栄養状態の管理方法及び管理用キット
【課題】疾患治療のための、迅速、簡便かつ特異性の高い栄養状態の管理方法及びキットを提供する。
【解決手段】血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定するに当たり、総分岐鎖アミノ酸をロイシンデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを用いて測定し、チロシンをチロシンデヒドロゲナーゼまたはβ−チロシナーゼを用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法および管理用キット。
【解決手段】血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定するに当たり、総分岐鎖アミノ酸をロイシンデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを用いて測定し、チロシンをチロシンデヒドロゲナーゼまたはβ−チロシナーゼを用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法および管理用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養管理、治療におけるアミノ酸測定を、迅速、簡便、効率よく実施可能な栄養状態の管理方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
栄養管理は、すべての疾患治療のうえで共通する基本的医療の一つである。近年、ＮＳＴ（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｔｅａｍ）という患者の栄養状態をチームで評価していくという考え方が普及し始めている。背景として診断群分類（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＤＰＣ）の導入が挙げられ、在院日数を短縮する目的で患者の栄養アセスメント（栄養状態の客観的評価）の重要性が認識されてきていると考えられる。
【０００３】
栄養状態を評価する指標として、栄養摂取量、窒素平衡、身体計測、血漿蛋白、免疫能などが挙げられる。臨床検査分野で測定される血液生化学検査は種々あるが、このうち、総蛋白、血清アルブミン（ＡＬＢ）が日常の検査で測定されている。
【０００４】
しかし、ＡＬＢの半減期は２０日前後と長い他、膠質浸透圧維持が必要な疾患ではアルブミン製剤が投与される場合もあり、その測定値は人為的に変化することがある。一方、血漿中アミノ酸は栄養状態を反映する指標の一つであるが、アミノ酸は半減期が短くアルブミンに比べ代謝が早いことから、栄養状態を把握する良好な指標とされる。
【０００５】
血漿中アミノ酸の測定方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法があるが、本法は除蛋白などの前処理が必要であり、測定に時間を要すなど、臨床検査室における多検体処理には不向きである。また、複数のアミノ酸を測定する場合は個々のアミノ酸を分画定量することとなり煩雑かつ高価となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は迅速、簡便かつ特異性の高い栄養状態の管理方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することにより、肝機能のみならず栄養状態を管理することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、肝機能の評価指標として用いられるが、肝硬変患者において高蛋白食療法か、ＢＣＡＡ（バリン、ロイシン、イソロイシン）製剤の投与かの治療選択を行ない、ＢＣＡＡ製剤が投与される場合であっても、アミノ酸は半減期が短くアルブミンに比べ代謝が早いことから、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比が栄養状態を把握する良好な指標となりうることを見出した。
上記課題に鑑み、本発明は、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法に関する。
本発明でいう栄養状態の管理方法とは、例えば入退院時期の判定などが例示される。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
項１．血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法。
項２．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項３．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項４．チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項５．採取した血清または血漿が、アミノ酸製剤を静脈内投与するかまたは経口投与した後に採取されたものである項１に記載の栄養状態の管理方法。
項６．チロシンを酵素を用いて測定する方法が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である項１または５に記載の栄養状態の管理方法。
項７．血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キット。
項８．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項９．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項１０．チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項１１．チロシンの測定が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することにより、患者の栄養状態を迅速、簡便かつ特異性よく評価することができ、さらには治療方針の早期判断に寄与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の栄養状態の管理方法における、総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の測定方法は、酵素を用いた方法であれば特に限定されないが、たとえば以下の方法が挙げられる。
（１）ＢＣＡＡに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法。たとえば図１のような方法が例示される。
（２）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法。
（３）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤをピルビン酸存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成せしめ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（４）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤをスーパーオキシドジスムターゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（５）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤを還元型ＮＡＤオキシダーゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（６）ＢＣＡＡにバリンデカルボキシラーゼを作用させモノアミンとし、生成したモノアミンをモノアミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（７）ＢＣＡＡに酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型チオＮＡＤに導く方法。
