未熟児合併症の治療及び／又は予防の方法と製品
本発明は、早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む組成物であって、該組み合わせが等モルより低い、好ましくは１：２０〜１：３．３３の範囲にあるＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比を有する組成物、並びに早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者を治療する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早産及び低出生体重の合併症、及び循環ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低血清レベルに関連する合併症の発症のリスクを防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国における毎年推定４.３百万人の生児出生のうち、約８７,０００人（約２.１％）は、３２週未満の在胎期間として定義される極早産（very prematurely）である。ヨーロッパでは、妊娠３２週未満の早産の発生率は、１０,０００人の住民中１.２％であると推定されている。従ってＥＵ２５内の４５０百万人の住民では、妊娠３２週未満の早産の発生率は、１年当り５４,０００児と予想される。切迫早産及びその合併症は、今日の先進社会において主要な周産期の公衆衛生問題である。低出生体重児及び早産児は、子宮内での成長の臨界期の一部又は全部を欠いている。それらは全乳児死亡の半分及び長期罹患率の３／４を占めている。新生児期の及び生存児の生涯にわたる、双方の高額な特別ケアに因り、それらは国民経済へ重い負担を課している。また、多くの生存児は、未熟児に直接起因する身体的障害故にクオリティオブライフを損なっている。
【０００３】
正常妊娠又は妊娠期間の長さは受胎日から４０週（２８０日）と考えられている。在胎３７週未満で出生した新生児は早産とされ、そして合併症のリスクがあり得る。在胎３２週満了未満で出生した新生児は極早産（very preterm）とされ、そして在胎２８週満了未満で出生した新生児は超早産（extremely preterm）とされている。医療技術の進歩は、在胎期間２３週（１７週早産）の若さで出生した新生児を生存可能にしている。早産で出生した新生児は、その低出生体重及びその体組織の未熟に因り死亡又は重篤な合併症の危険性が高い。２,５００ｇのカットオフで定義される低出生体重は、それが出生前リスクファクター、分娩時合併症及び新生児疾患と相関し、そして主として早産で構成されることから、ハイリスク新生児のマーカーとしての機能を果たす。超低出生体重に関する研究によって、超未熟児に関連して高率で重度の呼吸器及び神経系合併症を伴う新生児を、最も危険性が高い新生児と特定するカットオフが、１,５００ｇ未満又は１,０００ｇ未満として定義された。
【０００４】
肺、消化器系、及び神経系(脳を含む)は未熟児では未発育であり、これらが特に合併症を起こし易い。早産児に見られる最も多い医学的問題は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症である。早産児がその自然環境を奪われた場合、子宮内で普通に見られるタンパク質、成長因子及びサイトカインなどの重要な因子を失う。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）はそのような因子の１つであるが、他にもあり得る。
【０００５】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、出生後成長及び代謝のよく知られた調節因子である。これは約７.５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。ＩＧＦ−Ｉは、そのような成長因子による細胞の処理がＩＧＦ−Ｉの産生増加をもたらすことから、様々な他の成長因子の作用に関与している。しかしながら、胎内成長及び発育におけるその役割は極く最近になって認識された。ＩＧＦ−Ｉ-/-マウスで得られた実験データは、ＩＧＦ−Ｉが胚発生の妊娠第３期と幾つかの組織における発育で重要な役割を果たすことを示唆する。マウスでのＩＧＦ−Ｉ-/-データの裏づけとして、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子における遺伝子欠損でホモ接合型の患者は、胎内成長及び中枢神経系発育の障害を呈することが示された。
【０００６】
ＩＧＦ−Ｉはインスリン様活性を有し、そして細胞分裂促進性（細胞分裂を刺激する）であり、及び／又は神経、筋肉、生殖、骨格及び他の組織において細胞栄養性（回復／生存を促進する）である。殆どの成長因子と異なり、ＩＧＦは血中に相当量で存在しているが、血中及び／又は他の体液中では極少量の本ＩＧＦしか遊離していない。大部分の循環ＩＧＦはＩＧＦ結合タンパク質のＩＧＦＢＰ−３に結合している。ＩＧＦ−Ｉは、異常成長関連状態、例えば脳下垂体性巨人症、末端肥大症、小人症、種々の成長ホルモン欠損症等を診断するために血清で測定し得る。ＩＧＦ−Ｉは多くの組織で産生されるが、大部分の循環ＩＧＦ−Ｉは肝臓で合成されると考えられている。ヒト胎児血清では、ＩＧＦ−Ｉレベルは比較的低く、そして在胎期間及び出生体重と正の相関を有する。殆どすべてのＩＧＦは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、及び酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）と称する巨大タンパク質サブユニットから構成される非共有結合性三元複合体で循環する。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳ三元複合体は、各々等モル量の３成分から構成される。ＡＬＳは直接的なＩＧＦ結合活性を有しておらず、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３二元複合体に対してだけ結合するように見える。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳ三元複合体は、約１５０ｋＤａの分子量を有する。この三元複合体は、「ＩＧＦ−Ｉが遊離ＩＧＦの急速な濃度変化を防止するためのリザーバ及びバッファーとして」循環中で機能していると考えられている。過剰の遊離ＩＧＦ−ＩはＩＧＦＢＰの生物活性をダウンレギュレートし得ることが示されていおり；従って、ＩＧＦＢＰの活性低下もまた、高用量ＩＧＦ−Ｉの効果の欠如の一因となり得る。健常な小児及び成人での初期の研究では、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ複合体の半減期は血漿中でおおよそ１２〜１５時間であることが見出されている。ＩＧＦＢＰ−３は循環中で最も豊富なＩＧＦ結合タンパク質であるが、少なくとも５種の異なるＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）が種々の組織及び体液で同定されている。これらのタンパク質はＩＧＦと結合するが、それらは各々別個の遺伝子を起源とし、特有のアミノ酸配列を有する。このように、それらの結合タンパク質は、共通の前駆体の単なる類似体でもなければ誘導体でもない。ＩＧＦＢＰ−３と異なり、循環中の他のＩＧＦＢＰはＩＧＦで飽和されていない。その上、ＩＧＦＢＰ−３以外のＩＧＦＢＰは、いずれも１５０ｋＤａの三元複合体を形成し得ない。血漿中のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比は、非タンパク質結合のＩＧＦ−Ｉのアベイラビリティの推定値として使用されており、その比の増加は遊離生物活性ＩＧＦ−Ｉのアベイラビリティ増加を示唆する。生後１か月時点のより高いＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比は、満期産児に比べて中等度早産児のより高い成長速度と関連している。しかしながら、極早産及び超早産で生まれた乳児における生後１か月間のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３測定からの結論は、病的状態（即ち、ＲＯＰ）と健康な乳児間のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比に差を示さなかった。
【０００７】
ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は天然源から精製するか又は組み換え手段により生産することができる。例えば、ヒト血清からのＩＧＦ−Ｉの精製は当該技術分野でよく知られている。組み換え方法によるＩＧＦ−Ｉの産生は、１９８４年１２月に公開された特許文献１に示されている。ＩＧＦＢＰ−３は、Baxterら（非特許文献１）に示されるような方法を用いて天然源から精製することができる。或いは、ＩＧＦＢＰ−３は、非特許文献２に論じられているように組み換え法により合成し得る。組み換えＩＧＦＢＰ−３は、１：１のモル比でＩＧＦ−Ｉと結合する。
【０００８】
胎児期間に、これらの要素は胎盤吸収又は羊水（ＡＦ）からの摂取を通して導入される。これらの因子の欠乏は重要な経路の阻害又は不適切刺激を引き起こす可能性があり、目の場合には、これは未熟児網膜症（ＲＯＰ）の特徴である網膜血管生長異常を引き起こす可能性がある。
【０００９】
どのような因子が早産で失われるかを理解すること、及びそれらのＲＯＰ発症に及ぼす影響を評価することも、他の臓器系（脳、肺、腸、及び骨）の成長と発達にとって非常に大きな意義を有すると考えられる。消失因子の補充は、全体の発達を改善させるように見える。従って、この分野の研究は、未熟児の正常発達に及び／又は早産の多くの合併症の予防に非常に重要なものである。
【００１０】
ＲＯＰは、後期ＲＯＰの最新の治療にもかかわらず、先進の及び発展途上の世界の小児の失明の主因となっている。発展途上国は新生児及び母体の集中治療をより多く提供するにつれて、ＲＯＰの発生率は増加している。網膜のレーザー光凝固術又は凍結療法などのアブレーション治療は、後期疾患において失明の発生率を２５％低減するが、治療後の視力予後はしばしば不良である。ＲＯＰの予防的療法が明らかに好ましい。
【００１１】
網膜血管の発達は妊娠４か月の間に始まり、そして出産まで完結しない。従って、早産で出生した新生児は末梢の無血管帯を有する不完全な血管化網膜を有し、その領域は在胎期間に依存する。乳児の成熟とともに、結果として生じる非血管化網膜は、ますます代謝が活性に、そして低酸素状態になる。ＲＯＰの低酸素誘発網膜血管新生（ＮＶ）期は、糖尿病性網膜症などの他の増殖性網膜症に類似している。
【００１２】
１９５０年代初期の増殖性糖尿病性網膜症患者の研究では、下垂体アブレーションは網膜症の完全寛解をもたらし、成長ホルモン（ＧＨ）又はＧＨ軸における特定の因子が網膜症の発生に重要な役割を担うことを示した。ＧＨはマウスモデルの網膜症に重要なことが示された。加えて、ＲＯＰマウスモデルの実験研究では、ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニストが網膜血管新生を抑制することが見出されるということを実証した。ＩＧＦ−Ｉは、少なくとも部分的にｐ４４／４２ＭＡＰＫ(キナーゼインヒビター)の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）活性化の制御を介して網膜ＮＶを調節し、ＩＧＦ−ＩとＶＥＧＦ受容体間の階層的関係を確立している。これらの研究は、血管形成におけるＩＧＦ−Ｉの重要な役割を証明する。ＩＧＦ−Ｉは、新しい血管増殖の最大ＶＥＧＦ刺激を可能にするように寛容的に作用する。低レベルのＩＧＦ−ＩはＶＥＧＦの存在にもかかわらず血管増殖を阻害する。従って、ＲＯＰの発症に重要な非低酸素調節因子の１つになる可能性がある（非特許文献３）。
【００１３】
ＶＥＧＦの役割と同様に、ＩＧＦ−Ｉは網膜血管の正常な発達に重要なことが示されている（非特許文献４）。ＩＧＦ−Ｉレベルは、一部胎盤及び羊水によりもたらされたＩＧＦ−Ｉの減少に因り、出生後子宮内レベル以下に下がる。ＩＧＦ−Ｉは正常な網膜血管発生に重要なこと、そして新生児初期のＩＧＦ−Ｉの欠損は、血管増殖の欠如及びそれに続く増殖性ＲＯＰに関連すると仮定されている。ＩＧＦ−Ｉノックアウトマウス（ＩＧＦ−Ｉ−／−）では、ＩＧＦ−Ｉが正常な血管増殖に重要であるかを明らかにするために、正常な網膜血管発生が調べられた。網膜血管は、正常マウスよりもＩＧＦ−Ｉ−／−マウスで成長が遅く、そのパターンはＲＯＰの未熟児で見られるものに類似していた。これらの所見はＲＯＰ患者で確認された（非特許文献４、５）。
【００１４】
早産及び低出生体重の合併症発症のリスクを測定すること、及び当該合併症の治療法に一般的に関係した前の特許出願（特許文献２）では、これらの合併症は低レベルのＩＧＦ−Ｉに関連している。その治療的アプローチにより、患者へのＩＧＦ−Ｉの投与による未熟児合併症の治療で患者のＩＧＦ−Ｉの血清レベルが子宮内ベースラインレベルまで上昇することが示唆された。該発明の治療方法の１つによれば、ＩＧＦ−Ｉを、ＩＧＦ−Ｉを結合する能力がある追加タンパク質と組み合わせたＩＧＦ−Ｉを含む組成物で投与することができ、そしてこのような結合タンパク質がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）であることが提案されている。更に、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３を含む組成物が使用し得ることが示唆されている。
【００１５】
特許文献３では、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の皮下ボーラス注射による共投与（co-administration）が、一般的に約０.５：１〜３：１のＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−Ｉのモル比（又はモル比を本発明において特許請求したモル比と比べる場合、本出願全体のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３で表すと、特許文献３に記載された対応モル比は１：０.５〜１：３になる）になると示唆されている。この発明者らは治療に使用しようとする混合物が、個々の患者の臨床状態（認識された若しくは予想されたいずれの側面、又はＩＧＦ−Ｉを単独で使用する際の同化作用低下、特定の成長欠陥又は補正すべき異化状態、使用される特定のＩＧＦＢＰ、混合物のデリバリー部位、及び医師に公知の他の要因を含む）を考慮しながら、適正診療規範（good medical practice）に合致する方法で処方し投与すべきことを述べている。様々なモル比のＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の組成物の更なる製造方法は先行技術から公知である。しかしながら、特定比の範囲で２つの成分を組み合わせて投与することの有益な効果は、この文献には記載されていない。特に、発明者らの知る限りでは、どのようなＩＧＦ−Ｉによる方法が、残された人生の間ハンディキャップをもたらす明らかなリスクとなる未熟児の治療の最も効率的な方法を提供することが期待されるかについて、先行技術にはいかなる教示も又は示唆も存在しない。
【００１６】
未熟児合併症についての理解がますます増進しつつあるにもかかわらず、早産死が今なお標準的な状態であるように、現在のところ利用可能で有効な治療法、又はこれらの致死的状態を発症するリスクを測定する方法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第０１２８７３３号
【特許文献２】米国特許出願第２００４／００５３８３８号
【特許文献３】米国特許第５１８７１５１号(Genentech)
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Baxter et al.1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 139:1256-1261
【非特許文献２】Sommer et al., pp. 715-728, インスリン様成長因子の近代的概念（MODERN CONCEPTS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS）(E. M. Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991)
【非特許文献３】L.E. Smith, W. Shen, C. Perruzzi et al., インスリン様成長因子−１受容体による血管内皮増殖因子依存性網膜新生血管の調節（Regulation of vascular endothelial growth factor-dependent retinal neovascularization by insulin-like growth factor- 1 receptor）, Nat Med 5 (1999), pp. 1390-1395
【非特許文献４】Hellstrom, C, Perruzzi, M. Ju et al., 低ＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞のＶＥＧＦ生存シグナル伝達を抑制する：未熟児の臨床的網膜症との直接相関（Low IGF-I suppresses VEGF-survival signaling in retinal endothelial cells: direct correlation with clinical retinopathy of prematurity）, Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (2001), pp. 5804-5808
【非特許文献５】Hellstroem A, Engstrom E, Hard A-L, et al., 出生後血清ＩＧＦ−Ｉ欠乏は未熟児網膜症及び他の早産小児科合併症に関与している（Postnatal serum IGF-I deficiency is associated with retinopathy of prematurity and other complications of premature birth pediatrics）, Pediatrics 2003; 112: 1016-1020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む、新しい組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
特に、本発明は、早産、極早産（very preterm-birth）及び／又は超早産（extremely preterm birth）の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む組成物であって、該組み合わせが、等モルより低い、好ましくは１：２０〜１：３．３３の範囲のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比を有する組成物に関する。
【００２１】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲である。
【００２２】
その好ましい実施態様において、組成物は、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される。
【００２３】
その好ましい実施態様において、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である。
【００２４】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。
【００２５】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である。
【００２６】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである。
【００２７】
その好ましい実施態様において、早産（preterm birth）の合併症は未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。
【００２８】
その好ましい実施態様において、早産、超早産及び／又は極超早産の前記合併症は、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される。
【００２９】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入治療を含む。
【００３０】
その好ましい実施態様において、使用は、皮下、静脈内又は経口治療を含む。
【００３１】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内治療を含む。
【００３２】
その好ましい実施態様において、治療は生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される。
【００３３】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ類似体はｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体はｒｈＩＧＦＢＰ−３である。
【００３４】
本発明の更なる側面は、有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者に投与することを含む、早産合併症の発症から患者を予防する方法であって、ここで患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルに患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを上げるために、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は等モルより低く、好ましくは１：２０〜１：３.３３の範囲である、方法に関する。
【００３５】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は、１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲である。
