核移植卵子の作製方法
【課題】体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における、発生率を向上させる方法の提供。
【解決手段】ドナー細胞の核を卵子に移植する工程と、核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程を包含する、核移植卵子の作製方法、および核移植した卵子を動物に移植してクローン動物を作製する方法。脱メチル化剤はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、ドナー細胞は卵丘細胞、繊維芽細胞、ＥＳ細胞から選択される。
【解決手段】ドナー細胞の核を卵子に移植する工程と、核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程を包含する、核移植卵子の作製方法、および核移植した卵子を動物に移植してクローン動物を作製する方法。脱メチル化剤はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、ドナー細胞は卵丘細胞、繊維芽細胞、ＥＳ細胞から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核移植卵子の作製方法に関する。詳細には、本発明は体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な種（ヒツジ、マウス、ウシなど）について体細胞の核移植技術を用いてクローン動物の作製に成功した例が報告されている。また、体細胞核移植によって得られたクローン胚を培養することによってヒトやマウス由来のｎｔＥＳ細胞（nuclear transfer embryonic stem cell）、すなわち体細胞由来のＥＳ細胞を樹立することが可能になった。
【０００３】
従来の体細胞核移植技術の最も大きな問題点は核移植後の胚の低い発生率であった。その後の研究から、クローン胚においてはＤＮＡやヒストンのメチル化修飾が通常の受精卵と比べて異常に高いことが報告され、これが低い発生率の原因であるとされてきた。
【０００４】
この過剰なメチル化に起因する核移植胚（クローン胚）の低い発生率を向上させるために、現在までに以下のような試みがなされている。例えば、ドナー細胞としての繊維芽細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンＡやＤＮＡメチル化酵素の阻害剤である５’−アザ−２’−デオキシシチジン等の薬剤の存在下で核移植前に培養することによって胚盤胞発生率が向上することが報告されている（非特許文献１）。また、不死化ウシ乳上皮細胞株（ＭＥＣＬ）、ウシ胎児繊維芽細胞（ＢＦＦ）をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である酪酸ナトリウムで処理した後に核移植に供することによって胚盤胞発生率が向上することも報告されている（非特許文献２）。これらの研究は、ドナー細胞の核を核移植前に受精卵の核に近づけた上で核を再プログラムすることによって発生率を向上させようとするものであった。しかしながら、その効果は小さく実用レベルまでの改善には至っていなかった。
【０００５】
一方、近年、生殖補助技術が発展し、ＲＯＳＩ（round spermatid injection）と呼ばれる核移植技術が開発された。この技術によって精子の前駆体であり本来受精能力のない精子細胞を用いて人工的受精をし、個体を作製できることが、ヒトやマウスについて報告されている。しかし、精子細胞を用いて得られた胚の発生率は低く、その原因はこれまで不明であった。
【０００６】
高い経済形質を有する特定のウシの増産や、医薬品などの生産に有用な遺伝子導入ウシを効率的に生産するために、体細胞クローン技術は極めて有用である。しかし、ウシのクローン胚の発生率は極めて低い（非特許文献１６、非特許文献１７）。ウシクローン胚の発生率を改善できれば、移植に用いる受胚雌を大幅に節約でき、その生産効率は著しく向上する。発生率を改善する方法として、ドナーとなる体細胞の細胞周期をＧ１期に調整する方法（非特許文献１８、非特許文献１９、特許文献１）や、作製したクローン胚での遺伝子発現を調べることで発生効率の高い胚を選別する方法（特許文献２）などがある。しかし、これらの方法は、細胞周期を調整するために熟練した技術を必要としたり、遺伝子の発現を調べるのに特殊な機器を要する。従って、容易な方法および技術によりウシのクローン胚の発生率を向上させることが求められていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−０５２３６９号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６８２８号公報
【非特許文献１】Enright, B.P. et al., Biol. Reprod., 69:896-901 (2003)
【非特許文献２】Shi, W. et al., Biol. Reprod., 69:301-309 (2003)
【非特許文献３】Ma, J. et al., Biol. Reprod., 64:1713-1721 (2001)
【非特許文献４】Chen, Y. et al., Cell Research, 13:251-263 (2003)
【非特許文献５】Wakayama, T. et al., Nature, 394:369-374 (1998)
【非特許文献６】Kishigami, S. et al., Biol. Reprode., 70:1863-1869 (2004)）
【非特許文献７】Christman, J.K., Oncogene, 21:5483-5495 (2002)
【非特許文献８】De Ruijter, A.J.M. et al., Biochem. J., 370:737-749 (2003)
【非特許文献９】Santos, F. et al., Curr. Biol., 13:1116-1121 (2003)
【非特許文献１０】Wakayama, T. et al., J. Reprod. Fertil., 112:11-17 (1998)
【非特許文献１１】Wakayama, T. et al., Nat. Genet., 22:127-128 (1999)
【非特許文献１２】Hooper, M. et al., Nature, 326:292-295 (1987)
【非特許文献１３】Kishigami, S. et al., Biol. Reprod., 70:1863-1869 (2004)
【非特許文献１４】Kishigami et al., Zygote, 12:321-327 (2004)
【非特許文献１５】Dean, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:13734-13738 (2001)
【非特許文献１６】Hill, J.R. et al., Biol. Reprod., 63:1787-1794 (2000)
【非特許文献１７】Heyman, Y., et al., Biol. Reprod., 66:6-13 (2002)
【非特許文献１８】Kasinathan, P. et al., Nat. Biotechnol., 12:1176-1178 (2001)
【非特許文献１９】Urakawa, M. et al., Theriogenology, 62:714-728 (2004)
【非特許文献２０】Robl, J.M. et al., J. Anim. Sci., 64:642-647 (1987)
【非特許文献２１】Tervit, H.R. et al., J. Reprod. Fertil., 30:493-497 (1972)
【非特許文献２２】Takahashi, Y. et al., Theriogenology, 37:963-978 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した。本発明者らは、マウスをモデル動物として精子細胞を用いた研究から過剰なメチル化が卵子内で核移植後に起こること、核移植後に抗メチル化剤で核移植卵子を処理することにより過剰なメチル化を抑制できること、この処理によりクローン胚の試験管内の発生やクローン動物の出産率が改善されること、精子細胞を用いて得られた胚についても同様の処理が発生改善に有効であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、従来技術のように核移植前のドナー細胞を抗メチル化剤で処理するのではなく、卵子へ核移植した後に抗メチル化剤での処理を実施して過剰なＤＮＡのメチル化を抑制することにより、核移植胚の低い発生率を大きく改善することができる。
【０００９】
なお、受精後の卵子を抗メチル化剤の一種であるヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、トリコスタチンＡで処理すると発生率が低下することが知られていたので（非特許文献３）、本発明者らによるこのような知見は予想外であった。
【００１０】
本発明の主な目的は体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
［１］以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程、
［２］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる［１］の方法。
［３］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［４］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ３２細胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［５］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ４細胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［６］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性化以前の期間に行われる［１］の方法。
［７］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［８］抗メチル化剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である［１］の方法、
［９］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がトリコスタチンＡまたはＡｐｉｃｉｄｉｎである［８］の方法、
［１０］卵子が除核卵子である［１］の方法、
［１１］ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞およびＥＳ細胞からなる群より選択される［１０］の方法、
［１２］ドナー細胞が精子細胞である［１］の方法、
［１３］以下の工程を包含するクローン動物作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
（ｃ）抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程、
［１４］［１］の方法で作製された核移植卵子、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、クローン動物の作製、クローン胚からのＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）の樹立、精子細胞を用いた不妊治療などの幅広い目的に使用される核移植技術の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の核移植卵子の作製方法は以下の工程を包含する：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
【００１４】
本発明によれば、さらに上記方法で得られた抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植することによりクローン動物が作製される。また、上記方法で作製された核移植卵子も本発明により提供される。
【００１５】
本発明において、卵子としては発生能力を有している任意の卵子を使用することができる。採卵は通常の方法に従って実施することができる。例えば、卵子は過排卵処理した動物から採取することができる。ドナー細胞として体細胞などを使用する場合は卵子の核を予め取り除いておく（除核する）ことが好ましく、一方、ドナー細胞として精子細胞を使用するＲＯＳＩのような場合は除核の必要はない。卵子は通常精子との受精で活性化され発生を開始するが、精子を使用しない場合は人為的に活性化させる必要がある。例えば、ドナー細胞の核を移植（注入）する前、移植と同時または移植の後に卵子を活性化する。卵子の活性化は卵子を塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）の存在下で培養することによって行うことができる。さらに、ドナー核の細胞周期によっては細胞骨格を壊し、極体の放出を防ぐためにサイトカラシンＢなどの薬剤を添加してもよい。卵子の活性化は、通常の受精卵の場合は第２極体の放出と雌雄２つの前核の形成によって確認されるが、クローン胚の場合は上記のように極体の放出を薬剤で抑えているので前核形成のみで判断する。
【００１６】