【００１１】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるＢＣＡＡ分解酵素としては、特に限定されないが、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼが挙げられる。ロイシンデヒドロゲナーゼはバチルス・スフアエリカスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、バリンデカルボキシラーゼはプロテウス・ブルガリスより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１２】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる色源体としては、特に限定されないが、例えば水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１３】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるロイコ色素として、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１４】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるテトラゾリウム塩として、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム クロライド］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム クロライド、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］ −３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、などが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１５】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる可視部測定可能な補酵素としてチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰなどが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１６】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる電子伝達体としては、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メルドラブルーが挙げられる。電子伝達体の反応液中の初期濃度としては、０．００１〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００１７】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・ＳＰが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１８】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる還元型ＮＡＤオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いられる。
【００１９】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる緩衝剤としては、特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。好ましくは、グッド緩衝剤が挙げられ、グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。該緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整されるが、好ましくは酸化型ＮＡＤまたは酸化型チオＮＡＤを含有する試薬のｐＨを５〜７．５とし、酸化型チオＮＡＤを除く色源体を含有する試薬はｐＨ７．５〜９とするのが好ましい。
【００２０】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００２１】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２２】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００２３】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２４】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２５】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２６】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００２７】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる安定化剤としては、１−アリールセミカルバジド、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸又はホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定では検体中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、反応液中で０．１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１０Ｕ／ｍＬである。
【００２９】
本発明の栄養状態の管理方法における、チロシン（Ｔｙｒ）の測定方法は、酵素を用いた方法であれば特に限定されないが、たとえば以下の方法が挙げられる。
（１）ＴＹＲにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンをチラミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。たとえば図２のような方法が例示される。
（２）ＴＹＲにβ−チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成せしめ、ピルビン酸をチアミンピロホスフェート、フラビンアデニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成せしめ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（３）ＴＹＲにβ−チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成させ、還元型ＮＡＤ存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成させ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
この中で好ましい態様としては、（１）が挙げられ、ＴＹＲ分解酵素として、チロシンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定では、チロシンと同じ芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンの影響を低減することで特異性、再現性を改善することがわかった。具体的にはフェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２６％以下であることが好ましい。
【００３１】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができるＴＹＲ分解酵素としては、特に限定されないが、チロシンデカルボキシラーゼ、β−チロシナーゼが挙げられ、各々フェニルアラニンに対する作用性が低いものが好ましい。また、フェニルアラニン分解酵素のコンタミネーションを公知の精製法で低減したものが好ましい。チロシンデカルボキシラーゼはストレプトコッカス・フアエカリスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、β−チロシナーゼはエシェリシア・インターメディアより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３２】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる緩衝剤としては、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。好ましくは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、である。
【００３３】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる緩衝剤の濃度としては、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには５．５〜８が好ましい。中でも６〜７が好ましい。また、その他、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのアミンを含まない緩衝剤と組み合わせて用いることができる。