【００３６】
その好ましい実施態様において、組成物は、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、ＩＧＦＢＰのその含量に関して連続的に調整される。
【００３７】
その好ましい実施態様において、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である。
【００３８】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。
【００３９】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である。
【００４０】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである。
【００４１】
その好ましい実施態様において、早産（preterm birth）の合併症は未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。
【００４２】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の前記合併症は、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される。
【００４３】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入治療を含む。
【００４４】
その好ましい実施態様において、使用は、皮下、静脈内又は経口治療を含む。
【００４５】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内治療を含む。
【００４６】
その好ましい実施態様において、治療は生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される。
【００４７】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ類似体はｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体はｒｈＩＧＦＢＰ−３である。
【００４８】
定義
「早期産」又は「早産」又は「未熟児」は、妊娠４０週より前での、又は患者の在胎期間の平均より１０％小さい体重での、患者の出生を示す。
【００４９】
「極早産（very preterm birth）」は在胎３２満了週未満で出生した乳児を示す。
【００５０】
「超早産（extremely preterm birth）」は在胎２８満了週未満で出生した乳児を示す。
【００５１】
「ＩＧＦ−Ｉ」は、天然配列又は変異体の、ウシ、ヒツジ、ブタ及びヒトを含み、天然に存在する対立遺伝子多型を含むがこれに限定されない、任意の種由来のインスリン様成長因子Ｉをいう。ＩＧＦ−Ｉは、適切な部位でＩＧＦＢＰ−３と結合することを条件として、天然、合成又は組み換えを問わず任意の起源に由来していてもよい。本発明ではヒトＩＧＦ−Ｉが好適である。ＩＧＦ−Ｉは、例えばＰＣＴ刊行物国際公開第９５／０４０７６号に記載のように、組み換えにより生産し得る。
【００５２】
「ＩＧＦＢＰ」又は「ＩＧＦ結合タンパク質」は、インスリン様成長因子結合タンパク質ファミリー由来であって、そして循環性（即ち、血清又は組織中で）か否かにかかわらずＩＧＦ−Ｉと正常に会合又は結合又は錯体形成する、タンパク質又はポリペプチドをいう。そのような結合タンパク質は受容体を含まない。この定義には、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ−２５（ＩＧＦＢＰ−７）、及びプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ−１）、並びにＩＧＦＢＰと高い相同性を有する他のタンパク質が含まれる。
【００５３】
「ＩＧＦＢＰ−３」はインスリン様成長因子結合タンパク質３をいう。ＩＧＦＢＰ−３は、インスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ＩＧＦＢＰ−３は、天然配列又は変異体のウシ、ヒツジ、ブタ及びヒトを含み、天然に存在する対立遺伝子多型を含むがこれに限定されない、任意の種に由来してもよい。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉと二元複合体、及びＩＧＦ及び酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）と三元複合体を形成し得る。ＩＧＦＢＰ−３は、適切な部位でＩＧＦ−Ｉ及びＡＬＳと結合することを条件として、天然、合成又は組み換えを問わず任意の起源に由来していてもよい。ＩＧＦＢＰ−３は、ＰＣＴ刊行物国際公開第９５／０４０７６号に記載のように、組み換えにより生産し得る。
【００５４】
「ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比」は、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３の比をいい、絶対値のＩＧＦＢＰ−３で除したＩＧＦ−Ｉと定義され、そしてパーセント又はＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比で表わされる。ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３間のモル比較では、以下の分子質量が計算に使用された：ＩＧＦ−Ｉ、７．５ｋＤａ（即ち、７,６４９Ｄａ）；及びＩＧＦＢＰ−３、２８.７ｋＤａ（即ち、２８,７３２Ｄａ）。ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比は、以下の換算当量（equivalents for conversion）を用いて生物活性ＩＧＦ−Ｉの指標として計算される：１ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ＝０.１３０ｎｍｏｌ／ＬのＩＧＦ−Ｉ；１ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−３＝０.０３６ｎｍｏｌ／ＬのＩＧＦＢＰ−３。
【００５５】
本明細書で使用される「治療用組成物」は、ＩＧＦ−Ｉ、その類似体、又はその結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ−３と組み合わせたＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体）を含むものと定義される。治療用組成物は、また、水、ミネラルなどの他の物質、タンパク質などの担体、及び当業者によく知られた他の賦形剤を含んでもよい。
【００５６】
ＩＧＦ−Ｉの「類似体」は、ヒト又は動物のＩＧＦ−Ｉと同じ治療効果を有する化合物である。これらはＩＧＦ−Ｉ(例えば、切断ＩＧＦ−Ｉ)の天然起源の類似体又はＩＧＦ−Ｉの知られた合成類似体のいずれであってもよい。例えば、米国特許第６２５１８６５号及び第５４７３０５４号を参照されたい。
【００５７】
以下において、添付した図面に示した例証的実施態様を参照して、本発明を限定されない形式でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】５及び６０μｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅ（１及び１３μｇ／ｋｇ／ｒｈＩＧＦ−Ｉに等価）で３時間にわたり投与した、等モルの組み合わせのｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の静脈内注射後の、５名の小児の薬物動態血清比を示す。
【図２】ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現が、酸素誘導網膜血管消失に対する保護に用量依存的に関連することを示す。
【図３】ＩＧＦＢＰ−３の消失が酸素誘導消失後の網膜血管再生長を減少させることを示す。
【図４】内因性ＩＧＦＢＰ−３が基準を超えて血管再生長を更に増加させることを示す。
【図５】網膜新生血管形成がＩＧＦＢＰ−３の増加とともに減少することを示す。
【図６】全網膜におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡが低酸素とともに増加することを示す。
【図７】ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡが網膜血管に関連し、そして低酸素とともに増加することを示す。
【図８】ＩＧＦＢＰ−３ヌルマウスの網膜における血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）数の減少を示す。
【図９】ＩＧＦＢＰ−３の高い血清レベルが小児のＲＯＰの減少に関連することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号では、ＩＧＦ−Ｉが血管生長に必要であり、そして早産後の網膜血管生長の停止で始まるＲＯＰの疾患過程を合理的に説明することが実証されている。子宮内と出生後の血管生長間の主な違いは、ＩＧＦ−Ｉの濃度が出生後の未熟児では減少することである。米国特許出願第２００４／００５３８３８号での記載、ＩＧＦ−Ｉのレベルが分娩後の未熟児で急速に増加する場合に正常な血管発生が可能となり、ＲＯＰが起こらないことが示唆される。
【００６０】
ＶＥＧＦは血管の発生において重要な役割を果たすが、低ＩＧＦ−Ｉレベルの存在下で血管生長を可能にするには不十分であることが示されている。代謝要求が発生とともに増加し、そしてＶＥＧＦレベルが硝子体で上昇するにつれて、ＶＥＧＦが益々低酸素性の無血管網膜で産生される。ＩＧＦ−Ｉが非ＲＯＰ乳児で生じるように出生後より急速に上昇する場合、成熟網膜に酸素を供給しそしてＶＥＧＦ産生を調節する血管生長が起こり得ることから、ＶＥＧＦは蓄積しない。ＩＧＦ−Ｉの濃度が長期間低い場合、血管は生長を停止し、成熟無血管網膜は低酸素状態となり、そしてＶＥＧＦは硝子体に蓄積する。高レベルのＶＥＧＦが存在する場合、ＩＧＦ−Ｉの濃度が閾値に上昇すると、新血管の急速生長（網膜新生血管）が引き起こされる。ＩＧＦ−ＩとＶＥＧＦとはＭＡＰＫ及びＡＫＴシグナル伝達経路を通して血管内皮細胞機能にとって補完的であることから、この急速血管生長は、血管内皮細胞の生存と増殖増加に基づくように思われる。特に、データは、ＩＧＦ−Ｉ（及び恐らく他のサイトカイン）がＶＥＧＦの最大機能を促進するために最小レベルで必要なことを示す。
【００６１】
米国特許出願第２００４／００５３８３８号の記載によれば、ＩＧＦ−Ｉレベルが、どんな新生児がＲＯＰを発症するかを予測するのに使用できることが示されている。ＲＯＰを発症する及び発症しない乳児間でのＩＧＦ−Ｉレベルのパターンの差から、出生後早期のＩＧＦ−Ｉの血清中濃度増加がこの疾患を防止する可能性が示唆される。ＲＯＰ及び他の病的状態の相対リスクは、月経後週齢３３週でＩＧＦ−Ｉが≦３０μｇ／Ｌの場合に５.７倍（９５％信頼区間２.２〜１４.６）増加した。月経後週齢の調整後、月経後週齢３１〜３５週時点での５μｇ／Ｌの平均ＩＧＦ−Ｉの各増加は、ＲＯＰのリスクを５９％減少させた。妊娠の３１〜３５週においてＩＧＦ−Ｉの中央値レベルは、生後病的状態のない群（ｎ＝２９）での３８μｇ／Ｌ（２０〜５９の範囲）に比べて、ＲＯＰ及び他の病的状態の乳児（ｎ＝１９）では２６μｇ／Ｌ（１７〜４９の範囲）であった（ｐ＜０.０００１）。早産後、高レベルのＩＧＦ−Ｉを含む羊水の摂取を含み、ＩＧＦ−Ｉの潜在的供給源は失われる。ＩＧＦ−Ｉの濃度は、カロリー摂取増加、羊水の取込みを模倣するＩＧＦ−Ｉの経口摂取、又はより正常なレベルにＩＧＦ−Ｉを上昇させる静脈内供給を通して、ＲＯＰなしの乳児に認められるレベルに増加させることができる。ＲＯＰは他の発達障害と相関することから、ＲＯＰなしの乳児のレベルまでＩＧＦ−Ｉレベルを増加させることは、神経発達をも改善する可能性がある。
【００６２】
ＩＧＦ−Ｉ及びＶＥＧＦの両者は、ＲＯＰの第２の又は血管新生期における重要な因子でもある。ＩＧＦ−Ｉの濃度を増加させる早期介入は正常な血管生長を可能にし、ＲＯＰの第２の潜在的破壊期の発生を防止すること、そしてＶＥＧＦの蓄積後の遅れた介入は網膜血管新生を誘起するか又は憎悪させる可能性があることが示唆される。米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号の記載の治療法の１つによれば、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉを結合することができる追加タンパク質と組み合わせたＩＧＦ−Ｉを含む組成物として投与することができ、そしてそのような結合タンパク質がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）であることが提案されている。更に、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３を含む組成物が使用し得ることが示唆されている。
【００６３】
極低出生体重（ＶＬＢＷ）児に対して組み換え（ｒｈ）ＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の静脈内注入投与後のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３薬物動態プロファイルを明らかにし、そして安全性と忍容性を評価する初期研究において、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の組成物（米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号で示唆されるような）を使用した。これは非盲検比較臨床試験で、２００７年にGothenburgのQueen Silvia小児科病院の新生児病棟で行なった。２７週(２６週＋０日から２９週＋１日)の平均在胎期間(範囲)、及び１,０２２グラムの出生体重（８１０から１,３１０グラム）の５人の患者(３人は女性)がこの研究に参加した。３日目(暦年齢)の乳児に対して、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の等モルの組み合わせ（複合体として等量のｒｈＩＧＦ−Ｉ及びｒｈＩＧＦＢＰ−３）を、５及び６０μｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅ（１及び１３μｇ／ｋｇ／ｒｈＩＧＦ−Ｉと等価）で３時間かけて静脈内注入として投与した。結果を図１に示したが、この図は小児の血清ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比に及ぼす投与ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３複合体の影響を示す。注入開始時点のベースラインのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルは、それぞれ１８.８±６.１及び８１１.８±１５２.４μｇ／Ｌであった（これは約１：１２のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比に相当する、２.３％の百分率比である）。治験薬注入停止の直後、血清ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルは、それぞれ３９.６±１２.２及び８５６.６±１９７.６μｇ／Ｌであった（これは約１：６のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比に相当する４.６％の百分率比である）。ＩＧＦ−Ｉの平均濃度を、≦３０μｇ／Ｌ（本研究では平均１８.８μｇ／Ｌ）の失明の危険があるＲＯＰ低レベルから、米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号によりＲＯＰの危険がない状態を示す≧３５μｇ／Ｌ（３９.６μｇ／Ｌ）に増加したことも着目される。急性有害事象の報告はなく、すべての血糖測定値及び広範な安全性の基準はすべて正常であった。結論として：これらのデータは、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３複合体が、極早産児に対して血清ＩＧＦ−Ｉレベルを低レベルから正常範囲へと増加させるのに有効であること、及びｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の投与が安全で良好な忍容性であることを示した。
【００６４】
しかしながら、ＩＧＦ−Ｉの血清中濃度が輸血後倍以上に増え、それにより類似の在胎期間の胎児でいわれている生理的レベルに達したが、ＩＧＦＢＰ−３の血清中濃度において同様の増加を達成し得なかったことは、図１の血清比のグラフから明らかである。血清中のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比は、注入後１：１２から１：６に増加した。本研究からのもう１つの重要な所見は、約１時間である早産児の半減期が、小児及び成人で示される半減期と有意に異なることであった。従って、本研究からの主要な結論の１つとして、ｒＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体は、持続注入で投与する必要があるといえる。更に、ＩＧＦＢＰ−３と比べてＩＧＦ−Ｉの血清中濃度は相対的に高い増加を示し、血清中のＩＧＦ−Ｉ／ＧＦＢＰ−３の高い比率をもたらしたことから、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３の等モル組成物の投与は、早産児では最適ではない可能性があると結論し得る。
【００６５】
ＩＧＦ−Ｉレベル及びその結果としてＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比の増加に及ぼすこの影響は、ＩＧＦＢＰ−３のレベル増加もＲＯＰのリスク低減に関係することが発見された早産児の臨床研究（下記に述べる）で見られるような懸念をもたらす。そこでインビボ血管形成におけるＩＧＦＢＰ−３の役割をより明確にするために、酸素誘発血管消失及びそれに続く低酸素駆動血管新生のマウスモデルにおける、網膜血管生存及び血管再生長に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を調べた。
【００６６】
本モデルでは、ＩＧＦＢＰ−３の外因性デリバリー及び種々のレベルのＩＧＦＢＰ−３発現を有するＩｇｆｂｐ３-/-、Ｉｇｆｂｐ３+/-及びＩｇｆｂｐ３+/+トランスジェニックマウスを用いて、インビボの網膜症に対するＩＧＦＢＰ−３レベルの調節作用を調べた。ＩＧＦＢＰ−３の増加レベルが、酸素過剰誘発血管消失における血管生存増加、及び酸素誘発網膜症の低酸素期での血管再生長と修復の増加に関連し、結果的にＲＯＰのマウスモデルにおけるＩＧＦＢＰ−３レベルの増加に伴って網膜症の減少をもたらすことが発見された。
【００６７】
以下の実施例で、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例証し更に本発明を特徴付けするために提出するが、本発明を限定するものではない。本発明の方法を行なうために以下の材料及び方法を使用した。
【００６８】
動物
これらの研究は、眼及び視力研究における動物使用についてＡＲＶＯ声明に従ったものである（www.arvo.org/AboutARVO/animalst.asp）。ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−３-/-、ＩＧＦＢＰ−３+/-、ＩＧＦＢＰ−３+/+マウスは、Ning, Y., Schuller, A. G., Bradshaw, S., Rotwein, P., Ludwig, T., Frystyk, J. & Pintar, J. E. (2006) MoI Endocrinol 20, 2173-86に記載のとおりであり、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより尾試料におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの発現によって特徴付けられ、そしてサザンブロット法により確認された。
【００６９】
遺伝子発現の定量分析（定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＩＧＦＢＰ−３を標的とするＰＣＲプライマー、及び不変制御遺伝子（シクロフィリン）、ＲＮＡをPrimer Expressソフトウェア（Applied BioSystems, Foster City, Calif.）を用いてデザインした。遺伝子検出の特異性についてプライマー及びプローブ配列を解析するために３つの方法を使用した。第１に、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔモジュールによって測定して、選択配列を特異的に検出するプライマー及びプローブ配列のみが使用された。第２に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、Applied BioSystems製の一次導関数（first derivative）プライマー融解曲線ソフトウェアを用いて解析した。この解析は、アンプリコンの特異的融点温度に基づいてアンプリコンの存在を測定する。第３に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、ゲル精製して配列決定し（小児病院コア配列決定施設（Children's Hospital Core Sequencing Facility）、Boston, Mass）、所望の配列の選択を確認した。遺伝子発現の定量分析は、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（TaqMan）及びＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（Qiagen）を用いて行なった。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、７５％酸素への曝露の有りと無しの条件下で、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲにより、Ｐ８、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２６及びＰ３３で解析した。