本発明において、ドナー細胞としては核を有する任意の細胞を使用することができる。ドナー細胞の例としては、卵丘細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血球細胞（Ｔ細胞など）などの体細胞、精子細胞などの生殖細胞、ＥＳ細胞が挙げられる。本発明による核移植においては、例えば体細胞から得られた核を卵子へ注入してもよく、また精子細胞の核領域を卵子へ注入してもよい。
【００１７】
ドナー細胞と卵子とは同種の生物に由来してもよく、異種の生物に由来してもよい。例えば、同種の哺乳動物に由来するドナー細胞と卵子の組合せを本発明に好ましく使用することができる。あるいは、ウサギやウシの卵子は異種の体細胞核を受け入れる能力を有していることが知られており、ウサギの卵子にヒトドナー細胞の核を注入してｎｔＥＳ細胞を樹立した例が報告されていることから（非特許文献４）、卵子とは異なる種の生物由来の核を注入することも可能である。このような異種間の核移植により、例えばヒトｎｔＥＳ細胞を作製するためのヒト卵子の不足を補うために他の種の卵子で代用することが可能になる。
【００１８】
ドナー細胞由来の核の卵子への注入は公知の方法に従って実施することができる。体細胞核の除核卵子への注入は例えば非特許文献５記載の方法に従って実施することができる。精子細胞の核領域の卵子への注入は非特許文献６記載の方法に従って実施することができる。あるいは、特許文献２に記載されるようにドナー細胞と除核卵子との細胞融合によってドナー細胞由来の核を卵子へ注入することもできる。また、上記文献に記載されているような公知の方法に従って核移植胚を動物の卵管に移植してクローン動物を作製することもできる。
【００１９】
本発明において任意の抗メチル化剤を使用することができる。抗メチル化剤は直接的または間接的にＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤である。例えば、メチル化酵素阻害剤またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を抗メチル化剤として使用することができる。特に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用することが好ましい。メチル化酵素阻害剤としては５’−アザシチジン、５’−アザ−２’−デオキシシチジンなどを使用することができる。５−アザシチジンはメチル化酵素であるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られている（非特許文献７）。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてはトリコスタチンＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ（アピシジン）などを使用することができる。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として使用可能な種々の薬剤が知られている（非特許文献８）。本発明によれば、これらを単独でまたは任意の組合せで用いることができる。
【００２０】
抗メチル化剤の培地中の濃度は、本発明の効果、すなわち発生率の向上を指標として適切に設定することができる。例えば、トリコスタチンＡの場合、濃度は例えば０．５〜５００ｎＭ、好ましくは５〜５０ｎＭである。ただし適切な濃度は使用する動物種や体細胞の種類などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適切な濃度を決定することができる。
【００２１】
抗メチル化剤での処理期間を、通常の発生過程において重要な遺伝子の抑制を阻害しないように設定することが好ましい。詳細には、抗メチル化剤での処理を、ゲノムの「再プログラミング」（体細胞などの核を受精卵様の核にもどす過程、「初期化」ともいう）に際してヒストンのメチル化またはＤＮＡのメチル化を抑制するように行い、かつ再プログラミングに続く胚性遺伝子の活性化が始まる前に終了させることが好ましい。抗メチル化剤での処理は、例えば核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる。再メチル化の終了時期は発生中の胚におけるメチル化レベルを抗５−メチルシチジン抗体を用いた蛍光抗体法により経時的に５−メチルシトシンを測定することによって調べることができる。ただし、この方法により定量性が困難なため正確な終了時間の決定が難しい場合は、胚盤胞までの任意の時間において処理を終了し（拡張）胚盤胞への発生率が最も高かった処理時間を採用することが望ましい。発生の時期との関係でいえば、処理を核の移植後に開始し、胚盤胞までの任意の時点で終了することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、例えば核の移植以降かつ１細胞期終了以前の期間に、１細胞期のゲノムの再プログラムに際してヒストンまたはＤＮＡのメチル化を抑制するように行われる。具体的な処理時間も適切に設定することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、核の移植以降かつ卵子活性化の２０時間後までの期間、より好ましくは核移植以降かつ卵子活性化の１０時間後までの期間行われる。抗メチル化剤での処理が長すぎると通常の発生に重要な遺伝子抑制（再メチル化またはヒストン脱アセチル化による）が適切に行われず、むしろ発生が阻害される可能性がある。抗メチル化剤での適切な処理期間は使用する動物種などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適切な処理期間を決定することができる。
【００２２】
核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程（ｂ）を行うタイミングは、当該卵子を胚移植する前までであれば特に限定されるものではなく、対象となる動物種などに応じて適宜設定すればよい。但し、処理時間の過不足により胚発生の効率が充分には向上しなくなる虞を排除するために、好ましくは胚盤胞期終了以前の期間に、より好ましくは３２細胞期終了以前の期間に、さらに好ましくは１６細胞期、８細胞期、４細胞期、２細胞期、１細胞期終了以前の期間に処理を行うことが望まれる。
【００２３】
なお、抗メチル化剤での処理効率は、胚性遺伝子の活性化（zygotic gene activation）以前に処理を行うことで特に著しく向上する傾向があるようである。その理由は必ずしも定かではないが、例えばトリコスタチンＡは胚性遺伝子の活性化後に続いて起こる遺伝子発現の抑制状態（transcriptionally repressive state）を妨げ、その後の胚発生を阻害することが知られている（非特許文献３）。これと同様の機構が核移植胚においても働いていると推察される。この観点から考えると、マウスの場合には１細胞期終了以前に、ウシの場合には４細胞期終了以前に行うことが極めて好ましいと言える。
【００２４】
本発明の方法による発生率の向上を、クローン動物の出産率（移植胚数に対する出産クローン動物胎児数の比率）に基づいて確認することができる。あるいは、核移植した卵子を培養した際の拡張胚盤胞の形成率（核移植卵子数に対する胚盤胞発生の比率）を指標として本発明の方法の効果を調べることができる。これらの方法は下記実施例に詳細に記載されている。例えば、拡張胚盤胞への発生の確認は、活性化後９６時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、透明帯が薄くなったものを顕微鏡下で観察することによって行われる。本発明の方法によれば、例えば少なくとも３０％、好ましく４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上の胚盤胞形成率を達成することができる。また、本発明によれば、例えば少なくとも３％、好ましくは４％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上の出産率を達成することができる。胚盤胞形成率、出産率は、抗メチル化剤での処理をしない場合と比較して、例えば少なくとも１．５倍、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上向上する。
【００２５】
本発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子においては、父性（すなわちドナー細胞由来）ゲノムのメチル化の程度が低くなる。父性ゲノムのメチル化の程度は母性（すなわち卵子由来）ゲノムに対する父性ゲノムのメチル化レベルの百分率（％）として表すことができる。メチル化レベルは上記の抗５−メチルシチジン抗体を使用した測定によって決定ことができる。例えば、精子細胞の核領域を注入した卵子において、本発明の方法で作製された核移植卵子における上記値は例えば３０〜６０％、好ましくは４０〜５５％である。母性ゲノムに対する父性ゲノムのメチル化レベルの百分率（％）は、抗メチル化剤での処理をしない場合に比較して、例えば少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上低下する。
【００２６】
抗メチル化剤での処理を行わない場合、精子細胞核移植卵子においてはゲノムＤＮＡ全体の高メチル化が観察される。これに対して、抗メチル化剤での処理を含む本発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子においては動原体周囲以外の染色体部分にＤＮＡの低メチル化が観察される。一方、体細胞クローンについては、抗メチル化剤での処理を行わない場合にゲノムＤＮＡ全体の高メチル化およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の高メチル化が観察され、これらの両方が抗メチル化剤での処理によって低下する。従って、本発明の方法で作製された核移植卵子を、ゲノムＤＮＡの低メチル化（特に、動原体周囲以外の部分における）によって、さらにはヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の低メチル化によって特徴付けることができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
核移植胚の作製を含むクローンマウスの作製は、非特許文献５記載の方法に従った。詳細には、まず、過排卵処理のために８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）に妊娠ウマ血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を投与し、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与し、１６時間後に採卵を行った。採取した未受精卵から、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ存在下でマイクロマピュレーターを用いて核を除いた（除核）。
【００２９】
次いで、１．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液中に浮遊させたドナー体細胞としてのＢ６Ｄ２Ｆ１マウス由来の卵丘細胞の細胞膜を注入用のピペッティングにより破壊し、核をマイクロマニピュレーターを用いて除核卵子に注入した（核移植）。なお、核の注入のために必要な透明帯や細胞膜の穿孔のためのピエゾパルスの発生にはピエゾドライブ装置（プリマハム社製）を用いた。
【００３０】
得られた核移植卵子をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分〜１時間培養し、０．５、５、５０または５００ｎＭのトリコスタチンＡ（以下、ＴＳＡ）を含む卵子活性化溶液（５ｍＭ 塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）及び５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを補充したＣａ２＋不含ＣＺＢ培地（非特許文献１０））に移し、人工的に卵子の活性化を行って発生を開始させた。活性化開始から６時間後に前核形成を指標として卵子が活性化されたことを確認し、活性化核移植卵子を上記と同濃度のＴＳＡを含むＫＳＯＭ培地（Specialty Media社製）に移した。この培地中でさらに１４時間（活性化から２０時間）培養した。なお、コントロールとしてＴＳＡの代わりにＴＳＡの溶解に使用したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を同濃度になるように用いた。
【００３１】
その後、２細胞期の核移植胚をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察した。拡張胚盤胞への発生の確認は、活性化後９６時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、透明帯が薄くなったものを顕微鏡下で観察することによって行った。各濃度の実験区につき胚を８０個以上調べた。使用した核移植卵子数に対する胚盤胞発生の比率（胚盤胞形成率（％））を求めた。再構築した核移植卵子のうち卵割を開始した（すなわち２細胞期へ発生した）卵子数に対する拡張胚盤胞へと発生した比率（胚盤胞形成率（％））を求めた。
【００３２】
結果を図１および図２に示す。図２に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、５、５０、５００ｎＭの濃度のＴＳＡで処理した場合に胚盤胞発生率が増加した。
