最適化特性を有するＦｃ変異体
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体、それらの製造方法、最適化特性を有するＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、ならびに最適化特性を有するＦｃ変異体の使用方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００５年３月３１日出願のＵＳＳＮ６０／６６７，１９７；２００５年８月３日出願のＵＳＳＮ６０／７０５，３７８；２００５年１０月３日出願のＵＳＳＮ６０／７２３，２９４；および、２００５年１０月３日出願のＵＳＳＮ６０／７２３，３３５；ならびに、２００５年５月５日出願のＵＳＳＮ１１／１２４，６２０の一部継続出願（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に対し米国特許法１１９条(e)項の利益を請求する。２００４年３月２６日出願の米国特許出願番号第１０／８２２，２３１号の開示内容はまた、参照によりその全体が明示的に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体ポリペプチド、それらの製造のための操作（engineering）方法、および特に治療目的でのそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、抗体は、一対の重鎖および軽鎖ポリペプチド鎖から構築される。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインから成り、故に、一般名である免疫グロブリンが、そのようなタンパク質に用いられる。各鎖は、可変領域（Ｖ領域）および定常領域と称される２個の異なる領域から成る。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体間の顕著な配列多様性を示し、標的抗原への結合に関与する。定常領域は、配列多様性をあまり示さず、多くの天然タンパク質の結合に関与して重要な生化学的事象を引き起こす。ヒトでは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、およびＩｇＭを含む５種の異なる抗体クラスがある。これらの抗体クラス間の顕著な特徴は、それらの定常領域であるが、わずかな差異がＶ領域に存在し得る。免疫グロブリンの一般的な構造的特徴を記載する例として本明細書で用いる図１は、ＩｇＧ１抗体を示す。ＩｇＧ抗体は、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を示す。）（また、ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメイン、および定常ガンマ３ドメインを示す。）とも称される。）の順で連結する４個の免疫グロブリンドメインからなる。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ−ＣＬ（それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを示す。）の順で連結した２個の免疫グロブリンドメインからなる。
【０００４】
抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、故に、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラス内の他の抗体と配列が最も異なるため、そのように称される。配列多様性の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）中に生じる。重鎖および軽鎖あたりそれぞれ３個の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３で示される、計６個のＣＤＲがある。可変領域のうちＣＤＲ以外は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。ＣＤＲほど多様ではないが、配列多様性が、異なる抗体間のＦＲ領域中に生じる。概して、抗体のこの特徴的構造は、実質的な抗原結合の多様性（ＣＤＲ）が免疫系により調査され、広範囲の抗原に対する特異性を得ることを可能にする、安定な骨格（ＦＲ領域）を提供する。多くの高分解能構造が、異なる生物由来の多様な可変領域断片（いくつかは抗原と非結合、およびいくつかは抗原との複合体）に利用可能である。抗体可変領域の配列および構造的特徴は、よく特徴付けられており（Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9−16；Morea et al., 2000, Methods 20:267−279、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、抗体の保存的特徴は、多くの抗体操作技術の開発を可能にしている（Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−376、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。例えば、ある抗体、例えばマウス抗体由来のＣＤＲを、別の抗体、例えばヒト抗体のフレームワーク領域に移植することが可能である。この方法は、当技術分野で“ヒト化”と称され、非ヒト抗体由来の免疫原性の低い抗体治療剤の製造を可能とする。可変領域を含む断片は、抗体の他の領域を欠失して存在することができ、例えばＶＨ−Ｃγ１およびＶＨ−ＣＬを含む抗原結合断片（Ｆａｂ）、ＶＨおよびＶＬを含む可変断片（Ｆｖ）、同じ鎖中で共に連結するＶＨおよびＶＬを含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに多様な他の可変領域断片が含まれる（Little et al., 2000, Immunol Today 21:364−370、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００５】
抗体のＦｃ領域は、多くのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能を与える。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃ領域は、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ２につながるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに関して重要なＦｃ受容体ファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と細胞性免疫応答とのコミュニケーションを仲介する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーには、イソ型であるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型であるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型であるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃとの結合を仲介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を仲介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞を含む、様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合した抗原の部位に捕捉し、典型的に、細胞内のシグナル伝達事象ならびに、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃のようなその後の重要な免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用エフェクター機能を仲介する能力は、抗体が標的細胞を破壊することによる可能性のある機序である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と称される（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の食作用をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）と称される。ＦｃγＲＩＩａ（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437−442、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095−1103、参照によりその全体が本明細書中に包含される）；および、ＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むヒトＦｃγＲの細胞外ドメインの多くの構造が、解明されている。全てのＦｃγＲは、図２に示す通り、Ｃγ２ドメインおよび前記ヒンジのＮ末端でＦｃ上の同じ領域に結合する。この相互作用は、構造的によく特徴付けられており（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合するヒトＦｃのいくつかの構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびにヒトＩｇＥ Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｆ６Ａ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Garman et al., 2000, Nature 406:259−266、参照によりその全体が本明細書中に包含される）は、解明されてきた。
【０００６】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は典型的に、受容体に対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的によく結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。全てのＦｃγＲは、異なる親和性を有するが、ＩｇＧ Ｆｃの同じ領域に結合する：高親和性結合体であるＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１についてＫｄ１０−８Ｍ−１を有し、一方、低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般的に、それぞれ１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％の同一性を有する；しかしながら、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体により誘発される活性化の正の調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、故に阻害性である。故に、前者は、活性化受容体と称され、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害性受容体と称される。前記受容体はまた、様々な免疫細胞で発現パターンおよびレベルが異なる。さらに別の複雑度は、ヒトプロテオームにおける多くのＦｃγＲ多型の存在である。臨床的重要性を有する特に関連する多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりもＶ１５８アロタイプにより高い親和性で結合する。この親和性の差異、およびＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対する推定上のその効果が、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）、BiogenIdec）の効果の重要な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者は、リツキシマブ処置に好都合に応答する；しかしながら、低親和性のＦ１５８アロタイプを有する患者は、ほとんど応答しない（Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトの約１０−２０％が、Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％が、Ｖ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、そして３５−４５％が、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220−4232；Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。故に、ヒトの８０−９０％がほとんど応答せず、例えば、彼らは、Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも一方のアレルを有する。
【０００７】
図１に示すＦｃ上の重複しているが別個の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑのための接合部位として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを仲介するのと同様に、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を仲介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成し、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６個の抗体を結合し得るが、２個のＩｇＧとの結合が、補体カスケードを活性化するのに十分である。ＦｃとＦｃγＲの相互作用と同様に、様々なＩｇＧサブクラスが、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、典型的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＦｃγＲに対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在、Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に利用可能な構造は存在しない；しかしながら、変異誘発実験は、Ｃ１ｑに対するヒトＩｇＧ上の結合部位を残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｋ３２６、Ｐ３２９、Ｐ３３１およびＥ３３３を含む領域にマッピングした（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178−4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571−2575、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００８】
図１に示すＣγ２ドメインとＣγ３ドメインの間のＦｃ上の部位は、胎児性受容体（neonatal receptor：ＦｃＲｎ）との相互作用を仲介し、その結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流に戻して再利用する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。この過程は、全長分子のサイズが大きいため腎臓ろ過による除去を伴い、結果として、１ないし３週間までの範囲の好都合な抗体の血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎとの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。ＦｃＲｎのためのＦｃ上の結合部位は、細菌プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による強い結合は、典型的に、タンパク質精製中に、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを用いることにより抗体を精製するための手段として用いられる。故に、Ｆｃ上のこの領域の適合度は、抗体の臨床的特徴およびそれらの精製の両方に重要である。ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体（Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）、およびＦｃとタンパク質ＡおよびＧとの複合体（Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361−2370；Sauer−Eriksson et al., 1995, Structure 3:265−278；Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471−481、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）の利用可能な構造は、Ｆｃとこれらのタンパク質の相互作用に関する理解を提供する。
【０００９】
Ｆｃ領域の１つの重要な特徴は、図１に示すＮ２９７に起こる保存されたＮ結合グリコシル化である。よく記載される通り、この炭水化物またはオリゴ糖は、抗体にとって重要な構造的かつ機能的役割を果たし、抗体を哺乳動物発現系を用いて製造しなければならない根本的理由の１つである。１つの理論に制限されることを望まないが、この炭水化物の構造的目的は、Ｆｃを安定化または可溶化すること、Ｃγ３とＣγ２ドメインの間の特定の角度またはフレキシビリティーレベルを決定すること、２個のＣγ２ドメインを互いに中心軸を横切って凝集しないようにすること、またはこれらの組み合わせであり得ると考えられる。ＦｃγＲおよびＣ１ｑとの効率的なＦｃ結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７炭水化物の組成の変化またはその除去がこれらのタンパク質との結合に影響を与える（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539−45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478−16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133−147、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。該炭水化物は、ＦｃγＲと何ら特定の結合を作製しないが（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合を仲介するＮ２９７炭水化物の機能的役割が、Ｆｃ立体構造を決定する構造的役割を果たし得ることが示される。このことは、４個の異なるＦｃ糖型の結晶構造の収集により支持され、それは、オリゴ糖の組成が、Ｃγ２の立体構造に影響を与え、結果としてＦｃ／ＦｃγＲ結合をもたらすことを示す（Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979−989、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１０】
上記の抗体の特徴−標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を仲介する能力、および血清中の長い半減期−は、抗体を強力な治療薬にする。モノクローナル抗体は、癌、炎症性疾患および心疾患を含む様々な状態の処置のために治療的に用いられる。現在、１０種以上の市販されている抗体製品および数百種の開発中の抗体製品が存在する。抗体に加えて、研究および治療に拡大する役割を見出されている抗体様タンパク質が、Ｆｃ融合体である（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃ融合体は、１個以上のポリペプチドが、Ｆｃに作動可能に連結するタンパク質である。Ｆｃ融合体は、受容体、リガンドまたはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインの標的結合領域と抗体のＦｃ領域を結合し、それにより、その好ましいエフェクター機能および薬物動態組み合わせる。後者の役割は、標的認識を仲介することであり、故に、それは抗体の可変領域に機能的に類似している。Ｆｃ融合体と抗体の構造的および機能的重複により、本発明の抗体に関する説明はＦｃ融合体にも拡大される。
【００１１】
抗体は、腫瘍学における幅広い適用、特に細胞破壊を目的として、腫瘍細胞で選択的に発現される細胞抗原を標的化するための適用が見出されている。必要な増殖経路の阻止による抗増殖作用、アポトーシス、増強した下方制御および／または受容体のターンオーバーをもたらす細胞内シグナル伝達、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および適応的免疫応答の促進を含む、抗体が腫瘍細胞を破壊する多くの可能性のある機構が存在する（Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541−547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403−410、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。抗腫瘍効果は、これらの機構の組み合わせの結果であり、臨床治療におけるそれらの相対的重要性は、癌依存性であるように見える。これらの抗腫瘍手段を具備しているにもかかわらず、抗癌剤としての抗体の有効性は満足のいくものではなく、特にそれらは高コストである。患者の腫瘍応答データは、モノクローナル抗体が、通常の単剤の細胞傷害性化学療法剤よりも治療の成功にほんのわずかな改善しか提供しないことを示す。例えば、全ての再発した軽度の非ホジキンリンパ腫の患者の半数しか、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブに応答しない（McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825−2833、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。１６６名の臨床患者のうち、約１２ヶ月の反応期間中央値で、６％が完全な応答を示し、４２％が部分的な応答を示した。転移性乳癌の処置用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentech）は、効果がより少ない。２２２名の試験患者に関するトラスツズマブを用いる全体の反応率は、８名の完全な応答、および２６名の部分的な応答を含む、わずか１５％であって、９ないし１３ヶ月の反応期間中央値および生存期間であった（Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639−2648、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在の抗癌治療においては、死亡率におけるどんな小さな改善も成功を定義する。故に、標的癌細胞を破壊するために抗体の能力を高めることがかなり必要とされる。
【００１２】
抗体の抗腫瘍効果を高める有望な手段は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣのような細胞傷害性エフェクター機能を仲介するそれらの能力を増強することによる。抗体の抗癌活性に関するＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能の重要性は、マウスで立証されており（Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652−656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443−446、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）、Ｆｃと任意のＦｃγＲの相互作用の親和性は、細胞ベースのアッセイにおいて標的とする細胞傷害性と相関関係を有する（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487−490; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。さらに、相関関係は、ヒトにおける臨床効果と、ＦｃγＲＩＩＩａのアロタイプの高親和性多型（Ｖ１５８）または低親和性多型（Ｆ１５８）との間で観察されている（Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらのデータを合わせると、任意のＦｃγＲに結合するのに最適化される抗体が、エフェクター機能をより多く仲介し、それにより患者の癌細胞をより効果的に破壊することが示唆される。受容体の活性化と阻害のバランスは重要な検討事項であり、最適なエフェクター機能は、活性化受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａに対して増大した親和性を有するが、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した親和性を有する抗体によって生じ得る。さらに、ＦｃγＲが、抗原提示細胞による抗原の取り込みおよびプロセシングを仲介し得るため、最適化ＦｃγＲ親和性はまた、適応的免疫応答を誘導する抗体治療薬の能力を高め得る（Dhodapkar ＆ Dhodapkar, 2005, Proc Natl Acad Sci USA, 102, 6243−6244、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。抗体の抗癌治療に対する補体仲介性エフェクター機能の重要性は、あまり特徴付けられていない。ＣＤＣに対して最適化された抗体は、抗体の臨床適用における補体の役割を調査する方法を提供し、抗体の殺腫瘍能力を改善するための可能性のある機構を提供し得る。
【００１３】
エフェクター機能が臨床効果に貢献する抗体治療および適用とは対照的に、いくつかの抗体および臨床適用に関して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少するもしくは除去すること、または限定されないがＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを含む、１種以上のＦｃγＲまたは補体仲介性エフェクター機能を減少するもしくは除去することが、好適であり得る。このことはしばしば、その作用機序が、標的抗原を保持する細胞を殺すのではなく、阻止または抑制することを含む、治療抗体の場合に当てはまる。これらの場合において、標的細胞の減少は望ましくなく、副作用であると考えられ得る。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ４受容体を阻害する抗ＣＤ４抗体の能力は、それらを効果的な抗炎症薬にし、さらに、ＦｃγＲ受容体を捕捉するそれらの能力はまた、標的細胞に対する免疫的攻撃を誘導し、結果としてＴ細胞の減少をもたらす（Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925−1933、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。エフェクター機能はまた、放射性複合体と称される放射性標識抗体、および免疫毒素（immunotoxin）と称される毒素と複合体を形成した抗体にとって課題であり得る。これらの薬剤を、癌細胞を破壊するために用いることができるが、ＦｃのＦｃγＲとの相互作用による免疫細胞の捕捉は、健康な免疫細胞を有害なペイロード（放射線または毒素）の近接域にもたらし、結果として標的癌細胞と共に正常なリンパ系組織の減少をもたらす（Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980−11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125−145、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。補体またはエフェクター細胞の捕捉が不十分であるＩｇＧイソ型、例えばＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、この課題に取り組むために部分的に用いられ得る。Ｆｃリガンド結合を減少または低下するＦｃ変異体も当技術分野で公知である（Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537−1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980−11984; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925−1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16−26; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624; ＵＳ６，１９４，５５１；ＵＳ５，８８５，５７３；ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２；ＵＳＳＮ１０／２６７，２８６、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。しかしながら、これらの変異体の完全なＦｃリガンド結合特性およびエフェクター機能の能力、およびＷＴ ＩｇＧイソ型と比較したそれらの特性は明らかでない。全てのＦｃγＲ結合ならびにＦｃγＲおよび補体仲介性エフェクター機能の完全な低下のための一般的かつ強固な手段が必要である。さらなる検討事項は、他の重要な抗体特性が不安定でないことである。Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑとの結合を低下するだけでなく、抗体の安定性、溶解性および構造的完全性、ならびにＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびプロテインＧのような他の重要なＦｃリガンドと相互作用する能力を維持するように製造されるべきである。
【００１４】
最近の成功は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑとの変化した結合を有するＦｃ変異体を得ることを成し遂げ、いくつかの場合において、これらのＦｃ変異体は、ＦｃγＲおよび補体仲介性エフェクター機能を仲介する能力について試験されている（２００５年５月５日出願の、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、および２００５年１０月２１日出願のＵＳＳＮ１１／２５６，０６０、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらの実験において得られたＦｃ変異体は、ＦｃγＲとの選択的に改善した結合、増大したＡＤＣＣ、補体タンパク質Ｃ１ｑとの改善した結合、ＦｃγＲとの減少した結合、補体タンパク質Ｃ１ｑとの減少した結合、および他の最適化特性を含むＦｃリガンドおよびエフェクター機能特性の様々な最適な増強を、それらに限定されないが、提供する。本発明は、これらの実験から選択したＦｃ変異体の特性をさらに特徴付けること、および最適化特性を有する新規の変異体を製造するためにそのデータを利用することを目的とする。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体を提供する。該最適化特性には、親Ｆｃポリペプチドと比較して、ＦｃγＲとの変化した結合、変化した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、および変化した補体依存性細胞傷害作用が含まれる。
【００１６】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、１種以上のＦｃγＲとの結合を改善する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を改善する。好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３９位、２４６位、２５５位、２５８位、２６０位、２６４位、２６７位、２６８位、２７２位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２９３位、２９５位、３０４位、３２４位、３２７位、３２８位、３３０位、３３２位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される１箇所以上でのアミノ酸修飾を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して補体依存性細胞傷害作用を改善する。好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２３３位、２３４位、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７１位、２７２位、２７４位、２７６位、２７８位、２８１位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２０位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される１箇所以上でのアミノ酸修飾を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１種以上のＦｃγＲとの結合を減少する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を減少する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して補体依存性細胞傷害作用を減少する。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を減少し、補体依存性細胞傷害作用を減少する。最も好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２３２位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２７０位、２９７位、２９９位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位および３３１位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での１個以上のアミノ酸修飾を含む。
【００１９】
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体の製造方法を提供する。本発明のさらなる目的は、最適化したＦｃ変異体を得るための実験的製造方法およびスクリーニング方法を提供することである。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体をコードする単離した核酸を提供する。本発明は、所望により制御配列と作動可能に連結した該核酸を含むベクターを提供する。本発明は、該ベクターを含む宿主細胞、およびＦｃ変異体の製造方法および所望によりＦｃ変異体の回収方法を提供する。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含む、抗体、Ｆｃ融合体、単離したＦｃ、およびＦｃ断片を含む新規のＦｃポリペプチドを提供する。該新規のＦｃポリペプチドは、治療用製品への使用を見出され得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃポリペプチドは抗体である。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、および生理学的または薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチドの治療的および診断的使用を意図する。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１。抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインを示す。Ｆｃ領域を示す。可変領域中の抗原結合部位、ならびにＦｃ領域中のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧのための結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位を示す。
【００２５】
図２。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色リボンで示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色リボンで示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色棒で示す。
【００２６】
図３ａ−３ｂ。ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアライメント。図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）の配列およびヒンジドメインを提供し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。位置は、ＩｇＧ１配列のＥＵ Ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、ＩｇＧ１と他の免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４との差異を、灰色で示す。多型が多数の位置に存在し（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、故に、示した配列と従来の配列とにわずかな差異が存在し得る。Ｆｃ領域の可能性のある開始点が示され、ＥＵの２２６位または２３０位のどちらかとして本明細書に記載される。
【００２７】
図４。ヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプの位置および関連するアミノ酸置換を示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖における等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【００２８】
図５。Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、抗体ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らして構築した。倍数は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒトＶ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に関してＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０倍数を示す。
【００２９】
図６。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）との結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴ）の存在において、特徴的阻害曲線が発光シグナルの減少として観察される。結合データを、低および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、一部位競合モデルへのデータの適合を示す。
【００３０】
図７。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合。図７ａは、選択した変異体についてのデータを示し、図７ｂは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値および倍数を示す。
【００３１】
図８。Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２） ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして構築した。図８ａは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒト活性化受容体Ｖ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、および阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの結合の、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値およびＩＣ５０倍数を示す。図８ｂは、選択した変異体のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。
【００３２】
図９。ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対するトラスツズマブにおける、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体の結合親和性を測定する競合表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。図９ａは、センサーグラム生データ（sensorgram raw data）を示し、図９ｂは、各濃度で得られた初期結合率に対する受容体濃度のログ値（対数値）のプロットを示し、そして図９ｃは、実施例１に記載の、これらのデータへの適合から得られた親和性を示す。
【００３３】
図１０。抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。低濃度および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した、所定の抗体の抗体濃度におけるＡＤＣＣの用量依存性を示す。曲線は、非線形回帰を用いて、シグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【００３４】
図１１。血清レベルのヒトＩｇＧの不存在および存在下におけるＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。
【００３５】
図１２。ＣＤＣを増強するように設計されたＦｃ変異体において変異した残基。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を示す。黒色の球および棒は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を仲介するのに重要であることが示されている残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を示し、灰色の棒は、ＣＤＣに影響を与える変異体を検討するために本発明において変異させた残基を示す。
【００３６】
図１３。補体仲介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）についてスクリーニングしたＦｃ変異体およびＣＤＣデータ。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１であり、特に他に記載のない限りＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧである。ＣＤＣ倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較した相対的ＣＤＣ活性を示す。
【００３７】
図１４。Ｆｃ変異体 抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣアッセイ。補体により仲介される溶解の抗体濃度の用量依存性を、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する示したＰＲＯ７０７６９抗体について示す。溶解を、アラマーブルー（Alamar Blue）の放出を用いて測定し、データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれにおいてベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線の最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、勾配変化のあるシグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【００３８】
図１５。増大および減少したＣＤＣを供するアミノ酸修飾、および増大／調節したＣＤＣを供し得るように修飾され得る位置。位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従い番号付けされる。
【００３９】
図１６。減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａと結合するためのＩＣ５０倍数、およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＣＤＣ活性のＥＣ５０倍数を示す。
【００４０】
図１７。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体の選択によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。
【００４１】
図１８。ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体のＣＤＣアッセイ。溶解をアラマーブルー放出により測定した。
【００４２】
図１９。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【００４３】
図２０。減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体仲介性エフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、２つの別個の試験による、ＷＴと比較したヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＩＣ５０倍数、ＷＴと比較したヒトＦｃγＲＩとの結合についてのＩＣ５０倍数、およびＷＴと比較したＣＤＣ活性についてのＥＣ５０倍数を示す。
【００４４】
図２１。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体による低親和性ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよび高親和性ヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合。
【００４５】
図２２。ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体のＣＤＣ活性。溶解をアラマーブルーの放出により測定した。
【００４６】
図２３。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋ＳｋＢｒ−３乳癌標的細胞に対する抗Ｈｅｒ２ Ｆｃ変異体およびＷＴ ＩｇＧ抗体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【００４７】
図２４。ＰＲＯ７０７６９（図２４ａおよび２４ｂ）、トラスツズマブ（図２４ｃおよび２４ｄ）、およびイピリムマブ（図２４ｅおよび２４ｆ）を含む、本発明で用いた可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列。
【００４８】
図２５。本発明で用いたヒト定常軽鎖カッパ（図２５ａ）および定常重鎖（図２５ｂ−２５ｆ）のアミノ酸配列。
【００４９】
図２６。減少したＦｃリガンド結合およびエフェクター機能特性を有する可能性のある定常重鎖配列（図２６ａ）、および改良した抗ＣＴＬＡ−４抗体の配列（図２６ｂ−２６ｄ）を示す配列。図２６ａは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８として強調して示す可変位置を含む、可能性のあるＦｃ変異体定常重鎖配列を示す。配列の下の表は、ＷＴアミノ酸およびこれらの位置において可能性のある置換基を示す。改良した抗体配列は、この可能性のある修飾基から選択される１個以上の非ＷＴアミノ酸を含み得る。図２６ｂは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖配列を示し、図２６ｃおよび２６ｄは、減少したＦｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖配列を示す。これらには、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ ＩｇＧ１重鎖（図２６ｃ）およびＩｇＧ２重鎖（図２６ｄ）が含まれる。位置は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、故に、配列中の連続順に対応していない。
【００５０】
発明の詳しい説明
本発明は、理解をより完全にし得るために、いくつかの定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意味する。
【００５１】
本明細書で記載の“ＡＤＣＣ”または“抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用”は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらすＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５２】
本明細書で記載の“ＡＤＣＰ”または“抗体依存性細胞介在性食作用”は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の食作用を誘導するＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５３】
本明細書中、“アミノ酸修飾”は、ポリペプチド配列中の、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書中、“アミノ酸置換”または“置換”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置での、あるアミノ酸の別のアミノ酸との置換を意味する。例えば、Ｌ３２８Ｒ置換は、この場合のＦｃ変異体において、３２８位のロイシンをアルギニンに置換される変異体ポリペプチドを意味する。本明細書で用いる“アミノ酸挿入”または“挿入”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、Ｇ＞２３５−２３６挿入は、２３５および２３６位の間へのグリシンの挿入を意味する。本明細書で用いる“アミノ酸欠失”または“欠失”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｇ２３６−は、２３６位でのグリシンの欠失を意味する。本発明のアミノ酸はさらに、同位体または新規のどちらかとして分類され得る。
【００５４】
本明細書で記載の“ＣＤＣ”または“補体依存性細胞傷害作用”は、１個以上の補体タンパク質成分が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす反応を意味する。
【００５５】
本明細書で記載の“同位体修飾”は、あるイソ型のあるアミノ酸を、対応する異なるアミノ酸（整列したイソ型）に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧ１は、ＥＵ ２９６位にチロシンを有し、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを有するため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、同位体修飾と見なされる。
【００５６】
本明細書で記載の“新規の修飾”は、イソ型ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧは３３２位にグルタミン酸を有しないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４におけるＩ３３２Ｅ置換は、新規の修飾と見なされる。
【００５７】
本明細書で記載の“アミノ酸”および“アミノ酸同一性”は、特定の定められた位置に存在し得る、２０個の天然に存在するアミノ酸または何らかの天然に存在しない類似体のうち１つを意味する
【００５８】
本明細書で記載の“エフェクター機能”は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体またはリガンドとの相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰのようなＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、ならびにＣＤＣのような補体仲介性エフェクター機能が含まれる。
【００５９】
本明細書で記載の“エフェクター細胞”は、１種以上のＦｃ受容体を発現し、１個以上のエフェクター機能を仲介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞が含まれるが、それらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む何れかの生物を含むが、それらに限定されない生物由来であり得る。
【００６０】
本明細書で記載の“Ｆａｂ”または“Ｆａｂ領域”は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独のこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片中のこの領域を意味し得る。
【００６１】
本明細書で記載の“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリンドメインの第一の定常領域を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。故に、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの免疫グロブリンドメインの残り２個の定常領域、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの免疫グロブリンドメインの残り３個の定常領域、ならびにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃには、Ｊ鎖が含まれ得る。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。Ｆｃは、下記の通り、単離したこの領域か、またはＦｃポリペプチド中のこの領域を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド”は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００６２】
本明細書で記載の“Ｆｃ融合体”は、１個以上のポリペプチドがＦｃ領域に作動可能に連結されるタンパク質を意味する。本明細書中、Ｆｃ融合体は、従来技術（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）で用いられる通り、用語“免疫アドヘシン（immunoadhesin）”、“Ｉｇ融合体”、“Ｉｇキメラ”、および“受容体グロブリン”（ダッシュを付けることもある）と同義の意味である。Ｆｃ融合体は、一般的に、何れかのタンパク質、ポリペプチドまたは小分子であり得る“融合パートナー”を有する免疫グロブリンのＦｃ領域を結合する。Ｆｃ融合体の非Ｆｃ部分、すなわち融合パートナーの役割は、標的結合を仲介することであり、故に、それは、抗体の可変領域と機能的に類似している。実際、何れかのタンパク質または小分子はＦｃと結合し、Ｆｃ融合体を作製し得る。タンパク質融合パートナーには、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、何れかの分子、好ましくは疾患に関与する細胞外受容体であり得る。
【００６３】