【００３４】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３５】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができるロイコ色素として、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３６】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００３７】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００３８】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００３９】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４０】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００４１】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００４２】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００４３】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定ではその他に、安定化剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼなどを含有してよい。安定化剤としては、ピリドキサール５’−リン酸、アルブミンなどが挙げられる。
【００４４】
本発明の栄養状態の管理方法における、総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、上記測定方法によりそれぞれ求めたＢＣＡＡ値およびチロシン値から計算で求めることができる。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キットである。本発明のキットは上記の組成を適宜選択して製造することができる。
【００４６】
チロシンとフェニルアラニンは血中における代謝の動きが異なる。
分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、従来、分岐アミノ酸／芳香族アミノ酸モル比（フィッシャー比）で見ていたのを分岐アミノ酸／チロシンモル比で見ている。
肝機能を見る分においては多少Ｐｈｅの影響があっても良かったが、栄養状態の管理方法においては、高蛋白食療法またはＢＣＡＡ（バリン、ロイシン、イソロイシン）製剤の投与などの治療が同時に行なわれ、血中のアルブミンまたは測定対象と異なるアミノ酸の濃度が変動することがあり、これらの影響なく精密な測定が必要となる。
よって、本発明の栄養状態の管理方法は、チロシンを酵素を用いて測定する方法において、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下であることが好ましい。さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは、１５％以下、最も 好ましくは１０％以下である。
【００４７】
本発明のキットには、試薬あるいはセンサーなどの形態も含まれる。
【００４８】
本発明のキットの構成は、保存安定性や分析機器への適用性などを考慮して適宜設定してよい。
【００４９】
本発明のキットの物性は、溶液、凍結乾燥、粉末などいずれでもよい。
【００５０】
本発明のキットは、使用時に合わせて使用することを前提に、２以上に分割されていてもよい。
【００５１】
本発明のキットは、そのまま分析に用いることができる形態でもよいし、一部の組成を欠いた状態のもので使用時にそれらを補充して用いる形態のものでもよい。このようなものとして、たとえば、乾燥状態のキットであって使用時に精製水や緩衝液などを加えるよう構成されているものが例示される。
【００５２】
本発明の栄養状態の管理方法では、個人の血清または血漿のＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値、またはＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について、食事療法または各種アミノ酸などの栄養輸液治療前後に測定を行なうか、または日常管理では定期的に測定を実施し、モニタリングすることで治療効果または個人の栄養状態の変化を妨害物質の影響なく正確に把握することができる。具体的には血中のＢＣＡＡ濃度の上昇、ＴＹＲ濃度の低下、またはＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）の上昇は栄養状態が改善されていることを示唆するが、これらの測定値または変動幅により栄養状態を判定することができる。
【００５３】
また、従来、肝機能検査であるFischer比といわれるＢＣＡＡ値／芳香族アミノ酸モル比が慢性肝炎における栄養状態の把握に有用とされているが、本法は液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることから測定が煩雑である。本発明の栄養状態の管理方法は、Fischer比と異なり、栄養指標として挙動の異なるチロシン、フェニルアラニンを総芳香族アミノ酸として測定せずチロシンだけを測定し、各アミノ酸の測定においては、ＢＣＡＡ値はロイシンデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼなどの酵素を用い、チロシン測定はフェニルアラニンに対する作用を低減させたチロシンデカルボキシラーゼなどの酵素を用い高感度発色系に導くことで生化学自動分析機で簡便に測定することから、簡便、迅速、かつ正確に栄養状態を判定することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００５５】
（試薬の調製）
下記組成からなるＢＣＡＡ測定試薬を調製した。
（実施例１）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５６】
実施例１のＢＣＡＡ測定試薬を用いて、下記の測定条件にて同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ、IIＸ（シスメックス社）９容に対しＬ−チロシン水溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を１容添加混合したものを試料とし各々ｎ＝５で測定し平均値、標準偏差、変動係数ＣＶ（％）を算出した。また、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００５７】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５００μｍｏｌ／Ｌイソロイシン水溶液の測定吸光度より算出しＢＣＡＡ濃度として求めた。
【００５８】
【表１】
【００５９】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。また、同時再現性はＣＶ＜１％以下であり、良好な再現性であった。
【００６０】
（試薬の調製）
下記組成からなるＴＹＲ測定試薬を調製した。
（実施例２）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５−リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００６１】
上記、実施例２のＴＹＲ測定試薬を用いて、同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ、IIＸ（シスメックス社）９容に対しＬ−チロシン水溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を１容添加混合したものを試料とし各々ｎ＝５で測定し平均値、標準偏差、変動係数ＣＶ（％）を算出した。また、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００６２】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料３．５μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００μｍｏｌ／ＬＬ−チロシン水溶液の測定吸光度より算出しチロシン濃度として求めた。
【００６３】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。また、同時再現性はＣＶ＜１％以下であり、良好な再現性であった。
【００６４】
次に実施例１のＢＣＡＡ測定試薬および実施例２のＴＹＲ測定試薬の測定値よりＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）を算出し、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００６５】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。
【００６６】
次に実施例２のＴＹＲ測定試薬を用いて、１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液、１００μｍｏｌ／ＬＬ−チロシン水溶液を試料として測定した。測定した結果は、チロシン測定値１００μｍｏｌ／Ｌの測定値を１００％として１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液の測定値（Ｌ−チロシン換算値）の相対％を算出した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
結果 表２に示す。チロシン測定値１００μｍｏｌ／Ｌの測定値を１００％とした場合の１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液の測定値（Ｌ−チロシン換算値）の相対％は７．１％であり、２５％以下と良好な特異性であった。