【実施例２】
【００３３】
実施例１と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植卵子を５ｎＭのＴＳＡを含有するＫＳＯＭ培地中で種々の時間（活性化から０、２４、４８または７２時間）培養した後ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
【００３４】
結果を図３および図４に示す。図４に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、活性化後２４時間または４８時間ＴＳＡで処理した場合には胚盤胞発生率が増加し、特に２４時間の処理では約４倍の増加が見られたが、活性化後７２時間処理した場合は、むしろ発生率は低下した。なお、活性化後２４時間目は２細胞期に相当し、４８時間目は４〜１６細胞期に相当し、７２時間目は胚盤胞の形成時期に相当する（図４参照）。
【実施例３】
【００３５】
実施例１と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植卵子を５ｎＭのＴＳＡを含有するＫＳＯＭ培地中で種々の時間（０時間、活性化から６時間、活性化から１０時間、活性化後１０時間目から２４時間目、または活性化から２４時間）培養した後ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
【００３６】
結果を図５に示す。図５に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、活性化後１０時間ＴＳＡで処理した場合に最も高い胚盤胞発生率が見られた。
【実施例４】
【００３７】
上記実施例３の結果に基づきＴＳＡ処理の胎児出産率に対する効果を調べた。５ｎＭまたは５０ｎＭ ＴＳＡで活性化後１０時間または２０時間処理した核移植卵子をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移した後、核移植胚をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移し、移植までこの培地中で培養した。クローンマウスを作製するために、核移植の翌日に２細胞期の胚を偽妊娠マウス（仮親、０．５日目）の卵管に移植した。偽妊娠処理は、発情前期のＩＣＲ系雌マウスを精管結紮雄およびＩＣＲ系雄マウスと１体１で交配させることにより行い、交配の成立はプラグ形成の有無により確認した。胚の移植後１９日目に帝王切開によりクローンマウスを出産させ、移植胚数に対する出産クローンマウス胎児数の比率（出産率）を求めた。図６に出産直後のクローンマウス胎児と胎盤（左）、および３週間後のクローンマウス（黒）と仮親（白）（右）を示す。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示すように、１０時間または２０時間のＴＳＡ処理により出産率は増加した。特に、１０時間ＴＳＡで処理した場合に５ｎＭおよび５０ｎＭのいずれの濃度でも高い出産率（コントロールの６倍以上）が得られた。なお、活性化後１０時間目は１細胞期に相当する。
【実施例５】
【００４０】
卵丘細胞に加え、繊維芽細胞および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をドナー細胞として用いて実施例１と同様の操作を行った。繊維芽細胞を、マウスの尻尾の断片を培養して得た（非特許文献１１）。ＥＳ細胞としてはＥ１４細胞を使用した（非特許文献１２）。
それぞれのドナー細胞由来の核を移植した卵子をＴＳＡで２０時間処理した後、ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。各細胞の実験区につき胚を３０個以上調べた。
【００４１】
結果を図７および８に示す。図８に示すように、いずれのドナー細胞由来の核を移植した場合も、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して高い胚盤胞発生率が見られた。
【実施例６】
【００４２】
ＴＳＡの代わりに５μＭのＡｐｉｃｉｄｉｎ（Sigma）を用いて実施例１と同様に核移植卵子の拡張胚盤胞への発生を観察したところ、コントロールの胚盤胞形成率２９．７％に対してＡｐｃｉｄｉｎ処理した場合は６９．０％であり、Ａｐｉｃｉｄｉｎ処理した場合に胚盤胞発生率が約２倍増加した。
【実施例７】
【００４３】
本発明によるＴＳＡ処理の円形精子細胞注入法（ＲＯＳＩ）に対する効果を調べた。ＲＯＳＩは非特許文献１３記載の方法に従った。
詳細には、まず、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与し、１６時間後に採取した卵子をＣＺＢ培地中に入れた。次いで卵子をＫＳＯＭ培地に移し、３７℃で５％ＣＯ２存在下でインキュベートした。
【００４４】
卵子を５ｍＭ塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）を補充したＣａ２＋不含ＣＺＢ培地中で２０分間インキュベートすることによって活性化した。４０〜８０分後に、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雄マウス（日本エスエルシー社製）から採取した円形精子細胞の核領域（約１０μｍの直径および中央に位置する明確な核によって特徴付けられる；非特許文献１４参照）を卵子に注入した。
【００４５】
核を注入した卵子を、５ｎＭ ＴＳＡを含むＫＳＯＭ培地に移し、活性化の１０時間後にＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移した。
【００４６】
精子細胞注入の翌日に２細胞期の胚を偽妊娠マウス（仮親、０．５日目）の卵管に移植した。胚の移植後１９日目に帝王切開により胎児を得、移植胚数に対する出産胎児数の比率（出産率）を求めた。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
その結果、ＴＳＡ処理をしないコントロールに比較してＴＳＡ処理した場合に出産率が約４倍増加した。
【実施例８】
【００４９】
ＲＯＳＩによって得られた円形精子細胞の核領域を注入した卵子を２０ｎｇ／ｍｌデメコルチンの存在下で、１０μＭ ５−アザシチジン（５−ａｚａ）、または５００ｎＭ ＴＳＡを抗メチル化剤として含有する培地中で２０時間培養した。同様に、成熟精子の注入を実施した（ＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection））。詳細には、頭部−尾部連結部にピエゾドライブピペット（PrimeTech）によってパルスをかけることによって尾部から分離した精子の頭部を卵子に注入した。この際、卵子の活性化は行わなかった。
【００５０】
培養した核注入卵子を４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中４℃で一晩固定化した後、０．１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するＰＢＳで洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中４℃で一晩ブロッキングした。以下の工程は室温で実施した。固定化した核注入卵子をＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温で処理することによって透過処理した。次いでこれを２Ｎ ＨＣｌで室温で５０分間処理し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）で中和し（非特許文献１５）、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで十分に洗浄した。
【００５１】
次いで０．１％ＰＶＡ含有ＰＢＳ中、抗５−メチルシチジン抗体（Eurogentec）と共に２〜３時間インキュベートした。十分に洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８二次抗体（Molecular Probes）で染色した卵子を、５μｇ／ｍｌ ４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で３０分間染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Laboratories）を用いて封入した。標本をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡（オリンパス）を用いて観察した。全ての画像をＯｌｙｍｐｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してＤＰ７０ Ｏｌｙｍｐｕｓデジタルカメラでとらえ、ＤＡＰＩ染色ＤＮＡおよび結合画像に彩色を施した。
【００５２】
前核ＤＮＡメチル化レベルの定量分析のために、蛍光画像をアメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）のプログラムＩｍａｇｅ−Ｊ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用した濃度分析に供した。各々の前核について、父性ゲノムの相対的メチル化強度を、母性ゲノムの蛍光強度の百分率として算出した。結果を表３に示す。なお表３において（ａ）抗メチル化剤無添加の場合対（ｂ）抗メチル化剤を添加した場合について、データを統計プログラムＳＰＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０（SPSS Inc.）を使用した多重平均比較のためのシェフェ検定によって解析した。全ての百分位数データを統計解析前に逆正弦変換に供した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３に示すように成熟精子を注入した場合（ＩＣＳＩ、抗メチル化剤なし）に比較して精子細胞を注入した場合（ＲＯＳＩ、抗メチル化剤なし）、父性ゲノムのメチル化レベルが高いことが確認された。精子細胞を導入した場合に見られる過剰なメチル化について経時的に調べたところ、注入６時間目までは精子細胞および成熟精子のいずれの場合も脱メチルがおこり、高度にメチル化されたままの母性ゲノムに比較して低いメチル化を示した。しかし、１０時間目では精子細胞を注入した場合に成熟精子に比較して高いメチル化が観察された。すなわち、精子細胞を注入した場合には父性ゲノムは一旦脱メチル化された後に過剰にメチル化されることが示された。
【００５５】
表３に示すように、上記の精子細胞を注入した場合に観察された父性ゲノムの過剰なメチル化はいずれの抗メチル化剤を使用した場合も低下した。
【００５６】
なお、ＴＳＡで処理した場合、父性ゲノムに見られるＤＮＡメチル化は主に各染色体のヒストンＨ３のＬｙｓ９の高メチル化によって示される動原体周囲領域に限られていた。すなわち、母性ゲノムのメチル化はＴＳＡ処理に耐性であるのに対し、父性ゲノムのメチル化の大部分はＴＳＡ処理に感受性であるが、ヒストンＨ３のＬｙｓ９の高メチル化によって示される動原体周囲領域におけるＤＮＡのメチル化はＴＳＡに対して耐性であった。
【実施例９】
【００５７】
実施例１に記載の方法で作製したＢ６Ｄ２Ｆ１系統マウス由来の卵子を用いて卵丘細胞由来のクローン胚を作製し、５００ｎＭ ＴＳＡ存在下または非存在下で１５時間（活性化時間を含む）培養した。その後、核移植胚を固定し、ＤＮＡのメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔＣ）及びヒストンＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化（Ｈ３Ｋ９ ｔｒｉｍｅｔ）を各抗体を用いて調べた。さらにＤＮＡをＤＡＰＩ染色した。各々１５個のクローン胚を使用した。結果を結合画像（Ｍｅｒｇｅ）とともに図９に示す。
【００５８】
ＴＳＡ未処理の実験区（図９左、「無」）では、これまで報告されているように（非特許文献９）ＤＮＡ及びヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の両方の高いメチル化が染色体全体に認められた。一方、ＴＳＡ処理した実験区（図９右、「有」）では、実施例８に記載の精子細胞を用いた場合と同様に、動原体周囲ではいずれのメチル化も顕著な低下はみられなかったものの、それ以外の染色体部分では両方のメチル化の低下が観察された。
【実施例１０】
【００５９】
ウシ再構築胚の作製とトリコスタチンＡによる処理
（１）ウシ卵子の採取と体外成熟
食肉処理場にてウシ屠体より採取したウシ卵巣を２５℃の生理食塩水に保存し、屠殺後６〜８時間以内に研究室まで輸送した。ウシ卵巣表面の直径２〜５ｍｍの卵胞から２１Ｇの注射針（テルモ、東京、日本）と１０ｍｌシリンジ（テルモ）を用いてウシ卵子を卵胞液と共に吸引し回収した。回収した卵胞液から、２〜４層の卵丘細胞が付着した卵子卵丘細胞複合体のみを選別し回収した。回収した卵子卵丘細胞複合体は、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）下の５０μｌの５％（ｖ／ｖ）新生子ウシ血清（Ｎｅｗ Ｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＮＢＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ、ＵＳＡ）、２５μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）添加の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝ＴＣＭ−１９９（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ、Ｇｉｂｃｏ、ｍ−ＴＣＭ１９９Ｅ）に、０．０２ＡＵ／ｍｌ卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、アントリン、川崎製薬、神奈川、日本）および１μｇ／ｍｌエストラディオール１７−β（Ｓｉｇｍａ）を添加した成熟用培養液の小滴に導入し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度下で２１時間成熟培養した。
