核酸増幅に伴う汚染物質の排除
【課題】核酸増幅における、キャリーオーバー汚染の排除に関する。
【解決手段】増幅反応においてキャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用。
【解決手段】増幅反応においてキャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅反応におけるアンプリコンでのキャリーオーバー汚染の可能性を克服する戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８５年前後に開発されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiko，R.K.、Scharf，S.、Faloona，F.、Mullis，K.B.、Horn，G.T.、Erlich，H.A.、Arnheim，N.(1985). Science. 230: 1350-1354）は、事実上いかなる標的生物に由来するものでも、ＤＮＡであれＲＮＡであれ、ほんのわずかな量の核酸の検出および指数関数的増幅を可能にすることによって、生物システムの研究に革命をもたらした。通常のＰＣＲ反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの好熱性酵素、マグネシウムイオン（Mg2+）および４種のデオキシ−ヌクレオシド三リン酸（dNTP）、デオキシアデニン三リン酸（dATP）、デオキシグアニン（dGTP）、デオキシチミン（dTTP）およびデオキシシトシン（dCTP）の混合物を含む。理論上は、１コピーの核酸分子が、指数関数的に増幅され得、産物が、アガロースゲル電気泳動によって簡単に可視化され得るよう、十分に増幅された材料が得られる。したがって、４０サイクルの増幅を実施した場合には、単一の反応で、およそ２×１０１２コピーの標的核酸が生じる（ｎが、使用されるＰＣＲサイクルの数である場合、およそ２ｎコピー）。
【０００３】
増幅産物（本明細書においてアンプリコンと呼ばれる）の偶然の遊離を管理する戦略が実行されない場合は、ＰＣＲにおいて生成された多数のアンプリコンによる、キャリーオーバー汚染が問題となる。ＰＣＲの誕生以来、この方法の派生物、ならびに新規核酸増幅法（例えば、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）、リガーゼ連鎖反応、等温増幅、ローリングサークル型増幅）が開発されてきたが、それらのすべてがキャリーオーバー汚染の影響を受けやすい。キャリーオーバー汚染物質の存在は、偽陽性結果の１つの理由である。研究室状況では、特に、キャリーオーバー汚染物質の結果としての偽陽性結果は、データを無価値にする。したがって、実験は、相当に増大した経費および労力をかけて反復されなければならない。臨床状況では、キャリーオーバー汚染と関連している場合もそうでない場合も偽陽性結果は、特に、結果が、患者管理のための正しい投薬計画の決定に使用される場合には、深刻な結果を有し得る。
【０００４】
キャリーオーバー汚染は、以前増幅された標的ＤＮＡがアッセイに偶然に、または気づかずに入ることの結果として起こる。汚染物質は、質の悪い研究室業務の結果として、または汚染された実験機器、使い捨ておよび使い捨てではないガラス製品、プラスチック製品および試薬、ならびに試験とその他の環境汚染物質間のキャリーオーバー汚染の結果としてアッセイに入ってしまう可能性がある。
【０００５】
必要な場合には、汚染物質を含まない結果を達成するための２つの態様−（a）「防衛の最前線」としての汚染の防止および（b）汚染物質の破壊がある。
【０００６】
ＰＣＲ汚染物質を破壊するために使用できる方法として、（i）ＵＶ照射、（ii）次亜塩素酸ナトリウム、塩酸またはヒドロキシルアミン塩酸塩を用いる化学的排除、または（iii）１種または複数の酵素（単数または複数）を用いる処理が挙げられる。ＰＣＲプレミックス、実験室の表面、消耗品および機器からＤＮＡ／ＲＮＡを排除するのに効率的であるＵＶ照射は、ヌクレオチドの酸化を誘導し、その結果、一本鎖および二本鎖が破壊され、隣接するピリミジン間にシクロブタン環が形成される。形成されたピリミジン二量体は、Ｔａｑポリメラーゼによる産物の伸長を阻害する。次亜塩素酸ナトリウムは、強力な酸化剤であり、これもまた、核酸中の一本鎖および二本鎖の破壊を誘導する。還元剤であるヒドロキシルアミン塩酸塩は、正常な塩基対形成を破壊し、効率的なＰＣＲ後汚染防止であるが、変異原性である。しかし、これらの方法は、主に表面および容器の汚染除去に限定され、ＰＣＲ反応プレミックスの実際の準備とは適合しない。
【０００７】
核酸標的の酵素的処理は、汚染物質を排除するための第３の方法であり、核酸増幅反応と適合するとわかっている。汚染物質を破壊するために使用される酵素として、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼまたはエンドヌクレアーゼ／特定のヌクレオチドまたはヌクレオシドを標的とするＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを挙げることができる。ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼは、核酸およびその増幅産物を除去するのに効率的であるが、サブクローニングなど下流適用に干渉するであろう、不活性化後に残存する酵素活性がある場合がある。より重要なことには、このような酵素の使用もまた、標的分子ならびに可能性ある汚染を両方とも破壊するので、ＰＣＲ反応混合物の準備と適合しない。
【０００８】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（UDG）／ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（UNG）は、おそらく、キャリーオーバー汚染物質を排除するために使用される、最もよく知られているエンドヌクレアーゼである。増幅反応では、ｄＴＴＰは、ｄＵＴＰで置換され、これがＵＤＧ／ＵＮＧ消化の標的である。この酵素は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの糖骨格からウラシルを除去して脱塩基部位を作製し、サーマス・アクアチウス（Thermus aquatius）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）などの熱安定性酵素がこれを迂回して非効率的になり、ひいては、核酸増幅を阻害する。このＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染管理戦略は、単一試験管核酸増幅と適合しており、それによって、試験管を開けることに起因するさらなる汚染の機会が最小になる。具体的に言えば、この酵素を、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応プレミックス中に含めてもよい。ＵＤＧ／ＵＮＧは、増幅前にＰＣＲ反応混合物中に入ってしまったｄＵＴＰを含有する任意の増幅汚染物質を特異的に分解する。次いで、この酵素を、ＰＣＲの最初の変性工程の間に不活化して、新規標的アンプリコンの分解を防ぐ。この系は、ＰＣＲにおけるキャリーオーバー汚染を防ぐよう適応させられており、種々の増幅キットにおいて商業的に販売されている。しかし、この戦略は、重亜硫酸ナトリウム処理された核酸とは適合しない。これは、この修飾の工程が、シトシン残基を、ウラシルスルホニル中間体を介してウラシルに脱アミノ化するからである。
【０００９】
重亜硫酸ナトリウム修飾は、重亜硫酸塩（bisulphite）反応によってシトシン残基が変換されるが、５メチル−シトシンは、この化学修飾に対して耐性であるので、ＤＮＡのメチル化状態を調べるために広く用いられている技術である。ヒトゲノムにおけるシトシン残基のメチル化は、発生および胚発生における遺伝子発現の調節および制御において極めて重要であることがわかっている。腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子のシトシン−グアニン（CG）リッチプロモーター中のシトシンの低メチル化および過剰メチル化は、発癌の過程に関係するとされている。ＤＮＡの重亜硫酸ナトリウム修飾は、５−メチル−シトシンが、発癌、発生および胚発生において役割を果たすという役割の研究を大きく促進した。しかし、重亜硫酸塩法自体は、重亜硫酸塩修飾工程の際に生じたウラシル残基が、任意のクロスオーバー汚染物質とともに分解されるので、理論的に言えば、現実的には、ＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染戦略とは不適合である。
【００１０】
しかし、最近開発された方法は、重亜硫酸ナトリウム処理された標的ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応物におけるキャリーオーバー汚染の排除におけるＵＤＧの使用を可能にした。重亜硫酸ナトリウム修飾における重要な工程は、６−スルホニルウラシル中間体からのスルホン酸基の除去である。一般に、この除去は、ＤＮＡポリメラーゼが、かさ高い付加物を含有するＤＮＡの増幅で極めて非効率であるので、増幅またはさらに処理の前に、処理されたＤＮＡを、高温のアルカリ環境に付すことによって起こる。この方法では、６−スルホニルウラシル（Epigenomics AGによって「SafeBis DNA」と呼ばれる）は、修飾および脱塩後、直ちに脱スルホン化されるわけではない。ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡ中のスルホニル基は、ＵＤＧ消化に対して保護を与えるようであり、従って、上記のＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染管理戦略を、標的ＤＮＡを分解することなくＰＣＲと合わせることができる。ＵＤＧ／ＵＮＧ処理後、反応物を約９５℃に２０〜３０分間加熱すると、その結果、ＵＤＧ／ＵＮＧが不活化され、同時に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを活性化し、６−スルホニルウラシル残基を脱スルホン化することができる。
【００１１】
ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡを包含するこの方法に関しては、いくつかの制限パラメータが存在する。第１に、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡは、溶出され、低温の中性ｐＨの溶液中に保存されなければならない。８〜９を超えるアルカリｐＨおよび／または高い保存温度が、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡの脱スルホン化を誘導する。ＳａｆｅＢｉｓ法では、修飾されたＤＮＡは、滅菌水で溶出されることになっている。ＤＮＡは、酸性加水分解に対して弱く、従って、水中で保存された場合には、分解に対して感受性が高いので、ＤＮＡは、長期間の保存のためには、ＴＥバッファーに再懸濁されるべきであると推奨されている。
【００１２】
この技術の別の制限は、高い汚染物質濃度は、この系によって破壊されない場合があるということである。ＵＤＧ／ＵＮＧのキャリーオーバー汚染物質の除去は、高濃度の汚染物質の存在下では最適ではない場合がある。５０℃未満のＰＣＲアニーリング温度では、ＵＤＧは再活性化された状態とならず、従って、標的核酸とＰＣＲの際に生じたアンプリコンの両方を消化する場合がある。重要なことに、ＳａｆｅＢｉｓ法は、最大１０，０００コピーまでのアンプリコンを成功裏に除去するとしか評価されていない。しかし、標準の４０サイクルＰＣＲは、約２４０または２×１０１２コピーの核酸標的を増幅できる。ＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰキャリーオーバー汚染管理戦略は、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡにとって妥当である（ある程度）ことが確認されている一方、重亜硫酸ナトリウム変換のウラシル中間体ならびにウラシル−Ｄ−およびウラシル−Ｎ−グリコリアーゼ（glycolyase）活性を利用しない別の効率的な方法が、これらの制限を克服し得る。
【００１３】
一般的な意味では、従来法のその他の制限は、ＵＤＧ／ＵＮＧ酵素の特性と関連している。ＵＤＧは、ＰＣＲの最初の変性工程の際に不活化されるといわれており、酵素を不活化するのに９５℃で１０分間の変性が必要とされる。ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ Ｔａｑポリメラーゼ酵素を利用しない標準ＰＣＲは、通常、９５度で３〜５分の最初の変性を有し、これは、ＵＤＧまたはＵＮＧを不活化するのに十分ではない場合がある。さらに、熱安定性ＵＮＧが、７５℃〜９０℃の温度で何らかの残存活性を保持する可能性もあり、５５℃未満の温度ではＵＤＧ活性が部分的にしか再活性化され得ない。実際、酵素が、不活性のままであることを確実にするために、ＰＣＲの完了に、７２℃浸漬／保存工程を含めるべきであると推奨されてきた。設計されるプライマー／オリゴヌクレオチドのうち相当な割合が、５５℃未満または約５５℃の最適アニーリング温度を有し、従って、新規に増幅されたＤＮＡ鎖が、ＰＣＲの際に切断される可能性がある。これらの問題の一部またはすべてが、ＨＫ（商標）ＵＮＧ熱不安定性ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなどの熱不安定性ＵＤＧまたはＵＮＧを使用することによって克服され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、増幅反応におけるキャリーオーバー汚染排除におけるＵＤＧ／ＵＮＧの必要性を撤廃する手順を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、核酸増幅の不要な産物であるキャリーオーバー汚染物質を排除するための戦略に関する。概して、本発明は、汚染物質アンプリコンへの非天然塩基の組み込みおよび非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素の使用に関する。
【００１６】
第１の態様では、本発明は、キャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用を提供する。
【００１７】
非天然塩基は、エンドヌクレアーゼ基質、好ましくは、エンドヌクレアーゼＶ基質である、核酸中に組み込まれ得る化合物と定義される。適した非天然塩基の例として、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそのデオキシ−三リン酸類似体がある。その他の非天然塩基も、適したエンドヌクレアーゼの選択的分解特徴を使用する本発明に適したものであり得ると理解されたい。
【００１８】
好ましくは、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素として、エンドヌクレアーゼＶがある。
【００１９】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡおよびＲＮＡなどの正常な核酸および重亜硫酸塩処理された核酸の線形または指数関数的複製とともに使用できる。増幅／複製プロトコールにおいて使用される正常な反応条件に加え、反応条件を調整することができる。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、
（a）デオキシイノシン三リン酸（dITP）またはデオキシキサントシン三リン酸（dXTP）またはデオキシオキサノシン（dOTP）またはそれらの組合せ、
（b）デオキシグアニン三リン酸（dGTP）デオキシアデニン三リン酸（dATP）、デオキシシトシン三リン酸（dCTP）、デオキシチミン三リン酸（dTTP）を包含するデオキシヌクレオチド（dNTP）、
（c）非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素、および
（d）熱安定性ポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物を提供する。
【００２１】
増幅反応混合物は、使用されているｄＩＴＰまたはｄＸＴＰまたはｄＯＴＰまたはそれらの組合せの濃度と比較して、制限濃度の１種または複数のｄＮＴＰを含むことが好ましい。
【００２２】
非天然塩基ｄＩＴＰが使用される場合には、増幅反応混合物は、制限濃度のｄＧＴＰを含むことが好ましい。
【００２３】
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素は、エンドヌクレアーゼＶなどのエンドヌクレアーゼであることが好ましい。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られ、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌（Escherichia coli）細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。より最近、サルモネラ菌属およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（TMA）などの生物からその他のエンドヌクレアーゼＶ酵素が単離され、これらはオリジナルの大腸菌酵素と同様の基質認識を有することがわかった。この酵素は、イノシンを含有する核酸鎖を優先的に切断するが、キサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸も、損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、ヌクレオチド類似体が、次いで、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシウリジン残基、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００２４】