【００７０】
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション
ＯＣＴに包埋した眼を低温保持装置中８μｍで切片化してアンコーティングスライドグラスに載せ、そして直ちに−８０℃で保存した。凍結切片を含むスライドを直ちに７０％エタノール中で３０秒間固定して、ヘマトキシリン（Meyers）及びエオジンで染色し、そして続いて各々７０％、９５％、及び１００％エタノール中、そして最終的にキシレン中１０分の脱水工程から成る４脱水工程を行なった。一旦風乾して、切片をPixCell II LCMシステム（Arcturus Engineering, Mountain View, Calif.）により、血管及び網膜神経層のマイクロダイセクションにかけた。各母集団は、補足細胞の顕微鏡的視覚化によって測定して＞９５％の均質性と推定された。４匹を超えるマウスからの各細胞層由来の材料を合わせてＲＮＡを分離し、記載のｃＤＮＡに変換させた。特異的ｃＤＮＡを定量的リアルタイム（ｑＲＴ）ＰＣＲを用いて定量化した。
【００７１】
〔実施例１〕
血清中ＩＧＦ−ＩレベルはＩＧＦＢＰ−３ヌルマウスの野生型と変わらない
以下の研究は、眼及び視力研究における動物使用のＡＲＶＯ声明に従ったものである（www.arvo.org/AboutARVO/animalst.asp）。ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−３-/-、ＩＧＦＢＰ−３+/-、ＩＧＦＢＰ−３+/+マウスは、Ning, Y., Schuller, A. G., Bradshaw, S., Rotwein, P., Ludwig, T., Frystyk, J. & Pintar, J. E. (2006) MoI Endocrinol 20, 2173-86に記載のとおりであり、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより尾試料におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの発現によって特徴付けられ、そしてサザンブロット法により確認された（データは示していない）。
【００７２】
血清中のＩＧＦ−Ｉレベルは、ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８）、ＩＧＦＢＰ−３-/+（ｎ＝１１）及びＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝１０）同胞（sibling）マウスで、ＩＧＦ−Ｉの定量のために大過剰のＩＧＦ−ＩＩによるＩＧＦＢＰ−ブロックＲＩＡを用いて測定した（Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany）。ＩＧＦ−ＩアッセイのイントラアッセイＣＶは、３６、２０４、及び５４５μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ１１.１、７.２、及び７.４％であり、そしてインターアッセイＣＶは１３.５、８.８、及び９.９％であった。このアッセイは標準曲線においてラットＩＧＦ−Ｉを用いてマウスの異種アッセイとして使用できる。
【００７３】
ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８）、ＩＧＦＢＰ−３+/-（ｎ＝１１）及びＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝１０）同胞マウスにおいて、出生後５日目（Ｐ５）に測定した平均血清中ＩＧＦ−Ｉレベルは、それぞれ８９±１９、８８±８及び９５±２５μｇ／Ｌで、対照に比べてトランスジェニックマウスにおいてＩＧＦ−Ｉに有意差はなかったことを示した。また発達段階でのＩＧＦＢＰ−３-/-マウス及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス間で重量の差もなかった。
【００７４】
〔実施例２〕
ＩＧＦＢＰ−３は酸素誘発網膜血管消失に対して保護する（Ｐ８）
血管消失を誘発させるために、出生後７日目（Ｐ７）マウスを乳母とともに１８ｈから５日の範囲の期間７５％酸素に曝露した。Ｏ2曝露後、マウスをアベルチン（Avertin）（Sigma）で麻酔し、そして生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌの２×１０6分子量ＦＩＴＣ−デキストランの心内潅流により犠牲にした。眼球を摘出し、そして４℃にて２時間４％パラホルムアルデヒドで固定した。網膜を分離し、そして光受容体側を上にしてポリリシンコートスライド上にグリセリン−ゼラチン(シグマ)で全載した。網膜を蛍光顕微鏡（オリンパス、東京）で調べ、３電荷結合素子カラービデオカメラ（ＤＸ−９５０Ｐ、ソニー）を用いて画像をデジタル化し、そしてNORTHERN ECLIPSEソフトウェア（Empix Imaging、Tronto）により処理した。
【００７５】
酸素中の血管生存に対する低いＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３+/+又はＩＧＦＢＰ−３+/-マウス（ｎ＝２２眼）の全載網膜における血管消失度を、Ｐ８で酸素誘導の１７時間後に調べた（ｎ＝１１マウス；各々のデータポイントは、１匹のマウスの右目と左目の平均である）。血管消失度を、ヘテロ接合体及び野生型マウスの尾断片のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現と比較した。図２から、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現のレベル増加に伴い血管生存の有意な増加があったので、Ｉｇｆｂｐ３ｍＲＮＡ発現は、Ｉｇｆｂｐ３+/-マウスにおいてＰ８で７５％酸素の１８時間後に、用量依存的に酸素誘発網膜血管消失に対する保護作用と関連することが、認められた(図２)（Ｐ≦０.００６、ｒ＝−０.７０）。
【００７６】
〔実施例３〕
低いＩＧＦＢＰ−３はＰ１７で持続的血管閉鎖に関連する
Ｐ７とＰ１２の間で、ヘテロ接合体ＩＧＦＢＰ−３の仔を孕んだ母マウスを７５％酸素に曝露し、次いでＰ１２〜Ｐ１７から大気中に移し、その後犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝５２眼）及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝３８眼）から網膜を摘出して全載し、更に血管閉鎖領域を評価した。
【００７７】
血管消失の持続に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝５２眼）及び同胞のＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝３８眼）マウスの全載網膜においてＰ１７で持続した血管閉鎖領域を、血管消失の酸素誘導（Ｐ１２〜Ｐ１７）後、及び大気Ｐ１２〜Ｐ１７での血管再生長後に調べた。図３において、酸素誘発血管消失後のＩＧＦＢＰ−３の保護作用は、ＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝５２眼）(右)に比べてＷＴ（ｎ＝３８眼）（中央）においてＰ１７で示されるように持続することが認められる。ＩＧＦＢＰ−３-/-マウスにおける血管閉鎖の分画網膜領域は、１５.１＋／−０.５％の面積の野生型マウスに比べて２０.２＋／−０.１％（ＳＥＭ）であった（Ｐ≦０.００５）（図３Ａ）。典型的な網膜全載は、野生型ではＩＧＦＢＰ−３+/+マウスよりも少ない血管消失を示す（図３Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３+/+に比べてＩＧＦＢＰ−３-/-マウスでは網膜血管消失領域の３１％増加があったことから、低ＩＧＦＢＰ−３による血管消失の持続性及び／又は血管再生長の欠如が示された。
【００７８】
〔実施例４〕
外因性ＩＧＦＢＰ−３は血管再生長を増加させる
Ｐ７とＰ１２の間に、Ｃ５７ＢＩ／６マウスを７５％酸素に曝露した。Ｐ１２で酸素を除去後、マウスに６０μｇのＩＧＦＢＰ−３（ｎ＝１６眼）又はビヒクル（ｎ＝１４眼）を１日３回腹腔内注射（Ｐ１２〜Ｐ１４）した。マウスをＰ１５で犠牲にし、網膜を摘出して全載し、そして血管閉鎖領域の血管再生長に対するＩＧＦＢＰ−３の効果を評価した。
【００７９】
酸素誘発血管閉鎖後の血管再生長に対する血清ＩＧＦＢＰ−３のレベル上昇の効果を評価するために、酸素で誘発した血管消失後Ｐ１２〜Ｐ１４から、ＩＧＦＢＰ−３の１日３回注射したＣ５７ＢＩ／６マウスにおいて、Ｐ１５での全載網膜における血管面積を調べた。図４の中央と右では、酸素誘発血管消失後に生理食塩水で処置したＣ５７ＢＩ／６マウスの全載網膜(中央)が、Ｐ１２〜Ｐ１４から腹腔内注射によりＩＧＦＢＰ−３で処置した同腹子(右)よりも主に血管再生長を減少させていることを示した。Ｐ１５では、ビヒクル対照処置マウス（ｎ＝７）に比べて、ＩＧＦＢＰ−３で処置したＣ５７ＢＩ／６マウス（ｎ＝８マウス）において血管消失面積で４０％の減少があったことから、ＩＧＦＢＰ−３の増加によって血管再生長を増加させることを示した（Ｐ≦０.００１）（図４左）。
【００８０】
〔実施例５〕
ＩＧＦＢＰ−３の発現の増加はマウスにおける網膜血管新生の減少に関連する
Ｐ７とＰ１２間で、ヘテロ接合体ＩＧＦＢＰ−３の仔を孕んだ母マウスを７５％酸素に曝露し、次いでＰ１２〜Ｐ１７から大気中に移し、その後犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/+及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝９マウス、１８眼）から網膜を摘出し、全載して、そして血管閉鎖の面積を評価して、２網膜の平均として記録した。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルを記載のように尾断片から測定した。
【００８１】
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルと網膜血管新生との関連性を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３-/+及びＩＧＦＢＰ−３+/+（１１マウス＝２２眼）同胞マウスを、尾断片のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルについて評価し、そしてＰ１７で全載網膜の網膜血管新生の程度について評価した。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現の増加とともに網膜血管新生の減少があった。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現は、Ｐ１７でＩＧＦＢＰ−３+/-マウスのＲＯＰマウスモデルの網膜血管新生に対して用量依存的な保護作用と関連する（図５）。
【００８２】
〔実施例６〕
網膜のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは低酸素とともに増加する
ＩＧＦＢＰ−３を標的とするＰＣＲプライマー、及び不変制御遺伝子（unchanging control gene）（シクロフィリン）、ＲＮＡをプライマー発現（Primer Express）ソフトウェア（Applied BioSystems, Foster City, Calif.）を使用してデザインした。遺伝子検出の特異性についてプライマー及びプローブ配列を解析するために３つの方法を使用した。第１に、NCBI Blastモジュールによって測定して、選択配列を特異的に検出するプライマー及びプローブ配列のみが使用された。第２に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、Applied BioSystems製の一次導関数プライマー融解曲線ソフトウェアを用いて解析した。この解析は、アンプリコンの特異的融点温度に基づいてアンプリコンの存在を測定した。第３に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、ゲル精製して配列決定し（小児病院コア配列決定施設（Children's Hospital Core Sequencing Facility）, Boston, Mass.）、所望の配列選択を確認した。遺伝子発現の定量分析は、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（TaqMan）及びＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（Qiagen）を用いて行なった。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、７５％酸素へ曝露の有りと無しの条件下ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲにより、Ｐ８、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２６及びＰ３３で解析した。
【００８３】
低酸素症の発症は、酸素誘発網膜血管消失後マウスを大気に戻した場合にＰ１２で起こる。Ｐ１２とＰ１５の間に全網膜でＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡに３〜＞９倍増加があり、Ｐ１７を経過して持続し、低酸素症が血管再生長により軽減するＰ２６までに減少した（状態当りｎ＝１２網膜）。図６では、各々のバーは、シクロフィリンの百万コピーに正規化したＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡのコピー数を表わす(不変制御遺伝子)。
【００８４】
〔実施例７〕
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管領域に局在化する
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは、Ｐ１７で硝子体内に広がる網膜血管新生（タフト）の領域に、そして血管が位置する神経節細胞層及び内顆粒層に局在化する。局所血管領域内で、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡはＰ１７で低酸素症により５及び２５倍増加した。無血管光受容体層では、非酸素処置対照に比べて、Ｐ１７で低酸素症によるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡのわずかな増加のみがあった。図７において、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管に関係し、そして低酸素症で増加することが認められた。網膜血管のレーザー・キャプチャー領域から解析したＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、低酸素症によりＰ１７で表在血管層においてＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの大幅な増加が示され、ＩＧＦＢＰ−３は毛細血管に関係するが、周辺組織に関係しないことが示された。Ｔ：硝子体内に広がる血管新生血管タフト、Ｇ：神経節細胞層、ＯＮ：外核層、ＩＮ：内顆粒層。
【００８５】
〔実施例８〕
ＩＧＦＢＰ−３-/-マウスの網膜における内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の数の減少
ＩＧＦＢＰ−３-/-及び野生型対照同腹子をＰ７からＰ１２まで７５％の酸素に曝露し、次いで大気中へ移した。動物はＰ１５で犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８眼）及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝７眼）由来の網膜を分離し、そして４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定し、１％Triton X-100を有するＰＢＳで一夜膜透過した後、バンディラマメ（Griffonia simplicifolia）レクチンＩ（内皮細胞特異的）（Invitrogen、Eugene, Oregon, USA）及びＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体（Miltenyi Biotec Inc、Auburn, CA, USA）染色を行なった。
【００８６】
網膜内へのＥＰＣ動員に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、酸素誘発網膜症後にＰ１５でＩＧＦＢＰ−３-/-マウス由来の網膜を調べた。ＥＰＣはＣＤ３４抗体染色で同定した。野生型動物（ｎ＝７）に比べて、ＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝８）の網膜では、網膜中に殆ど３０％少ないＣＤ３４＋細胞が存在した（Ｐ＝０.００３）。図８では、Ｐ１５ＨでＰ１５ＨＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝８）の網膜のＣＤ３４＋細胞の定量化により、野生型動物（ｎ＝７、Ｐ＝０.００３）と比較してＥＰＣ数の有意な減少が示されたことが認められた。赤色：レクチン−アレクサ（lectin-Alexa）594（内皮細胞特異的）、緑色：ＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体。このことは、ＩＧＦＢＰ−３が損傷部位内に骨髄由来ＥＰＣを動員することにより、網膜血管修復に寄与している可能性を示唆する。
【００８７】
〔実施例９〕
臨床研究において血清ＩＧＦＢＰ−３の増加は重症度の低いＲＯＰと相関する
在胎期間（ＧＡ）＜３２週で出生した新生児を、GoteborgのQueen Silvia Children's
Hospital及びUppsala University Hospitalで募集した(１９０名は適格で、７９名が１９９９年１２月と２００２年４月の間に登録された)。月経後週齢（ＰＭＡ）４０週までの出生後フォローアップ完了不能、又は自宅への退院及び明らかな先天異常が除外基準であった。その群には、１９組の双子、８組のペア及び同胞が死亡した３名が含まれた。新生児はすべて新生児集中治療室に入院した。増加量の母乳で経腸栄養法を早期（出生後２〜４８ｈ）に導入した。完全経腸栄養法が達成されるまで、グルコース、アミノ酸、及び脂肪による補助非経口的栄養を与えた。０.８ｇのタンパク質／１００ｍｌで強化した母乳を、＜１,５００ｇの乳児に、ＰＭＡ約１０日から乳児が２,０００ｇ体重になるまで与えた。Goeteborgの医学部倫理委員会及びウプサラ大学で承認（＃Ｏ５９４−００）され、そして両親からはインフォームドコンセントを得た。
【００８８】
間接検眼鏡による拡大網膜検査が、出生後５週齢から６週齢まで、網膜が完全に血管新生するか又は状態が安定であると考えられるまで、週１回又は隔週行われた。プラス病（plus disease）及び／又はステージ３ＲＯＰの小児は、更に頻繁に検査した。ＲＯＰ変化はＲＯＰの国際分類に従って分類した。
【００８９】
各乳児に対する毎週の血液検体（０.５ｍｌ）は−２０℃から−８０℃で保存し、そし
て同時に分析した。血清中ＩＧＦＢＰ−３レベルは、ＩＧＦＢＰ−３の特異的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Mediagnost GmbH, Tuebingen, Germany）を用いて測定した。ＩＧＦＢＰ−３アッセイで、イントラアッセイ変動係数（ＣＶ）は、１,８００、３,７９０、及び５,７７６μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ７.１、７.３、及び７.９％であり、そしてインターアッセイＣＶは１３.４、１０.５、及び１４.１％であった。
【００９０】
出生後のＩＧＦＢＰ−３レベルの増加は血管消失に対して保護し、その結果未熟児の増殖性ＲＯＰに対して保護するという仮説を試験するために、予め、出生後週１回ＩＧＦＢＰ−３血漿レベルを測定し、そしてＲＯＰの危険性が高い在胎期間＜３２週で出生した全未熟児（ｎ＝７９）の網膜を同時に（coordinately）検査した。ＲＯＰステージ０〜４は国際分類に従って定義され、そしてこれらの研究ではＲＯＰステージ３〜４（ｎ＝１３）は増殖性ＲＯＰと定義され、そしてＲＯＰステージ０（ｎ＝３８）はＲＯＰでないと定義された。発明者らは、血管生長の欠如は増殖性ＲＯＰと関連することを確認した。正常な未成熟網膜は、半透明血管新生網膜から灰色の、非血管新生網膜への段階的移行を２つの間の明確な境界なしに有する。ＲＯＰでは、血管新生網膜及び非血管新生網膜間に線（line）又は稜線（ridge）から成る観察できる鋭い定常的境界が現われる。すべての増殖性ＲＯＰ患者（ｎ＝１３）では、血管がその先に見えない分界線が存在した。ＲＯＰのないすべての乳児（ｎ＝３８）では、稜線も境界線も存在しなかったことから、血管最前線のより正常な生長を示した（データは示していない）。増殖性ＲＯＰの乳児で月経後週齢３０〜３５週のＩＧＦＢＰ−３の平均±ＳＥＭレベルは８０２±６６μｇ／Ｌであり、そしてＲＯＰでない乳児では９７４±４１μｇ／Ｌであった。Mann-Whitney試験では０.０３のＰ値となり、この時点での平均ＩＧＦＢＰ−３において、２群間に有意差があることを示唆した（図９）。
【００９１】