本明細書で記載の“Ｆｃガンマ受容体”または“ＦｃγＲ”は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子により実質的にコードされる何れかのタンパク質ファミリーのメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびに何れかの未知のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型またはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、それらに限定されない何れかの生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何れかの未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型もしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。
【００６４】
本明細書で記載の“Ｆｃリガンド”は、抗体のＦｃ領域と結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何れかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質Ａ、ブドウ球菌タンパク質Ｇ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、それらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同性のＦｃ受容体ファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未知の分子を含み得る。
【００６５】
本明細書で記載の“全長抗体”は、可変領域および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧイソ型の全長抗体は四量体であり、２個の免疫グロブリン鎖の２個の相同対であって、各対が、１個の軽鎖および１個の重鎖（各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含む軽鎖を含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３を含む。）を有する相同対から構成される。ある哺乳動物、例えばラクダおよびラマにおいて、ＩｇＧ抗体は、２個の重鎖（各重鎖は、Ｆｃ領域に結合した可変ドメインを含む。）のみから構成され得る。
【００６６】
本明細書で記載の“ＩｇＧ”は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このＩｇＧには、サブクラスまたはイソ型であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。マウスにおいて、ＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３が含まれる。
【００６７】
本明細書中、“免疫グロブリン（Ｉｇ）“は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１個以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が含まれるが、それに限定されない。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体断片、および個々の免疫グロブリンドメインを含むが、これらに限定されない多くの構造形態を有し得る。
【００６８】
本明細書で記載の“免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン“は、タンパク質構造分野の当業者により確認される異なる構造要素として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは典型的に、特徴的なβ−サンドイッチフォールディングトポロジーを有する。抗体のＩｇＧイソ型における既知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬである。
【００６９】
本明細書で記載の“ＩｇＧ”または“ＩｇＧ免疫グロブリン”は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体クラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このクラスには、サブクラスまたはイソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。本明細書で用いる“イソ型”は、それらの定常領域の化学特性および抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００７０】
本明細書で記載の“親ポリペプチド”、“親タンパク質”、“前駆体ポリペプチド”または“前駆体タンパク質”は、後に修飾されて変異体を作製する未修飾ポリペプチドを意味する。該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは改変型であり得る。親ポリペプチドは、そのポリペプチド自体、該親ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。従って、本明細書で記載の“親Ｆｃポリペプチド”は、修飾されて変異体を作製するＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で記載の“親抗体”は、修飾されて変異体抗体を作製する抗体を意味する。
【００７１】
本明細書で記載の“位置”は、タンパク質配列中の位置を意味する。位置は、連続して、または確立された形式、例えばKabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、番号付けされ得る。例えば、２９７位は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の位置である。
【００７２】
本明細書で記載の“ポリペプチド”または“タンパク質”は、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。
【００７３】
本明細書で記載の“残基”は、タンパク質中の位置およびその関係するアミノ酸の特定を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７、またＮ２９７とも称する）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。
【００７４】
本明細書で記載の“標的抗原”は、所定の抗体の可変領域により特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であり得る。
【００７５】
本明細書で記載の“標的細胞”は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００７６】
本明細書で記載の“可変領域”は、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子領域それぞれからなるＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子の何れかにより実質的にコードされる１個以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
【００７７】
本明細書で記載の“変異体ポリペプチド”、“ポリペプチド変異体”または“変異体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親ポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するかまたは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであり得るか、またはＷＴポリペプチドの改変型であり得る。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、該ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ配列を含む組成物を意味し得る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有し、例えば、親ポリペプチドと比較して約１個ないし約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有する。本明細書中、変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。従って、本明細書で記載の“Ｆｃ変異体”または“変異体Ｆｃ”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃ領域のみを含み得るか、または抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、もしくはＦｃにより実質的にコードされる他のポリペプチドとして存在し得る。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、該Ｆｃ変異体ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド変異体”または“変異体Ｆｃポリペプチド”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親Ｆｃポリペプチドと異なるＦｃポリペプチドを意味する。本明細書で記載の“タンパク質変異体”または“変異体タンパク質”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。本明細書で記載の“抗体変異体”または“変異体抗体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親抗体と異なる抗体を意味する。本明細書で記載の“ＩｇＧ変異体”または“変異体ＩｇＧ”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親ＩｇＧと異なる抗体を意味する。本明細書で記載の“免疫グロブリン変異体”または“変異体免疫グロブリン”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【００７８】
本明細書中、“野生型またはＷＴ”は、アレル変異体を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００７９】
抗体
従って、本発明は、変異体抗体を提供する。
【００８０】
古典的抗体構造単位には、典型的に、四量体が含まれる。各四量体は、典型的に、ポリペプチド鎖の２個の相同対（各対は、１個の“軽”鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する。）および１個の“重”鎖（典型的に、約５０−７０ｋＤａの分子量を有する。）を有する。）からなる。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソ型を定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、それらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これに限定されないサブクラスを有する。故に、本明細書で記載の“イソ型”は、それらの定常領域の化学特性および抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００８１】
各鎖のアミノ末端部位には、抗原認識に主要な役割を果たす、約１００ないし１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域中、３つのループが、重鎖および軽鎖の各Ｖドメインに集合し、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域（以降、“ＣＤＲ”と称する）と称され、そこでのアミノ酸配列中の変異は、最も重要である。
【００８２】
各鎖のカルボキシ末端部位は、エフェクター機能に主要な役割を果たす定常領域を定義する。Kabatらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の主要配列を集めた。該配列の保存の程度に基づき、彼らは、ＣＤＲおよびフレームワークに個々の主要配列を分類し、そのリストを作成した（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91−3242, E.A. Kabat et alを参照のこと）。
【００８３】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖には、いくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書中、“免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン”とは、異なる三次元構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味があるのは、重鎖定常（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体において、ＩｇＧイソ型はそれぞれ、３個のＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧにおける“ＣＨ”ドメインは、下記である：“ＣＨ１”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、１１８−２２０位を示す。“ＣＨ２”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、２３７−３４０位を示し、“ＣＨ３”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、３４１−４４７位を示す。
【００８４】
重鎖のＩｇドメインの別のタイプは、ヒンジ領域である。本明細書中、“ヒンジ”もしくは“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”もしくは“免疫グロブリンヒンジ領域”は、抗体の第一および第二定常ドメイン間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ ２２０位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ ２３７位の残基で始まる。故に、ＩｇＧに関して、抗体ヒンジは、本明細書中、２２１位（ＩｇＧ１にてＤ２２１）ないし２３６位（ＩｇＧ１にてＧ２３６）を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。いくつかの態様において、例えばＦｃ領域において、一般的に２２６位または２３０位に当たる“下流側ヒンジ（lower hinge）”が包含される。
【００８５】
本発明において特に興味があるのは、Ｆｃ領域である。本明細書で用いる“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリンドメインの第一の定常領域、いくつかの場合に、ヒンジの一部を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。故に、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの残り２個の定常領域、ならびに免疫グロブリンドメインＩｇＥおよびＩｇＭの残り３個の定常領域、ならびにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃには、Ｊ鎖が含まれ得る。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃｇ２およびＣｇ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃｇ１）とＣガンマ２（Ｃｇ２）の間の下流側ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。Ｆｃは、下記に記載の通り、単離したこの領域か、またはＦｃポリペプチド中のこの領域を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド”は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００８６】
いくつかの態様において、抗体は全長である。本明細書中、“全長抗体”とは、本明細書に記載の通り、１個以上の修飾を含む可変領域および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００８７】
あるいは、抗体は、それぞれ、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書中、“抗体模倣体”と称されることもある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある。）、および各断片を含むが、それらに限定されない、多様な構造であり得る。
【００８８】
抗体断片
１つの態様において、抗体は抗体断片である。特に興味があるのは、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合体および重鎖の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み、さらにまた、重鎖定常領域融合体を含む、抗体である。
【００８９】
特定の抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989, Nature 341:544−546）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合したＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２個のドメインを結合させ、抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結される（Bird et al., 1988, Science 242:423−426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879−5883）、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）“二重抗体（diabody）”または“三重抗体（triabody）”、遺伝子融合により構築される多価または多特異的断片（Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461−479；WO94/13804；Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444−6448）が含まれるが、それらに限定されない。該抗体断片は、修飾され得る。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化され得る（Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239−1245）。
【００９０】
キメラ抗体およびヒト化抗体
いくつかの態様において、骨格成分は、異なる種由来の混合物であり得る。そういうものとして、問題の抗体がそのような抗体であるとき、かかる抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般的に、“キメラ抗体”および“ヒト化抗体”は両方とも、２種以上由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。例えば、“キメラ抗体”には、伝統的に、マウス（またはいくつかの場合に、ラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）が含まれる。“ヒト化抗体”は、一般的に、ヒト抗体中に見出される配列に置換した可変ドメインフレームワーク領域を有している非ヒト抗体を意味する。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。そのいくつかまたは全てが非ヒト生物に由来する核酸によりコードされるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のベータ−シートフレームワークに移植され、抗体を作製し、その特異性は、移植したＣＤＲにより決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Jones, 1986, Nature 321:522−525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534−1536に記載される。対応するドナー残基への選択したアクセプターフレームワーク残基の“復帰突然変異（Backmutation）”は、しばしば、初期の移植したコンストラクトで欠失している親和性を再び得るのに必要である（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含み、故に、ヒトＦｃ領域を典型的に含むだろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子組み換えされた免疫系を有するマウスを用いて作製され得る（Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639−654）。非ヒト抗体のヒト化および再形成のための様々な技術および方法は、当技術分野でよく知られている（Tsurushita ＆ Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533−545, Elsevier Science(USA)およびそこで引用される文献）。ヒト化方法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522−525；Riechmann et al.,1988；Nature 332:323−329；Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534−1536；Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029−33；He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029−1035；Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593−9；Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181−4185；O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321−8に記載の方法が含まれるが、それらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減じるヒト化または他の方法には、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969−973に記載の表面再形成（resurfacing）方法が含まれ得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野で公知の通り、成熟した親和性を有する。構造に基づく方法は、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載のヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151−162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611−22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910−8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753−759に記載の方法を含むが、これらに限定されない、抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟に用いられ得る。他のヒト化方法は、ＵＳＳＮ０９／８１０，５０２；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119−1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076−3084に記載の方法を含むが、これらに限定されない、ＣＤＲの一部のみの移植を伴い得る。
【００９１】
二重特異的抗体
１つの態様において、本発明の多特異的抗体、特に二重特異的抗体はまた、“二重抗体”と称されることもある。これらは、２個（またはそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。二重抗体は、当技術分野で公知の様々な方法で製造することができ（Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446−449）、例えば化学的に、またはハイブリッド・ハイブリドーマ（hybrid hybridoma）から製造することができる。
【００９２】
ミニボディ
１つの態様において、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055−3061）。いくつかの場合に、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域と結合することができ、ヒンジ領域のいくつかまたは全てを包含し得る。
【００９３】
ヒト抗体
１つの態様において、抗体は、本明細書に記載の通り、少なくとも１個の修飾を有する全長ヒト抗体である。“全長ヒト抗体”または“完全ヒト抗体”は、本明細書に記載の修飾を有するヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を意味する。
【００９４】
抗体融合体
１つの態様において、本発明の抗体は、抗体融合タンパク質（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある）である。抗体融合体の１つのタイプは、結合パートナーを有するＦｃ領域を連結するＦｃ融合体を含む。本明細書で記載の“Ｆｃ融合体”は、１個以上のポリペプチドが、Ｆｃ領域に作動可能に連結されるタンパク質を意味する。本明細書中、Ｆｃ融合体は、従来技術（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200）で用いる通り、用語“免疫アドヘシン（immunoadhesin）”、“Ｉｇ融合体”、“Ｉｇキメラ”、および“受容体グロブリン”（ダッシュを付けることもある）と同義の意味である。Ｆｃ融合体は、一般的に、何れかのタンパク質または小分子であり得る融合パートナーを有する免疫グロブリンのＦｃ領域を結合する。実際、何れかのタンパク質または小分子はＦｃと結合し、Ｆｃ融合体を作製し得る。タンパク質融合パートナーには、何れかの抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、疾患に関与する何れかの分子、好ましくは細胞外受容体であり得る。
【００９５】
Ｆｃ融合体に加えて、抗体融合体は、重鎖の定常領域と、１個以上の融合パートナー（何れかの抗体の可変領域をさらに含む）の融合を含むが、一方、他の抗体融合体は、融合パートナーを有する実質的または完全な全長抗体である。１つの態様において、融合パートナーの役割は標的結合を仲介することであり、故に、それは、抗体の可変領域に機能的に類似する（そして、実際抗体可変領域であり得る）。実際、何れかのタンパク質または小分子は、Ｆｃと結合してＦｃ融合体（または抗体融合体）を作製し得る。タンパク質融合パートナーは、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカインまたはいくつかの他のタンパク質またはタンパク質ドメインを含み得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、疾患に関与する何れかの分子、好ましくは細胞外受容体であり得る。
【００９６】
結合パートナーは、タンパク性または非タンパク性であり得る；後者は、一般的に、抗体および結合パートナー上の官能基を用いて作製される。例えばリンカーは、当技術分野で公知である；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーが、よく知られている（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照のこと、参照により本明細書中に包含される）。
【００９７】
適する複合体には、下記の標識、薬剤、ならびに細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）または毒物またはかかる毒物の活性断片を含むが、これらに限定されない細胞毒性物質が含まれるが、それらに限定されない。適する毒物およびそれらの対応する断片には、ジフテリアＡ鎖、エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。細胞毒性物質にはまた、放射性同位体と抗体を結合すること、または放射性核種と抗体に共有結合しているキレート剤を結合することにより作製される放射性化学物質が含まれる。さらなる態様が、カリケミシン、オーリスタチン（auristatin）、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ならびにデュオカルマイシンおよび類似体を利用する；後者に関して、Ｕ．Ｓ．２００３／００５０３３１を参照のこと、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【００９８】
抗体の共有結合修飾（Covalent modification）
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に包含され、常にではないが一般的に、翻訳後に行われる。例えば、抗体の共有結合修飾のいくつかのタイプは、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより分子内に導入される。
【００９９】
システイニル残基は、最も一般的に、α−ハロ酢酸（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導される。
【０１００】
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖と比較的特異的に反応するピロ炭酸ジエチルとのｐＨ５．５−７．０での反応により誘導される。臭化パラフェンアシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０にて行われる。
【０１０１】
リシニル（Lysinyl）およびアミノ末端残基を、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質を用いる誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆にする効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の反応剤には、メチルピコリンイミダート；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル、ならびにグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１０２】
アルギニル残基は、１個またはいくつかの常套反応剤（とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン）との反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基が高ｐＫａであるためにアルカリ性条件で行うことが必要である。さらに、これらの反応剤は、リシンの複数の基ならびにアルギニン イプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１０３】
チロシル残基の特異的修飾を、特に関心を持って、芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基中にスペクトル標識を導入することにより作製することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（acetylimidizole）およびテトラニトロメタンを、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いる。チロシル酸基を、ラジオイムノアッセイである、適する上記のクロラミンＴ法に用いるための標識したタンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化する。
【０１０４】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’Ｎ＝Ｃ＝Ｎ――Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、所望により、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような異なるアルキル基であり得る。）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１０５】
二官能性物質を用いる誘導体化は、下記の方法に加えて、様々な方法での使用のために抗体を不水溶性支持マトリックスまたは表面に架橋させるのに有用である。常用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）のようなジサクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性不水溶性マトリックスおよび米国特許番号第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および、同第４，３３０，４４０号に記載の反応基質を、タンパク質固定化に用いる。
【０１０６】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基の形態はどちらも、本発明の範囲内である。
【０１０７】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79−86 [1983]）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１０８】
グリコシル化
共有結合修飾の別のタイプは、グリコシル化である。他の態様において、本明細書に記載のＩｇＧ変異体は、１個以上の改変された糖鎖（engineered glycoform）を含むように修飾され得る。本明細書で用いる“改変された糖鎖”は、ＩｇＧと共有結合する炭水化物組成物を意味し、ここで該炭水化物組成物は、親ＩｇＧのそれと化学的に異なる。改変された糖鎖は、エフェクター機能を増強するかまたは減少することを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変された糖鎖は、当技術分野で公知の様々な方法により作製され得る（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466−3473；ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；PotelligentＴＭ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]）。多くのこれらの技術は、例えば、様々な生物、または遺伝子組み換えもしくは他の方法の細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）中でＩｇＧを発現させることによるか、またはグリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによるか、またはＩｇＧが発現された後、炭水化物（複数可）を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合するオリゴ糖のフコシル化レベルを制御すること、および／またはそれを２つに切断することに基づく。改変された糖鎖は、典型的に、異なる炭水化物またはオリゴ糖を意味する；故に、ＩｇＧ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、改変された糖鎖に包含され得る。あるいは、改変された糖鎖は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を意味し得る。当技術分野で公知の通り、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記の特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不存在）、または該タンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物に依存し得る。特定の発現系を以下に記載する。
【０１０９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。故に、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用可能である。）への糖の一種（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロース）の付加を意味する。
【０１１０】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のために）１個以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することにより都合よく達成される。該改変はまた、（Ｏ結合グリコシル化部位のために）出発配列への１個以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換により成され得る。簡単には、抗体のアミノ酸配列を、好ましくはＤＮＡレベルでの変化により、特に、コドンが所望のアミノ酸に翻訳され得るように作製されるように予め選択された塩基にて、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより、改変する。
【０１１１】
抗体上の炭水化物部分の数を増加する他の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの方法は、ＮおよびＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。用いるカップリング法に依存して、糖（糖類）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの一部のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの一部のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトランの一部のような芳香族性残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日刊行のＷＯ８７／０５３３０およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306に記載される。
【０１１２】
出発抗体上に存在する炭水化物部分の除去を、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理により、結果として、架橋している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖鎖が切断されるが、一方、ポリペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52、およびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131に記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載の通り、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る。可能性のあるグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105に記載の通り、ツニカマイシン化合物の使用により阻止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を妨げる。
【０１１３】
抗体の共有結合修飾の他のタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の方法で、抗体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような様々なポリオールを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク性ポリマーに結合することを含む。さらに、当技術分野で公知の通り、アミノ酸置換を、ＰＥＧのようなポリマーの付加を促進するために抗体内の様々な部位に行うことができる。例えば、米国特許公開番号２００５／０１１４０３７（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１１４】
標識抗体
いくつかの態様において、本発明の抗体の共有結合修飾は、１個以上の標識の付加を含む。いくつかの場合において、これらは、抗体融合体と見なされる。
【０１１５】
用語“標識基”は、何れかの検出可能な標識を意味する。いくつかの態様において、標識基を、可能性のある立体障害を減じるために様々な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための多様な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施に用いられ得る。
【０１１６】
一般的に、標識は、それらが検出される分析に依存して様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であり得るアイソトープ標識；ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）レドックス活性部分；ｄ）光学色素；酵素群（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；および、ｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー塩基対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの態様において、標識基を、可能性のある立体障害を減じるために様々な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための多様な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施において用いられ得る。
【０１１７】
特定の標識は、発色団、蛍光体およびフルオロフォアを含むが、これらに限定されない光学色素を含み、多くの例において特に後者である。フルオロフォアは、“小分子”蛍光物質、またはタンパク性蛍光物質のどちらかであり得る。
【０１１８】
“蛍光標識”は、その固有の蛍光特性により検出され得る何れかの分子を意味する。適する蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malacite green）、スチルベン、黄色蛍光色素（Lucifer Yellow）、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Pierce, Rockford, IL）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA）が含まれるが、それらに限定されない。適するフルオロフォアを含む光学色素は、Richard P. HauglandのMolecular Probes Handbook（参照により本明細書中に明示的に包含される）に記載される。
【０１１９】
適するタンパク性蛍光標識にはまた、ウミシイタケ（Renilla）種、ウミエラ（Ptilosarcus）種、またはオワンクラゲ（Aequorea）種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Chalfie et al., 1994, Science 263:802−805）、ＥＧＦＰ（Clontech Laboratories, Inc., Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9；Stauber, 1998, Biotechniques 24:462−471；Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178−182）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Clontech Laboratories, Inc.）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408−5417）、β−ガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603−2607）およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許番号第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）が含まれるが、それらに限定されない。上記の引用文献は全て、参照により本明細書中に明示的に包含される。
【０１２０】
任意の変異体において、抗体とは、認識された免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部により実質的にコードされる１個以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味し得る。例えばヒトにおいて認識された免疫グロブリン遺伝子には、無数の可変領域遺伝子、ならびに定常領域遺伝子である、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＥ、およびＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）イソ型それぞれによりコードされるミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）を共に含む、カッパ（κ）、ラムダ（λ）および重鎖遺伝子領域が含まれる。本明細書中、抗体は、全長抗体および抗体断片を含むことを意味し、何れかの生物由来の天然抗体、改変された抗体、または実験目的、治療目的または他の目的で組み換え的に作製された抗体を意味し得る。
【０１２１】
Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１個以上のアミノ酸修飾を含み、ここで、該アミノ酸修飾（複数可）は、１個以上の最適化特性を提供する。本発明のＦｃ変異体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾によりその親ＩｇＧと異なるアミノ酸配列である。故に、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して２個以上のアミノ酸修飾、例えば約１個ないし５個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個ないし１０個のアミノ酸修飾、最も好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有し得る。故に、Ｆｃ変異体の配列および親Ｆｃポリペプチドの配列は、実質的に相同性である。例えば、本明細書中、変異体Ｆｃの変異体配列は、親Ｆｃ変異体配列と約８０％の相同性、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。修飾を、分子生物学を用いて遺伝子組み換え的に行うか、または酵素的または化学的に行うことができる。
【０１２２】
本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。故に、例えばＩ３３２Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比較してＩ３３２Ｅ置換を含むＦｃ変異体である。同様に、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比較してＳ２３９Ｄ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅ置換を含むＦｃ変異体を定義する。置換が供される順序は任意であり、すなわち、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌなどと同じＦｃ変異体であることが特記される。本発明で検討する全ての位置について、番号付けは、ＥＵ ｉｎｄｅｘまたはＥＵ番号付けスキームに従う（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＥＵ ｉｎｄｅｘまたはKabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘまたはＥＵ番号付けスキームとは、ＥＵ抗体の番号付けを意味する（Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１２３】
本発明のＦｃ変異体は、何らかの生物、好ましくはヒトを含むがそれに限定されない哺乳動物、マウスおよびラットを含むがそれらに限定されないげっ歯動物、ウサギおよび野ウサギを含むがそれらに限定されないウサギ目（lagomorpha）、ラクダ、ラマおよびヒトコブラクダを含むがそれらに限定されないラクダ科（camelidae）、ならびに原猿（Prosimian）、広猿類（Platyrrhini）（新世界サル）、オナガザル上科（Cercopithecoidea）（旧世界サル）、ならびにギボンズおよび小型および大型類人猿を含むヒト上科を含むがそれらに限定されない非ヒト霊長動物由来の遺伝子により実質的にコードされ得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、実質的にヒトのものである。
【０１２４】
親Ｆｃポリペプチドは、抗体であり得る。親抗体は、例えば遺伝子組み換えマウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455−458、参照によりその全体が本明細書中に包含される）または選択方法と一体となったヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102−108、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いて得られる、完全長ヒト抗体であり得る。親抗体は、天然に存在する必要はない。例えば、親抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol Today 21:397−402、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むがそれらに限定されない遺伝子組み換えにより作製された抗体であり得る。親抗体は、１個以上の天然抗体遺伝子によって実質的にコードされる遺伝子組み換え的に作製された抗体変異体であり得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野で公知の通り、成熟した親和性を有する。あるいは、抗体は、いくつかの他の方法で、例えば２００３年３月３日出願のＵＳＳＮ１０／３３９７８８（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の通りに修飾されている。
【０１２５】
本発明のＦｃ変異体は、何れかの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体に使用する。図３は、これらのヒトＩｇＧ配列のアライメントを提供する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭの抗体クラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体に使用する。本発明のＦｃ変異体は、２個以上のタンパク質鎖を含み得る。すなわち、本発明を、モノマー、またはホモ−もしくはヘテロ−オリゴマーを含むオリゴマーである抗体またはＦｃ融合体に用い得る。
【０１２６】
当技術分野でよく知られている通り、ヒト集団には免疫グロブリン多型が存在する。Ｇｍ多型は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３分子のマーカーのためのＧ１ｍ、Ｇ２ｍおよびＧ３ｍアロタイプ（Ｇｍアロタイプは、ガンマ４鎖上に見出されていない）と称されるアロタイプ抗原決定基をコードするアレルを有するＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ３遺伝子により決定される。マーカーは、‘アロタイプ’および‘イソアロタイプ’に分類され得る。これらは、イソ型間の強い配列相同性に依存して異なる血清学的塩基に区別される。アロタイプは、Ｉｇ遺伝子のアレル形態により特定される抗原決定基である。アロタイプは、異なる個々の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列中にわずかな差異を示す。単一のアミノ酸差異でも、アロタイプ決定基を形成し得るが、多くの場合、いくつかのアミノ酸置換が起こっている。アロタイプは、血清がアレルの差異のみを認識する、サブクラスのアレル間の配列の差異である。イソアロタイプは、１個以上の他のイソ型の非多型相同性領域と共有されるエピトープを生じる１個のイソ型におけるアレルであり、このため、血清は、関連アロタイプおよび関連相同性イソ型の両方と反応し得る（Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88−110; Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１２７】
ヒト免疫グロブリンのアレル形態は、よく特徴付けられている（WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357−362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599−601; Loghem E van, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40−51、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。さらに、他の多型が特徴付けられている（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在、１８個のＧｍアロタイプが知られている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43−78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199−211、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。固定された組み合わせで遺伝するアロタイプは、Ｇｍハプロタイプと称される。
【０１２８】
図４は、位置および関連アミノ酸置換を示すヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプを示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖中の等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【０１２９】
