｇ／ｍｌとして使用］を注ぎ、一晩放置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。０．２５％ＢＳＡ ５０μｌにてブロッキングした。標準ＡＧＥ溶液（２００，１７５，１５０，１２５，１００，７５．５０，２５，１０，３μｇ／ｍｌ）と検体２５μｌずつアプライした。ＡＧ−１（抗イミダゾロン抗体）またはＡＧ−１０（抗ＣＭＬ抗体）５０μｌをアプライし３０分間室温に放置した後、溶液を吸引、除去した。反応開始液１５ｍｌにｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）１錠（１３ｍｇ／錠）を混合した溶液１００μｌを添加し、１５分間室温に放置した。
＊反応開始液：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １０．９ｇ
Ｈ２Ｏ２ ２５５μｌ
クエン酸１水和物 １．８３ｇ
Ｈ２Ｏ ３９０ｍｌ（ｐＨ６．２）
【００２４】
反応停止液（０．８Ｍ Ｈ２ＳＯ４）１００μｌをアプライし、マイクロプレートリーダー（Ｅｘ．４９０ｎｍ，Ｅｍ．６３０ｎｍ）を用いてＡＧＥ濃度を測定した。
【００２５】
２．結果
図１に示すように、３−ＤＧとＰＬＰをインキュベートすると、ＰＬＰの濃度依存性に３−ＤＧをトラップし、３−ＤＧ濃度が低下した。ピリドキサミンの３−ＤＧトラップ作用は、同じＰＬＰ濃度に比較して弱かった（図２）。
図３に示すように、３−ＤＧとＢＳＡを７日間インキュベートすると、ＰＬＰ濃度依存性にイミダゾロンの生成を抑制した。５ｍＭ、１５ｍＭではＰＬＰのイミダゾロンの生成はピリドキサミンに比較して強く抑制された。
以上の結果より、ＰＬＰは、３−ＤＧをトラップしイミダゾロンの生成を抑制したことから、ＡＧＥ生成阻害作用を有するといえる。また、ＰＬＰのＡＧＥ生成阻害作用は、同濃度のピリドキサミンより強い。
【実施例２】
【００２６】
＜ピリドキサール５’−リン酸の抗腹膜硬化作用＞
１．方法
正常ラットを３群に分け、各群（ｎ＝７）の腹腔内に１）生理食塩液２０ｍｌ（生食水群）、２）腹膜透析液（２．５％ダイアニール）２０ｍｌ（透析液群）、３）腹膜透析液（２．５％ダイアニール）２０ｍｌ＋ＰＬＰ５０ｍｇ／日（透析液＋ＰＬＰ群）、を１日１回４週間注入した。２．５％ダイアニール（ＰＤ−２）の組成はＮａ＋：１３２ｍＥｑ／ｌ、Ｃａ２＋：３．５ｍＥｑ／ｌ、Ｍｇ２＋：０．５ｍＥｑ／ｌ、Ｃｌ−：９６ｍＥｑ／ｌ、乳酸−：４０ｍＥｑ／ｌ、ブドウ糖：２．２７％、浸透圧：３９６ｍＯｓｍ／ｌ、ｐＨ：４．５〜５．５である。
顕微鏡下（１００倍）で腹膜厚を測定した。また、イミダゾロン、ＣＭＬ、ＴＧＦ−β１、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、１型コラーゲンに対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法に従って行った。
使用抗体：（１）ウサギ抗ヒトＨＧＦ−α抗体（ポリクローナル）；
（２）マウス抗ヒトＶＥＧＦ抗体；
（３）ウサギ抗ＴＧＦ−β１抗体（ポリクローナル）；
（４）マウス抗イミダゾロン抗体（ＡＧ−１）；
（５）マウス抗Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）抗体（ＡＧ−１０）
（６）ウサギ抗ラット１型コラーゲン抗体（ポリクローナル）
【００２７】
キシレン、エタノールを用いて脱パラフィン化し、蒸留水で５分間、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で５分間、アセトンで１０分間、さらに蒸留水、ＰＢＳで洗浄した。プロテナーゼＫ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１０分間処理した。ＰＢＳで３回洗浄、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールで１０分間、ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％血清によるブロッキングを３０分間行った。各抗体を添加し４℃で一晩静置した。ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチンラベル２次抗体を添加し、３０分後、ＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加し、３７℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、ｐ−ジメチルアミノアゾベンゼン（ＤＡＢ）で発色させた。
免疫染色を行った組織を顕微鏡（×１００、ニコン社製、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｅ６００、Ｈ−ＩＩＩ−３５）で観察し、デジタルネットカメラ（ニコン社製、ＤＮ１００）で取り込み、ＮＩＨイメージ（１．６２）ソフトを用い、腹膜長さ３００μｍ当たりの陽性面積（μｍ２）で表示した。またＶＥＧＦ染色組織の顕微鏡観察により、腹膜長さ３００μｍ当たりの血管数を測定した。
【００２８】
２．結果
図４に示すように、透析液群では腹膜壁の肥厚が認められた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して腹膜肥厚の増加は抑制されていた。
図５に示すように、透析液群では腹膜におけるイミダゾロンの陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してイミダゾロンの陽性面積の増加は抑制されていた。
図６に示すように、透析液群では腹膜におけるＣＭＬ陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＣＭＬ陽性面積の増加は抑制されていた。
図７に示すように、透析液群では腹膜における１型コラーゲン陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して１型コラーゲン陽性面積の増加は抑制されていた。