上記実施例から、ＩＧＦＢＰ−３レベルの増加は網膜血管新生の減少（ＲＯＰ）に関連し、従って正常血管生長の増加に関連すると見ることができる。ＩＧＦＢＰ−３-/-トランスジェニックマウスを用いた研究、及び野生型マウスにおける補充組み換え（supplemental recombinant）ＩＧＦＢＰ−３を用いた他の研究において、インビボのＩＧＦＢＰ−３レベルの減少に対する病理学的網膜血管新生の用量反応性の存在することが測定される。ＩＧＦＢＰ−３の増加レベルは、網膜血管消失を減少させ、血管再生長を増加させ、そしてその結果血管新生を減少させる。更に、トランスジェニックと野生型マウスにおける血清ＩＧＦ−Ｉレベルは同じで、そして正常レベル以上の外因性のＩＧＦＢＰ−３の添加が更に血管再生長を促進したことから、ＩＧＦＢＰ−３の保護効果はＩＧＦ−Ｉと無関係であるように見える。ＩＧＦＢＰ−３の作用はインビトロで検討されているが、血管発生におけるＩＧＦＢＰ−３の役割を直接扱うインビボの実験的研究は、あったとしても少ない。
【００９２】
先の実施例９で記載した早産児の臨床研究では、ＰＭＡ３０〜３３週（ＲＯＰの誘発が起こる場合）間の血清ＩＧＦＢＰ−３の低レベルは、増殖性ＲＯＰの発症リスク増加と相関することも示されている。これらのデータは、初期発生においてＩＧＦ−Ｉの低レベルの早産児が少ない血管生長及びＲＯＰのリスク増加を有するというこれまでの所見に対応している。興味深いことに、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比が増殖性ＲＯＰを発症する早産児と発症しない早産児間で類似していることが認められている(データは示していない)。その上、非ＲＯＰとＲＯＰの小児間で酸に不安定なサブユニットレベルに有意差は認められなかったことから(データは示していない)、血清ＩＧＦ１複合体（ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ−３及び酸に不安定なサブユニット）中の重要な因子は、ＩＧＦ１及びＩＧＦＢＰ−３の両方であることが示唆される。このことは、ＲＯＰ発症の恐れのある小児におけるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３両者のレベルを同時に回復すること、及びそれによりＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比をそのまま維持することは、破壊性網膜血管新生（ＲＯＰ）を予防するのに非常に重要である。現在ＩＧＦＢＰ−３は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の組み合わせものとして入手可能である。
【００９３】
ＩＧＦＢＰ−３が血管消失を予防し、そして修復を改善するメカニズムは多因子性のようである。全身性対局所性ＩＧＦＢＰ−３の相対的寄与は知られていない。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管系に見出され、そして低酸素により相当に増加する。この局所源は血管生長を調節するのに重要な役割を果たしている可能性がある。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−３がインビトロで幹細胞の増殖を促進することから、血管への幹細胞の動員がＩＧＦＢＰ−３レベルの増加により刺激される可能性が推測され得る。実施例８では、ＩＧＦＢＰ−３の欠乏が網膜中のＣＤ３４＋ＥＰＣ数の減少に関連することが示され、ＩＧＦＢＰ−３は網膜への骨髄由来ＥＰＣの組込みを促進することにより血管修復を改善する可能性を示唆する。この補充は網膜血管系を安定化し、そして正常化すると考えられる。
【００９４】
ＲＯＰ又は糖尿病の患者は、次いで低酸素誘発血管増殖を促進し得る網膜血管消失を起こし易く、網膜剥離及び失明を引き起こす。血管消失を予防し又は効率的な血管再生を促進する介入は、病理学的血管新生及び心臓病などの血管消失に関与する多くの糖尿病合併症を予防することができる。これらの知見は、血管網の調節に関与する他の疾患病因に対して当てはまるようである。
【００９５】
ＩＧＦ−Ｉは数十年来糖尿病性網膜症に関与すると疑われているが、相関についての臨床研究の結果は様々である。しかしながら、１つの研究では、１型糖尿病の患者は非糖尿病対照に比べて、ＩＧＦＢＰ−３の血清中レベル(及び遊離＋解離性ＩＧＦ−Ｉ)を低下させていた(Frystyk, J., Bek, T., Flyvbjerg, A., Skjaerbaek, C. & Orskov, H. (2003)
Diabet Med 20, 269-76.）。増殖性網膜症患者は、血液漏出増加に因ると考えられるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３、並びに他の結合タンパク質の硝子体中レベルを増加させている。
【００９６】
要約すれば、低レベルの血清ＩＧＦＢＰ−３を有する早産児は網膜症のリスクがより高い。ＲＯＰのマウスモデルにおいて、ＩＧＦＢＰ−３の保護効果はＩＧＦ−Ｉに無関係なようであり、そして血管消失に対する保護作用の増加及び損傷後の血管再生長増加の結果である。血管安定化のメカニズムは内皮前駆細胞の動員と整合性を有している。これらの結果は、糖尿病及びＲＯＰ、血管消失及びそれに続く破壊的血管新生に関連する疾患を有する患者の治療において重要な意義を有する。網膜の血管新生の改善は、病理学的血管新生の後期発生に必要な低酸素刺激を減少させる傾向があると考えられ、ＲＯＰの程度を軽減する可能性がある。この研究は、ＲＯＰを発症する危険性を有する小児においてＩＧＦ−ＩレベルだけでなくＩＧＦＢＰ−３のレベルをも同時に回復することは、同様の保護効果を有し、そしてそれによりＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比をそのまま維持することは、破壊性網膜血管新生（ＲＯＰ）を予防するのに非常に重要であることを示唆している。
【００９７】
従って、１つの側面において、本発明は、早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患する患者を治療し、又は患者を早産、極早産及び／又は超早産の合併症の発症から予防する方法を提供し、該合併症は、発育遅延、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。この方法は、患者のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルを患者の在胎期間に対して正常な子宮内レベルに対応する範囲に上昇させるために、有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内レベルでの基準未満のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者に投与することを含む。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３に対するこれらのレベルは、患者の在胎期間に応じて、それぞれ１０〜１００及び５００〜１,４００μｇ／Ｌの範囲内である。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３又はその類似体は、皮下、静脈内又は経口で投与し得る。静脈内投与が好ましい。
【００９８】
本研究の方法は、未熟児合併症を効果的に予防し、そして正常な血管発生を促進するために、出生後直ちに開始することが好ましい。このことは、ＩＧＦ−Ｉレベルの増加がＲＯＰの後期血管新生破壊期を促進する可能性があるＲＯＰの治療に特に重要である。非血管新生網膜が低酸素になった後まで遅延した治療は、異常な網膜血管新生を引き起こしかねない。
【００９９】
ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体と組み合わせたＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の投与は、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の循環レベルの増加をもたらす。従って、ＩＧＦＢＰ−３と組み合わせたＩＧＦ−Ｉの投与は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに伴う症状、障害、及び状態の治療又は予防に有用である。
【０１００】
本明細書に開示される本発明の方法は、そのような治療を必要とする乳児へのＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の組み合わせ複合体の非経口的投与を提供する。非経口的投与として、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法では、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３又はその類似体は、好ましくは経口で投与される。ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、及びＩＰ投与はボーラス又は注入によるものであってもよく、そしてポンプ、徐放性製剤、及び機械的デバイスを含むがこれらに限定されない、徐放性埋め込み型デバイスによるものであってよい。製剤、経路及び投与方法、並びに投与量は、治療すべき障害及び患者の病歴に依存する。一般的に、皮下注射によって投与される用量は、静脈内又は筋肉内投与される治療的等価用量より大きくなる。本発明に従って用いられる組成物は、患者の在胎期間に相関した患者の内因性モル比に対応する正常な生理的比を患者に与え維持するような比を有し、又はＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３の異常比を修正する。ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、投与方法に関係なく２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。用量は、当業者により、患者の体重及び／又は在胎期間及び／又は患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の測定レベルに基づいて各特定の症例で容易に決定される。より好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の用量は、２４時間当り約５μｇ／ｋｇから約３７０μｇ／ｋｇである。
【０１０１】
本発明の組成物は、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の両方を含む必要があり、ここで、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比は等モルより低く、好ましくは１：２〜１：３.３３、例えば１：２０〜１：４、１：１５〜１：５又は１：１２〜１：８の範囲である。好ましい形態は、患者の在胎期間に相関した患者の内因性モル比に相当する治療用組成物であり、ここで、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の当該モル比は、上記の好ましい間隔で１：２０〜１：３.３３の範囲である。
【０１０２】
組成物は、等モルより低く、好ましくは１：３.３３〜１：２０、例えば１：４、１：５、１：８、１：１２、１：１５、１：１８の比に固定した組み合わせとして患者に投与することができ；又は患者でＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の正しい比を達成するように、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は１：３.３３〜１：２０の比の範囲内で別々に投与することができ；又はＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は、上記のように患者で正しい比を達成するように、別に投与のＩＧＦＢＰ−３で補充して、固定した組み合わせとして患者に投与することができる。
【０１０３】
組成物は出生後５日以前に、好ましくは出生後４日以前に、より好ましくは出生後３日以前に、最も好ましくは出生後２日以前に、投与され又は開始される。
【０１０４】
組み合わせものは、好ましくは、生理食塩水、又はリン酸緩衝化生理食塩水溶液などの生理学的適合性の担体中に溶解する。より好ましくは、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉの濃縮溶液及び組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３の濃縮溶液を十分な時間一緒に混合して等モル複合体を形成させる。最も好ましくは、国際公開第９６／４０７３６号に記載のように、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ及び組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３を組み合わせて、精製時に複合体を形成させる。
【０１０５】
非経口的投与では、本複合体の組成物は、液剤、懸濁剤等のような半固体又は液体の製剤であってよい。生理学的適合性の担体としては、生理食塩水、血清アルブミン、５％デキストロース、血漿製剤、及び他のタンパク質含有溶液が含まれるが、これらに限定されない。場合により、担体は清浄剤又は界面活性剤を含んでもよい。
【０１０６】
本発明のなお別の側面では、早産合併症を治療するための薬剤組成物の製造における、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の使用が提供される。
【０１０７】
最後に、包装材料及び包装材料内に含有される薬剤を含む製品も提供される。包装材料は、早産に関連する合併症を治療及び／又は予防するための薬剤が十分な期間、有効量で投与すべきことを表示するラベルを含む。薬剤は、薬学的に許容される担体とともにＩＧＦ−Ｉ又はその類似体を含む。
【０１０８】
治療への応用として、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体は、単独で、又は１つ若しくはそれ以上の許容される担体及び場合により他の医薬成分とともにＩＧＦ−Ｉ又はその類似体を含む薬剤組成物の一部として、患者に好適に投与することができる。１つ又は複数の担体は、製剤の他の成分と適合し、そしてその受容者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【０１０９】
本発明の薬剤組成物は、経口、鼻内、局所（口腔（buccal）及び舌下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、微小透析及び皮内）投与に好適な組成物を含む。製剤は単位剤形、例えば錠剤及び徐放性カプセル剤の形態で、及びリポソームで便利に与えられ、そして調剤の技術分野でよく知られた任意の方法によって調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)を参照されたい。
【０１１０】
そのような調製方法は、１つ又はそれ以上の副成分から成る担体などの成分を、投与すべき分子との関連をもたらす工程を含む。一般的に、組成物は、有効成分を液体担体、リポソーム又は微粉化した固体担体、又はその両方と一様にそして緊密に関連させ、そして必要に応じて次に製品を成形することにより調製される。
【０１１１】
経口投与に好適な本発明の組成物は、所定量の有効成分を各々含有するカプセル剤、カシェ剤又は錠剤などのような別個の単位として；散剤又は顆粒剤として；液剤又は水性液体若しくは非水液体中の懸濁剤として；又は水中油液体乳剤又は油中水液体乳剤、又はリポソーム剤に包装され及びボーラス剤としてなど；与えられてもよい。
【０１１２】
錠剤は、場合により１つ又はそれ以上の副成分とともに圧縮又は成型することにより調製することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの自由流動形態の有効成分を、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性又は分散剤と混合して、好適な機械で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、不活性液体希釈剤により湿潤化した粉末化合物の混合物を、好適な機械で成型することにより製造することができる。錠剤は、場合により、中の有効成分の徐放又は制御放出を可能にするように、コーティング又は分割されてもよい。
【０１１３】
局所投与に好適な組成物としては、矯味矯臭した基剤、通常は蔗糖及びアカシア又はトラガント中に成分を含むトローチ剤；及びゼラチン及びグリセリン、又は蔗糖及びアカシアなどの不活性基剤中に有効成分を含むパステル剤が挙げられれる。
【０１１４】
非経口的投与に好適な組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質を含有してよい水性及び非水無菌注射用液剤；並びに懸濁化剤及び濃稠化剤を含有してよい水性及び非水性無菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単回投与又は反復投与の容器、例えば密封したアンプル及びバイアルで与えられ、そして滅菌液体担体、例えば注射用水の使用直前の添加のみを必要とする凍結乾燥(凍乾)状態で保存することができる。即時注射液剤及び懸濁剤は、滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【０１１５】
上に述べられ、開示された実施態様は単に例として与えられただけであり、本発明を限定すべきものではない。下記の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内の、他の解決、使用、目的、及び機能は、当業者には明らかなはずである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早産及び低出生体重の合併症、及び循環ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低血清レベルに関連する合併症の発症のリスクを防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国における毎年推定４.３百万人の生児出生のうち、約８７,０００人（約２.１％）は、３２週未満の在胎期間として定義される極早産（very prematurely）である。ヨーロッパでは、妊娠３２週未満の早産の発生率は、１０,０００人の住民中１.２％であると推定されている。従ってＥＵ２５内の４５０百万人の住民では、妊娠３２週未満の早産の発生率は、１年当り５４,０００児と予想される。切迫早産及びその合併症は、今日の先進社会において主要な周産期の公衆衛生問題である。低出生体重児及び早産児は、子宮内での成長の臨界期の一部又は全部を欠いている。それらは全乳児死亡の半分及び長期罹患率の３／４を占めている。新生児期の及び生存児の生涯にわたる、双方の高額な特別ケアに因り、それらは国民経済へ重い負担を課している。また、多くの生存児は、未熟児に直接起因する身体的障害故にクオリティオブライフを損なっている。
【０００３】
正常妊娠又は妊娠期間の長さは受胎日から４０週（２８０日）と考えられている。在胎３７週未満で出生した新生児は早産とされ、そして合併症のリスクがあり得る。在胎３２週満了未満で出生した新生児は極早産（very preterm）とされ、そして在胎２８週満了未満で出生した新生児は超早産（extremely preterm）とされている。医療技術の進歩は、在胎期間２３週（１７週早産）の若さで出生した新生児を生存可能にしている。早産で出生した新生児は、その低出生体重及びその体組織の未熟に因り死亡又は重篤な合併症の危険性が高い。２,５００ｇのカットオフで定義される低出生体重は、それが出生前リスクファクター、分娩時合併症及び新生児疾患と相関し、そして主として早産で構成されることから、ハイリスク新生児のマーカーとしての機能を果たす。超低出生体重に関する研究によって、超未熟児に関連して高率で重度の呼吸器及び神経系合併症を伴う新生児を、最も危険性が高い新生児と特定するカットオフが、１,５００ｇ未満又は１,０００ｇ未満として定義された。
【０００４】
肺、消化器系、及び神経系(脳を含む)は未熟児では未発育であり、これらが特に合併症を起こし易い。早産児に見られる最も多い医学的問題は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症である。早産児がその自然環境を奪われた場合、子宮内で普通に見られるタンパク質、成長因子及びサイトカインなどの重要な因子を失う。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）はそのような因子の１つであるが、他にもあり得る。
【０００５】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、出生後成長及び代謝のよく知られた調節因子である。これは約７.５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。ＩＧＦ−Ｉは、そのような成長因子による細胞の処理がＩＧＦ−Ｉの産生増加をもたらすことから、様々な他の成長因子の作用に関与している。しかしながら、胎内成長及び発育におけるその役割は極く最近になって認識された。ＩＧＦ−Ｉ-/-マウスで得られた実験データは、ＩＧＦ−Ｉが胚発生の妊娠第３期と幾つかの組織における発育で重要な役割を果たすことを示唆する。マウスでのＩＧＦ−Ｉ-/-データの裏づけとして、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子における遺伝子欠損でホモ接合型の患者は、胎内成長及び中枢神経系発育の障害を呈することが示された。
【０００６】