本発明のＦｃ変異体は、何れかの免疫グロブリン遺伝子の何れかのアロタイプまたはイソアロタイプにより実質的にコードされ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、Ｇ１ｍ（１）、Ｇ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１７）、ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、および／またはｎＧ１ｍ（１７）に分類されるＩｇＧ１配列を含む抗体またはＦｃ融合体に用いられる。故に、ＩｇＧ１イソ型において、本発明のＦｃ変異体には、２１４位にＬｙｓ（Ｇ１ｍ（１７））またはＡｒｇ（Ｇ１ｍ（３））、４３１位にＡｓｐ３５６／Ｌｅｕ３５８（Ｇ１ｍ（１））もしくはＧｌｕ３５６／Ｍｅｔ３５８（ｎＧ１ｍ（１））、および／またはＧｌｙ（Ｇ１ｍ（２））もしくはＡｌａ（ｎＧ１ｍ（２））が含まれる。
【０１３０】
最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒトＩｇＧ配列に基づき、そのためヒトＩｇＧ配列は、他の配列が比較される、他の生物、例えばげっ歯動物および霊長類由来の配列を含むが、それらに限定されない“ベース”配列として用いられる。Ｆｃ変異体はまた、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなどのような他の免疫グロブリンクラス由来の配列を含み得る。本発明のＦｃ変異体は、ある親ＩｇＧに照らして製造されるが、該変異体は、別の、第二の親ＩｇＧに照らして製造または“変換”され得ることが考慮される。これは、一般的に、第一と第二のＩｇＧ配列間の配列または構造同一性に基づき、第一と第二のＩｇＧ間の“等価”または“対応する”残基および置換基を決定することにより行われる。相同性を確立するために、本明細書に概説する第一のＩｇＧのアミノ酸配列を、第二のＩｇＧの配列と直接比較する。アライメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮し（すなわち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を避けて）、当技術分野で公知の１個以上の相同性アライメントプログラムを用いて（例えば、種間で保存された残基を用いて）配列をアライメント後、第一のＦｃ変異体の初めの配列において特定のアミノ酸と等価の残基が定義される。保存残基のアライメントは、好ましくはかかる残基の１００％を保存すべきである。しかしながら、保存残基の７５％以上またはわずか５０％程度のアライメントも、等価残基を定義するのに適する。等価残基はまた、構造が決定されているＩｇＧの三次構造レベルで、第一と第二のＩｇＧ間の構造的相同性を決定することにより定義され得る。この場合に、等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣおよびＯとＯ）の原子座標が、アライメント後、約０．１３ｎｍ以内、好ましくは約０．１ｎｍであると定義される。アライメントは、ベストモデルが、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を与えるように方向および位置付けされた後、達成される。等価または対応残基をどのように決定するかに関わらず、かつＩｇＧが作製される親ＩｇＧの同一性に関わらず、伝えられるべきであるとされていることは、本発明により見出されたＦｃ変異体を、重要な配列またはＦｃ変異体と構造的相同性を有する何れかの第二の親ＩｇＧに改変することができることである。故に、例えば、変異体抗体を、上記の方法または等価残基を決定するための他の方法を用いることにより作製するとき（ここで、親抗体はヒトＩｇＧ１である。）、変異体抗体は、異なる抗原を結合する別のＩｇＧ１親抗体、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などに改変され得る。さらに、上記の通り、親Ｆｃ変異体においては、本発明のＦｃ変異体を他の親ＩｇＧに転換する能力に影響しない。
【０１３１】
実質的には、下記の標的リストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープが含まれるが、それらに限定されない全ての抗原は、本発明のＦｃ変異体により標的とされ得る：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１ アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３ オステオゲニン（Osteogenin）、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、
【０１３２】
ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、補体制御因子（Decay accelerating factor）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、
【０１３３】
ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ １２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在的ＴＧＦ−１、潜在的ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティ、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、
【０１３４】
ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３，−４、または−６、ニュールツリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、睾丸ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ Ｐａｎ 特異的、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、
【０１３５】
ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド ＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンド ＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａ コネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド ｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド Ａｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド ＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび成長因子のための受容体。
【０１３６】
本発明は、様々な治療的に関連のある特性について最適化されるＦｃ変異体を提供する。１個以上の最適化特性を示すように組み込まれるまたは予測されるＦｃ変異体は、本明細書中、“最適化Ｆｃ変異体”と称される。最適化され得る特性には、ＦｃγＲに対する増大または減少した親和性が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒト活性化ＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａに対して増加した親和性を有するように最適化される。別の好ましい態様において、Ｆｃ変異体は、ヒト阻害性受容体 ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した親和性を有するように最適化される。これらの好ましい態様は、例えばヒトにおける増大した治療特性を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予想される。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むが、これらに限定されないヒトＦｃγＲに対する減少または低下した親和性を有するように最適化される。これらの態様は、ヒトにおける増強された治療特性、例えば減少したエフェクター機能および減少した毒性を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予定される。他の態様において、本発明のＦｃ変異体は、１種以上のＦｃγＲに対して増大した親和性を提供するが、１個以上の他のＦｃγＲに対して減少した親和性を提供する。例えば、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対して増大した結合を有し得るが、ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した結合を有し得る。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩに対して増大した結合を有し得るが、ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した結合を有し得る。さらに別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂに対して増大した親和性を有し得るが、１個以上の活性化ＦｃγＲに対して減少した親和性を有し得る。
【０１３７】
好ましい態様には、ヒトＦｃγＲとの結合の最適化が含まれるが、別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、げっ歯動物および非ヒト霊長動物を含むが、これらに限定されない非ヒト生物由来のＦｃγＲに対して増大または減少した親和性を有する。非ヒトＦｃγＲとの結合を最適化されるＦｃ変異体は、実験で使用され得る。例えば、マウスモデルは、所定の薬剤候補についての効果、毒性、および薬物動態のような特性の検査を可能にする様々な疾患に利用可能である。当技術分野で公知の通り、異種移植と称される方法である、癌細胞を、ヒト癌を模倣するためにマウスに移植または注入することができる。１個以上のマウスＦｃγＲに対して最適化されるＦｃ変異体を含むＦｃ変異体の試験は、タンパク質の有効性、その作用機序などに関する有益な情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体はまた、グリコシル化形態の機能性および／または溶解特性を増大するために最適化され得る。好ましい態様において、本発明のグリコシル化Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体のグリコシル化形態よりも強い親和性でＦｃリガンドを結合する。該Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎ、ならびにプロテインＡおよびＧが含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはサルを含むが、これらに限定されない何れかの起源由来、好ましくはヒト由来であり得る。別の好ましい態様において、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体のグリコシル化形態よりも安定および／または溶解性になるように最適化される。
【０１３８】
本発明のＦｃ変異体は、補体タンパク質、ＦｃＲｎ、およびＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）を含むが、これらに限定されないＦｃγＲ以外のＦｃリガンドと相互作用するように調節される修飾体を含み得る。ＦｃＲＨには、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３、ＦｃＲＨ４、ＦｃＲＨ５、およびＦｃＲＨ６が含まれるが、これらに限定されない（Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１３９】
好ましくは、本発明のＦｃ変異体のＦｃリガンド特異性は、その治療的有用性を決定し得る。治療目的のための所定のＦｃ変異体の有用性は、標的抗原のエピトープまたは形態ならびに処置される疾患または適応症に依存して変わり得る。いくつかの標的および適応症について、増強したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能が、好ましい。このことは、抗癌性Ｆｃ変異体にとって特に好ましい。故に、活性化ＦｃγＲに対する増大した親和性および／または阻害性ＦｃγＲに対する減少した親和性を提供するＦｃ変異体を含むＦｃ変異体が、用いられ得る。いくつかの標的および適応症について、異なる活性化ＦｃγＲに対する異なる選択性を提供するＦｃ変異体を利用することは、さらに有益であり得る；例えば、いくつかの場合に、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａとの増加した結合が望ましいが、ＦｃγＲＩには望ましくなく、一方、他の場合において、ＦｃγＲＩＩａのみとの増加した結合が好ましい。任意の標的および適応症について、ＦｃγＲおよび補体により仲介されるエフェクター機能の両方を増強するＦｃ変異体を利用することが好ましいが、一方、他の場合について、ＦｃγＲまたは補体により仲介されるエフェクター機能のどちらかを増大するＦｃ変異体を利用するのが都合よい。いくつかの標的または癌適応症について、１個以上のエフェクター機能を、例えばＣ１ｑ、１種以上のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、または１個以上の他のＦｃリガンドとの結合をなくすことにより減少または低下することは都合よい。他の標的および適応症について、活性化ＦｃγＲとのＷＴレベルの、減少したまたは低下した結合であるが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂとの増大した結合を提供するＦｃ変異体を利用することが好ましい。このことは、例えば、Ｆｃ変異体の目的が、炎症疾患または自己免疫疾患を阻止すること、またはいくつかの方法で免疫系を調節することであるとき、特に有用であり得る。
【０１４０】
所定の疾患を処置するための所定のＦｃ変異体の最も有益な選択性を決定する明らかに重要なパラメーターは、Ｆｃ変異体であり、例えばどのタイプＦｃ変異体が用いられるかである。故に、所定のＦｃ変異体のＦｃリガンド選択性または特異性は、それが、抗体、Ｆｃ融合体、または結合した融合体もしくは複合体パートナーを有するＦｃ変異体を含むかどうかに依存して異なる特性を提供し得る。例えば、毒物、放射性核種、または他の複合体は、それらを含むＦｃ変異体が、１種以上のＦｃリガンドとの結合を減少または低下したならば、正常細胞に対して毒性が少ない。別の例として、炎症性疾患または自己免疫疾患を阻止するため、活性化ＦｃγＲと結合し、それらの活性化を阻害するような、活性化ＦｃγＲに対する増大した親和性を有するＦｃ変異体を利用することが好ましい。反対に、増大したＦｃγＲＩＩｂ親和性を有する２個以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、免疫細胞の表面上でこの受容体と共結合し、それによりこれらの細胞の増殖を阻止し得る。いくつかの場合において、Ｆｃ変異体は、１つの細胞タイプ上のその標的抗原と結合し、さらに標的抗原とは別の細胞上のＦｃγＲと結合し得るが、他の場合において、それは、標的抗原として同じ細胞の表面上のＦｃγＲとの結合に都合よい。例えば、抗体が、１種以上のＦｃγＲを発現する細胞上の抗原を標的とするならば、その細胞の表面上のＦｃγＲとの結合を増大または減少するＦｃ変異体を利用するのが有益であり得る。このことは、例えば、Ｆｃ変異体が抗癌剤として用いられるとき可能であり、同じ細胞の表面上の標的抗原およびＦｃγＲの共結合は、増殖阻害、アポトーシス、または他の抗増殖性効果をもたらす細胞内のシグナル伝達事象を促進する。あるいは、同じ細胞上の抗原およびＦｃγＲの共結合は、Ｆｃ変異体が、いくつかの方法で免疫系を調節するために使用されるとき都合よく、ここで、標的抗原およびＦｃγＲの共結合は、いくつかの増殖性または抗増殖性効果を提供する。同様に、２個以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、ＦｃγＲ選択性または特異性を調節して同じ細胞の表面上のＦｃγＲを共結合するＦｃ変異体により有益であり得る。
【０１４１】
ＦｃγＲの異なる多型形態の存在は、本発明のＦｃ変異体の治療的利用性に影響を与えるさらに別のパラメーターを提供する。ＦｃγＲの異なるクラスに対する所定のＦｃ変異体の特異性および選択性は、所定の疾患の処置のために所定の抗原を標的とするＦｃ変異体の能力に顕著な影響を与えるが、これらの受容体の異なる多型に対するＦｃ変異体の特異性または選択性は、調査または前臨床実験が、試験に適当であり得るかどうか、最終的に患者集団が、処置に応答し得るかまたは応答し得ないかを一部決定することができる。故に、本発明のＦｃ変異体の、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎおよびＦｃＲＨ多型を含むが、これらに限定されないＦｃリガンド多型に対する特異性または選択性を、有効な調査および前臨床実験、臨床試験計画、患者の選択、用量依存性、および／または他の臨床試験に関する局面の選択を導くために用いることができる。
【０１４２】
修飾は、ＩｇＧ安定性、溶解性、機能性または臨床的用途を改善するために行われ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒトにおける免疫原性を減少するための修飾を含み得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体の免疫原性を、２００４年１２月３日出願のＵＳＳＮ１１／００４，５９０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を用いて減少させる。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒト化される（Clark, 2000, Immunol Today 21:397−402、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本明細書で記載の“ヒト化”抗体は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）および非ヒト（通常、マウスまたはラット）抗体由来の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提示する非ヒト抗体は、“ドナー”と称され、フレームワークを提示するヒト免疫グロブリンは、“アクセプター”と称される。ヒト化は、主に、アクセプター（ヒト）ＶＬおよびＶＨフレームワーク上へのドナーＣＤＲの移植による（例えば、Winter et al, US 5225539、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。このストラテジーは、“ＣＤＲ移植”と称される。選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への“逆変異（Backmutation）”は、しばしば、最初に移植されたコンストラクトが欠く親和性を取り戻すのに必要である（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；および、ＵＳ６４０７２１３、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、典型的にヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含み、故に、典型的に、ヒトＦｃ領域を含み得る。非ヒト抗体のヒト化および再形成のための様々な技術および方法は、当技術分野でよく知られている（Tsurushita ＆ Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533−545, Elsevier Science (USA)、およびそこに引用される文献を参照のこと、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化方法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522−525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323−329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534−1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029−33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029−1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593−9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181−4185; O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321−8（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法が含まれるが、それらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減じるヒト化方法または他の方法には、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969−973（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載のような、表面再形成法が含まれ得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野でよく知られている通り、成熟した親和性を有する。構造に基づく方法は、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載のヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151−162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611−22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910−8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753−759（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟に用いられ得る。他のヒト化方法は、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119−1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076−3084（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない、ＣＤＲの一部のみの移植を伴い得る。
【０１４３】
免疫原性を減少する修飾には、親配列由来の処理ペプチドのＭＨＣタンパク質への結合を減少する修飾が含まれ得る。例えば、アミノ酸修飾は、どんな一般的なＭＨＣアレルにも高親和性で結合することが予測される免疫エピトープがないかまたはそれが最小数となるように、作製され得る。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が、当技術分野で公知であり、本発明のＦｃ変異体中のエピトープを数えるために用い得る。例えば、ＷＯ９８／５２９７６；ＷＯ０２／０７９２３２；ＷＯ００／３３１７；ＵＳＳＮ０９／９０３，３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９，１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２，６９７；ＵＳＳＮ１０／７５４，２９６；ＰＣＴ ＷＯ ０１／２１８２３；および、ＰＣＴ ＷＯ ０２／００１６５；Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942−948；Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561；ＷＯ９８／５９２４４；ＷＯ０２／０６９２３２；ＷＯ０２／７７１８７；Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927−5933；and Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353−2358（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。配列に基づく情報は、所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用の結合スコアを決定するために用い得る（例えば、Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942−948；Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561を参照のこと、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１４４】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、１個以上の改変された糖鎖（engineered glycoform）を含む。本明細書で用いる“改変された糖鎖”は、ＩｇＧと共有結合する炭水化物組成物を意味し、ここで該炭水化物組成物は、親ＩｇＧのそれと化学的に異なる。改変された糖鎖は、エフェクター機能を増強するかまたは減少することを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変された糖鎖は、当技術分野で公知の様々な方法により作製され得る（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466−3473）；（ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１）；（PotelligentTM technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）glycosylation engineering technology [GLYCART Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]）（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。多くのこれらの技術は、例えば遺伝子組み換えまたは他の様々な生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現することによるか、またはグリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによるか、またはＩｇＧが発現された後、炭水化物（複数可）を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合するオリゴ糖のフコシル化レベルを制御すること、および／またはそれを２つに切断することに基づく。改変された糖鎖は、典型的に、異なる炭水化物またはオリゴ糖と称される；故に、Ｆｃ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、改変された糖鎖を含み得る。あるいは、改変された糖鎖は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＦｃ変異体と称され得る。
【０１４５】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、別の治療化合物と結合されるか、または作動可能に連結される。該治療化合物は、細胞毒性剤、化学療法剤、毒物、放射性同位体、サイトカイン、または他の治療的活性剤であり得る。ＩｇＧは、様々な非タンパク性ポリマーのうち１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーと結合し得る。
【０１４６】
本発明は、Ｆｃ変異体を製造、産生およびスクリーニングするための方法を提供する。記載の方法は、本発明が、何れかの特定の用途または操作理論にとらわれることを意味しない。むしろ、提供される方法は、一般的に、１種以上のＦｃ変異体が、最適化されたエフェクター機能を有するＦｃ変異体を実験的に得るために、製造、産生、およびスクリーニングされ得ることを説明することを意図する。様々な方法が、抗体の設計、産生、および試験、ならびにタンパク質変異体について、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。
【０１４７】
様々なタンパク質製造方法が、最適化したエフェクター機能を有するＦｃ変異体を設計するために用いられ得る。１つの態様において、構造に基づく製造方法を用いることができ、ここで利用可能な構造情報を、置換を誘導するために用いる。配列のアライメントを、表示の位置での置換を誘導するために用いることができる。あるいは、無作為的または半無作為的変異誘導法を、所望の位置にアミノ酸修飾を製造するために用いることができる。
【０１４８】
Ｆｃ変異体の製造方法およびスクリーニング方法は、当技術分野でよく知られている。抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングのための一般的方法は、Antibody Engineering、Duebel ＆ Kontermann編集, Springer−Verlag, Heidelberg, 2001；および、Hayhurst ＆ Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683−689；Maynard ＆ Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−76（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。また、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を参照のこと。
【０１４９】
本発明の１つの態様において、Ｆｃ変異体配列を、メンバー配列をコードし、故に、宿主細胞中にクローニングされ、要すれば発現され、かつ分析され得る核酸を製造するために用いる。これらの実施を、公知の方法、およびMolecular Cloning−A Laboratory Manual, 3rd Ed.（Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology（John Wiley ＆ Sons）（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の、本発明において使用され得る様々な方法を用いて行う。本発明のＦｃ変異体を、タンパク質の発現を誘導または引き起こすのに適当な条件下で、Ｆｃ変異体をコードする核酸を含む、核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することにより作製することができる。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母を含むが、これらに限定されない多様な適当な宿主細胞を、用いることができる。例えば、本発明において使用され得る様々な細胞系は、ＡＴＣＣ細胞系カタログ（American Type Culture Collectionにより利用可能）に記載される。宿主細胞中に外来の核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、用いる宿主細胞により異なり得る。
【０１５０】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体を発現後に精製または単離する。抗体を、当業者に公知の多様な方法で単離または精製することができる。標準的精製方法には、クロマトグラフ法、電気泳動法、免疫学的方法、沈殿法、透析法、ろ過法、濃縮法およびクロマト分画技術が含まれる。当技術分野で公知の通り、様々な天然タンパク質、例えば細菌プロテインＡ、Ｇ、およびＬが抗体に結合し、これらのタンパク質は、精製用に本発明で使用され得る。しばしば、精製は、特定の融合パートナーにより可能であり得る。例えば、タンパク質を、ＧＳＴ融合が用いられるときグルタチオン樹脂を用いて、Ｈｉｓタグが用いられるときＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを用いて、またはフラグタグが用いられるとき固定化抗フラグ抗体を用いて精製することができる。適する精製技術における一般的ガイダンスについては、Antibody Purification： Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer−Verlag, NY, 1994（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１５１】
Ｆｃ変異体を、インビトロ分析、インビボおよび細胞に基づくアッセイ、ならびに選択技術に用いる方法を含むが、これらに限定されない様々な方法を用いてスクリーニングすることができる。自動化高性能スクリーニング技術を、スクリーニング方法に利用することができる。スクリーニングには、融合パートナーまたは標識、例えば免疫標識、同位体標識、または蛍光もしくは比色色素のような小分子標識の使用を用いることができる。
【０１５２】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体の機能的および／または生物物理的特徴を、インビトロ分析においてスクリーニングする。好ましい態様において、タンパク質を、機能性、例えばその反応を触媒する能力またはその標的に対するその結合親和性についてスクリーニングする。
【０１５３】
当技術分野で公知の通り、スクリーニング法の一部には、ライブラリーの好ましいメンバーを選択する方法が含まれる。該方法は、本明細書中、“選択方法”と称され、これらの方法は、本発明においてＦｃ変異体のスクリーニングに使用される。タンパク質ライブラリーを、選択方法を用いてスクリーニングするとき、増殖され、単離され、および／または観察されるライブラリーのメンバーのみが、いくつかの選択基準を満たすとして好ましい。本発明においてタンパク質ライブラリーのスクリーニングに使用され得る様々な選択方法が、当技術分野で公知である。本発明において使用され得る他の選択方法には、インビボ方法のような提示によらない方法が含まれる。“定向進化（directed evolution）”法と称される選択方法の一部は、時折新規の変異の挿入を含む、選択中の好ましい配列のメイティング（mating）またはブレッディング（breading）を含む方法である。
【０１５４】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体を、１個以上の細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイを用いてスクリーニングする。そのような分析のために、精製または非精製タンパク質が典型的に、細胞が個々の変異体またはライブラリーに属する変異体の集合に暴露されるように、細胞外に添加される。これらの分析は、常にではないが一般的に、Ｆｃポリペプチドの機能に基づく；すなわち、その標的に結合し、いくつかの生化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなどを仲介するＦｃポリペプチドの能力に基づく。かかる分析はしばしば、ＩｇＧに対する細胞の応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、または天然遺伝子もしくはレポーター遺伝子の細胞発現のような転写活性化を観察することを含む。例えば、かかる分析は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣを誘導するＦｃ変異体の能力を測定することができる。いくつかの分析に関して、標的細胞に加えて、さらなる細胞または成分、例えば血清補体、または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を添加する必要があり得る。かかる添加細胞は、何れかの生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来であり得る。抗体は、標的を発現する任意の細胞系のアポトーシスを引き起こし得るか、またはその分析に添加された免疫細胞による標的細胞への攻撃を仲介し得る。細胞死または細胞生存を観察するための方法は、当技術分野で公知であり、それらには、色素、免疫化学的反応剤、細胞化学的反応剤、および放射性反応剤の使用が包含される。転写活性化は、細胞に基づくアッセイにおいて機能を分析するための方法にもなり得る。あるいは、細胞に基づくスクリーニングを、変異体をコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトした細胞を用いて行う。すなわち、Ｆｃ変異体を、細胞に対して細胞外に添加しない。
【０１５５】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体の免疫原性を、１個以上の細胞に基づくアッセイ法を用いて実験的に決定する。いくつかの方法を、エピトープの実験的確認に用いることができる。
【０１５６】
本発明のＦｃ変異体の生物学的特徴を、細胞、組織および生物全体の実験において特徴付けることができる。当技術分野で公知の通り、薬剤をしばしば、疾患または疾患モデルに対する処置のための薬剤の効果を測定するため、または薬剤の薬物動態、毒性および他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むが、これらに限定されない動物において試験する。該動物は、疾患モデルと称され得る。治療剤をしばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、および遺伝子組み換えマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むが、それらに限定されないマウスにおいて試験する。かかる実験は、治療剤として用いられるタンパク質の可能性を決定するための意味のあるデータを提供することができる。何れかの生物、好ましくは哺乳動物を試験に用いることができる。例えばヒトに遺伝的に類似するため、サルを適する治療モデルとすることができ、故に、本発明のＩｇＧの効果、毒性、薬物動態、または他の特性を試験するために用いることができる。ヒトにおける試験が、薬剤としての承認のために最終的に必要であり、故に、もちろんこれらの実験が意図される。従って、本発明のＩｇＧをヒトにおいて試験し、その治療効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定することができる。
【０１５７】
本発明のＦｃ変異体は、様々な製品に用いられ得る。１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、治療剤、診断剤、または実験反応剤であり、好ましくは治療剤である。Ｆｃ変異体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物に用いられ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞を殺すために使用する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、例えばサイトカインまたはサイトカイン受容体をアンタゴナイズするために用いる。別の好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、および標的抗原を有する標的細胞を殺すために用いる。
【０１５８】
本発明のＦｃ変異体を、様々な治療目的に用いることができる。好ましい態様において、Ｆｃ変異体を含む抗体を、抗体関連疾患を処置するために患者に投与する。本目的に関して“患者”には、ヒトおよび他の動物、好ましくは哺乳動物が含まれ、最も好ましくはヒトである。本明細書中、“抗体関連疾患”または“抗体応答性疾患”または“状態”または“疾患”は、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与により緩和され得る疾患を意味する。抗体関連疾患には、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経疾患、疼痛、肺疾患、血液学的状態、線維性状態、ならびに癌を含む腫瘍性および新生物性疾患が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中、“癌”および“癌性”は、制御されない細胞増殖により典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を意味するか、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮種、神経鞘腫（schwanoma）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、ならびに白血病およびリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。処置され得る他の状態には、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群（Sjorgren's disease）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびアレルギー状態、移植片対宿主疾患などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いる用語“処置”は、治療的処置、ならびに疾患、状態もしくは障害の予防的、または抑制的手段を含むことを意味する。故に、例えば、疾患の発症前の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、結果として疾患の“処置”をもたらす。別の例として、疾患の症状に対抗するための疾患の臨床症状後の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、疾患の“処置”に含まれる。“処置”はまた、疾患を根絶するための、疾患の出現後の本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与を含む。臨床症状の排除可能性および疾患の改善可能性を有する、発症後および臨床症状の発生後の本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、疾患の“処置”に含まれる。本明細書で用いる用語“処置を必要とする”ものには、予防されるべき疾患または障害を含む該疾患または障害を既に有する哺乳動物、ならびに該疾患または障害を有する傾向のある哺乳動物が含まれる。
【０１５９】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、患者に投与される唯一の治療的活性剤である。あるいは、本発明のＦｃ変異体を、細胞毒性薬、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、心臓保護剤、または他の治療剤を含むが、それらに限定されない１個以上の他の治療剤と併用して、ならびに外科手術の前または後に投与する。ＩｇＧ変異体を、１個以上の他の治療レジメンと併用して投与し得る。例えば、本発明のＦｃ変異体を、外科手術、化学療法、放射線治療、または外科手術、化学療法および放射線治療のいずれかもしくは全てと併用して、患者に投与し得る。１つの態様において、本発明のＦｃ変異体を、本発明のＦｃ変異体を含み得るかまたは含み得ない１個以上の抗体と併用投与することができる。本発明の別の態様に従い、本発明のＦｃ変異体および１個以上の他の抗癌治療剤を、エクスビボで癌細胞の処置に用いる。かかるエクスビボ処置は、骨髄移植および特に、自家骨髄移植に有用であり得ると考えられる。もちろん、本発明のＦｃ変異体は、外科手術のような、さらに他の治療技術と組み合わせて用いることができると考えられる。
【０１６０】
様々な他の治療剤が、本発明のＦｃ変異体との併用投与に使用され得る。１つの態様において、ＩｇＧを、血管形成阻害剤と併用投与する。本明細書で用いる“血管形成阻害剤”は、血管の形成を阻止、またはある程度妨げる化合物を意味する。血管形成阻害因子は、例えば、血管形成の促進に関与する増殖因子または増殖因子受容体と結合する、小分子またはタンパク質、例えば抗体、Ｆｃ融合体もしくはサイトカインであり得る。本明細書中、好ましい血管形成阻害因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体である。別の態様において、ＩｇＧを、適応的免疫応答を誘導または増大する治療剤、例えばＣＴＬＡ−４を標的とする抗体と共に投与する。別の態様において、ＩｇＧを、チロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。本明細書で用いる“チロシンキナーゼ阻害剤”は、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、サイトカインと共に投与する。本明細書で用いる“サイトカイン”は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、ある細胞集団により放出されるタンパク質の一般名を意味する。
【０１６１】
医薬組成物とは、本発明のＦｃ変異体および１個以上の治療的活性剤が、製剤されることを意図する。本発明のＦｃ変異体の製剤は、所望の純度を有するＩｇＧを、所望により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980、参照によりその全体が本明細書中に包含される）と共に混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に保存用に調製される。インビボ投与用に使用される製剤を、好ましくは滅菌する。これは、滅菌ろ過膜を通すろ過または他の方法により容易に達成される。本明細書に記載のＦｃ変異体および他の治療的活性剤は、免疫リポソーム、および／またはマイクロカプセル封入としても製剤され得る。
【０１６２】
製剤中の治療的に活性なＦｃ変異体の濃度は、約０．００１ないし１００重量％で変化し得る。好ましい態様において、ＩｇＧの濃度は、０．００３ないし１．０モルの範囲内である。患者を処置するために、本発明のＦｃ変異体の治療的有効用量を投与することができる。本明細書中、“治療的有効用量”とは、それが投与されて効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存して変化し、公知の技術を用いて当業者により確認され得る。投与量は、体重１ｋｇ当たり０．００１ないし１００ｍｇまたはそれ以上、例えば体重１ｋｇ当たり０．１、１、１０、または５０ｍｇの範囲であり、１ないし１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当技術分野で公知の通り、タンパク質分解、全身的対局所送達、および新しいタンパク質合成の速度、ならびに年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、薬剤の相互作用および状態の重症度に関する調整が必要であり、当業者により常套的実験にて確認され得る。
【０１６３】
好ましくは滅菌水溶液の形態の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与を、経口、皮下、静脈内、経鼻的、耳内（intraotically）、経皮的、局所的（例えば、ジェル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigmにより市販されるＡＥＲｘ（登録商標）吸入可能技術、またはInhale Therapeuticsにより市販されるＩｎｈａｎｃｅ（登録商標）肺送達システムなど）、経膣的、非経腸的、経直腸的、または眼内（intraocularly）を含むが、それらに限定されない様々な方法で行うことができる。本明細書に記載の治療剤を、他の治療剤と併用して投与することができる。
【実施例】
【０１６４】
実施例
下記の実施例を、本発明を説明するために提供する。これらの実施例は、どんな特定の適用または操作理論にも本発明を制限することを意味しない。
【０１６５】
実施例１．増大したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を用いて、さらなるＦｃ変異体を、Ｆｃリガンドとの結合を増大し、エフェクター機能を最適化するため、ならびにＦｃγＲ結合およびエフェクター機能を減少または低下させるために設計した。該変異体を、細胞に基づくアッセイにおいて測定可能なＣＤＣおよびＡＤＣＣを仲介することが知られる、抗ＣＤ２０抗体であるＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に照らして構築した。既に特徴付けられた変異体もまた、それらの特性をさらに特徴付け、現在の一連の新しい変異体の比較物（comparator）を提供するために、ＰＲＯ７０７６９中にコンストラクトした。図５は、これらのＦｃ変異体のリストを提供する。とりわけ、この変異体セットには、多くの挿入が含まれる。例えば、“インサート Ｌ＞２３５−２３６／Ｉ３３２Ｅ”は、Ｉ３３２Ｅ置換および残基２３５と２３６位の間へのロイシンの挿入を含む二重変異体を意味する。
【０１６６】
ＰＲＯ７０７６９の可変領域の遺伝子（図２４ａおよび２４ｂ）を、リカーシブ（recursive）ＰＣＲを用いてコンストラクトし、全長軽鎖カッパ（Ｃκ）および重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（Invitrogen）中にサブクローニングした。変異体を、ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ変異誘発技術（Stratagene）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏベクター中の抗体の可変領域中にコンストラクトし、２９３Ｔ細胞中で発現させた。ＤＮＡを、配列の忠実度を確認するために配列決定した。重鎖遺伝子（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）（野生型または変異体）を含むプラスミドを、軽鎖遺伝子（ＶＬ−Ｃκ）を含むプラスミドと共に、２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクトした。培地をトランスフェクションの５日後に集め、抗体をプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Pierce）を用いて上清から精製した。選択したＦｃ変異体は、アレムツズマブにおいても発現した。
【０１６７】
ＩｇＧ抗体によるヒトＦｃγＲに対する結合親和性を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ競合分析を用いて測定した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、ビーズに基づく発光近接分析である。ドナービーズのレーザー励起は、酸素を励起し、アクセプタービーズとの接近が十分なとき、化学発光事象のカスケードを生じ、最終的に５２０−６２０ｎｍでの蛍光放出をもたらし得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを、抗体をスクリーニングするための競合分析として用いた。野生型ＩｇＧ１抗体を、ストレプトアビジン ドナービーズへの標準的結合方法によりビオチン化し、タグ付きＦｃγＲを、グルタチオンキレート アクセプタービーズに結合させた。競合するＦｃポリペプチドの不存在において、野生型抗体およびＦｃγＲが相互作用し、５２０−６２０ｎｍでのシグナルを生じる。タグの付いていない抗体の添加は、野生型Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用と競合し、蛍光を定量的に減少させて相対的結合親和性の決定を可能にする。
【０１６８】
図６は、ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体の結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合データを提供する。該データを、非線形回帰を用いて一部位競合モデルに適合させ、これらの適合を、図中曲線で示す。これらの適合は、各抗体についての５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）（すなわち、５０％阻害に必要な濃度）を提供し、故に、ＷＴと比較した相対的結合親和性を決定することができる。図５は、これらの結合曲線への適合についての、ＷＴと比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１６９】
選択したＦｃ変異体を再発現させ、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて再試験した（図７）。図７ａは、これらの変異体の結合データを示し、図７ｂは、これらの結合曲線への適合についての、ＷＴと比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１７０】
これらのデータに基づき、多くのさらなるＦｃ変異体を、ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らしてコンストラクトした。さらに、いくつかのＦｃ変異体を、２００５年１０月２１日出願のＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の新規ＩｇＧ分子であるＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧに照らしてコンストラクトした。これらの変異体を、上記の通りにコンストラクトし、多くの既に特徴付けられたＦｃ変異体と共に発現させ精製した。これらの変異体を図８ａに列記する。ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、ならびに阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの該変異体の結合を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて測定した。図８ｂは、選択した変異体のこれらの受容体との結合データを示し、図８ａは、この一連のＦｃ変異体全てについての、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１７１】
該アッセイの高反応性性質のため、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、相対的親和性のみ提供する。正確な結合定数を、抗体／ＦｃγＲ平衡における非結合抗体をＦｃγＲＩＩＩａ表面に捕捉した、競合ＳＰＲ装置（Nieba et al., 1996, Anal Biochem 234:155−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いて得た。この実験を、上記でコンストラクトされ特徴付けられたトラスツズマブ ＩｇＧ１に照らして、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体を用いて行った（ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、およびＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＷＴおよび変異体トラスツズマブ抗体を、上記の通りに発現させ精製した。この実験に関して、データをＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（BIAcore）で得た。Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴを、固定化抗ＧＳＴ抗体を用いて捕捉し、組み換えＧＳＴを用いてブロッキングし、抗体／受容体への結合競合分析物を測定した。抗ＧＳＴ抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ ＧＳＴキャプチャーキットを用いてＣＭ５センサーに共有結合させた。各センサーチップに１個のフローセルを、非特異的結合の対照としてエタノールアミンと結合させ、バルク屈折率変化をオンラインで減算した。泳動バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、BIAcore）であり、チップ再生バッファーは、グリシン１．５（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５、BIAcore）であった。１μＭ Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴを、１μｌ／分にて５分間、ＨＢＳ−ＥＰ中で抗ＧＳＴ ＣＭ５チップに結合させた。表面を、１μｌ／分にて２分間、５μＭの組み換えＧＳＴ（Sigma）を注入してブロッキングした。１００ｎＭの野生型または変異体トラスツズマブ抗体を、４ないし１０００ｎＭの間の連続希釈のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴと合わせ、室温で少なくとも２時間インキュベートした。該競合結合物を、５０μｌ／分にて、ＨＢＳ−ＥＰ中、３０秒間の結合のために、Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴ／組み換えＧＳＴ表面上に注入した。抗体を含むが競合受容体を含まない１サイクルが、ベースライン応答を提供した。