【００６０】
（２）核移植
（ａ）ウシ卵子の裸化と除核
２１時間成熟培養した卵子卵丘細胞複合体を５％ＮＢＣＳ、２５μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）添加の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝ＴＣＭ−１９９（Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔｓ、Ｇｉｂｃｏ、ｍ−ＴＣＭ１９９Ｈ）に０．２５％（ｗ／ｖ）ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加した溶液内で５分間静置した。その後、卵子の周囲に付着した卵丘細胞をピペティング操作により完全に除去した。
【００６１】
卵丘細胞を除去した卵子をｍ−ＴＣＭ１９９Ｈ内に移し、倒立顕微鏡下で第一極体が放出された卵子のみを選別した。卵子の核を除去するため、第一極体付近の透明帯を微細なガラスニードルで切開し、これら卵子を５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）添加ｍ−ＴＣＭ１９９Ｈに移し１５分間静置した。その後、透明帯を切開したガラスニードルで卵子を上から押さえ、第一極体およびその周辺の卵細胞質を透明帯切開部位から卵子細胞質の容量の約１０〜２０％を除去することで除核した。除核の確認は、除去した卵細胞質を２０μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）含有ｍ−ＴＣＭ１９９Ｅに移し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度下で３０分間染色し、ＵＶ照射下で除核した卵細胞質内に核の有無を判定した。なお、以後の実験では、レシピエント除核卵子として除核した卵細胞質において核が確認できた除核卵子のみを供した。
【００６２】
（ｂ）ドナー細胞の調製と除核卵子への導入
核移植に用いるドナー細胞には、黒毛和種子ウシ耳介由来の繊維芽細胞を使用した。ドナー細胞を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、フナコシ、東京、日本）添加ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、ニッスイ、東京、日本）で８０％コンフルエント状態まで培養した後、０．４％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに培養液を交換し、７日間血清飢餓培養を行った。これら血清飢餓培養細胞を、０．０４％（ｗ／ｖ）エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（ＥＤＴＡ、ナカライテスク、京都、日本）添加の０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン（Ｓｉｇｍａ）溶液により培養皿から単離し、遠沈管で遠心処理により遠沈し細胞を回収した後、１０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、ＰＶＰ、ナカライテスク）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）（−）溶液中に懸濁した。単離した細胞を細胞導入用の微小ガラスピペットに吸引して、レシピエント除核卵子の透明帯切開部位から囲卵腔内に導入した。
【００６３】
（ｃ）電気融合処理
マイクロマニュピレーターに微小電極（ユニークメディカル イマダ、宮城、日本）をセットし、ＢＴＸ細胞融合装置（ＥＣＭ２００、ＢＴＸ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に接続した。細胞を導入したレシピエント除核卵子をＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ細胞融合液（非特許文献２０、表４にＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ細胞融合液の組成を示す）内に静かに移した。微小電極、卵子細胞質およびドナー細胞が一直線になるように両極から挟み、直流２．７ｋＶ／ｃｍ、１１μｓｅｃを２回印加することで除核卵子とドナー細胞とを融合して再構築胚を作製した。融合処理を行った後、再構築胚を５０μｌのｍ−ＴＣＭ１９９Ｅの小滴内へ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で３０分間培養した。培養後、実体顕微鏡下でドナー細胞と卵子細胞質との融合を確認した。なお、細胞融合の確認は、囲卵腔内のドナー細胞の有無により判定し、細胞を確認できない卵子を再構築胚とした。
【００６４】
【表４】
【００６５】
（ｄ）活性化処理
再構築胚は、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ、ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ）添加ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｄ−ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）に添加した５μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）溶液へ移し、５分間静置した。胚を直ちに、合成卵管液培養液（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｖｉｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＯＦＭ、非特許文献２１）に２０種類の必須および非必須アミノ酸を添加して修正した培養液（非特許文献２２）からさらに無機リン酸塩を除いた培養液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＦＭ、ｍＳＯＦＭ、表５に修正合成卵管液培養液（ｍＳＯＦＭ）の組成を示す）に１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養液５０μｌの小滴内に移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で６時間処理し、活性化処理を行った。
【００６６】
【表５】
【００６７】
（ｅ）体外培養
活性化処理を行った再構築胚をｍＳＯＦＭに移し、２回洗浄した。その後、胚を同培養液５０μｌの小滴内に２０〜３０個ずつ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で１６８時間（７日間）培養した。
【００６８】
（ｆ）トリコスタチンＡ処理
再構築胚のトリコスタチンＡ（ＴＳＡ、Ｓｉｇｍａ）処理は、活性化処理から４８時間行った。ＴＳＡはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）で溶解し、活性化処理の溶液およびｍＳＯＦＭにそれぞれ添加した（ＤＭＳＯの最終濃度は０．０５％とした）。対照区として０．０５％のＤＭＳＯのみを活性化処理の溶液およびｍＳＯＦＭに添加した。ＴＳＡは５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭの濃度で処理した。活性化後４８時間にＴＳＡ処理した再構築胚をｍＳＯＦＭで２回洗浄した後、胚を同培養液５０μｌの小滴に２０〜３０個ずつ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で培養した。
【００６９】
（ｇ）胚発生の評価
卵割率は、活性化後４８時間において培養した胚に占める卵割胚数の割合、胚盤胞への発生率は、活性化後１６８時間（７日）における卵割胚に占める胚盤胞数の割合とした。また、胚盤胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で３０分間染色し、核数を数えることで細胞数を測定した。
【００７０】
（ｈ）統計処理
実験は３回反復した。卵割率、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤテスト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ｖｅｒ５．０、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｔｄ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）により比較した。
【００７１】
（３）結果
培養液へのＴＳＡの添加がウシ再構築胚の初期発生に及ぼす影響について調べた。その結果、表６に示すように、培養液中のＴＳＡは卵割率（培養胚あたりの卵割胚数の割合（％））および胚盤胞の細胞数には影響を及ぼさなかった。しかし、胚盤胞への発生率（卵割胚あたりの胚盤胞期胚数の割合（％））は、５０ｎＭ ＴＳＡ区では４０％とＴＳＡ無添加区の１９％に比べ高かった（Ｐ＜０．０５）。一方、５００ｎＭ ＴＳＡ区では胚盤胞への発生率は７％であり、５ｎＭおよび５０ｎＭ ＴＳＡ区に比べて低下した（それぞれ３３％および４０％）。
【００７２】
【表６】
【００７３】
以上のように、ウシクローン胚にある適当な時間、一定濃度のＴＳＡに暴露させることで、胚盤胞期への発生率が２倍程度向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】種々の濃度のトリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。左上：０ｎＭ、右上：０．５ｎＭ、左下：５ｎＭ、右下：５０ｎＭ。
【図２】種々の濃度のトリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図３】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。左上：０時間、右上：２４時間、左下：４８時間、右下：７２時間。
【図４】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図５】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図６】出産直後のクローンマウス胎児と胎盤（左）および３週間後のクローンマウス（黒）と仮親（白）（右）を示す図である。
【図７】種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成を示す図である。左：ＴＳＡ処理なし、右：５０ｎＭ ＴＳＡ処理。
【図８】種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成率を示す図である。斜線棒：卵丘細胞、黒棒：繊維芽細胞、白棒：ＥＳ細胞。
【図９】ＴＳＡ処理によるＤＮＡおよびヒストンにおけるメチル化の影響を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は核移植卵子の作製方法に関する。詳細には、本発明は体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な種（ヒツジ、マウス、ウシなど）について体細胞の核移植技術を用いてクローン動物の作製に成功した例が報告されている。また、体細胞核移植によって得られたクローン胚を培養することによってヒトやマウス由来のｎｔＥＳ細胞（nuclear transfer embryonic stem cell）、すなわち体細胞由来のＥＳ細胞を樹立することが可能になった。
【０００３】
従来の体細胞核移植技術の最も大きな問題点は核移植後の胚の低い発生率であった。その後の研究から、クローン胚においてはＤＮＡやヒストンのメチル化修飾が通常の受精卵と比べて異常に高いことが報告され、これが低い発生率の原因であるとされてきた。
【０００４】
この過剰なメチル化に起因する核移植胚（クローン胚）の低い発生率を向上させるために、現在までに以下のような試みがなされている。例えば、ドナー細胞としての繊維芽細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンＡやＤＮＡメチル化酵素の阻害剤である５’−アザ−２’−デオキシシチジン等の薬剤の存在下で核移植前に培養することによって胚盤胞発生率が向上することが報告されている（非特許文献１）。また、不死化ウシ乳上皮細胞株（ＭＥＣＬ）、ウシ胎児繊維芽細胞（ＢＦＦ）をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である酪酸ナトリウムで処理した後に核移植に供することによって胚盤胞発生率が向上することも報告されている（非特許文献２）。これらの研究は、ドナー細胞の核を核移植前に受精卵の核に近づけた上で核を再プログラムすることによって発生率を向上させようとするものであった。しかしながら、その効果は小さく実用レベルまでの改善には至っていなかった。
