最適化されたアドへシンフラグメントおよび対応するナノ粒子
本発明は、最適化されたアドヘシンおよびこのアドヘシンが結合されたナノ粒子に関する。本発明はさらに、このナノ粒子を、インビボ造影剤として、特に、腸の癌の診断のために提供することに関する。ＣＲＣ細胞に対して高い親和性を有するアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメント（「アドヘシン構築物」）を提供することもまた本発明の目的である。この目的は、それぞれの野生型アドヘシンアミノ酸配列、好ましくは、ＤｒａＥ野生型配列と比較して、変異によって改変されたアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメントを提供することによって、達成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化されたアドヘシンおよび上記アドヘシンが結合したナノ粒子に関する。本発明はさらに、上記ナノ粒子を、インビボ造影剤として、特に、腸の癌の診断のために提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患について、可能な限り早期でかつ有意義な診断は、必要な医療手段を選択し、そして調整して行うために、決定的に重要である。これは、特に、その決定および治療のために健康な組織と発癌組織との間を識別することが必須である多くの種類（あり得る部分を含む）の腫瘍に当てはまる。よって、患者の回復もしくはさらには生存は、処置および／もしくは手術を担当している医師が、異なるタイプの組織を区別し得るか否かもしくは区別し得る程度に決定的に依存する。
【０００３】
診断および医療の手段を改善するために、過去に造影剤が開発されてきた。画像化剤は、画像化プロセスによって、身体における可視の機能および構造を作製するのを補助し得る。これらプロセスは、特に、癌関連の細胞変化を特異的に検出するために使用される。
【０００４】
特許文献１のＡ３は、例えば、少なくとも３つの構造（すなわち、不動態化層でコーティングされている無機コアであって、さらに上記不動態化層が特異的リガンドを有する、無機コア）を含む蛍光性ナノ粒子を開示する。これらリガンドは、上記ナノ粒子が標的に特異的に結合することを可能にする。上記標的は、特に、標的細胞の特異的表面分子（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。
【０００５】
この印刷された刊行物によって開示される、コアおよび周囲の不動態化層を有する上記ナノ粒子は、好ましくは、５ｎｍと１５ｎｍとの間である小さな流体力学的直径を有する。このサイズのナノ粒子は、腎臓を介して排出（ａｕｓｇｅｓｃｈｉｅｄｅｎ）され得、従って、身体に蓄積しないか、または多くても、許容可能な量においてしか、身体に蓄積しない。これは、ナノ粒子を医療目的に使用するための重要な要件のうちの１つである。
【０００６】
別の要件は、身体中の選択された標的構造を認識するナノ粒子に結合されるリガンドの高い選択性である。高い特異的認識のみが、造影剤の医療的使用の主目的である検出を可能にする。これら非常に特異的なリガンドは、同時に、上記ナノ粒子の良好な分布および浸透を妨げないように小さくなければならない。頻繁に使用される特異的リガンド（例えば、抗体もしくはＦａｂフラグメント）は、この要件を満たすためには、通常は大きすぎる。
【０００７】
工業国における腸癌の新たな症例数は、最近３０年間にわたって大きく上昇した。年間発生数は、１０００００名の居住者につき３０〜３５名の新たな症例であり、腸癌は、中央ヨーロッパで最も一般的な悪性腫瘍のうちの１つであり、全ての癌による死亡のうちの約１５％の原因である。世界的な発生数は、１年あたり１００万の新たな症例と見積もられる。男性は、女性よりわずかに多く罹患しており、特に、直腸癌腫においてそうである（性別比 ６０：４０）。
【０００８】
ドイツにおいては、腸癌は、新たな症例ならびに男性および女性における癌による死亡の両方で、２番目に多い一般的な癌の形態であり、２００５年には、２００００名を超える人々が死亡した。「Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｄｅｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅｎ Ｋｒｅｂｓｒｅｇｉｓｔｅｒ ［Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｓｔｅｒｓ］」は、１年あたりほぼ３００００名の死亡者がいるとすら想定している。
【０００９】
腸癌とは、腸の任意の悪性腫瘍をいう。それらは、腸粘膜の平滑筋および／もしくは結合組織に由来する、類癌腫（特に、虫垂および小腸における）、平滑筋肉腫および消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅ Ｓｔｒｏｍａｔｕｍｏｒｅｎ）（ＧＩＳＴ）であり得る。しかし、これら疾患はかなり稀であり、全ての腸癌症例のうちのわずかな割合に相当するに過ぎない。全ての腸癌症例の断然最大の部分（９５％を超える）は、盲腸、結腸もしくは直腸の腺癌によって代表され、これに関して、包括的な用語結腸直腸癌もまた、使用される。
【００１０】
腸癌（特に、結腸直腸癌腫）は、最初は極めて稀にしか症状を引き起こさず、そしてほぼ常に、最初は良性の腸ポリープから発症する。平均して４０〜６０％の５年生存率で、手術およびその後の化学療法によって治癒する可能性は、上記腸癌が診断される病期に決定的に依存する。従って、予防的措置および同様に早期の診断は、特に重要である。後者は、腸癌細胞（特に、ＣＲＣ（結腸直腸癌細胞））の早期検出によって可能である。
【００１１】
ＣＲＣの検出は、上記細胞に特異的な標的であって、可能であれば、上記腫瘍中で過剰発現される標的を必要とする。ＣＥＡＣＡＭファミリー（ＣＥＡ関連細胞接着分子；ＣＥＡ＝癌胎児性抗原）のメンバーは、ＣＲＣ細胞において上方調節された発現を有すると報告されている。従って、ＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーは、ＣＲＣ検出のための標的として特に適している。それらとしては、特に、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）およびＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６）が挙げられる。
【００１２】
上記ＣＥＡＣＡＭファミリーは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。各ファミリーメンバーは、高度にグリコシル化されており、かつＮ末端Ｉｇ可変様ドメインからなり、その下流に、最大６個のＩｇＣ２ドメインが存在する。ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ４は、細胞膜中のカルボキシ末端膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを介して挿入されるのに対して、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８は、膜上のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介してアンカーされる（ｖｅｒａｎｋｅｒｔ）。この群内のＮ末端ドメインは、アミノ酸レベルにおいて９０％より高い類似性を有する。
【００１３】
ＣＥＡおよびＮＣＡは、結腸組織中の円柱上皮および杯細胞に存在する。それらは、成熟腸細胞の先端表面に位置し、それはグリコカリックス／微絨毛領域に存在する。ＣＥＡＣＡＭは、細胞間接着分子として作用する。正常結腸上皮細胞における、ＣＥＡＣＡＭのこの厳密に先端での局在は、腺癌細胞において見捨てられてきた（従って、上記タンパク質は、細胞表面全体で発現される）。細胞組織化および細胞極性は、ＣＲＣ細胞において破壊され、従って、例えば、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡは、細胞表面全体に位置して見いだされ得る。ＣＥＡは放出され得、それによって、血流に入り、従って、血清腫瘍マーカーとして検出され得る。
【００１４】
これらレセプターについて報告されたリガンドは、とりわけ、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌のＤｒファミリーのアドヘシン（Ａｆａ／Ｄｒアドヘシン、ＤｒＣＥＡサブファミリー）である。これらアドヘシンは、拡散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）株の（線毛中の部分的に組織化された）細菌表面に位置し、そしてその上皮細胞への接着を媒介する。このファミリーのメンバーは、例えば、ＡｆａＥ−Ｉ、ＡｆａＥ−ＩＩＩ、ＡｆａＥ−Ｖ、ＤｒａＥおよびＤａａＥである。
【００１５】
Ａｆａ／Ｄｒ アドヘシンをコードする構造的アセンブリ遺伝子は、類似の構成を有する。これらは、少なくとも５つの遺伝子（Ａ〜Ｅ）を含むオペロンからなる。ここで遺伝子Ａ〜Ｄはアクセサリ遺伝子をコードし、遺伝子Ｄはインベイジン（Ｉｎｖａｓｉｎ）をコードする。遺伝子Ｅは、実際のアドヘシンをコードする。
【００１６】
上記遺伝子クラスターは、高度に保存された領域を有し（例えば、遺伝子ａｆａＡ、ａｆａＢ、ａｆａＣ、ａｆａＤおよびａｆａＦ）、これは、例えば、調節機能もしくはシャペロン機能を有する。上記構造的ＡｆａＥコード遺伝子は、非常に不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ）であり、抗原的に異なるアドヘシンが生成される。
【００１７】
アドヘシンのＡｆａ／Ｄｒファミリーのこれらのメンバーを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌は、ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞に接着する（非特許文献１）。さらに、アドヘシンはまた、非特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５７１８２号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｒら，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｂｙ Ａｆａ／Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ａｆａ／Ｄｒ ＤＡＥＣ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００４）５２（４），ｐｐ．９６３−９８３
【非特許文献２】Ａｌａｉｎ Ｌ．Ｓｅｒｖｉｎ「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｆａ／Ｄｒ Ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ Ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００５年４月）１８（２），ｐｐ．２６４−２９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかし、これら公知のアドヘシンは、それらのＣＥＡ親和性に関して、なお不十分である。従って、ＣＲＣ細胞に対して高い親和性を有するアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメント（「アドヘシン構築物」）を提供することが、本発明の目的である。この目的に関して、それらは、可能であれば、公知の野生型アドヘシンを超える改善されたＣＥＡ親和性を有するべきである。
【００２１】
さらに、造影剤を提供するために利用され得るナノ粒子にリガンドとして結合されるのに適したアドヘシンおよび／もしくはアドヘシンフラグメントを提供することは、本発明の目的である。上記ナノ粒子は、好ましくは、医学的に、特に好ましくは、インビボ造影剤として使用可能であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この目的は、それぞれの野生型アドヘシンアミノ酸配列、好ましくは、ＤｒａＥ野生型配列と比較して、変異によって改変されたアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメントを提供することによって、達成される。上記改変は、有利なことには、上記ＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバー（特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡ）に対する、本発明のアドヘシンの改善された親和性を生じる。本発明のアドヘシンおよびアドヘシンフラグメントはまた、本明細書中以下で、「改変された」もしくは「最適化された」アドヘシンとして包括的に言及される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤｒａＥの配列番号１。
【図２】ＡｆａＥ−５、ＤｒｂＥ−１２２、ＤｒａＥ、ＳＭ２５４、ＤａａＥ；ＡｆａＥ−２、ＡｆａＥ−１およびＮｆａＥ−１１１のアラインメント。
【図３】配列番号２。
【図４】Ｇ２１５２、ＳＭ２９７、ＪＪＢ３０、ＳＭ４３７、ＳＭ２４９、ＳＭ２４６、ＳＭ２４５、ＳＭ５４、Ｇ２１７１、Ｇ２１６６、Ｇ２１０６、Ｇ２１０２、Ｇ２０９７、Ｇ２０９６、ＤｒａＥ、Ｇ２０９９、Ｇ２１００、ＳＭ２５２、ＪＪＢ１７、ＳＭ２９３、Ｇ２０７６、ＳＭ５１３、ＡＦａＥ−ＩＩＩのアラインメント。
【図５】配列番号３。
【図６】配列番号４。
【図７】配列番号５。
【図８】ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ ５）、ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ ６）、ＣＥＡＣＡＭ １、ＣＥＡＣＡＭ ３、ＣＥＡＣＡＭ ４、ＣＥＡＣＡＭ ７およびＣＥＡＣＡＭ ８のアラインメント。
【図９】配列番号６。
【図１０】配列番号７。
【図１１】配列番号８。
【図１２】コンセンサス配列（配列番号９）。
【図１３】コンセンサス配列（配列番号１０）。
【図１４】コンセンサス配列（配列番号１１）。
【図１５】配列番号１２。
【図１６】ハイコンテントスクリーニングによる、本発明に従って使用可能なナノ粒子の、インビボ分解の分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記最適化されたアドヘシンは、以下の変異のうちの１つ以上を含む（ここでアミノ酸位置の番号付けは、ＤｒａＥ野生型アミノ酸配列に基づく；ＤｒａＥの配列番号１（図１）もまた参照のこと）。
【００２５】
【化１】
【００２６】
しかし、Ｔ８８Ｍおよび／もしくはＮ７７Ｋが存在する場合、本発明のアドヘシンは、前述の変異のうちの少なくとも１つの他のものを有さなければならない。これは特に、ＤｒａＥ群のアドヘシンに存在する変異に当てはまる。
【００２７】
好ましい変異は、Ｖ２８Ｗ；Ｖ２８Ｆ；Ａ３９Ｑ；Ａ３９Ｓ；Ｉ４１Ｌ；Ｑ４７Ｓ；Ｑ４７Ｔ；Ｉ８５Ｌ；Ｔ９５Ｌ；Ｇ１１８ＳおよびＴ１２３Ｉである。
【００２８】
本発明の目的に関して、「アドヘシン」とは、原則として、上記ＣＥＡＣＡＭファミリーのレセプター（本明細書中以降、結合タンパク質ともいう）のＮ末端ドメインに、特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合し得る任意のタンパク質をいう。これらは、「アドヘシン群」のアドヘシン、「ＤｒａＥ群」、ならびに特に、タンパク質ＤｒａＥおよびＡｆａＥ−ＩＩＩを包含する。これらはまた、上記アドヘシンに由来するコンセンサス配列を有するタンパク質を包含する。
【００２９】
本発明に従うアドヘシンは、好ましくは、１３９アミノ酸の配列、および１７ｋＤａのサイズを有する。しかし、これらはまた、ＣＥＡＣＡＭに、特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合する能力の喪失を生じない限りにおいて、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失を有し得る。上記Ｃ末端欠失は、可能であったとしても、５アミノ酸、８アミノ酸、でなければ多くても１０アミノ酸を超えるべきではない。上記Ｎ末端欠失は、最大１８アミノ酸までであり得る。しかし、任意のより短い欠失（例えば、５アミノ酸、８アミノ酸もしくは１０アミノ酸の欠失）もまた、可能である。本発明の一実施形態において、従って、上記アドヘシンは、１１１アミノ酸長である。
【００３０】
上記「アドヘシン群」は、ＡｆａＥ−５、ＤｒｂＥ−１２２、ＤｒａＥ、ＳＭ２５４、ＤａａＥ；ＡｆａＥ−２、ＡｆａＥ−１およびＮｆａＥ−１１１からなる（これに関連して、図２；アラインメントもまた参照のこと）。本発明によれば、これらは、配列番号２（図３）によるコンセンサス配列、および上記の変異のうちの１つ以上を有する。
【００３１】
同じことが、以下のタンパク質（これに関連して、図４、アラインメントもまた参照のこと）：Ｇ２１５２、ＳＭ２９７、ＪＪＢ３０、ＳＭ４３７、ＳＭ２４９、ＳＭ２４６、ＳＭ２４５、ＳＭ５４、Ｇ２１７１、Ｇ２１６６、Ｇ２１０６、Ｇ２１０２、Ｇ２０９７、Ｇ２０９６、ＤｒａＥ、Ｇ２０９９、Ｇ２１００、ＳＭ２５２、ＪＪＢ１７、ＳＭ２９３、Ｇ２０７６、ＳＭ５１３、ＡＦａＥ−ＩＩＩからなる「ＤｒａＥ群」に当てはまる。これらは、配列番号３（図５）によるコンセンサスを有する。一実施形態において、本発明は、よって、上記の変異のうちの１つ以上を有する配列番号３を有するアドヘシンに関する。
【００３２】
配列番号４（図６）によるコンセンサスを有するアドヘシンが、特に好ましい。後者は、ＤｒａＥおよびＡｆａＥ−ＩＩＩのアラインメントから得られる。特に好ましいのは、ＤｒａＥである。
【００３３】
本発明のアドヘシンは、ＣＥＡＣＡＭ群のタンパク質のＮ末端配列に結合し、これは、好ましくは、配列番号５（図７）によるコンセンサス配列である。この群のメンバーは、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ ５）、ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ ６）、ＣＥＡＣＡＭ １、ＣＥＡＣＡＭ ３、ＣＥＡＣＡＭ ４、ＣＥＡＣＡＭ ７およびＣＥＡＣＡＭ ８である（図８もまた参照のこと）。本発明のアドヘシンは、好ましくは、ＣＥＡおよびＮＣＡのアラインメントから得られる配列番号６（図９。ＣＥＡのみを含む領域に下線が付される）を有するタンパク質のＮ末端配列に結合する。一実施形態において、本発明のタンパク質は、ＣＥＡ（配列番号７、図１０）およびＮＣＡ（配列番号８、図１１）のＮ末端ドメインに結合する。
【００３４】
好ましい実施形態において、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合する、ＤｒａＥ（配列番号１）による上記改変されたアドヘシンは、上記の変異のうちの１つを有する。結論として、以下のように、配列番号９によるコンセンサス配列（アラインメント、図１２）を有するアドヘシンが好ましい：
【００３５】
【化２】
【００３６】
さらなる実施形態において、上記アドヘシン（特に、ＤｒａＥ由来のアドヘシン）は、配列番号１０によるコンセンサス配列（アラインメント、図１３を参照のこと）を有する：
【００３７】
【化３】
【００３８】
別の実施形態において、上記アドヘシン（特に、ＤｒａＥ由来のアドヘシン）は、以下のコンセンサス配列（配列番号１１、図１４）を有する：
【００３９】
【化４】
【００４０】
上記コンセンサス配列（配列番号９、配列番号１０および配列番号１１として規定される）は、配列番号１に従う番号付けに基づく。ここでまた、上記の欠失は、上記アドヘシンの、ＣＥＡＣＡＭメンバー（特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡ）への結合を不可能にしない限りにおいて、Ｎ末端および／もしくはＣ末端において存在し得る。
【００４１】
特定の実施形態において、配列番号１に従うアドヘシンであって、以下の変異（すなわち、Ｎ７７Ｋ、Ｔ８８Ｍ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１１４ＶおよびＶ１１６Ａ）を含む、アドへシン（本明細書中以下、「Ｆｕｅｎｆｆａｃｈ−Ｍｕｔａｎｔｅ」［五重変異体］、ＦＭともいう；配列番号１２、図１５）が好ましい。
【００４２】
当業者は、原則として、アドヘシンモノマーの調製に精通している。組換えタンパク質ＡｆａＥ−ＩＩＩ−ｄｓｃにおいて、例えば、Ｎ末端架橋セクションＧは、Ｃ末端へとクローニングされ、リンカーは、ＦとＧとの間に導入される。次いで、セクションＧは、上記リンカーを超えて反対側に折り返り、そして今度はＮ末端セクションＡ１に結合し、それによって、上記モノマー構造を安定化する。次いで、ＡｆａＥ−ＩＩＩ−ｄｓｃのこのモノマー構造は、ゲル濾過によって検出され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２００４からの図１Ｃを参照のこと）。
【００４３】
Ｐｉａｔｅｋら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）７３（１） ｐｐ．１３５−１４５，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｄｒ Ｆｉｍｂｒｉａｅ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤｒａＢ−ＤｒａＥ−Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」）は、モノマーアドヘシンを生成する別の可能性を記載している。彼らは、アドヘシンのＮ末端から様々な数のアミノ酸を除去し、これにより、モノマータンパク質を得ている。（Ｐｉａｔｅｋら，２００５からの図２を参照のこと）。これら公知の方法はまた、本発明に従って改変されるアドヘシンにも基本的に適用可能である。
【００４４】
改変されたアドヘシンを得るために、野生型アドヘシンが、変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチドベースの、部位特異的変異誘発（例えば、ＥＰ１７７７２９２ Ａ１））に供され得る。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明のアドヘシンは、さらなる変異誘発のためのテンプレートとして、ＤＡＦ（崩壊促進因子、ＣＤ５５）に対する減少した親和性を有するアドヘシン構築物を使用することによって調製され得る。これの例は、Ｎ７７Ｋ変異である（ｖａｎ Ｌｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４５（２），ｐｐ．４３９−４５２，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ」）。
【００４６】
上記変異誘発によって生成されるライブラリーは、その標的と一緒に酵母へと形質転換され得、そのレポーター遺伝子の読み取り値が検出され得る（これに関連して、以下の例示的実施形態もまた参照のこと）。これは、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対して改善された親和性を有する本発明のアドヘシンが同定されることを可能にする。
【００４７】
本発明のアドヘシンは、ナノ粒子に結合され得る。後者は、好ましくは、ＣＲＣ細胞を検出するためのインビボ造影剤として使用され得る。ＷＯ ２００７／０５７１８２ Ａ３は、有利なナノ粒子を開示する。その内容全体は、上記ナノ粒子の調製および使用の開示を目的として、本明細書に参考として援用される。上記ナノ粒子は、特に、その流体力学的直径が１５ｎｍを超えずかつ生物学的系において不活性でないものである。
【００４８】