すべての核酸の増幅とともに使用するのに適した熱安定性ポリメラーゼとして、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50（商標）、Tko、Bst、Vent（登録商標）、Deep Vent（商標）、Phusioｎ（商標）、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT（商標）、Therminator、polκ、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA I ポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT（商標）、Thermoscript RT（商標）、スーパースクリプト III）およびエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼ I）およびそれらの突然変異体またはキメラが挙げられる。ｄＮＴＰ、主にｄＣＴＰを（ｄＩＴＰと反対に）挿入することに適合していることがわかっている酵素として、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈおよびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１由来のＫＯＤならびに標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体がある。
【００２５】
本発明において使用するための可能性ある候補であるか、または増幅活性を起こすかまたは増強するためにさらに改変される、いくつかの改変ポリメラーゼが、ＥＰ１８０１２１１３に開示されている。ＥＰ１８０１２１１３において定義される酵素５Ｄ４は、イノシン含有核酸を増幅するのに特に適していることが本発明者によって見出されている。
【００２６】
増幅反応混合物は、増幅のためのプライマーまたはプライマーセットをさらに含有し得る。
【００２７】
第３の態様では、本発明は、核酸増幅の間に起こり得るキャリーオーバー汚染を排除する方法であって、
（a）増幅される核酸鋳型を含有する試料を提供する工程と、
（b）増幅反応のための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
（c）本発明の第２の態様の増幅混合物を提供する工程と、
（d）反応混合物中の、非天然塩基を含有する任意のアンプリコンが、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素によって分解されるよう、インキュベーション反応を実施する工程と、
（e）インキュベートされた反応混合物を、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を不活化する温度で加熱する工程と、
（f）核酸鋳型から所望の産物を増幅するために増幅反応を実施する工程と
を含む方法を提供する。
【００２８】
上記方法は、
（g）増幅産物をさらに処理または分析する工程
をさらに含み得る。
【００２９】
処理または分析する工程は、増幅産物のゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション、消化、リアルタイム増幅、アレイベースのアプローチ、ＲＦＬＰ分析および変法などの任意の適した手段によって、増幅産物の配列、メチル化状態、大きさ、長さを決定することを含み得る。
【００３０】
試料は、天然および重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡまたはそれらの核酸のいずれかの組合せを含み得る。
【００３１】
インキュベート工程（d）は、約０℃〜約７０℃であることが好ましい。加熱は、約３７℃であることがより好ましい。
【００３２】
インキュベート工程（d）は、通常、１秒間〜約９０分間実施すればよい。本発明者は、約３７℃で約１５分間インキュベートする工程が、ほとんどのＰＣＲ反応にとってよく働くことを見出した。
【００３３】
加熱工程（e）は、約７０℃〜約９５℃であることが好ましい。加熱は、イノシンを含有する核酸を分解できる酵素の完全不活性化を確実にするよう、約９５℃であることがより好ましい。
【００３４】
増幅反応（f）は、熱安定性ポリメラーゼが、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを使用して核酸鋳型をコピーするような通常の方法で実施することが好ましい。
【００３５】
本発明は、増幅反応のキャリーオーバー汚染を排除するために、重亜硫酸塩処理核酸に特に適している。
【００３６】
本発明の方法は、先行技術とは異なり、適した酵素の、核酸逆転写および／または増幅工程の間にｄＩＴＰを組み込む能力を利用する戦略を提供する。最初に、本発明は、核酸増幅の工程の間の新生合成核酸鎖へのｄＩＴＰの組み込みを可能にする。その後の逆転写および／または増幅反応では、本方法は、逆転写および／または増幅そのものの開始に先立って、反応容器中のｄＩＴＰを含有する任意のキャリーオーバー汚染物質を認識し、切断するエンドヌクレアーゼＶ酵素またはその他の適した酵素の能力を利用する。本方法は、重亜硫酸ナトリウム処理核酸に使用するのに特に適しているが、本方法は、天然核酸を鋳型として使用するすべての逆転写および増幅反応におけるキャリーオーバー汚染物質排除に適用でき、そのことが示されている。このキャリーオーバー汚染防止手段は、単一または複数の反応容器中で実施される、核酸を、線形または指数関数的に、逆転写および／または増幅する工程に関与するすべての技法（例えば、PCR、RT-PCRおよび／またはその他のDNA複製法）に適用できる。
【００３７】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、任意のその他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含まないことを意味するものではないと理解されよう。
【００３８】
文書、作用、物質、装置、品目または本明細書に含まれている同様のものについての任意の議論は、単に、本発明に状況を提供することを目的とするものである。これらの問題のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成するか、本明細書の各請求項の優先権主張日より前にオーストラリアにおいて存在したような、本発明が関連する技術分野における共通の一般知識であったということの承認ととられるべきではない。
【００３９】
本発明がより明確に理解され得るよう、好ましい実施形態を、以下の図面および実施例を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）およびデオキシグアニン三リン酸（dGTP）を補充したＰＣＲ反応混合物を使用したＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２】図１からのＰＣＲ産物の、エンドヌクレアーゼＶ酵素消化を使用するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図３】「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図４】「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後の２０および２５サイクルのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図５】「汚染物質」の排除に対する、可変エンドヌクレアーゼＶ濃度の効果を示す、ＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明者は、キャリーオーバー汚染排除におけるＵＤＧ／ＵＮＧの必要性を撤廃する手順を開発した。代わりに、エンドヌクレアーゼＶの特性およびその好ましい基質ｄＩＴＰまたはキサントシンおよびオキサノシンまたはそれらの組合せなどのその他の好ましい基質を利用して、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡを用いて研究することに伴う種々の制限を克服する。実際、本発明は、すべての種類の核酸（DNA、RNA、cDNA）に適用でき、重亜硫酸塩処理された核酸試料と処理されていない核酸試料の両方に適用できる。
【００４２】
本発明は、重亜硫酸塩修飾された核酸における優れたキャリーオーバー汚染防止を提供する。本発明は、キャリーオーバー汚染物質の完全な、特異的な排除を可能にする。本発明は、ＳａｆｅＢｉｓ法とは異なり、脱スルホン化の工程を促進するだけでなく、核酸を保存の間の分解から保護する適したアルカリバッファー中での、修飾された核酸の溶出、部分または完全脱スルホン化および安定な保存を可能にする。この強力な汚染排除戦略とロバストな重亜硫酸ナトリウム処理法（ＵＳ７２８８３７３）との組合せによって、メチル化状態の信頼できる正確な評価または微生物の特異的な高感度の検出が可能になる。
【００４３】
本発明は、修飾されていない核酸鋳型のその他の線形および指数関数的増幅、例えば、それだけには限らないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、ローリングサークル型増幅、全ゲノム増幅ならびに核酸の線形または指数関数的逆転写および／または増幅を含むすべての方法に適用できる。さらに、本発明は、それらの基質がＲＮＡまたはＤＮＡ中の天然に存在するヌクレオチドまたはヌクレオシドではない２種のその他のエンドヌクレアーゼである、ＦｐｇおよびｈＯＧＧ１の使用を提供する。両酵素は、切断のための損傷の５’および３’の最初のホスホジエステル結合を標的とすることによって、プリン、好ましくは、８−オキソグアニンを酸化すると報告されている。８−オキソグアニンは、酸化反応の変異原性塩基副産物である。本来、存在する見込みのないものなので、ヌクレオシド類似体の使用は、本発明と同様に働くはずである。さらに、キサントシンおよびオキサノシンは両方とも、グアニンの自然発生的脱アミノ化産物であり、これらはまた、異なる細菌供給源に由来するエンドヌクレアーゼＶ酵素によって認識される。したがって、これらの非天然塩基もまた、ＰＣＲ産物に組み込み、不要なＰＣＲクロスオーバー汚染を排除するのに有用であり得る。
【００４４】
本発明に使用される要素は、すべての種類の核酸の逆転写および／または増幅を含むすべての技法においてキャリーオーバー汚染を排除するためのキットの形態で提供され得ると理解される。
【００４５】
非天然塩基
非天然塩基は、本明細書において、核酸に組み込まれることができ、かつエンドヌクレアーゼ基質、好ましくは、エンドヌクレアーゼＶ基質である化合物として定義される。適した非天然塩基の例として、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそれらのデオキシ三リン酸類似体がある。その他の非天然塩基も、適したエンドヌクレアーゼの選択的分解特徴を使用する本発明に適したものであり得ると理解されたい。
【００４６】
酵素
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素（ezyme）として、エンドヌクレアーゼＶなどのエンドヌクレアーゼがある。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られ、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌（Escherichia coli）細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。より最近、サルモネラ菌属およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（TMA）などの生物からその他のエンドヌクレアーゼＶ酵素が単離され、これらはオリジナルの大腸菌酵素と同様の基質認識を有することがわかった。この酵素は、イノシンを含有する核酸鎖を優先的に切断するが、キサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸も、損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、ヌクレオチド類似体が、次いで、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシウリジン残基、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００４７】
すべての核酸の増幅とともに使用するのに適した熱安定性ポリメラーゼとして、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50（商標）、Tko、Bst、Vent（登録商標）、Deep Vent（商標）、Phusion（商標）、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT（商標）、Therminator、polκ、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA I ポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT（商標）、Thermoscript RT（商標）、スーパースクリプト III）ならびにエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼ I）およびそれらの突然変異体またはキメラならびに標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体が挙げられる。
【００４８】
本発明において使用するのに適していると思われるその他のポリメラーゼ酵素の例は、ＷＯ９９／０２６７１、ＷＯ００／４０７１２、ＷＯ０２／２２８６９、ＷＯ０３／０４４１８７、ＷＯ０５／０４５およびＥＰ１８０１２１１３（Medical Research Council）に開示される改変法を使用して得られる。
【００４９】
本発明において使用するための可能性ある候補であるか、または非天然塩基を含有する核酸に対する活性を起こすかまたは増強するためにさらに修飾される、いくつかの修飾された酵素が、ＥＰ１８０１２１１３に開示されている。例として、２Ｆ３、１Ａ１０、１Ａ９、２Ｆ１２、１Ｃ２、２Ｇ６、１Ａ８、２Ｆ１１、２Ｈ４、２Ｈ９、１Ｂ１２、２Ｈ２、１Ｃ８、２Ｈ１０Ｘ、３Ａ１０、３Ｂ５、３Ｂ６、３Ｂ８、３Ｂ１０、３Ｃ１２、３Ｄ１、４Ｄ１および５Ｄ４と表される酵素が挙げられる。酵素５Ｄ４が、イノシンを核酸に組み込むのに特に適していると本発明者によって見出された。
【００５０】
試料調製
試料は、組織、細胞から調製してよく、または血液、尿、糞便、精液、脳脊髄液、洗浄などの任意の生体試料、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの供給源から得た細胞または組織、胚または胚以外の系統から得た組織、環境試料、植物、細菌、細胞内寄生生物、ウイルス、真菌、原虫およびウイロイドなどをはじめとする微生物であり得る。本発明による処理に適した、哺乳類細胞種は、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、１９８９年、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、９９５−９９７に要約されている。
【００５１】
ヒト、動物、植物、細菌、真菌およびウイルス起源の試料から得た天然および重亜硫酸塩修飾された標的配列の転写および／または増幅とは、受精から死後４８時間までのすべての細胞、組織および臓器における、すべての生活環ステージ、ならびに、顕微鏡スライドなどの組織学的供給源に由来し得る試料、ブロックに包埋された試料、または合成もしくは天然表面から、もしくは液体から抽出された試料にも及ぶものとする。
【００５２】
分析は、健常な個人（ＷＨＯによって定義される健康）の細胞、組織および臓器間での、ならびに罹患個人から得た細胞、組織および臓器間での、天然に起こる変動を含む。この意味で罹患は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｊｅａｎ Ｄ Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃおよび続くその後の版に記載されるか、参照される、すべてのヒト疾患、苦痛、不快および異常な状態；ならびにＯＭＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man、www.ncbi.gov）に記載されるすべての疾患、苦痛、不快および異常な状態を含むが、主な死因、すなわち、悪性腫瘍、（癌）、虚血性心疾患、脳血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎およびインフルエンザ、動脈の疾患、（アテローム性動脈硬化症および大動脈瘤を含む）、真性糖尿病、ならびに不安神経症、ストレス関連精神神経状態および肥満症などの社会的に衰弱する状態と一緒の中枢神経系疾患ならびに異常な染色体数または染色体再編に起因するすべての状態、（常染色体ならびに性染色体が関与する異数性、重複、欠乏、転座および挿入）、ならびにミトコンドリアゲノムの同様の異常に重点を置く。