【０００５】
一方、近年、生殖補助技術が発展し、ＲＯＳＩ（round spermatid injection）と呼ばれる核移植技術が開発された。この技術によって精子の前駆体であり本来受精能力のない精子細胞を用いて人工的受精をし、個体を作製できることが、ヒトやマウスについて報告されている。しかし、精子細胞を用いて得られた胚の発生率は低く、その原因はこれまで不明であった。
【０００６】
高い経済形質を有する特定のウシの増産や、医薬品などの生産に有用な遺伝子導入ウシを効率的に生産するために、体細胞クローン技術は極めて有用である。しかし、ウシのクローン胚の発生率は極めて低い（非特許文献１６、非特許文献１７）。ウシクローン胚の発生率を改善できれば、移植に用いる受胚雌を大幅に節約でき、その生産効率は著しく向上する。発生率を改善する方法として、ドナーとなる体細胞の細胞周期をＧ１期に調整する方法（非特許文献１８、非特許文献１９、特許文献１）や、作製したクローン胚での遺伝子発現を調べることで発生効率の高い胚を選別する方法（特許文献２）などがある。しかし、これらの方法は、細胞周期を調整するために熟練した技術を必要としたり、遺伝子の発現を調べるのに特殊な機器を要する。従って、容易な方法および技術によりウシのクローン胚の発生率を向上させることが求められていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−０５２３６９号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６８２８号公報
【非特許文献１】Enright, B.P. et al., Biol. Reprod., 69:896-901 (2003)
【非特許文献２】Shi, W. et al., Biol. Reprod., 69:301-309 (2003)
【非特許文献３】Ma, J. et al., Biol. Reprod., 64:1713-1721 (2001)
【非特許文献４】Chen, Y. et al., Cell Research, 13:251-263 (2003)
【非特許文献５】Wakayama, T. et al., Nature, 394:369-374 (1998)
【非特許文献６】Kishigami, S. et al., Biol. Reprode., 70:1863-1869 (2004)）
【非特許文献７】Christman, J.K., Oncogene, 21:5483-5495 (2002)
【非特許文献８】De Ruijter, A.J.M. et al., Biochem. J., 370:737-749 (2003)
【非特許文献９】Santos, F. et al., Curr. Biol., 13:1116-1121 (2003)
【非特許文献１０】Wakayama, T. et al., J. Reprod. Fertil., 112:11-17 (1998)
【非特許文献１１】Wakayama, T. et al., Nat. Genet., 22:127-128 (1999)
【非特許文献１２】Hooper, M. et al., Nature, 326:292-295 (1987)
【非特許文献１３】Kishigami, S. et al., Biol. Reprod., 70:1863-1869 (2004)
【非特許文献１４】Kishigami et al., Zygote, 12:321-327 (2004)
【非特許文献１５】Dean, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:13734-13738 (2001)
【非特許文献１６】Hill, J.R. et al., Biol. Reprod., 63:1787-1794 (2000)
【非特許文献１７】Heyman, Y., et al., Biol. Reprod., 66:6-13 (2002)
【非特許文献１８】Kasinathan, P. et al., Nat. Biotechnol., 12:1176-1178 (2001)
【非特許文献１９】Urakawa, M. et al., Theriogenology, 62:714-728 (2004)
【非特許文献２０】Robl, J.M. et al., J. Anim. Sci., 64:642-647 (1987)
【非特許文献２１】Tervit, H.R. et al., J. Reprod. Fertil., 30:493-497 (1972)
【非特許文献２２】Takahashi, Y. et al., Theriogenology, 37:963-978 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した。本発明者らは、マウスをモデル動物として精子細胞を用いた研究から過剰なメチル化が卵子内で核移植後に起こること、核移植後に抗メチル化剤で核移植卵子を処理することにより過剰なメチル化を抑制できること、この処理によりクローン胚の試験管内の発生やクローン動物の出産率が改善されること、精子細胞を用いて得られた胚についても同様の処理が発生改善に有効であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、従来技術のように核移植前のドナー細胞を抗メチル化剤で処理するのではなく、卵子へ核移植した後に抗メチル化剤での処理を実施して過剰なＤＮＡのメチル化を抑制することにより、核移植胚の低い発生率を大きく改善することができる。
【０００９】
なお、受精後の卵子を抗メチル化剤の一種であるヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、トリコスタチンＡで処理すると発生率が低下することが知られていたので（非特許文献３）、本発明者らによるこのような知見は予想外であった。
【００１０】
本発明の主な目的は体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
［１］以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程、
［２］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる［１］の方法。
［３］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［４］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ３２細胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［５］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ４細胞期終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［６］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性化以前の期間に行われる［１］の方法。
［７］工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる［１］の方法。
［８］抗メチル化剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である［１］の方法、
［９］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がトリコスタチンＡまたはＡｐｉｃｉｄｉｎである［８］の方法、
［１０］卵子が除核卵子である［１］の方法、
［１１］ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞およびＥＳ細胞からなる群より選択される［１０］の方法、
［１２］ドナー細胞が精子細胞である［１］の方法、
［１３］以下の工程を包含するクローン動物作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
（ｃ）抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程、
［１４］［１］の方法で作製された核移植卵子、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、クローン動物の作製、クローン胚からのＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）の樹立、精子細胞を用いた不妊治療などの幅広い目的に使用される核移植技術の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の核移植卵子の作製方法は以下の工程を包含する：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
【００１４】
本発明によれば、さらに上記方法で得られた抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植することによりクローン動物が作製される。また、上記方法で作製された核移植卵子も本発明により提供される。
【００１５】
本発明において、卵子としては発生能力を有している任意の卵子を使用することができる。採卵は通常の方法に従って実施することができる。例えば、卵子は過排卵処理した動物から採取することができる。ドナー細胞として体細胞などを使用する場合は卵子の核を予め取り除いておく（除核する）ことが好ましく、一方、ドナー細胞として精子細胞を使用するＲＯＳＩのような場合は除核の必要はない。卵子は通常精子との受精で活性化され発生を開始するが、精子を使用しない場合は人為的に活性化させる必要がある。例えば、ドナー細胞の核を移植（注入）する前、移植と同時または移植の後に卵子を活性化する。卵子の活性化は卵子を塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）の存在下で培養することによって行うことができる。さらに、ドナー核の細胞周期によっては細胞骨格を壊し、極体の放出を防ぐためにサイトカラシンＢなどの薬剤を添加してもよい。卵子の活性化は、通常の受精卵の場合は第２極体の放出と雌雄２つの前核の形成によって確認されるが、クローン胚の場合は上記のように極体の放出を薬剤で抑えているので前核形成のみで判断する。
【００１６】
本発明において、ドナー細胞としては核を有する任意の細胞を使用することができる。ドナー細胞の例としては、卵丘細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血球細胞（Ｔ細胞など）などの体細胞、精子細胞などの生殖細胞、ＥＳ細胞が挙げられる。本発明による核移植においては、例えば体細胞から得られた核を卵子へ注入してもよく、また精子細胞の核領域を卵子へ注入してもよい。
【００１７】
ドナー細胞と卵子とは同種の生物に由来してもよく、異種の生物に由来してもよい。例えば、同種の哺乳動物に由来するドナー細胞と卵子の組合せを本発明に好ましく使用することができる。あるいは、ウサギやウシの卵子は異種の体細胞核を受け入れる能力を有していることが知られており、ウサギの卵子にヒトドナー細胞の核を注入してｎｔＥＳ細胞を樹立した例が報告されていることから（非特許文献４）、卵子とは異なる種の生物由来の核を注入することも可能である。このような異種間の核移植により、例えばヒトｎｔＥＳ細胞を作製するためのヒト卵子の不足を補うために他の種の卵子で代用することが可能になる。
【００１８】
ドナー細胞由来の核の卵子への注入は公知の方法に従って実施することができる。体細胞核の除核卵子への注入は例えば非特許文献５記載の方法に従って実施することができる。精子細胞の核領域の卵子への注入は非特許文献６記載の方法に従って実施することができる。あるいは、特許文献２に記載されるようにドナー細胞と除核卵子との細胞融合によってドナー細胞由来の核を卵子へ注入することもできる。また、上記文献に記載されているような公知の方法に従って核移植胚を動物の卵管に移植してクローン動物を作製することもできる。
【００１９】
本発明において任意の抗メチル化剤を使用することができる。抗メチル化剤は直接的または間接的にＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤である。例えば、メチル化酵素阻害剤またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を抗メチル化剤として使用することができる。特に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用することが好ましい。メチル化酵素阻害剤としては５’−アザシチジン、５’−アザ−２’−デオキシシチジンなどを使用することができる。５−アザシチジンはメチル化酵素であるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られている（非特許文献７）。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてはトリコスタチンＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ（アピシジン）などを使用することができる。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として使用可能な種々の薬剤が知られている（非特許文献８）。本発明によれば、これらを単独でまたは任意の組合せで用いることができる。