本発明のナノ粒子は、少なくとも３つの構造体（すなわち、不動態化層でコーティングされている無機コアであって、さらに上記不動態化層が特異的リガンドを有する、無機コア）を含み、ここで上記特異的リガンドはまた、上記不動態化層の一部であり得る。上記リガンドは、上記生物学的な系の標的に特異的に結合するナノ粒子を生じる。
【００４９】
好ましいナノ粒子において、上記無機コア（上記無機コアを囲む上記不動態化層を含む）は、１５ｎｍ以下、可能であれば、好ましくは、１０ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。特に好ましいのは、８ｎｍ以下もしくは５ｎｍ以下の流体力学的直径である。これは、球状のナノ粒子に特に当てはまる。このサイズのナノ粒子は、腎臓を介して排出され得、従って、身体に蓄積しないか、または多くても、許容可能な量でしか蓄積しない。このことは、インビボ適用を可能にする。これは、特に、５ｎｍ以下の流体力学的直径を有するナノ粒子に当てはまる。
【００５０】
代替の実施形態において、上記ナノ粒子はまた、桿状であり得る。この実施形態において、これは、上記桿体の直径が上記の制限１５ｎｍを超えない場合に、有利である。ここでまた、身体からの排出を促進するために、５ｎｍ、８ｎｍ、もしくは１０ｎｍの範囲内の直径が好ましい。従って、例えば、本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子は、８×１５ｎｍの長さ／幅寸法を有し得る。
【００５１】
本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子は、好ましくは、６００〜７００ｎｍの間、例えば、６２０ｎｍ〜６６０ｎｍの間、特に好ましくは、約６２５ｎｍもしくは６５５ｎｍの波長において最大発光を有する。上記発光は、ヒトの目で容易に見え、従って、このようなナノ粒子は、医療的介入のための造影剤として、直接的に使用され得る。結論として、補助的光学装置が、いくつかの環境において不要になり得る。
【００５２】
代替の実施形態において、上記の流体力学的直径を超えるナノ粒子は、上記粒子が、インビボで不活性でないことが保証される限りにおいて、本発明に従って使用され得る。後者は、上記粒子が生分解性であるため、そしてその結果として、最初に粒状物としてそこに結合された金属（例えば、Ｃｄ）は、イオン性形態に変換されるための前提条件である。この分解生成物は、腎臓を介して排出され得る。
【００５３】
イミダゾール成分を含む不動態化層を有する無機ナノ粒子は、実際には、（以前に実証されたように）インビボで不活性ではなく、これらの条件下で分解される。従って、上記ナノ粒子は、インビボ適用に特に関連する、生分解性の基準および分解生成物の腎通過の基準を満たす。このことは、驚くべき知見であった。なぜなら、上記不動態化層は、特に、上記ナノ粒子の化学的安定性および／もしくは物理的安定性を増大するようにも作用するからである（これに関連して、以下のさらなるコメントも参照のこと）。従って、一方では、良好な診断に必要とされる上記ナノ粒子の安定性と、他方では、「大きな」粒子の腎通過に必要とされる生分解性との間の関係は、インビボ造影剤としての使用に適している。
【００５４】
上記不動態化層の主要な課題は、上記無機コアの蛍光強度、ならびに化学的安定性および物理的安定性を増大することである。上記不動態化層によってコーティングされた上記無機コアは、少なくとも１０％、有利なことには、少なくとも３０％、５０％もしくはさらに７０％の量子収率によって特徴付けられる。量子収率は、本明細書で、上記サンプルによって発せられる光の量の、サンプルによって吸収される光の量に対する比を意味する。有利なことには、上記不動態化層は、１ｎｍ以下の厚みを有する。この場合、上記不動態化コアの直径の増加は、２ｎｍ以下であった。
【００５５】
有利なことには、上記ナノ粒子にはまた、各場合において、特に、生物学的環境との適合性を改善するために、モディファイアー（Ｍｏｄｉｆｉｋａｔｏｒｅｎ）が提供される。好ましくは、モディファイアーの使用に起因するその流体力学的半径の増加は、２ｎｍを超えない。特定の場合において、上記不動態化層および上記モディファイアーの厚みはまた、上記２つの構造体の互いの中での関係、および上記無機コアに対する関係に依存する。
【００５６】
本発明のナノ粒子は、上記のようにサイズが制限される場合、生きている患者における診断剤としての使用に特に適している。従って、サイズ縮小は、組織への拡散速度および浸透の深さを増大させる。このことは、上記ナノ粒子を、均一にかつ迅速に生物学的環境において拡散させること、ならびに局所投与後、組織（例えば、腫瘍）のできるだけ遠くまで浸透させることを可能にする。本発明のナノ粒子は、同様に、注射によっても行われ得る全身投与を可能にする。しかし、局所投与（例えば、表面適用または腫瘍の処置のための腫瘍内投与もしくは腫瘍周辺（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｅ）投与）もまた、可能である。
【００５７】
上記改変されたアドヘシンに連結された上記ナノ粒子を含む本発明の特に有利な実施形態は、８ｎｍ以下、特に好ましくは、４ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。この規模のナノ粒子は、腎臓を介してすぐに排出され得、従って、身体に蓄積しないか、または非常に少ない程度でしか蓄積しない。結果として、本発明のナノ粒子は、公知の量子ドットとおそらく関係する長期の毒性という問題をかなり減少させる。
【００５８】
上記ナノ粒子は、特に好ましくは、６００〜６６０ｎｍの間での最大発光、特に好ましくは、６２０〜６６０ｎｍの間での最大発光を有する、６００〜７００ｎｍの間の蛍光スペクトルを、有利なことに発光する。上記発光スペクトルは、ヘモグロビンおよび生体系における他の光吸収物質（水を含む）によって、ごく少量しか吸収されないため、組織透過が非常に高いという利点を有する。これら波長の光は、ヒトの目によってなお感知され得、従って、処置を担当している医師が、さらにいかなる複雑な技術的検出補助物（例えば、ＣＣＤカメラ）をも使用せずに、標識した組織を同定することを可能にする。このことは、ＣＥＡ発現細胞および／もしくはＮＣＡ発現細胞を同定するための、特に、発癌組織と健康な組織とを区別するための、外科的介入中に、造影剤として本発明のナノ粒子を使用する場合に、特に有利である。
【００５９】
一実施形態において、好ましくは、使用可能なナノ粒子は、例えば、科学的刊行物を参照するＵＳ ２００４／０２４７８６１において記載されるような、（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳもしくはＣｄＴｅの）コアを有する公知のナノ粒子である。本公報はまた、上記コア物質の調製に関する文書（例えば、米国特許第６，１７９，９１２号）を参照する。これら公知のナノ粒子の特性およびその調製の開示に関する、これら文書の全体の内容が参照される。ナノ粒子を調製するための方法は、米国特許第７，１４７，７１２ Ｂ２号においてもさらに開示され、この公報もまた、開示の目的で参照される。
【００６０】
特に有利なことには、上記ナノ粒子の上記無機コアは、本質的に半導体からなる。これらコアは、それらの個々のサイズおよび／もしくは組成に依存して、種々の色の光を発するが、これらコアの全ては、同一範囲の光スペクトル（ＵＶからＶＩＳ範囲まで）内における広域にわたって吸収する。その高いストークスシフトに起因して、励起スペクトルと発光スペクトルとは、非常に離れており、このことは、種々のナノ粒子の単純かつ同時の励起を可能にする。これらは、ごくわずかに重なり合うかもしくは全く重なり合わない、狭く、対称な発光スペクトルを有する。特に、侵入深度の改善（ｖｅｒｂｅｓｓｅｒｔｅ Ｅｉｎｄｒｉｎｇｔｉｅｆｅ）およびインビボ標識のために非常に重要な他の有益な特性は、最大８０％に至る高い量子収率および高い光安定性である。
【００６１】
好ましいナノ粒子は、例えば、ＷＯ ２００５／００１８８９において開示された。それによると、それらは、少なくとも２種の半導体の合金から作製される無機コアを含む。上記半導体は、均一に分布するか、または各場合において、上記合金内で濃度勾配が存在するかのいずれかである。上記ナノ粒子の性質および調製の開示に関し、上記で引用されるＷＯ ２００５／００１８８９が参照される。上記コアは、各場合において、それらのサイズにおいて５％まで異なり得る。
【００６２】
よって、上記ナノ粒子の無機コアは、少なくとも２種の半導体の合金を含み得、ここで上記コアは、均質な組成を有し、上記２種の半導体のモル比に対して非線形的である「バンドギャップエネルギー（Ｂａｎｄ−Ｇａｐ−Ｅｎｅｒｇｉｅ）」によって特徴付けられる。
【００６３】
あるいは、上記コアは、不均一であり得、上記第１の半導体の濃度は、上記コアの中心から始まって上記コアの表面へと徐々に増大しており、上記第２の半導体の濃度は、上記コアの中心からその表面へと徐々に減少している。
【００６４】
両方のコアについて、上記半導体のうちの少なくとも１種は、ＩＩ族−ＶＩ族の半導体もしくはＩＩＩ群−Ｖ群の半導体（族の定義は、元素周期表の族に対応する）である。例えば、上記合金は、以下の合金の群から選択され得る：ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＡｌＡｓ、ＩｎＧａＮ。これらコアは、無機物質（例えば、半導体（例えば、ＺｎＳ））のコーティングをさらに有し得る。このさらなる層は、「キャッピング」もしくは「シェル（ｓｈｅｌｌ）」として、当業者に公知である。
【００６５】
ＩＩ族−ＶＩ族およびＩＩＩ族−Ｖ族の半導体は、一般に公知であり、例として以下が挙げられる：ＣｄＳ１−ｘＳｅｘ、ＣｄＳ１−ｘＴｅｘ、ＣｄＳｅ１−ｘＴｅｘ、ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘ、Ｚｎ１−ｘＣｄｘＴｅ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＳ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＴｅ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＡｓ、Ｇａ１−ｘＡｌｘＡｓおよびＩｎ１−ｘＧａｘＰ。半導体ＣｄＳｅ１−ｘＴｅｘ、ＣｄＳ１−ｘＴｅｘ、ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘ、Ｚｎ１−ｘＣｄｘＴｅ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＳ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＴｅ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＡｓ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＰ（ここでｘは、０〜１の分数（Ｆｒａｋｔｉｏｎ）である）を使用することが好ましい。
【００６６】
上記半導体のモル比は、任意のモル比であり得る。しかし、上記合金がＣｄＳＳｅを含む場合、分子式ＣｄＳ１−ｘＳｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＣｄＳＴｅを含む場合、分子式ＣｄＳ１−ｘＴｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＺｎＳｅＴｅを含む場合、分子式ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＺｎＣｄＴｅを含む場合、ＣｄＴｅのみの分子式を有する合金が好ましい。これらの場合の各々において、ｘは、０〜１の間の分数である。
【００６７】
上記ナノ粒子のこれら好ましい無機コアは、以下の工程を使用して調製され得る：（ｉ）ナノ結晶の形成を可能にする条件下で、第１の溶液を調製すること、（ｉｉ）ナノ結晶の形成を可能にしない条件下で、一定のモル比を有する上記半導体の前駆物質を含む第２の溶液を調製すること、（ｉｉｉ）上記第２の溶液を上記第１の溶液に添加し、ナノ粒子の形成を可能にすること、および（ｉｖ）上記条件を変更して、上記ナノ結晶の成長および形成を停止させること。上記コアを調製するための方法は、ＷＯ ２００５／００１８８９に例示され、これは、本発明のナノ粒子の無機コアのこの好ましい実施形態の調製の開示に関し、参照される。
【００６８】
代替の実施形態において、上記無機コアは、好ましくは、２個〜２７個の貴金属原子を含む貴金属クラスターから本質的になり得る。好ましい実施形態において、上記貴金属は、金、銀、銅、白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウムからなる群より選択された。上記クラスターは、種々の電荷を有し得る。
【００６９】
これらコアは、それらの吸収および発光が強いので、弱い水銀ランプ励起を用いても個々の「ナノドット」として容易に検出され得るという利点を有する。これらコアを含む本発明のナノ粒子は、有利なことには、蛍光性の個々の分子標識および質量標識として使用され得る。
【００７０】
用語「貴金属」とは、金、銀、および銅、ならびに白金族金属（ＰＧＭ）（白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウム）からなる群より選択される元素の群をいう。本発明の好ましい実施形態において、上記貴金属は、金、銀および銅からなる群より選択される。特に好ましい実施形態において、上記貴金属は、銀もしくは金である。
【００７１】
用語「クラスター」とは、２〜２７個の金属原子の化合物に関する。クラスターは、特に、化学触媒、セラミックス、半導体技術および材料科学の分野から、公知である。従って、当業者は、それらの調製に精通している。ＷＯ ２００４／００３５５８は、特に、貴金属クラスターの調製を記載し、さらに、この主題に関する広範囲なさらなる参考文献を含んでいる。より具体的には、これは、有機分子と会合した貴金属ナノクラスターの調製を開示している。用語、会合とは、ここで、結合の化学的性質にも物理的性質にもかかわりなく、任意の結合形態（従って、例えば、共有結合、非共有結合、静電気結合もしくはファンデルワールス結合）を意味する。本発明のナノ粒子のコアとしての上記ナノクラスターの調製に関して、ＷＯ ２００４／００３５５８が参照される。
【００７２】
好ましくは本発明に従って使用可能である上記ナノ粒子は、蛍光強度を増大し、上記無機コアの化学的安定性および物理的安定性を改善する不動態化層を有する。結果として、上記ナノ粒子は、好ましくは、１０％より大きい、好ましくは、５０％より大きい量子収率で、光を発する。
【００７３】
上記ナノ粒子は、好ましくは、４℃の水性環境において少なくとも１２ヶ月の貯蔵安定性を有し、可能であれば、ｐＨ５〜ｐＨ１０、好ましくは、ｐＨ７〜ｐＨ１０のｐＨ範囲にわたって安定であり、すなわち、上記ナノ粒子は、それらの特定のスペクトル特性（例えば、量子収率，最大発光の位置、発光スペクトルの半値幅）に関して、５０％未満の偏差を示す。好ましい粒子は、これら特定のスペクトル特性に関して、１０％未満の偏差を示す。
【００７４】
本発明の別の実施形態に従って使用可能な上記ナノ粒子は、本質的に、生物学的（すなわち、生理学的）条件下でも、もしくは少なくとも３日間にわたってインビボで、上記コア（これを囲む上記不動態化層を含む）の特性の恒常性／安定性を示す。好ましい粒子は、７〜１４日間にわたって、この種の恒常性／安定性を示し、ここで安定性によって、上記特性のうちの１つの恒常性の少なくとも５０％を保持する。この情報は、特に、実際の標的器官における上記ナノ粒子の安定性に言及する。主に異化機能を有する器官において（例えば、肝臓において）、上記ナノ粒子の安定性が、明らかに低下し得るということは、注目すべきである。このことは、明らかに望ましくすらあり得る。
【００７５】
上記ナノ粒子は、上記の意味において安定であるが、それにも拘わらず、基本的にインビボで分解性であり、結果として、不活性でない。この意味において、「不活性でない」とは、上記ナノ粒子のうちの少なくとも５０％が、投与の１２週間後もしくはこれ以上後では、既に分解されていることを意味する。８週間後、６週間後、もしくは４週間後において既に、少なくとも５０％の分解が検出可能であることが好ましい。身体に残っている上記粒子の検出は、この目的のための、身体器官中および血漿中での検出を含む。よって、「不活性な」とは、上記粒子のうちの５０％より多く、さらには、最大ほぼ１００％までが、投与の４週間後に上記患者の身体中でなお検出可能であることを意味する。
【００７６】
上記ナノ粒子の分解性は、当業者に公知のアッセイによって（すなわち、例えば、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって）、検出され得る。このアッセイはまた、上記サンプルが適切であれば（これについて本明細書以降も参照のこと）、蛍光分光光度測定によって補われ得る。
【００７７】
上記不動態化層は、金属原子もしくは金属イオン（例えば、亜鉛イオン、水銀イオンもしくはカドミウムイオン）を配位し得る少なくとも１種の化合物を含む。この化合物は、ルイス塩基または共鳴電子を有する環式もしくは直鎖状の不飽和化合物であり得る。環式不飽和化合物として、上記化合物はまた、複素環もしくはヘテロ芳香族であり得る。好ましい実施形態において、上記不飽和基もしくは共役基は、上記分子の構造に基づく末端位置にある。上記不動態化層は、架橋剤をさらに有し得、または環式もしくは直鎖状の不飽和化合物はまた、架橋剤として作用し得る。上記架橋剤は、塩基性であり得る。
【００７８】
金属原子もしくは金属イオンを含む配位化合物は、キレート化、配位、もしくはルイス塩基の電子供与特性によって蛍光性無機コアに機能的に結合し得、かつ対応する共役部分／基を有し得る。上記分子は、上記分子でコーティングされている上記コアに水性溶液中での可溶性もしくは湿潤性を付与する特定の部分をさらに含み得る。
【００７９】
上記分子もしくは化合物は、１つ、２つもしくはこれ以上の結合した（もしくはまた、縮合した）環を含む均一なもしくは不均一な（複素環式）環系を含み得る。ヘテロ芳香族系の好ましい例は、チアゾール、チアゾール誘導体、オキサゾール、オキサゾール誘導体、ピロール、ピロール誘導体（ドープされたかもしくは非ドープのポリピロールオリゴマーを含む）、チオフェン、チオフェン誘導体（ドープされたかもしくは非ドープのポリチオフェンを含む）、フラン、フラン誘導体、ピリジンおよびピリジン誘導体、ピリミジンおよびその誘導体、ピラジン、ピラジン誘導体、トリアジンおよびトリアジン誘導体、トリアゾール、トリアゾール誘導体、フタロシアニンおよびフタロシアニン誘導体、ポルフィリンおよびポルフィリン誘導体である。上記化合物としては、アセチレン、プロピンおよびアレンを含み得る不飽和（オレフィン）炭化水素またはそのアミン、リン誘導体もしくは酸素誘導体が挙げられ得るが、これらに限定されない。上記半導体コアの表面で付加物もしくは共鳴の形成に関与するために、十分なｐ−電子密度もしくはπ−電子密度を有する分子が好ましいはずである。
【００８０】
上記ヘテロ芳香族化合物は、好ましくは、イミダゾール成分である。さらに、架橋剤として、ホスフィン化合物、好ましくは、アルキルホスフィン化合物を添加することが好ましい。
【００８１】
用語「イミダゾール成分」とは、本発明の説明の目的において、少なくとも１つのイミダゾール基（イミダゾール誘導体を含む）を含み、かつ上記無機コア、もしくは上記不動態化層（これは、金属（例えば、カドミウム、亜鉛、ガリウムまたは金属カチオンもしくはそのようなカチオンを含む基材）を有する）への結合に利用可能である、複素環式もしくはヘテロ芳香族の分子を意味する。この点について、好ましくは、少なくとも１つのイミダゾール基は、上記分子の構造に基づく末端位置にあるべきである。その機能的形態にある上記イミダゾール成分は、上記蛍光性ナノ結晶に対して、非局在化分子軌道を含む環を介して結合する。通常、上記イミダゾール環の窒素原子は、配位リガンドとして働いて、金属イオン（例えば、カドミウムもしくは亜鉛）を機能的に結合させる。
【００８２】
一実施形態において、上記イミダゾール成分は、反応性官能基（例えば、１個もしくは２個のアミノ酸（例えば、ヒスチジン、カルノシン、アンセリン、バレイン（Ｂａｌｅｉｎ）、ホモカルノシン、ヒスチジルフェニルアラニン、シクロ−ヒスチジルフェニルアラニン、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、ヒスチジルロイシン、２−メルカプトイミダゾール、ｂｏｃ−ヒスチジン、ヒドラジド、ヒスチノール、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、イミダゾリシン（Ｉｍｉｄａｚｏｌｙｓｉｎ）、イミダゾール含有オルニチン（例えば、５−メチルイミダゾール）、イミダゾール含有アラニン（例えば、（β）−（２−イミダゾリル）−Ｌ−（α）アラニン）、カルジニン（Ｃａｒｚｉｎｉｎ）、ヒスタミン）を含む。これらヒスチジンベースの分子もしくはイミダゾール含有アミノ酸は、一般に公知の方法によって合成され得る。
【００８３】
用語「ホスフィン」とは、本発明の目的で、非金属（例えば、Ｓｅ、Ｓもしくは他の非金属）または上記の原子を含む基材を結合もしくはキレート化するための少なくとも１個のホスフィン基（それらの誘導体を含む）を有し、かつ隣り合う分子との反応のための少なくとも１個の官能基（例えば、ヒドロキシル−、アミノ−、チオール−、カルボキシル−、カルボキサミド−など）を提供する分子を意味する。
【００８４】
好ましくは、少なくとも１個のホスフィン基は、上記分子の構造に基づく末端位置に位置すべきである。上記ホスフィン部分は、配位リガンドとして働いて、その機能的形態において、例えば、ＳｅもしくはＳなどの非金属もしくはイオンを、蛍光性コアまたはシールド層からの化合物と結合させる。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記ホスフィン含有化合物は、互いに（例えば、ポリマー形態において）連結した１個、２個もしくはこれ以上のホスフィン基を含み、これらとしては、ヒドロキシメチルホスフィン化合物などが挙げられ得るが、これらに限定されない。ホスフィン含有化合物は、一般に公知の方法によって合成され得る。さらに、アルキルホスフィン含有化合物は、１個以上のさらなる官能基（例えば、ヒドロキシル−、アミノ−、チオール−、カルボキシル−、カルボキサミド−など）も有し得ることが公知である。誘導体の例は、その誘導体化が、本明細書に記載されるコーティングとしてのホスフィンの機能と適合性がある限りにおいて、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、アミドもしくはエステルである。
【００８６】
本発明のナノ粒子の蛍光性無機コアをコーティングするためには、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィンおよびβ−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロパン酸が特に好ましい。架橋されたホスフィン含有化合物は、さらに金属原子および／もしくはイオン（例えば、ＺｎもしくはＣｄ）に機能的に結合し得ることが周知である。この点に関して、官能化されたイソシアネートもしくはアルキルシアノアクリレートは、リガンドにとってのおよび上記蛍光性コアとの付加物形成にとっての架橋剤としてさらに有用であり得る。上記架橋剤はまた、塩基性であり得る。
【００８７】
本発明に従って存在する上記不動態化層の不動態化効果は、ヘテロ芳香族もしくは複素環との（好ましくは、上記イミダゾール成分との）錯体形成による表面のカドミウム原子もしくは亜鉛原子などの遮蔽に、および上記ホスフィン含有化合物との錯体形成を介した対原子（Ｇｅｇｅｎａｔｏｍｅ）（ＳｅもしくはＳなど）の遮蔽に基づく。
【００８８】
本発明のナノ粒子の上記不動態化層は、ＵＳ ２００４／０２４７８６１ Ａ１において開示された。この公開された出願は、上記不動態化層でコーティングされた無機コア（例えば、量子ドット）の調製を記載する。従って、本発明に従って使用される上記不動態化層およびこれらでコーティングされる上記無機コアの調製の開示の目的のため、ＵＳ ２００４／０２４７８６１が参照される。