ＩＧＦ−Ｉはインスリン様活性を有し、そして細胞分裂促進性（細胞分裂を刺激する）であり、及び／又は神経、筋肉、生殖、骨格及び他の組織において細胞栄養性（回復／生存を促進する）である。殆どの成長因子と異なり、ＩＧＦは血中に相当量で存在しているが、血中及び／又は他の体液中では極少量の本ＩＧＦしか遊離していない。大部分の循環ＩＧＦはＩＧＦ結合タンパク質のＩＧＦＢＰ−３に結合している。ＩＧＦ−Ｉは、異常成長関連状態、例えば脳下垂体性巨人症、末端肥大症、小人症、種々の成長ホルモン欠損症等を診断するために血清で測定し得る。ＩＧＦ−Ｉは多くの組織で産生されるが、大部分の循環ＩＧＦ−Ｉは肝臓で合成されると考えられている。ヒト胎児血清では、ＩＧＦ−Ｉレベルは比較的低く、そして在胎期間及び出生体重と正の相関を有する。殆どすべてのＩＧＦは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、及び酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）と称する巨大タンパク質サブユニットから構成される非共有結合性三元複合体で循環する。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳ三元複合体は、各々等モル量の３成分から構成される。ＡＬＳは直接的なＩＧＦ結合活性を有しておらず、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３二元複合体に対してだけ結合するように見える。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳ三元複合体は、約１５０ｋＤａの分子量を有する。この三元複合体は、「ＩＧＦ−Ｉが遊離ＩＧＦの急速な濃度変化を防止するためのリザーバ及びバッファーとして」循環中で機能していると考えられている。過剰の遊離ＩＧＦ−ＩはＩＧＦＢＰの生物活性をダウンレギュレートし得ることが示されていおり；従って、ＩＧＦＢＰの活性低下もまた、高用量ＩＧＦ−Ｉの効果の欠如の一因となり得る。健常な小児及び成人での初期の研究では、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ複合体の半減期は血漿中でおおよそ１２〜１５時間であることが見出されている。ＩＧＦＢＰ−３は循環中で最も豊富なＩＧＦ結合タンパク質であるが、少なくとも５種の異なるＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）が種々の組織及び体液で同定されている。これらのタンパク質はＩＧＦと結合するが、それらは各々別個の遺伝子を起源とし、特有のアミノ酸配列を有する。このように、それらの結合タンパク質は、共通の前駆体の単なる類似体でもなければ誘導体でもない。ＩＧＦＢＰ−３と異なり、循環中の他のＩＧＦＢＰはＩＧＦで飽和されていない。その上、ＩＧＦＢＰ−３以外のＩＧＦＢＰは、いずれも１５０ｋＤａの三元複合体を形成し得ない。血漿中のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比は、非タンパク質結合のＩＧＦ−Ｉのアベイラビリティの推定値として使用されており、その比の増加は遊離生物活性ＩＧＦ−Ｉのアベイラビリティ増加を示唆する。生後１か月時点のより高いＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比は、満期産児に比べて中等度早産児のより高い成長速度と関連している。しかしながら、極早産及び超早産で生まれた乳児における生後１か月間のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３測定からの結論は、病的状態（即ち、ＲＯＰ）と健康な乳児間のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比に差を示さなかった。
【０００７】
ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は天然源から精製するか又は組み換え手段により生産することができる。例えば、ヒト血清からのＩＧＦ−Ｉの精製は当該技術分野でよく知られている。組み換え方法によるＩＧＦ−Ｉの産生は、１９８４年１２月に公開された特許文献１に示されている。ＩＧＦＢＰ−３は、Baxterら（非特許文献１）に示されるような方法を用いて天然源から精製することができる。或いは、ＩＧＦＢＰ−３は、非特許文献２に論じられているように組み換え法により合成し得る。組み換えＩＧＦＢＰ−３は、１：１のモル比でＩＧＦ−Ｉと結合する。
【０００８】
胎児期間に、これらの要素は胎盤吸収又は羊水（ＡＦ）からの摂取を通して導入される。これらの因子の欠乏は重要な経路の阻害又は不適切刺激を引き起こす可能性があり、目の場合には、これは未熟児網膜症（ＲＯＰ）の特徴である網膜血管生長異常を引き起こす可能性がある。
【０００９】
どのような因子が早産で失われるかを理解すること、及びそれらのＲＯＰ発症に及ぼす影響を評価することも、他の臓器系（脳、肺、腸、及び骨）の成長と発達にとって非常に大きな意義を有すると考えられる。消失因子の補充は、全体の発達を改善させるように見える。従って、この分野の研究は、未熟児の正常発達に及び／又は早産の多くの合併症の予防に非常に重要なものである。
【００１０】
ＲＯＰは、後期ＲＯＰの最新の治療にもかかわらず、先進の及び発展途上の世界の小児の失明の主因となっている。発展途上国は新生児及び母体の集中治療をより多く提供するにつれて、ＲＯＰの発生率は増加している。網膜のレーザー光凝固術又は凍結療法などのアブレーション治療は、後期疾患において失明の発生率を２５％低減するが、治療後の視力予後はしばしば不良である。ＲＯＰの予防的療法が明らかに好ましい。
【００１１】
網膜血管の発達は妊娠４か月の間に始まり、そして出産まで完結しない。従って、早産で出生した新生児は末梢の無血管帯を有する不完全な血管化網膜を有し、その領域は在胎期間に依存する。乳児の成熟とともに、結果として生じる非血管化網膜は、ますます代謝が活性に、そして低酸素状態になる。ＲＯＰの低酸素誘発網膜血管新生（ＮＶ）期は、糖尿病性網膜症などの他の増殖性網膜症に類似している。
【００１２】
１９５０年代初期の増殖性糖尿病性網膜症患者の研究では、下垂体アブレーションは網膜症の完全寛解をもたらし、成長ホルモン（ＧＨ）又はＧＨ軸における特定の因子が網膜症の発生に重要な役割を担うことを示した。ＧＨはマウスモデルの網膜症に重要なことが示された。加えて、ＲＯＰマウスモデルの実験研究では、ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニストが網膜血管新生を抑制することが見出されるということを実証した。ＩＧＦ−Ｉは、少なくとも部分的にｐ４４／４２ＭＡＰＫ(キナーゼインヒビター)の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）活性化の制御を介して網膜ＮＶを調節し、ＩＧＦ−ＩとＶＥＧＦ受容体間の階層的関係を確立している。これらの研究は、血管形成におけるＩＧＦ−Ｉの重要な役割を証明する。ＩＧＦ−Ｉは、新しい血管増殖の最大ＶＥＧＦ刺激を可能にするように寛容的に作用する。低レベルのＩＧＦ−ＩはＶＥＧＦの存在にもかかわらず血管増殖を阻害する。従って、ＲＯＰの発症に重要な非低酸素調節因子の１つになる可能性がある（非特許文献３）。
【００１３】
ＶＥＧＦの役割と同様に、ＩＧＦ−Ｉは網膜血管の正常な発達に重要なことが示されている（非特許文献４）。ＩＧＦ−Ｉレベルは、一部胎盤及び羊水によりもたらされたＩＧＦ−Ｉの減少に因り、出生後子宮内レベル以下に下がる。ＩＧＦ−Ｉは正常な網膜血管発生に重要なこと、そして新生児初期のＩＧＦ−Ｉの欠損は、血管増殖の欠如及びそれに続く増殖性ＲＯＰに関連すると仮定されている。ＩＧＦ−Ｉノックアウトマウス（ＩＧＦ−Ｉ−／−）では、ＩＧＦ−Ｉが正常な血管増殖に重要であるかを明らかにするために、正常な網膜血管発生が調べられた。網膜血管は、正常マウスよりもＩＧＦ−Ｉ−／−マウスで成長が遅く、そのパターンはＲＯＰの未熟児で見られるものに類似していた。これらの所見はＲＯＰ患者で確認された（非特許文献４、５）。
【００１４】
早産及び低出生体重の合併症発症のリスクを測定すること、及び当該合併症の治療法に一般的に関係した前の特許出願（特許文献２）では、これらの合併症は低レベルのＩＧＦ−Ｉに関連している。その治療的アプローチにより、患者へのＩＧＦ−Ｉの投与による未熟児合併症の治療で患者のＩＧＦ−Ｉの血清レベルが子宮内ベースラインレベルまで上昇することが示唆された。該発明の治療方法の１つによれば、ＩＧＦ−Ｉを、ＩＧＦ−Ｉを結合する能力がある追加タンパク質と組み合わせたＩＧＦ−Ｉを含む組成物で投与することができ、そしてこのような結合タンパク質がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）であることが提案されている。更に、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３を含む組成物が使用し得ることが示唆されている。
【００１５】
特許文献３では、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の皮下ボーラス注射による共投与（co-administration）が、一般的に約０.５：１〜３：１のＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−Ｉのモル比（又はモル比を本発明において特許請求したモル比と比べる場合、本出願全体のＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３で表すと、特許文献３に記載された対応モル比は１：０.５〜１：３になる）になると示唆されている。この発明者らは治療に使用しようとする混合物が、個々の患者の臨床状態（認識された若しくは予想されたいずれの側面、又はＩＧＦ−Ｉを単独で使用する際の同化作用低下、特定の成長欠陥又は補正すべき異化状態、使用される特定のＩＧＦＢＰ、混合物のデリバリー部位、及び医師に公知の他の要因を含む）を考慮しながら、適正診療規範（good medical practice）に合致する方法で処方し投与すべきことを述べている。様々なモル比のＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の組成物の更なる製造方法は先行技術から公知である。しかしながら、特定比の範囲で２つの成分を組み合わせて投与することの有益な効果は、この文献には記載されていない。特に、発明者らの知る限りでは、どのようなＩＧＦ−Ｉによる方法が、残された人生の間ハンディキャップをもたらす明らかなリスクとなる未熟児の治療の最も効率的な方法を提供することが期待されるかについて、先行技術にはいかなる教示も又は示唆も存在しない。
【００１６】
未熟児合併症についての理解がますます増進しつつあるにもかかわらず、早産死が今なお標準的な状態であるように、現在のところ利用可能で有効な治療法、又はこれらの致死的状態を発症するリスクを測定する方法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第０１２８７３３号
【特許文献２】米国特許出願第２００４／００５３８３８号
【特許文献３】米国特許第５１８７１５１号(Genentech)
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Baxter et al.1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 139:1256-1261
【非特許文献２】Sommer et al., pp. 715-728, インスリン様成長因子の近代的概念（MODERN CONCEPTS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS）(E. M. Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991)
【非特許文献３】L.E. Smith, W. Shen, C. Perruzzi et al., インスリン様成長因子−１受容体による血管内皮増殖因子依存性網膜新生血管の調節（Regulation of vascular endothelial growth factor-dependent retinal neovascularization by insulin-like growth factor- 1 receptor）, Nat Med 5 (1999), pp. 1390-1395
【非特許文献４】Hellstrom, C, Perruzzi, M. Ju et al., 低ＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞のＶＥＧＦ生存シグナル伝達を抑制する：未熟児の臨床的網膜症との直接相関（Low IGF-I suppresses VEGF-survival signaling in retinal endothelial cells: direct correlation with clinical retinopathy of prematurity）, Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (2001), pp. 5804-5808
【非特許文献５】Hellstroem A, Engstrom E, Hard A-L, et al., 出生後血清ＩＧＦ−Ｉ欠乏は未熟児網膜症及び他の早産小児科合併症に関与している（Postnatal serum IGF-I deficiency is associated with retinopathy of prematurity and other complications of premature birth pediatrics）, Pediatrics 2003; 112: 1016-1020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む、新しい組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
特に、本発明は、早産、極早産（very preterm-birth）及び／又は超早産（extremely preterm birth）の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む組成物であって、該組み合わせが、等モルより低い、好ましくは１：２０〜１：３．３３の範囲のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比を有する組成物に関する。
【００２１】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲である。
【００２２】
その好ましい実施態様において、組成物は、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される。
【００２３】
その好ましい実施態様において、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である。
【００２４】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。
【００２５】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である。
【００２６】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである。
【００２７】
その好ましい実施態様において、早産（preterm birth）の合併症は未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。
【００２８】
その好ましい実施態様において、早産、超早産及び／又は極超早産の前記合併症は、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される。
【００２９】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入治療を含む。
【００３０】
その好ましい実施態様において、使用は、皮下、静脈内又は経口治療を含む。
【００３１】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内治療を含む。
【００３２】
その好ましい実施態様において、治療は生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される。
【００３３】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ類似体はｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体はｒｈＩＧＦＢＰ−３である。
【００３４】
本発明の更なる側面は、有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者に投与することを含む、早産合併症の発症から患者を予防する方法であって、ここで患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルに患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを上げるために、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は等モルより低く、好ましくは１：２０〜１：３.３３の範囲である、方法に関する。
【００３５】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比は、１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲である。
【００３６】
その好ましい実施態様において、組成物は、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、ＩＧＦＢＰのその含量に関して連続的に調整される。
【００３７】
その好ましい実施態様において、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である。
【００３８】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。
【００３９】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である。
【００４０】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の合併症は、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである。
【００４１】
その好ましい実施態様において、早産（preterm birth）の合併症は未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。
【００４２】
その好ましい実施態様において、早産、極早産及び／又は超早産の前記合併症は、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される。
【００４３】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入治療を含む。
【００４４】
その好ましい実施態様において、使用は、皮下、静脈内又は経口治療を含む。
【００４５】
その好ましい実施態様において、使用は、静脈内治療を含む。
【００４６】
その好ましい実施態様において、治療は生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される。
【００４７】
その好ましい実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ類似体はｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体はｒｈＩＧＦＢＰ−３である。
【００４８】
定義
「早期産」又は「早産」又は「未熟児」は、妊娠４０週より前での、又は患者の在胎期間の平均より１０％小さい体重での、患者の出生を示す。
【００４９】
「極早産（very preterm birth）」は在胎３２満了週未満で出生した乳児を示す。
【００５０】
「超早産（extremely preterm birth）」は在胎２８満了週未満で出生した乳児を示す。
【００５１】
「ＩＧＦ−Ｉ」は、天然配列又は変異体の、ウシ、ヒツジ、ブタ及びヒトを含み、天然に存在する対立遺伝子多型を含むがこれに限定されない、任意の種由来のインスリン様成長因子Ｉをいう。ＩＧＦ−Ｉは、適切な部位でＩＧＦＢＰ−３と結合することを条件として、天然、合成又は組み換えを問わず任意の起源に由来していてもよい。本発明ではヒトＩＧＦ−Ｉが好適である。ＩＧＦ−Ｉは、例えばＰＣＴ刊行物国際公開第９５／０４０７６号に記載のように、組み換えにより生産し得る。
【００５２】
「ＩＧＦＢＰ」又は「ＩＧＦ結合タンパク質」は、インスリン様成長因子結合タンパク質ファミリー由来であって、そして循環性（即ち、血清又は組織中で）か否かにかかわらずＩＧＦ−Ｉと正常に会合又は結合又は錯体形成する、タンパク質又はポリペプチドをいう。そのような結合タンパク質は受容体を含まない。この定義には、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ−２５（ＩＧＦＢＰ−７）、及びプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ−１）、並びにＩＧＦＢＰと高い相同性を有する他のタンパク質が含まれる。
【００５３】
「ＩＧＦＢＰ−３」はインスリン様成長因子結合タンパク質３をいう。ＩＧＦＢＰ−３は、インスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ＩＧＦＢＰ−３は、天然配列又は変異体のウシ、ヒツジ、ブタ及びヒトを含み、天然に存在する対立遺伝子多型を含むがこれに限定されない、任意の種に由来してもよい。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉと二元複合体、及びＩＧＦ及び酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）と三元複合体を形成し得る。ＩＧＦＢＰ−３は、適切な部位でＩＧＦ−Ｉ及びＡＬＳと結合することを条件として、天然、合成又は組み換えを問わず任意の起源に由来していてもよい。ＩＧＦＢＰ−３は、ＰＣＴ刊行物国際公開第９５／０４０７６号に記載のように、組み換えにより生産し得る。
【００５４】
「ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比」は、ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３の比をいい、絶対値のＩＧＦＢＰ−３で除したＩＧＦ−Ｉと定義され、そしてパーセント又はＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比で表わされる。ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３間のモル比較では、以下の分子質量が計算に使用された：ＩＧＦ−Ｉ、７．５ｋＤａ（即ち、７,６４９Ｄａ）；及びＩＧＦＢＰ−３、２８.７ｋＤａ（即ち、２８,７３２Ｄａ）。ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比は、以下の換算当量（equivalents for conversion）を用いて生物活性ＩＧＦ−Ｉの指標として計算される：１ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ＝０.１３０ｎｍｏｌ／ＬのＩＧＦ−Ｉ；１ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−３＝０.０３６ｎｍｏｌ／ＬのＩＧＦＢＰ−３。
【００５５】
本明細書で使用される「治療用組成物」は、ＩＧＦ−Ｉ、その類似体、又はその結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ−３と組み合わせたＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体）を含むものと定義される。治療用組成物は、また、水、ミネラルなどの他の物質、タンパク質などの担体、及び当業者によく知られた他の賦形剤を含んでもよい。
【００５６】
ＩＧＦ−Ｉの「類似体」は、ヒト又は動物のＩＧＦ−Ｉと同じ治療効果を有する化合物である。これらはＩＧＦ−Ｉ(例えば、切断ＩＧＦ−Ｉ)の天然起源の類似体又はＩＧＦ−Ｉの知られた合成類似体のいずれであってもよい。例えば、米国特許第６２５１８６５号及び第５４７３０５４号を参照されたい。
【００５７】
以下において、添付した図面に示した例証的実施態様を参照して、本発明を限定されない形式でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】５及び６０μｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅ（１及び１３μｇ／ｋｇ／ｒｈＩＧＦ−Ｉに等価）で３時間にわたり投与した、等モルの組み合わせのｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の静脈内注射後の、５名の小児の薬物動態血清比を示す。
【図２】ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現が、酸素誘導網膜血管消失に対する保護に用量依存的に関連することを示す。
【図３】ＩＧＦＢＰ−３の消失が酸素誘導消失後の網膜血管再生長を減少させることを示す。
【図４】内因性ＩＧＦＢＰ−３が基準を超えて血管再生長を更に増加させることを示す。
【図５】網膜新生血管形成がＩＧＦＢＰ−３の増加とともに減少することを示す。
【図６】全網膜におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡが低酸素とともに増加することを示す。
【図７】ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡが網膜血管に関連し、そして低酸素とともに増加することを示す。
【図８】ＩＧＦＢＰ−３ヌルマウスの網膜における血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）数の減少を示す。
【図９】ＩＧＦＢＰ−３の高い血清レベルが小児のＲＯＰの減少に関連することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号では、ＩＧＦ−Ｉが血管生長に必要であり、そして早産後の網膜血管生長の停止で始まるＲＯＰの疾患過程を合理的に説明することが実証されている。子宮内と出生後の血管生長間の主な違いは、ＩＧＦ−Ｉの濃度が出生後の未熟児では減少することである。米国特許出願第２００４／００５３８３８号での記載、ＩＧＦ−Ｉのレベルが分娩後の未熟児で急速に増加する場合に正常な血管発生が可能となり、ＲＯＰが起こらないことが示唆される。
【００６０】
ＶＥＧＦは血管の発生において重要な役割を果たすが、低ＩＧＦ−Ｉレベルの存在下で血管生長を可能にするには不十分であることが示されている。代謝要求が発生とともに増加し、そしてＶＥＧＦレベルが硝子体で上昇するにつれて、ＶＥＧＦが益々低酸素性の無血管網膜で産生される。ＩＧＦ−Ｉが非ＲＯＰ乳児で生じるように出生後より急速に上昇する場合、成熟網膜に酸素を供給しそしてＶＥＧＦ産生を調節する血管生長が起こり得ることから、ＶＥＧＦは蓄積しない。ＩＧＦ−Ｉの濃度が長期間低い場合、血管は生長を停止し、成熟無血管網膜は低酸素状態となり、そしてＶＥＧＦは硝子体に蓄積する。高レベルのＶＥＧＦが存在する場合、ＩＧＦ−Ｉの濃度が閾値に上昇すると、新血管の急速生長（網膜新生血管）が引き起こされる。ＩＧＦ−ＩとＶＥＧＦとはＭＡＰＫ及びＡＫＴシグナル伝達経路を通して血管内皮細胞機能にとって補完的であることから、この急速血管生長は、血管内皮細胞の生存と増殖増加に基づくように思われる。特に、データは、ＩＧＦ−Ｉ（及び恐らく他のサイトカイン）がＶＥＧＦの最大機能を促進するために最小レベルで必要なことを示す。
【００６１】
米国特許出願第２００４／００５３８３８号の記載によれば、ＩＧＦ−Ｉレベルが、どんな新生児がＲＯＰを発症するかを予測するのに使用できることが示されている。ＲＯＰを発症する及び発症しない乳児間でのＩＧＦ−Ｉレベルのパターンの差から、出生後早期のＩＧＦ−Ｉの血清中濃度増加がこの疾患を防止する可能性が示唆される。ＲＯＰ及び他の病的状態の相対リスクは、月経後週齢３３週でＩＧＦ−Ｉが≦３０μｇ／Ｌの場合に５.７倍（９５％信頼区間２.２〜１４.６）増加した。月経後週齢の調整後、月経後週齢３１〜３５週時点での５μｇ／Ｌの平均ＩＧＦ−Ｉの各増加は、ＲＯＰのリスクを５９％減少させた。妊娠の３１〜３５週においてＩＧＦ−Ｉの中央値レベルは、生後病的状態のない群（ｎ＝２９）での３８μｇ／Ｌ（２０〜５９の範囲）に比べて、ＲＯＰ及び他の病的状態の乳児（ｎ＝１９）では２６μｇ／Ｌ（１７〜４９の範囲）であった（ｐ＜０.０００１）。早産後、高レベルのＩＧＦ−Ｉを含む羊水の摂取を含み、ＩＧＦ−Ｉの潜在的供給源は失われる。ＩＧＦ−Ｉの濃度は、カロリー摂取増加、羊水の取込みを模倣するＩＧＦ−Ｉの経口摂取、又はより正常なレベルにＩＧＦ−Ｉを上昇させる静脈内供給を通して、ＲＯＰなしの乳児に認められるレベルに増加させることができる。ＲＯＰは他の発達障害と相関することから、ＲＯＰなしの乳児のレベルまでＩＧＦ−Ｉレベルを増加させることは、神経発達をも改善する可能性がある。
【００６２】
ＩＧＦ−Ｉ及びＶＥＧＦの両者は、ＲＯＰの第２の又は血管新生期における重要な因子でもある。ＩＧＦ−Ｉの濃度を増加させる早期介入は正常な血管生長を可能にし、ＲＯＰの第２の潜在的破壊期の発生を防止すること、そしてＶＥＧＦの蓄積後の遅れた介入は網膜血管新生を誘起するか又は憎悪させる可能性があることが示唆される。米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号の記載の治療法の１つによれば、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉを結合することができる追加タンパク質と組み合わせたＩＧＦ−Ｉを含む組成物として投与することができ、そしてそのような結合タンパク質がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）であることが提案されている。更に、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３を含む組成物が使用し得ることが示唆されている。
【００６３】
極低出生体重（ＶＬＢＷ）児に対して組み換え（ｒｈ）ＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の静脈内注入投与後のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３薬物動態プロファイルを明らかにし、そして安全性と忍容性を評価する初期研究において、等モル量のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の組成物（米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号で示唆されるような）を使用した。これは非盲検比較臨床試験で、２００７年にGothenburgのQueen Silvia小児科病院の新生児病棟で行なった。２７週(２６週＋０日から２９週＋１日)の平均在胎期間(範囲)、及び１,０２２グラムの出生体重（８１０から１,３１０グラム）の５人の患者(３人は女性)がこの研究に参加した。３日目(暦年齢)の乳児に対して、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の等モルの組み合わせ（複合体として等量のｒｈＩＧＦ−Ｉ及びｒｈＩＧＦＢＰ−３）を、５及び６０μｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅ（１及び１３μｇ／ｋｇ／ｒｈＩＧＦ−Ｉと等価）で３時間かけて静脈内注入として投与した。結果を図１に示したが、この図は小児の血清ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比に及ぼす投与ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３複合体の影響を示す。注入開始時点のベースラインのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルは、それぞれ１８.８±６.１及び８１１.８±１５２.４μｇ／Ｌであった（これは約１：１２のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比に相当する、２.３％の百分率比である）。治験薬注入停止の直後、血清ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルは、それぞれ３９.６±１２.２及び８５６.６±１９７.６μｇ／Ｌであった（これは約１：６のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比に相当する４.６％の百分率比である）。ＩＧＦ−Ｉの平均濃度を、≦３０μｇ／Ｌ（本研究では平均１８.８μｇ／Ｌ）の失明の危険があるＲＯＰ低レベルから、米国特許出願公開第２００４／００５３８３８号によりＲＯＰの危険がない状態を示す≧３５μｇ／Ｌ（３９.６μｇ／Ｌ）に増加したことも着目される。急性有害事象の報告はなく、すべての血糖測定値及び広範な安全性の基準はすべて正常であった。結論として：これらのデータは、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３複合体が、極早産児に対して血清ＩＧＦ−Ｉレベルを低レベルから正常範囲へと増加させるのに有効であること、及びｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の投与が安全で良好な忍容性であることを示した。
【００６４】
しかしながら、ＩＧＦ−Ｉの血清中濃度が輸血後倍以上に増え、それにより類似の在胎期間の胎児でいわれている生理的レベルに達したが、ＩＧＦＢＰ−３の血清中濃度において同様の増加を達成し得なかったことは、図１の血清比のグラフから明らかである。血清中のＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰ−３のモル比は、注入後１：１２から１：６に増加した。本研究からのもう１つの重要な所見は、約１時間である早産児の半減期が、小児及び成人で示される半減期と有意に異なることであった。従って、本研究からの主要な結論の１つとして、ｒＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体は、持続注入で投与する必要があるといえる。更に、ＩＧＦＢＰ−３と比べてＩＧＦ−Ｉの血清中濃度は相対的に高い増加を示し、血清中のＩＧＦ−Ｉ／ＧＦＢＰ−３の高い比率をもたらしたことから、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３の等モル組成物の投与は、早産児では最適ではない可能性があると結論し得る。
【００６５】
ＩＧＦ−Ｉレベル及びその結果としてＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比の増加に及ぼすこの影響は、ＩＧＦＢＰ−３のレベル増加もＲＯＰのリスク低減に関係することが発見された早産児の臨床研究（下記に述べる）で見られるような懸念をもたらす。そこでインビボ血管形成におけるＩＧＦＢＰ−３の役割をより明確にするために、酸素誘発血管消失及びそれに続く低酸素駆動血管新生のマウスモデルにおける、網膜血管生存及び血管再生長に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を調べた。
【００６６】
本モデルでは、ＩＧＦＢＰ−３の外因性デリバリー及び種々のレベルのＩＧＦＢＰ−３発現を有するＩｇｆｂｐ３-/-、Ｉｇｆｂｐ３+/-及びＩｇｆｂｐ３+/+トランスジェニックマウスを用いて、インビボの網膜症に対するＩＧＦＢＰ−３レベルの調節作用を調べた。ＩＧＦＢＰ−３の増加レベルが、酸素過剰誘発血管消失における血管生存増加、及び酸素誘発網膜症の低酸素期での血管再生長と修復の増加に関連し、結果的にＲＯＰのマウスモデルにおけるＩＧＦＢＰ−３レベルの増加に伴って網膜症の減少をもたらすことが発見された。
【００６７】
以下の実施例で、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例証し更に本発明を特徴付けするために提出するが、本発明を限定するものではない。本発明の方法を行なうために以下の材料及び方法を使用した。
【００６８】
動物
これらの研究は、眼及び視力研究における動物使用についてＡＲＶＯ声明に従ったものである（www.arvo.org/AboutARVO/animalst.asp）。ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−３-/-、ＩＧＦＢＰ−３+/-、ＩＧＦＢＰ−３+/+マウスは、Ning, Y., Schuller, A. G., Bradshaw, S., Rotwein, P., Ludwig, T., Frystyk, J. & Pintar, J. E. (2006) MoI Endocrinol 20, 2173-86に記載のとおりであり、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより尾試料におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの発現によって特徴付けられ、そしてサザンブロット法により確認された。
【００６９】
遺伝子発現の定量分析（定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＩＧＦＢＰ−３を標的とするＰＣＲプライマー、及び不変制御遺伝子（シクロフィリン）、ＲＮＡをPrimer Expressソフトウェア（Applied BioSystems, Foster City, Calif.）を用いてデザインした。遺伝子検出の特異性についてプライマー及びプローブ配列を解析するために３つの方法を使用した。第１に、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔモジュールによって測定して、選択配列を特異的に検出するプライマー及びプローブ配列のみが使用された。第２に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、Applied BioSystems製の一次導関数（first derivative）プライマー融解曲線ソフトウェアを用いて解析した。この解析は、アンプリコンの特異的融点温度に基づいてアンプリコンの存在を測定する。第３に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、ゲル精製して配列決定し（小児病院コア配列決定施設（Children's Hospital Core Sequencing Facility）、Boston, Mass）、所望の配列の選択を確認した。遺伝子発現の定量分析は、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（TaqMan）及びＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（Qiagen）を用いて行なった。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、７５％酸素への曝露の有りと無しの条件下で、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲにより、Ｐ８、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２６及びＰ３３で解析した。
【００７０】
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション
ＯＣＴに包埋した眼を低温保持装置中８μｍで切片化してアンコーティングスライドグラスに載せ、そして直ちに−８０℃で保存した。凍結切片を含むスライドを直ちに７０％エタノール中で３０秒間固定して、ヘマトキシリン（Meyers）及びエオジンで染色し、そして続いて各々７０％、９５％、及び１００％エタノール中、そして最終的にキシレン中１０分の脱水工程から成る４脱水工程を行なった。一旦風乾して、切片をPixCell II LCMシステム（Arcturus Engineering, Mountain View, Calif.）により、血管及び網膜神経層のマイクロダイセクションにかけた。各母集団は、補足細胞の顕微鏡的視覚化によって測定して＞９５％の均質性と推定された。４匹を超えるマウスからの各細胞層由来の材料を合わせてＲＮＡを分離し、記載のｃＤＮＡに変換させた。特異的ｃＤＮＡを定量的リアルタイム（ｑＲＴ）ＰＣＲを用いて定量化した。
【００７１】
〔実施例１〕
血清中ＩＧＦ−ＩレベルはＩＧＦＢＰ−３ヌルマウスの野生型と変わらない
以下の研究は、眼及び視力研究における動物使用のＡＲＶＯ声明に従ったものである（www.arvo.org/AboutARVO/animalst.asp）。ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−３-/-、ＩＧＦＢＰ−３+/-、ＩＧＦＢＰ−３+/+マウスは、Ning, Y., Schuller, A. G., Bradshaw, S., Rotwein, P., Ludwig, T., Frystyk, J. & Pintar, J. E. (2006) MoI Endocrinol 20, 2173-86に記載のとおりであり、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより尾試料におけるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの発現によって特徴付けられ、そしてサザンブロット法により確認された（データは示していない）。
【００７２】
血清中のＩＧＦ−Ｉレベルは、ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８）、ＩＧＦＢＰ−３-/+（ｎ＝１１）及びＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝１０）同胞（sibling）マウスで、ＩＧＦ−Ｉの定量のために大過剰のＩＧＦ−ＩＩによるＩＧＦＢＰ−ブロックＲＩＡを用いて測定した（Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany）。ＩＧＦ−ＩアッセイのイントラアッセイＣＶは、３６、２０４、及び５４５μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ１１.１、７.２、及び７.４％であり、そしてインターアッセイＣＶは１３.５、８.８、及び９.９％であった。このアッセイは標準曲線においてラットＩＧＦ−Ｉを用いてマウスの異種アッセイとして使用できる。
【００７３】
ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８）、ＩＧＦＢＰ−３+/-（ｎ＝１１）及びＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝１０）同胞マウスにおいて、出生後５日目（Ｐ５）に測定した平均血清中ＩＧＦ−Ｉレベルは、それぞれ８９±１９、８８±８及び９５±２５μｇ／Ｌで、対照に比べてトランスジェニックマウスにおいてＩＧＦ−Ｉに有意差はなかったことを示した。また発達段階でのＩＧＦＢＰ−３-/-マウス及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス間で重量の差もなかった。
【００７４】
〔実施例２〕
ＩＧＦＢＰ−３は酸素誘発網膜血管消失に対して保護する（Ｐ８）
血管消失を誘発させるために、出生後７日目（Ｐ７）マウスを乳母とともに１８ｈから５日の範囲の期間７５％酸素に曝露した。Ｏ2曝露後、マウスをアベルチン（Avertin）（Sigma）で麻酔し、そして生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌの２×１０6分子量ＦＩＴＣ−デキストランの心内潅流により犠牲にした。眼球を摘出し、そして４℃にて２時間４％パラホルムアルデヒドで固定した。網膜を分離し、そして光受容体側を上にしてポリリシンコートスライド上にグリセリン−ゼラチン(シグマ)で全載した。網膜を蛍光顕微鏡（オリンパス、東京）で調べ、３電荷結合素子カラービデオカメラ（ＤＸ−９５０Ｐ、ソニー）を用いて画像をデジタル化し、そしてNORTHERN ECLIPSEソフトウェア（Empix Imaging、Tronto）により処理した。
【００７５】