【００５３】
正常な個体または罹患個体は、（i）多様な民族性および進化的系統の集団、（ii）種族および地理的隔離集団、（iii）亜種、（iv）同一または異なる性別の双子または高次の多胎児、（v）正常な接合方法、人工授精、胚幹細胞法による、または核移植（体細胞または生殖系列核から得た）によるクローニングから、またはミトコンドリアもしくはその他の細胞小器官のインプットもしくは修飾から生じる個体、（vi）トランスジェニックノックアウト、ノックインまたはノックダウン法（ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または遺伝子活性が一時的にまたは永久に改変される任意の方法、例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム、トランスポゾン活性化、薬物または小分子法、ペプチド核酸（PNA）、インターカレーティング核酸（INA）、アルトリトール（Altritol）核酸（ANA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ロックド核酸（LNA）、シクロヘキサニル核酸（CNA）など、または限定されるものではないが、Ｔｒｏｊａｎペプチドなどの核酸ベースのコンジュゲートによるのいずれかの方法によって得られる個体、あるいは正常または異所性の妊娠の任意の段階の個体からのものであり得る。
【００５４】
分析はまた、以下のパラメータの変化および根底にある機序を、正常に変動する系および罹患系の両方で、診断および疾患状態モニタリングまたは決定および治療的変更を目的として、細胞外様式または細胞内様式でヒト疾患と関連している、原核生物または真核生物およびウイルス（またはそれらの組合せ）由来の、天然および修飾されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡも含む。
（i）遺伝病、
（ii）生物起源であろうと非生物起源であろうと、環境によって誘発される因子によって引き起こされる非遺伝的疾患またはエピジェネティックな疾患（この意味での環境は、妊娠のすべての段階の間、または受精および不妊処置の条件下の生物自体の内の環境も含むととられる）、
（iii）遺伝病または非遺伝病の素因、例えば、「プリオン」クラスの因子によって、圧力変化および無重力に対する曝露によって、または放射線の影響によって引き起こされる作用、
（iv）すべての細胞種、組織、臓器系および生体ネットワークにおける加齢の過程における（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、例えば、年齢関連鬱病、疼痛、精神神経および神経変性状態および閉経前および閉経後状態、（例えば、男女ともの受精能の低下）、
（v）癌における（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、（例えば、ＤＮＡ増幅、欠失、再編、転座および挿入事象から生じる異常な核型を有する細胞における変化）、および種々の細胞周期現象におけるそれらの変動または変化（例えば、日周リズム、光周期、睡眠、記憶、および「時差ぼけ」に対する細胞周期の効果）、
（vi）接合子から、胚発生、胎児発達、誕生、青年期、成人期および老齢期までの最も広義に定義される代謝ネットワークにおける（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化（例えば、低酸素症、無酸素症、任意の種類の照射（イオン化であろうと、非イオン化であろうと、または化学療法薬治療、近距離の岩などの自然源から、または軍もしくは政府支援の活動からの「放射性降下物」からの高高度曝露照射から生じるものであろうと）、ストレスによって、またはミトコンドリア、核またはオルガネラゲノム間の不均衡によって引き起こされる代謝効果、
（vii）タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなど、またはペプチドアプタマー（例えば、翻訳後付加物、翻訳後切断産物、翻訳後修飾（例えば、インテインおよびエキセイン、ユビキネーション（ubiquination）および分解産物）を含む任意のもの；複数の稀な天然アミノ酸ならびに単一の稀なアミノ酸（例えば、学習、脳成長および細胞死に関与するＤ−セリン）を含有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド；薬物、生物薬剤、化学物質（化学物質および生物薬剤の定義は、G.Ashton、2001、Nature Biotechnology 19、307-3111のものである））、既存の化合物の代謝産物、新規塩、プロドラッグ、エステル、ワクチン、抗原、ポリケチド、非リボソームペプチド、ビタミン、および任意の自然源に由来する分子（例えば、植物由来シクロパミン）に対する分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（viii）外部供給源に由来する、または内因性トランスポゾンまたはレトロトランスポゾンにおいてのように（SINESおよびLINES）内部で活性化された、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス（一本鎖であろうと二本鎖であろうと）に対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（ix）遺伝子起源であろうと非遺伝子起源であろうと（またはイントロンを含有してもしなくても）、ＲＮＡ転写物の逆転写されたコピーに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（x）（a）血液および脳脊髄液ならびに妊娠の前、妊娠中および妊娠後の母体の液体をはじめとするすべての液体中で循環する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸）、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＣＮＡ（HNAとは、例えば、Van Aetschotら、１９９５によって記載される核酸を意味し；MNAとは、Hossainら、1998によって記載される核酸を意味する。ANAとは、Allertら、1999によって記載される核酸を指す。LNAは、ＷＯ９９／１４２２６（Exiqon）に記載される任意のLNA分子であり得、LNAは、ＷＯ９９／１４２２６の要約に表される分子から選択されることが好ましい。LNAは、Singhら、1998、Koshkinら、1998またはObikaら、1997に記載される核酸であることがより好ましい。PNAとは、例えば、Nielsenら、1991によって記載されるペプチド核酸を指す）など（またはすべての組合せ中のいずれかのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、アプタマー）；例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなどの分子、（b）ペプチドと核酸のキメラである、またはコレステロール部分、ホルモンなどの天然分子と核酸のキメラであるコンジュゲートしている生体分子の組合せに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（xi）上記の（i）から（x）に記載される任意の摂動に対する、ヒトおよび動物起源の幹細胞の応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化（in vivo、ex vivoまたは新規環境または天然および合成基質（またはそれらの組合せ）と関連してのいずれか。
【００５５】
核酸の重亜硫酸塩処理
核酸物質を得るための任意の適した方法を使用してよい。例として、それだけには限らないが、市販のＤＮＡ、ＲＮＡキットまたは試薬、ワークステーション、プロテアーゼ試薬を含有する標準細胞溶解バッファーおよび有機抽出手順が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【００５６】
本方法は、反応容器中で実施してよい。反応容器は、任意の適した容器、例えば、試験管、プレート、毛細管、ウェル、遠心分離管、マイクロチューブ、スライド、カバースリップ、ビーズ、メンブレンまたは任意の適した表面であり得る。
【００５７】
通常、試料には、ＮａＯＨなどのアルカリを添加することによってアルカリ環境が提供される。核酸物質がＲＮＡである場合には、アルカリの代わりに熱を使用して、二次構造を持たない一本鎖物質を生じさせることが好ましい。分子が重亜硫酸塩試薬と容易に反応する状態へと二本鎖核酸分子を変性するために、アルカリ環境が提供される。しかし、当然のことながら、任意のその他の変性法、例えば、熱処理またはその他の適したアルカリもしくは変性剤、例えば、ＫＯＨおよび任意のその他のアルカリを添加または使用してもよい。
【００５８】
通常、重亜硫酸塩試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウムである。重亜硫酸塩試薬は、シトシン塩基の、スルホン酸シトシンへのスルホン化と、それに続く、スルホン酸シトシンの、スルホン酸ウラシルへの加水分解脱アミノ化を引き起こすために使用される。しかし、当然のことながら、任意のその他の適した重亜硫酸塩試薬、例えば、亜硫酸塩または酢酸イオンを使用してよい（Shapiro,R.、DiFate,V.、およびWelcher,M、(1974) J. Am. Chem. Soc 96: 906-912を参照のこと）。
【００５９】
スルホン化試薬とのインキュベーションは、７より低いｐＨで、スルホン酸ウラシル基の形成に有利に働く温度で実施してよい。７より低いｐＨは、シトシン塩基を、スルホン酸シトシンに、続いて、スルホン酸ウラシルに変換するスルホン化反応を実施するのに最適である。しかし、本方法は、必要に応じて、ｐＨ７を上回るスルホン化反応を用いて実施してもよい。
【００６０】
スルホン化反応は、重亜硫酸塩反応を増強できる添加剤の存在下で実施してもよい。適した添加剤の例として、それだけには限らないが、キノール、尿素、ＤＴＴおよびメトキシアミンが挙げられる。これらの試薬のうち、キノールは還元剤である。尿素およびメチオキシアミン（methyoxyamine）は、重亜硫酸塩反応の効率を改良するために加えられる薬剤である。さらに、ＤＴＴを、反応において、内因性ＲＮアーゼによるＲＮＡの分解を防ぐために使用してもよい。当然のことではあるが、その他の添加剤または薬剤も重亜硫酸塩反応に役立つよう提供され得る。スルホン化反応の結果、核酸試料中のメチル化シトシンは変化されないままであり、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。
【００６１】
よく働くとわかった反応条件は、以下のとおりである。処理されるＤＮＡ、またはその他の核酸は、最大２０μｌの容積に作製し、新しく調製した３Ｍ水酸化ナトリウム（BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）溶液２．２□ｌとともに、３７℃で１５分間インキュベートすることによって変性させる。水酸化ナトリウムの濃度およびインキュベーション時間は、鋳型核酸の変性を確実に完了させるのに必要なように調整してよい。３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）２２０μｌの新しく調製した溶液ｐＨ５．０（ｐＨは、１０Ｍ水酸化ナトリウム（BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）の添加によって調整する）および１００ｍＭキノール溶液（BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）１２μｌを加える。添加されるキノールの濃度は、実験的に決定される、約１０〜５００ｍＭの範囲中いずれであってもよい。次いで、溶液をボルテックス処理し、鉱油（Sigma分子生物学等級Ｍ−５９０４）２０８μｌで覆う。次いで、試料を、適した温度で、十分な重亜硫酸塩変換を見越した十分な時間、例えば、８０℃で、４５分間インキュベートする。当業者には、上記の容積、濃度およびインキュベーション時間および温度は、反応条件が、核酸のスルホン化に適している限り、変更してもよいということはということは理解される。
【００６２】
次いで、変換された核酸を、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ Ｉカラムなどの脱塩カラムを、製造業者の使用説明書に従って使用することによって、または沈殿によってのいずれかで脱塩する。沈殿のためには、その後の反応にとって阻害的である塩が、スルホン化核酸とともに共沈されないよう試料を希釈する。塩濃度は、約１Ｍ未満に希釈する。通常、希釈工程は、水またはバッファーを使用して、塩濃度を約０．５Ｍ未満に低下させるよう実施する。例えば、塩濃度は、通常、約１ｍＭ〜約１Ｍ未満、特に、約０．５Ｍ未満、約０．４Ｍ未満、約０．３Ｍ未満、約０．２Ｍ未満、約０．１Ｍ未満、約５０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満に、または必要に応じて、約１ｍＭ未満にさえ希釈する。当業者ならば、核酸との塩析を減少させて、その結果、その後の工程を、核酸試料の最小のさらなる精製または操作しか伴わずに実施できる適した希釈を容易に決定できる。希釈は、通常、水中で実施するが、バッファーが相当に沈殿しない限り、または塩を核酸とともに相当に沈殿させて、その後の反応を阻害しない限り、任意の適したバッファー、例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡまたはその他の生物学的バッファー中で実施してよい。通常、沈殿は、アルコールなどの沈殿剤を使用して実施する。核酸の沈殿のための例示的アルコールは、イソプロパノール、エタノールまたは任意のその他の適したアルコールから選択できる。
【００６３】
脱スルホン化工程は、沈殿した処理核酸のｐＨを、最大約１２．５に調整することによって実施してよい。アルカリ環境への曝露は、酸性ｐＨに対する事前の曝露によって誘導されたＤＮＡ中の脱プリン塩基部位において鎖の破壊を促進する傾向がある。したがって、鎖の破壊が避けられるべきである場合には、アルカリｐＨ処理は、最小にする。この工程は、適したバッファーまたはアルカリ試薬を用いて約ｐＨ１０．５〜１１．５で効率的に実施できる。適したバッファーまたはアルカリ試薬の例として、ｐＨ７．０〜１２．５を有するバッファーが挙げられる。当業者には当然のことながら、適したバッファーまたはアルカリ試薬は、利用可能な、広範囲の既知バッファーおよびアルカリ試薬から選択してよい。
【００６４】
使用される条件に応じて、脱スルホン化工程のための温度範囲は、室温から約９６℃までであり、時間は、２分から９６時間以上まで変わり得る。当業者ならば、脱スルホン化反応を実施するのに適した時間および温度を容易に決定できる。十分な脱スルホン化を可能にするようインキュベーション時間を増大する限り、室温より低い温度も使用してよい。したがって、インキュベーション工程は、約１０℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、および約９０℃で実施することができる。脱スルホン化反応を実施するのに特に有用な温度は、７５〜９０℃の温度範囲内にある。
【００６５】
増幅
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡおよびＲＮＡなどの正常な核酸および重亜硫酸塩処理核酸の線形または指数関数的複製とともに使用される方法を提供する。増幅／複製プロトコールにおいて使用される正常な反応条件に加え、反応条件を調整することができる。好ましい一形態では、本発明によって、増幅反応物中に、（i）種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）、（ii）反応混合物中における、残りのデオキシヌクレオチド（dNTP）濃度（すなわち、dATP、dCTP、dTTP）を変更する必要なく、制限濃度のデオキシグアニン三リン酸（dGTP）および（iii）エンドヌクレアーゼＶを含めることが可能になる。
【００６６】
イノシンは、アデニンから、アデノシンまたはイノシン一リン酸（IMP）中間体を介して誘導され、リボース環（リボフラノース）がヒポキサンチン分子と結合されると形成される。ｔＲＮＡ中でよく見られ、ゆらぎ塩基対の遺伝子翻訳に関与する必須の要素である。そのリボおよびデオキシリボヌクレオシド誘導体、ＩＴＰおよびｄＩＴＰは、ＤＮＡおよびＲＮＡと天然塩基ペアを形成できるが、形成される塩基ペアは、ワトソン−クリック塩基ペアよりも弱い。ｄＩＴＰ−ＤＮＡがＰＣＲの鋳型として作用する場合には、ｄＣＴＰが、ｄＩＴＰの反対側の唯一の置換基と報告されているが、デオキシイノシンは、以下の順：ｄＩ：ｄＣ＞ｄＩ：ｄＡ＞ｄＩ：ｄＧ〜ｄＩ：ｄＴでｄＮＴＰにおいて親和性を有するとわかった。反対に、直接配列決定の前のＰＣＲにおけるｄＩＴＰのｄＧＴＰとの置換は、配列決定された断片の積み重ねによって引き起こされる圧縮アーチファクトを成功裏に克服することができ、ならびに、安定的なヘアピン構造を核酸増幅にとって利用しやすいものにできると報告された。反対に、標準配列決定反応におけるｄＩＴＰの付加は、二次構造が多い領域の付近での中途での終結を促進すると思われるが、これは、配列決定反応の開始温度を９０℃から７０℃に下げることによって克服され得る。おそらく、これは、ｄＩＴＰの置換は、高温に耐容性を示すＴａｑポリメラーゼの能力にもかかわらず、鎖分離温度およびプライマーアニーリング温度を下げるという事実と関連している。直接配列決定の際に、ｄＩＴＰの配列決定反応の組み込みが、配列決定反応を中途で終結させることが観察され、直接配列決定には推奨されないが、中途終結率は反応温度を低下させることによって低減され得る。