【００８９】
上記不動態化層の分子は、標的分子および細胞（特異的リガンド）を結合および架橋するために、さらに化学基を有し得る。適切な試薬（例えば、ＺｎＳＯ４およびＮａ２Ｓ）の存在下で、上記分子もしくは化合物は、上記蛍光性コア上の分子と不動態化層を形成し得る（「キャッピング」もしくは「シェル」）。これら試薬はまた、上記蛍光性ナノ結晶の表面上の原子もしくはイオンに機能的に結合し得、結果として、このさらなる不動態化層はまた、上記コアの表面上に直接形成され得る。
【００９０】
有利な実施形態において、本発明のナノ粒子は、有機部分および／もしくは無機部分からなり得るモディファイアーをさらに有し得る。それらは、液体もしくは懸濁媒体中で、特に生理学的環境において、上記ナノ粒子の適合性、効能および／もしくは溶解性を改変するために使用される。この表面改変は、生物系、特にヒトの身体における非常に低い非特異的吸着および増大した適合性を達成するために、特に有利である。
【００９１】
１つの可能性としては、特定の医療適用について既に認可されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で、特に、上記ナノ粒子が小さな全体的サイズを維持するために低分子量形態のＰＥＧで、表面を改変することがある。これによって、上記ナノ粒子の生体適合性と血液循環時間との両方、さらに、細胞への取り込み効率を、増大させ得る。低分子量ＰＥＧ層と他の物質（例えば、ビタミン（例えば、葉酸））との組み合わせは、マクロファージへの上記ナノ粒子の低い取り込みを達成し得る。なぜなら、上記ナノ粒子へのタンパク質吸着は、上記組み合わせによって低下し、これによって免疫系による上記ナノ粒子の認識がより困難になるからである。
【００９２】
モディファイアーを使用することによる別の考えられる有利な表面改変は、１つのタイプのモノサッカリドもしくは種々のモノサッカリドから構成される、モノサッカリド、ジサッカリドもしくはトリサッカリドから低分子量ポリサッカリドまででのコーティングである。考えられる開発の１つのタイプは、ポリグルコースでの改変であり、例えば、ここでデキストランが使用され得、デキストランは、代用血液として医学的に承認されている。これは、良好な生体適合性／寛容性を示す。別の実施形態は、あり得る分解を妨げるための、サッカリドの立体異性形態（Ｄ−／Ｌ−）の使用である。
【００９３】
別の実施形態は、モディファイアーとしての、生物学的に適合性の親水性ビタミンの使用である（例えば、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、コバラミン、パントテン酸、アスコルビン酸および葉酸）。従って、例えば、葉酸は、癌細胞へのナノ粒子の好ましい結合をもたらし得る。このビタミンは、ごく低い免疫原性しか示さず、従って、高い生体適合性を示す。上記ナノ粒子の内在化は、膜結合型葉酸レセプターへの結合によって促進される。
【００９４】
表面改変はまた、親油性ビタミン（レチノール、コレカルシフェロール、トコフェロールおよびフィロキノンなど）で可能である。従って、例えば、ビタミンＥは、ナノ粒子の細胞取り込みを増大し得る。
【００９５】
脂肪酸（例えば、１−オクタデセンもしくは１８−メチルエイコサン酸およびこれらの誘導体）は、上記コロイドの溶解性および安定性を増大させ得、ならびに、その後の特異的リガンドの結合について利用され得る末端官能性カルボキシル基を有し得る。従って、モディファイアーとして脂肪酸を含むことは有用である。
【００９６】
表面改変の別の実施形態は、多価アルコール（例えば、ジエチレングリコール（ＤＥＧ））でのコーティングである。これらは、非特異的タンパク質吸着を減少させることにおいて特に良好である。同じことが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））（特にその低分子量形態のもの）に当てはまり、ポリテトラフルオロエチレンは、低下したタンパク質吸着を達成し得る。ポリテトラフルオロエチレンは、心臓外科適用において頻繁に使用される。
【００９７】
表面改変は、タンパク質新生に関与する（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｅｎ）アミノ酸およびタンパク質新生に関与しないアミノ酸の両方を包含する１個以上の天然に存在するアミノ酸、ならびに１個以上の合成アミノ酸を使用して同様に行われ得る。立体異性体（Ｄ体およびＬ体）の両方が、ここで使用され得る。上記アミノ酸のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドから小さなポリペプチドまでは、免疫系をほとんど刺激せず、従って、薄い適合性層にもに適している。それらは、人工アミノ酸配列、ならびに生物学的タンパク質に由来する配列であり得る。天然タンパク質（例えば、ファイトケラチン）のペプチド誘導体は、同様に、表面改変のために使用され得る。ＴａｔペプチドおよびＴａｔペプチド含有ペプチドでの表面改変は、生物医療的適用において使用できるナノ粒子を作製する別の可能性である。上記Ｔａｔペプチドは、例えば、細胞膜を通って核へと金ナノ粒子を送達するための有効な分子である。
【００９８】
考えられるモディファイアーの別の実施形態は、ホスホリルコリンコーティングの形成である。ホスホリルコリンは、（例えば、コンタクト・レンズ上の）考えられる非特異的タンパク質吸着を減少させる。その非血栓形成特性のおかげで、ホスホリルコリン改変は、生物学的系において容易に使用され得、高い貯蔵安定性によって認識される。
【００９９】
ポリラクテートは生体適合性であるので、この物質は、種々の医療的適用において使用される。より具体的には、ポリラクテートの低分子量形態は、本発明のナノ粒子の別の考えられる表面改変を構成する。両方の立体異性体（Ｄ体／Ｌ体）が、考えられる生体分解を減らすために、本明細書で使用され得る。
【０１００】
記載された表面改変とは別に、上記ナノ粒子への、非特異的タンパク質の、タンパク質分解により切断可能な結合もまた可能である。これは、生体適合性／適合性を増大させ得る。標的位置において、大きなタンパク質は、組織中に放出される小さなナノ粒子とともに除去され得る。上記除去はまた、適切な滞留時間の後に起こり得る。これに適切なのは、好ましくは、例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、セルロプラスミン、エラスチンおよびアルブミンのような一般に使用されるタンパク質、ならびに非特異的吸着を低下させる他のタンパク質である。従って、例えば、ポリペプチドとエラスチンとの組み合わせから構成される表面コーティングは、望ましくない凝塊形成を予防し得、従って、上記ナノ粒子の生体適合性を増大させ得る。
【０１０１】
主要な血清タンパク質アルブミンは、形質膜との非特異的相互作用を低下させ得る。さらに、適切に改変されたナノ粒子は、特異的リガンド（これは、同時に上記粒子表面に結合している）によって、標的細胞との特異的相互作用を発生させる能力を保持する。血清アルブミンでのコーティングは、静脈内投与後のマクロファージによる迅速な取り込みを防止することによって、コーティングされていないナノ粒子での場合よりも実質的に長い血液循環時間を生じ得る。
【０１０２】
上記に概説される非特異的コーティングとは別に、本発明のナノ粒子は、標的細胞−特異的リガンドでの選択的標識を有し；これらは、例えば、タンパク質、抗体、ペプチドと、あるいは特に好ましくは、小さな高親和性タンパク質ドメイン、抗体フラグメントまたは例えば、腫瘍細胞特異的構造もしくは他の標的に結合する他の有機分子と、結合体化される。好ましいリガンドは、アドヘシンである（例示的実施形態４を参照のこと）。この状況において「特異的」とは、上記リガンドが、もっぱら、もしくは増大した程度にまでのいずれかで標的上に発現されることを意味する。
【０１０３】
記載された拡散および灌流のより高い速度を生じる低下した流体力学的直径を、上記の特性および改善ならびに高い蛍光強度（特に、可視赤色光範囲において）と組み合わせることは、本発明のナノ粒子を、インビボで組織形態の選択的かつ正確な識別のための多くの異なる方法において使用され得る、単純な診断剤にする。これらの可能性は、抗原特異的生体マーカーとの組み合わせにおいて、特に、ＣＥＡ発現細胞および／もしくはＮＣＡ発現細胞を同定するために、特に、異常な（前）発癌組織を正常な組織から区別し、より正確な腫瘍切除のための外科的介入の間に視覚的評価を補助するために使用される。従って、本明細書で使用可能な本発明のナノ粒子は、造影剤として働く。このことは、特に、腸癌診断および外科手術における使用に適用される。
【０１０４】
本発明による改変されたアドヘシンを有する上記ナノ粒子は、インビトロもしくはインビボでの診断剤、セラノスティック剤（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｋｕｍ）および／もしくは治療剤のいずれかとして使用され得る。この目的に関して、それらは、局所的に（例えば、腫瘍内に、筋肉内にもしくは外科的に接近可能な組織／器官に）投与され得、さもなければ、全身に（例えば、静脈内に）もまた投与され得る。局所／表面投与は、液体、スプレー溶液、ゲル、フォーム、クリーム、活性パッチ（Ｗｉｒｋｐｆｌａｓｔｅｒ）によって、提供され得る。これは、特に、中空器官（例えば、腸癌の場合）の処置／診断のために好適であり得る。例えば、シロップ剤として、または錠剤もしくはカプセル剤の形態において、経口摂取もまた可能である。吸入も同様に可能である（例えば、スプレー）。坐剤による肛門投与は、想定される。１つの改変において、上記ナノ粒子は、デポー形態において移植され得る。
【０１０５】
用語「診断剤」とは、「造影剤」の同義語として本発明の状況において使用される。すなわち、診断剤は、医療的介入を補助するために、生物学的系、特に、生きている人々において、形態的構造もしくは機能的構造の識別的可視化のために働く。
【０１０６】
上記ナノ粒子は、特に、外科的介入において、診断剤として使用され得る。これらはまた、低侵襲法（ｍｉｎｉｍａｌ−ｉｎｖａｓｉｖｅｎ Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（例えば、内視鏡検査法、腹腔鏡検査法）において使用され得る。画像化法（例えば、ＰＥＴ、ＭＲＴ、ＣＴなど）との組み合わせは、価値がある。
【０１０７】
既に上で述べられているように、局所投与の形態における本発明に従う使用は、特に有利である。この点について局所投与に際して使用されるＣｄの量は、有利なことには、高齢でかつ通常の生活様式のヒトの肝臓および腎臓に、一生の間にいずれにせよ通常蓄積する総曝露量の１０分の１を超えない。これら器官の総曝露量は、約１８ｍｇである（Ｓａｔｕｒａｇら ２０００；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；２０００，（８４），７９１−８０２）。よって、局所投与に際して、供給されるＣｄの量が少なくとも実質的に２ｍｇを超えないように、ナノ粒子の量を制限することは有利である。特に好ましい実施形態において、腫瘍可視化は、カドミウムが０．６ｍｇ、特に好ましくは、０．２ｍｇの合計量を超えない造影剤の量ですら可能である。
【０１０８】
「局所投与」とは、本発明の目的では、上記造影剤の量もしくは用量の増大が、投与様式に依存して、身体の明確な領域において期待され得る、任意の投与を意味する。よって、例えば、輸入管もしくは輸出管に結紮を適用することなど、投与する職員による付随的手段によって、本質的に妨げられていない様式で身体中の血管系の至る所に上記造影剤が拡がることがないようにされる場合、上記造影剤の脈管投与もまた、局所投与である。
【０１０９】
この実施形態の特有の利点は、生きているヒトに対する医療的適用における上記ナノ粒子の使用がこれによって初めて可能になることである。なぜなら、別の方法（すなわち、全身投与）は、上記ナノ粒子の使用に関連する毒性が原因で、予め排除されるからである。上記の利点は、局所投与が、適切に可視化するために必要なナノ粒子の用量を低下させることによる。
【０１１０】
Ｃｄ含有造影剤が、有利なことに、インビボで腫瘍を可視化するために、腫瘍組織１ｃｍ3あたり０．００２〜０．０２ｍｇのＣｄの量に対応する用量で本発明に従って使用されることが明らかになった。０．００２〜０．０１５ｍｇ Ｃｄ／ｃｍ3 腫瘍組織の上記造影剤の用量は、特に有利であり、とりわけ、０．００２〜０．０１０ｍｇ Ｃｄ／ｃｍ3の間の用量が有利である。ヒトについての曝露の通常受容可能である上限を超えることなく、インビボで最大約１５０ｃｍ3の体積を有する腫瘍を可視化することは、この有利な投与量で可能である。最大５０ｃｍ3までの体積を有する腫瘍の可視化のために、特に都合がよい。
【０１１１】
調査は、患者の全ての接近可能な組織／器官（特に、皮膚、中空器官（例えば、胃腸管、尿生殖路、気道））に、または感覚器官の外側から接近可能な領域に、および心血管系に関し得る。
【０１１２】
インビトロ診断剤としての使用もまた可能である（例えば、免疫組織化学もしくはＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ）。インビボ診断とインビトロ診断との組み合わせ（例えば、生検材料）は、特に有利である。
【０１１３】
本発明に従う改変されたアドヘシンは、上記ナノ粒子に結合されたままであり得るか、または、除去可能か検出可能か放出可能であり得る。
【実施例】
【０１１４】
（例示的実施形態）
（Ｉ．改変されたアドヘシンの提供）
上記Ｎ末端ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡ）ドメインは、アドヘシンの結合に十分である。このことは、精製した線毛（特定のアドヘシンも含む）を使用した結合研究から公知である（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」）。従って、ＣＥＡおよびＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６）のＮ末端ドメインを、本実施形態に従うアドヘシンの標的として使用した。
【０１１５】
この目的のために、事前に、ＣＥＡおよびＮＣＡのＮ末端ドメインのコドン使用法、およびリガンドとしてのＤｒａＥ成熟タンパク質（アドヘシン）のコドン使用法を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために最適化した。これらの遺伝子を合成した。
【０１１６】
（好ましくは、変異Ｎ７７Ｋを含む）ＤｒａＥ構築物およびＣＥＡの末端ドメイン（本明細書中以降、Ｎ−ＣＥＡ）を、酵母ＴＨベクターにクローニングし、酵母へ形質転換した。
【０１１７】
上記アドヘシンを変異誘発、特に好ましい実施形態において、オリゴベースの部位特異的変異誘発（例えば、ＥＰ１７７７２９２ Ａ１）に供する。そこから得られるライブラリーを、単一コロニーおよび上記ライブラリーＤＮＡを配列決定することによって特徴付ける。
【０１１８】
上記ライブラリーおよび上記標的（Ｎ−ＣＥＡ）を、ゲノムへのＭｅｔ１遺伝子（これは、ウロポルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼをコードする）の組込みによって改変された酵母株Ｙ１９０に形質転換し、この酵母を、２５ｍＭの３−ＡＴを含む培地上に蒔く。レポーター遺伝子（Ｍｅｔ１およびβ−ガラクトシダーゼ）が読み取られるためには、上記２つのタンパク質が相互作用しなければならない。
【０１１９】
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行う。上記Ｍｅｔ１レポーター遺伝子を、ウロポルフィリノーゲンIIIの酵素的変換から生じる産物の蛍光によって検出する。
【０１２０】
得られたヒットを確認するために、さらなる試験を、上記第２のレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）の配列決定の前に利用した。この目的のために、β−ガラクトシダーゼの活性を、この酵素（β−ガラクトシダーゼ）によって基質ＦＤＧを蛍光産物へと変換することによって決定し、これによって、配列決定の前に、ヒット数を２５％に低下させた。
【０１２１】
従って、野生型よりも（さらにとりわけ、上記テンプレートよりも）改善されたＣＥＡ親和性および／もしくはＮＣＡ親和性を有するアドヘシン変異体を提供することは可能である。上記テンプレートに対する親和性（これは、例えば、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に開示されるスクリーニング法に従うレポーター遺伝子の読み取り値として記録される）の改善は、少なくとも約５％、好ましくは、少なくとも１００％、特に好ましくは、さらに少なくとも３００％もしくは少なくとも５００％である。野生型と比較した親和性は、ここで上記テンプレートの親和性の最大２倍まで、さもなければ最大４倍までの値にまさに近づき得る。
【０１２２】
親和性における特に優れた改善を、少なくとも２つの変異、好ましくは、さらに、最大３つ、５つもしくは７つの変異を組み合わせることによって達成する。親和性の特に大きな増大は、特に、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１のスクリーニング工程を反復する（必要に応じて、さらに数回反復する）ことによって、可能である。
【０１２３】
種々の親和性を有する改善された変異体の検出が、意図される。本明細書において、野生型より改善されているアドヘシンを同定するために、上記野生型を見いだすことは重要である。これは、親和性が改善された変異体についての完全配列空間を含む。
【０１２４】
すなわち、１個もしくはそれより多いアミノ酸位置において改変された本発明の改変アドヘシンは、これらの調査から得られ得る。
【０１２５】
（１．有利な改変）
（例示的実施形態１−８８位−スレオニン）
変異Ｔ８８Ｍは、文献（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」）から、アドヘシンにおいて、特に、ＤｒａＥにおいて、上記アドヘシンのＣＥＡ親和性の増大を引き起こすことが公知である。したがって、Ｔ８８位を、最初の変異誘発のために選択した。
【０１２６】
この情報およびこの後の全ての情報は、配列番号１に従うＤｒａＥにおけるアミノ酸位置に関する。
【０１２７】
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１において記載されるように行った。
【０１２８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｍ＞Ｌ＞ＷＴ
このＴ８８Ｍ位を有する最も改善された変異体を、以下の変異誘発のためのテンプレートとして使用した。
【０１２９】
さらに、変異Ｎ７７Ｋを、アドヘシンがＤＡＦへ結合しないように、導入した（ｖａｎ Ｌｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４５（２），ｐｐ．４３９−４５２，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ」）。この変異は、Ｎ−ＣＥＡへのアドヘシンの結合に影響を与えない（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」および発明者自身のデータ）。従って、以下の変異誘発のためのテンプレートは、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋである。
【０１３０】
（例示的実施形態２−７位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｎ＞（Ｆ，Ｃ）＞Ｓ＞Ｖ＞Ｒ，Ａ＞（Ｉ，Ｌ，Ｙ）＞ＷＴ
（例示的実施形態３−１７位−グルタミン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｐ＞Ｋ＞Ｇ，Ｄ，Ｒ，Ｎ＞Ｈ，Ｑ＞ＷＴ
（例示的実施形態４−２２位−アルギニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３３】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＞Ａ＞Ｓ＞Ｎ＞Ｋ＞ＷＴ
（例示的実施形態５−２５位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｇ＞Ｎ＞Ａ，Ｔ＞Ｋ，Ｒ，Ｈ，Ｑ，Ｍ＞ＷＴ
（例示的実施形態６−２７位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３５】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｋ＞Ｒ＞Ｌ＞Ｖ，Ｙ＞Ｐ，Ｎ，Ｑ＞ＷＴ
（例示的実施形態７−２８位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｗ＝Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態８−２９位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｋ＞Ｒ＞Ｓ＞Ｅ，Ｑ＞Ｆ，Ｇ＞Ｌ，Ｈ＞Ｐ，Ｎ，Ｔ，Ｗ＞ＷＴ
（例示的実施形態９−３１位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｇ＝Ｄ＞Ｓ＞Ｎ＞ＷＴ
（例示的実施形態１０−３４位−グルタミン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３９】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｄ＞＞Ｇ＞Ｓ＝Ｎ＞Ｌ＝Ｖ＝Ｔ＝Ａ＞ＷＴ
（例示的実施形態１１−３７位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｎ＞＞ＷＴ
（例示的実施形態１２−３８位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＝Ｔ＞Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態１３−３９位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｑ＞Ｓ＞Ｄ，Ｍ＞Ｇ，Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態１４−４１位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４３】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞＞ＷＴ
ＦＤＧアッセイによる再スクリーニングにおいて、Ｉ４１Ｌクローンは、Ｉ４１Ｖクローンよりも高い読み取り値を有した。その配列を分析したところ、これらクローンの全てが、さらなる変異Ｖ１１６Ａも有することが明らかになった。従って、Ｉ４１Ｌ Ｖ１１６Ａはまた、改善された変異体である。
【０１４４】
（例示的実施形態１５−４７位−グルタミン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４５】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＞＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴ
（例示的実施形態１６−５２位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｇ＞Ｎ，Ｓ＞Ｃ，Ｐ，Ｑ，Ｙ，Ｈ，Ｋ，Ｒ，Ｔ＞ＷＴ
（例示的実施形態１７−８４位−アスパラギン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｄ＞＞Ｓ＞Ｈ＞ＷＴ
上記スクリーニングはまた、上記ＦＤＧ再スクリーニングにおいて、Ｎ８４Ｓと比較してより高い読み取り値を有する、（組み合わせ）変異体Ｑ３４Ｌ Ｎ８４Ｓを見いだした。
【０１４８】