【００２０】
抗メチル化剤の培地中の濃度は、本発明の効果、すなわち発生率の向上を指標として適切に設定することができる。例えば、トリコスタチンＡの場合、濃度は例えば０．５〜５００ｎＭ、好ましくは５〜５０ｎＭである。ただし適切な濃度は使用する動物種や体細胞の種類などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適切な濃度を決定することができる。
【００２１】
抗メチル化剤での処理期間を、通常の発生過程において重要な遺伝子の抑制を阻害しないように設定することが好ましい。詳細には、抗メチル化剤での処理を、ゲノムの「再プログラミング」（体細胞などの核を受精卵様の核にもどす過程、「初期化」ともいう）に際してヒストンのメチル化またはＤＮＡのメチル化を抑制するように行い、かつ再プログラミングに続く胚性遺伝子の活性化が始まる前に終了させることが好ましい。抗メチル化剤での処理は、例えば核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる。再メチル化の終了時期は発生中の胚におけるメチル化レベルを抗５−メチルシチジン抗体を用いた蛍光抗体法により経時的に５−メチルシトシンを測定することによって調べることができる。ただし、この方法により定量性が困難なため正確な終了時間の決定が難しい場合は、胚盤胞までの任意の時間において処理を終了し（拡張）胚盤胞への発生率が最も高かった処理時間を採用することが望ましい。発生の時期との関係でいえば、処理を核の移植後に開始し、胚盤胞までの任意の時点で終了することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、例えば核の移植以降かつ１細胞期終了以前の期間に、１細胞期のゲノムの再プログラムに際してヒストンまたはＤＮＡのメチル化を抑制するように行われる。具体的な処理時間も適切に設定することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、核の移植以降かつ卵子活性化の２０時間後までの期間、より好ましくは核移植以降かつ卵子活性化の１０時間後までの期間行われる。抗メチル化剤での処理が長すぎると通常の発生に重要な遺伝子抑制（再メチル化またはヒストン脱アセチル化による）が適切に行われず、むしろ発生が阻害される可能性がある。抗メチル化剤での適切な処理期間は使用する動物種などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適切な処理期間を決定することができる。
【００２２】
核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程（ｂ）を行うタイミングは、当該卵子を胚移植する前までであれば特に限定されるものではなく、対象となる動物種などに応じて適宜設定すればよい。但し、処理時間の過不足により胚発生の効率が充分には向上しなくなる虞を排除するために、好ましくは胚盤胞期終了以前の期間に、より好ましくは３２細胞期終了以前の期間に、さらに好ましくは１６細胞期、８細胞期、４細胞期、２細胞期、１細胞期終了以前の期間に処理を行うことが望まれる。
【００２３】
なお、抗メチル化剤での処理効率は、胚性遺伝子の活性化（zygotic gene activation）以前に処理を行うことで特に著しく向上する傾向があるようである。その理由は必ずしも定かではないが、例えばトリコスタチンＡは胚性遺伝子の活性化後に続いて起こる遺伝子発現の抑制状態（transcriptionally repressive state）を妨げ、その後の胚発生を阻害することが知られている（非特許文献３）。これと同様の機構が核移植胚においても働いていると推察される。この観点から考えると、マウスの場合には１細胞期終了以前に、ウシの場合には４細胞期終了以前に行うことが極めて好ましいと言える。
【００２４】
本発明の方法による発生率の向上を、クローン動物の出産率（移植胚数に対する出産クローン動物胎児数の比率）に基づいて確認することができる。あるいは、核移植した卵子を培養した際の拡張胚盤胞の形成率（核移植卵子数に対する胚盤胞発生の比率）を指標として本発明の方法の効果を調べることができる。これらの方法は下記実施例に詳細に記載されている。例えば、拡張胚盤胞への発生の確認は、活性化後９６時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、透明帯が薄くなったものを顕微鏡下で観察することによって行われる。本発明の方法によれば、例えば少なくとも３０％、好ましく４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上の胚盤胞形成率を達成することができる。また、本発明によれば、例えば少なくとも３％、好ましくは４％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上の出産率を達成することができる。胚盤胞形成率、出産率は、抗メチル化剤での処理をしない場合と比較して、例えば少なくとも１．５倍、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上向上する。
【００２５】
本発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子においては、父性（すなわちドナー細胞由来）ゲノムのメチル化の程度が低くなる。父性ゲノムのメチル化の程度は母性（すなわち卵子由来）ゲノムに対する父性ゲノムのメチル化レベルの百分率（％）として表すことができる。メチル化レベルは上記の抗５−メチルシチジン抗体を使用した測定によって決定ことができる。例えば、精子細胞の核領域を注入した卵子において、本発明の方法で作製された核移植卵子における上記値は例えば３０〜６０％、好ましくは４０〜５５％である。母性ゲノムに対する父性ゲノムのメチル化レベルの百分率（％）は、抗メチル化剤での処理をしない場合に比較して、例えば少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上低下する。
【００２６】
抗メチル化剤での処理を行わない場合、精子細胞核移植卵子においてはゲノムＤＮＡ全体の高メチル化が観察される。これに対して、抗メチル化剤での処理を含む本発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子においては動原体周囲以外の染色体部分にＤＮＡの低メチル化が観察される。一方、体細胞クローンについては、抗メチル化剤での処理を行わない場合にゲノムＤＮＡ全体の高メチル化およびヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の高メチル化が観察され、これらの両方が抗メチル化剤での処理によって低下する。従って、本発明の方法で作製された核移植卵子を、ゲノムＤＮＡの低メチル化（特に、動原体周囲以外の部分における）によって、さらにはヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の低メチル化によって特徴付けることができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
核移植胚の作製を含むクローンマウスの作製は、非特許文献５記載の方法に従った。詳細には、まず、過排卵処理のために８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）に妊娠ウマ血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を投与し、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与し、１６時間後に採卵を行った。採取した未受精卵から、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ存在下でマイクロマピュレーターを用いて核を除いた（除核）。
【００２９】
次いで、１．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液中に浮遊させたドナー体細胞としてのＢ６Ｄ２Ｆ１マウス由来の卵丘細胞の細胞膜を注入用のピペッティングにより破壊し、核をマイクロマニピュレーターを用いて除核卵子に注入した（核移植）。なお、核の注入のために必要な透明帯や細胞膜の穿孔のためのピエゾパルスの発生にはピエゾドライブ装置（プリマハム社製）を用いた。
【００３０】
得られた核移植卵子をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分〜１時間培養し、０．５、５、５０または５００ｎＭのトリコスタチンＡ（以下、ＴＳＡ）を含む卵子活性化溶液（５ｍＭ 塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）及び５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを補充したＣａ２＋不含ＣＺＢ培地（非特許文献１０））に移し、人工的に卵子の活性化を行って発生を開始させた。活性化開始から６時間後に前核形成を指標として卵子が活性化されたことを確認し、活性化核移植卵子を上記と同濃度のＴＳＡを含むＫＳＯＭ培地（Specialty Media社製）に移した。この培地中でさらに１４時間（活性化から２０時間）培養した。なお、コントロールとしてＴＳＡの代わりにＴＳＡの溶解に使用したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を同濃度になるように用いた。
【００３１】
その後、２細胞期の核移植胚をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察した。拡張胚盤胞への発生の確認は、活性化後９６時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、透明帯が薄くなったものを顕微鏡下で観察することによって行った。各濃度の実験区につき胚を８０個以上調べた。使用した核移植卵子数に対する胚盤胞発生の比率（胚盤胞形成率（％））を求めた。再構築した核移植卵子のうち卵割を開始した（すなわち２細胞期へ発生した）卵子数に対する拡張胚盤胞へと発生した比率（胚盤胞形成率（％））を求めた。
【００３２】
結果を図１および図２に示す。図２に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、５、５０、５００ｎＭの濃度のＴＳＡで処理した場合に胚盤胞発生率が増加した。
【実施例２】
【００３３】
実施例１と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植卵子を５ｎＭのＴＳＡを含有するＫＳＯＭ培地中で種々の時間（活性化から０、２４、４８または７２時間）培養した後ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
【００３４】
結果を図３および図４に示す。図４に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、活性化後２４時間または４８時間ＴＳＡで処理した場合には胚盤胞発生率が増加し、特に２４時間の処理では約４倍の増加が見られたが、活性化後７２時間処理した場合は、むしろ発生率は低下した。なお、活性化後２４時間目は２細胞期に相当し、４８時間目は４〜１６細胞期に相当し、７２時間目は胚盤胞の形成時期に相当する（図４参照）。
【実施例３】
【００３５】
実施例１と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植卵子を５ｎＭのＴＳＡを含有するＫＳＯＭ培地中で種々の時間（０時間、活性化から６時間、活性化から１０時間、活性化後１０時間目から２４時間目、または活性化から２４時間）培養した後ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地中で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
【００３６】
結果を図５に示す。図５に示すように、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して、活性化後１０時間ＴＳＡで処理した場合に最も高い胚盤胞発生率が見られた。
【実施例４】
【００３７】
上記実施例３の結果に基づきＴＳＡ処理の胎児出産率に対する効果を調べた。５ｎＭまたは５０ｎＭ ＴＳＡで活性化後１０時間または２０時間処理した核移植卵子をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移した後、核移植胚をＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移し、移植までこの培地中で培養した。クローンマウスを作製するために、核移植の翌日に２細胞期の胚を偽妊娠マウス（仮親、０．５日目）の卵管に移植した。偽妊娠処理は、発情前期のＩＣＲ系雌マウスを精管結紮雄およびＩＣＲ系雄マウスと１体１で交配させることにより行い、交配の成立はプラグ形成の有無により確認した。胚の移植後１９日目に帝王切開によりクローンマウスを出産させ、移植胚数に対する出産クローンマウス胎児数の比率（出産率）を求めた。図６に出産直後のクローンマウス胎児と胎盤（左）、および３週間後のクローンマウス（黒）と仮親（白）（右）を示す。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示すように、１０時間または２０時間のＴＳＡ処理により出産率は増加した。特に、１０時間ＴＳＡで処理した場合に５ｎＭおよび５０ｎＭのいずれの濃度でも高い出産率（コントロールの６倍以上）が得られた。なお、活性化後１０時間目は１細胞期に相当する。