【００６７】
デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られるエンドヌクレアーゼＶ（NEBカタログ番号Ｍ０３０５）は、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。さらに、Ｔ．マリティマ（T. maritima）に由来するエンドヌクレアーゼＶ（Fermentasカタログ番号ＥＮ０１４１）またはサルモネラ菌属エンドヌクレアーゼＶなどの任意のその他の適したエンドヌクレアーゼＶ酵素も反応において使用してよい。この酵素は、イノシンなどの非天然塩基、またキサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸鎖を損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、次いで、ＤＮＡが、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００６８】
すべての核酸の増幅とともに使用するための注目する酵素として、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50□、Tko、Bst、VentR（登録商標）、Deep Vent□、Phusion□、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT□、Therminator、pol□、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA Iポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT□、Thermoscript RT□、スーパースクリプトIII）、およびエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼＩ）およびそれらの突然変異体またはキメラが挙げられる。ｄＮＴＰ、主にｄＣＴＰを（ｄＩＴＰの反対に）挿入することに適合していることがわかっている酵素として、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈおよびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１から得られるＫＯＤおよび標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている、５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体がある。
【実施例】
【００６９】
本発明を実証するために、イノシンを、本発明に適した代表的な非天然塩基として使用した。
【００７０】
方法および試薬
化学薬品は、以下のとおりに入手した：Ａｌｄｒｉｃｈ製エタノール（St. Louis MO;200プルーフ:Ｅ７０２−３）；Ｓｉｇｍａ製イソプロパノール（St. Louis MO;９９％＋Sigma Ｉ−９５１６）；Ｓｉｇｍａ製鉱油（M-5904）；ＢＤＨ製キノール（AnalaR番号１０３１２２Ｅ）；Ｓｉｇｍａ製３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（S-7899）；Ｓｉｇｍａ製塩化ナトリウム（ＡＣＳ試薬Ｓ９８８８）；およびＢＤＨ製水酸化ナトリウム（AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）；ＢＤＨ製メタ重亜硫酸ナトリウム（AnalaR番号１０３５６）；Ｓｉｇｍａ製ジエチルエーテル（St.Louis MO;３０９９５８）；Ｓｉｇｍａ製ヘキサン（St. Louis MO;６５０４２０）；Ｏｘｏｉｄ製Ｌｕｒｉａ培養液（Liverpool;ＣＭ０９９６Ｂ）；Ｓｉｇｍａ製塩化マグネシウム（St.Louis MO;６３０６９）；Ｓｉｇｍａ製鉱油（M-5904）；Ｓｉｇｍａ製塩化カリウム（St. Louis MO;６０１４２）；Ｆｌｕｋａ製Ｓｐａｎ８０（Buchs CH;８５５４８）；Ｓｉｇｍａ製塩酸テトラサイクリン（St. Louis MO;Ｔ８０３２）；Ｓｉｇｍａ製Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（St. Louis MO;９３４２６）；Ｓｉｇｍａ製トリズマ塩酸塩（St. Louis MO;T5941）;Ｓｉｇｍａ製Ｔｗｅｅｎ ８０（St. Louis MO;Ｐ８０７４）。
【００７１】
酵素／試薬は、以下のとおりに入手した：Ｐｒｏｍｅｇａ製ｄＮＴＰ（Madison WI;Ｃ１１４５）；Ｒｏｃｈｅ製グリコーゲン（Indianapolis IN;番号１０ ９０１ ３９３ ００１）；およびＳｉｇｍａ製ＤＮＡマーカー（Direct load PCRローラダー100〜1000bp、Sigma D-3687および100〜10Kb、Sigma D-7058）;Ｐｒｏｍｅｇａ製ＰＣＲマスターミックス（Madison WI;番号Ｍ７５０５）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製のエンドヌクレアーゼＶ（Beverly MA;番号Ｍ０３０５）、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のｄＩＴＰ（カタログ番号Ｒ１１９１）、
【００７２】
溶液は、以下のとおりであった：（１）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０〜１２．５；（２）３Ｍ ＮａＯＨ（水５０ｍｌ中、６ｇ；BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）；（３）３Ｍメタ重亜硫酸塩（１０Ｎ ＮａＯＨ（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）４１６□ｌを含む、水２０ｍｌ中、７．６ｇ）；（４）１００ｍＭキノール（水５０ｍｌ中、０．５５ｇ；BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）；（５）５０×ＴＡＥゲル電気泳動バッファー（Trizma塩基２４２ｇ、氷酢酸５７．１ｍｌ、EDTA ３７．２ｇおよび全量１ｌまでの水）；（６）５×アガロースゲルローディングバッファー（１％ブロモフェノールブルー（Sigma Ｂ６１３１）１ｍｌ、キシレンシアノール（Sigma Ｘ−４１２６）１ｍｌ、グリセロール（Sigma Ｇ６２７９）３．２ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ８μｌ、５０×ＴＡＥバッファー２００μｌおよび全量１０ｍｌまでの水）；および（７）１×Ｔａｑバッファー（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．１％ Triton Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）。
【００７３】
鋳型ＤＮＡの重亜硫酸塩処理
核酸の重亜硫酸塩処理のための例示的プロトコールを以下に示し、これを使用して、新規な酵素によって増幅またはコピーするための鋳型核酸を作製した。このプロトコールによって、実質的にすべての処理されたＤＮＡを保持することが成功裏にもたらされる。当然のことではあるが、試料または試薬の容積または量は変更してもよい。
【００７４】
２０□ｌの容積中、核酸２□ｇに、３Ｍ ＮａＯＨ（新しく作製された、水５０ｍｌ中、６ｇ）２．２□ｌを加えた。重亜硫酸塩試薬は、一本鎖分子と反応することが好ましいので、この工程によって、二本鎖核酸分子を一本鎖の形態に変性する。混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。室温を上回る温度でのインキュベーションを使用して、変性効率を改善することができる。
【００７５】
インキュベーション後、３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム２２０□ｌ（新しく作製した、１０Ｎ ＮａＯＨ ３２０□ｌを含む、水４．６８ｍｌ中３．３５ｇ；BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）および１００ｍＭキノール（新しく作製した、水５０ｍｌ中、０．５５ｇ、BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）１２□ｌを連続して加える。キノールは、還元剤であり、試薬の酸化を低減するのに役立つ。その他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（DTT）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、またはその他の適した還元剤も使用できる。同様に、反応を増強する添加剤、例えば、メトキシアミンまたは尿素も組み込んでよい。試料を、鉱油２００□ｌで覆い、これによって、試薬の蒸発および酸化を防いだが、必須ではない。次いで、試料を８０℃で４５分間インキュベートした。２５℃〜９０℃のその他の温度も使用してよく、インキュベーションの長さは、５分から８時間以上まで変動する。
【００７６】
メタ重亜硫酸ナトリウムを用いて処理した後、オイルを除去し、核酸濃度が低かった場合は、グリコーゲン２□ｌ（２０ｍｇ／ｍｌ；Roche番号１０ ９０１ ３９３ ００１）またはｔＲＮＡ（Roche番号１０ １０９ ４９５ ００１）を加えた。これらの添加剤は任意選択であり、特に、核酸が低濃度で存在した場合には、これらを使用して、標的核酸と共沈させることによって、得られる核酸の収率を改善できる。通常、グリコーゲンは、ＤＮＡの沈殿において使用され、ＲＮＡとの共沈剤としてはｔＲＮＡが使用されたが、その他の共沈剤も使用してよい。
【００７７】
次いで、重亜硫酸塩修飾された核酸を、脱塩スピンカラム、例えば、Ｚｙｍｏ−ｓｐｉｎカラム（Zymo番号Ｃ１００３）を、製造業者の使用説明書に従って使用することによって脱塩した。あるいは、試料は、以下のとおりにイソプロパノール沈殿させてもよい。試料に水８００μｌを加え、混合し、次いで、イソプロパノール１ｍｌを加える。水またはバッファーが、反応容器中の重亜硫酸塩塩の濃度を、塩が注目する標的核酸とともに沈殿しないレベルに下げる。試料を再度混合し、４℃に６０分間静置するが、効果的に核酸の沈殿をもたらす限り、その他の温度および長さのインキュベーションを使用してもよい。試料を、１５，０００×ｇ、４℃で１０〜１５分間遠心分離し、ペレットを７０％ ＥｔＯＨで洗浄する。この洗浄処理によって、核酸とともに沈殿した任意の残存する塩を除去する。
【００７８】
ペレットを乾燥させ、次いで、下流の適用に応じて、適した容積のバッファーまたは水に再懸濁する。脱スルホン化が望まれる場合には、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ１０．５への再懸濁および９５℃で２０分間のインキュベーションが、ＤＮＡ試料の脱スルホン化に特に効率的であるとわかった。ｐＨ７．０〜１２．５のバッファーも使用でき、試料を、ユーザーによって許容されるレベルへの核酸の脱スルホン化を促進するよう、必要に応じて、３７℃〜９５℃で、１分から９６時間までインキュベートしてよい。
【００７９】
上記の方法は、１種または複数の制限酵素を用いる消化によって進めてもよい。以下に記載される同一のＤＮＡ試料の２種の独立した制限酵素消化が設定されている。消化のために選択される酵素は、通常、増幅されようとする配列に応じて変わる。例えば、２０μｌの容積でＥｃｏＲＩを用いて、ゲノムＤＮＡ２μｇを、３７℃で１時間消化する。この工程を使用して、ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡよりも重亜硫酸塩変換に受け入れられる、より小さい断片に消化する。また、超音波処理または物理的力を使用して、ＤＮＡをより小さい大きさの断片に剪断してもよい。超音波処理の強度および超音波処理の長さは、所望のＤＮＡ断片の大きさに基づいて選択される。個別の消化反応を、例えば、上記のようにＨｉｎｄＩＩＩを用いてゲノムＤＮＡ２μｇを消化することによって実施した。これらまたはその他の適した制限酵素を、前処理消化のために選択してもよい。消化されたＤＮＡを、上記のようにメタ重亜硫酸塩で処理する。
【００８０】
結果
キャリーオーバー汚染物質の排除およびＰＣＲ増幅
図１は、種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）およびデオキシグアニン三リン酸（dGTP）を補充したＰＣＲ反応混合物を使用したＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００８１】
ヒトゲノムＤＮＡ１マイクロリットル（Promega、２０ｎｇ／□ｌ）を、１×ＰＣＲバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびにミトコンドリア遺伝子、ＭＡＲＳに特異的であるフォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ各５０ｎｇからなる最終２５□ｌの反応容積で増幅した。ＰＣＲでは、２００マイクロモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを使用し、また、反応物に、以下の限定量のｄＩＴＰおよびｄＧＴＰを補充した。
レーン１：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ、対照反応
レーン２：１８０□ＭのｄＧＴＰおよび２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン３：１６０□ＭのｄＧＴＰおよび４０□ＭのｄＩＴＰ
レーン４：１２０□ＭのｄＧＴＰおよび８０□ＭのｄＩＴＰ
レーン５：８０□ＭのｄＧＴＰおよび１２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン６：４０□ＭのｄＧＴＰおよび１６０□ＭのｄＩＴＰ
レーン７：２０□ＭのｄＧＴＰおよび１８０□ＭのｄＩＴＰ
レーン８：０□ＭのｄＧＴＰおよび２００□ＭのｄＩＴＰ
レーン９：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ、鋳型なし
【００８２】
反応物を９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の３０サイクル間、ＰＣＲ増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。結果は、ｄＧＴＰが、ｄＩＴＰで完全に補われている場合には（レーン8）、増幅産物が検出されなかったということを示す。このことは、増幅反応では、ｄＩＴＰが、ｄＧＴＰを全く置換できないことを示す。
【００８３】
図２は、図１から得られたＰＣＲ産物のエンドヌクレアーゼＶ酵素消化の結果を示す。
【００８４】
ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒプライマーを用いて事前に増幅された９マイクロリットルのアンプリコン（図１参照のこと）を、１□ｌのエンドヌクレアーゼＶ（10U/□l）を用いて消化した。試料を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、９５℃で５分間不活化し、５□ｌの産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。
【００８５】
消化に使用した試料は、以下とした：
レーン１：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ（対照反応）
レーン２：８０□ＭのｄＧＴＰおよび１２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン３：４０□ＭのｄＧＴＰおよび１６０□ＭのｄＩＴＰ
レーン４：２０□ＭのｄＧＴＰおよび１８０□ＭのｄＩＴＰ
【００８６】
１０ユニットのエンドヌクレアーゼＶは、限定量のｄＧＴＰおよびｄＩＴＰを使用して作製したアンプリコンを部分的にまたは完全に消化するとわかった。対照的に、２００□ＭのｄＧＴＰのみを使用した対照反応物は消化されないままであった。
【００８７】
図３は、「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後のＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００８８】
図２から得られた、エンドヌクレアーゼＶ処理されたＰＣＲ産物または「汚染物質」を段階希釈した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promegaカタログ番号Ｍ７５０５）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ５０ｎｇを含むＰＣＲ反応において増幅した。
【００８９】
反応物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の５、１０、１５および２０サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。５、１０、１５および２０サイクルのＰＣＲの完了時に、反応を中止し、試料の１セットが除去され得るよう、試料を１５℃で浸漬した。試料の１セットが除去された時点でＰＣＲプロトコールを再開し、アガロースゲルで可視化した。
【００９０】