【００６９】
（実施例３）
実施例１、２のＢＣＡＡおよびＴＹＲ測定試薬を用いて、１０ｇ／ｄＬヒト血清アルブミン水溶液と市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）を１：１で添加混合した試料およびヒト血清アルブミン溶液に変えて精製水とした試料を測定し、ヒト血清アルブミンの影響を検討した。測定値はＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値およびＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について検討した。測定した結果は、各々ヒト血清アルブミン添加血清の測定値をヒト血清アルブミンに変えて精製水添加血清の測定値を１００％として相対％を算出した。
【００７０】
【表３】
【００７１】
結果 表３に示す。ＢＣＡＡ、ＴＹＲ、ＢＴＲいずれにおいてもヒト血清アルブミンを添加した血清測定値はほぼ１００％と測定され、ヒト血清アルブミンの影響なく測定されていることが確認された。このことから、栄養管理としてアルブミンを指標とすると測定時にアルブミン製剤投与の影響を受けるが、本発明では測定時にアルブミン製剤投与の影響を受けないことを示唆する結果である。
【００７２】
（実施例４）
実施例１のＢＣＡＡ測定試薬および、実施例２のＴＹＲ測定試薬の第一試薬、第二試薬のｐＨを６．０、６．５、７．０、７．５と変えて、５０００または１００００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液と市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）を１：９で添加混合した試料およびフェニルアラニン水溶液に変えて精製水とした試料を測定し、フェニルアラニンの影響を検討した。測定値はＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値およびＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について検討した。測定した結果は、各々フェニルアラニン添加血清の測定値をフェニルアラニンに変えて精製水添加血清の測定値を１００％として相対％を算出した。
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】
結果 表４、５に示す。ＢＣＡＡ、ＴＹＲ、ＢＴＲいずれにおいてもフェニルアラニンを添加した血清測定値はほぼ１００±２５％以内で測定されることがわかる。ＴＹＲ試薬ｐＨによりフェニルアラニンの影響度は異なり改善することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の栄養状態の管理方法及び管理用キットは、臨床検査などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＢＣＡＡ測定法の例示。
【図２】チロシン測定法の例示。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養管理、治療におけるアミノ酸測定を、迅速、簡便、効率よく実施可能な栄養状態の管理方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
栄養管理は、すべての疾患治療のうえで共通する基本的医療の一つである。近年、ＮＳＴ（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｔｅａｍ）という患者の栄養状態をチームで評価していくという考え方が普及し始めている。背景として診断群分類（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＤＰＣ）の導入が挙げられ、在院日数を短縮する目的で患者の栄養アセスメント（栄養状態の客観的評価）の重要性が認識されてきていると考えられる。
【０００３】
栄養状態を評価する指標として、栄養摂取量、窒素平衡、身体計測、血漿蛋白、免疫能などが挙げられる。臨床検査分野で測定される血液生化学検査は種々あるが、このうち、総蛋白、血清アルブミン（ＡＬＢ）が日常の検査で測定されている。
【０００４】
しかし、ＡＬＢの半減期は２０日前後と長い他、膠質浸透圧維持が必要な疾患ではアルブミン製剤が投与される場合もあり、その測定値は人為的に変化することがある。一方、血漿中アミノ酸は栄養状態を反映する指標の一つであるが、アミノ酸は半減期が短くアルブミンに比べ代謝が早いことから、栄養状態を把握する良好な指標とされる。
【０００５】
血漿中アミノ酸の測定方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法があるが、本法は除蛋白などの前処理が必要であり、測定に時間を要すなど、臨床検査室における多検体処理には不向きである。また、複数のアミノ酸を測定する場合は個々のアミノ酸を分画定量することとなり煩雑かつ高価となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は迅速、簡便かつ特異性の高い栄養状態の管理方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することにより、肝機能のみならず栄養状態を管理することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、肝機能の評価指標として用いられるが、肝硬変患者において高蛋白食療法か、ＢＣＡＡ（バリン、ロイシン、イソロイシン）製剤の投与かの治療選択を行ない、ＢＣＡＡ製剤が投与される場合であっても、アミノ酸は半減期が短くアルブミンに比べ代謝が早いことから、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比が栄養状態を把握する良好な指標となりうることを見出した。
上記課題に鑑み、本発明は、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法に関する。
本発明でいう栄養状態の管理方法とは、例えば入退院時期の判定などが例示される。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
項１．血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法。
項２．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項３．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項４．チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを用いた方法である項１に記載の栄養状態の管理方法。
項５．採取した血清または血漿が、アミノ酸製剤を静脈内投与するかまたは経口投与した後に採取されたものである項１に記載の栄養状態の管理方法。
項６．チロシンを酵素を用いて測定する方法が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である項１または５に記載の栄養状態の管理方法。
項７．血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キット。
項８．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項９．総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項１０．チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを含有したものである項７に記載の栄養状態の管理用キット。
項１１．チロシンの測定が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することにより、患者の栄養状態を迅速、簡便かつ特異性よく評価することができ、さらには治療方針の早期判断に寄与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の栄養状態の管理方法における、総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の測定方法は、酵素を用いた方法であれば特に限定されないが、たとえば以下の方法が挙げられる。
（１）ＢＣＡＡに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法。たとえば図１のような方法が例示される。
（２）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法。