【０１７２】
上記の“競合ＢＩＡｃｏｒｅ”法を用いて、動力学的曲線を結合率を導くために適合させた（Nieba et al., 1996, Anal Biochem 234:155−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本発明者らは、動力学的曲線から得られる結合率が用いた抗体濃度に非線形相関を示したため、この方法があまり信頼性のないことを見出した。本研究に用いた分析は、初期結合率Ｒの遊離抗体濃度との比例に基づく（Holwill et al., 1996, Process Control and Quality 8:133−145; Edwards ＆ Leatherbarrow, 1997, Anal Biochem 246:1−6、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。応答単位データを、ＢＩＡ評価ソフトウェア（BIAcore）を用いて出力し、Ｘｌｆｉｔバージョン３．０．５のマイクロソフトＥｘｃｅｌ（IDBS）を用いて分析した。（シグナル増加の）初期結合率値を、傾きのＥｘｃｅｌ式を用いて各センサーグラムの生データから決定した。平衡解離結合定数（ＫＤ）を、各濃度で得られた初期結合率に対するＦｃγＲＩＩＩａ濃度のｌｏｇ値をプロットすることにより決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）を用いて、下記の式にデータを合わせた：
【０１７３】
【数１】
〔式中、
［Ａ０］＝抗体濃度
Ｒ０＝競合する受容体の不存在下での、抗体濃度Ａ０での初期結合率
Ｘ＝ｌｏｇ［Ｌ０］（ここで、［Ｌ０］＝インプット受容体濃度である。）
ＫＤ＝平衡解離定数である。〕。
Ｒ０は、抗体と固定化受容体との結合率を示し（競合する受容体の不存在下での）、それらの異なる受容体親和性のため、それを、ＷＴ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ抗体について別個に計算した。
【０１７４】
初期結合率Ｒについての式は、単一の結合部位についてのＫＤ：
【数２】
で示される定義、および質量保存式
【数３】
〔式中：
［Ｌ］＝遊離受容体の濃度である。〕
から導かれる。
【０１７５】
初期結合率を、センサーグラムの生データから決定し（図９ａ）、ＫＤ値を、各濃度で得られる初期結合率に対する受容体濃度のｌｏｇ値をプロットすることにより計算した（図９ｂ、９ｃ）（Edwards ＆ Leatherbarrow, 1997, Anal Biochem 246:1−6、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＷＴ ＫＤ（２５２ｎＭ）は、公表されたデータとよく一致する（ＳＰＲからの２０８ｎＭ、熱量測定からの５３５ｎＭ）（Okazaki et al., 2004 J Mol Biol 336:1239−4９、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｉ３３２Ｅ（３０ｎＭ）およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２ｎＭ）変異体のＫＤ値は、Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対してそれぞれおよそ１０倍および１００倍値（1-および2-logs）の強い親和性を示す。
【０１７６】
本発明のＦｃ変異体を含む抗体の、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を発揮するための能力を調査するために、インビトロでの細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いて行った。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いてラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ヒトＰＢＭＣを、フィコール・グラディエント（ficoll gradient）法を用いてｌｅｕｋｏｐａｃｋから精製し、ＣＤ２０＋標的リンパ腫細胞株ＷＩＬ２−ＳをＡＴＣＣから得た。標的細胞を、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで播種し、Ｆｃ変異体またはＷＴ抗体を示した最終濃度で用いてオプソニン化した。トライトンＸ１００およびＰＢＭＣのみを、対照として用いた。エフェクター細胞を、ＰＢＭＣ：標的細胞を２５：１で添加し、プレートを、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を、ＬＤＨ反応混合物と共にインキュベートし、蛍光を、ＦｕｓｉｏｎＴＭＡｌｐｈａ−ＦＰ（Perkin Elmer）を用いて測定した。データを、最大溶解（トライトン）および最小溶解（ＰＢＭＣのみ）に標準化し、シグモイド型用量応答モデルに合わせた。図１０は、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧのどちらかにおける選択したＦｃ変異体抗体についてのこれらのデータを提供する。Ｆｃ変異体は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１抗体と比較して、ＦｃγＲにより仲介されるＣＤ２０＋標的細胞溶解における明確な増大を提供する。
【０１７７】
これらのインビトロ分析は、本発明のＦｃ変異体が、臨床設定における増強した効力および／または有効性を提供し得ることを示唆する。インビボ性能は、これらのインビトロ実験で検討されないいくつかの因子を含む多くの因子の影響を受け得る。１つのそのようなパラメーターは、抗体の臨床効力に影響を与えることが示されている、血清中非特異的ＩｇＧの高濃度である（Vugmeyster ＆ Howell, 2004, Int Immunopharmacol 4:1117−24; Preithner et al., 2005, Mol Immunol, 43(8):1183−93、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本発明のＦｃ変異が、インビボ生物学により酷似した溶液中でどのように起こるのかを調べるため、ＡＤＣＣアッセイを、生物学的に関連する濃度（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト血清から精製したＩｇＧ（Jackson Immunoresearch Lab, Inc.により市販されている）の存在下で繰り返した。これらのデータを、図１１に示す。ＷＴ 抗ＣＤ２０抗体の有効性は、血清レベルのＩｇＧの存在下で減少するだけでなく、完全になくなる。対照的に、Ｆｃ変異体抗体は、顕著に減少するが、依然、標的細胞系を殺すのを仲介する実質的な能力を示す。
【０１７８】
実施例２．増大した補体により仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
多くの変異体を、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するのを目的として設計した。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを仲介するのと同じ方法で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を仲介する。現在、Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に利用可能な構造は存在しない；しかしながら、変異誘発研究は、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を中心とする領域にＣ１ｑのためのヒトＩｇＧ上の結合部位をマッピングした（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178−4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571−2575、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。図１２は、このマッピングされた中心点を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造を示す。これらの４個の残基に構造的に近いＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）に開示される選択したアミノ酸修飾を、Ｃ１ｑに対する増加した親和性を仲介し、および／または増加したＣＤＣを提供し得る変異体を探索するために調査した。増加したＦｃγＲ親和性およびＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を既に示した変異体には、この一連の変異体が含まれ、それらの相補的特性を特徴付けた。この変異体ライブラリーを、図１３に示す。
【０１７９】
該変異体を、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９（可変領域）および重鎖定常領域としてＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして、上記の通りにコンストラクトした。変異体を、上記の通りに発現させて精製した。細胞ベースの分析を、Ｆｃ変異体がＣＤＣを仲介する能力を測定するために用いた。溶解を、Ｆｃ変異体およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９によりオプソニン化したＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞の溶解をヒト血清補体によりモニターするために、アラマーブルーの放出を用いて測定した。標的細胞を、１０％ＦＢＳ培地で遠心および再懸濁して３回洗浄し、ＷＴまたは変異体リツキシマブ抗体を、示した最終濃度で添加した。ヒト血清補体（Quidel）を、培地を用いて５０％に希釈し、抗体によりオプソニン化した標的細胞に添加した。補体の最終濃度は、原液の１／６であった。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、アラマーブルーを添加し、細胞を２日間インキュベートし、蛍光を測定した。この分析の代表的なデータを図１４に示す。結合データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれでのベースラインにより、それぞれの特定の曲線について最大および最小発光シグナルに標準化した。データを、非線形回帰を用いて傾き変化モデル（variable slope model）を含むシグモイド型用量応答に適合させ、これらの適合を、図に曲線で示す。これらの適合は、Ｆｃ変異体の相対的結合親和性を定量的に決定するのを可能にする、各抗体についての５０％有効濃度（ＥＣ５０）（すなわち、５０％応答に必要な濃度）を提供する。各変異体のＥＣ５０をＷＴ ＰＲＯ７０７６９のＥＣ５０で割ることにより、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９（ＷＴ倍数）と比較した増加倍数または減少倍数を得た。これらの値を、図１３に示す。ここで、１を超える倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９と比較してＣＤＣ ＥＣ５０の増大を示し、１より小さい倍数は、ＣＤＣ ＥＣ５０の減少を示す。
【０１８０】
図１３および１４のデータは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較して増大したＣＤＣを提供することを示す。例えば、２倍以上のＣＤＣの増大が、修飾２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７２Ｉ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｒ、２８２Ｇ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｔ、３２４Ｉ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２６Ｅ、３２６Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ｆ、３３４Ｔおよび３３５Ｄで観察される（図１５）。さらに、データは、多くの修飾体が、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較して減少したＣＤＣを提供することを示す。例えば、０．５倍以下の相対的ＣＤＣを示す修飾には、２３５Ｄ、２３９Ｄ、２８４Ｄ、３２２Ｈ、３２２Ｔ、３２２Ｙ、３２７Ｒ、３３０Ｅ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｖ、３３１Ｄ、３３１Ｌおよび３３２Ｅが含まれる（図１５）。これらの修飾は、増大したＣＤＣのための変異体のさらなる設計を導くために用いられ得るさらなる有益な構造活性相関（ＳＡＲ）情報を提供する。同時に、データは、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７２位、２７６位、２７８位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位および３３５位（図１５）での修飾が、親Ｆｃポリペプチドと比較して、増大したＣＤＣを提供し得ることを示唆する。
【０１８１】
実施例３．減少したＦｃγＲおよび補体により仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
上記の通り、エフェクター機能が臨床効果に貢献する抗体治療および適応とは対照的に、いくつかの抗体および臨床適用に関して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少するもしくは除去するか、またはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを含むが、これらに限定されない１個以上のＦｃγＲまたは補体により仲介されるエフェクター機能を減少するもしくは除去するのが、好ましい。これはしばしば、その作用機序が標的抗原を有する細胞の死ではなく、その阻止または拮抗作用を伴う治療抗体の場合である。これらの場合において、標的細胞の減少は望ましくなく、副作用と見なされ得る。エフェクター機能はまた、放射性複合体と称される放射性標識抗体、および免疫毒素と称される毒素と複合体形成した抗体についての課題でもあり得る。これらの薬物を、癌細胞を破壊するために用いることができるが、ＦｃとＦｃγＲとの相互作用による免疫細胞の捕捉は、有害なペイロード（放射物または毒素）の近接域に健康な免疫細胞をもたらし、結果として標的癌細胞と共に正常なリンパ系組織の減少をもたらす。
【０１８２】
低下したＦｃγＲ結合および補体結合の従来考慮されていなかった利点は、エフェクター機能が必要ない場合に、ＦｃγＲおよび補体との結合が、薬物の活性濃度を効果的に低下し得ることである。Ｆｃリガンドとの結合は、抗体またはＦｃ融合体、または血清タンパク質が遊離の（複合体を形成していない）ときと比較して活性が低いかまたは不活性である血清タンパク質との複合体を細胞表面に局在化させ得る。これは、抗体が所望される結合部位での低下した有効濃度のためか、または恐らく、Ｆｃリガンド結合が、Ｆｃポリペプチドを、非結合であった場合より活性が低い立体構造にし得るためである。さらなる考察は、ＦｃγＲ受容体が、抗体のターンオーバーの１つ機序であり得ること、ならびに樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞による取り込みおよびプロセシングを仲介し得ることである。これは、抗体またはＦｃ融合体の薬物動態（または、インビボ半減期）およびその免疫原性（両方とも、臨床パフォーマンスの重要なパラメーターである。）に影響を与え得る。
【０１８３】
Ｆｃ／ＦｃγＲ構造（図２）および上記のＦｃ／Ｃ１ｑ接合部位（図１２）の外観図、ならびに上記およびＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）のデータを、ＦｃγＲに対する減少した親和性、および減少したＣＤＣを有する変異体をスクリーニングするためのライブラリーの設計の指針に用いた。この変異体ライブラリーを図１６に示す。変異体を、ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らしてコンストラクトし、上記の通り発現させ精製した。相対的ＦｃγＲ親和性を、上記の通りに、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて測定した。図１７は、選択したＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示し、図１６は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したそのＩＣ５０倍数を示す。変異体を、上記のＣＤＣアッセイを用いて、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する補体仲介性溶解を仲介するその能力についても調べた。図１８は、選択したＦｃ変異体のＣＤＣデータを示し、図１６は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＥＣ５０倍数を示す。これらの実験の結果に基づき、選択したＦｃ変異体を、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を仲介するその能力について特徴付けた。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、およびＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞を標的細胞として用いるＡＤＣＣアッセイを、上記の通りに行った。図１９は、選択した変異体についてのこれらのＡＤＣＣデータを示す。
【０１８４】
データは、多くの位置での修飾が、減少または低下したＦｃγＲ親和性、減少したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および減少した補体により仲介されるエフェクター機能を提供することを示す。さらに、２３５および３３０位を含むがこれらに限定されないいくつかの位置での修飾は、減少したＣＤＣを提供するが、ＦｃγＲ親和性はＷＴレベルであり得る。例えば、２３５Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｎおよび３３０Ｒは、そのような作用を示す。あるいは、２３６位および２９９位を含むがこれらに限定されないいくつかの位置における修飾は、減少したＦｃγＲ親和性を提供するが、ＣＤＣはＷＴレベルであり得る。例えば、２３６Ｉおよび２９９Ａは、これらの特性を示す。
【０１８５】
これらの実験の結果に基づき、ＦｃγＲ親和性およびＣＤＣを同時に低下する多くの修飾を、完全に低下したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能を有する変異体をスクリーニングするために設計されたＦｃ変異体の新しいライブラリー中の多数の変異を有する変異体に組み合わせた。これらの変異体は、２３４位、２３５位、２３６位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位での修飾を含み、図２０に示す。ＷＴ ＩｇＧ１抗体、ならびにＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体変異体、グリコシル化変異体Ｎ２９７Ｓ、および減少したエフェクター機能を有することが既に特徴付けられた２つの変異体：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Xu et al., 2000, Cellular Immunology 200:16−26；ＵＳＳＮ１０／２６７，２８６、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−（Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が、包含される。
【０１８６】
これらの変異体を、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体以外の重鎖定常領域であるＩｇＧ１を含み、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９に照らしてコンストラクトした。抗体を、上記の通りに発現させ精製した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを、Ｆｃ変異体の相対的ＦｃγＲ親和性を測定するために、上記の通りに用いた。図２１は、選択した変異体の、低親和性のヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、ならびに高親和性のヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。ＷＴと比較したＩＣ５０倍数を、図２０に示す。Ｆｃ領域に対するそのより大きな結合親和性のため、ＦｃγＲＩは、変異体のよりストリンジェントな試験を提供する。図２０および２１のデータはこれを支持し、変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を実質的に減少し得るかまたは完全に低下し得るが、ＦｃγＲＩ結合にはあまり影響しないことを示す。Ｆｃ変異体はまた、上記のＣＤＣアッセイを用いて、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対して補体仲介性溶解を仲介するそれらの能力を試験した。図２２は、選択したＦｃ変異体についてのＣＤＣデータを示し、図２０は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＥＣ５０倍数を示す。
【０１８７】
Ｆｃ変異体がＡＤＣＣを仲介する能力を調べるため、選択した変異体を、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（可変領域配列を、図２４ｃおよび２４ｄに示す）中にサブクローニングした。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２＋発現細胞系に対してＡＤＣＣアッセイにおいて実質的なシグナルを確実に提供し、故に、エフェクター機能を減少／低下するＦｃ変異体の厳しい検査を提供する。Ｆｃ変異体Ｌ２３５Ｇ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ｋ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｒ／Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３６Ｒ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｇ２３７Ｋ／Ｎ３２５Ｌ、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ／Ｇ２３７ＫおよびＧ２３６Ｒ／Ｇ２３７Ｋ／Ｌ３２８Ｒを、トラスツズマブＩｇＧ１に照らしてコンストラクトした。ＷＴ ＩｇＧ１、ＷＴ ＩｇＧ２およびＷＴ ＩｇＧ４抗体変異体を、同様にコンストラクトした。ＡＤＣＣアッセイを、Ｈｅｒ２＋乳癌細胞系ＳｋＢｒ−３を標的細胞として用いた以外、上記の通りに行った。図２３は、ＡＤＣＣ実験の結果を示す。データは、いくつかの変異体が、ＡＤＣＣを完全に低下することを示す。さらに、ＩｇＧ２はまた、ＡＤＣＣを仲介しないことが明らかであるが、ＩｇＧ４は、かなりのレベルのＡＤＣＣを示す。
【０１８８】
結果は、２３２位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２７０位、２９７位、２９９位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位および３３１位を含むが、これらに限定されない多くの位置でのアミノ酸修飾が、ＦｃγＲ結合、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および／または補体仲介性エフェクター機能が所望されない、抗体およびＦｃ融合体の臨床特性を改善するための有望な候補を提供することを示す。例えば、アミノ酸修飾２３２Ｇ、２３４Ｇ、２３４Ｈ、２３５Ｄ、２３５Ｇ、２３５Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｎ、２３６Ｐ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２３７Ｌ、２３７Ｎ、２３７Ｐ、２３８Ｋ、２３９Ｒ、２６５Ｇ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、２７０Ｈ、２９７Ｓ、２９９Ａ、２９９Ｉ、２９９Ｖ、３２５Ａ、３２５Ｌ、３２７Ｒ、３２８Ｒ、３２９Ｋ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｐ、３３０Ｒ、３３０Ｓおよび３３１Ｌは、顕著に減少したＦｃリガンド結合特性および／またはエフェクター機能を提供する。Ｆｃリガンドとの結合およびエフェクター機能を減少するのに特に有効なのは、変異体２３６Ｒ／２３７Ｋ、２３６Ｒ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３７Ｋ／３２８Ｒ、３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ、２６７Ｒ／２６９Ｒ、２３４Ｇ／２３５Ｇ、２３６Ｒ／２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ／２３７Ｋ、および２３７Ｋ／３２５Ｌ／３２８Ｒである。特に、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒを含むこれらの変異体を含むアミノ酸修飾は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩの両方との結合を減少し、１０倍以上ＣＤＣを減少させ得る。さらに、データは、ヒトＩｇＧ２が、ヒトＩｇＧ４と比較して、顕著に減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能を有することを示す。
【０１８９】
上記の通り、減少したＦｃγＲ親和性および／またはエフェクター機能は、Ｆｃリガンド結合またはエフェクター機能が毒性および／または減少した効果をもたらすＦｃポリペプチドに最適であり得る。例えば、ＣＴＬＡ４を標的とする抗体がＴ細胞活性化の阻害を阻止し、抗腫瘍免疫応答を促進するのに有効であるが、抗体により仲介されるエフェクター機能によるＴ細胞の破壊は、作用機序および／または潜在的な毒性に逆効果となり得る。実際の毒性は、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブの臨床適用で観察した（Maker et al., 2005, Ann Surg Oncol 12:1005−16、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＵＳ６，９８４，７２０の配列番号７（ＶＬ、図２４ｅ）および配列番号１７（ＶＨ、図２４ｆ）（参照により本明細書中にその全体が包含される）から抜粋した、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブ（Ｍａｂ １０Ｄ．１、ＭＤＸ０１０）の配列を、図２４に示す。説明を目的として、本発明の多くのＦｃ変異体を、ＣＴＬＡ４を標的とする抗体の配列中に組み込む。本発明のＦｃ変異体の組み合わせが、典型的に、相加的または相乗的結合調節、それによるエフェクター機能の相加的または相乗的調節をもたらしたため、本発明で供されるＦｃ変異体の未だ明らかになっていない組み合わせ、または他の既報の修飾との組み合わせがまた、好ましい結果を提供し得ることが、予想される。可能性のあるＦｃ変異体を図２６ａに示す。最適化した抗体配列には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８からなる群から選択される少なくとも１個の非ＷＴアミノ酸が含まれる。例えば、ＩｇＧ１定常領域中Ｌ２３５ＧおよびＧ２３６Ｒ修飾を含む改良された抗ＣＴＬＡ−４抗体配列を、図２６ｂおよび２６ｃに示す。あるいは、本発明が示す通り、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４を、Ｆｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を減少するためにも用い得る。図２６ｂおよび２６ｄは、改良した抗ＣＴＬＡ４ ＩｇＧ２抗体配列の配列を提供する。本明細書中、抗ＣＴＬＡ４の使用は、単なる一例であり、Ｆｃ変異体の適用をこの抗体または何れか他の特定のＦｃポリペプチドに制限することを意味しない。減少したＦｃリガンド結合および／またはエフェクター機能の他の例示的適用には、例えばインフリキシマブおよびアダリムマブを含む抗ＴＮＦα抗体、例えばベバシツマブを含む抗ＶＥＧＦ抗体、例えばナタリズマブを含む抗α４−インテグリン抗体、および例えばＵＳＳＮ１０／６４３，８５７（参照により本明細書中にその全体が包含される）に記載のものを含む抗ＣＤ３２ｂ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
好ましいＦｃ変異体のこのリストは、本発明を制限することを意味しない。実際に、供される何れかのＦｃ変異体の全ての組み合わせが、本発明の態様を提供する。さらに、本発明の何れかのＦｃ変異体と他の発見されたまたは未発見のＦｃ変異体との組み合わせも、好ましい特性を提供することができ、これらの組み合わせはまた、本発明の態様として意図される。最後に、これらの結果から、本発明において変異した位置での他の置換が、好ましい結合増大および特異性も提供し得ること、故に、本明細書に記載の全ての位置での置換が考慮されることが予想される。
【０１９１】
全ての引用される文献は、参照により本明細書中にその全体が明示的に包含される。
【０１９２】
本発明の特定の態様は、説明を目的として上記されるが、多数の変形が、添付の特許請求の範囲に記載の通り、本発明から逸脱しない範囲で製造され得ることは、当業者に認められるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインを示す。Ｆｃ領域を示す。可変領域中の抗原結合部位、ならびにＦｃ領域中のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧのための結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位を示す。
【図２】Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色リボンで示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色リボンで示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色棒で示す。
【図３】ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアライメント。図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）の配列およびヒンジドメインを提供し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。位置は、ＩｇＧ１配列のＥＵ Ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、ＩｇＧ１と他の免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４との差異を、灰色で示す。多型が多数の位置に存在し（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、故に、示した配列と従来の配列とにわずかな差異が存在し得る。Ｆｃ領域の可能性のある開始点が示され、ＥＵの２２６位または２３０位のどちらかとして本明細書に記載される。
【図４】ヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプの位置および関連するアミノ酸置換を示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖における等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【図５】Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、抗体ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らして構築した。倍数は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒトＶ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に関してＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０倍数を示す。
【図６】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）との結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴ）の存在において、特徴的阻害曲線が発光シグナルの減少として観察される。結合データを、低および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、一部位競合モデルへのデータの適合を示す。
【図７】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合。図７ａは、選択した変異体についてのデータを示し、図７ｂは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値および倍数を示す。
【図８】Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２） ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして構築した。図８ａは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒト活性化受容体Ｖ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、および阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの結合の、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値およびＩＣ５０倍数を示す。図８ｂは、選択した変異体のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。
【図９】ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対するトラスツズマブにおける、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体の結合親和性を測定する競合表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。図９ａは、センサーグラム生データ（sensorgram raw data）を示し、図９ｂは、各濃度で得られた初期結合率に対する受容体濃度のログ値（対数値）のプロットを示し、そして図９ｃは、実施例１に記載の、これらのデータへの適合から得られた親和性を示す。
【図１０】抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。低濃度および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した、所定の抗体の抗体濃度におけるＡＤＣＣの用量依存性を示す。曲線は、非線形回帰を用いて、シグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【図１１】血清レベルのヒトＩｇＧの不存在および存在下におけるＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。
【図１２】ＣＤＣを増強するように設計されたＦｃ変異体において変異した残基。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造を示す（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。黒色の球および棒は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を仲介するのに重要であることが示されている残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を示し、灰色の棒は、ＣＤＣに影響を与える変異体を検討するために本発明において変異させた残基を示す。
【図１３】補体仲介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）についてスクリーニングしたＦｃ変異体およびＣＤＣデータ。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１であり、特に他に記載のない限りＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧである。ＣＤＣ倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較した相対的ＣＤＣ活性を示す。
【図１４】Ｆｃ変異体 抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣアッセイ。補体により仲介される溶解の抗体濃度の用量依存性を、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する示したＰＲＯ７０７６９抗体について示す。溶解を、アラマーブルー（Alamar Blue）の放出を用いて測定し、データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれにおいてベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線の最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、勾配変化のあるシグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【図１５】増大および減少したＣＤＣを供するアミノ酸修飾、および増大／調節したＣＤＣを供し得るように修飾され得る位置。位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従い番号付けされる。
【図１６】減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａと結合するためのＩＣ５０倍数、およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＣＤＣ活性のＥＣ５０倍数を示す。
【図１７】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体の選択によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。
【図１８】ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体のＣＤＣアッセイ。溶解をアラマーブルー放出により測定した。
【図１９】ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【図２０】減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体仲介性エフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、２つの別個の試験による、ＷＴと比較したヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＩＣ５０倍数、ＷＴと比較したヒトＦｃγＲＩとの結合についてのＩＣ５０倍数、およびＷＴと比較したＣＤＣ活性についてのＥＣ５０倍数を示す。
【図２１】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体による低親和性ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよび高親和性ヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合。
【図２２】ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体のＣＤＣ活性。溶解をアラマーブルーの放出により測定した。
【図２３】Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋ＳｋＢｒ−３乳癌標的細胞に対する抗Ｈｅｒ２ Ｆｃ変異体およびＷＴ ＩｇＧ抗体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【図２４】ＰＲＯ７０７６９（図２４ａおよび２４ｂ）、トラスツズマブ（図２４ｃおよび２４ｄ）、およびイピリムマブ（図２４ｅおよび２４ｆ）を含む、本発明で用いた可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列。
【図２５】本発明で用いたヒト定常軽鎖カッパ（図２５ａ）および定常重鎖（図２５ｂ−２５ｆ）のアミノ酸配列。
【図２６】減少したＦｃリガンド結合およびエフェクター機能特性を有する可能性のある定常重鎖配列（図２６ａ）、および改良した抗ＣＴＬＡ−４抗体の配列（図２６ｂ−２６ｄ）を示す配列。図２６ａは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８として強調して示す可変位置を含む、可能性のあるＦｃ変異体定常重鎖配列を示す。配列の下の表は、ＷＴアミノ酸およびこれらの位置において可能性のある置換基を示す。改良した抗体配列は、この可能性のある修飾基から選択される１個以上の非ＷＴアミノ酸を含み得る。図２６ｂは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖配列を示し、図２６ｃおよび２６ｄは、減少したＦｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖配列を示す。これらには、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ ＩｇＧ１重鎖（図２６ｃ）およびＩｇＧ２重鎖（図２６ｄ）が含まれる。位置は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、故に、配列中の連続順に対応していない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００５年３月３１日出願のＵＳＳＮ６０／６６７，１９７；２００５年８月３日出願のＵＳＳＮ６０／７０５，３７８；２００５年１０月３日出願のＵＳＳＮ６０／７２３，２９４；および、２００５年１０月３日出願のＵＳＳＮ６０／７２３，３３５；ならびに、２００５年５月５日出願のＵＳＳＮ１１／１２４，６２０の一部継続出願（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に対し米国特許法１１９条(e)項の利益を請求する。２００４年３月２６日出願の米国特許出願番号第１０／８２２，２３１号の開示内容はまた、参照によりその全体が明示的に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体ポリペプチド、それらの製造のための操作（engineering）方法、および特に治療目的でのそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、抗体は、一対の重鎖および軽鎖ポリペプチド鎖から構築される。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインから成り、故に、一般名である免疫グロブリンが、そのようなタンパク質に用いられる。各鎖は、可変領域（Ｖ領域）および定常領域と称される２個の異なる領域から成る。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体間の顕著な配列多様性を示し、標的抗原への結合に関与する。定常領域は、配列多様性をあまり示さず、多くの天然タンパク質の結合に関与して重要な生化学的事象を引き起こす。ヒトでは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、およびＩｇＭを含む５種の異なる抗体クラスがある。これらの抗体クラス間の顕著な特徴は、それらの定常領域であるが、わずかな差異がＶ領域に存在し得る。免疫グロブリンの一般的な構造的特徴を記載する例として本明細書で用いる図１は、ＩｇＧ１抗体を示す。ＩｇＧ抗体は、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を示す。）（また、ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメイン、および定常ガンマ３ドメインを示す。）とも称される。）の順で連結する４個の免疫グロブリンドメインからなる。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ−ＣＬ（それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを示す。）の順で連結した２個の免疫グロブリンドメインからなる。
【０００４】
抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、故に、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラス内の他の抗体と配列が最も異なるため、そのように称される。配列多様性の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）中に生じる。重鎖および軽鎖あたりそれぞれ３個の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３で示される、計６個のＣＤＲがある。可変領域のうちＣＤＲ以外は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。ＣＤＲほど多様ではないが、配列多様性が、異なる抗体間のＦＲ領域中に生じる。概して、抗体のこの特徴的構造は、実質的な抗原結合の多様性（ＣＤＲ）が免疫系により調査され、広範囲の抗原に対する特異性を得ることを可能にする、安定な骨格（ＦＲ領域）を提供する。多くの高分解能構造が、異なる生物由来の多様な可変領域断片（いくつかは抗原と非結合、およびいくつかは抗原との複合体）に利用可能である。抗体可変領域の配列および構造的特徴は、よく特徴付けられており（Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9−16；Morea et al., 2000, Methods 20:267−279、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、抗体の保存的特徴は、多くの抗体操作技術の開発を可能にしている（Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−376、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。例えば、ある抗体、例えばマウス抗体由来のＣＤＲを、別の抗体、例えばヒト抗体のフレームワーク領域に移植することが可能である。この方法は、当技術分野で“ヒト化”と称され、非ヒト抗体由来の免疫原性の低い抗体治療剤の製造を可能とする。可変領域を含む断片は、抗体の他の領域を欠失して存在することができ、例えばＶＨ−Ｃγ１およびＶＨ−ＣＬを含む抗原結合断片（Ｆａｂ）、ＶＨおよびＶＬを含む可変断片（Ｆｖ）、同じ鎖中で共に連結するＶＨおよびＶＬを含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに多様な他の可変領域断片が含まれる（Little et al., 2000, Immunol Today 21:364−370、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００５】
抗体のＦｃ領域は、多くのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能を与える。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃ領域は、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ２につながるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに関して重要なＦｃ受容体ファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と細胞性免疫応答とのコミュニケーションを仲介する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーには、イソ型であるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型であるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型であるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃとの結合を仲介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を仲介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞を含む、様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合した抗原の部位に捕捉し、典型的に、細胞内のシグナル伝達事象ならびに、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃のようなその後の重要な免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用エフェクター機能を仲介する能力は、抗体が標的細胞を破壊することによる可能性のある機序である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と称される（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の食作用をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）と称される。ＦｃγＲＩＩａ（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437−442、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095−1103、参照によりその全体が本明細書中に包含される）；および、ＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むヒトＦｃγＲの細胞外ドメインの多くの構造が、解明されている。全てのＦｃγＲは、図２に示す通り、Ｃγ２ドメインおよび前記ヒンジのＮ末端でＦｃ上の同じ領域に結合する。この相互作用は、構造的によく特徴付けられており（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合するヒトＦｃのいくつかの構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびにヒトＩｇＥ Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｆ６Ａ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Garman et al., 2000, Nature 406:259−266、参照によりその全体が本明細書中に包含される）は、解明されてきた。
【０００６】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は典型的に、受容体に対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的によく結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。全てのＦｃγＲは、異なる親和性を有するが、ＩｇＧ Ｆｃの同じ領域に結合する：高親和性結合体であるＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１についてＫｄ１０−８Ｍ−１を有し、一方、低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般的に、それぞれ１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％の同一性を有する；しかしながら、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体により誘発される活性化の正の調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、故に阻害性である。故に、前者は、活性化受容体と称され、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害性受容体と称される。前記受容体はまた、様々な免疫細胞で発現パターンおよびレベルが異なる。さらに別の複雑度は、ヒトプロテオームにおける多くのＦｃγＲ多型の存在である。臨床的重要性を有する特に関連する多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりもＶ１５８アロタイプにより高い親和性で結合する。この親和性の差異、およびＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対する推定上のその効果が、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）、BiogenIdec）の効果の重要な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者は、リツキシマブ処置に好都合に応答する；しかしながら、低親和性のＦ１５８アロタイプを有する患者は、ほとんど応答しない（Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトの約１０−２０％が、Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％が、Ｖ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、そして３５−４５％が、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220−4232；Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。故に、ヒトの８０−９０％がほとんど応答せず、例えば、彼らは、Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも一方のアレルを有する。