増幅される汚染物質の量は、以下とした：
レーン１：ニート汚染物質、未希釈
レーン２：１：１０希釈の汚染物質
レーン３：１：１００希釈の汚染物質
レーン４：１：１０００希釈の汚染物質
レーン５：１：１００００希釈の汚染物質
レーン６：鋳型なし対照
【００９１】
図４は、「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後の２０および２５サイクルのＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００９２】
図２から得られたエンドヌクレアーゼＶ処理されたＰＣＲ産物または「汚染物質」を段階希釈した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promega）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ５０ｎｇからなるＰＣＲ反応において増幅した。反応物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の２０または２５サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。図３とは異なり、ＰＣＲ反応は中断しなかった。
【００９３】
増幅される汚染物質の量は以下とした：
レーン１：ニート汚染物質、未希釈
レーン２：１：１０希釈の汚染物質
レーン３：１：１００希釈の汚染物質
レーン４：１：１０００希釈の汚染物質
レーン５：１：１００００希釈の汚染物質
レーン６：１：１０００００希釈の汚染物質
【００９４】
図５は、「汚染物質」の排除に対する可変エンドヌクレアーゼＶ濃度の効果を示す。
【００９５】
ヒトゲノムＤＮＡ１マイクロリットル（Promega、２０ｎｇ／□ｌ）を、１×ＰＣＲバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびにミトコンドリア遺伝子、ＭＡＲＳに特異的であるフォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−３Ｒ、それぞれ５０ｎｇからなる最終２５□ｌの反応容積で増幅した。ＰＣＲでは、２００マイクロモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを使用し、また、反応物に、以下の限定量のｄＩＴＰおよびｄＧＴＰを補充した。
【００９６】
ＰＣＲ産物を、１０ユニット（１）、５ユニット（２）、２．５ユニット（３）および１．２５ユニット（４）のエンドヌクレアーゼＶを用いて３７℃で１５分間処理した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promega）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、５０ｎｇを含むＰＣＲ反応において増幅した。反応物は、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の５サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。
【００９７】
結果は、ｄＩＴＰは、ヌクレオチドミックス中にいくらかの残存するｄＧＴＰが、依然としてある限り、ＰＣＲ増幅の間に効率的に組み込まれ得ることおよびｄＩＴＰを含有するＰＣＲ産物の完全消化は、エンドヌクレアーゼＶの使用によって達成できること（図１および２参照のこと）を示す。さらに、図２に示されるように、アンプリコンが希釈されず、続いて、再増幅された場合でさえ、消化された産物の再増幅が、２０サイクルの増幅後にＰＣＲ産物をもたらさないので、図３および図４に示されるように、反応混合物に、１８０μＭ／２０μＭの濃度のｄＩＴＰ／ｄＧＴＰを補充することは、ＰＣＲ産物の完全分解をもたらす（図３参照のこと）。図５は、増幅反応におけるエンドヌクレアーゼＶの濃度を低下させ、１．２５ユニットのみの酵素が使用される場合でさえ、依然として、増幅の大幅な低減を達成することが可能であることを示す。
【００９８】
ＰＣＲ増幅
プライマー、酵素、バッファー、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋および鋳型ＤＮＡなど、必要な要素すべてを含有するＰＣＲプレミックスを準備する。標準ＰＣＲ試薬に加え、反応物にｄＩＴＰおよびエンドヌクレアーゼＶを補充する。準備反応の間に、ミックスが、事前の反応に由来するアンプリコン（ｄＩＴＰを含む）で汚染された場合には、この汚染物質は、反応物を３７℃で約１５分間加熱することによって、ＰＣＲの開始に先立って除去できる。このプレインキュベーション工程は、鋳型ＤＮＡまたはＰＣＲプライマーに影響を及ぼさないが、これはこれらの要素のどちらも、ｄＩＴＰを含まないからである。ｄＩＴＰは、増幅された物質中にのみ組み込まれる。次の工程は、増幅間近の試料を分解しないようエンドヌクレアーゼＶを不活化することであった。不活性化は、最初の９５℃で３分間の変性工程の間に実施された。変性後、やはりｄＩＴＰを含有する新規アンプリコンを産生するＰＣＲ反応を、標準法で実施し、次いで、これを任意の適した手段によって逐次分析すればよい。
【００９９】
当業者には当然のことながら、特定の実施形態において示される本発明に、広く記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、多数の変法および／または改変を行うことができる。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、例示的と考えられるべきであって、制限的と考えられるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅反応におけるアンプリコンでのキャリーオーバー汚染の可能性を克服する戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８５年前後に開発されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiko，R.K.、Scharf，S.、Faloona，F.、Mullis，K.B.、Horn，G.T.、Erlich，H.A.、Arnheim，N.(1985). Science. 230: 1350-1354）は、事実上いかなる標的生物に由来するものでも、ＤＮＡであれＲＮＡであれ、ほんのわずかな量の核酸の検出および指数関数的増幅を可能にすることによって、生物システムの研究に革命をもたらした。通常のＰＣＲ反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの好熱性酵素、マグネシウムイオン（Mg2+）および４種のデオキシ−ヌクレオシド三リン酸（dNTP）、デオキシアデニン三リン酸（dATP）、デオキシグアニン（dGTP）、デオキシチミン（dTTP）およびデオキシシトシン（dCTP）の混合物を含む。理論上は、１コピーの核酸分子が、指数関数的に増幅され得、産物が、アガロースゲル電気泳動によって簡単に可視化され得るよう、十分に増幅された材料が得られる。したがって、４０サイクルの増幅を実施した場合には、単一の反応で、およそ２×１０１２コピーの標的核酸が生じる（ｎが、使用されるＰＣＲサイクルの数である場合、およそ２ｎコピー）。
【０００３】
増幅産物（本明細書においてアンプリコンと呼ばれる）の偶然の遊離を管理する戦略が実行されない場合は、ＰＣＲにおいて生成された多数のアンプリコンによる、キャリーオーバー汚染が問題となる。ＰＣＲの誕生以来、この方法の派生物、ならびに新規核酸増幅法（例えば、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）、リガーゼ連鎖反応、等温増幅、ローリングサークル型増幅）が開発されてきたが、それらのすべてがキャリーオーバー汚染の影響を受けやすい。キャリーオーバー汚染物質の存在は、偽陽性結果の１つの理由である。研究室状況では、特に、キャリーオーバー汚染物質の結果としての偽陽性結果は、データを無価値にする。したがって、実験は、相当に増大した経費および労力をかけて反復されなければならない。臨床状況では、キャリーオーバー汚染と関連している場合もそうでない場合も偽陽性結果は、特に、結果が、患者管理のための正しい投薬計画の決定に使用される場合には、深刻な結果を有し得る。
【０００４】
キャリーオーバー汚染は、以前増幅された標的ＤＮＡがアッセイに偶然に、または気づかずに入ることの結果として起こる。汚染物質は、質の悪い研究室業務の結果として、または汚染された実験機器、使い捨ておよび使い捨てではないガラス製品、プラスチック製品および試薬、ならびに試験とその他の環境汚染物質間のキャリーオーバー汚染の結果としてアッセイに入ってしまう可能性がある。
【０００５】
必要な場合には、汚染物質を含まない結果を達成するための２つの態様−（a）「防衛の最前線」としての汚染の防止および（b）汚染物質の破壊がある。
【０００６】
ＰＣＲ汚染物質を破壊するために使用できる方法として、（i）ＵＶ照射、（ii）次亜塩素酸ナトリウム、塩酸またはヒドロキシルアミン塩酸塩を用いる化学的排除、または（iii）１種または複数の酵素（単数または複数）を用いる処理が挙げられる。ＰＣＲプレミックス、実験室の表面、消耗品および機器からＤＮＡ／ＲＮＡを排除するのに効率的であるＵＶ照射は、ヌクレオチドの酸化を誘導し、その結果、一本鎖および二本鎖が破壊され、隣接するピリミジン間にシクロブタン環が形成される。形成されたピリミジン二量体は、Ｔａｑポリメラーゼによる産物の伸長を阻害する。次亜塩素酸ナトリウムは、強力な酸化剤であり、これもまた、核酸中の一本鎖および二本鎖の破壊を誘導する。還元剤であるヒドロキシルアミン塩酸塩は、正常な塩基対形成を破壊し、効率的なＰＣＲ後汚染防止であるが、変異原性である。しかし、これらの方法は、主に表面および容器の汚染除去に限定され、ＰＣＲ反応プレミックスの実際の準備とは適合しない。
【０００７】
核酸標的の酵素的処理は、汚染物質を排除するための第３の方法であり、核酸増幅反応と適合するとわかっている。汚染物質を破壊するために使用される酵素として、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼまたはエンドヌクレアーゼ／特定のヌクレオチドまたはヌクレオシドを標的とするＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを挙げることができる。ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼは、核酸およびその増幅産物を除去するのに効率的であるが、サブクローニングなど下流適用に干渉するであろう、不活性化後に残存する酵素活性がある場合がある。より重要なことには、このような酵素の使用もまた、標的分子ならびに可能性ある汚染を両方とも破壊するので、ＰＣＲ反応混合物の準備と適合しない。
【０００８】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（UDG）／ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（UNG）は、おそらく、キャリーオーバー汚染物質を排除するために使用される、最もよく知られているエンドヌクレアーゼである。増幅反応では、ｄＴＴＰは、ｄＵＴＰで置換され、これがＵＤＧ／ＵＮＧ消化の標的である。この酵素は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの糖骨格からウラシルを除去して脱塩基部位を作製し、サーマス・アクアチウス（Thermus aquatius）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）などの熱安定性酵素がこれを迂回して非効率的になり、ひいては、核酸増幅を阻害する。このＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染管理戦略は、単一試験管核酸増幅と適合しており、それによって、試験管を開けることに起因するさらなる汚染の機会が最小になる。具体的に言えば、この酵素を、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応プレミックス中に含めてもよい。ＵＤＧ／ＵＮＧは、増幅前にＰＣＲ反応混合物中に入ってしまったｄＵＴＰを含有する任意の増幅汚染物質を特異的に分解する。次いで、この酵素を、ＰＣＲの最初の変性工程の間に不活化して、新規標的アンプリコンの分解を防ぐ。この系は、ＰＣＲにおけるキャリーオーバー汚染を防ぐよう適応させられており、種々の増幅キットにおいて商業的に販売されている。しかし、この戦略は、重亜硫酸ナトリウム処理された核酸とは適合しない。これは、この修飾の工程が、シトシン残基を、ウラシルスルホニル中間体を介してウラシルに脱アミノ化するからである。
【０００９】
重亜硫酸ナトリウム修飾は、重亜硫酸塩（bisulphite）反応によってシトシン残基が変換されるが、５メチル−シトシンは、この化学修飾に対して耐性であるので、ＤＮＡのメチル化状態を調べるために広く用いられている技術である。ヒトゲノムにおけるシトシン残基のメチル化は、発生および胚発生における遺伝子発現の調節および制御において極めて重要であることがわかっている。腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子のシトシン−グアニン（CG）リッチプロモーター中のシトシンの低メチル化および過剰メチル化は、発癌の過程に関係するとされている。ＤＮＡの重亜硫酸ナトリウム修飾は、５−メチル−シトシンが、発癌、発生および胚発生において役割を果たすという役割の研究を大きく促進した。しかし、重亜硫酸塩法自体は、重亜硫酸塩修飾工程の際に生じたウラシル残基が、任意のクロスオーバー汚染物質とともに分解されるので、理論的に言えば、現実的には、ＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染戦略とは不適合である。
【００１０】
しかし、最近開発された方法は、重亜硫酸ナトリウム処理された標的ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応物におけるキャリーオーバー汚染の排除におけるＵＤＧの使用を可能にした。重亜硫酸ナトリウム修飾における重要な工程は、６−スルホニルウラシル中間体からのスルホン酸基の除去である。一般に、この除去は、ＤＮＡポリメラーゼが、かさ高い付加物を含有するＤＮＡの増幅で極めて非効率であるので、増幅またはさらに処理の前に、処理されたＤＮＡを、高温のアルカリ環境に付すことによって起こる。この方法では、６−スルホニルウラシル（Epigenomics AGによって「SafeBis DNA」と呼ばれる）は、修飾および脱塩後、直ちに脱スルホン化されるわけではない。ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡ中のスルホニル基は、ＵＤＧ消化に対して保護を与えるようであり、従って、上記のＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰ汚染管理戦略を、標的ＤＮＡを分解することなくＰＣＲと合わせることができる。ＵＤＧ／ＵＮＧ処理後、反応物を約９５℃に２０〜３０分間加熱すると、その結果、ＵＤＧ／ＵＮＧが不活化され、同時に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを活性化し、６−スルホニルウラシル残基を脱スルホン化することができる。
【００１１】
ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡを包含するこの方法に関しては、いくつかの制限パラメータが存在する。第１に、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡは、溶出され、低温の中性ｐＨの溶液中に保存されなければならない。８〜９を超えるアルカリｐＨおよび／または高い保存温度が、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡの脱スルホン化を誘導する。ＳａｆｅＢｉｓ法では、修飾されたＤＮＡは、滅菌水で溶出されることになっている。ＤＮＡは、酸性加水分解に対して弱く、従って、水中で保存された場合には、分解に対して感受性が高いので、ＤＮＡは、長期間の保存のためには、ＴＥバッファーに再懸濁されるべきであると推奨されている。
【００１２】
この技術の別の制限は、高い汚染物質濃度は、この系によって破壊されない場合があるということである。ＵＤＧ／ＵＮＧのキャリーオーバー汚染物質の除去は、高濃度の汚染物質の存在下では最適ではない場合がある。５０℃未満のＰＣＲアニーリング温度では、ＵＤＧは再活性化された状態とならず、従って、標的核酸とＰＣＲの際に生じたアンプリコンの両方を消化する場合がある。重要なことに、ＳａｆｅＢｉｓ法は、最大１０，０００コピーまでのアンプリコンを成功裏に除去するとしか評価されていない。しかし、標準の４０サイクルＰＣＲは、約２４０または２×１０１２コピーの核酸標的を増幅できる。ＵＤＧ／ＵＮＧ−ｄＵＴＰキャリーオーバー汚染管理戦略は、ＳａｆｅＢｉｓ ＤＮＡにとって妥当である（ある程度）ことが確認されている一方、重亜硫酸ナトリウム変換のウラシル中間体ならびにウラシル−Ｄ−およびウラシル−Ｎ−グリコリアーゼ（glycolyase）活性を利用しない別の効率的な方法が、これらの制限を克服し得る。
【００１３】