（３）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤをピルビン酸存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成せしめ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（４）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤをスーパーオキシドジスムターゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（５）ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤを還元型ＮＡＤオキシダーゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（６）ＢＣＡＡにバリンデカルボキシラーゼを作用させモノアミンとし、生成したモノアミンをモノアミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（７）ＢＣＡＡに酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型チオＮＡＤに導く方法。
【００１１】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるＢＣＡＡ分解酵素としては、特に限定されないが、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼが挙げられる。ロイシンデヒドロゲナーゼはバチルス・スフアエリカスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、バリンデカルボキシラーゼはプロテウス・ブルガリスより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１２】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる色源体としては、特に限定されないが、例えば水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１３】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるロイコ色素として、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１４】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるテトラゾリウム塩として、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム クロライド］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム クロライド、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］ −３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、などが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１５】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる可視部測定可能な補酵素としてチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰなどが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１６】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる電子伝達体としては、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メルドラブルーが挙げられる。電子伝達体の反応液中の初期濃度としては、０．００１〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００１７】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・ＳＰが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１８】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる還元型ＮＡＤオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いられる。
【００１９】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる緩衝剤としては、特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。好ましくは、グッド緩衝剤が挙げられ、グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。該緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整されるが、好ましくは酸化型ＮＡＤまたは酸化型チオＮＡＤを含有する試薬のｐＨを５〜７．５とし、酸化型チオＮＡＤを除く色源体を含有する試薬はｐＨ７．５〜９とするのが好ましい。
【００２０】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００２１】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２２】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００２３】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２４】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２５】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２６】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００２７】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定に用いることができる安定化剤としては、１−アリールセミカルバジド、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸又はホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
本発明の方法において、ＢＣＡＡ測定では検体中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、反応液中で０．１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１０Ｕ／ｍＬである。
【００２９】
本発明の栄養状態の管理方法における、チロシン（Ｔｙｒ）の測定方法は、酵素を用いた方法であれば特に限定されないが、たとえば以下の方法が挙げられる。
（１）ＴＹＲにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンをチラミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。たとえば図２のような方法が例示される。
（２）ＴＹＲにβ−チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成せしめ、ピルビン酸をチアミンピロホスフェート、フラビンアデニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成せしめ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
（３）ＴＹＲにβ−チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成させ、還元型ＮＡＤ存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成させ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法。
この中で好ましい態様としては、（１）が挙げられ、ＴＹＲ分解酵素として、チロシンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定では、チロシンと同じ芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンの影響を低減することで特異性、再現性を改善することがわかった。具体的にはフェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２６％以下であることが好ましい。