【０００７】
図１に示すＦｃ上の重複しているが別個の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑのための接合部位として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを仲介するのと同様に、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を仲介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成し、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６個の抗体を結合し得るが、２個のＩｇＧとの結合が、補体カスケードを活性化するのに十分である。ＦｃとＦｃγＲの相互作用と同様に、様々なＩｇＧサブクラスが、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、典型的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＦｃγＲに対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在、Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に利用可能な構造は存在しない；しかしながら、変異誘発実験は、Ｃ１ｑに対するヒトＩｇＧ上の結合部位を残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｋ３２６、Ｐ３２９、Ｐ３３１およびＥ３３３を含む領域にマッピングした（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178−4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571−2575、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００８】
図１に示すＣγ２ドメインとＣγ３ドメインの間のＦｃ上の部位は、胎児性受容体（neonatal receptor：ＦｃＲｎ）との相互作用を仲介し、その結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流に戻して再利用する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。この過程は、全長分子のサイズが大きいため腎臓ろ過による除去を伴い、結果として、１ないし３週間までの範囲の好都合な抗体の血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎとの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。ＦｃＲｎのためのＦｃ上の結合部位は、細菌プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による強い結合は、典型的に、タンパク質精製中に、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを用いることにより抗体を精製するための手段として用いられる。故に、Ｆｃ上のこの領域の適合度は、抗体の臨床的特徴およびそれらの精製の両方に重要である。ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体（Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）、およびＦｃとタンパク質ＡおよびＧとの複合体（Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361−2370；Sauer−Eriksson et al., 1995, Structure 3:265−278；Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471−481、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）の利用可能な構造は、Ｆｃとこれらのタンパク質の相互作用に関する理解を提供する。
【０００９】
Ｆｃ領域の１つの重要な特徴は、図１に示すＮ２９７に起こる保存されたＮ結合グリコシル化である。よく記載される通り、この炭水化物またはオリゴ糖は、抗体にとって重要な構造的かつ機能的役割を果たし、抗体を哺乳動物発現系を用いて製造しなければならない根本的理由の１つである。１つの理論に制限されることを望まないが、この炭水化物の構造的目的は、Ｆｃを安定化または可溶化すること、Ｃγ３とＣγ２ドメインの間の特定の角度またはフレキシビリティーレベルを決定すること、２個のＣγ２ドメインを互いに中心軸を横切って凝集しないようにすること、またはこれらの組み合わせであり得ると考えられる。ＦｃγＲおよびＣ１ｑとの効率的なＦｃ結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７炭水化物の組成の変化またはその除去がこれらのタンパク質との結合に影響を与える（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539−45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478−16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133−147、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。該炭水化物は、ＦｃγＲと何ら特定の結合を作製しないが（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合を仲介するＮ２９７炭水化物の機能的役割が、Ｆｃ立体構造を決定する構造的役割を果たし得ることが示される。このことは、４個の異なるＦｃ糖型の結晶構造の収集により支持され、それは、オリゴ糖の組成が、Ｃγ２の立体構造に影響を与え、結果としてＦｃ／ＦｃγＲ結合をもたらすことを示す（Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979−989、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１０】
上記の抗体の特徴−標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を仲介する能力、および血清中の長い半減期−は、抗体を強力な治療薬にする。モノクローナル抗体は、癌、炎症性疾患および心疾患を含む様々な状態の処置のために治療的に用いられる。現在、１０種以上の市販されている抗体製品および数百種の開発中の抗体製品が存在する。抗体に加えて、研究および治療に拡大する役割を見出されている抗体様タンパク質が、Ｆｃ融合体である（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃ融合体は、１個以上のポリペプチドが、Ｆｃに作動可能に連結するタンパク質である。Ｆｃ融合体は、受容体、リガンドまたはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインの標的結合領域と抗体のＦｃ領域を結合し、それにより、その好ましいエフェクター機能および薬物動態組み合わせる。後者の役割は、標的認識を仲介することであり、故に、それは抗体の可変領域に機能的に類似している。Ｆｃ融合体と抗体の構造的および機能的重複により、本発明の抗体に関する説明はＦｃ融合体にも拡大される。
【００１１】
抗体は、腫瘍学における幅広い適用、特に細胞破壊を目的として、腫瘍細胞で選択的に発現される細胞抗原を標的化するための適用が見出されている。必要な増殖経路の阻止による抗増殖作用、アポトーシス、増強した下方制御および／または受容体のターンオーバーをもたらす細胞内シグナル伝達、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および適応的免疫応答の促進を含む、抗体が腫瘍細胞を破壊する多くの可能性のある機構が存在する（Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541−547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403−410、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。抗腫瘍効果は、これらの機構の組み合わせの結果であり、臨床治療におけるそれらの相対的重要性は、癌依存性であるように見える。これらの抗腫瘍手段を具備しているにもかかわらず、抗癌剤としての抗体の有効性は満足のいくものではなく、特にそれらは高コストである。患者の腫瘍応答データは、モノクローナル抗体が、通常の単剤の細胞傷害性化学療法剤よりも治療の成功にほんのわずかな改善しか提供しないことを示す。例えば、全ての再発した軽度の非ホジキンリンパ腫の患者の半数しか、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブに応答しない（McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825−2833、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。１６６名の臨床患者のうち、約１２ヶ月の反応期間中央値で、６％が完全な応答を示し、４２％が部分的な応答を示した。転移性乳癌の処置用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentech）は、効果がより少ない。２２２名の試験患者に関するトラスツズマブを用いる全体の反応率は、８名の完全な応答、および２６名の部分的な応答を含む、わずか１５％であって、９ないし１３ヶ月の反応期間中央値および生存期間であった（Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639−2648、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在の抗癌治療においては、死亡率におけるどんな小さな改善も成功を定義する。故に、標的癌細胞を破壊するために抗体の能力を高めることがかなり必要とされる。
【００１２】
抗体の抗腫瘍効果を高める有望な手段は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣのような細胞傷害性エフェクター機能を仲介するそれらの能力を増強することによる。抗体の抗癌活性に関するＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能の重要性は、マウスで立証されており（Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652−656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443−446、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）、Ｆｃと任意のＦｃγＲの相互作用の親和性は、細胞ベースのアッセイにおいて標的とする細胞傷害性と相関関係を有する（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487−490; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。さらに、相関関係は、ヒトにおける臨床効果と、ＦｃγＲＩＩＩａのアロタイプの高親和性多型（Ｖ１５８）または低親和性多型（Ｆ１５８）との間で観察されている（Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらのデータを合わせると、任意のＦｃγＲに結合するのに最適化される抗体が、エフェクター機能をより多く仲介し、それにより患者の癌細胞をより効果的に破壊することが示唆される。受容体の活性化と阻害のバランスは重要な検討事項であり、最適なエフェクター機能は、活性化受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａに対して増大した親和性を有するが、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した親和性を有する抗体によって生じ得る。さらに、ＦｃγＲが、抗原提示細胞による抗原の取り込みおよびプロセシングを仲介し得るため、最適化ＦｃγＲ親和性はまた、適応的免疫応答を誘導する抗体治療薬の能力を高め得る（Dhodapkar ＆ Dhodapkar, 2005, Proc Natl Acad Sci USA, 102, 6243−6244、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。抗体の抗癌治療に対する補体仲介性エフェクター機能の重要性は、あまり特徴付けられていない。ＣＤＣに対して最適化された抗体は、抗体の臨床適用における補体の役割を調査する方法を提供し、抗体の殺腫瘍能力を改善するための可能性のある機構を提供し得る。
【００１３】
エフェクター機能が臨床効果に貢献する抗体治療および適用とは対照的に、いくつかの抗体および臨床適用に関して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少するもしくは除去すること、または限定されないがＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを含む、１種以上のＦｃγＲまたは補体仲介性エフェクター機能を減少するもしくは除去することが、好適であり得る。このことはしばしば、その作用機序が、標的抗原を保持する細胞を殺すのではなく、阻止または抑制することを含む、治療抗体の場合に当てはまる。これらの場合において、標的細胞の減少は望ましくなく、副作用であると考えられ得る。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ４受容体を阻害する抗ＣＤ４抗体の能力は、それらを効果的な抗炎症薬にし、さらに、ＦｃγＲ受容体を捕捉するそれらの能力はまた、標的細胞に対する免疫的攻撃を誘導し、結果としてＴ細胞の減少をもたらす（Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925−1933、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。エフェクター機能はまた、放射性複合体と称される放射性標識抗体、および免疫毒素（immunotoxin）と称される毒素と複合体を形成した抗体にとって課題であり得る。これらの薬剤を、癌細胞を破壊するために用いることができるが、ＦｃのＦｃγＲとの相互作用による免疫細胞の捕捉は、健康な免疫細胞を有害なペイロード（放射線または毒素）の近接域にもたらし、結果として標的癌細胞と共に正常なリンパ系組織の減少をもたらす（Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980−11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125−145、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。補体またはエフェクター細胞の捕捉が不十分であるＩｇＧイソ型、例えばＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、この課題に取り組むために部分的に用いられ得る。Ｆｃリガンド結合を減少または低下するＦｃ変異体も当技術分野で公知である（Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537−1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980−11984; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925−1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16−26; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624; ＵＳ６，１９４，５５１；ＵＳ５，８８５，５７３；ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２；ＵＳＳＮ１０／２６７，２８６、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。しかしながら、これらの変異体の完全なＦｃリガンド結合特性およびエフェクター機能の能力、およびＷＴ ＩｇＧイソ型と比較したそれらの特性は明らかでない。全てのＦｃγＲ結合ならびにＦｃγＲおよび補体仲介性エフェクター機能の完全な低下のための一般的かつ強固な手段が必要である。さらなる検討事項は、他の重要な抗体特性が不安定でないことである。Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑとの結合を低下するだけでなく、抗体の安定性、溶解性および構造的完全性、ならびにＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびプロテインＧのような他の重要なＦｃリガンドと相互作用する能力を維持するように製造されるべきである。
【００１４】
最近の成功は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑとの変化した結合を有するＦｃ変異体を得ることを成し遂げ、いくつかの場合において、これらのＦｃ変異体は、ＦｃγＲおよび補体仲介性エフェクター機能を仲介する能力について試験されている（２００５年５月５日出願の、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、および２００５年１０月２１日出願のＵＳＳＮ１１／２５６，０６０、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらの実験において得られたＦｃ変異体は、ＦｃγＲとの選択的に改善した結合、増大したＡＤＣＣ、補体タンパク質Ｃ１ｑとの改善した結合、ＦｃγＲとの減少した結合、補体タンパク質Ｃ１ｑとの減少した結合、および他の最適化特性を含むＦｃリガンドおよびエフェクター機能特性の様々な最適な増強を、それらに限定されないが、提供する。本発明は、これらの実験から選択したＦｃ変異体の特性をさらに特徴付けること、および最適化特性を有する新規の変異体を製造するためにそのデータを利用することを目的とする。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体を提供する。該最適化特性には、親Ｆｃポリペプチドと比較して、ＦｃγＲとの変化した結合、変化した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、および変化した補体依存性細胞傷害作用が含まれる。
【００１６】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、１種以上のＦｃγＲとの結合を改善する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を改善する。好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３９位、２４６位、２５５位、２５８位、２６０位、２６４位、２６７位、２６８位、２７２位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２９３位、２９５位、３０４位、３２４位、３２７位、３２８位、３３０位、３３２位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される１箇所以上でのアミノ酸修飾を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して補体依存性細胞傷害作用を改善する。好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２３３位、２３４位、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７１位、２７２位、２７４位、２７６位、２７８位、２８１位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２０位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される１箇所以上でのアミノ酸修飾を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１種以上のＦｃγＲとの結合を減少する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を減少する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して補体依存性細胞傷害作用を減少する。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を減少し、補体依存性細胞傷害作用を減少する。最も好ましい態様において、該Ｆｃ変異体は、２３２位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２７０位、２９７位、２９９位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位および３３１位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での１個以上のアミノ酸修飾を含む。
【００１９】
本発明は、最適化特性を有するＦｃ変異体の製造方法を提供する。本発明のさらなる目的は、最適化したＦｃ変異体を得るための実験的製造方法およびスクリーニング方法を提供することである。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体をコードする単離した核酸を提供する。本発明は、所望により制御配列と作動可能に連結した該核酸を含むベクターを提供する。本発明は、該ベクターを含む宿主細胞、およびＦｃ変異体の製造方法および所望によりＦｃ変異体の回収方法を提供する。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含む、抗体、Ｆｃ融合体、単離したＦｃ、およびＦｃ断片を含む新規のＦｃポリペプチドを提供する。該新規のＦｃポリペプチドは、治療用製品への使用を見出され得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃポリペプチドは抗体である。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、および生理学的または薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチドの治療的および診断的使用を意図する。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１。抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインを示す。Ｆｃ領域を示す。可変領域中の抗原結合部位、ならびにＦｃ領域中のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧのための結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位を示す。
【００２５】
図２。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色リボンで示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色リボンで示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色棒で示す。
【００２６】
図３ａ−３ｂ。ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアライメント。図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）の配列およびヒンジドメインを提供し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。位置は、ＩｇＧ１配列のＥＵ Ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、ＩｇＧ１と他の免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４との差異を、灰色で示す。多型が多数の位置に存在し（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、故に、示した配列と従来の配列とにわずかな差異が存在し得る。Ｆｃ領域の可能性のある開始点が示され、ＥＵの２２６位または２３０位のどちらかとして本明細書に記載される。
【００２７】
図４。ヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプの位置および関連するアミノ酸置換を示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖における等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【００２８】
図５。Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、抗体ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らして構築した。倍数は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒトＶ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に関してＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０倍数を示す。
【００２９】
図６。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）との結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴ）の存在において、特徴的阻害曲線が発光シグナルの減少として観察される。結合データを、低および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、一部位競合モデルへのデータの適合を示す。
【００３０】
図７。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合。図７ａは、選択した変異体についてのデータを示し、図７ｂは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値および倍数を示す。
【００３１】
図８。Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２） ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして構築した。図８ａは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒト活性化受容体Ｖ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、および阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの結合の、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値およびＩＣ５０倍数を示す。図８ｂは、選択した変異体のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。
【００３２】
図９。ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対するトラスツズマブにおける、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体の結合親和性を測定する競合表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。図９ａは、センサーグラム生データ（sensorgram raw data）を示し、図９ｂは、各濃度で得られた初期結合率に対する受容体濃度のログ値（対数値）のプロットを示し、そして図９ｃは、実施例１に記載の、これらのデータへの適合から得られた親和性を示す。
【００３３】
図１０。抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。低濃度および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した、所定の抗体の抗体濃度におけるＡＤＣＣの用量依存性を示す。曲線は、非線形回帰を用いて、シグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【００３４】
図１１。血清レベルのヒトＩｇＧの不存在および存在下におけるＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。
【００３５】
図１２。ＣＤＣを増強するように設計されたＦｃ変異体において変異した残基。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を示す。黒色の球および棒は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を仲介するのに重要であることが示されている残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を示し、灰色の棒は、ＣＤＣに影響を与える変異体を検討するために本発明において変異させた残基を示す。
【００３６】
図１３。補体仲介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）についてスクリーニングしたＦｃ変異体およびＣＤＣデータ。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１であり、特に他に記載のない限りＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧである。ＣＤＣ倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較した相対的ＣＤＣ活性を示す。
【００３７】
図１４。Ｆｃ変異体 抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣアッセイ。補体により仲介される溶解の抗体濃度の用量依存性を、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する示したＰＲＯ７０７６９抗体について示す。溶解を、アラマーブルー（Alamar Blue）の放出を用いて測定し、データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれにおいてベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線の最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、勾配変化のあるシグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【００３８】
図１５。増大および減少したＣＤＣを供するアミノ酸修飾、および増大／調節したＣＤＣを供し得るように修飾され得る位置。位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従い番号付けされる。
【００３９】
図１６。減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａと結合するためのＩＣ５０倍数、およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＣＤＣ活性のＥＣ５０倍数を示す。
【００４０】
図１７。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体の選択によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。
【００４１】
図１８。ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体のＣＤＣアッセイ。溶解をアラマーブルー放出により測定した。
【００４２】
図１９。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【００４３】
図２０。減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体仲介性エフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、２つの別個の試験による、ＷＴと比較したヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＩＣ５０倍数、ＷＴと比較したヒトＦｃγＲＩとの結合についてのＩＣ５０倍数、およびＷＴと比較したＣＤＣ活性についてのＥＣ５０倍数を示す。
【００４４】
図２１。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体による低親和性ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよび高親和性ヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合。
【００４５】
図２２。ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体のＣＤＣ活性。溶解をアラマーブルーの放出により測定した。
【００４６】
図２３。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋ＳｋＢｒ−３乳癌標的細胞に対する抗Ｈｅｒ２ Ｆｃ変異体およびＷＴ ＩｇＧ抗体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【００４７】
図２４。ＰＲＯ７０７６９（図２４ａおよび２４ｂ）、トラスツズマブ（図２４ｃおよび２４ｄ）、およびイピリムマブ（図２４ｅおよび２４ｆ）を含む、本発明で用いた可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列。
【００４８】
図２５。本発明で用いたヒト定常軽鎖カッパ（図２５ａ）および定常重鎖（図２５ｂ−２５ｆ）のアミノ酸配列。
【００４９】
図２６。減少したＦｃリガンド結合およびエフェクター機能特性を有する可能性のある定常重鎖配列（図２６ａ）、および改良した抗ＣＴＬＡ−４抗体の配列（図２６ｂ−２６ｄ）を示す配列。図２６ａは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８として強調して示す可変位置を含む、可能性のあるＦｃ変異体定常重鎖配列を示す。配列の下の表は、ＷＴアミノ酸およびこれらの位置において可能性のある置換基を示す。改良した抗体配列は、この可能性のある修飾基から選択される１個以上の非ＷＴアミノ酸を含み得る。図２６ｂは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖配列を示し、図２６ｃおよび２６ｄは、減少したＦｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖配列を示す。これらには、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ ＩｇＧ１重鎖（図２６ｃ）およびＩｇＧ２重鎖（図２６ｄ）が含まれる。位置は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、故に、配列中の連続順に対応していない。
【００５０】
発明の詳しい説明
本発明は、理解をより完全にし得るために、いくつかの定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意味する。
【００５１】
本明細書で記載の“ＡＤＣＣ”または“抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用”は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらすＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５２】
本明細書で記載の“ＡＤＣＰ”または“抗体依存性細胞介在性食作用”は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の食作用を誘導するＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５３】
本明細書中、“アミノ酸修飾”は、ポリペプチド配列中の、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書中、“アミノ酸置換”または“置換”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置での、あるアミノ酸の別のアミノ酸との置換を意味する。例えば、Ｌ３２８Ｒ置換は、この場合のＦｃ変異体において、３２８位のロイシンをアルギニンに置換される変異体ポリペプチドを意味する。本明細書で用いる“アミノ酸挿入”または“挿入”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、Ｇ＞２３５−２３６挿入は、２３５および２３６位の間へのグリシンの挿入を意味する。本明細書で用いる“アミノ酸欠失”または“欠失”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｇ２３６−は、２３６位でのグリシンの欠失を意味する。本発明のアミノ酸はさらに、同位体または新規のどちらかとして分類され得る。
【００５４】
本明細書で記載の“ＣＤＣ”または“補体依存性細胞傷害作用”は、１個以上の補体タンパク質成分が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす反応を意味する。
【００５５】
本明細書で記載の“同位体修飾”は、あるイソ型のあるアミノ酸を、対応する異なるアミノ酸（整列したイソ型）に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧ１は、ＥＵ ２９６位にチロシンを有し、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを有するため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、同位体修飾と見なされる。
【００５６】
本明細書で記載の“新規の修飾”は、イソ型ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧは３３２位にグルタミン酸を有しないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４におけるＩ３３２Ｅ置換は、新規の修飾と見なされる。
【００５７】
本明細書で記載の“アミノ酸”および“アミノ酸同一性”は、特定の定められた位置に存在し得る、２０個の天然に存在するアミノ酸または何らかの天然に存在しない類似体のうち１つを意味する
【００５８】
本明細書で記載の“エフェクター機能”は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体またはリガンドとの相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰのようなＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、ならびにＣＤＣのような補体仲介性エフェクター機能が含まれる。
【００５９】
本明細書で記載の“エフェクター細胞”は、１種以上のＦｃ受容体を発現し、１個以上のエフェクター機能を仲介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞が含まれるが、それらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む何れかの生物を含むが、それらに限定されない生物由来であり得る。
【００６０】
本明細書で記載の“Ｆａｂ”または“Ｆａｂ領域”は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独のこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片中のこの領域を意味し得る。
【００６１】
本明細書で記載の“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリンドメインの第一の定常領域を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。故に、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの免疫グロブリンドメインの残り２個の定常領域、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの免疫グロブリンドメインの残り３個の定常領域、ならびにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃには、Ｊ鎖が含まれ得る。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。Ｆｃは、下記の通り、単離したこの領域か、またはＦｃポリペプチド中のこの領域を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド”は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００６２】
本明細書で記載の“Ｆｃ融合体”は、１個以上のポリペプチドがＦｃ領域に作動可能に連結されるタンパク質を意味する。本明細書中、Ｆｃ融合体は、従来技術（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）で用いられる通り、用語“免疫アドヘシン（immunoadhesin）”、“Ｉｇ融合体”、“Ｉｇキメラ”、および“受容体グロブリン”（ダッシュを付けることもある）と同義の意味である。Ｆｃ融合体は、一般的に、何れかのタンパク質、ポリペプチドまたは小分子であり得る“融合パートナー”を有する免疫グロブリンのＦｃ領域を結合する。Ｆｃ融合体の非Ｆｃ部分、すなわち融合パートナーの役割は、標的結合を仲介することであり、故に、それは、抗体の可変領域と機能的に類似している。実際、何れかのタンパク質または小分子はＦｃと結合し、Ｆｃ融合体を作製し得る。タンパク質融合パートナーには、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、何れかの分子、好ましくは疾患に関与する細胞外受容体であり得る。
【００６３】
本明細書で記載の“Ｆｃガンマ受容体”または“ＦｃγＲ”は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子により実質的にコードされる何れかのタンパク質ファミリーのメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびに何れかの未知のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型またはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、それらに限定されない何れかの生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何れかの未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型もしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。
【００６４】
本明細書で記載の“Ｆｃリガンド”は、抗体のＦｃ領域と結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何れかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質Ａ、ブドウ球菌タンパク質Ｇ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、それらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同性のＦｃ受容体ファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未知の分子を含み得る。
【００６５】
本明細書で記載の“全長抗体”は、可変領域および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧイソ型の全長抗体は四量体であり、２個の免疫グロブリン鎖の２個の相同対であって、各対が、１個の軽鎖および１個の重鎖（各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含む軽鎖を含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３を含む。）を有する相同対から構成される。ある哺乳動物、例えばラクダおよびラマにおいて、ＩｇＧ抗体は、２個の重鎖（各重鎖は、Ｆｃ領域に結合した可変ドメインを含む。）のみから構成され得る。
【００６６】
本明細書で記載の“ＩｇＧ”は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このＩｇＧには、サブクラスまたはイソ型であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。マウスにおいて、ＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３が含まれる。
【００６７】
本明細書中、“免疫グロブリン（Ｉｇ）“は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１個以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が含まれるが、それに限定されない。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体断片、および個々の免疫グロブリンドメインを含むが、これらに限定されない多くの構造形態を有し得る。
【００６８】
本明細書で記載の“免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン“は、タンパク質構造分野の当業者により確認される異なる構造要素として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは典型的に、特徴的なβ−サンドイッチフォールディングトポロジーを有する。抗体のＩｇＧイソ型における既知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬである。
【００６９】
本明細書で記載の“ＩｇＧ”または“ＩｇＧ免疫グロブリン”は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体クラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このクラスには、サブクラスまたはイソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。本明細書で用いる“イソ型”は、それらの定常領域の化学特性および抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００７０】
本明細書で記載の“親ポリペプチド”、“親タンパク質”、“前駆体ポリペプチド”または“前駆体タンパク質”は、後に修飾されて変異体を作製する未修飾ポリペプチドを意味する。該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは改変型であり得る。親ポリペプチドは、そのポリペプチド自体、該親ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。従って、本明細書で記載の“親Ｆｃポリペプチド”は、修飾されて変異体を作製するＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で記載の“親抗体”は、修飾されて変異体抗体を作製する抗体を意味する。
【００７１】
本明細書で記載の“位置”は、タンパク質配列中の位置を意味する。位置は、連続して、または確立された形式、例えばKabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、番号付けされ得る。例えば、２９７位は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の位置である。
【００７２】
本明細書で記載の“ポリペプチド”または“タンパク質”は、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。
【００７３】
本明細書で記載の“残基”は、タンパク質中の位置およびその関係するアミノ酸の特定を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７、またＮ２９７とも称する）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。
【００７４】
本明細書で記載の“標的抗原”は、所定の抗体の可変領域により特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であり得る。
【００７５】
本明細書で記載の“標的細胞”は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００７６】
本明細書で記載の“可変領域”は、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子領域それぞれからなるＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子の何れかにより実質的にコードされる１個以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
【００７７】
本明細書で記載の“変異体ポリペプチド”、“ポリペプチド変異体”または“変異体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親ポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するかまたは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであり得るか、またはＷＴポリペプチドの改変型であり得る。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、該ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ配列を含む組成物を意味し得る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有し、例えば、親ポリペプチドと比較して約１個ないし約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有する。本明細書中、変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。従って、本明細書で記載の“Ｆｃ変異体”または“変異体Ｆｃ”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃ領域のみを含み得るか、または抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、もしくはＦｃにより実質的にコードされる他のポリペプチドとして存在し得る。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、該Ｆｃ変異体ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド変異体”または“変異体Ｆｃポリペプチド”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親Ｆｃポリペプチドと異なるＦｃポリペプチドを意味する。本明細書で記載の“タンパク質変異体”または“変異体タンパク質”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。本明細書で記載の“抗体変異体”または“変異体抗体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親抗体と異なる抗体を意味する。本明細書で記載の“ＩｇＧ変異体”または“変異体ＩｇＧ”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親ＩｇＧと異なる抗体を意味する。本明細書で記載の“免疫グロブリン変異体”または“変異体免疫グロブリン”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【００７８】
本明細書中、“野生型またはＷＴ”は、アレル変異体を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００７９】
抗体
従って、本発明は、変異体抗体を提供する。
【００８０】
古典的抗体構造単位には、典型的に、四量体が含まれる。各四量体は、典型的に、ポリペプチド鎖の２個の相同対（各対は、１個の“軽”鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する。）および１個の“重”鎖（典型的に、約５０−７０ｋＤａの分子量を有する。）を有する。）からなる。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソ型を定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、それらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これに限定されないサブクラスを有する。故に、本明細書で記載の“イソ型”は、それらの定常領域の化学特性および抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００８１】
各鎖のアミノ末端部位には、抗原認識に主要な役割を果たす、約１００ないし１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域中、３つのループが、重鎖および軽鎖の各Ｖドメインに集合し、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域（以降、“ＣＤＲ”と称する）と称され、そこでのアミノ酸配列中の変異は、最も重要である。
【００８２】
各鎖のカルボキシ末端部位は、エフェクター機能に主要な役割を果たす定常領域を定義する。Kabatらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の主要配列を集めた。該配列の保存の程度に基づき、彼らは、ＣＤＲおよびフレームワークに個々の主要配列を分類し、そのリストを作成した（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91−3242, E.A. Kabat et alを参照のこと）。