一般的な意味では、従来法のその他の制限は、ＵＤＧ／ＵＮＧ酵素の特性と関連している。ＵＤＧは、ＰＣＲの最初の変性工程の際に不活化されるといわれており、酵素を不活化するのに９５℃で１０分間の変性が必要とされる。ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ Ｔａｑポリメラーゼ酵素を利用しない標準ＰＣＲは、通常、９５度で３〜５分の最初の変性を有し、これは、ＵＤＧまたはＵＮＧを不活化するのに十分ではない場合がある。さらに、熱安定性ＵＮＧが、７５℃〜９０℃の温度で何らかの残存活性を保持する可能性もあり、５５℃未満の温度ではＵＤＧ活性が部分的にしか再活性化され得ない。実際、酵素が、不活性のままであることを確実にするために、ＰＣＲの完了に、７２℃浸漬／保存工程を含めるべきであると推奨されてきた。設計されるプライマー／オリゴヌクレオチドのうち相当な割合が、５５℃未満または約５５℃の最適アニーリング温度を有し、従って、新規に増幅されたＤＮＡ鎖が、ＰＣＲの際に切断される可能性がある。これらの問題の一部またはすべてが、ＨＫ（商標）ＵＮＧ熱不安定性ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなどの熱不安定性ＵＤＧまたはＵＮＧを使用することによって克服され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、増幅反応におけるキャリーオーバー汚染排除におけるＵＤＧ／ＵＮＧの必要性を撤廃する手順を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、核酸増幅の不要な産物であるキャリーオーバー汚染物質を排除するための戦略に関する。概して、本発明は、汚染物質アンプリコンへの非天然塩基の組み込みおよび非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素の使用に関する。
【００１６】
第１の態様では、本発明は、キャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用を提供する。
【００１７】
非天然塩基は、エンドヌクレアーゼ基質、好ましくは、エンドヌクレアーゼＶ基質である、核酸中に組み込まれ得る化合物と定義される。適した非天然塩基の例として、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそのデオキシ−三リン酸類似体がある。その他の非天然塩基も、適したエンドヌクレアーゼの選択的分解特徴を使用する本発明に適したものであり得ると理解されたい。
【００１８】
好ましくは、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素として、エンドヌクレアーゼＶがある。
【００１９】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡおよびＲＮＡなどの正常な核酸および重亜硫酸塩処理された核酸の線形または指数関数的複製とともに使用できる。増幅／複製プロトコールにおいて使用される正常な反応条件に加え、反応条件を調整することができる。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、
（a）デオキシイノシン三リン酸（dITP）またはデオキシキサントシン三リン酸（dXTP）またはデオキシオキサノシン（dOTP）またはそれらの組合せ、
（b）デオキシグアニン三リン酸（dGTP）デオキシアデニン三リン酸（dATP）、デオキシシトシン三リン酸（dCTP）、デオキシチミン三リン酸（dTTP）を包含するデオキシヌクレオチド（dNTP）、
（c）非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素、および
（d）熱安定性ポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物を提供する。
【００２１】
増幅反応混合物は、使用されているｄＩＴＰまたはｄＸＴＰまたはｄＯＴＰまたはそれらの組合せの濃度と比較して、制限濃度の１種または複数のｄＮＴＰを含むことが好ましい。
【００２２】
非天然塩基ｄＩＴＰが使用される場合には、増幅反応混合物は、制限濃度のｄＧＴＰを含むことが好ましい。
【００２３】
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素は、エンドヌクレアーゼＶなどのエンドヌクレアーゼであることが好ましい。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られ、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌（Escherichia coli）細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。より最近、サルモネラ菌属およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（TMA）などの生物からその他のエンドヌクレアーゼＶ酵素が単離され、これらはオリジナルの大腸菌酵素と同様の基質認識を有することがわかった。この酵素は、イノシンを含有する核酸鎖を優先的に切断するが、キサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸も、損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、ヌクレオチド類似体が、次いで、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシウリジン残基、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００２４】
すべての核酸の増幅とともに使用するのに適した熱安定性ポリメラーゼとして、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50（商標）、Tko、Bst、Vent（登録商標）、Deep Vent（商標）、Phusioｎ（商標）、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT（商標）、Therminator、polκ、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA I ポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT（商標）、Thermoscript RT（商標）、スーパースクリプト III）およびエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼ I）およびそれらの突然変異体またはキメラが挙げられる。ｄＮＴＰ、主にｄＣＴＰを（ｄＩＴＰと反対に）挿入することに適合していることがわかっている酵素として、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈおよびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１由来のＫＯＤならびに標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体がある。
【００２５】
本発明において使用するための可能性ある候補であるか、または増幅活性を起こすかまたは増強するためにさらに改変される、いくつかの改変ポリメラーゼが、ＥＰ１８０１２１１３に開示されている。ＥＰ１８０１２１１３において定義される酵素５Ｄ４は、イノシン含有核酸を増幅するのに特に適していることが本発明者によって見出されている。
【００２６】
増幅反応混合物は、増幅のためのプライマーまたはプライマーセットをさらに含有し得る。
【００２７】
第３の態様では、本発明は、核酸増幅の間に起こり得るキャリーオーバー汚染を排除する方法であって、
（a）増幅される核酸鋳型を含有する試料を提供する工程と、
（b）増幅反応のための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
（c）本発明の第２の態様の増幅混合物を提供する工程と、
（d）反応混合物中の、非天然塩基を含有する任意のアンプリコンが、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素によって分解されるよう、インキュベーション反応を実施する工程と、
（e）インキュベートされた反応混合物を、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を不活化する温度で加熱する工程と、
（f）核酸鋳型から所望の産物を増幅するために増幅反応を実施する工程と
を含む方法を提供する。
【００２８】
上記方法は、
（g）増幅産物をさらに処理または分析する工程
をさらに含み得る。
【００２９】
処理または分析する工程は、増幅産物のゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション、消化、リアルタイム増幅、アレイベースのアプローチ、ＲＦＬＰ分析および変法などの任意の適した手段によって、増幅産物の配列、メチル化状態、大きさ、長さを決定することを含み得る。
【００３０】
試料は、天然および重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡまたはそれらの核酸のいずれかの組合せを含み得る。
【００３１】
インキュベート工程（d）は、約０℃〜約７０℃であることが好ましい。加熱は、約３７℃であることがより好ましい。
【００３２】
インキュベート工程（d）は、通常、１秒間〜約９０分間実施すればよい。本発明者は、約３７℃で約１５分間インキュベートする工程が、ほとんどのＰＣＲ反応にとってよく働くことを見出した。
【００３３】
加熱工程（e）は、約７０℃〜約９５℃であることが好ましい。加熱は、イノシンを含有する核酸を分解できる酵素の完全不活性化を確実にするよう、約９５℃であることがより好ましい。
【００３４】
増幅反応（f）は、熱安定性ポリメラーゼが、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを使用して核酸鋳型をコピーするような通常の方法で実施することが好ましい。
【００３５】
本発明は、増幅反応のキャリーオーバー汚染を排除するために、重亜硫酸塩処理核酸に特に適している。
【００３６】
本発明の方法は、先行技術とは異なり、適した酵素の、核酸逆転写および／または増幅工程の間にｄＩＴＰを組み込む能力を利用する戦略を提供する。最初に、本発明は、核酸増幅の工程の間の新生合成核酸鎖へのｄＩＴＰの組み込みを可能にする。その後の逆転写および／または増幅反応では、本方法は、逆転写および／または増幅そのものの開始に先立って、反応容器中のｄＩＴＰを含有する任意のキャリーオーバー汚染物質を認識し、切断するエンドヌクレアーゼＶ酵素またはその他の適した酵素の能力を利用する。本方法は、重亜硫酸ナトリウム処理核酸に使用するのに特に適しているが、本方法は、天然核酸を鋳型として使用するすべての逆転写および増幅反応におけるキャリーオーバー汚染物質排除に適用でき、そのことが示されている。このキャリーオーバー汚染防止手段は、単一または複数の反応容器中で実施される、核酸を、線形または指数関数的に、逆転写および／または増幅する工程に関与するすべての技法（例えば、PCR、RT-PCRおよび／またはその他のDNA複製法）に適用できる。
【００３７】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、任意のその他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群を含まないことを意味するものではないと理解されよう。
【００３８】
文書、作用、物質、装置、品目または本明細書に含まれている同様のものについての任意の議論は、単に、本発明に状況を提供することを目的とするものである。これらの問題のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成するか、本明細書の各請求項の優先権主張日より前にオーストラリアにおいて存在したような、本発明が関連する技術分野における共通の一般知識であったということの承認ととられるべきではない。
【００３９】
本発明がより明確に理解され得るよう、好ましい実施形態を、以下の図面および実施例を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）およびデオキシグアニン三リン酸（dGTP）を補充したＰＣＲ反応混合物を使用したＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２】図１からのＰＣＲ産物の、エンドヌクレアーゼＶ酵素消化を使用するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図３】「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図４】「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後の２０および２５サイクルのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図５】「汚染物質」の排除に対する、可変エンドヌクレアーゼＶ濃度の効果を示す、ＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明者は、キャリーオーバー汚染排除におけるＵＤＧ／ＵＮＧの必要性を撤廃する手順を開発した。代わりに、エンドヌクレアーゼＶの特性およびその好ましい基質ｄＩＴＰまたはキサントシンおよびオキサノシンまたはそれらの組合せなどのその他の好ましい基質を利用して、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡを用いて研究することに伴う種々の制限を克服する。実際、本発明は、すべての種類の核酸（DNA、RNA、cDNA）に適用でき、重亜硫酸塩処理された核酸試料と処理されていない核酸試料の両方に適用できる。
【００４２】
本発明は、重亜硫酸塩修飾された核酸における優れたキャリーオーバー汚染防止を提供する。本発明は、キャリーオーバー汚染物質の完全な、特異的な排除を可能にする。本発明は、ＳａｆｅＢｉｓ法とは異なり、脱スルホン化の工程を促進するだけでなく、核酸を保存の間の分解から保護する適したアルカリバッファー中での、修飾された核酸の溶出、部分または完全脱スルホン化および安定な保存を可能にする。この強力な汚染排除戦略とロバストな重亜硫酸ナトリウム処理法（ＵＳ７２８８３７３）との組合せによって、メチル化状態の信頼できる正確な評価または微生物の特異的な高感度の検出が可能になる。
【００４３】
本発明は、修飾されていない核酸鋳型のその他の線形および指数関数的増幅、例えば、それだけには限らないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、ローリングサークル型増幅、全ゲノム増幅ならびに核酸の線形または指数関数的逆転写および／または増幅を含むすべての方法に適用できる。さらに、本発明は、それらの基質がＲＮＡまたはＤＮＡ中の天然に存在するヌクレオチドまたはヌクレオシドではない２種のその他のエンドヌクレアーゼである、ＦｐｇおよびｈＯＧＧ１の使用を提供する。両酵素は、切断のための損傷の５’および３’の最初のホスホジエステル結合を標的とすることによって、プリン、好ましくは、８−オキソグアニンを酸化すると報告されている。８−オキソグアニンは、酸化反応の変異原性塩基副産物である。本来、存在する見込みのないものなので、ヌクレオシド類似体の使用は、本発明と同様に働くはずである。さらに、キサントシンおよびオキサノシンは両方とも、グアニンの自然発生的脱アミノ化産物であり、これらはまた、異なる細菌供給源に由来するエンドヌクレアーゼＶ酵素によって認識される。したがって、これらの非天然塩基もまた、ＰＣＲ産物に組み込み、不要なＰＣＲクロスオーバー汚染を排除するのに有用であり得る。
【００４４】
本発明に使用される要素は、すべての種類の核酸の逆転写および／または増幅を含むすべての技法においてキャリーオーバー汚染を排除するためのキットの形態で提供され得ると理解される。
【００４５】
非天然塩基
非天然塩基は、本明細書において、核酸に組み込まれることができ、かつエンドヌクレアーゼ基質、好ましくは、エンドヌクレアーゼＶ基質である化合物として定義される。適した非天然塩基の例として、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそれらのデオキシ三リン酸類似体がある。その他の非天然塩基も、適したエンドヌクレアーゼの選択的分解特徴を使用する本発明に適したものであり得ると理解されたい。
【００４６】
酵素
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素（ezyme）として、エンドヌクレアーゼＶなどのエンドヌクレアーゼがある。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られ、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌（Escherichia coli）細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。より最近、サルモネラ菌属およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（TMA）などの生物からその他のエンドヌクレアーゼＶ酵素が単離され、これらはオリジナルの大腸菌酵素と同様の基質認識を有することがわかった。この酵素は、イノシンを含有する核酸鎖を優先的に切断するが、キサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸も、損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、ヌクレオチド類似体が、次いで、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、デオキシウリジン残基、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００４７】