【００３１】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができるＴＹＲ分解酵素としては、特に限定されないが、チロシンデカルボキシラーゼ、β−チロシナーゼが挙げられ、各々フェニルアラニンに対する作用性が低いものが好ましい。また、フェニルアラニン分解酵素のコンタミネーションを公知の精製法で低減したものが好ましい。チロシンデカルボキシラーゼはストレプトコッカス・フアエカリスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、β−チロシナーゼはエシェリシア・インターメディアより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３２】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる緩衝剤としては、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。好ましくは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、である。
【００３３】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる緩衝剤の濃度としては、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには５．５〜８が好ましい。中でも６〜７が好ましい。また、その他、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのアミンを含まない緩衝剤と組み合わせて用いることができる。
【００３４】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３５】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができるロイコ色素として、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３６】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００３７】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００３８】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００３９】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４０】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００４１】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００４２】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定に用いることができる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００４３】
本発明の方法において、ＴＹＲ測定ではその他に、安定化剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼなどを含有してよい。安定化剤としては、ピリドキサール５’−リン酸、アルブミンなどが挙げられる。
【００４４】
本発明の栄養状態の管理方法における、総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、上記測定方法によりそれぞれ求めたＢＣＡＡ値およびチロシン値から計算で求めることができる。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キットである。本発明のキットは上記の組成を適宜選択して製造することができる。
【００４６】
チロシンとフェニルアラニンは血中における代謝の動きが異なる。
分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比は、従来、分岐アミノ酸／芳香族アミノ酸モル比（フィッシャー比）で見ていたのを分岐アミノ酸／チロシンモル比で見ている。
肝機能を見る分においては多少Ｐｈｅの影響があっても良かったが、栄養状態の管理方法においては、高蛋白食療法またはＢＣＡＡ（バリン、ロイシン、イソロイシン）製剤の投与などの治療が同時に行なわれ、血中のアルブミンまたは測定対象と異なるアミノ酸の濃度が変動することがあり、これらの影響なく精密な測定が必要となる。
よって、本発明の栄養状態の管理方法は、チロシンを酵素を用いて測定する方法において、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下であることが好ましい。さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは、１５％以下、最も 好ましくは１０％以下である。
【００４７】
本発明のキットには、試薬あるいはセンサーなどの形態も含まれる。
【００４８】
本発明のキットの構成は、保存安定性や分析機器への適用性などを考慮して適宜設定してよい。
【００４９】
本発明のキットの物性は、溶液、凍結乾燥、粉末などいずれでもよい。
【００５０】
本発明のキットは、使用時に合わせて使用することを前提に、２以上に分割されていてもよい。
【００５１】
本発明のキットは、そのまま分析に用いることができる形態でもよいし、一部の組成を欠いた状態のもので使用時にそれらを補充して用いる形態のものでもよい。このようなものとして、たとえば、乾燥状態のキットであって使用時に精製水や緩衝液などを加えるよう構成されているものが例示される。
【００５２】
本発明の栄養状態の管理方法では、個人の血清または血漿のＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値、またはＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について、食事療法または各種アミノ酸などの栄養輸液治療前後に測定を行なうか、または日常管理では定期的に測定を実施し、モニタリングすることで治療効果または個人の栄養状態の変化を妨害物質の影響なく正確に把握することができる。具体的には血中のＢＣＡＡ濃度の上昇、ＴＹＲ濃度の低下、またはＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）の上昇は栄養状態が改善されていることを示唆するが、これらの測定値または変動幅により栄養状態を判定することができる。
【００５３】
また、従来、肝機能検査であるFischer比といわれるＢＣＡＡ値／芳香族アミノ酸モル比が慢性肝炎における栄養状態の把握に有用とされているが、本法は液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることから測定が煩雑である。本発明の栄養状態の管理方法は、Fischer比と異なり、栄養指標として挙動の異なるチロシン、フェニルアラニンを総芳香族アミノ酸として測定せずチロシンだけを測定し、各アミノ酸の測定においては、ＢＣＡＡ値はロイシンデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼなどの酵素を用い、チロシン測定はフェニルアラニンに対する作用を低減させたチロシンデカルボキシラーゼなどの酵素を用い高感度発色系に導くことで生化学自動分析機で簡便に測定することから、簡便、迅速、かつ正確に栄養状態を判定することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００５５】
（試薬の調製）
下記組成からなるＢＣＡＡ測定試薬を調製した。
（実施例１）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５６】
実施例１のＢＣＡＡ測定試薬を用いて、下記の測定条件にて同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ、IIＸ（シスメックス社）９容に対しＬ−チロシン水溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を１容添加混合したものを試料とし各々ｎ＝５で測定し平均値、標準偏差、変動係数ＣＶ（％）を算出した。また、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００５７】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５００μｍｏｌ／Ｌイソロイシン水溶液の測定吸光度より算出しＢＣＡＡ濃度として求めた。
【００５８】
【表１】
【００５９】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。また、同時再現性はＣＶ＜１％以下であり、良好な再現性であった。
【００６０】
（試薬の調製）
下記組成からなるＴＹＲ測定試薬を調製した。
（実施例２）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５−リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００６１】