このことは、変異体の組み合わせが、その単一変異体との比較において、ＣＥＡに対しより高い親和性を生じることを示す。
【０１４９】
（例示的実施形態１８−８６位−アルギニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞＞ＷＴ
（例示的実施形態１９−９５位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｌ＞＞Ｍ，Ｙ，Ｆ＞（Ｃ，Ｗ，Ｑ）＞Ｎ，Ｅ，Ｓ，Ｉ，Ｈ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｔ９５Ｅ Ｔ１２３Ｉをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｔ９５Ｅ変異体より高いＦＤＧ読み取り値を有した。
【０１５２】
このことは、変異体のこの組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１５３】
（例示的実施形態２０−１００位−フェニルアラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｙ＞Ｖ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｆ１００Ｓ Ｔ１１Ｉ Ｄ３７Ｇをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｆ１００Ｓ変異体よりも高いＦＤＧ読み取り値を有した。同様に、組み合わせ変異体Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉは、Ｆ１００Ｉ変異体よりも高いＦＤＧ読み取り値を示すことを見出した。
【０１５５】
このことは、変異体のこの組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１５６】
（例示的実施形態２１−１０５位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ａ，Ｔ＞Ｒ＞Ｍ，Ｖ，Ｐ，Ｎ，Ｅ＞Ｑ，Ｇ，Ｋ，Ｈ＞ＷＴ
（例示的実施形態２２−１１１位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｃ＞Ｖ＞Ｈ＞Ｙ＞Ｔ＞Ｍ＝Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態２３−１１４位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５９】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる；
Ｖ＞＞Ｌ＞Ａ＝Ｃ＞ＷＴ
（例示的実施形態２４−１１５位−チロシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＝Ｗ＞Ｅ＞Ｖ＞ＷＴ
（例示的実施形態２５−１１６位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ａ＞Ｓ＞Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態２６−１１８位−グリシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｐ＞Ｓ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｇ１１８Ｓ Ｉ８５Ｌをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｇ１１８Ｓと比較して、より高いＦＤＧ読み取り値を有した。この組み合わせを最初のヒットの中で見いだした。
【０１６３】
このことは、変異体の組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１６４】
（例示的実施形態１〜２６のまとめ）
以下のコンセンサス配列の全てを、ＤｒａＥ Ｎ７７Ｋの以下の配列に基づいて特定する（図１、配列番号１もまた参照のこと）：
【０１６５】
【化５】
【０１６６】
これら例示的実施形態は、アドヘシン遺伝子内で変異すると、上記アドヘシンの改善されたＣＥＡ親和性を生じるようなアミノ酸についての、以下の「ポジティブ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」コンセンサス配列を生じる：
（コンセンサス配列 配列番号９）
【０１６７】
【化６】
【０１６８】
アラインメントを、図１２に示す。
【０１６９】
有利な実施形態において、本発明に従う改変されたアドヘシンは、以下のアミノ酸のうちの１つ以上を有する：Ｌ２６、Ｇ４２、Ｐ４３、Ｖ４４、Ｌ４９、Ｄ８９、Ｓ９１、Ｓ１０７、Ｗ１０８、Ｇ１１０。特に好ましい実施形態において、これらアミノ酸のうちの全てが存在する。
【０１７０】
このことは、有利なことには、以下のコンセンサス配列を生じる：
（コンセンサス配列、配列番号１０）
【０１７１】
【化７】
【０１７２】
アラインメントを、図１３に示す。有利に存在するアミノ酸には、ここで下線を付す。
【０１７３】
本発明のアドヘシンが、さらに、以下のアミノ酸のうちの１個以上を、特に、全てを有する場合、有利である：Ｃ１９、Ｃ５１、Ｇ１０６、Ｙ１２８、Ｔ１２９。
【０１７４】
よって、本発明のアドヘシンは、以下のようなコンセンサスを、有利に有する：コンセンサス配列１１（図１４を参照なこと。有利に存在する全てのアミノ酸に、下線を付す；コンセンサス構造９および１０、ならびに上記の情報に従うさらなる好ましいアミノ酸の組み合わせ）：
（コンセンサス配列、配列番号１１）（図１４）：
【０１７５】
【化８】
【０１７６】
（２．特に好ましい変異の組み合わせ）
単一の変異体の以下の組み合わせは、特に有利であることが判明した：
野生型アドヘシン ＤｒａＥの変異誘発は、改善された変異体Ｔ８８Ｍ（例示的実施形態１を参照のこと）を生じ、テンプレートとしてこの変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ（Ｎ７７Ｋ）を用いたさらなるラウンドの変異誘発により、さらに改善された変異体が検出された（例示的実施形態２〜２６を参照のこと）。従って、例えば、多重変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ（Ｎ７７Ｋ） Ｉ１１１Ｈを生成した。これは、野生型アドヘシンＤｒａＥおよび上記ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ変異体と比較して、明らかにより高いＣＥＡ親和性を示す。
【０１７７】
別の例は、構築物ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｑ３４Ｌ Ｎ８４Ｓであり、これは、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ８４Ｓより高いＣＥＡ親和性を有する（例示的実施形態１７を参照のこと）。組み合わせ変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｇ１１８Ｓ Ｉ８５Ｌはまた、変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｇ１１８Ｓと比較して、より高いＣＥＡ親和性を有する（例示的実施形態２６）。
【０１７８】
組み合わせ変異体Ｆ１００Ｓ Ｔ１１Ｉ Ｄ３７Ｇは、Ｆ１１０Ｓと比較して、増大したＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態２０を参照のこと）。これはまた、組み合わせ変異体Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉについても事実であり、Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉは、Ｆ１００Ｉと比較して増大したＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態２０を参照のこと）。組み合せ変異体Ｔ９５Ｅ Ｔ１２３Ｉをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｔ９５Ｅ変異体よりも高いＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態１９を参照のこと）。
【０１７９】
結論として、本発明の目的は、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対する親和性に関して、改善されたアドヘシンリガンドの好ましい実施形態を規定することによって解決される。その実施形態は、各場合において、コンセンサス配列１において列挙された単一変異体の任意の考えられる組み合わせを有する。
【０１８０】
列挙された例示的実施形態は、本明細書で使用される上記ｎＨｙｂｒｉｄ／Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法が、反復サイクルを行うことによって、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対して増大した親和性を有する組み合わせ変異体を生成するのを可能にすることを実証する。
【０１８１】
（３．多重変異誘発）
これらの実験を、ｎＨｙｂｒｉｄシステムにおいて行った（ＥＰ１７２１９７４ Ａ１）。
【０１８２】
第１に、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋ Ｉ１１１Ｖ（ＴＭ＝三重変異体）を、変異誘発テンプレートとして使用し、第２に、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋ Ｉ１１１Ｖ Ｉ１１４Ｖ Ｖ１１６Ａ（ＦＭ＝「Ｆｕｅｎｆｆａｃｈｍｕｔａｎｔｅ」［五重変異体］）を使用した。これは、さらに高いＣＥＡ親和性を有する。
【０１８３】
（例示的実施形態２７−３９位−アラニン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｇ＞Ｄ＝Ｈ＞Ｑ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｑ＞Ｓ＞Ｄ＞Ｍ＞Ｇ＞Ｆであった。このことは、上記ＴＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、３９位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１８５】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｑ＞Ｓ＞Ｄ＞Ｍ＞Ｇ＞Ｆであった。このことは、上記ＦＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、３９位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１８７】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｓ＞Ｇ＞Ｄ＝Ｈ＞Ｑ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｓ＞ＷＴ
（例示的実施形態２８−４１位−イソロイシン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞Ｌ＞Ｔ＞ＷＴ
これは、上記ＴＭをテンプレートとして使用してもなお、この部位における変異が、ＣＥＡ親和性をさらに改善することを意味する；この場合において、変異体の範囲（Ｍｕｔａｎｔｅｎｓｐｅｋｔｒｕｍ）は、テンプレートとしてＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋを用いたときと同じように現れる。この事実は、上記ＴＭにおける構造的改変は、アミノ酸４１位に大きな影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１８９】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｌ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、わずかに改善された変異体としてＬが検出された；Ｖは、最良の変異体であった。このことは、上記ＦＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４１位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９１】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｖ＞Ｌ＞Ｔ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態２９−４７位−グルタミン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ａ＞Ｃ＞Ｔ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｔ＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴであった。このことは、上記ＴＭは、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４７位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９３】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｔ＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴであった。このことは、上記ＦＭは、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４７位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９５】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｓ＞Ａ＞Ｃ＞Ｔ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｓ＞ＷＴ
これらの列挙された例示的実施形態は、本明細書で使用される上記ｎＨｙｂｒｉｄスクリーニング法が、反復サイクルを行うことによって、増大したＣＥＡ親和性を有する組み合わせ変異体を生成するのを可能にすることを再び実証した。
【０１９６】
（３．ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）による、本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子の、インビボ分解の分析）
この研究の目的は、選択したマウス器官における、ジペプチドコーティングしたナノ粒子（コア：ＣｄＳｅ、シェル：ＺｎＳ、最大発光：６５５ｎｍ、流体力学的直径はタンパク質リガンドなしで約１２．５ｎｍ）の生物学的分解を検出することであり、これは、体重１ｋｇあたり１．７ｍｇの用量で蛍光ナノ粒子結合体を静脈内注射した後に、２日目の蛍光と４２日目の蛍光とを比較することによって行った。
【０１９７】
（方法）
６匹のＮＭＲＩマウスに、体重１ｋｇあたり１．７ｍｇの上記蛍光ナノ粒子結合体（ＱＤ６５５＃Ｄ４１６−３６−ＫＮＨ−タンパク質リガンドクローン５５８２（「Ｆｕｅｎｆａｃｈ−Ｍｕｔａｎｔｅ」ＦＭ［五重変異体］、上記を参照のこと））を、尾静脈を介して注射した。上記マウスを、注射後２日目および４２日目にそれぞれ屠殺し、その器官を取り出し、−８０℃で急速冷凍した。
【０１９８】
（サンプル調製）
２００ｍｇの特定の器官を秤量し、クリオチューブ（Ｃｒｙｏｒｏｅｈｒｃｈｅｎ）中で、１ｍｌの５００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ＝８．３）および１ｇのホモジナイゼーションビーズ（ＭａｔｒｉｘＤ ｆｒｏｍ ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、Ｆａｓｔｐｒｅｐ２４（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）ホモジナイザーを使用し１分間ホモジナイズした。そのホモジネートを、氷上に置いた。
【０１９９】
サンプル包埋ミックス（全て容量（μｌ単位））
【０２００】
【表１】
【０２０１】
上記ＢＳＡ溶液を、エッペンドルフ容器に入れ、続いて、上記ホモジネートを添加し、そしてこのサンプルを、氷上で２分間にわたって冷却した。これに続いて、グルタルアルデヒド溶液を添加し、迅速に混合した。各場合において、上記サンプルのうちの２００μｌを、カバースリップが底にあるマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルにピペットで入れた。グルタルアルデヒド固定には、数分間かかり、数分間後、固体ゲルになった。
【０２０２】
（生データの測定）
顕微鏡観察を、６０×／１．２Ｗレンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ Ｓｃａｎ＾Ｒシステムを用いて行った。上記サンプルの画像を、Ｓｃａｎ＾Ｒ Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアを使用して取得した：１サンプルあたり（＝１ウェルあたり）１６スタック（Ｓｔａｐｅｌ）を、各場合において、１スタックあたり４０フレームで記録した。フレームは、０．５μｍ間隔であった。上記画像を、並行して２チャネルで撮った：ナノ粒子チャネル（吸収フィルタ（Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓｆｉｌｔｅｒ）６５５／１６）における露出時間は、２００ｍｓであり、自動蛍光チャネル（吸収フィルタ５２５／３０）では、１０００ｍｓであった。
【０２０３】
画像領域およびボリュームに関する情報は、以下のとおり。
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
（生データの評価）
上記ナノ粒子を、Ｓｃａｎ＾Ｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによって定量した。まず、上記スタックの最大投射（Ｍａｘｉｍａｌｐｒｏｊｅｋｔｉｏｎ）を、平面上にｚ軸に沿って生成し、続いて、ローリングボールによって平滑化を行い、最後に、重み付けした自動蛍光チャネルを、ナノ粒子チャネルから差し引いた。セグメント化のための強度閾値を、４３に設定した。
【０２０６】
見いだされた上記ナノ粒子を、ゲーティングによって３つのカテゴリー（小、中、大）に分けた。その基準は、平均強度（６０〜４００の範囲のグレースケール値）によって定義される感知できるコリドー（ｓｉｎｎｖｏｌｌｅｎ Ｋｏｒｒｉｄｏｒｓ）内における、見いだされた上記ナノ粒子の面積である。上記ゲートは矩形であり、かつ以下のように定義した：
小：４〜３５ピクセル
中：３６〜４００ピクセル
大：４０１〜１０００００ピクセル。
【０２０７】
大部分の物体を、小ゲートにおいて見いだした。最も少ないのは、大ゲートにおいてであった。
【０２０８】
大および中〜大の大きさの凝集物の出現のため、正確な定量の提示が不可能である。なぜなら、各凝集物を形成する個々のナノ粒子の数を、正確に決定できないからである。しかし、上記ナノ粒子分布および薬物動態に関する定性的な提示を、凝集物中のナノ粒子に数に概して比例する無次元パラメーターとして、その蛍光を介して行い得る。
【０２０９】
無次元蛍光の計算：
物体の数に、ナノ粒子の粒状クラスの平均総強度（物体あたりの平均総蛍光強度）を乗算する：
物体×平均強度＝蛍光
２日目および４２日目の肝臓、脾臓および肺からのホモジネートの蛍光を計算し、その平均を決定した。２日目の蛍光を、各場合において１００％に正規化した。
【０２１０】
上記の結果を、図１６にまとめる。これによれば、２日目と比較して４２日目で、肝臓においては蛍光の０．５４％のみが、脾臓においては蛍光の４．９７％のみが、肺においては蛍光の１８．６６％のみが検出可能であった。このことは、本発明のアドヘシン連結ナノ粒子が、インビボで分解されることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化されたアドヘシンおよび上記アドヘシンが結合したナノ粒子に関する。本発明はさらに、上記ナノ粒子を、インビボ造影剤として、特に、腸の癌の診断のために提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患について、可能な限り早期でかつ有意義な診断は、必要な医療手段を選択し、そして調整して行うために、決定的に重要である。これは、特に、その決定および治療のために健康な組織と発癌組織との間を識別することが必須である多くの種類（あり得る部分を含む）の腫瘍に当てはまる。よって、患者の回復もしくはさらには生存は、処置および／もしくは手術を担当している医師が、異なるタイプの組織を区別し得るか否かもしくは区別し得る程度に決定的に依存する。
【０００３】
診断および医療の手段を改善するために、過去に造影剤が開発されてきた。画像化剤は、画像化プロセスによって、身体における可視の機能および構造を作製するのを補助し得る。これらプロセスは、特に、癌関連の細胞変化を特異的に検出するために使用される。
【０００４】
特許文献１のＡ３は、例えば、少なくとも３つの構造（すなわち、不動態化層でコーティングされている無機コアであって、さらに上記不動態化層が特異的リガンドを有する、無機コア）を含む蛍光性ナノ粒子を開示する。これらリガンドは、上記ナノ粒子が標的に特異的に結合することを可能にする。上記標的は、特に、標的細胞の特異的表面分子（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。
【０００５】
この印刷された刊行物によって開示される、コアおよび周囲の不動態化層を有する上記ナノ粒子は、好ましくは、５ｎｍと１５ｎｍとの間である小さな流体力学的直径を有する。このサイズのナノ粒子は、腎臓を介して排出（ａｕｓｇｅｓｃｈｉｅｄｅｎ）され得、従って、身体に蓄積しないか、または多くても、許容可能な量においてしか、身体に蓄積しない。これは、ナノ粒子を医療目的に使用するための重要な要件のうちの１つである。
【０００６】
別の要件は、身体中の選択された標的構造を認識するナノ粒子に結合されるリガンドの高い選択性である。高い特異的認識のみが、造影剤の医療的使用の主目的である検出を可能にする。これら非常に特異的なリガンドは、同時に、上記ナノ粒子の良好な分布および浸透を妨げないように小さくなければならない。頻繁に使用される特異的リガンド（例えば、抗体もしくはＦａｂフラグメント）は、この要件を満たすためには、通常は大きすぎる。
【０００７】
工業国における腸癌の新たな症例数は、最近３０年間にわたって大きく上昇した。年間発生数は、１０００００名の居住者につき３０〜３５名の新たな症例であり、腸癌は、中央ヨーロッパで最も一般的な悪性腫瘍のうちの１つであり、全ての癌による死亡のうちの約１５％の原因である。世界的な発生数は、１年あたり１００万の新たな症例と見積もられる。男性は、女性よりわずかに多く罹患しており、特に、直腸癌腫においてそうである（性別比 ６０：４０）。
【０００８】
ドイツにおいては、腸癌は、新たな症例ならびに男性および女性における癌による死亡の両方で、２番目に多い一般的な癌の形態であり、２００５年には、２００００名を超える人々が死亡した。「Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｄｅｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅｎ Ｋｒｅｂｓｒｅｇｉｓｔｅｒ ［Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｓｔｅｒｓ］」は、１年あたりほぼ３００００名の死亡者がいるとすら想定している。
【０００９】