酸素中の血管生存に対する低いＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３+/+又はＩＧＦＢＰ−３+/-マウス（ｎ＝２２眼）の全載網膜における血管消失度を、Ｐ８で酸素誘導の１７時間後に調べた（ｎ＝１１マウス；各々のデータポイントは、１匹のマウスの右目と左目の平均である）。血管消失度を、ヘテロ接合体及び野生型マウスの尾断片のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現と比較した。図２から、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現のレベル増加に伴い血管生存の有意な増加があったので、Ｉｇｆｂｐ３ｍＲＮＡ発現は、Ｉｇｆｂｐ３+/-マウスにおいてＰ８で７５％酸素の１８時間後に、用量依存的に酸素誘発網膜血管消失に対する保護作用と関連することが、認められた(図２)（Ｐ≦０.００６、ｒ＝−０.７０）。
【００７６】
〔実施例３〕
低いＩＧＦＢＰ−３はＰ１７で持続的血管閉鎖に関連する
Ｐ７とＰ１２の間で、ヘテロ接合体ＩＧＦＢＰ−３の仔を孕んだ母マウスを７５％酸素に曝露し、次いでＰ１２〜Ｐ１７から大気中に移し、その後犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝５２眼）及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝３８眼）から網膜を摘出して全載し、更に血管閉鎖領域を評価した。
【００７７】
血管消失の持続に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝５２眼）及び同胞のＩＧＦＢＰ−３+/+（ｎ＝３８眼）マウスの全載網膜においてＰ１７で持続した血管閉鎖領域を、血管消失の酸素誘導（Ｐ１２〜Ｐ１７）後、及び大気Ｐ１２〜Ｐ１７での血管再生長後に調べた。図３において、酸素誘発血管消失後のＩＧＦＢＰ−３の保護作用は、ＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝５２眼）(右)に比べてＷＴ（ｎ＝３８眼）（中央）においてＰ１７で示されるように持続することが認められる。ＩＧＦＢＰ−３-/-マウスにおける血管閉鎖の分画網膜領域は、１５.１＋／−０.５％の面積の野生型マウスに比べて２０.２＋／−０.１％（ＳＥＭ）であった（Ｐ≦０.００５）（図３Ａ）。典型的な網膜全載は、野生型ではＩＧＦＢＰ−３+/+マウスよりも少ない血管消失を示す（図３Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３+/+に比べてＩＧＦＢＰ−３-/-マウスでは網膜血管消失領域の３１％増加があったことから、低ＩＧＦＢＰ−３による血管消失の持続性及び／又は血管再生長の欠如が示された。
【００７８】
〔実施例４〕
外因性ＩＧＦＢＰ−３は血管再生長を増加させる
Ｐ７とＰ１２の間に、Ｃ５７ＢＩ／６マウスを７５％酸素に曝露した。Ｐ１２で酸素を除去後、マウスに６０μｇのＩＧＦＢＰ−３（ｎ＝１６眼）又はビヒクル（ｎ＝１４眼）を１日３回腹腔内注射（Ｐ１２〜Ｐ１４）した。マウスをＰ１５で犠牲にし、網膜を摘出して全載し、そして血管閉鎖領域の血管再生長に対するＩＧＦＢＰ−３の効果を評価した。
【００７９】
酸素誘発血管閉鎖後の血管再生長に対する血清ＩＧＦＢＰ−３のレベル上昇の効果を評価するために、酸素で誘発した血管消失後Ｐ１２〜Ｐ１４から、ＩＧＦＢＰ−３の１日３回注射したＣ５７ＢＩ／６マウスにおいて、Ｐ１５での全載網膜における血管面積を調べた。図４の中央と右では、酸素誘発血管消失後に生理食塩水で処置したＣ５７ＢＩ／６マウスの全載網膜(中央)が、Ｐ１２〜Ｐ１４から腹腔内注射によりＩＧＦＢＰ−３で処置した同腹子(右)よりも主に血管再生長を減少させていることを示した。Ｐ１５では、ビヒクル対照処置マウス（ｎ＝７）に比べて、ＩＧＦＢＰ−３で処置したＣ５７ＢＩ／６マウス（ｎ＝８マウス）において血管消失面積で４０％の減少があったことから、ＩＧＦＢＰ−３の増加によって血管再生長を増加させることを示した（Ｐ≦０.００１）（図４左）。
【００８０】
〔実施例５〕
ＩＧＦＢＰ−３の発現の増加はマウスにおける網膜血管新生の減少に関連する
Ｐ７とＰ１２間で、ヘテロ接合体ＩＧＦＢＰ−３の仔を孕んだ母マウスを７５％酸素に曝露し、次いでＰ１２〜Ｐ１７から大気中に移し、その後犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/+及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝９マウス、１８眼）から網膜を摘出し、全載して、そして血管閉鎖の面積を評価して、２網膜の平均として記録した。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルを記載のように尾断片から測定した。
【００８１】
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルと網膜血管新生との関連性を評価するために、ＩＧＦＢＰ−３-/+及びＩＧＦＢＰ−３+/+（１１マウス＝２２眼）同胞マウスを、尾断片のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルについて評価し、そしてＰ１７で全載網膜の網膜血管新生の程度について評価した。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現の増加とともに網膜血管新生の減少があった。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡ発現は、Ｐ１７でＩＧＦＢＰ−３+/-マウスのＲＯＰマウスモデルの網膜血管新生に対して用量依存的な保護作用と関連する（図５）。
【００８２】
〔実施例６〕
網膜のＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは低酸素とともに増加する
ＩＧＦＢＰ−３を標的とするＰＣＲプライマー、及び不変制御遺伝子（unchanging control gene）（シクロフィリン）、ＲＮＡをプライマー発現（Primer Express）ソフトウェア（Applied BioSystems, Foster City, Calif.）を使用してデザインした。遺伝子検出の特異性についてプライマー及びプローブ配列を解析するために３つの方法を使用した。第１に、NCBI Blastモジュールによって測定して、選択配列を特異的に検出するプライマー及びプローブ配列のみが使用された。第２に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、Applied BioSystems製の一次導関数プライマー融解曲線ソフトウェアを用いて解析した。この解析は、アンプリコンの特異的融点温度に基づいてアンプリコンの存在を測定した。第３に、ＰＣＲ反応時に生成したアンプリコンを、ゲル精製して配列決定し（小児病院コア配列決定施設（Children's Hospital Core Sequencing Facility）, Boston, Mass.）、所望の配列選択を確認した。遺伝子発現の定量分析は、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（TaqMan）及びＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（Qiagen）を用いて行なった。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、７５％酸素へ曝露の有りと無しの条件下ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲにより、Ｐ８、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２６及びＰ３３で解析した。
【００８３】
低酸素症の発症は、酸素誘発網膜血管消失後マウスを大気に戻した場合にＰ１２で起こる。Ｐ１２とＰ１５の間に全網膜でＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡに３〜＞９倍増加があり、Ｐ１７を経過して持続し、低酸素症が血管再生長により軽減するＰ２６までに減少した（状態当りｎ＝１２網膜）。図６では、各々のバーは、シクロフィリンの百万コピーに正規化したＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡのコピー数を表わす(不変制御遺伝子)。
【００８４】
〔実施例７〕
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管領域に局在化する
ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは、Ｐ１７で硝子体内に広がる網膜血管新生（タフト）の領域に、そして血管が位置する神経節細胞層及び内顆粒層に局在化する。局所血管領域内で、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡはＰ１７で低酸素症により５及び２５倍増加した。無血管光受容体層では、非酸素処置対照に比べて、Ｐ１７で低酸素症によるＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡのわずかな増加のみがあった。図７において、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管に関係し、そして低酸素症で増加することが認められた。網膜血管のレーザー・キャプチャー領域から解析したＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、低酸素症によりＰ１７で表在血管層においてＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの大幅な増加が示され、ＩＧＦＢＰ−３は毛細血管に関係するが、周辺組織に関係しないことが示された。Ｔ：硝子体内に広がる血管新生血管タフト、Ｇ：神経節細胞層、ＯＮ：外核層、ＩＮ：内顆粒層。
【００８５】
〔実施例８〕
ＩＧＦＢＰ−３-/-マウスの網膜における内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の数の減少
ＩＧＦＢＰ−３-/-及び野生型対照同腹子をＰ７からＰ１２まで７５％の酸素に曝露し、次いで大気中へ移した。動物はＰ１５で犠牲にした。ＩＧＦＢＰ−３-/-（ｎ＝８眼）及びＩＧＦＢＰ−３+/+マウス（ｎ＝７眼）由来の網膜を分離し、そして４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定し、１％Triton X-100を有するＰＢＳで一夜膜透過した後、バンディラマメ（Griffonia simplicifolia）レクチンＩ（内皮細胞特異的）（Invitrogen、Eugene, Oregon, USA）及びＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体（Miltenyi Biotec Inc、Auburn, CA, USA）染色を行なった。
【００８６】
網膜内へのＥＰＣ動員に対するＩＧＦＢＰ−３の作用を評価するために、酸素誘発網膜症後にＰ１５でＩＧＦＢＰ−３-/-マウス由来の網膜を調べた。ＥＰＣはＣＤ３４抗体染色で同定した。野生型動物（ｎ＝７）に比べて、ＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝８）の網膜では、網膜中に殆ど３０％少ないＣＤ３４＋細胞が存在した（Ｐ＝０.００３）。図８では、Ｐ１５ＨでＰ１５ＨＩＧＦＢＰ−３-/-マウス（ｎ＝８）の網膜のＣＤ３４＋細胞の定量化により、野生型動物（ｎ＝７、Ｐ＝０.００３）と比較してＥＰＣ数の有意な減少が示されたことが認められた。赤色：レクチン−アレクサ（lectin-Alexa）594（内皮細胞特異的）、緑色：ＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体。このことは、ＩＧＦＢＰ−３が損傷部位内に骨髄由来ＥＰＣを動員することにより、網膜血管修復に寄与している可能性を示唆する。
【００８７】
〔実施例９〕
臨床研究において血清ＩＧＦＢＰ−３の増加は重症度の低いＲＯＰと相関する
在胎期間（ＧＡ）＜３２週で出生した新生児を、GoteborgのQueen Silvia Children's
Hospital及びUppsala University Hospitalで募集した(１９０名は適格で、７９名が１９９９年１２月と２００２年４月の間に登録された)。月経後週齢（ＰＭＡ）４０週までの出生後フォローアップ完了不能、又は自宅への退院及び明らかな先天異常が除外基準であった。その群には、１９組の双子、８組のペア及び同胞が死亡した３名が含まれた。新生児はすべて新生児集中治療室に入院した。増加量の母乳で経腸栄養法を早期（出生後２〜４８ｈ）に導入した。完全経腸栄養法が達成されるまで、グルコース、アミノ酸、及び脂肪による補助非経口的栄養を与えた。０.８ｇのタンパク質／１００ｍｌで強化した母乳を、＜１,５００ｇの乳児に、ＰＭＡ約１０日から乳児が２,０００ｇ体重になるまで与えた。Goeteborgの医学部倫理委員会及びウプサラ大学で承認（＃Ｏ５９４−００）され、そして両親からはインフォームドコンセントを得た。
【００８８】
間接検眼鏡による拡大網膜検査が、出生後５週齢から６週齢まで、網膜が完全に血管新生するか又は状態が安定であると考えられるまで、週１回又は隔週行われた。プラス病（plus disease）及び／又はステージ３ＲＯＰの小児は、更に頻繁に検査した。ＲＯＰ変化はＲＯＰの国際分類に従って分類した。
【００８９】
各乳児に対する毎週の血液検体（０.５ｍｌ）は−２０℃から−８０℃で保存し、そし
て同時に分析した。血清中ＩＧＦＢＰ−３レベルは、ＩＧＦＢＰ−３の特異的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Mediagnost GmbH, Tuebingen, Germany）を用いて測定した。ＩＧＦＢＰ−３アッセイで、イントラアッセイ変動係数（ＣＶ）は、１,８００、３,７９０、及び５,７７６μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ７.１、７.３、及び７.９％であり、そしてインターアッセイＣＶは１３.４、１０.５、及び１４.１％であった。
【００９０】
出生後のＩＧＦＢＰ−３レベルの増加は血管消失に対して保護し、その結果未熟児の増殖性ＲＯＰに対して保護するという仮説を試験するために、予め、出生後週１回ＩＧＦＢＰ−３血漿レベルを測定し、そしてＲＯＰの危険性が高い在胎期間＜３２週で出生した全未熟児（ｎ＝７９）の網膜を同時に（coordinately）検査した。ＲＯＰステージ０〜４は国際分類に従って定義され、そしてこれらの研究ではＲＯＰステージ３〜４（ｎ＝１３）は増殖性ＲＯＰと定義され、そしてＲＯＰステージ０（ｎ＝３８）はＲＯＰでないと定義された。発明者らは、血管生長の欠如は増殖性ＲＯＰと関連することを確認した。正常な未成熟網膜は、半透明血管新生網膜から灰色の、非血管新生網膜への段階的移行を２つの間の明確な境界なしに有する。ＲＯＰでは、血管新生網膜及び非血管新生網膜間に線（line）又は稜線（ridge）から成る観察できる鋭い定常的境界が現われる。すべての増殖性ＲＯＰ患者（ｎ＝１３）では、血管がその先に見えない分界線が存在した。ＲＯＰのないすべての乳児（ｎ＝３８）では、稜線も境界線も存在しなかったことから、血管最前線のより正常な生長を示した（データは示していない）。増殖性ＲＯＰの乳児で月経後週齢３０〜３５週のＩＧＦＢＰ−３の平均±ＳＥＭレベルは８０２±６６μｇ／Ｌであり、そしてＲＯＰでない乳児では９７４±４１μｇ／Ｌであった。Mann-Whitney試験では０.０３のＰ値となり、この時点での平均ＩＧＦＢＰ−３において、２群間に有意差があることを示唆した（図９）。
【００９１】
上記実施例から、ＩＧＦＢＰ−３レベルの増加は網膜血管新生の減少（ＲＯＰ）に関連し、従って正常血管生長の増加に関連すると見ることができる。ＩＧＦＢＰ−３-/-トランスジェニックマウスを用いた研究、及び野生型マウスにおける補充組み換え（supplemental recombinant）ＩＧＦＢＰ−３を用いた他の研究において、インビボのＩＧＦＢＰ−３レベルの減少に対する病理学的網膜血管新生の用量反応性の存在することが測定される。ＩＧＦＢＰ−３の増加レベルは、網膜血管消失を減少させ、血管再生長を増加させ、そしてその結果血管新生を減少させる。更に、トランスジェニックと野生型マウスにおける血清ＩＧＦ−Ｉレベルは同じで、そして正常レベル以上の外因性のＩＧＦＢＰ−３の添加が更に血管再生長を促進したことから、ＩＧＦＢＰ−３の保護効果はＩＧＦ−Ｉと無関係であるように見える。ＩＧＦＢＰ−３の作用はインビトロで検討されているが、血管発生におけるＩＧＦＢＰ−３の役割を直接扱うインビボの実験的研究は、あったとしても少ない。
【００９２】
先の実施例９で記載した早産児の臨床研究では、ＰＭＡ３０〜３３週（ＲＯＰの誘発が起こる場合）間の血清ＩＧＦＢＰ−３の低レベルは、増殖性ＲＯＰの発症リスク増加と相関することも示されている。これらのデータは、初期発生においてＩＧＦ−Ｉの低レベルの早産児が少ない血管生長及びＲＯＰのリスク増加を有するというこれまでの所見に対応している。興味深いことに、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比が増殖性ＲＯＰを発症する早産児と発症しない早産児間で類似していることが認められている(データは示していない)。その上、非ＲＯＰとＲＯＰの小児間で酸に不安定なサブユニットレベルに有意差は認められなかったことから(データは示していない)、血清ＩＧＦ１複合体（ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ−３及び酸に不安定なサブユニット）中の重要な因子は、ＩＧＦ１及びＩＧＦＢＰ−３の両方であることが示唆される。このことは、ＲＯＰ発症の恐れのある小児におけるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３両者のレベルを同時に回復すること、及びそれによりＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比をそのまま維持することは、破壊性網膜血管新生（ＲＯＰ）を予防するのに非常に重要である。現在ＩＧＦＢＰ−３は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の組み合わせものとして入手可能である。
【００９３】
ＩＧＦＢＰ−３が血管消失を予防し、そして修復を改善するメカニズムは多因子性のようである。全身性対局所性ＩＧＦＢＰ−３の相対的寄与は知られていない。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡは網膜血管系に見出され、そして低酸素により相当に増加する。この局所源は血管生長を調節するのに重要な役割を果たしている可能性がある。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−３がインビトロで幹細胞の増殖を促進することから、血管への幹細胞の動員がＩＧＦＢＰ−３レベルの増加により刺激される可能性が推測され得る。実施例８では、ＩＧＦＢＰ−３の欠乏が網膜中のＣＤ３４＋ＥＰＣ数の減少に関連することが示され、ＩＧＦＢＰ−３は網膜への骨髄由来ＥＰＣの組込みを促進することにより血管修復を改善する可能性を示唆する。この補充は網膜血管系を安定化し、そして正常化すると考えられる。
【００９４】
ＲＯＰ又は糖尿病の患者は、次いで低酸素誘発血管増殖を促進し得る網膜血管消失を起こし易く、網膜剥離及び失明を引き起こす。血管消失を予防し又は効率的な血管再生を促進する介入は、病理学的血管新生及び心臓病などの血管消失に関与する多くの糖尿病合併症を予防することができる。これらの知見は、血管網の調節に関与する他の疾患病因に対して当てはまるようである。
【００９５】
ＩＧＦ−Ｉは数十年来糖尿病性網膜症に関与すると疑われているが、相関についての臨床研究の結果は様々である。しかしながら、１つの研究では、１型糖尿病の患者は非糖尿病対照に比べて、ＩＧＦＢＰ−３の血清中レベル(及び遊離＋解離性ＩＧＦ−Ｉ)を低下させていた(Frystyk, J., Bek, T., Flyvbjerg, A., Skjaerbaek, C. & Orskov, H. (2003)
Diabet Med 20, 269-76.）。増殖性網膜症患者は、血液漏出増加に因ると考えられるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３、並びに他の結合タンパク質の硝子体中レベルを増加させている。
【００９６】
要約すれば、低レベルの血清ＩＧＦＢＰ−３を有する早産児は網膜症のリスクがより高い。ＲＯＰのマウスモデルにおいて、ＩＧＦＢＰ−３の保護効果はＩＧＦ−Ｉに無関係なようであり、そして血管消失に対する保護作用の増加及び損傷後の血管再生長増加の結果である。血管安定化のメカニズムは内皮前駆細胞の動員と整合性を有している。これらの結果は、糖尿病及びＲＯＰ、血管消失及びそれに続く破壊的血管新生に関連する疾患を有する患者の治療において重要な意義を有する。網膜の血管新生の改善は、病理学的血管新生の後期発生に必要な低酸素刺激を減少させる傾向があると考えられ、ＲＯＰの程度を軽減する可能性がある。この研究は、ＲＯＰを発症する危険性を有する小児においてＩＧＦ−ＩレベルだけでなくＩＧＦＢＰ−３のレベルをも同時に回復することは、同様の保護効果を有し、そしてそれによりＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３比をそのまま維持することは、破壊性網膜血管新生（ＲＯＰ）を予防するのに非常に重要であることを示唆している。
【００９７】