上記、実施例２のＴＹＲ測定試薬を用いて、同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ、IIＸ（シスメックス社）９容に対しＬ−チロシン水溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を１容添加混合したものを試料とし各々ｎ＝５で測定し平均値、標準偏差、変動係数ＣＶ（％）を算出した。また、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００６２】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料３．５μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００μｍｏｌ／ＬＬ−チロシン水溶液の測定吸光度より算出しチロシン濃度として求めた。
【００６３】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。また、同時再現性はＣＶ＜１％以下であり、良好な再現性であった。
【００６４】
次に実施例１のＢＣＡＡ測定試薬および実施例２のＴＹＲ測定試薬の測定値よりＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）を算出し、既知濃度に対する相対％を算出した。
【００６５】
結果 表１に示す。既知濃度に対し、１００±５％以内であり良好な正確性であった。
【００６６】
次に実施例２のＴＹＲ測定試薬を用いて、１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液、１００μｍｏｌ／ＬＬ−チロシン水溶液を試料として測定した。測定した結果は、チロシン測定値１００μｍｏｌ／Ｌの測定値を１００％として１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液の測定値（Ｌ−チロシン換算値）の相対％を算出した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
結果 表２に示す。チロシン測定値１００μｍｏｌ／Ｌの測定値を１００％とした場合の１０００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液の測定値（Ｌ−チロシン換算値）の相対％は７．１％であり、２５％以下と良好な特異性であった。
【００６９】
（実施例３）
実施例１、２のＢＣＡＡおよびＴＹＲ測定試薬を用いて、１０ｇ／ｄＬヒト血清アルブミン水溶液と市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）を１：１で添加混合した試料およびヒト血清アルブミン溶液に変えて精製水とした試料を測定し、ヒト血清アルブミンの影響を検討した。測定値はＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値およびＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について検討した。測定した結果は、各々ヒト血清アルブミン添加血清の測定値をヒト血清アルブミンに変えて精製水添加血清の測定値を１００％として相対％を算出した。
【００７０】
【表３】
【００７１】
結果 表３に示す。ＢＣＡＡ、ＴＹＲ、ＢＴＲいずれにおいてもヒト血清アルブミンを添加した血清測定値はほぼ１００％と測定され、ヒト血清アルブミンの影響なく測定されていることが確認された。このことから、栄養管理としてアルブミンを指標とすると測定時にアルブミン製剤投与の影響を受けるが、本発明では測定時にアルブミン製剤投与の影響を受けないことを示唆する結果である。
【００７２】
（実施例４）
実施例１のＢＣＡＡ測定試薬および、実施例２のＴＹＲ測定試薬の第一試薬、第二試薬のｐＨを６．０、６．５、７．０、７．５と変えて、５０００または１００００μｍｏｌ／Ｌフェニルアラニン水溶液と市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）を１：９で添加混合した試料およびフェニルアラニン水溶液に変えて精製水とした試料を測定し、フェニルアラニンの影響を検討した。測定値はＢＣＡＡ値、ＴＹＲ値およびＢＴＲ値（ＢＣＡＡ測定値÷ＴＹＲ測定値）について検討した。測定した結果は、各々フェニルアラニン添加血清の測定値をフェニルアラニンに変えて精製水添加血清の測定値を１００％として相対％を算出した。
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】
結果 表４、５に示す。ＢＣＡＡ、ＴＹＲ、ＢＴＲいずれにおいてもフェニルアラニンを添加した血清測定値はほぼ１００±２５％以内で測定されることがわかる。ＴＹＲ試薬ｐＨによりフェニルアラニンの影響度は異なり改善することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の栄養状態の管理方法及び管理用キットは、臨床検査などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＢＣＡＡ測定法の例示。
【図２】チロシン測定法の例示。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法。
【請求項２】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項３】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項４】
チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項５】
採取した血清または血漿が、アミノ酸製剤を静脈内投与するかまたは経口投与した後に採取されたものである請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項６】
チロシンを酵素を用いて測定する方法が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である請求項１または５に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項７】
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キット。
【請求項８】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項９】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項１０】
チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項１１】
チロシンの測定が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項１】
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理方法。
【請求項２】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項３】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項４】
チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを用いた方法である請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項５】
採取した血清または血漿が、アミノ酸製剤を静脈内投与するかまたは経口投与した後に採取されたものである請求項１に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項６】
チロシンを酵素を用いて測定する方法が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である請求項１または５に記載の栄養状態の管理方法。
【請求項７】
血清または血漿中の総分岐鎖アミノ酸またはチロシンまたは総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を酵素を用いて測定することを特徴とする栄養状態の管理用キット。
【請求項８】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項９】
総分岐鎖アミノ酸の測定が、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項１０】
チロシンの測定が、チロシンデカルボキシラーゼまたはβ−チロシナーゼを含有したものである請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【請求項１１】
チロシンの測定が、フェニルアラニン１０００μｍｏｌ／Ｌの測定感度がチロシン１００μｍｏｌ／Ｌの測定感度の２５％以下である請求項７に記載の栄養状態の管理用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２６７６８４（Ｐ２００７−２６７６８４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９８２３３（Ｐ２００６−９８２３３）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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