【００８３】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖には、いくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書中、“免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン”とは、異なる三次元構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味があるのは、重鎖定常（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体において、ＩｇＧイソ型はそれぞれ、３個のＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧにおける“ＣＨ”ドメインは、下記である：“ＣＨ１”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、１１８−２２０位を示す。“ＣＨ２”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、２３７−３４０位を示し、“ＣＨ３”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、３４１−４４７位を示す。
【００８４】
重鎖のＩｇドメインの別のタイプは、ヒンジ領域である。本明細書中、“ヒンジ”もしくは“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”もしくは“免疫グロブリンヒンジ領域”は、抗体の第一および第二定常ドメイン間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ ２２０位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ ２３７位の残基で始まる。故に、ＩｇＧに関して、抗体ヒンジは、本明細書中、２２１位（ＩｇＧ１にてＤ２２１）ないし２３６位（ＩｇＧ１にてＧ２３６）を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。いくつかの態様において、例えばＦｃ領域において、一般的に２２６位または２３０位に当たる“下流側ヒンジ（lower hinge）”が包含される。
【００８５】
本発明において特に興味があるのは、Ｆｃ領域である。本明細書で用いる“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリンドメインの第一の定常領域、いくつかの場合に、ヒンジの一部を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。故に、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの残り２個の定常領域、ならびに免疫グロブリンドメインＩｇＥおよびＩｇＭの残り３個の定常領域、ならびにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃには、Ｊ鎖が含まれ得る。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃｇ２およびＣｇ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃｇ１）とＣガンマ２（Ｃｇ２）の間の下流側ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。Ｆｃは、下記に記載の通り、単離したこの領域か、またはＦｃポリペプチド中のこの領域を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド”は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００８６】
いくつかの態様において、抗体は全長である。本明細書中、“全長抗体”とは、本明細書に記載の通り、１個以上の修飾を含む可変領域および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００８７】
あるいは、抗体は、それぞれ、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書中、“抗体模倣体”と称されることもある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある。）、および各断片を含むが、それらに限定されない、多様な構造であり得る。
【００８８】
抗体断片
１つの態様において、抗体は抗体断片である。特に興味があるのは、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合体および重鎖の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み、さらにまた、重鎖定常領域融合体を含む、抗体である。
【００８９】
特定の抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989, Nature 341:544−546）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合したＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２個のドメインを結合させ、抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結される（Bird et al., 1988, Science 242:423−426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879−5883）、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）“二重抗体（diabody）”または“三重抗体（triabody）”、遺伝子融合により構築される多価または多特異的断片（Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461−479；WO94/13804；Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444−6448）が含まれるが、それらに限定されない。該抗体断片は、修飾され得る。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化され得る（Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239−1245）。
【００９０】
キメラ抗体およびヒト化抗体
いくつかの態様において、骨格成分は、異なる種由来の混合物であり得る。そういうものとして、問題の抗体がそのような抗体であるとき、かかる抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般的に、“キメラ抗体”および“ヒト化抗体”は両方とも、２種以上由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。例えば、“キメラ抗体”には、伝統的に、マウス（またはいくつかの場合に、ラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）が含まれる。“ヒト化抗体”は、一般的に、ヒト抗体中に見出される配列に置換した可変ドメインフレームワーク領域を有している非ヒト抗体を意味する。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。そのいくつかまたは全てが非ヒト生物に由来する核酸によりコードされるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のベータ−シートフレームワークに移植され、抗体を作製し、その特異性は、移植したＣＤＲにより決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Jones, 1986, Nature 321:522−525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534−1536に記載される。対応するドナー残基への選択したアクセプターフレームワーク残基の“復帰突然変異（Backmutation）”は、しばしば、初期の移植したコンストラクトで欠失している親和性を再び得るのに必要である（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含み、故に、ヒトＦｃ領域を典型的に含むだろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子組み換えされた免疫系を有するマウスを用いて作製され得る（Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639−654）。非ヒト抗体のヒト化および再形成のための様々な技術および方法は、当技術分野でよく知られている（Tsurushita ＆ Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533−545, Elsevier Science(USA)およびそこで引用される文献）。ヒト化方法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522−525；Riechmann et al.,1988；Nature 332:323−329；Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534−1536；Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029−33；He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029−1035；Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593−9；Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181−4185；O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321−8に記載の方法が含まれるが、それらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減じるヒト化または他の方法には、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969−973に記載の表面再形成（resurfacing）方法が含まれ得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野で公知の通り、成熟した親和性を有する。構造に基づく方法は、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載のヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151−162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611−22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910−8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753−759に記載の方法を含むが、これらに限定されない、抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟に用いられ得る。他のヒト化方法は、ＵＳＳＮ０９／８１０，５０２；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119−1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076−3084に記載の方法を含むが、これらに限定されない、ＣＤＲの一部のみの移植を伴い得る。
【００９１】
二重特異的抗体
１つの態様において、本発明の多特異的抗体、特に二重特異的抗体はまた、“二重抗体”と称されることもある。これらは、２個（またはそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。二重抗体は、当技術分野で公知の様々な方法で製造することができ（Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446−449）、例えば化学的に、またはハイブリッド・ハイブリドーマ（hybrid hybridoma）から製造することができる。
【００９２】
ミニボディ
１つの態様において、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055−3061）。いくつかの場合に、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域と結合することができ、ヒンジ領域のいくつかまたは全てを包含し得る。
【００９３】
ヒト抗体
１つの態様において、抗体は、本明細書に記載の通り、少なくとも１個の修飾を有する全長ヒト抗体である。“全長ヒト抗体”または“完全ヒト抗体”は、本明細書に記載の修飾を有するヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を意味する。
【００９４】
抗体融合体
１つの態様において、本発明の抗体は、抗体融合タンパク質（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある）である。抗体融合体の１つのタイプは、結合パートナーを有するＦｃ領域を連結するＦｃ融合体を含む。本明細書で記載の“Ｆｃ融合体”は、１個以上のポリペプチドが、Ｆｃ領域に作動可能に連結されるタンパク質を意味する。本明細書中、Ｆｃ融合体は、従来技術（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200）で用いる通り、用語“免疫アドヘシン（immunoadhesin）”、“Ｉｇ融合体”、“Ｉｇキメラ”、および“受容体グロブリン”（ダッシュを付けることもある）と同義の意味である。Ｆｃ融合体は、一般的に、何れかのタンパク質または小分子であり得る融合パートナーを有する免疫グロブリンのＦｃ領域を結合する。実際、何れかのタンパク質または小分子はＦｃと結合し、Ｆｃ融合体を作製し得る。タンパク質融合パートナーには、何れかの抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、疾患に関与する何れかの分子、好ましくは細胞外受容体であり得る。
【００９５】
Ｆｃ融合体に加えて、抗体融合体は、重鎖の定常領域と、１個以上の融合パートナー（何れかの抗体の可変領域をさらに含む）の融合を含むが、一方、他の抗体融合体は、融合パートナーを有する実質的または完全な全長抗体である。１つの態様において、融合パートナーの役割は標的結合を仲介することであり、故に、それは、抗体の可変領域に機能的に類似する（そして、実際抗体可変領域であり得る）。実際、何れかのタンパク質または小分子は、Ｆｃと結合してＦｃ融合体（または抗体融合体）を作製し得る。タンパク質融合パートナーは、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカインまたはいくつかの他のタンパク質またはタンパク質ドメインを含み得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、疾患に関与する何れかの分子、好ましくは細胞外受容体であり得る。
【００９６】
結合パートナーは、タンパク性または非タンパク性であり得る；後者は、一般的に、抗体および結合パートナー上の官能基を用いて作製される。例えばリンカーは、当技術分野で公知である；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーが、よく知られている（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照のこと、参照により本明細書中に包含される）。
【００９７】
適する複合体には、下記の標識、薬剤、ならびに細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）または毒物またはかかる毒物の活性断片を含むが、これらに限定されない細胞毒性物質が含まれるが、それらに限定されない。適する毒物およびそれらの対応する断片には、ジフテリアＡ鎖、エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。細胞毒性物質にはまた、放射性同位体と抗体を結合すること、または放射性核種と抗体に共有結合しているキレート剤を結合することにより作製される放射性化学物質が含まれる。さらなる態様が、カリケミシン、オーリスタチン（auristatin）、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ならびにデュオカルマイシンおよび類似体を利用する；後者に関して、Ｕ．Ｓ．２００３／００５０３３１を参照のこと、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【００９８】
抗体の共有結合修飾（Covalent modification）
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に包含され、常にではないが一般的に、翻訳後に行われる。例えば、抗体の共有結合修飾のいくつかのタイプは、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより分子内に導入される。
【００９９】
システイニル残基は、最も一般的に、α−ハロ酢酸（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導される。
【０１００】
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖と比較的特異的に反応するピロ炭酸ジエチルとのｐＨ５．５−７．０での反応により誘導される。臭化パラフェンアシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０にて行われる。
【０１０１】
リシニル（Lysinyl）およびアミノ末端残基を、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質を用いる誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆にする効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の反応剤には、メチルピコリンイミダート；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル、ならびにグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１０２】
アルギニル残基は、１個またはいくつかの常套反応剤（とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン）との反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基が高ｐＫａであるためにアルカリ性条件で行うことが必要である。さらに、これらの反応剤は、リシンの複数の基ならびにアルギニン イプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１０３】
チロシル残基の特異的修飾を、特に関心を持って、芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基中にスペクトル標識を導入することにより作製することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（acetylimidizole）およびテトラニトロメタンを、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いる。チロシル酸基を、ラジオイムノアッセイである、適する上記のクロラミンＴ法に用いるための標識したタンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化する。
【０１０４】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’Ｎ＝Ｃ＝Ｎ――Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、所望により、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような異なるアルキル基であり得る。）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１０５】
二官能性物質を用いる誘導体化は、下記の方法に加えて、様々な方法での使用のために抗体を不水溶性支持マトリックスまたは表面に架橋させるのに有用である。常用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）のようなジサクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性不水溶性マトリックスおよび米国特許番号第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および、同第４，３３０，４４０号に記載の反応基質を、タンパク質固定化に用いる。
【０１０６】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基の形態はどちらも、本発明の範囲内である。
【０１０７】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79−86 [1983]）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１０８】
グリコシル化
共有結合修飾の別のタイプは、グリコシル化である。他の態様において、本明細書に記載のＩｇＧ変異体は、１個以上の改変された糖鎖（engineered glycoform）を含むように修飾され得る。本明細書で用いる“改変された糖鎖”は、ＩｇＧと共有結合する炭水化物組成物を意味し、ここで該炭水化物組成物は、親ＩｇＧのそれと化学的に異なる。改変された糖鎖は、エフェクター機能を増強するかまたは減少することを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変された糖鎖は、当技術分野で公知の様々な方法により作製され得る（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466−3473；ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；PotelligentＴＭ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]）。多くのこれらの技術は、例えば、様々な生物、または遺伝子組み換えもしくは他の方法の細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）中でＩｇＧを発現させることによるか、またはグリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによるか、またはＩｇＧが発現された後、炭水化物（複数可）を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合するオリゴ糖のフコシル化レベルを制御すること、および／またはそれを２つに切断することに基づく。改変された糖鎖は、典型的に、異なる炭水化物またはオリゴ糖を意味する；故に、ＩｇＧ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、改変された糖鎖に包含され得る。あるいは、改変された糖鎖は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を意味し得る。当技術分野で公知の通り、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記の特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不存在）、または該タンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物に依存し得る。特定の発現系を以下に記載する。
【０１０９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。故に、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用可能である。）への糖の一種（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロース）の付加を意味する。
【０１１０】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のために）１個以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することにより都合よく達成される。該改変はまた、（Ｏ結合グリコシル化部位のために）出発配列への１個以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換により成され得る。簡単には、抗体のアミノ酸配列を、好ましくはＤＮＡレベルでの変化により、特に、コドンが所望のアミノ酸に翻訳され得るように作製されるように予め選択された塩基にて、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより、改変する。
【０１１１】
抗体上の炭水化物部分の数を増加する他の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの方法は、ＮおよびＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。用いるカップリング法に依存して、糖（糖類）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの一部のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの一部のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトランの一部のような芳香族性残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日刊行のＷＯ８７／０５３３０およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306に記載される。
【０１１２】
出発抗体上に存在する炭水化物部分の除去を、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理により、結果として、架橋している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖鎖が切断されるが、一方、ポリペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52、およびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131に記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載の通り、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る。可能性のあるグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105に記載の通り、ツニカマイシン化合物の使用により阻止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を妨げる。
【０１１３】
抗体の共有結合修飾の他のタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の方法で、抗体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような様々なポリオールを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク性ポリマーに結合することを含む。さらに、当技術分野で公知の通り、アミノ酸置換を、ＰＥＧのようなポリマーの付加を促進するために抗体内の様々な部位に行うことができる。例えば、米国特許公開番号２００５／０１１４０３７（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１１４】
標識抗体
いくつかの態様において、本発明の抗体の共有結合修飾は、１個以上の標識の付加を含む。いくつかの場合において、これらは、抗体融合体と見なされる。
【０１１５】
用語“標識基”は、何れかの検出可能な標識を意味する。いくつかの態様において、標識基を、可能性のある立体障害を減じるために様々な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための多様な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施に用いられ得る。
【０１１６】
一般的に、標識は、それらが検出される分析に依存して様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であり得るアイソトープ標識；ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）レドックス活性部分；ｄ）光学色素；酵素群（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；および、ｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー塩基対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの態様において、標識基を、可能性のある立体障害を減じるために様々な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための多様な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施において用いられ得る。
【０１１７】
特定の標識は、発色団、蛍光体およびフルオロフォアを含むが、これらに限定されない光学色素を含み、多くの例において特に後者である。フルオロフォアは、“小分子”蛍光物質、またはタンパク性蛍光物質のどちらかであり得る。
【０１１８】
“蛍光標識”は、その固有の蛍光特性により検出され得る何れかの分子を意味する。適する蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malacite green）、スチルベン、黄色蛍光色素（Lucifer Yellow）、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Pierce, Rockford, IL）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA）が含まれるが、それらに限定されない。適するフルオロフォアを含む光学色素は、Richard P. HauglandのMolecular Probes Handbook（参照により本明細書中に明示的に包含される）に記載される。
【０１１９】
適するタンパク性蛍光標識にはまた、ウミシイタケ（Renilla）種、ウミエラ（Ptilosarcus）種、またはオワンクラゲ（Aequorea）種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Chalfie et al., 1994, Science 263:802−805）、ＥＧＦＰ（Clontech Laboratories, Inc., Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9；Stauber, 1998, Biotechniques 24:462−471；Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178−182）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Clontech Laboratories, Inc.）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408−5417）、β−ガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603−2607）およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許番号第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）が含まれるが、それらに限定されない。上記の引用文献は全て、参照により本明細書中に明示的に包含される。
【０１２０】
任意の変異体において、抗体とは、認識された免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部により実質的にコードされる１個以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味し得る。例えばヒトにおいて認識された免疫グロブリン遺伝子には、無数の可変領域遺伝子、ならびに定常領域遺伝子である、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＥ、およびＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）イソ型それぞれによりコードされるミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）を共に含む、カッパ（κ）、ラムダ（λ）および重鎖遺伝子領域が含まれる。本明細書中、抗体は、全長抗体および抗体断片を含むことを意味し、何れかの生物由来の天然抗体、改変された抗体、または実験目的、治療目的または他の目的で組み換え的に作製された抗体を意味し得る。
【０１２１】
Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１個以上のアミノ酸修飾を含み、ここで、該アミノ酸修飾（複数可）は、１個以上の最適化特性を提供する。本発明のＦｃ変異体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾によりその親ＩｇＧと異なるアミノ酸配列である。故に、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して２個以上のアミノ酸修飾、例えば約１個ないし５個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個ないし１０個のアミノ酸修飾、最も好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有し得る。故に、Ｆｃ変異体の配列および親Ｆｃポリペプチドの配列は、実質的に相同性である。例えば、本明細書中、変異体Ｆｃの変異体配列は、親Ｆｃ変異体配列と約８０％の相同性、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。修飾を、分子生物学を用いて遺伝子組み換え的に行うか、または酵素的または化学的に行うことができる。
【０１２２】
本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。故に、例えばＩ３３２Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比較してＩ３３２Ｅ置換を含むＦｃ変異体である。同様に、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比較してＳ２３９Ｄ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅ置換を含むＦｃ変異体を定義する。置換が供される順序は任意であり、すなわち、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌなどと同じＦｃ変異体であることが特記される。本発明で検討する全ての位置について、番号付けは、ＥＵ ｉｎｄｅｘまたはＥＵ番号付けスキームに従う（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＥＵ ｉｎｄｅｘまたはKabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘまたはＥＵ番号付けスキームとは、ＥＵ抗体の番号付けを意味する（Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１２３】
本発明のＦｃ変異体は、何らかの生物、好ましくはヒトを含むがそれに限定されない哺乳動物、マウスおよびラットを含むがそれらに限定されないげっ歯動物、ウサギおよび野ウサギを含むがそれらに限定されないウサギ目（lagomorpha）、ラクダ、ラマおよびヒトコブラクダを含むがそれらに限定されないラクダ科（camelidae）、ならびに原猿（Prosimian）、広猿類（Platyrrhini）（新世界サル）、オナガザル上科（Cercopithecoidea）（旧世界サル）、ならびにギボンズおよび小型および大型類人猿を含むヒト上科を含むがそれらに限定されない非ヒト霊長動物由来の遺伝子により実質的にコードされ得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、実質的にヒトのものである。
【０１２４】
親Ｆｃポリペプチドは、抗体であり得る。親抗体は、例えば遺伝子組み換えマウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455−458、参照によりその全体が本明細書中に包含される）または選択方法と一体となったヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102−108、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いて得られる、完全長ヒト抗体であり得る。親抗体は、天然に存在する必要はない。例えば、親抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol Today 21:397−402、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むがそれらに限定されない遺伝子組み換えにより作製された抗体であり得る。親抗体は、１個以上の天然抗体遺伝子によって実質的にコードされる遺伝子組み換え的に作製された抗体変異体であり得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野で公知の通り、成熟した親和性を有する。あるいは、抗体は、いくつかの他の方法で、例えば２００３年３月３日出願のＵＳＳＮ１０／３３９７８８（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の通りに修飾されている。
【０１２５】
本発明のＦｃ変異体は、何れかの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体に使用する。図３は、これらのヒトＩｇＧ配列のアライメントを提供する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭの抗体クラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体に使用する。本発明のＦｃ変異体は、２個以上のタンパク質鎖を含み得る。すなわち、本発明を、モノマー、またはホモ−もしくはヘテロ−オリゴマーを含むオリゴマーである抗体またはＦｃ融合体に用い得る。
【０１２６】
当技術分野でよく知られている通り、ヒト集団には免疫グロブリン多型が存在する。Ｇｍ多型は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３分子のマーカーのためのＧ１ｍ、Ｇ２ｍおよびＧ３ｍアロタイプ（Ｇｍアロタイプは、ガンマ４鎖上に見出されていない）と称されるアロタイプ抗原決定基をコードするアレルを有するＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ３遺伝子により決定される。マーカーは、‘アロタイプ’および‘イソアロタイプ’に分類され得る。これらは、イソ型間の強い配列相同性に依存して異なる血清学的塩基に区別される。アロタイプは、Ｉｇ遺伝子のアレル形態により特定される抗原決定基である。アロタイプは、異なる個々の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列中にわずかな差異を示す。単一のアミノ酸差異でも、アロタイプ決定基を形成し得るが、多くの場合、いくつかのアミノ酸置換が起こっている。アロタイプは、血清がアレルの差異のみを認識する、サブクラスのアレル間の配列の差異である。イソアロタイプは、１個以上の他のイソ型の非多型相同性領域と共有されるエピトープを生じる１個のイソ型におけるアレルであり、このため、血清は、関連アロタイプおよび関連相同性イソ型の両方と反応し得る（Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88−110; Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１２７】
ヒト免疫グロブリンのアレル形態は、よく特徴付けられている（WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357−362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599−601; Loghem E van, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40−51、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。さらに、他の多型が特徴付けられている（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。現在、１８個のＧｍアロタイプが知られている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43−78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199−211、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。固定された組み合わせで遺伝するアロタイプは、Ｇｍハプロタイプと称される。
【０１２８】
図４は、位置および関連アミノ酸置換を示すヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプを示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖中の等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【０１２９】
本発明のＦｃ変異体は、何れかの免疫グロブリン遺伝子の何れかのアロタイプまたはイソアロタイプにより実質的にコードされ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、Ｇ１ｍ（１）、Ｇ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１７）、ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、および／またはｎＧ１ｍ（１７）に分類されるＩｇＧ１配列を含む抗体またはＦｃ融合体に用いられる。故に、ＩｇＧ１イソ型において、本発明のＦｃ変異体には、２１４位にＬｙｓ（Ｇ１ｍ（１７））またはＡｒｇ（Ｇ１ｍ（３））、４３１位にＡｓｐ３５６／Ｌｅｕ３５８（Ｇ１ｍ（１））もしくはＧｌｕ３５６／Ｍｅｔ３５８（ｎＧ１ｍ（１））、および／またはＧｌｙ（Ｇ１ｍ（２））もしくはＡｌａ（ｎＧ１ｍ（２））が含まれる。
【０１３０】
最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒトＩｇＧ配列に基づき、そのためヒトＩｇＧ配列は、他の配列が比較される、他の生物、例えばげっ歯動物および霊長類由来の配列を含むが、それらに限定されない“ベース”配列として用いられる。Ｆｃ変異体はまた、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなどのような他の免疫グロブリンクラス由来の配列を含み得る。本発明のＦｃ変異体は、ある親ＩｇＧに照らして製造されるが、該変異体は、別の、第二の親ＩｇＧに照らして製造または“変換”され得ることが考慮される。これは、一般的に、第一と第二のＩｇＧ配列間の配列または構造同一性に基づき、第一と第二のＩｇＧ間の“等価”または“対応する”残基および置換基を決定することにより行われる。相同性を確立するために、本明細書に概説する第一のＩｇＧのアミノ酸配列を、第二のＩｇＧの配列と直接比較する。アライメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮し（すなわち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を避けて）、当技術分野で公知の１個以上の相同性アライメントプログラムを用いて（例えば、種間で保存された残基を用いて）配列をアライメント後、第一のＦｃ変異体の初めの配列において特定のアミノ酸と等価の残基が定義される。保存残基のアライメントは、好ましくはかかる残基の１００％を保存すべきである。しかしながら、保存残基の７５％以上またはわずか５０％程度のアライメントも、等価残基を定義するのに適する。等価残基はまた、構造が決定されているＩｇＧの三次構造レベルで、第一と第二のＩｇＧ間の構造的相同性を決定することにより定義され得る。この場合に、等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣおよびＯとＯ）の原子座標が、アライメント後、約０．１３ｎｍ以内、好ましくは約０．１ｎｍであると定義される。アライメントは、ベストモデルが、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を与えるように方向および位置付けされた後、達成される。等価または対応残基をどのように決定するかに関わらず、かつＩｇＧが作製される親ＩｇＧの同一性に関わらず、伝えられるべきであるとされていることは、本発明により見出されたＦｃ変異体を、重要な配列またはＦｃ変異体と構造的相同性を有する何れかの第二の親ＩｇＧに改変することができることである。故に、例えば、変異体抗体を、上記の方法または等価残基を決定するための他の方法を用いることにより作製するとき（ここで、親抗体はヒトＩｇＧ１である。）、変異体抗体は、異なる抗原を結合する別のＩｇＧ１親抗体、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などに改変され得る。さらに、上記の通り、親Ｆｃ変異体においては、本発明のＦｃ変異体を他の親ＩｇＧに転換する能力に影響しない。
【０１３１】
実質的には、下記の標的リストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープが含まれるが、それらに限定されない全ての抗原は、本発明のＦｃ変異体により標的とされ得る：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１ アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３ オステオゲニン（Osteogenin）、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、
【０１３２】
ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、補体制御因子（Decay accelerating factor）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、
【０１３３】
ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ １２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在的ＴＧＦ−１、潜在的ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティ、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、
【０１３４】
ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３，−４、または−６、ニュールツリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、睾丸ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ Ｐａｎ 特異的、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、
【０１３５】
ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド ＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンド ＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａ コネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド ｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド Ａｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド ＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび成長因子のための受容体。
【０１３６】
本発明は、様々な治療的に関連のある特性について最適化されるＦｃ変異体を提供する。１個以上の最適化特性を示すように組み込まれるまたは予測されるＦｃ変異体は、本明細書中、“最適化Ｆｃ変異体”と称される。最適化され得る特性には、ＦｃγＲに対する増大または減少した親和性が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒト活性化ＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａに対して増加した親和性を有するように最適化される。別の好ましい態様において、Ｆｃ変異体は、ヒト阻害性受容体 ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した親和性を有するように最適化される。これらの好ましい態様は、例えばヒトにおける増大した治療特性を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予想される。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むが、これらに限定されないヒトＦｃγＲに対する減少または低下した親和性を有するように最適化される。これらの態様は、ヒトにおける増強された治療特性、例えば減少したエフェクター機能および減少した毒性を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予定される。他の態様において、本発明のＦｃ変異体は、１種以上のＦｃγＲに対して増大した親和性を提供するが、１個以上の他のＦｃγＲに対して減少した親和性を提供する。例えば、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対して増大した結合を有し得るが、ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した結合を有し得る。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩに対して増大した結合を有し得るが、ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した結合を有し得る。さらに別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂに対して増大した親和性を有し得るが、１個以上の活性化ＦｃγＲに対して減少した親和性を有し得る。
【０１３７】
好ましい態様には、ヒトＦｃγＲとの結合の最適化が含まれるが、別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、げっ歯動物および非ヒト霊長動物を含むが、これらに限定されない非ヒト生物由来のＦｃγＲに対して増大または減少した親和性を有する。非ヒトＦｃγＲとの結合を最適化されるＦｃ変異体は、実験で使用され得る。例えば、マウスモデルは、所定の薬剤候補についての効果、毒性、および薬物動態のような特性の検査を可能にする様々な疾患に利用可能である。当技術分野で公知の通り、異種移植と称される方法である、癌細胞を、ヒト癌を模倣するためにマウスに移植または注入することができる。１個以上のマウスＦｃγＲに対して最適化されるＦｃ変異体を含むＦｃ変異体の試験は、タンパク質の有効性、その作用機序などに関する有益な情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体はまた、グリコシル化形態の機能性および／または溶解特性を増大するために最適化され得る。好ましい態様において、本発明のグリコシル化Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体のグリコシル化形態よりも強い親和性でＦｃリガンドを結合する。該Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎ、ならびにプロテインＡおよびＧが含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはサルを含むが、これらに限定されない何れかの起源由来、好ましくはヒト由来であり得る。別の好ましい態様において、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体のグリコシル化形態よりも安定および／または溶解性になるように最適化される。
【０１３８】
本発明のＦｃ変異体は、補体タンパク質、ＦｃＲｎ、およびＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）を含むが、これらに限定されないＦｃγＲ以外のＦｃリガンドと相互作用するように調節される修飾体を含み得る。ＦｃＲＨには、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３、ＦｃＲＨ４、ＦｃＲＨ５、およびＦｃＲＨ６が含まれるが、これらに限定されない（Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１３９】
好ましくは、本発明のＦｃ変異体のＦｃリガンド特異性は、その治療的有用性を決定し得る。治療目的のための所定のＦｃ変異体の有用性は、標的抗原のエピトープまたは形態ならびに処置される疾患または適応症に依存して変わり得る。いくつかの標的および適応症について、増強したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能が、好ましい。このことは、抗癌性Ｆｃ変異体にとって特に好ましい。故に、活性化ＦｃγＲに対する増大した親和性および／または阻害性ＦｃγＲに対する減少した親和性を提供するＦｃ変異体を含むＦｃ変異体が、用いられ得る。いくつかの標的および適応症について、異なる活性化ＦｃγＲに対する異なる選択性を提供するＦｃ変異体を利用することは、さらに有益であり得る；例えば、いくつかの場合に、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａとの増加した結合が望ましいが、ＦｃγＲＩには望ましくなく、一方、他の場合において、ＦｃγＲＩＩａのみとの増加した結合が好ましい。任意の標的および適応症について、ＦｃγＲおよび補体により仲介されるエフェクター機能の両方を増強するＦｃ変異体を利用することが好ましいが、一方、他の場合について、ＦｃγＲまたは補体により仲介されるエフェクター機能のどちらかを増大するＦｃ変異体を利用するのが都合よい。いくつかの標的または癌適応症について、１個以上のエフェクター機能を、例えばＣ１ｑ、１種以上のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、または１個以上の他のＦｃリガンドとの結合をなくすことにより減少または低下することは都合よい。他の標的および適応症について、活性化ＦｃγＲとのＷＴレベルの、減少したまたは低下した結合であるが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂとの増大した結合を提供するＦｃ変異体を利用することが好ましい。このことは、例えば、Ｆｃ変異体の目的が、炎症疾患または自己免疫疾患を阻止すること、またはいくつかの方法で免疫系を調節することであるとき、特に有用であり得る。