腸癌とは、腸の任意の悪性腫瘍をいう。それらは、腸粘膜の平滑筋および／もしくは結合組織に由来する、類癌腫（特に、虫垂および小腸における）、平滑筋肉腫および消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅ Ｓｔｒｏｍａｔｕｍｏｒｅｎ）（ＧＩＳＴ）であり得る。しかし、これら疾患はかなり稀であり、全ての腸癌症例のうちのわずかな割合に相当するに過ぎない。全ての腸癌症例の断然最大の部分（９５％を超える）は、盲腸、結腸もしくは直腸の腺癌によって代表され、これに関して、包括的な用語結腸直腸癌もまた、使用される。
【００１０】
腸癌（特に、結腸直腸癌腫）は、最初は極めて稀にしか症状を引き起こさず、そしてほぼ常に、最初は良性の腸ポリープから発症する。平均して４０〜６０％の５年生存率で、手術およびその後の化学療法によって治癒する可能性は、上記腸癌が診断される病期に決定的に依存する。従って、予防的措置および同様に早期の診断は、特に重要である。後者は、腸癌細胞（特に、ＣＲＣ（結腸直腸癌細胞））の早期検出によって可能である。
【００１１】
ＣＲＣの検出は、上記細胞に特異的な標的であって、可能であれば、上記腫瘍中で過剰発現される標的を必要とする。ＣＥＡＣＡＭファミリー（ＣＥＡ関連細胞接着分子；ＣＥＡ＝癌胎児性抗原）のメンバーは、ＣＲＣ細胞において上方調節された発現を有すると報告されている。従って、ＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーは、ＣＲＣ検出のための標的として特に適している。それらとしては、特に、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）およびＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６）が挙げられる。
【００１２】
上記ＣＥＡＣＡＭファミリーは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。各ファミリーメンバーは、高度にグリコシル化されており、かつＮ末端Ｉｇ可変様ドメインからなり、その下流に、最大６個のＩｇＣ２ドメインが存在する。ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ４は、細胞膜中のカルボキシ末端膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを介して挿入されるのに対して、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８は、膜上のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介してアンカーされる（ｖｅｒａｎｋｅｒｔ）。この群内のＮ末端ドメインは、アミノ酸レベルにおいて９０％より高い類似性を有する。
【００１３】
ＣＥＡおよびＮＣＡは、結腸組織中の円柱上皮および杯細胞に存在する。それらは、成熟腸細胞の先端表面に位置し、それはグリコカリックス／微絨毛領域に存在する。ＣＥＡＣＡＭは、細胞間接着分子として作用する。正常結腸上皮細胞における、ＣＥＡＣＡＭのこの厳密に先端での局在は、腺癌細胞において見捨てられてきた（従って、上記タンパク質は、細胞表面全体で発現される）。細胞組織化および細胞極性は、ＣＲＣ細胞において破壊され、従って、例えば、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡは、細胞表面全体に位置して見いだされ得る。ＣＥＡは放出され得、それによって、血流に入り、従って、血清腫瘍マーカーとして検出され得る。
【００１４】
これらレセプターについて報告されたリガンドは、とりわけ、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌のＤｒファミリーのアドヘシン（Ａｆａ／Ｄｒアドヘシン、ＤｒＣＥＡサブファミリー）である。これらアドヘシンは、拡散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）株の（線毛中の部分的に組織化された）細菌表面に位置し、そしてその上皮細胞への接着を媒介する。このファミリーのメンバーは、例えば、ＡｆａＥ−Ｉ、ＡｆａＥ−ＩＩＩ、ＡｆａＥ−Ｖ、ＤｒａＥおよびＤａａＥである。
【００１５】
Ａｆａ／Ｄｒ アドヘシンをコードする構造的アセンブリ遺伝子は、類似の構成を有する。これらは、少なくとも５つの遺伝子（Ａ〜Ｅ）を含むオペロンからなる。ここで遺伝子Ａ〜Ｄはアクセサリ遺伝子をコードし、遺伝子Ｄはインベイジン（Ｉｎｖａｓｉｎ）をコードする。遺伝子Ｅは、実際のアドヘシンをコードする。
【００１６】
上記遺伝子クラスターは、高度に保存された領域を有し（例えば、遺伝子ａｆａＡ、ａｆａＢ、ａｆａＣ、ａｆａＤおよびａｆａＦ）、これは、例えば、調節機能もしくはシャペロン機能を有する。上記構造的ＡｆａＥコード遺伝子は、非常に不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ）であり、抗原的に異なるアドヘシンが生成される。
【００１７】
アドヘシンのＡｆａ／Ｄｒファミリーのこれらのメンバーを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌は、ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞に接着する（非特許文献１）。さらに、アドヘシンはまた、非特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５７１８２号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｒら，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｂｙ Ａｆａ／Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ａｆａ／Ｄｒ ＤＡＥＣ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００４）５２（４），ｐｐ．９６３−９８３
【非特許文献２】Ａｌａｉｎ Ｌ．Ｓｅｒｖｉｎ「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｆａ／Ｄｒ Ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ Ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００５年４月）１８（２），ｐｐ．２６４−２９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかし、これら公知のアドヘシンは、それらのＣＥＡ親和性に関して、なお不十分である。従って、ＣＲＣ細胞に対して高い親和性を有するアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメント（「アドヘシン構築物」）を提供することが、本発明の目的である。この目的に関して、それらは、可能であれば、公知の野生型アドヘシンを超える改善されたＣＥＡ親和性を有するべきである。
【００２１】
さらに、造影剤を提供するために利用され得るナノ粒子にリガンドとして結合されるのに適したアドヘシンおよび／もしくはアドヘシンフラグメントを提供することは、本発明の目的である。上記ナノ粒子は、好ましくは、医学的に、特に好ましくは、インビボ造影剤として使用可能であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この目的は、それぞれの野生型アドヘシンアミノ酸配列、好ましくは、ＤｒａＥ野生型配列と比較して、変異によって改変されたアドヘシンもしくはアドヘシンフラグメントを提供することによって、達成される。上記改変は、有利なことには、上記ＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバー（特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡ）に対する、本発明のアドヘシンの改善された親和性を生じる。本発明のアドヘシンおよびアドヘシンフラグメントはまた、本明細書中以下で、「改変された」もしくは「最適化された」アドヘシンとして包括的に言及される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤｒａＥの配列番号１。
【図２】ＡｆａＥ−５、ＤｒｂＥ−１２２、ＤｒａＥ、ＳＭ２５４、ＤａａＥ；ＡｆａＥ−２、ＡｆａＥ−１およびＮｆａＥ−１１１のアラインメント。
【図３】配列番号２。
【図４】Ｇ２１５２、ＳＭ２９７、ＪＪＢ３０、ＳＭ４３７、ＳＭ２４９、ＳＭ２４６、ＳＭ２４５、ＳＭ５４、Ｇ２１７１、Ｇ２１６６、Ｇ２１０６、Ｇ２１０２、Ｇ２０９７、Ｇ２０９６、ＤｒａＥ、Ｇ２０９９、Ｇ２１００、ＳＭ２５２、ＪＪＢ１７、ＳＭ２９３、Ｇ２０７６、ＳＭ５１３、ＡＦａＥ−ＩＩＩのアラインメント。
【図５】配列番号３。
【図６】配列番号４。
【図７】配列番号５。
【図８】ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ ５）、ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ ６）、ＣＥＡＣＡＭ １、ＣＥＡＣＡＭ ３、ＣＥＡＣＡＭ ４、ＣＥＡＣＡＭ ７およびＣＥＡＣＡＭ ８のアラインメント。
【図９】配列番号６。
【図１０】配列番号７。
【図１１】配列番号８。
【図１２】コンセンサス配列（配列番号９）。
【図１３】コンセンサス配列（配列番号１０）。
【図１４】コンセンサス配列（配列番号１１）。
【図１５】配列番号１２。
【図１６】ハイコンテントスクリーニングによる、本発明に従って使用可能なナノ粒子の、インビボ分解の分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記最適化されたアドヘシンは、以下の変異のうちの１つ以上を含む（ここでアミノ酸位置の番号付けは、ＤｒａＥ野生型アミノ酸配列に基づく；ＤｒａＥの配列番号１（図１）もまた参照のこと）。
【００２５】
【化１】
【００２６】
しかし、Ｔ８８Ｍおよび／もしくはＮ７７Ｋが存在する場合、本発明のアドヘシンは、前述の変異のうちの少なくとも１つの他のものを有さなければならない。これは特に、ＤｒａＥ群のアドヘシンに存在する変異に当てはまる。
【００２７】
好ましい変異は、Ｖ２８Ｗ；Ｖ２８Ｆ；Ａ３９Ｑ；Ａ３９Ｓ；Ｉ４１Ｌ；Ｑ４７Ｓ；Ｑ４７Ｔ；Ｉ８５Ｌ；Ｔ９５Ｌ；Ｇ１１８ＳおよびＴ１２３Ｉである。
【００２８】
本発明の目的に関して、「アドヘシン」とは、原則として、上記ＣＥＡＣＡＭファミリーのレセプター（本明細書中以降、結合タンパク質ともいう）のＮ末端ドメインに、特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合し得る任意のタンパク質をいう。これらは、「アドヘシン群」のアドヘシン、「ＤｒａＥ群」、ならびに特に、タンパク質ＤｒａＥおよびＡｆａＥ−ＩＩＩを包含する。これらはまた、上記アドヘシンに由来するコンセンサス配列を有するタンパク質を包含する。
【００２９】
本発明に従うアドヘシンは、好ましくは、１３９アミノ酸の配列、および１７ｋＤａのサイズを有する。しかし、これらはまた、ＣＥＡＣＡＭに、特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合する能力の喪失を生じない限りにおいて、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失を有し得る。上記Ｃ末端欠失は、可能であったとしても、５アミノ酸、８アミノ酸、でなければ多くても１０アミノ酸を超えるべきではない。上記Ｎ末端欠失は、最大１８アミノ酸までであり得る。しかし、任意のより短い欠失（例えば、５アミノ酸、８アミノ酸もしくは１０アミノ酸の欠失）もまた、可能である。本発明の一実施形態において、従って、上記アドヘシンは、１１１アミノ酸長である。
【００３０】
上記「アドヘシン群」は、ＡｆａＥ−５、ＤｒｂＥ−１２２、ＤｒａＥ、ＳＭ２５４、ＤａａＥ；ＡｆａＥ−２、ＡｆａＥ−１およびＮｆａＥ−１１１からなる（これに関連して、図２；アラインメントもまた参照のこと）。本発明によれば、これらは、配列番号２（図３）によるコンセンサス配列、および上記の変異のうちの１つ以上を有する。
【００３１】
同じことが、以下のタンパク質（これに関連して、図４、アラインメントもまた参照のこと）：Ｇ２１５２、ＳＭ２９７、ＪＪＢ３０、ＳＭ４３７、ＳＭ２４９、ＳＭ２４６、ＳＭ２４５、ＳＭ５４、Ｇ２１７１、Ｇ２１６６、Ｇ２１０６、Ｇ２１０２、Ｇ２０９７、Ｇ２０９６、ＤｒａＥ、Ｇ２０９９、Ｇ２１００、ＳＭ２５２、ＪＪＢ１７、ＳＭ２９３、Ｇ２０７６、ＳＭ５１３、ＡＦａＥ−ＩＩＩからなる「ＤｒａＥ群」に当てはまる。これらは、配列番号３（図５）によるコンセンサスを有する。一実施形態において、本発明は、よって、上記の変異のうちの１つ以上を有する配列番号３を有するアドヘシンに関する。
【００３２】
配列番号４（図６）によるコンセンサスを有するアドヘシンが、特に好ましい。後者は、ＤｒａＥおよびＡｆａＥ−ＩＩＩのアラインメントから得られる。特に好ましいのは、ＤｒａＥである。
【００３３】
本発明のアドヘシンは、ＣＥＡＣＡＭ群のタンパク質のＮ末端配列に結合し、これは、好ましくは、配列番号５（図７）によるコンセンサス配列である。この群のメンバーは、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ ５）、ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ ６）、ＣＥＡＣＡＭ １、ＣＥＡＣＡＭ ３、ＣＥＡＣＡＭ ４、ＣＥＡＣＡＭ ７およびＣＥＡＣＡＭ ８である（図８もまた参照のこと）。本発明のアドヘシンは、好ましくは、ＣＥＡおよびＮＣＡのアラインメントから得られる配列番号６（図９。ＣＥＡのみを含む領域に下線が付される）を有するタンパク質のＮ末端配列に結合する。一実施形態において、本発明のタンパク質は、ＣＥＡ（配列番号７、図１０）およびＮＣＡ（配列番号８、図１１）のＮ末端ドメインに結合する。
【００３４】
好ましい実施形態において、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに結合する、ＤｒａＥ（配列番号１）による上記改変されたアドヘシンは、上記の変異のうちの１つを有する。結論として、以下のように、配列番号９によるコンセンサス配列（アラインメント、図１２）を有するアドヘシンが好ましい：
【００３５】
【化２】
【００３６】
さらなる実施形態において、上記アドヘシン（特に、ＤｒａＥ由来のアドヘシン）は、配列番号１０によるコンセンサス配列（アラインメント、図１３を参照のこと）を有する：
【００３７】
【化３】
【００３８】
別の実施形態において、上記アドヘシン（特に、ＤｒａＥ由来のアドヘシン）は、以下のコンセンサス配列（配列番号１１、図１４）を有する：
【００３９】
【化４】
【００４０】
上記コンセンサス配列（配列番号９、配列番号１０および配列番号１１として規定される）は、配列番号１に従う番号付けに基づく。ここでまた、上記の欠失は、上記アドヘシンの、ＣＥＡＣＡＭメンバー（特に、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡ）への結合を不可能にしない限りにおいて、Ｎ末端および／もしくはＣ末端において存在し得る。
【００４１】
特定の実施形態において、配列番号１に従うアドヘシンであって、以下の変異（すなわち、Ｎ７７Ｋ、Ｔ８８Ｍ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１１４ＶおよびＶ１１６Ａ）を含む、アドへシン（本明細書中以下、「Ｆｕｅｎｆｆａｃｈ−Ｍｕｔａｎｔｅ」［五重変異体］、ＦＭともいう；配列番号１２、図１５）が好ましい。
【００４２】
当業者は、原則として、アドヘシンモノマーの調製に精通している。組換えタンパク質ＡｆａＥ−ＩＩＩ−ｄｓｃにおいて、例えば、Ｎ末端架橋セクションＧは、Ｃ末端へとクローニングされ、リンカーは、ＦとＧとの間に導入される。次いで、セクションＧは、上記リンカーを超えて反対側に折り返り、そして今度はＮ末端セクションＡ１に結合し、それによって、上記モノマー構造を安定化する。次いで、ＡｆａＥ−ＩＩＩ−ｄｓｃのこのモノマー構造は、ゲル濾過によって検出され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２００４からの図１Ｃを参照のこと）。
【００４３】
Ｐｉａｔｅｋら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）７３（１） ｐｐ．１３５−１４５，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｄｒ Ｆｉｍｂｒｉａｅ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤｒａＢ−ＤｒａＥ−Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」）は、モノマーアドヘシンを生成する別の可能性を記載している。彼らは、アドヘシンのＮ末端から様々な数のアミノ酸を除去し、これにより、モノマータンパク質を得ている。（Ｐｉａｔｅｋら，２００５からの図２を参照のこと）。これら公知の方法はまた、本発明に従って改変されるアドヘシンにも基本的に適用可能である。
【００４４】
改変されたアドヘシンを得るために、野生型アドヘシンが、変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチドベースの、部位特異的変異誘発（例えば、ＥＰ１７７７２９２ Ａ１））に供され得る。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明のアドヘシンは、さらなる変異誘発のためのテンプレートとして、ＤＡＦ（崩壊促進因子、ＣＤ５５）に対する減少した親和性を有するアドヘシン構築物を使用することによって調製され得る。これの例は、Ｎ７７Ｋ変異である（ｖａｎ Ｌｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４５（２），ｐｐ．４３９−４５２，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ」）。
【００４６】
上記変異誘発によって生成されるライブラリーは、その標的と一緒に酵母へと形質転換され得、そのレポーター遺伝子の読み取り値が検出され得る（これに関連して、以下の例示的実施形態もまた参照のこと）。これは、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対して改善された親和性を有する本発明のアドヘシンが同定されることを可能にする。
【００４７】
本発明のアドヘシンは、ナノ粒子に結合され得る。後者は、好ましくは、ＣＲＣ細胞を検出するためのインビボ造影剤として使用され得る。ＷＯ ２００７／０５７１８２ Ａ３は、有利なナノ粒子を開示する。その内容全体は、上記ナノ粒子の調製および使用の開示を目的として、本明細書に参考として援用される。上記ナノ粒子は、特に、その流体力学的直径が１５ｎｍを超えずかつ生物学的系において不活性でないものである。
【００４８】
本発明のナノ粒子は、少なくとも３つの構造体（すなわち、不動態化層でコーティングされている無機コアであって、さらに上記不動態化層が特異的リガンドを有する、無機コア）を含み、ここで上記特異的リガンドはまた、上記不動態化層の一部であり得る。上記リガンドは、上記生物学的な系の標的に特異的に結合するナノ粒子を生じる。
【００４９】
好ましいナノ粒子において、上記無機コア（上記無機コアを囲む上記不動態化層を含む）は、１５ｎｍ以下、可能であれば、好ましくは、１０ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。特に好ましいのは、８ｎｍ以下もしくは５ｎｍ以下の流体力学的直径である。これは、球状のナノ粒子に特に当てはまる。このサイズのナノ粒子は、腎臓を介して排出され得、従って、身体に蓄積しないか、または多くても、許容可能な量でしか蓄積しない。このことは、インビボ適用を可能にする。これは、特に、５ｎｍ以下の流体力学的直径を有するナノ粒子に当てはまる。
【００５０】
代替の実施形態において、上記ナノ粒子はまた、桿状であり得る。この実施形態において、これは、上記桿体の直径が上記の制限１５ｎｍを超えない場合に、有利である。ここでまた、身体からの排出を促進するために、５ｎｍ、８ｎｍ、もしくは１０ｎｍの範囲内の直径が好ましい。従って、例えば、本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子は、８×１５ｎｍの長さ／幅寸法を有し得る。
【００５１】
本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子は、好ましくは、６００〜７００ｎｍの間、例えば、６２０ｎｍ〜６６０ｎｍの間、特に好ましくは、約６２５ｎｍもしくは６５５ｎｍの波長において最大発光を有する。上記発光は、ヒトの目で容易に見え、従って、このようなナノ粒子は、医療的介入のための造影剤として、直接的に使用され得る。結論として、補助的光学装置が、いくつかの環境において不要になり得る。
【００５２】
代替の実施形態において、上記の流体力学的直径を超えるナノ粒子は、上記粒子が、インビボで不活性でないことが保証される限りにおいて、本発明に従って使用され得る。後者は、上記粒子が生分解性であるため、そしてその結果として、最初に粒状物としてそこに結合された金属（例えば、Ｃｄ）は、イオン性形態に変換されるための前提条件である。この分解生成物は、腎臓を介して排出され得る。
【００５３】
イミダゾール成分を含む不動態化層を有する無機ナノ粒子は、実際には、（以前に実証されたように）インビボで不活性ではなく、これらの条件下で分解される。従って、上記ナノ粒子は、インビボ適用に特に関連する、生分解性の基準および分解生成物の腎通過の基準を満たす。このことは、驚くべき知見であった。なぜなら、上記不動態化層は、特に、上記ナノ粒子の化学的安定性および／もしくは物理的安定性を増大するようにも作用するからである（これに関連して、以下のさらなるコメントも参照のこと）。従って、一方では、良好な診断に必要とされる上記ナノ粒子の安定性と、他方では、「大きな」粒子の腎通過に必要とされる生分解性との間の関係は、インビボ造影剤としての使用に適している。
【００５４】
上記不動態化層の主要な課題は、上記無機コアの蛍光強度、ならびに化学的安定性および物理的安定性を増大することである。上記不動態化層によってコーティングされた上記無機コアは、少なくとも１０％、有利なことには、少なくとも３０％、５０％もしくはさらに７０％の量子収率によって特徴付けられる。量子収率は、本明細書で、上記サンプルによって発せられる光の量の、サンプルによって吸収される光の量に対する比を意味する。有利なことには、上記不動態化層は、１ｎｍ以下の厚みを有する。この場合、上記不動態化コアの直径の増加は、２ｎｍ以下であった。
【００５５】
有利なことには、上記ナノ粒子にはまた、各場合において、特に、生物学的環境との適合性を改善するために、モディファイアー（Ｍｏｄｉｆｉｋａｔｏｒｅｎ）が提供される。好ましくは、モディファイアーの使用に起因するその流体力学的半径の増加は、２ｎｍを超えない。特定の場合において、上記不動態化層および上記モディファイアーの厚みはまた、上記２つの構造体の互いの中での関係、および上記無機コアに対する関係に依存する。
【００５６】
本発明のナノ粒子は、上記のようにサイズが制限される場合、生きている患者における診断剤としての使用に特に適している。従って、サイズ縮小は、組織への拡散速度および浸透の深さを増大させる。このことは、上記ナノ粒子を、均一にかつ迅速に生物学的環境において拡散させること、ならびに局所投与後、組織（例えば、腫瘍）のできるだけ遠くまで浸透させることを可能にする。本発明のナノ粒子は、同様に、注射によっても行われ得る全身投与を可能にする。しかし、局所投与（例えば、表面適用または腫瘍の処置のための腫瘍内投与もしくは腫瘍周辺（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｅ）投与）もまた、可能である。