図８に示すように、透析液群では腹膜におけるＴＧＦ−β１陽性面積が増加していた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＴＧＦ−β１陽性面積の増加は抑制されていた。
図９に示すように、透析液＋ＰＬＰ群では、生食水群、透析液群に比較して腹膜におけるＨＧＦ陽性面積が増加していた。
図１０に示すように、透析液群では腹膜におけるＶＥＧＦ陽性面積の増加傾向を示した。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較してＶＥＧＦ陽性面積の増加は抑制されていた。
図１１に示すように、透析液群では腹膜における血管数の増加が認められた。透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して腹膜血管数の増加が抑制されていた。
【００２９】
以上の結果をまとめると以下の通りとなる。
１）ＰＬＰは腹膜肥厚の増加を抑制した。
２）ＰＬＰはイミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ生成を抑制した。
３）ＰＬＰは、１型コラーゲンなど腹膜の繊維化を抑制した。
４）ＰＬＰは、繊維化を促進するＴＧＦ−β１の発現を抑制し、繊維化を抑制するＨＧＦの発現を促進した。
５）ＰＬＰは、血管増殖を促進するＶＥＧＦの発現を抑制し、腹膜血管数の増加を抑制した。
６）ＰＬＰは腹膜硬化抑制作用を示した。
【００３０】
以上のように、透析液＋ＰＬＰ群では、透析液群に比較して、イミダゾロン、ＣＭＬなどのＡＧＥ沈着の減少、ＴＧＦ−β１及びＶＥＧＦ発現の減少、ＨＧＦ発現の増加、腹膜血管数の減少、腹膜繊維化及び腹膜肥厚の抑制が認められた。ＰＬＰは３−ＤＧをトラップしイミダゾロンの産生を抑制した。またＰＬＰはＣＭＬの産生も抑制した。その結果、ＴＧＦ−β１発現を減少させ、ＨＧＦ発現を増加させることにより、腹膜繊維化および腹膜肥厚を抑制した。またＶＥＧＦ発現を減少させ腹膜血管数の増加を抑制した。これらの実験事実より、ＰＬＰは腹膜硬化症（硬化性腹膜炎）の発症および進行を抑制し予防する作用を有するといえる。
【００３１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の薬剤は、ＡＧＥが発症、進展に関与している様々な疾病ないし病態の予防ないし治療に利用され得る。本発明の薬剤は特に、腹膜透析に伴い発症することが問題とされている硬化性腹膜炎の予防ないし治療に利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む最終糖化産物生成抑制剤。
【請求項２】
ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む抗腹膜硬化剤。
【請求項３】
ピリドキサール５’−リン酸を成分の一つとして含む腹膜透析液。
【請求項４】
ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む最終糖化産物生成抑制方法。
【請求項５】
治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法。
【請求項６】
腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む腹膜透析方法。
【請求項７】
前記ステップが、以下のａ〜ｃの少なくとも一つ以上の時期に実施される、請求項６に記載の腹膜透析方法、
ａ：透析処置の前、
ｂ：透析処置中、
ｃ：透析処理後。
【請求項８】
最終糖化産物生成抑制剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【請求項９】
抗腹膜硬化剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【請求項１】
ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む最終糖化産物生成抑制剤。
【請求項２】
ピリドキサール５’−リン酸を有効成分として含む抗腹膜硬化剤。
【請求項３】
ピリドキサール５’−リン酸を成分の一つとして含む腹膜透析液。
【請求項４】
ピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む最終糖化産物生成抑制方法。
【請求項５】
治療上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む硬化性腹膜炎の予防又は治療方法。
【請求項６】
腹膜硬化の予防上有効量のピリドキサール５’−リン酸を患者に投与するステップ、を含む腹膜透析方法。
【請求項７】
前記ステップが、以下のａ〜ｃの少なくとも一つ以上の時期に実施される、請求項６に記載の腹膜透析方法、
ａ：透析処置の前、
ｂ：透析処置中、
ｃ：透析処理後。
【請求項８】
最終糖化産物生成抑制剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【請求項９】
抗腹膜硬化剤を製造するための、ピリドキサール５’−リン酸の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１８６４９
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３３０５（Ｐ２００５−５１３３０５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９９１
【国際出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【出願人】（８０５００００１８）財団法人名古屋産業科学研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９９１
【国際出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【出願人】（８０５００００１８）財団法人名古屋産業科学研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
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