すべての核酸の増幅とともに使用するのに適した熱安定性ポリメラーゼとして、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50（商標）、Tko、Bst、Vent（登録商標）、Deep Vent（商標）、Phusion（商標）、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT（商標）、Therminator、polκ、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA I ポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT（商標）、Thermoscript RT（商標）、スーパースクリプト III）ならびにエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼ I）およびそれらの突然変異体またはキメラならびに標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体が挙げられる。
【００４８】
本発明において使用するのに適していると思われるその他のポリメラーゼ酵素の例は、ＷＯ９９／０２６７１、ＷＯ００／４０７１２、ＷＯ０２／２２８６９、ＷＯ０３／０４４１８７、ＷＯ０５／０４５およびＥＰ１８０１２１１３（Medical Research Council）に開示される改変法を使用して得られる。
【００４９】
本発明において使用するための可能性ある候補であるか、または非天然塩基を含有する核酸に対する活性を起こすかまたは増強するためにさらに修飾される、いくつかの修飾された酵素が、ＥＰ１８０１２１１３に開示されている。例として、２Ｆ３、１Ａ１０、１Ａ９、２Ｆ１２、１Ｃ２、２Ｇ６、１Ａ８、２Ｆ１１、２Ｈ４、２Ｈ９、１Ｂ１２、２Ｈ２、１Ｃ８、２Ｈ１０Ｘ、３Ａ１０、３Ｂ５、３Ｂ６、３Ｂ８、３Ｂ１０、３Ｃ１２、３Ｄ１、４Ｄ１および５Ｄ４と表される酵素が挙げられる。酵素５Ｄ４が、イノシンを核酸に組み込むのに特に適していると本発明者によって見出された。
【００５０】
試料調製
試料は、組織、細胞から調製してよく、または血液、尿、糞便、精液、脳脊髄液、洗浄などの任意の生体試料、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの供給源から得た細胞または組織、胚または胚以外の系統から得た組織、環境試料、植物、細菌、細胞内寄生生物、ウイルス、真菌、原虫およびウイロイドなどをはじめとする微生物であり得る。本発明による処理に適した、哺乳類細胞種は、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、１９８９年、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、９９５−９９７に要約されている。
【００５１】
ヒト、動物、植物、細菌、真菌およびウイルス起源の試料から得た天然および重亜硫酸塩修飾された標的配列の転写および／または増幅とは、受精から死後４８時間までのすべての細胞、組織および臓器における、すべての生活環ステージ、ならびに、顕微鏡スライドなどの組織学的供給源に由来し得る試料、ブロックに包埋された試料、または合成もしくは天然表面から、もしくは液体から抽出された試料にも及ぶものとする。
【００５２】
分析は、健常な個人（ＷＨＯによって定義される健康）の細胞、組織および臓器間での、ならびに罹患個人から得た細胞、組織および臓器間での、天然に起こる変動を含む。この意味で罹患は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｊｅａｎ Ｄ Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃおよび続くその後の版に記載されるか、参照される、すべてのヒト疾患、苦痛、不快および異常な状態；ならびにＯＭＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man、www.ncbi.gov）に記載されるすべての疾患、苦痛、不快および異常な状態を含むが、主な死因、すなわち、悪性腫瘍、（癌）、虚血性心疾患、脳血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎およびインフルエンザ、動脈の疾患、（アテローム性動脈硬化症および大動脈瘤を含む）、真性糖尿病、ならびに不安神経症、ストレス関連精神神経状態および肥満症などの社会的に衰弱する状態と一緒の中枢神経系疾患ならびに異常な染色体数または染色体再編に起因するすべての状態、（常染色体ならびに性染色体が関与する異数性、重複、欠乏、転座および挿入）、ならびにミトコンドリアゲノムの同様の異常に重点を置く。
【００５３】
正常な個体または罹患個体は、（i）多様な民族性および進化的系統の集団、（ii）種族および地理的隔離集団、（iii）亜種、（iv）同一または異なる性別の双子または高次の多胎児、（v）正常な接合方法、人工授精、胚幹細胞法による、または核移植（体細胞または生殖系列核から得た）によるクローニングから、またはミトコンドリアもしくはその他の細胞小器官のインプットもしくは修飾から生じる個体、（vi）トランスジェニックノックアウト、ノックインまたはノックダウン法（ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または遺伝子活性が一時的にまたは永久に改変される任意の方法、例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム、トランスポゾン活性化、薬物または小分子法、ペプチド核酸（PNA）、インターカレーティング核酸（INA）、アルトリトール（Altritol）核酸（ANA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ロックド核酸（LNA）、シクロヘキサニル核酸（CNA）など、または限定されるものではないが、Ｔｒｏｊａｎペプチドなどの核酸ベースのコンジュゲートによるのいずれかの方法によって得られる個体、あるいは正常または異所性の妊娠の任意の段階の個体からのものであり得る。
【００５４】
分析はまた、以下のパラメータの変化および根底にある機序を、正常に変動する系および罹患系の両方で、診断および疾患状態モニタリングまたは決定および治療的変更を目的として、細胞外様式または細胞内様式でヒト疾患と関連している、原核生物または真核生物およびウイルス（またはそれらの組合せ）由来の、天然および修飾されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡも含む。
（i）遺伝病、
（ii）生物起源であろうと非生物起源であろうと、環境によって誘発される因子によって引き起こされる非遺伝的疾患またはエピジェネティックな疾患（この意味での環境は、妊娠のすべての段階の間、または受精および不妊処置の条件下の生物自体の内の環境も含むととられる）、
（iii）遺伝病または非遺伝病の素因、例えば、「プリオン」クラスの因子によって、圧力変化および無重力に対する曝露によって、または放射線の影響によって引き起こされる作用、
（iv）すべての細胞種、組織、臓器系および生体ネットワークにおける加齢の過程における（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、例えば、年齢関連鬱病、疼痛、精神神経および神経変性状態および閉経前および閉経後状態、（例えば、男女ともの受精能の低下）、
（v）癌における（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、（例えば、ＤＮＡ増幅、欠失、再編、転座および挿入事象から生じる異常な核型を有する細胞における変化）、および種々の細胞周期現象におけるそれらの変動または変化（例えば、日周リズム、光周期、睡眠、記憶、および「時差ぼけ」に対する細胞周期の効果）、
（vi）接合子から、胚発生、胎児発達、誕生、青年期、成人期および老齢期までの最も広義に定義される代謝ネットワークにおける（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化（例えば、低酸素症、無酸素症、任意の種類の照射（イオン化であろうと、非イオン化であろうと、または化学療法薬治療、近距離の岩などの自然源から、または軍もしくは政府支援の活動からの「放射性降下物」からの高高度曝露照射から生じるものであろうと）、ストレスによって、またはミトコンドリア、核またはオルガネラゲノム間の不均衡によって引き起こされる代謝効果、
（vii）タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなど、またはペプチドアプタマー（例えば、翻訳後付加物、翻訳後切断産物、翻訳後修飾（例えば、インテインおよびエキセイン、ユビキネーション（ubiquination）および分解産物）を含む任意のもの；複数の稀な天然アミノ酸ならびに単一の稀なアミノ酸（例えば、学習、脳成長および細胞死に関与するＤ−セリン）を含有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド；薬物、生物薬剤、化学物質（化学物質および生物薬剤の定義は、G.Ashton、2001、Nature Biotechnology 19、307-3111のものである））、既存の化合物の代謝産物、新規塩、プロドラッグ、エステル、ワクチン、抗原、ポリケチド、非リボソームペプチド、ビタミン、および任意の自然源に由来する分子（例えば、植物由来シクロパミン）に対する分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（viii）外部供給源に由来する、または内因性トランスポゾンまたはレトロトランスポゾンにおいてのように（SINESおよびLINES）内部で活性化された、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス（一本鎖であろうと二本鎖であろうと）に対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（ix）遺伝子起源であろうと非遺伝子起源であろうと（またはイントロンを含有してもしなくても）、ＲＮＡ転写物の逆転写されたコピーに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（x）（a）血液および脳脊髄液ならびに妊娠の前、妊娠中および妊娠後の母体の液体をはじめとするすべての液体中で循環する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸）、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＣＮＡ（HNAとは、例えば、Van Aetschotら、１９９５によって記載される核酸を意味し；MNAとは、Hossainら、1998によって記載される核酸を意味する。ANAとは、Allertら、1999によって記載される核酸を指す。LNAは、ＷＯ９９／１４２２６（Exiqon）に記載される任意のLNA分子であり得、LNAは、ＷＯ９９／１４２２６の要約に表される分子から選択されることが好ましい。LNAは、Singhら、1998、Koshkinら、1998またはObikaら、1997に記載される核酸であることがより好ましい。PNAとは、例えば、Nielsenら、1991によって記載されるペプチド核酸を指す）など（またはすべての組合せ中のいずれかのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、アプタマー）；例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなどの分子、（b）ペプチドと核酸のキメラである、またはコレステロール部分、ホルモンなどの天然分子と核酸のキメラであるコンジュゲートしている生体分子の組合せに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化、
（xi）上記の（i）から（x）に記載される任意の摂動に対する、ヒトおよび動物起源の幹細胞の応答による（例えば５−メチルシトシンの）遺伝的変化およびエピジェネティックな変化（in vivo、ex vivoまたは新規環境または天然および合成基質（またはそれらの組合せ）と関連してのいずれか。
【００５５】
核酸の重亜硫酸塩処理
核酸物質を得るための任意の適した方法を使用してよい。例として、それだけには限らないが、市販のＤＮＡ、ＲＮＡキットまたは試薬、ワークステーション、プロテアーゼ試薬を含有する標準細胞溶解バッファーおよび有機抽出手順が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【００５６】
本方法は、反応容器中で実施してよい。反応容器は、任意の適した容器、例えば、試験管、プレート、毛細管、ウェル、遠心分離管、マイクロチューブ、スライド、カバースリップ、ビーズ、メンブレンまたは任意の適した表面であり得る。
【００５７】
通常、試料には、ＮａＯＨなどのアルカリを添加することによってアルカリ環境が提供される。核酸物質がＲＮＡである場合には、アルカリの代わりに熱を使用して、二次構造を持たない一本鎖物質を生じさせることが好ましい。分子が重亜硫酸塩試薬と容易に反応する状態へと二本鎖核酸分子を変性するために、アルカリ環境が提供される。しかし、当然のことながら、任意のその他の変性法、例えば、熱処理またはその他の適したアルカリもしくは変性剤、例えば、ＫＯＨおよび任意のその他のアルカリを添加または使用してもよい。
【００５８】
通常、重亜硫酸塩試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウムである。重亜硫酸塩試薬は、シトシン塩基の、スルホン酸シトシンへのスルホン化と、それに続く、スルホン酸シトシンの、スルホン酸ウラシルへの加水分解脱アミノ化を引き起こすために使用される。しかし、当然のことながら、任意のその他の適した重亜硫酸塩試薬、例えば、亜硫酸塩または酢酸イオンを使用してよい（Shapiro,R.、DiFate,V.、およびWelcher,M、(1974) J. Am. Chem. Soc 96: 906-912を参照のこと）。
【００５９】
スルホン化試薬とのインキュベーションは、７より低いｐＨで、スルホン酸ウラシル基の形成に有利に働く温度で実施してよい。７より低いｐＨは、シトシン塩基を、スルホン酸シトシンに、続いて、スルホン酸ウラシルに変換するスルホン化反応を実施するのに最適である。しかし、本方法は、必要に応じて、ｐＨ７を上回るスルホン化反応を用いて実施してもよい。
【００６０】
スルホン化反応は、重亜硫酸塩反応を増強できる添加剤の存在下で実施してもよい。適した添加剤の例として、それだけには限らないが、キノール、尿素、ＤＴＴおよびメトキシアミンが挙げられる。これらの試薬のうち、キノールは還元剤である。尿素およびメチオキシアミン（methyoxyamine）は、重亜硫酸塩反応の効率を改良するために加えられる薬剤である。さらに、ＤＴＴを、反応において、内因性ＲＮアーゼによるＲＮＡの分解を防ぐために使用してもよい。当然のことではあるが、その他の添加剤または薬剤も重亜硫酸塩反応に役立つよう提供され得る。スルホン化反応の結果、核酸試料中のメチル化シトシンは変化されないままであり、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。
【００６１】
よく働くとわかった反応条件は、以下のとおりである。処理されるＤＮＡ、またはその他の核酸は、最大２０μｌの容積に作製し、新しく調製した３Ｍ水酸化ナトリウム（BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）溶液２．２□ｌとともに、３７℃で１５分間インキュベートすることによって変性させる。水酸化ナトリウムの濃度およびインキュベーション時間は、鋳型核酸の変性を確実に完了させるのに必要なように調整してよい。３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）２２０μｌの新しく調製した溶液ｐＨ５．０（ｐＨは、１０Ｍ水酸化ナトリウム（BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）の添加によって調整する）および１００ｍＭキノール溶液（BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）１２μｌを加える。添加されるキノールの濃度は、実験的に決定される、約１０〜５００ｍＭの範囲中いずれであってもよい。次いで、溶液をボルテックス処理し、鉱油（Sigma分子生物学等級Ｍ−５９０４）２０８μｌで覆う。次いで、試料を、適した温度で、十分な重亜硫酸塩変換を見越した十分な時間、例えば、８０℃で、４５分間インキュベートする。当業者には、上記の容積、濃度およびインキュベーション時間および温度は、反応条件が、核酸のスルホン化に適している限り、変更してもよいということはということは理解される。
【００６２】