【００５７】
上記改変されたアドヘシンに連結された上記ナノ粒子を含む本発明の特に有利な実施形態は、８ｎｍ以下、特に好ましくは、４ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。この規模のナノ粒子は、腎臓を介してすぐに排出され得、従って、身体に蓄積しないか、または非常に少ない程度でしか蓄積しない。結果として、本発明のナノ粒子は、公知の量子ドットとおそらく関係する長期の毒性という問題をかなり減少させる。
【００５８】
上記ナノ粒子は、特に好ましくは、６００〜６６０ｎｍの間での最大発光、特に好ましくは、６２０〜６６０ｎｍの間での最大発光を有する、６００〜７００ｎｍの間の蛍光スペクトルを、有利なことに発光する。上記発光スペクトルは、ヘモグロビンおよび生体系における他の光吸収物質（水を含む）によって、ごく少量しか吸収されないため、組織透過が非常に高いという利点を有する。これら波長の光は、ヒトの目によってなお感知され得、従って、処置を担当している医師が、さらにいかなる複雑な技術的検出補助物（例えば、ＣＣＤカメラ）をも使用せずに、標識した組織を同定することを可能にする。このことは、ＣＥＡ発現細胞および／もしくはＮＣＡ発現細胞を同定するための、特に、発癌組織と健康な組織とを区別するための、外科的介入中に、造影剤として本発明のナノ粒子を使用する場合に、特に有利である。
【００５９】
一実施形態において、好ましくは、使用可能なナノ粒子は、例えば、科学的刊行物を参照するＵＳ ２００４／０２４７８６１において記載されるような、（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳもしくはＣｄＴｅの）コアを有する公知のナノ粒子である。本公報はまた、上記コア物質の調製に関する文書（例えば、米国特許第６，１７９，９１２号）を参照する。これら公知のナノ粒子の特性およびその調製の開示に関する、これら文書の全体の内容が参照される。ナノ粒子を調製するための方法は、米国特許第７，１４７，７１２ Ｂ２号においてもさらに開示され、この公報もまた、開示の目的で参照される。
【００６０】
特に有利なことには、上記ナノ粒子の上記無機コアは、本質的に半導体からなる。これらコアは、それらの個々のサイズおよび／もしくは組成に依存して、種々の色の光を発するが、これらコアの全ては、同一範囲の光スペクトル（ＵＶからＶＩＳ範囲まで）内における広域にわたって吸収する。その高いストークスシフトに起因して、励起スペクトルと発光スペクトルとは、非常に離れており、このことは、種々のナノ粒子の単純かつ同時の励起を可能にする。これらは、ごくわずかに重なり合うかもしくは全く重なり合わない、狭く、対称な発光スペクトルを有する。特に、侵入深度の改善（ｖｅｒｂｅｓｓｅｒｔｅ Ｅｉｎｄｒｉｎｇｔｉｅｆｅ）およびインビボ標識のために非常に重要な他の有益な特性は、最大８０％に至る高い量子収率および高い光安定性である。
【００６１】
好ましいナノ粒子は、例えば、ＷＯ ２００５／００１８８９において開示された。それによると、それらは、少なくとも２種の半導体の合金から作製される無機コアを含む。上記半導体は、均一に分布するか、または各場合において、上記合金内で濃度勾配が存在するかのいずれかである。上記ナノ粒子の性質および調製の開示に関し、上記で引用されるＷＯ ２００５／００１８８９が参照される。上記コアは、各場合において、それらのサイズにおいて５％まで異なり得る。
【００６２】
よって、上記ナノ粒子の無機コアは、少なくとも２種の半導体の合金を含み得、ここで上記コアは、均質な組成を有し、上記２種の半導体のモル比に対して非線形的である「バンドギャップエネルギー（Ｂａｎｄ−Ｇａｐ−Ｅｎｅｒｇｉｅ）」によって特徴付けられる。
【００６３】
あるいは、上記コアは、不均一であり得、上記第１の半導体の濃度は、上記コアの中心から始まって上記コアの表面へと徐々に増大しており、上記第２の半導体の濃度は、上記コアの中心からその表面へと徐々に減少している。
【００６４】
両方のコアについて、上記半導体のうちの少なくとも１種は、ＩＩ族−ＶＩ族の半導体もしくはＩＩＩ群−Ｖ群の半導体（族の定義は、元素周期表の族に対応する）である。例えば、上記合金は、以下の合金の群から選択され得る：ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＡｌＡｓ、ＩｎＧａＮ。これらコアは、無機物質（例えば、半導体（例えば、ＺｎＳ））のコーティングをさらに有し得る。このさらなる層は、「キャッピング」もしくは「シェル（ｓｈｅｌｌ）」として、当業者に公知である。
【００６５】
ＩＩ族−ＶＩ族およびＩＩＩ族−Ｖ族の半導体は、一般に公知であり、例として以下が挙げられる：ＣｄＳ１−ｘＳｅｘ、ＣｄＳ１−ｘＴｅｘ、ＣｄＳｅ１−ｘＴｅｘ、ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘ、Ｚｎ１−ｘＣｄｘＴｅ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＳ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＴｅ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＡｓ、Ｇａ１−ｘＡｌｘＡｓおよびＩｎ１−ｘＧａｘＰ。半導体ＣｄＳｅ１−ｘＴｅｘ、ＣｄＳ１−ｘＴｅｘ、ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘ、Ｚｎ１−ｘＣｄｘＴｅ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＳ、Ｃｄ１−ｘＨｇｘＴｅ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＡｓ、Ｉｎ１−ｘＧａｘＰ（ここでｘは、０〜１の分数（Ｆｒａｋｔｉｏｎ）である）を使用することが好ましい。
【００６６】
上記半導体のモル比は、任意のモル比であり得る。しかし、上記合金がＣｄＳＳｅを含む場合、分子式ＣｄＳ１−ｘＳｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＣｄＳＴｅを含む場合、分子式ＣｄＳ１−ｘＴｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＺｎＳｅＴｅを含む場合、分子式ＺｎＳｅ１−ｘＴｅｘを有する合金が好ましい。上記合金がＺｎＣｄＴｅを含む場合、ＣｄＴｅのみの分子式を有する合金が好ましい。これらの場合の各々において、ｘは、０〜１の間の分数である。
【００６７】
上記ナノ粒子のこれら好ましい無機コアは、以下の工程を使用して調製され得る：（ｉ）ナノ結晶の形成を可能にする条件下で、第１の溶液を調製すること、（ｉｉ）ナノ結晶の形成を可能にしない条件下で、一定のモル比を有する上記半導体の前駆物質を含む第２の溶液を調製すること、（ｉｉｉ）上記第２の溶液を上記第１の溶液に添加し、ナノ粒子の形成を可能にすること、および（ｉｖ）上記条件を変更して、上記ナノ結晶の成長および形成を停止させること。上記コアを調製するための方法は、ＷＯ ２００５／００１８８９に例示され、これは、本発明のナノ粒子の無機コアのこの好ましい実施形態の調製の開示に関し、参照される。
【００６８】
代替の実施形態において、上記無機コアは、好ましくは、２個〜２７個の貴金属原子を含む貴金属クラスターから本質的になり得る。好ましい実施形態において、上記貴金属は、金、銀、銅、白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウムからなる群より選択された。上記クラスターは、種々の電荷を有し得る。
【００６９】
これらコアは、それらの吸収および発光が強いので、弱い水銀ランプ励起を用いても個々の「ナノドット」として容易に検出され得るという利点を有する。これらコアを含む本発明のナノ粒子は、有利なことには、蛍光性の個々の分子標識および質量標識として使用され得る。
【００７０】
用語「貴金属」とは、金、銀、および銅、ならびに白金族金属（ＰＧＭ）（白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウム）からなる群より選択される元素の群をいう。本発明の好ましい実施形態において、上記貴金属は、金、銀および銅からなる群より選択される。特に好ましい実施形態において、上記貴金属は、銀もしくは金である。
【００７１】
用語「クラスター」とは、２〜２７個の金属原子の化合物に関する。クラスターは、特に、化学触媒、セラミックス、半導体技術および材料科学の分野から、公知である。従って、当業者は、それらの調製に精通している。ＷＯ ２００４／００３５５８は、特に、貴金属クラスターの調製を記載し、さらに、この主題に関する広範囲なさらなる参考文献を含んでいる。より具体的には、これは、有機分子と会合した貴金属ナノクラスターの調製を開示している。用語、会合とは、ここで、結合の化学的性質にも物理的性質にもかかわりなく、任意の結合形態（従って、例えば、共有結合、非共有結合、静電気結合もしくはファンデルワールス結合）を意味する。本発明のナノ粒子のコアとしての上記ナノクラスターの調製に関して、ＷＯ ２００４／００３５５８が参照される。
【００７２】
好ましくは本発明に従って使用可能である上記ナノ粒子は、蛍光強度を増大し、上記無機コアの化学的安定性および物理的安定性を改善する不動態化層を有する。結果として、上記ナノ粒子は、好ましくは、１０％より大きい、好ましくは、５０％より大きい量子収率で、光を発する。
【００７３】
上記ナノ粒子は、好ましくは、４℃の水性環境において少なくとも１２ヶ月の貯蔵安定性を有し、可能であれば、ｐＨ５〜ｐＨ１０、好ましくは、ｐＨ７〜ｐＨ１０のｐＨ範囲にわたって安定であり、すなわち、上記ナノ粒子は、それらの特定のスペクトル特性（例えば、量子収率，最大発光の位置、発光スペクトルの半値幅）に関して、５０％未満の偏差を示す。好ましい粒子は、これら特定のスペクトル特性に関して、１０％未満の偏差を示す。
【００７４】
本発明の別の実施形態に従って使用可能な上記ナノ粒子は、本質的に、生物学的（すなわち、生理学的）条件下でも、もしくは少なくとも３日間にわたってインビボで、上記コア（これを囲む上記不動態化層を含む）の特性の恒常性／安定性を示す。好ましい粒子は、７〜１４日間にわたって、この種の恒常性／安定性を示し、ここで安定性によって、上記特性のうちの１つの恒常性の少なくとも５０％を保持する。この情報は、特に、実際の標的器官における上記ナノ粒子の安定性に言及する。主に異化機能を有する器官において（例えば、肝臓において）、上記ナノ粒子の安定性が、明らかに低下し得るということは、注目すべきである。このことは、明らかに望ましくすらあり得る。
【００７５】
上記ナノ粒子は、上記の意味において安定であるが、それにも拘わらず、基本的にインビボで分解性であり、結果として、不活性でない。この意味において、「不活性でない」とは、上記ナノ粒子のうちの少なくとも５０％が、投与の１２週間後もしくはこれ以上後では、既に分解されていることを意味する。８週間後、６週間後、もしくは４週間後において既に、少なくとも５０％の分解が検出可能であることが好ましい。身体に残っている上記粒子の検出は、この目的のための、身体器官中および血漿中での検出を含む。よって、「不活性な」とは、上記粒子のうちの５０％より多く、さらには、最大ほぼ１００％までが、投与の４週間後に上記患者の身体中でなお検出可能であることを意味する。
【００７６】
上記ナノ粒子の分解性は、当業者に公知のアッセイによって（すなわち、例えば、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって）、検出され得る。このアッセイはまた、上記サンプルが適切であれば（これについて本明細書以降も参照のこと）、蛍光分光光度測定によって補われ得る。
【００７７】
上記不動態化層は、金属原子もしくは金属イオン（例えば、亜鉛イオン、水銀イオンもしくはカドミウムイオン）を配位し得る少なくとも１種の化合物を含む。この化合物は、ルイス塩基または共鳴電子を有する環式もしくは直鎖状の不飽和化合物であり得る。環式不飽和化合物として、上記化合物はまた、複素環もしくはヘテロ芳香族であり得る。好ましい実施形態において、上記不飽和基もしくは共役基は、上記分子の構造に基づく末端位置にある。上記不動態化層は、架橋剤をさらに有し得、または環式もしくは直鎖状の不飽和化合物はまた、架橋剤として作用し得る。上記架橋剤は、塩基性であり得る。
【００７８】
金属原子もしくは金属イオンを含む配位化合物は、キレート化、配位、もしくはルイス塩基の電子供与特性によって蛍光性無機コアに機能的に結合し得、かつ対応する共役部分／基を有し得る。上記分子は、上記分子でコーティングされている上記コアに水性溶液中での可溶性もしくは湿潤性を付与する特定の部分をさらに含み得る。
【００７９】
上記分子もしくは化合物は、１つ、２つもしくはこれ以上の結合した（もしくはまた、縮合した）環を含む均一なもしくは不均一な（複素環式）環系を含み得る。ヘテロ芳香族系の好ましい例は、チアゾール、チアゾール誘導体、オキサゾール、オキサゾール誘導体、ピロール、ピロール誘導体（ドープされたかもしくは非ドープのポリピロールオリゴマーを含む）、チオフェン、チオフェン誘導体（ドープされたかもしくは非ドープのポリチオフェンを含む）、フラン、フラン誘導体、ピリジンおよびピリジン誘導体、ピリミジンおよびその誘導体、ピラジン、ピラジン誘導体、トリアジンおよびトリアジン誘導体、トリアゾール、トリアゾール誘導体、フタロシアニンおよびフタロシアニン誘導体、ポルフィリンおよびポルフィリン誘導体である。上記化合物としては、アセチレン、プロピンおよびアレンを含み得る不飽和（オレフィン）炭化水素またはそのアミン、リン誘導体もしくは酸素誘導体が挙げられ得るが、これらに限定されない。上記半導体コアの表面で付加物もしくは共鳴の形成に関与するために、十分なｐ−電子密度もしくはπ−電子密度を有する分子が好ましいはずである。
【００８０】
上記ヘテロ芳香族化合物は、好ましくは、イミダゾール成分である。さらに、架橋剤として、ホスフィン化合物、好ましくは、アルキルホスフィン化合物を添加することが好ましい。
【００８１】
用語「イミダゾール成分」とは、本発明の説明の目的において、少なくとも１つのイミダゾール基（イミダゾール誘導体を含む）を含み、かつ上記無機コア、もしくは上記不動態化層（これは、金属（例えば、カドミウム、亜鉛、ガリウムまたは金属カチオンもしくはそのようなカチオンを含む基材）を有する）への結合に利用可能である、複素環式もしくはヘテロ芳香族の分子を意味する。この点について、好ましくは、少なくとも１つのイミダゾール基は、上記分子の構造に基づく末端位置にあるべきである。その機能的形態にある上記イミダゾール成分は、上記蛍光性ナノ結晶に対して、非局在化分子軌道を含む環を介して結合する。通常、上記イミダゾール環の窒素原子は、配位リガンドとして働いて、金属イオン（例えば、カドミウムもしくは亜鉛）を機能的に結合させる。
【００８２】
一実施形態において、上記イミダゾール成分は、反応性官能基（例えば、１個もしくは２個のアミノ酸（例えば、ヒスチジン、カルノシン、アンセリン、バレイン（Ｂａｌｅｉｎ）、ホモカルノシン、ヒスチジルフェニルアラニン、シクロ−ヒスチジルフェニルアラニン、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、ヒスチジルロイシン、２−メルカプトイミダゾール、ｂｏｃ−ヒスチジン、ヒドラジド、ヒスチノール、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、イミダゾリシン（Ｉｍｉｄａｚｏｌｙｓｉｎ）、イミダゾール含有オルニチン（例えば、５−メチルイミダゾール）、イミダゾール含有アラニン（例えば、（β）−（２−イミダゾリル）−Ｌ−（α）アラニン）、カルジニン（Ｃａｒｚｉｎｉｎ）、ヒスタミン）を含む。これらヒスチジンベースの分子もしくはイミダゾール含有アミノ酸は、一般に公知の方法によって合成され得る。
【００８３】
用語「ホスフィン」とは、本発明の目的で、非金属（例えば、Ｓｅ、Ｓもしくは他の非金属）または上記の原子を含む基材を結合もしくはキレート化するための少なくとも１個のホスフィン基（それらの誘導体を含む）を有し、かつ隣り合う分子との反応のための少なくとも１個の官能基（例えば、ヒドロキシル−、アミノ−、チオール−、カルボキシル−、カルボキサミド−など）を提供する分子を意味する。
【００８４】
好ましくは、少なくとも１個のホスフィン基は、上記分子の構造に基づく末端位置に位置すべきである。上記ホスフィン部分は、配位リガンドとして働いて、その機能的形態において、例えば、ＳｅもしくはＳなどの非金属もしくはイオンを、蛍光性コアまたはシールド層からの化合物と結合させる。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記ホスフィン含有化合物は、互いに（例えば、ポリマー形態において）連結した１個、２個もしくはこれ以上のホスフィン基を含み、これらとしては、ヒドロキシメチルホスフィン化合物などが挙げられ得るが、これらに限定されない。ホスフィン含有化合物は、一般に公知の方法によって合成され得る。さらに、アルキルホスフィン含有化合物は、１個以上のさらなる官能基（例えば、ヒドロキシル−、アミノ−、チオール−、カルボキシル−、カルボキサミド−など）も有し得ることが公知である。誘導体の例は、その誘導体化が、本明細書に記載されるコーティングとしてのホスフィンの機能と適合性がある限りにおいて、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、アミドもしくはエステルである。
【００８６】
本発明のナノ粒子の蛍光性無機コアをコーティングするためには、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィンおよびβ−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロパン酸が特に好ましい。架橋されたホスフィン含有化合物は、さらに金属原子および／もしくはイオン（例えば、ＺｎもしくはＣｄ）に機能的に結合し得ることが周知である。この点に関して、官能化されたイソシアネートもしくはアルキルシアノアクリレートは、リガンドにとってのおよび上記蛍光性コアとの付加物形成にとっての架橋剤としてさらに有用であり得る。上記架橋剤はまた、塩基性であり得る。
【００８７】
本発明に従って存在する上記不動態化層の不動態化効果は、ヘテロ芳香族もしくは複素環との（好ましくは、上記イミダゾール成分との）錯体形成による表面のカドミウム原子もしくは亜鉛原子などの遮蔽に、および上記ホスフィン含有化合物との錯体形成を介した対原子（Ｇｅｇｅｎａｔｏｍｅ）（ＳｅもしくはＳなど）の遮蔽に基づく。
【００８８】
本発明のナノ粒子の上記不動態化層は、ＵＳ ２００４／０２４７８６１ Ａ１において開示された。この公開された出願は、上記不動態化層でコーティングされた無機コア（例えば、量子ドット）の調製を記載する。従って、本発明に従って使用される上記不動態化層およびこれらでコーティングされる上記無機コアの調製の開示の目的のため、ＵＳ ２００４／０２４７８６１が参照される。
【００８９】
上記不動態化層の分子は、標的分子および細胞（特異的リガンド）を結合および架橋するために、さらに化学基を有し得る。適切な試薬（例えば、ＺｎＳＯ４およびＮａ２Ｓ）の存在下で、上記分子もしくは化合物は、上記蛍光性コア上の分子と不動態化層を形成し得る（「キャッピング」もしくは「シェル」）。これら試薬はまた、上記蛍光性ナノ結晶の表面上の原子もしくはイオンに機能的に結合し得、結果として、このさらなる不動態化層はまた、上記コアの表面上に直接形成され得る。
【００９０】
有利な実施形態において、本発明のナノ粒子は、有機部分および／もしくは無機部分からなり得るモディファイアーをさらに有し得る。それらは、液体もしくは懸濁媒体中で、特に生理学的環境において、上記ナノ粒子の適合性、効能および／もしくは溶解性を改変するために使用される。この表面改変は、生物系、特にヒトの身体における非常に低い非特異的吸着および増大した適合性を達成するために、特に有利である。
【００９１】
１つの可能性としては、特定の医療適用について既に認可されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で、特に、上記ナノ粒子が小さな全体的サイズを維持するために低分子量形態のＰＥＧで、表面を改変することがある。これによって、上記ナノ粒子の生体適合性と血液循環時間との両方、さらに、細胞への取り込み効率を、増大させ得る。低分子量ＰＥＧ層と他の物質（例えば、ビタミン（例えば、葉酸））との組み合わせは、マクロファージへの上記ナノ粒子の低い取り込みを達成し得る。なぜなら、上記ナノ粒子へのタンパク質吸着は、上記組み合わせによって低下し、これによって免疫系による上記ナノ粒子の認識がより困難になるからである。
【００９２】
モディファイアーを使用することによる別の考えられる有利な表面改変は、１つのタイプのモノサッカリドもしくは種々のモノサッカリドから構成される、モノサッカリド、ジサッカリドもしくはトリサッカリドから低分子量ポリサッカリドまででのコーティングである。考えられる開発の１つのタイプは、ポリグルコースでの改変であり、例えば、ここでデキストランが使用され得、デキストランは、代用血液として医学的に承認されている。これは、良好な生体適合性／寛容性を示す。別の実施形態は、あり得る分解を妨げるための、サッカリドの立体異性形態（Ｄ−／Ｌ−）の使用である。
【００９３】
別の実施形態は、モディファイアーとしての、生物学的に適合性の親水性ビタミンの使用である（例えば、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、コバラミン、パントテン酸、アスコルビン酸および葉酸）。従って、例えば、葉酸は、癌細胞へのナノ粒子の好ましい結合をもたらし得る。このビタミンは、ごく低い免疫原性しか示さず、従って、高い生体適合性を示す。上記ナノ粒子の内在化は、膜結合型葉酸レセプターへの結合によって促進される。
【００９４】
表面改変はまた、親油性ビタミン（レチノール、コレカルシフェロール、トコフェロールおよびフィロキノンなど）で可能である。従って、例えば、ビタミンＥは、ナノ粒子の細胞取り込みを増大し得る。
【００９５】
脂肪酸（例えば、１−オクタデセンもしくは１８−メチルエイコサン酸およびこれらの誘導体）は、上記コロイドの溶解性および安定性を増大させ得、ならびに、その後の特異的リガンドの結合について利用され得る末端官能性カルボキシル基を有し得る。従って、モディファイアーとして脂肪酸を含むことは有用である。
【００９６】
表面改変の別の実施形態は、多価アルコール（例えば、ジエチレングリコール（ＤＥＧ））でのコーティングである。これらは、非特異的タンパク質吸着を減少させることにおいて特に良好である。同じことが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））（特にその低分子量形態のもの）に当てはまり、ポリテトラフルオロエチレンは、低下したタンパク質吸着を達成し得る。ポリテトラフルオロエチレンは、心臓外科適用において頻繁に使用される。
【００９７】
表面改変は、タンパク質新生に関与する（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｅｎ）アミノ酸およびタンパク質新生に関与しないアミノ酸の両方を包含する１個以上の天然に存在するアミノ酸、ならびに１個以上の合成アミノ酸を使用して同様に行われ得る。立体異性体（Ｄ体およびＬ体）の両方が、ここで使用され得る。上記アミノ酸のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドから小さなポリペプチドまでは、免疫系をほとんど刺激せず、従って、薄い適合性層にもに適している。それらは、人工アミノ酸配列、ならびに生物学的タンパク質に由来する配列であり得る。天然タンパク質（例えば、ファイトケラチン）のペプチド誘導体は、同様に、表面改変のために使用され得る。ＴａｔペプチドおよびＴａｔペプチド含有ペプチドでの表面改変は、生物医療的適用において使用できるナノ粒子を作製する別の可能性である。上記Ｔａｔペプチドは、例えば、細胞膜を通って核へと金ナノ粒子を送達するための有効な分子である。