【０１４０】
所定の疾患を処置するための所定のＦｃ変異体の最も有益な選択性を決定する明らかに重要なパラメーターは、Ｆｃ変異体であり、例えばどのタイプＦｃ変異体が用いられるかである。故に、所定のＦｃ変異体のＦｃリガンド選択性または特異性は、それが、抗体、Ｆｃ融合体、または結合した融合体もしくは複合体パートナーを有するＦｃ変異体を含むかどうかに依存して異なる特性を提供し得る。例えば、毒物、放射性核種、または他の複合体は、それらを含むＦｃ変異体が、１種以上のＦｃリガンドとの結合を減少または低下したならば、正常細胞に対して毒性が少ない。別の例として、炎症性疾患または自己免疫疾患を阻止するため、活性化ＦｃγＲと結合し、それらの活性化を阻害するような、活性化ＦｃγＲに対する増大した親和性を有するＦｃ変異体を利用することが好ましい。反対に、増大したＦｃγＲＩＩｂ親和性を有する２個以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、免疫細胞の表面上でこの受容体と共結合し、それによりこれらの細胞の増殖を阻止し得る。いくつかの場合において、Ｆｃ変異体は、１つの細胞タイプ上のその標的抗原と結合し、さらに標的抗原とは別の細胞上のＦｃγＲと結合し得るが、他の場合において、それは、標的抗原として同じ細胞の表面上のＦｃγＲとの結合に都合よい。例えば、抗体が、１種以上のＦｃγＲを発現する細胞上の抗原を標的とするならば、その細胞の表面上のＦｃγＲとの結合を増大または減少するＦｃ変異体を利用するのが有益であり得る。このことは、例えば、Ｆｃ変異体が抗癌剤として用いられるとき可能であり、同じ細胞の表面上の標的抗原およびＦｃγＲの共結合は、増殖阻害、アポトーシス、または他の抗増殖性効果をもたらす細胞内のシグナル伝達事象を促進する。あるいは、同じ細胞上の抗原およびＦｃγＲの共結合は、Ｆｃ変異体が、いくつかの方法で免疫系を調節するために使用されるとき都合よく、ここで、標的抗原およびＦｃγＲの共結合は、いくつかの増殖性または抗増殖性効果を提供する。同様に、２個以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、ＦｃγＲ選択性または特異性を調節して同じ細胞の表面上のＦｃγＲを共結合するＦｃ変異体により有益であり得る。
【０１４１】
ＦｃγＲの異なる多型形態の存在は、本発明のＦｃ変異体の治療的利用性に影響を与えるさらに別のパラメーターを提供する。ＦｃγＲの異なるクラスに対する所定のＦｃ変異体の特異性および選択性は、所定の疾患の処置のために所定の抗原を標的とするＦｃ変異体の能力に顕著な影響を与えるが、これらの受容体の異なる多型に対するＦｃ変異体の特異性または選択性は、調査または前臨床実験が、試験に適当であり得るかどうか、最終的に患者集団が、処置に応答し得るかまたは応答し得ないかを一部決定することができる。故に、本発明のＦｃ変異体の、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎおよびＦｃＲＨ多型を含むが、これらに限定されないＦｃリガンド多型に対する特異性または選択性を、有効な調査および前臨床実験、臨床試験計画、患者の選択、用量依存性、および／または他の臨床試験に関する局面の選択を導くために用いることができる。
【０１４２】
修飾は、ＩｇＧ安定性、溶解性、機能性または臨床的用途を改善するために行われ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒトにおける免疫原性を減少するための修飾を含み得る。最も好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体の免疫原性を、２００４年１２月３日出願のＵＳＳＮ１１／００４，５９０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を用いて減少させる。別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、ヒト化される（Clark, 2000, Immunol Today 21:397−402、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本明細書で記載の“ヒト化”抗体は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）および非ヒト（通常、マウスまたはラット）抗体由来の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提示する非ヒト抗体は、“ドナー”と称され、フレームワークを提示するヒト免疫グロブリンは、“アクセプター”と称される。ヒト化は、主に、アクセプター（ヒト）ＶＬおよびＶＨフレームワーク上へのドナーＣＤＲの移植による（例えば、Winter et al, US 5225539、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。このストラテジーは、“ＣＤＲ移植”と称される。選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への“逆変異（Backmutation）”は、しばしば、最初に移植されたコンストラクトが欠く親和性を取り戻すのに必要である（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；および、ＵＳ６４０７２１３、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、典型的にヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含み、故に、典型的に、ヒトＦｃ領域を含み得る。非ヒト抗体のヒト化および再形成のための様々な技術および方法は、当技術分野でよく知られている（Tsurushita ＆ Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533−545, Elsevier Science (USA)、およびそこに引用される文献を参照のこと、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化方法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522−525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323−329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534−1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029−33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029−1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593−9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181−4185; O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321−8（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法が含まれるが、それらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減じるヒト化方法または他の方法には、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969−973（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載のような、表面再形成法が含まれ得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野でよく知られている通り、成熟した親和性を有する。構造に基づく方法は、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載のヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151−162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611−22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910−8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753−759（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟に用いられ得る。他のヒト化方法は、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119−1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076−3084（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない、ＣＤＲの一部のみの移植を伴い得る。
【０１４３】
免疫原性を減少する修飾には、親配列由来の処理ペプチドのＭＨＣタンパク質への結合を減少する修飾が含まれ得る。例えば、アミノ酸修飾は、どんな一般的なＭＨＣアレルにも高親和性で結合することが予測される免疫エピトープがないかまたはそれが最小数となるように、作製され得る。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が、当技術分野で公知であり、本発明のＦｃ変異体中のエピトープを数えるために用い得る。例えば、ＷＯ９８／５２９７６；ＷＯ０２／０７９２３２；ＷＯ００／３３１７；ＵＳＳＮ０９／９０３，３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９，１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２，６９７；ＵＳＳＮ１０／７５４，２９６；ＰＣＴ ＷＯ ０１／２１８２３；および、ＰＣＴ ＷＯ ０２／００１６５；Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942−948；Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561；ＷＯ９８／５９２４４；ＷＯ０２／０６９２３２；ＷＯ０２／７７１８７；Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927−5933；and Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353−2358（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。配列に基づく情報は、所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用の結合スコアを決定するために用い得る（例えば、Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942−948；Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561を参照のこと、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１４４】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、１個以上の改変された糖鎖（engineered glycoform）を含む。本明細書で用いる“改変された糖鎖”は、ＩｇＧと共有結合する炭水化物組成物を意味し、ここで該炭水化物組成物は、親ＩｇＧのそれと化学的に異なる。改変された糖鎖は、エフェクター機能を増強するかまたは減少することを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変された糖鎖は、当技術分野で公知の様々な方法により作製され得る（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466−3473）；（ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１）；（PotelligentTM technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）glycosylation engineering technology [GLYCART Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]）（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。多くのこれらの技術は、例えば遺伝子組み換えまたは他の様々な生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現することによるか、またはグリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによるか、またはＩｇＧが発現された後、炭水化物（複数可）を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合するオリゴ糖のフコシル化レベルを制御すること、および／またはそれを２つに切断することに基づく。改変された糖鎖は、典型的に、異なる炭水化物またはオリゴ糖と称される；故に、Ｆｃ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、改変された糖鎖を含み得る。あるいは、改変された糖鎖は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＦｃ変異体と称され得る。
【０１４５】
別の態様において、本発明のＦｃ変異体は、別の治療化合物と結合されるか、または作動可能に連結される。該治療化合物は、細胞毒性剤、化学療法剤、毒物、放射性同位体、サイトカイン、または他の治療的活性剤であり得る。ＩｇＧは、様々な非タンパク性ポリマーのうち１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーと結合し得る。
【０１４６】
本発明は、Ｆｃ変異体を製造、産生およびスクリーニングするための方法を提供する。記載の方法は、本発明が、何れかの特定の用途または操作理論にとらわれることを意味しない。むしろ、提供される方法は、一般的に、１種以上のＦｃ変異体が、最適化されたエフェクター機能を有するＦｃ変異体を実験的に得るために、製造、産生、およびスクリーニングされ得ることを説明することを意図する。様々な方法が、抗体の設計、産生、および試験、ならびにタンパク質変異体について、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。
【０１４７】
様々なタンパク質製造方法が、最適化したエフェクター機能を有するＦｃ変異体を設計するために用いられ得る。１つの態様において、構造に基づく製造方法を用いることができ、ここで利用可能な構造情報を、置換を誘導するために用いる。配列のアライメントを、表示の位置での置換を誘導するために用いることができる。あるいは、無作為的または半無作為的変異誘導法を、所望の位置にアミノ酸修飾を製造するために用いることができる。
【０１４８】
Ｆｃ変異体の製造方法およびスクリーニング方法は、当技術分野でよく知られている。抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングのための一般的方法は、Antibody Engineering、Duebel ＆ Kontermann編集, Springer−Verlag, Heidelberg, 2001；および、Hayhurst ＆ Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683−689；Maynard ＆ Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−76（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。また、ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を参照のこと。
【０１４９】
本発明の１つの態様において、Ｆｃ変異体配列を、メンバー配列をコードし、故に、宿主細胞中にクローニングされ、要すれば発現され、かつ分析され得る核酸を製造するために用いる。これらの実施を、公知の方法、およびMolecular Cloning−A Laboratory Manual, 3rd Ed.（Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology（John Wiley ＆ Sons）（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の、本発明において使用され得る様々な方法を用いて行う。本発明のＦｃ変異体を、タンパク質の発現を誘導または引き起こすのに適当な条件下で、Ｆｃ変異体をコードする核酸を含む、核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することにより作製することができる。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母を含むが、これらに限定されない多様な適当な宿主細胞を、用いることができる。例えば、本発明において使用され得る様々な細胞系は、ＡＴＣＣ細胞系カタログ（American Type Culture Collectionにより利用可能）に記載される。宿主細胞中に外来の核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、用いる宿主細胞により異なり得る。
【０１５０】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体を発現後に精製または単離する。抗体を、当業者に公知の多様な方法で単離または精製することができる。標準的精製方法には、クロマトグラフ法、電気泳動法、免疫学的方法、沈殿法、透析法、ろ過法、濃縮法およびクロマト分画技術が含まれる。当技術分野で公知の通り、様々な天然タンパク質、例えば細菌プロテインＡ、Ｇ、およびＬが抗体に結合し、これらのタンパク質は、精製用に本発明で使用され得る。しばしば、精製は、特定の融合パートナーにより可能であり得る。例えば、タンパク質を、ＧＳＴ融合が用いられるときグルタチオン樹脂を用いて、Ｈｉｓタグが用いられるときＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを用いて、またはフラグタグが用いられるとき固定化抗フラグ抗体を用いて精製することができる。適する精製技術における一般的ガイダンスについては、Antibody Purification： Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer−Verlag, NY, 1994（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１５１】
Ｆｃ変異体を、インビトロ分析、インビボおよび細胞に基づくアッセイ、ならびに選択技術に用いる方法を含むが、これらに限定されない様々な方法を用いてスクリーニングすることができる。自動化高性能スクリーニング技術を、スクリーニング方法に利用することができる。スクリーニングには、融合パートナーまたは標識、例えば免疫標識、同位体標識、または蛍光もしくは比色色素のような小分子標識の使用を用いることができる。
【０１５２】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体の機能的および／または生物物理的特徴を、インビトロ分析においてスクリーニングする。好ましい態様において、タンパク質を、機能性、例えばその反応を触媒する能力またはその標的に対するその結合親和性についてスクリーニングする。
【０１５３】
当技術分野で公知の通り、スクリーニング法の一部には、ライブラリーの好ましいメンバーを選択する方法が含まれる。該方法は、本明細書中、“選択方法”と称され、これらの方法は、本発明においてＦｃ変異体のスクリーニングに使用される。タンパク質ライブラリーを、選択方法を用いてスクリーニングするとき、増殖され、単離され、および／または観察されるライブラリーのメンバーのみが、いくつかの選択基準を満たすとして好ましい。本発明においてタンパク質ライブラリーのスクリーニングに使用され得る様々な選択方法が、当技術分野で公知である。本発明において使用され得る他の選択方法には、インビボ方法のような提示によらない方法が含まれる。“定向進化（directed evolution）”法と称される選択方法の一部は、時折新規の変異の挿入を含む、選択中の好ましい配列のメイティング（mating）またはブレッディング（breading）を含む方法である。
【０１５４】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体を、１個以上の細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイを用いてスクリーニングする。そのような分析のために、精製または非精製タンパク質が典型的に、細胞が個々の変異体またはライブラリーに属する変異体の集合に暴露されるように、細胞外に添加される。これらの分析は、常にではないが一般的に、Ｆｃポリペプチドの機能に基づく；すなわち、その標的に結合し、いくつかの生化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなどを仲介するＦｃポリペプチドの能力に基づく。かかる分析はしばしば、ＩｇＧに対する細胞の応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、または天然遺伝子もしくはレポーター遺伝子の細胞発現のような転写活性化を観察することを含む。例えば、かかる分析は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣを誘導するＦｃ変異体の能力を測定することができる。いくつかの分析に関して、標的細胞に加えて、さらなる細胞または成分、例えば血清補体、または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を添加する必要があり得る。かかる添加細胞は、何れかの生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来であり得る。抗体は、標的を発現する任意の細胞系のアポトーシスを引き起こし得るか、またはその分析に添加された免疫細胞による標的細胞への攻撃を仲介し得る。細胞死または細胞生存を観察するための方法は、当技術分野で公知であり、それらには、色素、免疫化学的反応剤、細胞化学的反応剤、および放射性反応剤の使用が包含される。転写活性化は、細胞に基づくアッセイにおいて機能を分析するための方法にもなり得る。あるいは、細胞に基づくスクリーニングを、変異体をコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトした細胞を用いて行う。すなわち、Ｆｃ変異体を、細胞に対して細胞外に添加しない。
【０１５５】
好ましい態様において、Ｆｃ変異体の免疫原性を、１個以上の細胞に基づくアッセイ法を用いて実験的に決定する。いくつかの方法を、エピトープの実験的確認に用いることができる。
【０１５６】
本発明のＦｃ変異体の生物学的特徴を、細胞、組織および生物全体の実験において特徴付けることができる。当技術分野で公知の通り、薬剤をしばしば、疾患または疾患モデルに対する処置のための薬剤の効果を測定するため、または薬剤の薬物動態、毒性および他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むが、これらに限定されない動物において試験する。該動物は、疾患モデルと称され得る。治療剤をしばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、および遺伝子組み換えマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むが、それらに限定されないマウスにおいて試験する。かかる実験は、治療剤として用いられるタンパク質の可能性を決定するための意味のあるデータを提供することができる。何れかの生物、好ましくは哺乳動物を試験に用いることができる。例えばヒトに遺伝的に類似するため、サルを適する治療モデルとすることができ、故に、本発明のＩｇＧの効果、毒性、薬物動態、または他の特性を試験するために用いることができる。ヒトにおける試験が、薬剤としての承認のために最終的に必要であり、故に、もちろんこれらの実験が意図される。従って、本発明のＩｇＧをヒトにおいて試験し、その治療効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定することができる。
【０１５７】
本発明のＦｃ変異体は、様々な製品に用いられ得る。１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、治療剤、診断剤、または実験反応剤であり、好ましくは治療剤である。Ｆｃ変異体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物に用いられ得る。好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞を殺すために使用する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、例えばサイトカインまたはサイトカイン受容体をアンタゴナイズするために用いる。別の好ましい態様において、本発明のＦｃ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、および標的抗原を有する標的細胞を殺すために用いる。
【０１５８】
本発明のＦｃ変異体を、様々な治療目的に用いることができる。好ましい態様において、Ｆｃ変異体を含む抗体を、抗体関連疾患を処置するために患者に投与する。本目的に関して“患者”には、ヒトおよび他の動物、好ましくは哺乳動物が含まれ、最も好ましくはヒトである。本明細書中、“抗体関連疾患”または“抗体応答性疾患”または“状態”または“疾患”は、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与により緩和され得る疾患を意味する。抗体関連疾患には、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経疾患、疼痛、肺疾患、血液学的状態、線維性状態、ならびに癌を含む腫瘍性および新生物性疾患が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中、“癌”および“癌性”は、制御されない細胞増殖により典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を意味するか、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮種、神経鞘腫（schwanoma）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、ならびに白血病およびリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。処置され得る他の状態には、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群（Sjorgren's disease）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびアレルギー状態、移植片対宿主疾患などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いる用語“処置”は、治療的処置、ならびに疾患、状態もしくは障害の予防的、または抑制的手段を含むことを意味する。故に、例えば、疾患の発症前の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、結果として疾患の“処置”をもたらす。別の例として、疾患の症状に対抗するための疾患の臨床症状後の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、疾患の“処置”に含まれる。“処置”はまた、疾患を根絶するための、疾患の出現後の本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与を含む。臨床症状の排除可能性および疾患の改善可能性を有する、発症後および臨床症状の発生後の本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の成功裏の投与は、疾患の“処置”に含まれる。本明細書で用いる用語“処置を必要とする”ものには、予防されるべき疾患または障害を含む該疾患または障害を既に有する哺乳動物、ならびに該疾患または障害を有する傾向のある哺乳動物が含まれる。
【０１５９】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、患者に投与される唯一の治療的活性剤である。あるいは、本発明のＦｃ変異体を、細胞毒性薬、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、心臓保護剤、または他の治療剤を含むが、それらに限定されない１個以上の他の治療剤と併用して、ならびに外科手術の前または後に投与する。ＩｇＧ変異体を、１個以上の他の治療レジメンと併用して投与し得る。例えば、本発明のＦｃ変異体を、外科手術、化学療法、放射線治療、または外科手術、化学療法および放射線治療のいずれかもしくは全てと併用して、患者に投与し得る。１つの態様において、本発明のＦｃ変異体を、本発明のＦｃ変異体を含み得るかまたは含み得ない１個以上の抗体と併用投与することができる。本発明の別の態様に従い、本発明のＦｃ変異体および１個以上の他の抗癌治療剤を、エクスビボで癌細胞の処置に用いる。かかるエクスビボ処置は、骨髄移植および特に、自家骨髄移植に有用であり得ると考えられる。もちろん、本発明のＦｃ変異体は、外科手術のような、さらに他の治療技術と組み合わせて用いることができると考えられる。
【０１６０】
様々な他の治療剤が、本発明のＦｃ変異体との併用投与に使用され得る。１つの態様において、ＩｇＧを、血管形成阻害剤と併用投与する。本明細書で用いる“血管形成阻害剤”は、血管の形成を阻止、またはある程度妨げる化合物を意味する。血管形成阻害因子は、例えば、血管形成の促進に関与する増殖因子または増殖因子受容体と結合する、小分子またはタンパク質、例えば抗体、Ｆｃ融合体もしくはサイトカインであり得る。本明細書中、好ましい血管形成阻害因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体である。別の態様において、ＩｇＧを、適応的免疫応答を誘導または増大する治療剤、例えばＣＴＬＡ−４を標的とする抗体と共に投与する。別の態様において、ＩｇＧを、チロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。本明細書で用いる“チロシンキナーゼ阻害剤”は、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。別の態様において、本発明のＦｃ変異体を、サイトカインと共に投与する。本明細書で用いる“サイトカイン”は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、ある細胞集団により放出されるタンパク質の一般名を意味する。
【０１６１】
医薬組成物とは、本発明のＦｃ変異体および１個以上の治療的活性剤が、製剤されることを意図する。本発明のＦｃ変異体の製剤は、所望の純度を有するＩｇＧを、所望により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980、参照によりその全体が本明細書中に包含される）と共に混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に保存用に調製される。インビボ投与用に使用される製剤を、好ましくは滅菌する。これは、滅菌ろ過膜を通すろ過または他の方法により容易に達成される。本明細書に記載のＦｃ変異体および他の治療的活性剤は、免疫リポソーム、および／またはマイクロカプセル封入としても製剤され得る。
【０１６２】
製剤中の治療的に活性なＦｃ変異体の濃度は、約０．００１ないし１００重量％で変化し得る。好ましい態様において、ＩｇＧの濃度は、０．００３ないし１．０モルの範囲内である。患者を処置するために、本発明のＦｃ変異体の治療的有効用量を投与することができる。本明細書中、“治療的有効用量”とは、それが投与されて効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存して変化し、公知の技術を用いて当業者により確認され得る。投与量は、体重１ｋｇ当たり０．００１ないし１００ｍｇまたはそれ以上、例えば体重１ｋｇ当たり０．１、１、１０、または５０ｍｇの範囲であり、１ないし１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当技術分野で公知の通り、タンパク質分解、全身的対局所送達、および新しいタンパク質合成の速度、ならびに年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、薬剤の相互作用および状態の重症度に関する調整が必要であり、当業者により常套的実験にて確認され得る。
【０１６３】
好ましくは滅菌水溶液の形態の、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与を、経口、皮下、静脈内、経鼻的、耳内（intraotically）、経皮的、局所的（例えば、ジェル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigmにより市販されるＡＥＲｘ（登録商標）吸入可能技術、またはInhale Therapeuticsにより市販されるＩｎｈａｎｃｅ（登録商標）肺送達システムなど）、経膣的、非経腸的、経直腸的、または眼内（intraocularly）を含むが、それらに限定されない様々な方法で行うことができる。本明細書に記載の治療剤を、他の治療剤と併用して投与することができる。
【実施例】
【０１６４】
実施例
下記の実施例を、本発明を説明するために提供する。これらの実施例は、どんな特定の適用または操作理論にも本発明を制限することを意味しない。
【０１６５】
実施例１．増大したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を用いて、さらなるＦｃ変異体を、Ｆｃリガンドとの結合を増大し、エフェクター機能を最適化するため、ならびにＦｃγＲ結合およびエフェクター機能を減少または低下させるために設計した。該変異体を、細胞に基づくアッセイにおいて測定可能なＣＤＣおよびＡＤＣＣを仲介することが知られる、抗ＣＤ２０抗体であるＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に照らして構築した。既に特徴付けられた変異体もまた、それらの特性をさらに特徴付け、現在の一連の新しい変異体の比較物（comparator）を提供するために、ＰＲＯ７０７６９中にコンストラクトした。図５は、これらのＦｃ変異体のリストを提供する。とりわけ、この変異体セットには、多くの挿入が含まれる。例えば、“インサート Ｌ＞２３５−２３６／Ｉ３３２Ｅ”は、Ｉ３３２Ｅ置換および残基２３５と２３６位の間へのロイシンの挿入を含む二重変異体を意味する。
【０１６６】
ＰＲＯ７０７６９の可変領域の遺伝子（図２４ａおよび２４ｂ）を、リカーシブ（recursive）ＰＣＲを用いてコンストラクトし、全長軽鎖カッパ（Ｃκ）および重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（Invitrogen）中にサブクローニングした。変異体を、ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ変異誘発技術（Stratagene）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏベクター中の抗体の可変領域中にコンストラクトし、２９３Ｔ細胞中で発現させた。ＤＮＡを、配列の忠実度を確認するために配列決定した。重鎖遺伝子（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）（野生型または変異体）を含むプラスミドを、軽鎖遺伝子（ＶＬ−Ｃκ）を含むプラスミドと共に、２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクトした。培地をトランスフェクションの５日後に集め、抗体をプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Pierce）を用いて上清から精製した。選択したＦｃ変異体は、アレムツズマブにおいても発現した。
【０１６７】
ＩｇＧ抗体によるヒトＦｃγＲに対する結合親和性を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ競合分析を用いて測定した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、ビーズに基づく発光近接分析である。ドナービーズのレーザー励起は、酸素を励起し、アクセプタービーズとの接近が十分なとき、化学発光事象のカスケードを生じ、最終的に５２０−６２０ｎｍでの蛍光放出をもたらし得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを、抗体をスクリーニングするための競合分析として用いた。野生型ＩｇＧ１抗体を、ストレプトアビジン ドナービーズへの標準的結合方法によりビオチン化し、タグ付きＦｃγＲを、グルタチオンキレート アクセプタービーズに結合させた。競合するＦｃポリペプチドの不存在において、野生型抗体およびＦｃγＲが相互作用し、５２０−６２０ｎｍでのシグナルを生じる。タグの付いていない抗体の添加は、野生型Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用と競合し、蛍光を定量的に減少させて相対的結合親和性の決定を可能にする。
【０１６８】
図６は、ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体の結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合データを提供する。該データを、非線形回帰を用いて一部位競合モデルに適合させ、これらの適合を、図中曲線で示す。これらの適合は、各抗体についての５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）（すなわち、５０％阻害に必要な濃度）を提供し、故に、ＷＴと比較した相対的結合親和性を決定することができる。図５は、これらの結合曲線への適合についての、ＷＴと比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１６９】
選択したＦｃ変異体を再発現させ、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて再試験した（図７）。図７ａは、これらの変異体の結合データを示し、図７ｂは、これらの結合曲線への適合についての、ＷＴと比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１７０】
これらのデータに基づき、多くのさらなるＦｃ変異体を、ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らしてコンストラクトした。さらに、いくつかのＦｃ変異体を、２００５年１０月２１日出願のＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の新規ＩｇＧ分子であるＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧに照らしてコンストラクトした。これらの変異体を、上記の通りにコンストラクトし、多くの既に特徴付けられたＦｃ変異体と共に発現させ精製した。これらの変異体を図８ａに列記する。ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、ならびに阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの該変異体の結合を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて測定した。図８ｂは、選択した変異体のこれらの受容体との結合データを示し、図８ａは、この一連のＦｃ変異体全てについての、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０およびＩＣ５０倍数を提供する。
【０１７１】
該アッセイの高反応性性質のため、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、相対的親和性のみ提供する。正確な結合定数を、抗体／ＦｃγＲ平衡における非結合抗体をＦｃγＲＩＩＩａ表面に捕捉した、競合ＳＰＲ装置（Nieba et al., 1996, Anal Biochem 234:155−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いて得た。この実験を、上記でコンストラクトされ特徴付けられたトラスツズマブ ＩｇＧ１に照らして、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体を用いて行った（ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、およびＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＷＴおよび変異体トラスツズマブ抗体を、上記の通りに発現させ精製した。この実験に関して、データをＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（BIAcore）で得た。Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴを、固定化抗ＧＳＴ抗体を用いて捕捉し、組み換えＧＳＴを用いてブロッキングし、抗体／受容体への結合競合分析物を測定した。抗ＧＳＴ抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ ＧＳＴキャプチャーキットを用いてＣＭ５センサーに共有結合させた。各センサーチップに１個のフローセルを、非特異的結合の対照としてエタノールアミンと結合させ、バルク屈折率変化をオンラインで減算した。泳動バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、BIAcore）であり、チップ再生バッファーは、グリシン１．５（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５、BIAcore）であった。１μＭ Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴを、１μｌ／分にて５分間、ＨＢＳ−ＥＰ中で抗ＧＳＴ ＣＭ５チップに結合させた。表面を、１μｌ／分にて２分間、５μＭの組み換えＧＳＴ（Sigma）を注入してブロッキングした。１００ｎＭの野生型または変異体トラスツズマブ抗体を、４ないし１０００ｎＭの間の連続希釈のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴと合わせ、室温で少なくとも２時間インキュベートした。該競合結合物を、５０μｌ／分にて、ＨＢＳ−ＥＰ中、３０秒間の結合のために、Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−ＧＳＴ／組み換えＧＳＴ表面上に注入した。抗体を含むが競合受容体を含まない１サイクルが、ベースライン応答を提供した。
【０１７２】
上記の“競合ＢＩＡｃｏｒｅ”法を用いて、動力学的曲線を結合率を導くために適合させた（Nieba et al., 1996, Anal Biochem 234:155−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本発明者らは、動力学的曲線から得られる結合率が用いた抗体濃度に非線形相関を示したため、この方法があまり信頼性のないことを見出した。本研究に用いた分析は、初期結合率Ｒの遊離抗体濃度との比例に基づく（Holwill et al., 1996, Process Control and Quality 8:133−145; Edwards ＆ Leatherbarrow, 1997, Anal Biochem 246:1−6、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。応答単位データを、ＢＩＡ評価ソフトウェア（BIAcore）を用いて出力し、Ｘｌｆｉｔバージョン３．０．５のマイクロソフトＥｘｃｅｌ（IDBS）を用いて分析した。（シグナル増加の）初期結合率値を、傾きのＥｘｃｅｌ式を用いて各センサーグラムの生データから決定した。平衡解離結合定数（ＫＤ）を、各濃度で得られた初期結合率に対するＦｃγＲＩＩＩａ濃度のｌｏｇ値をプロットすることにより決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）を用いて、下記の式にデータを合わせた：
【０１７３】
【数１】
〔式中、
［Ａ０］＝抗体濃度
Ｒ０＝競合する受容体の不存在下での、抗体濃度Ａ０での初期結合率
Ｘ＝ｌｏｇ［Ｌ０］（ここで、［Ｌ０］＝インプット受容体濃度である。）
ＫＤ＝平衡解離定数である。〕。
Ｒ０は、抗体と固定化受容体との結合率を示し（競合する受容体の不存在下での）、それらの異なる受容体親和性のため、それを、ＷＴ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ抗体について別個に計算した。
【０１７４】
初期結合率Ｒについての式は、単一の結合部位についてのＫＤ：
【数２】
で示される定義、および質量保存式
【数３】
〔式中：
［Ｌ］＝遊離受容体の濃度である。〕
から導かれる。
【０１７５】
初期結合率を、センサーグラムの生データから決定し（図９ａ）、ＫＤ値を、各濃度で得られる初期結合率に対する受容体濃度のｌｏｇ値をプロットすることにより計算した（図９ｂ、９ｃ）（Edwards ＆ Leatherbarrow, 1997, Anal Biochem 246:1−6、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＷＴ ＫＤ（２５２ｎＭ）は、公表されたデータとよく一致する（ＳＰＲからの２０８ｎＭ、熱量測定からの５３５ｎＭ）（Okazaki et al., 2004 J Mol Biol 336:1239−4９、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｉ３３２Ｅ（３０ｎＭ）およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２ｎＭ）変異体のＫＤ値は、Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対してそれぞれおよそ１０倍および１００倍値（1-および2-logs）の強い親和性を示す。
【０１７６】
本発明のＦｃ変異体を含む抗体の、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を発揮するための能力を調査するために、インビトロでの細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いて行った。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いてラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ヒトＰＢＭＣを、フィコール・グラディエント（ficoll gradient）法を用いてｌｅｕｋｏｐａｃｋから精製し、ＣＤ２０＋標的リンパ腫細胞株ＷＩＬ２−ＳをＡＴＣＣから得た。標的細胞を、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで播種し、Ｆｃ変異体またはＷＴ抗体を示した最終濃度で用いてオプソニン化した。トライトンＸ１００およびＰＢＭＣのみを、対照として用いた。エフェクター細胞を、ＰＢＭＣ：標的細胞を２５：１で添加し、プレートを、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を、ＬＤＨ反応混合物と共にインキュベートし、蛍光を、ＦｕｓｉｏｎＴＭＡｌｐｈａ−ＦＰ（Perkin Elmer）を用いて測定した。データを、最大溶解（トライトン）および最小溶解（ＰＢＭＣのみ）に標準化し、シグモイド型用量応答モデルに合わせた。図１０は、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧのどちらかにおける選択したＦｃ変異体抗体についてのこれらのデータを提供する。Ｆｃ変異体は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１抗体と比較して、ＦｃγＲにより仲介されるＣＤ２０＋標的細胞溶解における明確な増大を提供する。
【０１７７】
これらのインビトロ分析は、本発明のＦｃ変異体が、臨床設定における増強した効力および／または有効性を提供し得ることを示唆する。インビボ性能は、これらのインビトロ実験で検討されないいくつかの因子を含む多くの因子の影響を受け得る。１つのそのようなパラメーターは、抗体の臨床効力に影響を与えることが示されている、血清中非特異的ＩｇＧの高濃度である（Vugmeyster ＆ Howell, 2004, Int Immunopharmacol 4:1117−24; Preithner et al., 2005, Mol Immunol, 43(8):1183−93、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。本発明のＦｃ変異が、インビボ生物学により酷似した溶液中でどのように起こるのかを調べるため、ＡＤＣＣアッセイを、生物学的に関連する濃度（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト血清から精製したＩｇＧ（Jackson Immunoresearch Lab, Inc.により市販されている）の存在下で繰り返した。これらのデータを、図１１に示す。ＷＴ 抗ＣＤ２０抗体の有効性は、血清レベルのＩｇＧの存在下で減少するだけでなく、完全になくなる。対照的に、Ｆｃ変異体抗体は、顕著に減少するが、依然、標的細胞系を殺すのを仲介する実質的な能力を示す。
【０１７８】
実施例２．増大した補体により仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
多くの変異体を、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するのを目的として設計した。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを仲介するのと同じ方法で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を仲介する。現在、Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に利用可能な構造は存在しない；しかしながら、変異誘発研究は、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を中心とする領域にＣ１ｑのためのヒトＩｇＧ上の結合部位をマッピングした（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178−4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571−2575、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。図１２は、このマッピングされた中心点を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造を示す。これらの４個の残基に構造的に近いＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）に開示される選択したアミノ酸修飾を、Ｃ１ｑに対する増加した親和性を仲介し、および／または増加したＣＤＣを提供し得る変異体を探索するために調査した。増加したＦｃγＲ親和性およびＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を既に示した変異体には、この一連の変異体が含まれ、それらの相補的特性を特徴付けた。この変異体ライブラリーを、図１３に示す。
【０１７９】
該変異体を、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９（可変領域）および重鎖定常領域としてＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして、上記の通りにコンストラクトした。変異体を、上記の通りに発現させて精製した。細胞ベースの分析を、Ｆｃ変異体がＣＤＣを仲介する能力を測定するために用いた。溶解を、Ｆｃ変異体およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９によりオプソニン化したＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞の溶解をヒト血清補体によりモニターするために、アラマーブルーの放出を用いて測定した。標的細胞を、１０％ＦＢＳ培地で遠心および再懸濁して３回洗浄し、ＷＴまたは変異体リツキシマブ抗体を、示した最終濃度で添加した。ヒト血清補体（Quidel）を、培地を用いて５０％に希釈し、抗体によりオプソニン化した標的細胞に添加した。補体の最終濃度は、原液の１／６であった。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、アラマーブルーを添加し、細胞を２日間インキュベートし、蛍光を測定した。この分析の代表的なデータを図１４に示す。結合データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれでのベースラインにより、それぞれの特定の曲線について最大および最小発光シグナルに標準化した。データを、非線形回帰を用いて傾き変化モデル（variable slope model）を含むシグモイド型用量応答に適合させ、これらの適合を、図に曲線で示す。これらの適合は、Ｆｃ変異体の相対的結合親和性を定量的に決定するのを可能にする、各抗体についての５０％有効濃度（ＥＣ５０）（すなわち、５０％応答に必要な濃度）を提供する。各変異体のＥＣ５０をＷＴ ＰＲＯ７０７６９のＥＣ５０で割ることにより、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９（ＷＴ倍数）と比較した増加倍数または減少倍数を得た。これらの値を、図１３に示す。ここで、１を超える倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９と比較してＣＤＣ ＥＣ５０の増大を示し、１より小さい倍数は、ＣＤＣ ＥＣ５０の減少を示す。
【０１８０】