【実施例５】
【００４０】
卵丘細胞に加え、繊維芽細胞および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をドナー細胞として用いて実施例１と同様の操作を行った。繊維芽細胞を、マウスの尻尾の断片を培養して得た（非特許文献１１）。ＥＳ細胞としてはＥ１４細胞を使用した（非特許文献１２）。
それぞれのドナー細胞由来の核を移植した卵子をＴＳＡで２０時間処理した後、ＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地で活性化後９６時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。各細胞の実験区につき胚を３０個以上調べた。
【００４１】
結果を図７および８に示す。図８に示すように、いずれのドナー細胞由来の核を移植した場合も、ＴＳＡ処理をしなかった場合に比較して高い胚盤胞発生率が見られた。
【実施例６】
【００４２】
ＴＳＡの代わりに５μＭのＡｐｉｃｉｄｉｎ（Sigma）を用いて実施例１と同様に核移植卵子の拡張胚盤胞への発生を観察したところ、コントロールの胚盤胞形成率２９．７％に対してＡｐｃｉｄｉｎ処理した場合は６９．０％であり、Ａｐｉｃｉｄｉｎ処理した場合に胚盤胞発生率が約２倍増加した。
【実施例７】
【００４３】
本発明によるＴＳＡ処理の円形精子細胞注入法（ＲＯＳＩ）に対する効果を調べた。ＲＯＳＩは非特許文献１３記載の方法に従った。
詳細には、まず、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与し、１６時間後に採取した卵子をＣＺＢ培地中に入れた。次いで卵子をＫＳＯＭ培地に移し、３７℃で５％ＣＯ２存在下でインキュベートした。
【００４４】
卵子を５ｍＭ塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）を補充したＣａ２＋不含ＣＺＢ培地中で２０分間インキュベートすることによって活性化した。４０〜８０分後に、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雄マウス（日本エスエルシー社製）から採取した円形精子細胞の核領域（約１０μｍの直径および中央に位置する明確な核によって特徴付けられる；非特許文献１４参照）を卵子に注入した。
【００４５】
核を注入した卵子を、５ｎＭ ＴＳＡを含むＫＳＯＭ培地に移し、活性化の１０時間後にＴＳＡ不含ＫＳＯＭ培地に移した。
【００４６】
精子細胞注入の翌日に２細胞期の胚を偽妊娠マウス（仮親、０．５日目）の卵管に移植した。胚の移植後１９日目に帝王切開により胎児を得、移植胚数に対する出産胎児数の比率（出産率）を求めた。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
その結果、ＴＳＡ処理をしないコントロールに比較してＴＳＡ処理した場合に出産率が約４倍増加した。
【実施例８】
【００４９】
ＲＯＳＩによって得られた円形精子細胞の核領域を注入した卵子を２０ｎｇ／ｍｌデメコルチンの存在下で、１０μＭ ５−アザシチジン（５−ａｚａ）、または５００ｎＭ ＴＳＡを抗メチル化剤として含有する培地中で２０時間培養した。同様に、成熟精子の注入を実施した（ＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection））。詳細には、頭部−尾部連結部にピエゾドライブピペット（PrimeTech）によってパルスをかけることによって尾部から分離した精子の頭部を卵子に注入した。この際、卵子の活性化は行わなかった。
【００５０】
培養した核注入卵子を４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中４℃で一晩固定化した後、０．１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するＰＢＳで洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中４℃で一晩ブロッキングした。以下の工程は室温で実施した。固定化した核注入卵子をＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温で処理することによって透過処理した。次いでこれを２Ｎ ＨＣｌで室温で５０分間処理し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）で中和し（非特許文献１５）、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで十分に洗浄した。
【００５１】
次いで０．１％ＰＶＡ含有ＰＢＳ中、抗５−メチルシチジン抗体（Eurogentec）と共に２〜３時間インキュベートした。十分に洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８二次抗体（Molecular Probes）で染色した卵子を、５μｇ／ｍｌ ４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で３０分間染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Laboratories）を用いて封入した。標本をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡（オリンパス）を用いて観察した。全ての画像をＯｌｙｍｐｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してＤＰ７０ Ｏｌｙｍｐｕｓデジタルカメラでとらえ、ＤＡＰＩ染色ＤＮＡおよび結合画像に彩色を施した。
【００５２】
前核ＤＮＡメチル化レベルの定量分析のために、蛍光画像をアメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）のプログラムＩｍａｇｅ−Ｊ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用した濃度分析に供した。各々の前核について、父性ゲノムの相対的メチル化強度を、母性ゲノムの蛍光強度の百分率として算出した。結果を表３に示す。なお表３において（ａ）抗メチル化剤無添加の場合対（ｂ）抗メチル化剤を添加した場合について、データを統計プログラムＳＰＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０（SPSS Inc.）を使用した多重平均比較のためのシェフェ検定によって解析した。全ての百分位数データを統計解析前に逆正弦変換に供した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３に示すように成熟精子を注入した場合（ＩＣＳＩ、抗メチル化剤なし）に比較して精子細胞を注入した場合（ＲＯＳＩ、抗メチル化剤なし）、父性ゲノムのメチル化レベルが高いことが確認された。精子細胞を導入した場合に見られる過剰なメチル化について経時的に調べたところ、注入６時間目までは精子細胞および成熟精子のいずれの場合も脱メチルがおこり、高度にメチル化されたままの母性ゲノムに比較して低いメチル化を示した。しかし、１０時間目では精子細胞を注入した場合に成熟精子に比較して高いメチル化が観察された。すなわち、精子細胞を注入した場合には父性ゲノムは一旦脱メチル化された後に過剰にメチル化されることが示された。
【００５５】
表３に示すように、上記の精子細胞を注入した場合に観察された父性ゲノムの過剰なメチル化はいずれの抗メチル化剤を使用した場合も低下した。
【００５６】
なお、ＴＳＡで処理した場合、父性ゲノムに見られるＤＮＡメチル化は主に各染色体のヒストンＨ３のＬｙｓ９の高メチル化によって示される動原体周囲領域に限られていた。すなわち、母性ゲノムのメチル化はＴＳＡ処理に耐性であるのに対し、父性ゲノムのメチル化の大部分はＴＳＡ処理に感受性であるが、ヒストンＨ３のＬｙｓ９の高メチル化によって示される動原体周囲領域におけるＤＮＡのメチル化はＴＳＡに対して耐性であった。
【実施例９】
【００５７】
実施例１に記載の方法で作製したＢ６Ｄ２Ｆ１系統マウス由来の卵子を用いて卵丘細胞由来のクローン胚を作製し、５００ｎＭ ＴＳＡ存在下または非存在下で１５時間（活性化時間を含む）培養した。その後、核移植胚を固定し、ＤＮＡのメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔＣ）及びヒストンＨ３ Ｌｙｓ９のメチル化（Ｈ３Ｋ９ ｔｒｉｍｅｔ）を各抗体を用いて調べた。さらにＤＮＡをＤＡＰＩ染色した。各々１５個のクローン胚を使用した。結果を結合画像（Ｍｅｒｇｅ）とともに図９に示す。
【００５８】
ＴＳＡ未処理の実験区（図９左、「無」）では、これまで報告されているように（非特許文献９）ＤＮＡ及びヒストンＨ３ Ｌｙｓ９の両方の高いメチル化が染色体全体に認められた。一方、ＴＳＡ処理した実験区（図９右、「有」）では、実施例８に記載の精子細胞を用いた場合と同様に、動原体周囲ではいずれのメチル化も顕著な低下はみられなかったものの、それ以外の染色体部分では両方のメチル化の低下が観察された。
【実施例１０】
【００５９】
ウシ再構築胚の作製とトリコスタチンＡによる処理
（１）ウシ卵子の採取と体外成熟
食肉処理場にてウシ屠体より採取したウシ卵巣を２５℃の生理食塩水に保存し、屠殺後６〜８時間以内に研究室まで輸送した。ウシ卵巣表面の直径２〜５ｍｍの卵胞から２１Ｇの注射針（テルモ、東京、日本）と１０ｍｌシリンジ（テルモ）を用いてウシ卵子を卵胞液と共に吸引し回収した。回収した卵胞液から、２〜４層の卵丘細胞が付着した卵子卵丘細胞複合体のみを選別し回収した。回収した卵子卵丘細胞複合体は、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）下の５０μｌの５％（ｖ／ｖ）新生子ウシ血清（Ｎｅｗ Ｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＮＢＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ、ＵＳＡ）、２５μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）添加の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝ＴＣＭ−１９９（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ、Ｇｉｂｃｏ、ｍ−ＴＣＭ１９９Ｅ）に、０．０２ＡＵ／ｍｌ卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、アントリン、川崎製薬、神奈川、日本）および１μｇ／ｍｌエストラディオール１７−β（Ｓｉｇｍａ）を添加した成熟用培養液の小滴に導入し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度下で２１時間成熟培養した。
【００６０】
（２）核移植
（ａ）ウシ卵子の裸化と除核
２１時間成熟培養した卵子卵丘細胞複合体を５％ＮＢＣＳ、２５μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）添加の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝ＴＣＭ−１９９（Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔｓ、Ｇｉｂｃｏ、ｍ−ＴＣＭ１９９Ｈ）に０．２５％（ｗ／ｖ）ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加した溶液内で５分間静置した。その後、卵子の周囲に付着した卵丘細胞をピペティング操作により完全に除去した。
【００６１】
卵丘細胞を除去した卵子をｍ−ＴＣＭ１９９Ｈ内に移し、倒立顕微鏡下で第一極体が放出された卵子のみを選別した。卵子の核を除去するため、第一極体付近の透明帯を微細なガラスニードルで切開し、これら卵子を５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）添加ｍ−ＴＣＭ１９９Ｈに移し１５分間静置した。その後、透明帯を切開したガラスニードルで卵子を上から押さえ、第一極体およびその周辺の卵細胞質を透明帯切開部位から卵子細胞質の容量の約１０〜２０％を除去することで除核した。除核の確認は、除去した卵細胞質を２０μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）含有ｍ−ＴＣＭ１９９Ｅに移し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度下で３０分間染色し、ＵＶ照射下で除核した卵細胞質内に核の有無を判定した。なお、以後の実験では、レシピエント除核卵子として除核した卵細胞質において核が確認できた除核卵子のみを供した。
【００６２】
（ｂ）ドナー細胞の調製と除核卵子への導入