従って、１つの側面において、本発明は、早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患する患者を治療し、又は患者を早産、極早産及び／又は超早産の合併症の発症から予防する方法を提供し、該合併症は、発育遅延、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。この方法は、患者のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３レベルを患者の在胎期間に対して正常な子宮内レベルに対応する範囲に上昇させるために、有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内レベルでの基準未満のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者に投与することを含む。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３に対するこれらのレベルは、患者の在胎期間に応じて、それぞれ１０〜１００及び５００〜１,４００μｇ／Ｌの範囲内である。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３又はその類似体は、皮下、静脈内又は経口で投与し得る。静脈内投与が好ましい。
【００９８】
本研究の方法は、未熟児合併症を効果的に予防し、そして正常な血管発生を促進するために、出生後直ちに開始することが好ましい。このことは、ＩＧＦ−Ｉレベルの増加がＲＯＰの後期血管新生破壊期を促進する可能性があるＲＯＰの治療に特に重要である。非血管新生網膜が低酸素になった後まで遅延した治療は、異常な網膜血管新生を引き起こしかねない。
【００９９】
ＩＧＦＢＰ−３又はその類似体と組み合わせたＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の投与は、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の循環レベルの増加をもたらす。従って、ＩＧＦＢＰ−３と組み合わせたＩＧＦ−Ｉの投与は、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに伴う症状、障害、及び状態の治療又は予防に有用である。
【０１００】
本明細書に開示される本発明の方法は、そのような治療を必要とする乳児へのＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の組み合わせ複合体の非経口的投与を提供する。非経口的投与として、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法では、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３又はその類似体は、好ましくは経口で投与される。ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、及びＩＰ投与はボーラス又は注入によるものであってもよく、そしてポンプ、徐放性製剤、及び機械的デバイスを含むがこれらに限定されない、徐放性埋め込み型デバイスによるものであってよい。製剤、経路及び投与方法、並びに投与量は、治療すべき障害及び患者の病歴に依存する。一般的に、皮下注射によって投与される用量は、静脈内又は筋肉内投与される治療的等価用量より大きくなる。本発明に従って用いられる組成物は、患者の在胎期間に相関した患者の内因性モル比に対応する正常な生理的比を患者に与え維持するような比を有し、又はＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３の異常比を修正する。ＩＧＦ−Ｉの用量範囲は、投与方法に関係なく２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである。用量は、当業者により、患者の体重及び／又は在胎期間及び／又は患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の測定レベルに基づいて各特定の症例で容易に決定される。より好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の用量は、２４時間当り約５μｇ／ｋｇから約３７０μｇ／ｋｇである。
【０１０１】
本発明の組成物は、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の両方を含む必要があり、ここで、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３モル比は等モルより低く、好ましくは１：２〜１：３.３３、例えば１：２０〜１：４、１：１５〜１：５又は１：１２〜１：８の範囲である。好ましい形態は、患者の在胎期間に相関した患者の内因性モル比に相当する治療用組成物であり、ここで、ｒｈＩＧＦ−Ｉ／ｒｈＩＧＦＢＰ−３の当該モル比は、上記の好ましい間隔で１：２０〜１：３.３３の範囲である。
【０１０２】
組成物は、等モルより低く、好ましくは１：３.３３〜１：２０、例えば１：４、１：５、１：８、１：１２、１：１５、１：１８の比に固定した組み合わせとして患者に投与することができ；又は患者でＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の正しい比を達成するように、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は１：３.３３〜１：２０の比の範囲内で別々に投与することができ；又はＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３は、上記のように患者で正しい比を達成するように、別に投与のＩＧＦＢＰ−３で補充して、固定した組み合わせとして患者に投与することができる。
【０１０３】
組成物は出生後５日以前に、好ましくは出生後４日以前に、より好ましくは出生後３日以前に、最も好ましくは出生後２日以前に、投与され又は開始される。
【０１０４】
組み合わせものは、好ましくは、生理食塩水、又はリン酸緩衝化生理食塩水溶液などの生理学的適合性の担体中に溶解する。より好ましくは、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉの濃縮溶液及び組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３の濃縮溶液を十分な時間一緒に混合して等モル複合体を形成させる。最も好ましくは、国際公開第９６／４０７３６号に記載のように、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ及び組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３を組み合わせて、精製時に複合体を形成させる。
【０１０５】
非経口的投与では、本複合体の組成物は、液剤、懸濁剤等のような半固体又は液体の製剤であってよい。生理学的適合性の担体としては、生理食塩水、血清アルブミン、５％デキストロース、血漿製剤、及び他のタンパク質含有溶液が含まれるが、これらに限定されない。場合により、担体は清浄剤又は界面活性剤を含んでもよい。
【０１０６】
本発明のなお別の側面では、早産合併症を治療するための薬剤組成物の製造における、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体の使用が提供される。
【０１０７】
最後に、包装材料及び包装材料内に含有される薬剤を含む製品も提供される。包装材料は、早産に関連する合併症を治療及び／又は予防するための薬剤が十分な期間、有効量で投与すべきことを表示するラベルを含む。薬剤は、薬学的に許容される担体とともにＩＧＦ−Ｉ又はその類似体を含む。
【０１０８】
治療への応用として、ＩＧＦ−Ｉ又はその類似体は、単独で、又は１つ若しくはそれ以上の許容される担体及び場合により他の医薬成分とともにＩＧＦ−Ｉ又はその類似体を含む薬剤組成物の一部として、患者に好適に投与することができる。１つ又は複数の担体は、製剤の他の成分と適合し、そしてその受容者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【０１０９】
本発明の薬剤組成物は、経口、鼻内、局所（口腔（buccal）及び舌下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、微小透析及び皮内）投与に好適な組成物を含む。製剤は単位剤形、例えば錠剤及び徐放性カプセル剤の形態で、及びリポソームで便利に与えられ、そして調剤の技術分野でよく知られた任意の方法によって調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)を参照されたい。
【０１１０】
そのような調製方法は、１つ又はそれ以上の副成分から成る担体などの成分を、投与すべき分子との関連をもたらす工程を含む。一般的に、組成物は、有効成分を液体担体、リポソーム又は微粉化した固体担体、又はその両方と一様にそして緊密に関連させ、そして必要に応じて次に製品を成形することにより調製される。
【０１１１】
経口投与に好適な本発明の組成物は、所定量の有効成分を各々含有するカプセル剤、カシェ剤又は錠剤などのような別個の単位として；散剤又は顆粒剤として；液剤又は水性液体若しくは非水液体中の懸濁剤として；又は水中油液体乳剤又は油中水液体乳剤、又はリポソーム剤に包装され及びボーラス剤としてなど；与えられてもよい。
【０１１２】
錠剤は、場合により１つ又はそれ以上の副成分とともに圧縮又は成型することにより調製することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの自由流動形態の有効成分を、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性又は分散剤と混合して、好適な機械で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、不活性液体希釈剤により湿潤化した粉末化合物の混合物を、好適な機械で成型することにより製造することができる。錠剤は、場合により、中の有効成分の徐放又は制御放出を可能にするように、コーティング又は分割されてもよい。
【０１１３】
局所投与に好適な組成物としては、矯味矯臭した基剤、通常は蔗糖及びアカシア又はトラガント中に成分を含むトローチ剤；及びゼラチン及びグリセリン、又は蔗糖及びアカシアなどの不活性基剤中に有効成分を含むパステル剤が挙げられれる。
【０１１４】
非経口的投与に好適な組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質を含有してよい水性及び非水無菌注射用液剤；並びに懸濁化剤及び濃稠化剤を含有してよい水性及び非水性無菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単回投与又は反復投与の容器、例えば密封したアンプル及びバイアルで与えられ、そして滅菌液体担体、例えば注射用水の使用直前の添加のみを必要とする凍結乾燥(凍乾)状態で保存することができる。即時注射液剤及び懸濁剤は、滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【０１１５】
上に述べられ、開示された実施態様は単に例として与えられただけであり、本発明を限定すべきものではない。下記の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内の、他の解決、使用、目的、及び機能は、当業者には明らかなはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む組成物であって、該組み合わせが、等モルより低い、好ましくは１：２０〜１：３．３３の範囲にあるＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比を有する組成物。
【請求項２】
ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）がＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＩＧＦ−Ｉの用量範囲が２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
早産の合併症が未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
使用が静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入の治療を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
使用が皮下、静脈内又は経口の治療を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
使用が静脈内の治療を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
治療が、生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＧＦ−Ｉ類似体がｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体がｒｈＩＧＦＢＰ−３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内基準以下の血清レベルのＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３を有する患者に投与することを含む、患者を早産合併症の発症から予防する方法であって、ここでＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルに患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを上げるために、等モルより低く、好ましくは１：２０〜１：３.３３の範囲にある、方法。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が、１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）がＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＧＦ−Ｉの用量範囲が２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症がＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
早産の合併症が未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
使用が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入の治療を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
使用が皮下、静脈内又は経口の治療を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
使用が静脈内の治療を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療が、生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＧＦ−Ｉ類似体がｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体がｒｈＩＧＦＢＰ−３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症を罹患している患者の治療に使用するための、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその類似体をインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）又はその類似体と組み合わせて含む組成物であって、該組み合わせが、等モルより低い、好ましくは１：２０〜１：３．３３の範囲にあるＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比を有する組成物。
【請求項２】
ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）がＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＩＧＦ−Ｉの用量範囲が２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
早産の合併症が未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
使用が静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入の治療を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
使用が皮下、静脈内又は経口の治療を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
使用が静脈内の治療を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
治療が、生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＧＦ−Ｉ類似体がｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体がｒｈＩＧＦＢＰ−３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
有効量のＩＧＦ−Ｉ又はその類似体をＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）又はその類似体と組み合わせて、子宮内基準以下の血清レベルのＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３を有する患者に投与することを含む、患者を早産合併症の発症から予防する方法であって、ここでＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルに患者のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを上げるために、等モルより低く、好ましくは１：２０〜１：３.３３の範囲にある、方法。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ対ＩＧＦＢＰのモル比が、１：２０〜１：４、好ましくは１：１５〜１：５、より好ましくは１：１２〜１：８の範囲にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、患者の在胎期間に対応するモル比を有する血清中濃度を達成するために、そのＩＧＦＢＰ含量に関して連続的に調整される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）がＩＧＦＢＰ−３又はその類似体である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＧＦ−Ｉの用量範囲が２４時間当り５〜４５０μｇ／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症がＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の低循環レベルに関連する状態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、発達遅滞、精神発達遅滞、気管支肺異形成、脳室内出血及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む群からの１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
早産の合併症が未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
早産、極早産及び／又は超早産の合併症が、患者の在胎期間の正常レベルに対応する子宮内レベルの基準以下のＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦＢＰ−３の血清レベルを有する患者によって示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
使用が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、微小透析及び吸入の治療を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
使用が皮下、静脈内又は経口の治療を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
使用が静脈内の治療を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療が、生後５日以前に、好ましくは生後４日以前に、より好ましくは生後３日以前に、最も好ましくは生後２日以前に開始される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＧＦ−Ｉ類似体がｒｈＩＧＦ−Ｉであり、そしてＩＧＦＢＰ−３類似体がｒｈＩＧＦＢＰ−３である、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５２４９２８（Ｐ２０１０−５２４９２８Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４０１８（Ｐ２０１０−５０４０１８）
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０４４１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０３１５
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０９２８７９６８）プレーマクレ・アクチエボラーグ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０４４１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０３１５
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０９２８７９６８）プレーマクレ・アクチエボラーグ (1)
【Ｆターム（参考）】
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