【００９８】
考えられるモディファイアーの別の実施形態は、ホスホリルコリンコーティングの形成である。ホスホリルコリンは、（例えば、コンタクト・レンズ上の）考えられる非特異的タンパク質吸着を減少させる。その非血栓形成特性のおかげで、ホスホリルコリン改変は、生物学的系において容易に使用され得、高い貯蔵安定性によって認識される。
【００９９】
ポリラクテートは生体適合性であるので、この物質は、種々の医療的適用において使用される。より具体的には、ポリラクテートの低分子量形態は、本発明のナノ粒子の別の考えられる表面改変を構成する。両方の立体異性体（Ｄ体／Ｌ体）が、考えられる生体分解を減らすために、本明細書で使用され得る。
【０１００】
記載された表面改変とは別に、上記ナノ粒子への、非特異的タンパク質の、タンパク質分解により切断可能な結合もまた可能である。これは、生体適合性／適合性を増大させ得る。標的位置において、大きなタンパク質は、組織中に放出される小さなナノ粒子とともに除去され得る。上記除去はまた、適切な滞留時間の後に起こり得る。これに適切なのは、好ましくは、例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、セルロプラスミン、エラスチンおよびアルブミンのような一般に使用されるタンパク質、ならびに非特異的吸着を低下させる他のタンパク質である。従って、例えば、ポリペプチドとエラスチンとの組み合わせから構成される表面コーティングは、望ましくない凝塊形成を予防し得、従って、上記ナノ粒子の生体適合性を増大させ得る。
【０１０１】
主要な血清タンパク質アルブミンは、形質膜との非特異的相互作用を低下させ得る。さらに、適切に改変されたナノ粒子は、特異的リガンド（これは、同時に上記粒子表面に結合している）によって、標的細胞との特異的相互作用を発生させる能力を保持する。血清アルブミンでのコーティングは、静脈内投与後のマクロファージによる迅速な取り込みを防止することによって、コーティングされていないナノ粒子での場合よりも実質的に長い血液循環時間を生じ得る。
【０１０２】
上記に概説される非特異的コーティングとは別に、本発明のナノ粒子は、標的細胞−特異的リガンドでの選択的標識を有し；これらは、例えば、タンパク質、抗体、ペプチドと、あるいは特に好ましくは、小さな高親和性タンパク質ドメイン、抗体フラグメントまたは例えば、腫瘍細胞特異的構造もしくは他の標的に結合する他の有機分子と、結合体化される。好ましいリガンドは、アドヘシンである（例示的実施形態４を参照のこと）。この状況において「特異的」とは、上記リガンドが、もっぱら、もしくは増大した程度にまでのいずれかで標的上に発現されることを意味する。
【０１０３】
記載された拡散および灌流のより高い速度を生じる低下した流体力学的直径を、上記の特性および改善ならびに高い蛍光強度（特に、可視赤色光範囲において）と組み合わせることは、本発明のナノ粒子を、インビボで組織形態の選択的かつ正確な識別のための多くの異なる方法において使用され得る、単純な診断剤にする。これらの可能性は、抗原特異的生体マーカーとの組み合わせにおいて、特に、ＣＥＡ発現細胞および／もしくはＮＣＡ発現細胞を同定するために、特に、異常な（前）発癌組織を正常な組織から区別し、より正確な腫瘍切除のための外科的介入の間に視覚的評価を補助するために使用される。従って、本明細書で使用可能な本発明のナノ粒子は、造影剤として働く。このことは、特に、腸癌診断および外科手術における使用に適用される。
【０１０４】
本発明による改変されたアドヘシンを有する上記ナノ粒子は、インビトロもしくはインビボでの診断剤、セラノスティック剤（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｋｕｍ）および／もしくは治療剤のいずれかとして使用され得る。この目的に関して、それらは、局所的に（例えば、腫瘍内に、筋肉内にもしくは外科的に接近可能な組織／器官に）投与され得、さもなければ、全身に（例えば、静脈内に）もまた投与され得る。局所／表面投与は、液体、スプレー溶液、ゲル、フォーム、クリーム、活性パッチ（Ｗｉｒｋｐｆｌａｓｔｅｒ）によって、提供され得る。これは、特に、中空器官（例えば、腸癌の場合）の処置／診断のために好適であり得る。例えば、シロップ剤として、または錠剤もしくはカプセル剤の形態において、経口摂取もまた可能である。吸入も同様に可能である（例えば、スプレー）。坐剤による肛門投与は、想定される。１つの改変において、上記ナノ粒子は、デポー形態において移植され得る。
【０１０５】
用語「診断剤」とは、「造影剤」の同義語として本発明の状況において使用される。すなわち、診断剤は、医療的介入を補助するために、生物学的系、特に、生きている人々において、形態的構造もしくは機能的構造の識別的可視化のために働く。
【０１０６】
上記ナノ粒子は、特に、外科的介入において、診断剤として使用され得る。これらはまた、低侵襲法（ｍｉｎｉｍａｌ−ｉｎｖａｓｉｖｅｎ Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（例えば、内視鏡検査法、腹腔鏡検査法）において使用され得る。画像化法（例えば、ＰＥＴ、ＭＲＴ、ＣＴなど）との組み合わせは、価値がある。
【０１０７】
既に上で述べられているように、局所投与の形態における本発明に従う使用は、特に有利である。この点について局所投与に際して使用されるＣｄの量は、有利なことには、高齢でかつ通常の生活様式のヒトの肝臓および腎臓に、一生の間にいずれにせよ通常蓄積する総曝露量の１０分の１を超えない。これら器官の総曝露量は、約１８ｍｇである（Ｓａｔｕｒａｇら ２０００；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；２０００，（８４），７９１−８０２）。よって、局所投与に際して、供給されるＣｄの量が少なくとも実質的に２ｍｇを超えないように、ナノ粒子の量を制限することは有利である。特に好ましい実施形態において、腫瘍可視化は、カドミウムが０．６ｍｇ、特に好ましくは、０．２ｍｇの合計量を超えない造影剤の量ですら可能である。
【０１０８】
「局所投与」とは、本発明の目的では、上記造影剤の量もしくは用量の増大が、投与様式に依存して、身体の明確な領域において期待され得る、任意の投与を意味する。よって、例えば、輸入管もしくは輸出管に結紮を適用することなど、投与する職員による付随的手段によって、本質的に妨げられていない様式で身体中の血管系の至る所に上記造影剤が拡がることがないようにされる場合、上記造影剤の脈管投与もまた、局所投与である。
【０１０９】
この実施形態の特有の利点は、生きているヒトに対する医療的適用における上記ナノ粒子の使用がこれによって初めて可能になることである。なぜなら、別の方法（すなわち、全身投与）は、上記ナノ粒子の使用に関連する毒性が原因で、予め排除されるからである。上記の利点は、局所投与が、適切に可視化するために必要なナノ粒子の用量を低下させることによる。
【０１１０】
Ｃｄ含有造影剤が、有利なことに、インビボで腫瘍を可視化するために、腫瘍組織１ｃｍ3あたり０．００２〜０．０２ｍｇのＣｄの量に対応する用量で本発明に従って使用されることが明らかになった。０．００２〜０．０１５ｍｇ Ｃｄ／ｃｍ3 腫瘍組織の上記造影剤の用量は、特に有利であり、とりわけ、０．００２〜０．０１０ｍｇ Ｃｄ／ｃｍ3の間の用量が有利である。ヒトについての曝露の通常受容可能である上限を超えることなく、インビボで最大約１５０ｃｍ3の体積を有する腫瘍を可視化することは、この有利な投与量で可能である。最大５０ｃｍ3までの体積を有する腫瘍の可視化のために、特に都合がよい。
【０１１１】
調査は、患者の全ての接近可能な組織／器官（特に、皮膚、中空器官（例えば、胃腸管、尿生殖路、気道））に、または感覚器官の外側から接近可能な領域に、および心血管系に関し得る。
【０１１２】
インビトロ診断剤としての使用もまた可能である（例えば、免疫組織化学もしくはＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ）。インビボ診断とインビトロ診断との組み合わせ（例えば、生検材料）は、特に有利である。
【０１１３】
本発明に従う改変されたアドヘシンは、上記ナノ粒子に結合されたままであり得るか、または、除去可能か検出可能か放出可能であり得る。
【実施例】
【０１１４】
（例示的実施形態）
（Ｉ．改変されたアドヘシンの提供）
上記Ｎ末端ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡ）ドメインは、アドヘシンの結合に十分である。このことは、精製した線毛（特定のアドヘシンも含む）を使用した結合研究から公知である（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」）。従って、ＣＥＡおよびＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６）のＮ末端ドメインを、本実施形態に従うアドヘシンの標的として使用した。
【０１１５】
この目的のために、事前に、ＣＥＡおよびＮＣＡのＮ末端ドメインのコドン使用法、およびリガンドとしてのＤｒａＥ成熟タンパク質（アドヘシン）のコドン使用法を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために最適化した。これらの遺伝子を合成した。
【０１１６】
（好ましくは、変異Ｎ７７Ｋを含む）ＤｒａＥ構築物およびＣＥＡの末端ドメイン（本明細書中以降、Ｎ−ＣＥＡ）を、酵母ＴＨベクターにクローニングし、酵母へ形質転換した。
【０１１７】
上記アドヘシンを変異誘発、特に好ましい実施形態において、オリゴベースの部位特異的変異誘発（例えば、ＥＰ１７７７２９２ Ａ１）に供する。そこから得られるライブラリーを、単一コロニーおよび上記ライブラリーＤＮＡを配列決定することによって特徴付ける。
【０１１８】
上記ライブラリーおよび上記標的（Ｎ−ＣＥＡ）を、ゲノムへのＭｅｔ１遺伝子（これは、ウロポルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼをコードする）の組込みによって改変された酵母株Ｙ１９０に形質転換し、この酵母を、２５ｍＭの３−ＡＴを含む培地上に蒔く。レポーター遺伝子（Ｍｅｔ１およびβ−ガラクトシダーゼ）が読み取られるためには、上記２つのタンパク質が相互作用しなければならない。
【０１１９】
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行う。上記Ｍｅｔ１レポーター遺伝子を、ウロポルフィリノーゲンIIIの酵素的変換から生じる産物の蛍光によって検出する。
【０１２０】
得られたヒットを確認するために、さらなる試験を、上記第２のレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）の配列決定の前に利用した。この目的のために、β−ガラクトシダーゼの活性を、この酵素（β−ガラクトシダーゼ）によって基質ＦＤＧを蛍光産物へと変換することによって決定し、これによって、配列決定の前に、ヒット数を２５％に低下させた。
【０１２１】
従って、野生型よりも（さらにとりわけ、上記テンプレートよりも）改善されたＣＥＡ親和性および／もしくはＮＣＡ親和性を有するアドヘシン変異体を提供することは可能である。上記テンプレートに対する親和性（これは、例えば、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に開示されるスクリーニング法に従うレポーター遺伝子の読み取り値として記録される）の改善は、少なくとも約５％、好ましくは、少なくとも１００％、特に好ましくは、さらに少なくとも３００％もしくは少なくとも５００％である。野生型と比較した親和性は、ここで上記テンプレートの親和性の最大２倍まで、さもなければ最大４倍までの値にまさに近づき得る。
【０１２２】
親和性における特に優れた改善を、少なくとも２つの変異、好ましくは、さらに、最大３つ、５つもしくは７つの変異を組み合わせることによって達成する。親和性の特に大きな増大は、特に、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１のスクリーニング工程を反復する（必要に応じて、さらに数回反復する）ことによって、可能である。
【０１２３】
種々の親和性を有する改善された変異体の検出が、意図される。本明細書において、野生型より改善されているアドヘシンを同定するために、上記野生型を見いだすことは重要である。これは、親和性が改善された変異体についての完全配列空間を含む。
【０１２４】
すなわち、１個もしくはそれより多いアミノ酸位置において改変された本発明の改変アドヘシンは、これらの調査から得られ得る。
【０１２５】
（１．有利な改変）
（例示的実施形態１−８８位−スレオニン）
変異Ｔ８８Ｍは、文献（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」）から、アドヘシンにおいて、特に、ＤｒａＥにおいて、上記アドヘシンのＣＥＡ親和性の増大を引き起こすことが公知である。したがって、Ｔ８８位を、最初の変異誘発のために選択した。
【０１２６】
この情報およびこの後の全ての情報は、配列番号１に従うＤｒａＥにおけるアミノ酸位置に関する。
【０１２７】
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１において記載されるように行った。
【０１２８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｍ＞Ｌ＞ＷＴ
このＴ８８Ｍ位を有する最も改善された変異体を、以下の変異誘発のためのテンプレートとして使用した。
【０１２９】
さらに、変異Ｎ７７Ｋを、アドヘシンがＤＡＦへ結合しないように、導入した（ｖａｎ Ｌｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４５（２），ｐｐ．４３９−４５２，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｄｒ ａｄｈｅｓｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ」）。この変異は、Ｎ−ＣＥＡへのアドヘシンの結合に影響を与えない（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）２８１（３９），ｐｐ．２９１２０−２９１３９，「Ａ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｒ Ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂｉｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｏ Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ」および発明者自身のデータ）。従って、以下の変異誘発のためのテンプレートは、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋである。
【０１３０】
（例示的実施形態２−７位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｎ＞（Ｆ，Ｃ）＞Ｓ＞Ｖ＞Ｒ，Ａ＞（Ｉ，Ｌ，Ｙ）＞ＷＴ
（例示的実施形態３−１７位−グルタミン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｐ＞Ｋ＞Ｇ，Ｄ，Ｒ，Ｎ＞Ｈ，Ｑ＞ＷＴ
（例示的実施形態４−２２位−アルギニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３３】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＞Ａ＞Ｓ＞Ｎ＞Ｋ＞ＷＴ
（例示的実施形態５−２５位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｇ＞Ｎ＞Ａ，Ｔ＞Ｋ，Ｒ，Ｈ，Ｑ，Ｍ＞ＷＴ
（例示的実施形態６−２７位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３５】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｋ＞Ｒ＞Ｌ＞Ｖ，Ｙ＞Ｐ，Ｎ，Ｑ＞ＷＴ
（例示的実施形態７−２８位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｗ＝Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態８−２９位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｋ＞Ｒ＞Ｓ＞Ｅ，Ｑ＞Ｆ，Ｇ＞Ｌ，Ｈ＞Ｐ，Ｎ，Ｔ，Ｗ＞ＷＴ
（例示的実施形態９−３１位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｇ＝Ｄ＞Ｓ＞Ｎ＞ＷＴ
（例示的実施形態１０−３４位−グルタミン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１３９】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｄ＞＞Ｇ＞Ｓ＝Ｎ＞Ｌ＝Ｖ＝Ｔ＝Ａ＞ＷＴ
（例示的実施形態１１−３７位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｎ＞＞ＷＴ
（例示的実施形態１２−３８位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＝Ｔ＞Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態１３−３９位−アラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｑ＞Ｓ＞Ｄ，Ｍ＞Ｇ，Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態１４−４１位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４３】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞＞ＷＴ
ＦＤＧアッセイによる再スクリーニングにおいて、Ｉ４１Ｌクローンは、Ｉ４１Ｖクローンよりも高い読み取り値を有した。その配列を分析したところ、これらクローンの全てが、さらなる変異Ｖ１１６Ａも有することが明らかになった。従って、Ｉ４１Ｌ Ｖ１１６Ａはまた、改善された変異体である。
【０１４４】
（例示的実施形態１５−４７位−グルタミン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４５】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＞＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴ
（例示的実施形態１６−５２位−アスパラギン酸）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｇ＞Ｎ，Ｓ＞Ｃ，Ｐ，Ｑ，Ｙ，Ｈ，Ｋ，Ｒ，Ｔ＞ＷＴ
（例示的実施形態１７−８４位−アスパラギン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１４７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｄ＞＞Ｓ＞Ｈ＞ＷＴ
上記スクリーニングはまた、上記ＦＤＧ再スクリーニングにおいて、Ｎ８４Ｓと比較してより高い読み取り値を有する、（組み合わせ）変異体Ｑ３４Ｌ Ｎ８４Ｓを見いだした。
【０１４８】
このことは、変異体の組み合わせが、その単一変異体との比較において、ＣＥＡに対しより高い親和性を生じることを示す。
【０１４９】
（例示的実施形態１８−８６位−アルギニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞＞ＷＴ
（例示的実施形態１９−９５位−スレオニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｌ＞＞Ｍ，Ｙ，Ｆ＞（Ｃ，Ｗ，Ｑ）＞Ｎ，Ｅ，Ｓ，Ｉ，Ｈ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｔ９５Ｅ Ｔ１２３Ｉをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｔ９５Ｅ変異体より高いＦＤＧ読み取り値を有した。
【０１５２】
このことは、変異体のこの組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１５３】
（例示的実施形態２０−１００位−フェニルアラニン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｙ＞Ｖ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｆ１００Ｓ Ｔ１１Ｉ Ｄ３７Ｇをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｆ１００Ｓ変異体よりも高いＦＤＧ読み取り値を有した。同様に、組み合わせ変異体Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉは、Ｆ１００Ｉ変異体よりも高いＦＤＧ読み取り値を示すことを見出した。
【０１５５】
このことは、変異体のこの組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１５６】
（例示的実施形態２１−１０５位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５７】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ａ，Ｔ＞Ｒ＞Ｍ，Ｖ，Ｐ，Ｎ，Ｅ＞Ｑ，Ｇ，Ｋ，Ｈ＞ＷＴ
（例示的実施形態２２−１１１位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｃ＞Ｖ＞Ｈ＞Ｙ＞Ｔ＞Ｍ＝Ｆ＞ＷＴ
（例示的実施形態２３−１１４位−イソロイシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１５９】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる；
Ｖ＞＞Ｌ＞Ａ＝Ｃ＞ＷＴ
（例示的実施形態２４−１１５位−チロシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｔ＝Ｗ＞Ｅ＞Ｖ＞ＷＴ
（例示的実施形態２５−１１６位−バリン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６１】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ａ＞Ｓ＞Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態２６−１１８位−グリシン）
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１６２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｐ＞Ｓ＞ＷＴ
組み合わせ変異体Ｇ１１８Ｓ Ｉ８５Ｌをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｇ１１８Ｓと比較して、より高いＦＤＧ読み取り値を有した。この組み合わせを最初のヒットの中で見いだした。
【０１６３】
このことは、変異体の組み合わせにより、その単一変異体と比較して、より高いＣＥＡ親和性が得られることを示す。
【０１６４】
（例示的実施形態１〜２６のまとめ）