核移植に用いるドナー細胞には、黒毛和種子ウシ耳介由来の繊維芽細胞を使用した。ドナー細胞を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、フナコシ、東京、日本）添加ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、ニッスイ、東京、日本）で８０％コンフルエント状態まで培養した後、０．４％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに培養液を交換し、７日間血清飢餓培養を行った。これら血清飢餓培養細胞を、０．０４％（ｗ／ｖ）エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（ＥＤＴＡ、ナカライテスク、京都、日本）添加の０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン（Ｓｉｇｍａ）溶液により培養皿から単離し、遠沈管で遠心処理により遠沈し細胞を回収した後、１０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、ＰＶＰ、ナカライテスク）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）（−）溶液中に懸濁した。単離した細胞を細胞導入用の微小ガラスピペットに吸引して、レシピエント除核卵子の透明帯切開部位から囲卵腔内に導入した。
【００６３】
（ｃ）電気融合処理
マイクロマニュピレーターに微小電極（ユニークメディカル イマダ、宮城、日本）をセットし、ＢＴＸ細胞融合装置（ＥＣＭ２００、ＢＴＸ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に接続した。細胞を導入したレシピエント除核卵子をＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ細胞融合液（非特許文献２０、表４にＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ細胞融合液の組成を示す）内に静かに移した。微小電極、卵子細胞質およびドナー細胞が一直線になるように両極から挟み、直流２．７ｋＶ／ｃｍ、１１μｓｅｃを２回印加することで除核卵子とドナー細胞とを融合して再構築胚を作製した。融合処理を行った後、再構築胚を５０μｌのｍ−ＴＣＭ１９９Ｅの小滴内へ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で３０分間培養した。培養後、実体顕微鏡下でドナー細胞と卵子細胞質との融合を確認した。なお、細胞融合の確認は、囲卵腔内のドナー細胞の有無により判定し、細胞を確認できない卵子を再構築胚とした。
【００６４】
【表４】
【００６５】
（ｄ）活性化処理
再構築胚は、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ、ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ）添加ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｄ−ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）に添加した５μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）溶液へ移し、５分間静置した。胚を直ちに、合成卵管液培養液（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｖｉｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＯＦＭ、非特許文献２１）に２０種類の必須および非必須アミノ酸を添加して修正した培養液（非特許文献２２）からさらに無機リン酸塩を除いた培養液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＦＭ、ｍＳＯＦＭ、表５に修正合成卵管液培養液（ｍＳＯＦＭ）の組成を示す）に１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養液５０μｌの小滴内に移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で６時間処理し、活性化処理を行った。
【００６６】
【表５】
【００６７】
（ｅ）体外培養
活性化処理を行った再構築胚をｍＳＯＦＭに移し、２回洗浄した。その後、胚を同培養液５０μｌの小滴内に２０〜３０個ずつ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で１６８時間（７日間）培養した。
【００６８】
（ｆ）トリコスタチンＡ処理
再構築胚のトリコスタチンＡ（ＴＳＡ、Ｓｉｇｍａ）処理は、活性化処理から４８時間行った。ＴＳＡはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）で溶解し、活性化処理の溶液およびｍＳＯＦＭにそれぞれ添加した（ＤＭＳＯの最終濃度は０．０５％とした）。対照区として０．０５％のＤＭＳＯのみを活性化処理の溶液およびｍＳＯＦＭに添加した。ＴＳＡは５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭの濃度で処理した。活性化後４８時間にＴＳＡ処理した再構築胚をｍＳＯＦＭで２回洗浄した後、胚を同培養液５０μｌの小滴に２０〜３０個ずつ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度下で培養した。
【００６９】
（ｇ）胚発生の評価
卵割率は、活性化後４８時間において培養した胚に占める卵割胚数の割合、胚盤胞への発生率は、活性化後１６８時間（７日）における卵割胚に占める胚盤胞数の割合とした。また、胚盤胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で３０分間染色し、核数を数えることで細胞数を測定した。
【００７０】
（ｈ）統計処理
実験は３回反復した。卵割率、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤテスト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ｖｅｒ５．０、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｔｄ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）により比較した。
【００７１】
（３）結果
培養液へのＴＳＡの添加がウシ再構築胚の初期発生に及ぼす影響について調べた。その結果、表６に示すように、培養液中のＴＳＡは卵割率（培養胚あたりの卵割胚数の割合（％））および胚盤胞の細胞数には影響を及ぼさなかった。しかし、胚盤胞への発生率（卵割胚あたりの胚盤胞期胚数の割合（％））は、５０ｎＭ ＴＳＡ区では４０％とＴＳＡ無添加区の１９％に比べ高かった（Ｐ＜０．０５）。一方、５００ｎＭ ＴＳＡ区では胚盤胞への発生率は７％であり、５ｎＭおよび５０ｎＭ ＴＳＡ区に比べて低下した（それぞれ３３％および４０％）。
【００７２】
【表６】
【００７３】
以上のように、ウシクローン胚にある適当な時間、一定濃度のＴＳＡに暴露させることで、胚盤胞期への発生率が２倍程度向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】種々の濃度のトリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。左上：０ｎＭ、右上：０．５ｎＭ、左下：５ｎＭ、右下：５０ｎＭ。
【図２】種々の濃度のトリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図３】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。左上：０時間、右上：２４時間、左下：４８時間、右下：７２時間。
【図４】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図５】種々の時間トリコスタチンＡで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
【図６】出産直後のクローンマウス胎児と胎盤（左）および３週間後のクローンマウス（黒）と仮親（白）（右）を示す図である。
【図７】種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成を示す図である。左：ＴＳＡ処理なし、右：５０ｎＭ ＴＳＡ処理。
【図８】種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成率を示す図である。斜線棒：卵丘細胞、黒棒：繊維芽細胞、白棒：ＥＳ細胞。
【図９】ＴＳＡ処理によるＤＮＡおよびヒストンにおけるメチル化の影響を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
【請求項２】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ３２細胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ４細胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性化以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗メチル化剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項１記載の方法。
【請求項９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がトリコスタチンＡまたはＡｐｉｃｉｄｉｎである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
卵子が除核卵子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞およびＥＳ細胞からなる群より選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ドナー細胞が精子細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を包含するクローン動物の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
（ｃ）抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程。
【請求項１４】
請求項１記載の方法で作製された核移植卵子。
【請求項１】
以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；および
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
【請求項２】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ３２細胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ４細胞期終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性化以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の処理が核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期間に行われる請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗メチル化剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項１記載の方法。
【請求項９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がトリコスタチンＡまたはＡｐｉｃｉｄｉｎである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
卵子が除核卵子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞およびＥＳ細胞からなる群より選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ドナー細胞が精子細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を包含するクローン動物の作製方法：
（ａ）ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
（ｂ）核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
（ｃ）抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程。
【請求項１４】
請求項１記載の方法で作製された核移植卵子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−１１７０８１（Ｐ２００７−１１７０８１Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０８５６５（Ｐ２００６−２０８５６５）
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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