図１３および１４のデータは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較して増大したＣＤＣを提供することを示す。例えば、２倍以上のＣＤＣの増大が、修飾２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７２Ｉ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｒ、２８２Ｇ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｔ、３２４Ｉ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２６Ｅ、３２６Ｔ、３２６Ｗ、３２７Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ｆ、３３４Ｔおよび３３５Ｄで観察される（図１５）。さらに、データは、多くの修飾体が、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較して減少したＣＤＣを提供することを示す。例えば、０．５倍以下の相対的ＣＤＣを示す修飾には、２３５Ｄ、２３９Ｄ、２８４Ｄ、３２２Ｈ、３２２Ｔ、３２２Ｙ、３２７Ｒ、３３０Ｅ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｖ、３３１Ｄ、３３１Ｌおよび３３２Ｅが含まれる（図１５）。これらの修飾は、増大したＣＤＣのための変異体のさらなる設計を導くために用いられ得るさらなる有益な構造活性相関（ＳＡＲ）情報を提供する。同時に、データは、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７２位、２７６位、２７８位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位および３３５位（図１５）での修飾が、親Ｆｃポリペプチドと比較して、増大したＣＤＣを提供し得ることを示唆する。
【０１８１】
実施例３．減少したＦｃγＲおよび補体により仲介されるエフェクター機能を有するＦｃ変異体
上記の通り、エフェクター機能が臨床効果に貢献する抗体治療および適応とは対照的に、いくつかの抗体および臨床適用に関して、１種以上のＦｃγＲとの結合を減少するもしくは除去するか、またはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを含むが、これらに限定されない１個以上のＦｃγＲまたは補体により仲介されるエフェクター機能を減少するもしくは除去するのが、好ましい。これはしばしば、その作用機序が標的抗原を有する細胞の死ではなく、その阻止または拮抗作用を伴う治療抗体の場合である。これらの場合において、標的細胞の減少は望ましくなく、副作用と見なされ得る。エフェクター機能はまた、放射性複合体と称される放射性標識抗体、および免疫毒素と称される毒素と複合体形成した抗体についての課題でもあり得る。これらの薬物を、癌細胞を破壊するために用いることができるが、ＦｃとＦｃγＲとの相互作用による免疫細胞の捕捉は、有害なペイロード（放射物または毒素）の近接域に健康な免疫細胞をもたらし、結果として標的癌細胞と共に正常なリンパ系組織の減少をもたらす。
【０１８２】
低下したＦｃγＲ結合および補体結合の従来考慮されていなかった利点は、エフェクター機能が必要ない場合に、ＦｃγＲおよび補体との結合が、薬物の活性濃度を効果的に低下し得ることである。Ｆｃリガンドとの結合は、抗体またはＦｃ融合体、または血清タンパク質が遊離の（複合体を形成していない）ときと比較して活性が低いかまたは不活性である血清タンパク質との複合体を細胞表面に局在化させ得る。これは、抗体が所望される結合部位での低下した有効濃度のためか、または恐らく、Ｆｃリガンド結合が、Ｆｃポリペプチドを、非結合であった場合より活性が低い立体構造にし得るためである。さらなる考察は、ＦｃγＲ受容体が、抗体のターンオーバーの１つ機序であり得ること、ならびに樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞による取り込みおよびプロセシングを仲介し得ることである。これは、抗体またはＦｃ融合体の薬物動態（または、インビボ半減期）およびその免疫原性（両方とも、臨床パフォーマンスの重要なパラメーターである。）に影響を与え得る。
【０１８３】
Ｆｃ／ＦｃγＲ構造（図２）および上記のＦｃ／Ｃ１ｑ接合部位（図１２）の外観図、ならびに上記およびＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０、およびＵＳＳＮ１１／２５６，０６０（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）のデータを、ＦｃγＲに対する減少した親和性、および減少したＣＤＣを有する変異体をスクリーニングするためのライブラリーの設計の指針に用いた。この変異体ライブラリーを図１６に示す。変異体を、ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らしてコンストラクトし、上記の通り発現させ精製した。相対的ＦｃγＲ親和性を、上記の通りに、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを用いて測定した。図１７は、選択したＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示し、図１６は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したそのＩＣ５０倍数を示す。変異体を、上記のＣＤＣアッセイを用いて、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する補体仲介性溶解を仲介するその能力についても調べた。図１８は、選択したＦｃ変異体のＣＤＣデータを示し、図１６は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＥＣ５０倍数を示す。これらの実験の結果に基づき、選択したＦｃ変異体を、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能を仲介するその能力について特徴付けた。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、およびＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞を標的細胞として用いるＡＤＣＣアッセイを、上記の通りに行った。図１９は、選択した変異体についてのこれらのＡＤＣＣデータを示す。
【０１８４】
データは、多くの位置での修飾が、減少または低下したＦｃγＲ親和性、減少したＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および減少した補体により仲介されるエフェクター機能を提供することを示す。さらに、２３５および３３０位を含むがこれらに限定されないいくつかの位置での修飾は、減少したＣＤＣを提供するが、ＦｃγＲ親和性はＷＴレベルであり得る。例えば、２３５Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｎおよび３３０Ｒは、そのような作用を示す。あるいは、２３６位および２９９位を含むがこれらに限定されないいくつかの位置における修飾は、減少したＦｃγＲ親和性を提供するが、ＣＤＣはＷＴレベルであり得る。例えば、２３６Ｉおよび２９９Ａは、これらの特性を示す。
【０１８５】
これらの実験の結果に基づき、ＦｃγＲ親和性およびＣＤＣを同時に低下する多くの修飾を、完全に低下したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能を有する変異体をスクリーニングするために設計されたＦｃ変異体の新しいライブラリー中の多数の変異を有する変異体に組み合わせた。これらの変異体は、２３４位、２３５位、２３６位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位での修飾を含み、図２０に示す。ＷＴ ＩｇＧ１抗体、ならびにＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体変異体、グリコシル化変異体Ｎ２９７Ｓ、および減少したエフェクター機能を有することが既に特徴付けられた２つの変異体：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Xu et al., 2000, Cellular Immunology 200:16−26；ＵＳＳＮ１０／２６７，２８６、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−（Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613−2624、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が、包含される。
【０１８６】
これらの変異体を、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体以外の重鎖定常領域であるＩｇＧ１を含み、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９に照らしてコンストラクトした。抗体を、上記の通りに発現させ精製した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイを、Ｆｃ変異体の相対的ＦｃγＲ親和性を測定するために、上記の通りに用いた。図２１は、選択した変異体の、低親和性のヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、ならびに高親和性のヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。ＷＴと比較したＩＣ５０倍数を、図２０に示す。Ｆｃ領域に対するそのより大きな結合親和性のため、ＦｃγＲＩは、変異体のよりストリンジェントな試験を提供する。図２０および２１のデータはこれを支持し、変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を実質的に減少し得るかまたは完全に低下し得るが、ＦｃγＲＩ結合にはあまり影響しないことを示す。Ｆｃ変異体はまた、上記のＣＤＣアッセイを用いて、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対して補体仲介性溶解を仲介するそれらの能力を試験した。図２２は、選択したＦｃ変異体についてのＣＤＣデータを示し、図２０は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＥＣ５０倍数を示す。
【０１８７】
Ｆｃ変異体がＡＤＣＣを仲介する能力を調べるため、選択した変異体を、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（可変領域配列を、図２４ｃおよび２４ｄに示す）中にサブクローニングした。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２＋発現細胞系に対してＡＤＣＣアッセイにおいて実質的なシグナルを確実に提供し、故に、エフェクター機能を減少／低下するＦｃ変異体の厳しい検査を提供する。Ｆｃ変異体Ｌ２３５Ｇ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ｋ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｒ／Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３６Ｒ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｇ２３７Ｋ／Ｎ３２５Ｌ、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ／Ｇ２３７ＫおよびＧ２３６Ｒ／Ｇ２３７Ｋ／Ｌ３２８Ｒを、トラスツズマブＩｇＧ１に照らしてコンストラクトした。ＷＴ ＩｇＧ１、ＷＴ ＩｇＧ２およびＷＴ ＩｇＧ４抗体変異体を、同様にコンストラクトした。ＡＤＣＣアッセイを、Ｈｅｒ２＋乳癌細胞系ＳｋＢｒ−３を標的細胞として用いた以外、上記の通りに行った。図２３は、ＡＤＣＣ実験の結果を示す。データは、いくつかの変異体が、ＡＤＣＣを完全に低下することを示す。さらに、ＩｇＧ２はまた、ＡＤＣＣを仲介しないことが明らかであるが、ＩｇＧ４は、かなりのレベルのＡＤＣＣを示す。
【０１８８】
結果は、２３２位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２７０位、２９７位、２９９位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位および３３１位を含むが、これらに限定されない多くの位置でのアミノ酸修飾が、ＦｃγＲ結合、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および／または補体仲介性エフェクター機能が所望されない、抗体およびＦｃ融合体の臨床特性を改善するための有望な候補を提供することを示す。例えば、アミノ酸修飾２３２Ｇ、２３４Ｇ、２３４Ｈ、２３５Ｄ、２３５Ｇ、２３５Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｎ、２３６Ｐ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２３７Ｌ、２３７Ｎ、２３７Ｐ、２３８Ｋ、２３９Ｒ、２６５Ｇ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、２７０Ｈ、２９７Ｓ、２９９Ａ、２９９Ｉ、２９９Ｖ、３２５Ａ、３２５Ｌ、３２７Ｒ、３２８Ｒ、３２９Ｋ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｐ、３３０Ｒ、３３０Ｓおよび３３１Ｌは、顕著に減少したＦｃリガンド結合特性および／またはエフェクター機能を提供する。Ｆｃリガンドとの結合およびエフェクター機能を減少するのに特に有効なのは、変異体２３６Ｒ／２３７Ｋ、２３６Ｒ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３７Ｋ／３２８Ｒ、３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ、２６７Ｒ／２６９Ｒ、２３４Ｇ／２３５Ｇ、２３６Ｒ／２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ／２３７Ｋ、および２３７Ｋ／３２５Ｌ／３２８Ｒである。特に、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒを含むこれらの変異体を含むアミノ酸修飾は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩの両方との結合を減少し、１０倍以上ＣＤＣを減少させ得る。さらに、データは、ヒトＩｇＧ２が、ヒトＩｇＧ４と比較して、顕著に減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能を有することを示す。
【０１８９】
上記の通り、減少したＦｃγＲ親和性および／またはエフェクター機能は、Ｆｃリガンド結合またはエフェクター機能が毒性および／または減少した効果をもたらすＦｃポリペプチドに最適であり得る。例えば、ＣＴＬＡ４を標的とする抗体がＴ細胞活性化の阻害を阻止し、抗腫瘍免疫応答を促進するのに有効であるが、抗体により仲介されるエフェクター機能によるＴ細胞の破壊は、作用機序および／または潜在的な毒性に逆効果となり得る。実際の毒性は、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブの臨床適用で観察した（Maker et al., 2005, Ann Surg Oncol 12:1005−16、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＵＳ６，９８４，７２０の配列番号７（ＶＬ、図２４ｅ）および配列番号１７（ＶＨ、図２４ｆ）（参照により本明細書中にその全体が包含される）から抜粋した、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブ（Ｍａｂ １０Ｄ．１、ＭＤＸ０１０）の配列を、図２４に示す。説明を目的として、本発明の多くのＦｃ変異体を、ＣＴＬＡ４を標的とする抗体の配列中に組み込む。本発明のＦｃ変異体の組み合わせが、典型的に、相加的または相乗的結合調節、それによるエフェクター機能の相加的または相乗的調節をもたらしたため、本発明で供されるＦｃ変異体の未だ明らかになっていない組み合わせ、または他の既報の修飾との組み合わせがまた、好ましい結果を提供し得ることが、予想される。可能性のあるＦｃ変異体を図２６ａに示す。最適化した抗体配列には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８からなる群から選択される少なくとも１個の非ＷＴアミノ酸が含まれる。例えば、ＩｇＧ１定常領域中Ｌ２３５ＧおよびＧ２３６Ｒ修飾を含む改良された抗ＣＴＬＡ−４抗体配列を、図２６ｂおよび２６ｃに示す。あるいは、本発明が示す通り、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４を、Ｆｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を減少するためにも用い得る。図２６ｂおよび２６ｄは、改良した抗ＣＴＬＡ４ ＩｇＧ２抗体配列の配列を提供する。本明細書中、抗ＣＴＬＡ４の使用は、単なる一例であり、Ｆｃ変異体の適用をこの抗体または何れか他の特定のＦｃポリペプチドに制限することを意味しない。減少したＦｃリガンド結合および／またはエフェクター機能の他の例示的適用には、例えばインフリキシマブおよびアダリムマブを含む抗ＴＮＦα抗体、例えばベバシツマブを含む抗ＶＥＧＦ抗体、例えばナタリズマブを含む抗α４−インテグリン抗体、および例えばＵＳＳＮ１０／６４３，８５７（参照により本明細書中にその全体が包含される）に記載のものを含む抗ＣＤ３２ｂ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
好ましいＦｃ変異体のこのリストは、本発明を制限することを意味しない。実際に、供される何れかのＦｃ変異体の全ての組み合わせが、本発明の態様を提供する。さらに、本発明の何れかのＦｃ変異体と他の発見されたまたは未発見のＦｃ変異体との組み合わせも、好ましい特性を提供することができ、これらの組み合わせはまた、本発明の態様として意図される。最後に、これらの結果から、本発明において変異した位置での他の置換が、好ましい結合増大および特異性も提供し得ること、故に、本明細書に記載の全ての位置での置換が考慮されることが予想される。
【０１９１】
全ての引用される文献は、参照により本明細書中にその全体が明示的に包含される。
【０１９２】
本発明の特定の態様は、説明を目的として上記されるが、多数の変形が、添付の特許請求の範囲に記載の通り、本発明から逸脱しない範囲で製造され得ることは、当業者に認められるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインを示す。Ｆｃ領域を示す。可変領域中の抗原結合部位、ならびにＦｃ領域中のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧのための結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位を示す。
【図２】Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色リボンで示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色リボンで示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色棒で示す。
【図３】ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアライメント。図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）の配列およびヒンジドメインを提供し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。位置は、ＩｇＧ１配列のＥＵ Ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、ＩｇＧ１と他の免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４との差異を、灰色で示す。多型が多数の位置に存在し（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1−9、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、故に、示した配列と従来の配列とにわずかな差異が存在し得る。Ｆｃ領域の可能性のある開始点が示され、ＥＵの２２６位または２３０位のどちらかとして本明細書に記載される。
【図４】ヒトＩｇＧ１のガンマ１鎖のアロタイプおよびイソアロタイプの位置および関連するアミノ酸置換を示す（Gorman ＆ Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457−66、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。比較のため、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ガンマ鎖における等価な位置に見出されるアミノ酸も示す。
【図５】Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、抗体ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１に照らして構築した。倍数は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒトＶ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に関してＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０倍数を示す。
【図６】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図６ｂ）との結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴ）の存在において、特徴的阻害曲線が発光シグナルの減少として観察される。結合データを、低および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、一部位競合モデルへのデータの適合を示す。
【図７】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合。図７ａは、選択した変異体についてのデータを示し、図７ｂは、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値および倍数を示す。
【図８】Ｆｃ変異体およびＦｃγＲ結合データ。全てのＦｃ変異体を、可変領域ＰＲＯ７０７６９およびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ（１／２） ＥＬＬＧＧのどちらかに照らして構築した。図８ａは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより測定される、ヒト活性化受容体Ｖ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、および阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの結合の、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＩＣ５０値およびＩＣ５０倍数を示す。図８ｂは、選択した変異体のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎデータを示す。
【図９】ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対するトラスツズマブにおける、Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体の結合親和性を測定する競合表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。図９ａは、センサーグラム生データ（sensorgram raw data）を示し、図９ｂは、各濃度で得られた初期結合率に対する受容体濃度のログ値（対数値）のプロットを示し、そして図９ｃは、実施例１に記載の、これらのデータへの適合から得られた親和性を示す。
【図１０】抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。低濃度および高濃度の抗体それぞれにおけるベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線についての最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した、所定の抗体の抗体濃度におけるＡＤＣＣの用量依存性を示す。曲線は、非線形回帰を用いて、シグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【図１１】血清レベルのヒトＩｇＧの不存在および存在下におけるＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１における、選択したＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。ＡＤＣＣを、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostic）を用いて、ラクトースデヒドロゲナーゼの放出により測定した。ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として用い、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。
【図１２】ＣＤＣを増強するように設計されたＦｃ変異体において変異した残基。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の構造を示す（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。黒色の球および棒は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を仲介するのに重要であることが示されている残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１を示し、灰色の棒は、ＣＤＣに影響を与える変異体を検討するために本発明において変異させた残基を示す。
【図１３】補体仲介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）についてスクリーニングしたＦｃ変異体およびＣＤＣデータ。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１であり、特に他に記載のない限りＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧである。ＣＤＣ倍数は、ＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較した相対的ＣＤＣ活性を示す。
【図１４】Ｆｃ変異体 抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣアッセイ。補体により仲介される溶解の抗体濃度の用量依存性を、ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する示したＰＲＯ７０７６９抗体について示す。溶解を、アラマーブルー（Alamar Blue）の放出を用いて測定し、データを、低濃度および高濃度の抗体それぞれにおいてベースラインにより供される、それぞれの特定の曲線の最小および最大蛍光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を用いて、勾配変化のあるシグモイド型用量応答モデルへのデータの適合を示す。
【図１５】増大および減少したＣＤＣを供するアミノ酸修飾、および増大／調節したＣＤＣを供し得るように修飾され得る位置。位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従い番号付けされる。
【図１６】減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体により仲介されるエフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａと結合するためのＩＣ５０倍数、およびＷＴ ＰＲＯ７０７６９ ＩｇＧ１と比較したＣＤＣ活性のＥＣ５０倍数を示す。
【図１７】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、ＰＲＯ７０７６９ Ｆｃ変異体の選択によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。
【図１８】ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体のＣＤＣアッセイ。溶解をアラマーブルー放出により測定した。
【図１９】ＣＤ２０＋リンパ腫ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対する選択した抗ＣＤ２０抗体 Ｆｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【図２０】減少したＦｃγＲ親和性、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター機能、および補体仲介性エフェクター機能についてスクリーニングしたＦｃ変異体。可変領域は、抗ＣＤ２０抗体 ＰＲＯ７０７６９のものであり、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。図は、２つの別個の試験による、ＷＴと比較したヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａとの結合についてのＩＣ５０倍数、ＷＴと比較したヒトＦｃγＲＩとの結合についてのＩＣ５０倍数、およびＷＴと比較したＣＤＣ活性についてのＥＣ５０倍数を示す。
【図２１】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイにより決定される、選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体による低親和性ヒト活性化受容体Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよび高親和性ヒト活性化受容体ＦｃγＲＩとの結合。
【図２２】ＣＤ２０＋ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞に対する選択したＰＲＯ７０７６９Ｆｃ変異体のＣＤＣ活性。溶解をアラマーブルーの放出により測定した。
【図２３】Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋ＳｋＢｒ−３乳癌標的細胞に対する抗Ｈｅｒ２ Ｆｃ変異体およびＷＴ ＩｇＧ抗体の細胞ベースのＡＤＣＣ活性。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、溶解をＬＤＨ放出により測定した。
【図２４】ＰＲＯ７０７６９（図２４ａおよび２４ｂ）、トラスツズマブ（図２４ｃおよび２４ｄ）、およびイピリムマブ（図２４ｅおよび２４ｆ）を含む、本発明で用いた可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列。
【図２５】本発明で用いたヒト定常軽鎖カッパ（図２５ａ）および定常重鎖（図２５ｂ−２５ｆ）のアミノ酸配列。
【図２６】減少したＦｃリガンド結合およびエフェクター機能特性を有する可能性のある定常重鎖配列（図２６ａ）、および改良した抗ＣＴＬＡ−４抗体の配列（図２６ｂ−２６ｄ）を示す配列。図２６ａは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８として強調して示す可変位置を含む、可能性のあるＦｃ変異体定常重鎖配列を示す。配列の下の表は、ＷＴアミノ酸およびこれらの位置において可能性のある置換基を示す。改良した抗体配列は、この可能性のある修飾基から選択される１個以上の非ＷＴアミノ酸を含み得る。図２６ｂは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖配列を示し、図２６ｃおよび２６ｄは、減少したＦｃリガンド結合およびＦｃにより仲介されるエフェクター機能を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖配列を示す。これらには、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ ＩｇＧ１重鎖（図２６ｃ）およびＩｇＧ２重鎖（図２６ｄ）が含まれる。位置は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従って番号付けられ、故に、配列中の連続順に対応していない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して少なくとも１個のＦｃγＲとの変化した結合または変化した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該変異体は、２２７Ｇ／３３２Ｅ、２３４Ｄ／３３２Ｅ、２３４Ｅ／３３２Ｅ、２３４Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｉ／３３２Ｅ、２３４Ｇ／３３２Ｅ、２３５Ｉ／３３２Ｅ、２３５Ｓ／３３２Ｅ、２３５Ｄ／３３２Ｅ、２３５Ｅ／３３２Ｅ、２４６Ｈ／３３２Ｅ、２５５Ｙ／３３２Ｅ、２５８Ｈ／３３２Ｅ、２６０Ｈ／３３２Ｅ、２６７Ｅ／３３２Ｅ、２６７Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３３０Ｙ、２６８Ｄ／３３０Ｙ、２７２Ｒ／３３２Ｅ、２７２Ｈ／３３２Ｅ、２８３Ｈ／３３２Ｅ、２９３Ｒ／３３２Ｅ、２９５Ｅ／３３２Ｅ、３０４Ｔ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｅ、３２４Ｇ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｄ、３２４Ｇ／３３２Ｄ、３２７Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ｆ／３３２Ｅ、３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２８Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ａ／３３２Ｄ、３２８Ｔ／３３２Ｄ、３２８Ｖ／３３２Ｄ、３２８Ｉ／３３２Ｄ、３２８Ｆ／３３２Ｄ、３２８Ｙ／３３２Ｄ、３２８Ｍ／３３２Ｄ、３２８Ｄ／３３２Ｄ、３２８Ｅ／３３２Ｄ、３２８Ｎ／３３２Ｄ、３２８Ｑ／３３２Ｄ、３３５Ｄ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ、３３２Ｅ／３３０Ｙ／２６８Ｅ／３２７Ａ、および２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項２】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成する、請求項１記載のＦｃ変異体。
【請求項３】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成し、該ＩｇＧ１抗体がアロタイプ残基３５６Ｄおよび３５８Ｌを有する、請求項２記載のＦｃ変異体。
【請求項４】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成し、該ＩｇＧ１抗体がアロタイプ残基３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する、請求項２記載のＦｃ変異体。
【請求項５】
該Ｆｃポリペプチドが、配列番号１２に定義されるＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧ抗体を構成する、請求項１記載のＦｃ変異体。
【請求項６】
親ＩｇＧ１ポリペプチドのＩｇＧ１変異体であって、該ＩｇＧ１変異体が、少なくとも１個のＦｃγＲとの改善された結合を示し、該Ｆｃ変異体が、該親ＩｇＧ１ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、ＩｇＧ１変異体。
【請求項７】
該挿入が、２３５位および２３６位、２９７位および２９８位、ならびに３２６位および３２７位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される２つの位置の間で起こる、請求項６記載のＩｇＧ１変異体。
【請求項８】
該挿入が、２３５および２３６位の間のＧの挿入、２３５および２３６位の間のＡの挿入、２３５および２３６位の間のＳの挿入、２３５および２３６位の間のＴの挿入、２３５および２３６位の間のＮの挿入、２３５および２３６位の間のＤの挿入、２３５および２３６位の間のＶの挿入、２３５および２３６位の間のＬの挿入、２３５および２３６位の間のＧの挿入、２３５および２３６位の間のＡの挿入、２３５および２３６位の間のＳの挿入、２３５および２３６位の間のＴの挿入、２３５および２３６位の間のＮの挿入、２３５および２３６位の間のＤの挿入、２３５および２３６位の間のＶの挿入、２３５および２３６位の間のＬの挿入、２９７および２９８位の間のＧの挿入、２９７および２９８位の間のＡの挿入、２９７および２９８位の間のＳの挿入、２９７および２９８位の間のＤの挿入、３２６および３２７位の間のＧの挿入、３２６および３２７位の間のＡの挿入、３２６および３２７位の間のＴの挿入、３２６および３２７位の間のＤの挿入、ならびに３２６および３２７位の間のＥの挿入（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、請求項７記載のＩｇＧ１変異体。
【請求項９】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して変化した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該修飾は、２３３Ｉ、２３４Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｙ、２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７１Ａ、２７１Ｄ、２７１Ｉ、２７２Ｈ、２７２Ｉ、２７２Ｒ、２７４Ｅ、２７４Ｒ、２７４Ｙ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｅ、２７８Ｈ、２７８Ｑ、２７８Ｒ、２８１Ｄ、２８２Ｇ、２８４Ｄ、２８４Ｅ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｄ、３００Ｔ、３２０Ｉ、３２０Ｔ、３２０Ｙ、３２２Ｈ、３２２Ｔ、３２２Ｙ、３２４Ｄ、３２４Ｈ、３２４Ｉ、３２４Ｌ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２６Ｌ、３２６Ｔ、３２７Ａ、３２７Ｄ、３２７Ｈ、３２７Ｒ、３２８Ｑ、３３０Ｅ、３３０Ｇ、３３０Ｈ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｖ、３３０Ｙ、３３１Ｄ、３３１Ｌ、３３２Ｅ、３３３Ｆ、３３４Ｔ、３３５Ｄおよび３３５Ｙ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項１０】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して改善した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該修飾は、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７２位、２７６位、２７８位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２２位、３２４位、３２７位、３３０位、３３１位、３３２位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置である、Ｆｃ変異体。
【請求項１１】
該Ｆｃ変異体が、２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７２Ｉ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｒ、２８２Ｇ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｔ、３２４Ｉ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２７Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｓ、３３２Ｅ、３３５Ｄからなる群から選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１０記載のＦｃ変異体。
【請求項１２】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して１種以上のＦｃγＲとの減少した結合、減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、または減少した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該変異体は、２３６Ｒ／２３７Ｋ、２３６Ｒ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３７Ｋ／３２８Ｒ、３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ、２６７Ｒ／２６９Ｒ、２３４Ｇ／２３５Ｇ、２３６Ｒ／２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ／２３７Ｋ、および２３７Ｋ／３２５Ｌ／３２８Ｒからなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項１３】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性、ヒトＦｃγＲＩとの親和性、および補体依存性細胞傷害作用が少なくとも１０倍減少する、Ｆｃ変異体。
【請求項１４】
該Ｆｃポリペプチドが、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ（ここで、番号は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での少なくとも１個の修飾を含む、請求項１３記載のＦｃ変異体。
【請求項１５】
ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、α４−インテグリン、またはＣＤ３２ｂを標的とするＩｇＧ抗体であって、ＷＴ抗体と比較して、減少したＦｃγＲ親和性、減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、または減少した補体依存性細胞傷害作用を有する、ＩｇＧ抗体。
【請求項１６】
該抗体が、親ＩｇＧ抗体と比較して、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での１個のアミノ酸修飾を含む、請求項１５記載のＩｇＧ抗体。
【請求項１７】
該抗体がヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体である、請求項１５記載のＩｇＧ抗体。
【請求項１８】
親ＩｇＧ抗体のＩｇＧ抗体変異体であって、競合するＩｇＧの存在下で改善した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を示す、ＩｇＧ抗体変異体。
【請求項１】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して少なくとも１個のＦｃγＲとの変化した結合または変化した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該変異体は、２２７Ｇ／３３２Ｅ、２３４Ｄ／３３２Ｅ、２３４Ｅ／３３２Ｅ、２３４Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｉ／３３２Ｅ、２３４Ｇ／３３２Ｅ、２３５Ｉ／３３２Ｅ、２３５Ｓ／３３２Ｅ、２３５Ｄ／３３２Ｅ、２３５Ｅ／３３２Ｅ、２４６Ｈ／３３２Ｅ、２５５Ｙ／３３２Ｅ、２５８Ｈ／３３２Ｅ、２６０Ｈ／３３２Ｅ、２６７Ｅ／３３２Ｅ、２６７Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３３０Ｙ、２６８Ｄ／３３０Ｙ、２７２Ｒ／３３２Ｅ、２７２Ｈ／３３２Ｅ、２８３Ｈ／３３２Ｅ、２９３Ｒ／３３２Ｅ、２９５Ｅ／３３２Ｅ、３０４Ｔ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｅ、３２４Ｇ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｄ、３２４Ｇ／３３２Ｄ、３２７Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ｆ／３３２Ｅ、３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２８Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ａ／３３２Ｄ、３２８Ｔ／３３２Ｄ、３２８Ｖ／３３２Ｄ、３２８Ｉ／３３２Ｄ、３２８Ｆ／３３２Ｄ、３２８Ｙ／３３２Ｄ、３２８Ｍ／３３２Ｄ、３２８Ｄ／３３２Ｄ、３２８Ｅ／３３２Ｄ、３２８Ｎ／３３２Ｄ、３２８Ｑ／３３２Ｄ、３３５Ｄ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ、３３２Ｅ／３３０Ｙ／２６８Ｅ／３２７Ａ、および２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項２】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成する、請求項１記載のＦｃ変異体。
【請求項３】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成し、該ＩｇＧ１抗体がアロタイプ残基３５６Ｄおよび３５８Ｌを有する、請求項２記載のＦｃ変異体。
【請求項４】
該ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１抗体を構成し、該ＩｇＧ１抗体がアロタイプ残基３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する、請求項２記載のＦｃ変異体。
【請求項５】
該Ｆｃポリペプチドが、配列番号１２に定義されるＩｇＧ（１／２）ＥＬＬＧＧ抗体を構成する、請求項１記載のＦｃ変異体。
【請求項６】
親ＩｇＧ１ポリペプチドのＩｇＧ１変異体であって、該ＩｇＧ１変異体が、少なくとも１個のＦｃγＲとの改善された結合を示し、該Ｆｃ変異体が、該親ＩｇＧ１ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、ＩｇＧ１変異体。
【請求項７】
該挿入が、２３５位および２３６位、２９７位および２９８位、ならびに３２６位および３２７位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される２つの位置の間で起こる、請求項６記載のＩｇＧ１変異体。
【請求項８】
該挿入が、２３５および２３６位の間のＧの挿入、２３５および２３６位の間のＡの挿入、２３５および２３６位の間のＳの挿入、２３５および２３６位の間のＴの挿入、２３５および２３６位の間のＮの挿入、２３５および２３６位の間のＤの挿入、２３５および２３６位の間のＶの挿入、２３５および２３６位の間のＬの挿入、２３５および２３６位の間のＧの挿入、２３５および２３６位の間のＡの挿入、２３５および２３６位の間のＳの挿入、２３５および２３６位の間のＴの挿入、２３５および２３６位の間のＮの挿入、２３５および２３６位の間のＤの挿入、２３５および２３６位の間のＶの挿入、２３５および２３６位の間のＬの挿入、２９７および２９８位の間のＧの挿入、２９７および２９８位の間のＡの挿入、２９７および２９８位の間のＳの挿入、２９７および２９８位の間のＤの挿入、３２６および３２７位の間のＧの挿入、３２６および３２７位の間のＡの挿入、３２６および３２７位の間のＴの挿入、３２６および３２７位の間のＤの挿入、ならびに３２６および３２７位の間のＥの挿入（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、請求項７記載のＩｇＧ１変異体。
【請求項９】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して変化した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該修飾は、２３３Ｉ、２３４Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｙ、２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７１Ａ、２７１Ｄ、２７１Ｉ、２７２Ｈ、２７２Ｉ、２７２Ｒ、２７４Ｅ、２７４Ｒ、２７４Ｙ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｅ、２７８Ｈ、２７８Ｑ、２７８Ｒ、２８１Ｄ、２８２Ｇ、２８４Ｄ、２８４Ｅ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｄ、３００Ｔ、３２０Ｉ、３２０Ｔ、３２０Ｙ、３２２Ｈ、３２２Ｔ、３２２Ｙ、３２４Ｄ、３２４Ｈ、３２４Ｉ、３２４Ｌ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２６Ｌ、３２６Ｔ、３２７Ａ、３２７Ｄ、３２７Ｈ、３２７Ｒ、３２８Ｑ、３３０Ｅ、３３０Ｇ、３３０Ｈ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｖ、３３０Ｙ、３３１Ｄ、３３１Ｌ、３３２Ｅ、３３３Ｆ、３３４Ｔ、３３５Ｄおよび３３５Ｙ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項１０】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して改善した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該修飾は、２３５位、２３９位、２６７位、２６８位、２７２位、２７６位、２７８位、２８２位、２８４位、２８５位、２９３位、３００位、３２２位、３２４位、３２７位、３３０位、３３１位、３３２位および３３５位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置である、Ｆｃ変異体。
【請求項１１】
該Ｆｃ変異体が、２３９Ｄ、２６７Ｄ、２６７Ｑ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、２６８Ｇ、２７２Ｉ、２７６Ｄ、２７６Ｌ、２７６Ｓ、２７８Ｒ、２８２Ｇ、２８４Ｔ、２８５Ｙ、２９３Ｒ、３００Ｔ、３２４Ｉ、３２４Ｔ、３２４Ｖ、３２７Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｓ、３３２Ｅ、３３５Ｄからなる群から選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１０記載のＦｃ変異体。
【請求項１２】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して１種以上のＦｃγＲとの減少した結合、減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、または減少した補体依存性細胞傷害作用を示し、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、該変異体は、２３６Ｒ／２３７Ｋ、２３６Ｒ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３７Ｋ／３２８Ｒ、３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ、２６７Ｒ／２６９Ｒ、２３４Ｇ／２３５Ｇ、２３６Ｒ／２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ／２３７Ｋ、および２３７Ｋ／３２５Ｌ／３２８Ｒからなる群から選択される、Ｆｃ変異体。
【請求項１３】
親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親Ｆｃポリペプチドと比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性、ヒトＦｃγＲＩとの親和性、および補体依存性細胞傷害作用が少なくとも１０倍減少する、Ｆｃ変異体。
【請求項１４】
該Ｆｃポリペプチドが、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ（ここで、番号は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での少なくとも１個の修飾を含む、請求項１３記載のＦｃ変異体。
【請求項１５】
ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、α４−インテグリン、またはＣＤ３２ｂを標的とするＩｇＧ抗体であって、ＷＴ抗体と比較して、減少したＦｃγＲ親和性、減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、または減少した補体依存性細胞傷害作用を有する、ＩｇＧ抗体。
【請求項１６】
該抗体が、親ＩｇＧ抗体と比較して、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される位置での１個のアミノ酸修飾を含む、請求項１５記載のＩｇＧ抗体。
【請求項１７】
該抗体がヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体である、請求項１５記載のＩｇＧ抗体。
【請求項１８】
親ＩｇＧ抗体のＩｇＧ抗体変異体であって、競合するＩｇＧの存在下で改善した抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を示す、ＩｇＧ抗体変異体。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３ａ】
【図２３ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３ａ】
【図２３ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２００８−５３７９４１（Ｐ２００８−５３７９４１Ａ）
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４３８９（Ｐ２００８−５０４３８９）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１１７５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５３３８
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５０１１５４０３５）ゼンコー・インコーポレイテッド (18)
【氏名又は名称原語表記】ＸＥＮＣＯＲ、 ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１１７５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５３３８
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５０１１５４０３５）ゼンコー・インコーポレイテッド (18)
【氏名又は名称原語表記】ＸＥＮＣＯＲ、 ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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