以下のコンセンサス配列の全てを、ＤｒａＥ Ｎ７７Ｋの以下の配列に基づいて特定する（図１、配列番号１もまた参照のこと）：
【０１６５】
【化５】
【０１６６】
これら例示的実施形態は、アドヘシン遺伝子内で変異すると、上記アドヘシンの改善されたＣＥＡ親和性を生じるようなアミノ酸についての、以下の「ポジティブ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」コンセンサス配列を生じる：
（コンセンサス配列 配列番号９）
【０１６７】
【化６】
【０１６８】
アラインメントを、図１２に示す。
【０１６９】
有利な実施形態において、本発明に従う改変されたアドヘシンは、以下のアミノ酸のうちの１つ以上を有する：Ｌ２６、Ｇ４２、Ｐ４３、Ｖ４４、Ｌ４９、Ｄ８９、Ｓ９１、Ｓ１０７、Ｗ１０８、Ｇ１１０。特に好ましい実施形態において、これらアミノ酸のうちの全てが存在する。
【０１７０】
このことは、有利なことには、以下のコンセンサス配列を生じる：
（コンセンサス配列、配列番号１０）
【０１７１】
【化７】
【０１７２】
アラインメントを、図１３に示す。有利に存在するアミノ酸には、ここで下線を付す。
【０１７３】
本発明のアドヘシンが、さらに、以下のアミノ酸のうちの１個以上を、特に、全てを有する場合、有利である：Ｃ１９、Ｃ５１、Ｇ１０６、Ｙ１２８、Ｔ１２９。
【０１７４】
よって、本発明のアドヘシンは、以下のようなコンセンサスを、有利に有する：コンセンサス配列１１（図１４を参照なこと。有利に存在する全てのアミノ酸に、下線を付す；コンセンサス構造９および１０、ならびに上記の情報に従うさらなる好ましいアミノ酸の組み合わせ）：
（コンセンサス配列、配列番号１１）（図１４）：
【０１７５】
【化８】
【０１７６】
（２．特に好ましい変異の組み合わせ）
単一の変異体の以下の組み合わせは、特に有利であることが判明した：
野生型アドヘシン ＤｒａＥの変異誘発は、改善された変異体Ｔ８８Ｍ（例示的実施形態１を参照のこと）を生じ、テンプレートとしてこの変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ（Ｎ７７Ｋ）を用いたさらなるラウンドの変異誘発により、さらに改善された変異体が検出された（例示的実施形態２〜２６を参照のこと）。従って、例えば、多重変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ（Ｎ７７Ｋ） Ｉ１１１Ｈを生成した。これは、野生型アドヘシンＤｒａＥおよび上記ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ変異体と比較して、明らかにより高いＣＥＡ親和性を示す。
【０１７７】
別の例は、構築物ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｑ３４Ｌ Ｎ８４Ｓであり、これは、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ８４Ｓより高いＣＥＡ親和性を有する（例示的実施形態１７を参照のこと）。組み合わせ変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｇ１１８Ｓ Ｉ８５Ｌはまた、変異体ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｇ１１８Ｓと比較して、より高いＣＥＡ親和性を有する（例示的実施形態２６）。
【０１７８】
組み合わせ変異体Ｆ１００Ｓ Ｔ１１Ｉ Ｄ３７Ｇは、Ｆ１１０Ｓと比較して、増大したＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態２０を参照のこと）。これはまた、組み合わせ変異体Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉについても事実であり、Ｆ１００Ｉ Ｔ１２３Ｉは、Ｆ１００Ｉと比較して増大したＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態２０を参照のこと）。組み合せ変異体Ｔ９５Ｅ Ｔ１２３Ｉをまた、見いだした；この組み合わせは、Ｔ９５Ｅ変異体よりも高いＣＥＡ親和性を有した（例示的実施形態１９を参照のこと）。
【０１７９】
結論として、本発明の目的は、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対する親和性に関して、改善されたアドヘシンリガンドの好ましい実施形態を規定することによって解決される。その実施形態は、各場合において、コンセンサス配列１において列挙された単一変異体の任意の考えられる組み合わせを有する。
【０１８０】
列挙された例示的実施形態は、本明細書で使用される上記ｎＨｙｂｒｉｄ／Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法が、反復サイクルを行うことによって、ＣＥＡおよび／もしくはＮＣＡに対して増大した親和性を有する組み合わせ変異体を生成するのを可能にすることを実証する。
【０１８１】
（３．多重変異誘発）
これらの実験を、ｎＨｙｂｒｉｄシステムにおいて行った（ＥＰ１７２１９７４ Ａ１）。
【０１８２】
第１に、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋ Ｉ１１１Ｖ（ＴＭ＝三重変異体）を、変異誘発テンプレートとして使用し、第２に、ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋ Ｉ１１１Ｖ Ｉ１１４Ｖ Ｖ１１６Ａ（ＦＭ＝「Ｆｕｅｎｆｆａｃｈｍｕｔａｎｔｅ」［五重変異体］）を使用した。これは、さらに高いＣＥＡ親和性を有する。
【０１８３】
（例示的実施形態２７−３９位−アラニン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ｇ＞Ｄ＝Ｈ＞Ｑ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｑ＞Ｓ＞Ｄ＞Ｍ＞Ｇ＞Ｆであった。このことは、上記ＴＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、３９位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１８５】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８６】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｑ＞Ｓ＞Ｄ＞Ｍ＞Ｇ＞Ｆであった。このことは、上記ＦＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、３９位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１８７】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｓ＞Ｇ＞Ｄ＝Ｈ＞Ｑ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｓ＞ＷＴ
（例示的実施形態２８−４１位−イソロイシン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１８８】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｖ＞Ｌ＞Ｔ＞ＷＴ
これは、上記ＴＭをテンプレートとして使用してもなお、この部位における変異が、ＣＥＡ親和性をさらに改善することを意味する；この場合において、変異体の範囲（Ｍｕｔａｎｔｅｎｓｐｅｋｔｒｕｍ）は、テンプレートとしてＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋを用いたときと同じように現れる。この事実は、上記ＴＭにおける構造的改変は、アミノ酸４１位に大きな影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１８９】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９０】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｌ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、わずかに改善された変異体としてＬが検出された；Ｖは、最良の変異体であった。このことは、上記ＦＭが、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４１位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９１】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｖ＞Ｌ＞Ｔ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｌ＞ＷＴ
（例示的実施形態２９−４７位−グルタミン）
ａ）テンプレートとしてのＴＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９２】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞Ａ＞Ｃ＞Ｔ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｔ＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴであった。このことは、上記ＴＭは、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４７位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９３】
ｂ）テンプレートとしてのＦＭ
定量的スクリーニングを、ＥＰ１７２１９７４ Ａ１に記載されるように行った；さらに、再スクリーニングを行った（上記を参照のこと）。
【０１９４】
（ｉ）ヒットの配列決定および評価
細菌への形質転換後のヒットからのＤＮＡの配列決定により、同定されたヒットの頻度に基づいて、改善されたＣＥＡ親和性を有する変異体の以下の順序が得られる：
Ｓ＞ＷＴ
ＤｒａＥ Ｔ８８Ｍ Ｎ７７Ｋをテンプレートとして使用したところ、改善された変異体の順序は、Ｔ＞Ｎ＝Ｃ＞Ｓ＞Ｇ＝Ａ＝Ｐ＞ＷＴであった。このことは、上記ＦＭは、おそらく、異なる変異体もしくは異なる順序の公知の変異体（これらは、４７位において見いだされる）を生じる、改変された構造を有することを意味する。
【０１９５】
ｃ）上記２つのテンプレートの比較
ＴＭ：Ｓ＞Ａ＞Ｃ＞Ｔ＞ＷＴ
ＦＭ：Ｓ＞ＷＴ
これらの列挙された例示的実施形態は、本明細書で使用される上記ｎＨｙｂｒｉｄスクリーニング法が、反復サイクルを行うことによって、増大したＣＥＡ親和性を有する組み合わせ変異体を生成するのを可能にすることを再び実証した。
【０１９６】
（３．ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）による、本発明に従って使用可能な上記ナノ粒子の、インビボ分解の分析）
この研究の目的は、選択したマウス器官における、ジペプチドコーティングしたナノ粒子（コア：ＣｄＳｅ、シェル：ＺｎＳ、最大発光：６５５ｎｍ、流体力学的直径はタンパク質リガンドなしで約１２．５ｎｍ）の生物学的分解を検出することであり、これは、体重１ｋｇあたり１．７ｍｇの用量で蛍光ナノ粒子結合体を静脈内注射した後に、２日目の蛍光と４２日目の蛍光とを比較することによって行った。
【０１９７】
（方法）
６匹のＮＭＲＩマウスに、体重１ｋｇあたり１．７ｍｇの上記蛍光ナノ粒子結合体（ＱＤ６５５＃Ｄ４１６−３６−ＫＮＨ−タンパク質リガンドクローン５５８２（「Ｆｕｅｎｆａｃｈ−Ｍｕｔａｎｔｅ」ＦＭ［五重変異体］、上記を参照のこと））を、尾静脈を介して注射した。上記マウスを、注射後２日目および４２日目にそれぞれ屠殺し、その器官を取り出し、−８０℃で急速冷凍した。
【０１９８】
（サンプル調製）
２００ｍｇの特定の器官を秤量し、クリオチューブ（Ｃｒｙｏｒｏｅｈｒｃｈｅｎ）中で、１ｍｌの５００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ＝８．３）および１ｇのホモジナイゼーションビーズ（ＭａｔｒｉｘＤ ｆｒｏｍ ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、Ｆａｓｔｐｒｅｐ２４（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）ホモジナイザーを使用し１分間ホモジナイズした。そのホモジネートを、氷上に置いた。
【０１９９】
サンプル包埋ミックス（全て容量（μｌ単位））
【０２００】
【表１】
【０２０１】
上記ＢＳＡ溶液を、エッペンドルフ容器に入れ、続いて、上記ホモジネートを添加し、そしてこのサンプルを、氷上で２分間にわたって冷却した。これに続いて、グルタルアルデヒド溶液を添加し、迅速に混合した。各場合において、上記サンプルのうちの２００μｌを、カバースリップが底にあるマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルにピペットで入れた。グルタルアルデヒド固定には、数分間かかり、数分間後、固体ゲルになった。
【０２０２】
（生データの測定）
顕微鏡観察を、６０×／１．２Ｗレンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ Ｓｃａｎ＾Ｒシステムを用いて行った。上記サンプルの画像を、Ｓｃａｎ＾Ｒ Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアを使用して取得した：１サンプルあたり（＝１ウェルあたり）１６スタック（Ｓｔａｐｅｌ）を、各場合において、１スタックあたり４０フレームで記録した。フレームは、０．５μｍ間隔であった。上記画像を、並行して２チャネルで撮った：ナノ粒子チャネル（吸収フィルタ（Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓｆｉｌｔｅｒ）６５５／１６）における露出時間は、２００ｍｓであり、自動蛍光チャネル（吸収フィルタ５２５／３０）では、１０００ｍｓであった。
【０２０３】
画像領域およびボリュームに関する情報は、以下のとおり。
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
（生データの評価）
上記ナノ粒子を、Ｓｃａｎ＾Ｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによって定量した。まず、上記スタックの最大投射（Ｍａｘｉｍａｌｐｒｏｊｅｋｔｉｏｎ）を、平面上にｚ軸に沿って生成し、続いて、ローリングボールによって平滑化を行い、最後に、重み付けした自動蛍光チャネルを、ナノ粒子チャネルから差し引いた。セグメント化のための強度閾値を、４３に設定した。
【０２０６】
見いだされた上記ナノ粒子を、ゲーティングによって３つのカテゴリー（小、中、大）に分けた。その基準は、平均強度（６０〜４００の範囲のグレースケール値）によって定義される感知できるコリドー（ｓｉｎｎｖｏｌｌｅｎ Ｋｏｒｒｉｄｏｒｓ）内における、見いだされた上記ナノ粒子の面積である。上記ゲートは矩形であり、かつ以下のように定義した：
小：４〜３５ピクセル
中：３６〜４００ピクセル
大：４０１〜１０００００ピクセル。
【０２０７】
大部分の物体を、小ゲートにおいて見いだした。最も少ないのは、大ゲートにおいてであった。
【０２０８】
大および中〜大の大きさの凝集物の出現のため、正確な定量の提示が不可能である。なぜなら、各凝集物を形成する個々のナノ粒子の数を、正確に決定できないからである。しかし、上記ナノ粒子分布および薬物動態に関する定性的な提示を、凝集物中のナノ粒子に数に概して比例する無次元パラメーターとして、その蛍光を介して行い得る。
【０２０９】
無次元蛍光の計算：
物体の数に、ナノ粒子の粒状クラスの平均総強度（物体あたりの平均総蛍光強度）を乗算する：
物体×平均強度＝蛍光
２日目および４２日目の肝臓、脾臓および肺からのホモジネートの蛍光を計算し、その平均を決定した。２日目の蛍光を、各場合において１００％に正規化した。
【０２１０】
上記の結果を、図１６にまとめる。これによれば、２日目と比較して４２日目で、肝臓においては蛍光の０．５４％のみが、脾臓においては蛍光の４．９７％のみが、肺においては蛍光の１８．６６％のみが検出可能であった。このことは、本発明のアドヘシン連結ナノ粒子が、インビボで分解されることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
ａ．アドヘシン群（配列番号２）
ｂ．ＤｒａＥ群（配列番号３）
ｃ．ＤｒａＥ／ＡｆａＥ−ＩＩＩ（配列番号４）
ｄ．ＤｒａＥ（配列番号１）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアドヘシンであって、ここで該アドヘシンは、以下の変異：
【化９】
のうちの１つ以上を有し、かつ最大１８個、好ましくは、最大１２個、１０個もしくは５個までのアミノ酸が、Ｎ末端で欠失され得、そして／または最大１０個まで、好ましくは、最大８個もしくは５個までのアミノ酸がＣ末端で欠失される、アドヘシン。
【請求項２】
以下の配列：
ａ．ＣＥＡＣＡＭ群（配列番号５）
ｂ．ＣＥＡ／ＮＣＡ（配列番号６）
ｃ．ＣＥＡ（配列番号７）および／もしくはＮＣＡ（配列番号８）
の群より選択されるアミノ酸配列を有する結合タンパク質のＮ末端配列に結合し得る点で特徴付けられる、請求項１に記載のアドヘシン。
【請求項３】
前記アドヘシンは、請求項２に記載される結合タンパク質、特に、ＣＥＡのＮ末端配列に対して親和性を有し、該親和性は、野生型の親和性に対して少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１００％、特に、少なくとも３００％もしくは５００％改善されている点で特徴付けられる、請求項１および２のいずれかに記載のアドヘシン。
【請求項４】
前記アドヘシンは、以下の変異：
Ｖ２８Ｗ；Ｖ２８Ｆ；Ａ３９Ｑ；Ａ３９Ｓ；Ｉ４１Ｌ；Ｑ４７Ｓ；Ｑ４７Ｔ；Ｉ８５Ｌ；Ｔ９５Ｌ；Ｇ１１８ＳおよびＴ１２３Ｉ、
のうちの１つ以上を有する点で特徴付けられる、先の請求項のいずれか１項に記載のアドヘシン。
【請求項５】
配列番号１２に記載の配列ＩＤを有する、アドヘシン。
【請求項６】
先の請求項のうちの１項以上に記載のアドヘシンに結合体化された、ナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、無機コアおよび不動態化層を有し、該不動態化層を含む該無機コアの最小の直径は、１５ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、特に好ましくは５ｎｍ以下である点で特徴付けられる、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、不活性でない点で特徴付けられる、請求項６および７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
医療用途の造影剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアドヘシンもしくは請求項６〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項１０】
腸の癌、特に、ＣＲＣ細胞を同定する目的の造影剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアドヘシンもしくは請求項６〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項１】
以下の配列：
ａ．アドヘシン群（配列番号２）
ｂ．ＤｒａＥ群（配列番号３）
ｃ．ＤｒａＥ／ＡｆａＥ−ＩＩＩ（配列番号４）
ｄ．ＤｒａＥ（配列番号１）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアドヘシンであって、ここで該アドヘシンは、以下の変異：
【化９】
のうちの１つ以上を有し、かつ最大１８個、好ましくは、最大１２個、１０個もしくは５個までのアミノ酸が、Ｎ末端で欠失され得、そして／または最大１０個まで、好ましくは、最大８個もしくは５個までのアミノ酸がＣ末端で欠失される、アドヘシン。
【請求項２】
以下の配列：
ａ．ＣＥＡＣＡＭ群（配列番号５）
ｂ．ＣＥＡ／ＮＣＡ（配列番号６）
ｃ．ＣＥＡ（配列番号７）および／もしくはＮＣＡ（配列番号８）
の群より選択されるアミノ酸配列を有する結合タンパク質のＮ末端配列に結合し得る点で特徴付けられる、請求項１に記載のアドヘシン。
【請求項３】
前記アドヘシンは、請求項２に記載される結合タンパク質、特に、ＣＥＡのＮ末端配列に対して親和性を有し、該親和性は、野生型の親和性に対して少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１００％、特に、少なくとも３００％もしくは５００％改善されている点で特徴付けられる、請求項１および２のいずれかに記載のアドヘシン。
【請求項４】
前記アドヘシンは、以下の変異：
Ｖ２８Ｗ；Ｖ２８Ｆ；Ａ３９Ｑ；Ａ３９Ｓ；Ｉ４１Ｌ；Ｑ４７Ｓ；Ｑ４７Ｔ；Ｉ８５Ｌ；Ｔ９５Ｌ；Ｇ１１８ＳおよびＴ１２３Ｉ、
のうちの１つ以上を有する点で特徴付けられる、先の請求項のいずれか１項に記載のアドヘシン。
【請求項５】
配列番号１２に記載の配列ＩＤを有する、アドヘシン。
【請求項６】
先の請求項のうちの１項以上に記載のアドヘシンに結合体化された、ナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、無機コアおよび不動態化層を有し、該不動態化層を含む該無機コアの最小の直径は、１５ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、特に好ましくは５ｎｍ以下である点で特徴付けられる、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、不活性でない点で特徴付けられる、請求項６および７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
医療用途の造影剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアドヘシンもしくは請求項６〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項１０】
腸の癌、特に、ＣＲＣ細胞を同定する目的の造影剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアドヘシンもしくは請求項６〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１１−５１４８９０（Ｐ２０１１−５１４８９０Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４７９６１（Ｐ２０１０−５４７９６１）
【出願日】平成２０年６月１７日（２００８．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６１０２
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０８１４６６６２）シグナロミクス ゲーエムベーハー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１７日（２００８．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６１０２
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０８１４６６６２）シグナロミクス ゲーエムベーハー (3)
【Ｆターム（参考）】
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