次いで、変換された核酸を、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ Ｉカラムなどの脱塩カラムを、製造業者の使用説明書に従って使用することによって、または沈殿によってのいずれかで脱塩する。沈殿のためには、その後の反応にとって阻害的である塩が、スルホン化核酸とともに共沈されないよう試料を希釈する。塩濃度は、約１Ｍ未満に希釈する。通常、希釈工程は、水またはバッファーを使用して、塩濃度を約０．５Ｍ未満に低下させるよう実施する。例えば、塩濃度は、通常、約１ｍＭ〜約１Ｍ未満、特に、約０．５Ｍ未満、約０．４Ｍ未満、約０．３Ｍ未満、約０．２Ｍ未満、約０．１Ｍ未満、約５０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満に、または必要に応じて、約１ｍＭ未満にさえ希釈する。当業者ならば、核酸との塩析を減少させて、その結果、その後の工程を、核酸試料の最小のさらなる精製または操作しか伴わずに実施できる適した希釈を容易に決定できる。希釈は、通常、水中で実施するが、バッファーが相当に沈殿しない限り、または塩を核酸とともに相当に沈殿させて、その後の反応を阻害しない限り、任意の適したバッファー、例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡまたはその他の生物学的バッファー中で実施してよい。通常、沈殿は、アルコールなどの沈殿剤を使用して実施する。核酸の沈殿のための例示的アルコールは、イソプロパノール、エタノールまたは任意のその他の適したアルコールから選択できる。
【００６３】
脱スルホン化工程は、沈殿した処理核酸のｐＨを、最大約１２．５に調整することによって実施してよい。アルカリ環境への曝露は、酸性ｐＨに対する事前の曝露によって誘導されたＤＮＡ中の脱プリン塩基部位において鎖の破壊を促進する傾向がある。したがって、鎖の破壊が避けられるべきである場合には、アルカリｐＨ処理は、最小にする。この工程は、適したバッファーまたはアルカリ試薬を用いて約ｐＨ１０．５〜１１．５で効率的に実施できる。適したバッファーまたはアルカリ試薬の例として、ｐＨ７．０〜１２．５を有するバッファーが挙げられる。当業者には当然のことながら、適したバッファーまたはアルカリ試薬は、利用可能な、広範囲の既知バッファーおよびアルカリ試薬から選択してよい。
【００６４】
使用される条件に応じて、脱スルホン化工程のための温度範囲は、室温から約９６℃までであり、時間は、２分から９６時間以上まで変わり得る。当業者ならば、脱スルホン化反応を実施するのに適した時間および温度を容易に決定できる。十分な脱スルホン化を可能にするようインキュベーション時間を増大する限り、室温より低い温度も使用してよい。したがって、インキュベーション工程は、約１０℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、および約９０℃で実施することができる。脱スルホン化反応を実施するのに特に有用な温度は、７５〜９０℃の温度範囲内にある。
【００６５】
増幅
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡおよびＲＮＡなどの正常な核酸および重亜硫酸塩処理核酸の線形または指数関数的複製とともに使用される方法を提供する。増幅／複製プロトコールにおいて使用される正常な反応条件に加え、反応条件を調整することができる。好ましい一形態では、本発明によって、増幅反応物中に、（i）種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）、（ii）反応混合物中における、残りのデオキシヌクレオチド（dNTP）濃度（すなわち、dATP、dCTP、dTTP）を変更する必要なく、制限濃度のデオキシグアニン三リン酸（dGTP）および（iii）エンドヌクレアーゼＶを含めることが可能になる。
【００６６】
イノシンは、アデニンから、アデノシンまたはイノシン一リン酸（IMP）中間体を介して誘導され、リボース環（リボフラノース）がヒポキサンチン分子と結合されると形成される。ｔＲＮＡ中でよく見られ、ゆらぎ塩基対の遺伝子翻訳に関与する必須の要素である。そのリボおよびデオキシリボヌクレオシド誘導体、ＩＴＰおよびｄＩＴＰは、ＤＮＡおよびＲＮＡと天然塩基ペアを形成できるが、形成される塩基ペアは、ワトソン−クリック塩基ペアよりも弱い。ｄＩＴＰ−ＤＮＡがＰＣＲの鋳型として作用する場合には、ｄＣＴＰが、ｄＩＴＰの反対側の唯一の置換基と報告されているが、デオキシイノシンは、以下の順：ｄＩ：ｄＣ＞ｄＩ：ｄＡ＞ｄＩ：ｄＧ〜ｄＩ：ｄＴでｄＮＴＰにおいて親和性を有するとわかった。反対に、直接配列決定の前のＰＣＲにおけるｄＩＴＰのｄＧＴＰとの置換は、配列決定された断片の積み重ねによって引き起こされる圧縮アーチファクトを成功裏に克服することができ、ならびに、安定的なヘアピン構造を核酸増幅にとって利用しやすいものにできると報告された。反対に、標準配列決定反応におけるｄＩＴＰの付加は、二次構造が多い領域の付近での中途での終結を促進すると思われるが、これは、配列決定反応の開始温度を９０℃から７０℃に下げることによって克服され得る。おそらく、これは、ｄＩＴＰの置換は、高温に耐容性を示すＴａｑポリメラーゼの能力にもかかわらず、鎖分離温度およびプライマーアニーリング温度を下げるという事実と関連している。直接配列決定の際に、ｄＩＴＰの配列決定反応の組み込みが、配列決定反応を中途で終結させることが観察され、直接配列決定には推奨されないが、中途終結率は反応温度を低下させることによって低減され得る。
【００６７】
デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼとしても知られるエンドヌクレアーゼＶ（NEBカタログ番号Ｍ０３０５）は、標準ｄＮＴＰのバックグラウンドから、デオキシイノシンが組み込まれた一本鎖および二本鎖核酸を優先的に認識できる、大腸菌細菌に由来するＤＮＡ修復酵素である。さらに、Ｔ．マリティマ（T. maritima）に由来するエンドヌクレアーゼＶ（Fermentasカタログ番号ＥＮ０１４１）またはサルモネラ菌属エンドヌクレアーゼＶなどの任意のその他の適したエンドヌクレアーゼＶ酵素も反応において使用してよい。この酵素は、イノシンなどの非天然塩基、またキサントシンおよびオキサノシン残基を含有する核酸鎖を損傷の３’側の２番目のホスホジエステル結合で切断し、３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基とともにニックを残す。修復タンパク質の存在下では、次いで、ＤＮＡが、切除され、修復される。エンドヌクレアーゼＶはまた、脱塩基部位または尿素、塩基ミスマッチ、挿入／欠失ミスマッチ、ヘアピンおよび不対ループ、フラップおよび偽Ｙ構造（pseudo-Y structures）を含むＤＮＡを、相当に低率ではあるが認識する。
【００６８】
すべての核酸の増幅とともに使用するための注目する酵素として、それだけには限らないが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Pfx50□、Tko、Bst、VentR（登録商標）、Deep Vent□、Phusion□、ABV、UlTima、DyNAzyme EXT□、Therminator、pol□、pol IV、Dbh、Dpo4およびDpo4様酵素、DNA I、DNA Iポリメラーゼのクレノウ断片、Phi29、T4およびT7 DNAポリメラーゼ）、逆転写酵素（例えば、AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX RT□、Thermoscript RT□、スーパースクリプトIII）、およびエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼIII、IV、V、VIII、T7エンドヌクレアーゼＩ）およびそれらの突然変異体またはキメラが挙げられる。ｄＮＴＰ、主にｄＣＴＰを（ｄＩＴＰの反対に）挿入することに適合していることがわかっている酵素として、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈおよびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１から得られるＫＯＤおよび標準Ｔａｑポリメラーゼよりもイノシン残基を効率的にを組み込むことがわかっている、５Ｄ４と呼ばれるＴａｑポリメラーゼの修飾変異体がある。
【実施例】
【００６９】
本発明を実証するために、イノシンを、本発明に適した代表的な非天然塩基として使用した。
【００７０】
方法および試薬
化学薬品は、以下のとおりに入手した：Ａｌｄｒｉｃｈ製エタノール（St. Louis MO;200プルーフ:Ｅ７０２−３）；Ｓｉｇｍａ製イソプロパノール（St. Louis MO;９９％＋Sigma Ｉ−９５１６）；Ｓｉｇｍａ製鉱油（M-5904）；ＢＤＨ製キノール（AnalaR番号１０３１２２Ｅ）；Ｓｉｇｍａ製３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（S-7899）；Ｓｉｇｍａ製塩化ナトリウム（ＡＣＳ試薬Ｓ９８８８）；およびＢＤＨ製水酸化ナトリウム（AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）；ＢＤＨ製メタ重亜硫酸ナトリウム（AnalaR番号１０３５６）；Ｓｉｇｍａ製ジエチルエーテル（St.Louis MO;３０９９５８）；Ｓｉｇｍａ製ヘキサン（St. Louis MO;６５０４２０）；Ｏｘｏｉｄ製Ｌｕｒｉａ培養液（Liverpool;ＣＭ０９９６Ｂ）；Ｓｉｇｍａ製塩化マグネシウム（St.Louis MO;６３０６９）；Ｓｉｇｍａ製鉱油（M-5904）；Ｓｉｇｍａ製塩化カリウム（St. Louis MO;６０１４２）；Ｆｌｕｋａ製Ｓｐａｎ８０（Buchs CH;８５５４８）；Ｓｉｇｍａ製塩酸テトラサイクリン（St. Louis MO;Ｔ８０３２）；Ｓｉｇｍａ製Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（St. Louis MO;９３４２６）；Ｓｉｇｍａ製トリズマ塩酸塩（St. Louis MO;T5941）;Ｓｉｇｍａ製Ｔｗｅｅｎ ８０（St. Louis MO;Ｐ８０７４）。
【００７１】
酵素／試薬は、以下のとおりに入手した：Ｐｒｏｍｅｇａ製ｄＮＴＰ（Madison WI;Ｃ１１４５）；Ｒｏｃｈｅ製グリコーゲン（Indianapolis IN;番号１０ ９０１ ３９３ ００１）；およびＳｉｇｍａ製ＤＮＡマーカー（Direct load PCRローラダー100〜1000bp、Sigma D-3687および100〜10Kb、Sigma D-7058）;Ｐｒｏｍｅｇａ製ＰＣＲマスターミックス（Madison WI;番号Ｍ７５０５）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製のエンドヌクレアーゼＶ（Beverly MA;番号Ｍ０３０５）、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のｄＩＴＰ（カタログ番号Ｒ１１９１）、
【００７２】
溶液は、以下のとおりであった：（１）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０〜１２．５；（２）３Ｍ ＮａＯＨ（水５０ｍｌ中、６ｇ；BDH AnalaR番号１０２５２．４Ｘ）；（３）３Ｍメタ重亜硫酸塩（１０Ｎ ＮａＯＨ（BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）４１６□ｌを含む、水２０ｍｌ中、７．６ｇ）；（４）１００ｍＭキノール（水５０ｍｌ中、０．５５ｇ；BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）；（５）５０×ＴＡＥゲル電気泳動バッファー（Trizma塩基２４２ｇ、氷酢酸５７．１ｍｌ、EDTA ３７．２ｇおよび全量１ｌまでの水）；（６）５×アガロースゲルローディングバッファー（１％ブロモフェノールブルー（Sigma Ｂ６１３１）１ｍｌ、キシレンシアノール（Sigma Ｘ−４１２６）１ｍｌ、グリセロール（Sigma Ｇ６２７９）３．２ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ８μｌ、５０×ＴＡＥバッファー２００μｌおよび全量１０ｍｌまでの水）；および（７）１×Ｔａｑバッファー（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．１％ Triton Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）。
【００７３】
鋳型ＤＮＡの重亜硫酸塩処理
核酸の重亜硫酸塩処理のための例示的プロトコールを以下に示し、これを使用して、新規な酵素によって増幅またはコピーするための鋳型核酸を作製した。このプロトコールによって、実質的にすべての処理されたＤＮＡを保持することが成功裏にもたらされる。当然のことではあるが、試料または試薬の容積または量は変更してもよい。
【００７４】
２０□ｌの容積中、核酸２□ｇに、３Ｍ ＮａＯＨ（新しく作製された、水５０ｍｌ中、６ｇ）２．２□ｌを加えた。重亜硫酸塩試薬は、一本鎖分子と反応することが好ましいので、この工程によって、二本鎖核酸分子を一本鎖の形態に変性する。混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。室温を上回る温度でのインキュベーションを使用して、変性効率を改善することができる。
【００７５】
インキュベーション後、３Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム２２０□ｌ（新しく作製した、１０Ｎ ＮａＯＨ ３２０□ｌを含む、水４．６８ｍｌ中３．３５ｇ；BDH AnalaR番号１０３５６．４Ｄ）および１００ｍＭキノール（新しく作製した、水５０ｍｌ中、０．５５ｇ、BDH AnalaR番号１０３１２２Ｅ）１２□ｌを連続して加える。キノールは、還元剤であり、試薬の酸化を低減するのに役立つ。その他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（DTT）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、またはその他の適した還元剤も使用できる。同様に、反応を増強する添加剤、例えば、メトキシアミンまたは尿素も組み込んでよい。試料を、鉱油２００□ｌで覆い、これによって、試薬の蒸発および酸化を防いだが、必須ではない。次いで、試料を８０℃で４５分間インキュベートした。２５℃〜９０℃のその他の温度も使用してよく、インキュベーションの長さは、５分から８時間以上まで変動する。
【００７６】
メタ重亜硫酸ナトリウムを用いて処理した後、オイルを除去し、核酸濃度が低かった場合は、グリコーゲン２□ｌ（２０ｍｇ／ｍｌ；Roche番号１０ ９０１ ３９３ ００１）またはｔＲＮＡ（Roche番号１０ １０９ ４９５ ００１）を加えた。これらの添加剤は任意選択であり、特に、核酸が低濃度で存在した場合には、これらを使用して、標的核酸と共沈させることによって、得られる核酸の収率を改善できる。通常、グリコーゲンは、ＤＮＡの沈殿において使用され、ＲＮＡとの共沈剤としてはｔＲＮＡが使用されたが、その他の共沈剤も使用してよい。
【００７７】
次いで、重亜硫酸塩修飾された核酸を、脱塩スピンカラム、例えば、Ｚｙｍｏ−ｓｐｉｎカラム（Zymo番号Ｃ１００３）を、製造業者の使用説明書に従って使用することによって脱塩した。あるいは、試料は、以下のとおりにイソプロパノール沈殿させてもよい。試料に水８００μｌを加え、混合し、次いで、イソプロパノール１ｍｌを加える。水またはバッファーが、反応容器中の重亜硫酸塩塩の濃度を、塩が注目する標的核酸とともに沈殿しないレベルに下げる。試料を再度混合し、４℃に６０分間静置するが、効果的に核酸の沈殿をもたらす限り、その他の温度および長さのインキュベーションを使用してもよい。試料を、１５，０００×ｇ、４℃で１０〜１５分間遠心分離し、ペレットを７０％ ＥｔＯＨで洗浄する。この洗浄処理によって、核酸とともに沈殿した任意の残存する塩を除去する。
【００７８】
ペレットを乾燥させ、次いで、下流の適用に応じて、適した容積のバッファーまたは水に再懸濁する。脱スルホン化が望まれる場合には、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ１０．５への再懸濁および９５℃で２０分間のインキュベーションが、ＤＮＡ試料の脱スルホン化に特に効率的であるとわかった。ｐＨ７．０〜１２．５のバッファーも使用でき、試料を、ユーザーによって許容されるレベルへの核酸の脱スルホン化を促進するよう、必要に応じて、３７℃〜９５℃で、１分から９６時間までインキュベートしてよい。
【００７９】
上記の方法は、１種または複数の制限酵素を用いる消化によって進めてもよい。以下に記載される同一のＤＮＡ試料の２種の独立した制限酵素消化が設定されている。消化のために選択される酵素は、通常、増幅されようとする配列に応じて変わる。例えば、２０μｌの容積でＥｃｏＲＩを用いて、ゲノムＤＮＡ２μｇを、３７℃で１時間消化する。この工程を使用して、ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡよりも重亜硫酸塩変換に受け入れられる、より小さい断片に消化する。また、超音波処理または物理的力を使用して、ＤＮＡをより小さい大きさの断片に剪断してもよい。超音波処理の強度および超音波処理の長さは、所望のＤＮＡ断片の大きさに基づいて選択される。個別の消化反応を、例えば、上記のようにＨｉｎｄＩＩＩを用いてゲノムＤＮＡ２μｇを消化することによって実施した。これらまたはその他の適した制限酵素を、前処理消化のために選択してもよい。消化されたＤＮＡを、上記のようにメタ重亜硫酸塩で処理する。
【００８０】
結果
キャリーオーバー汚染物質の排除およびＰＣＲ増幅
図１は、種々の濃度のデオキシイノシン三リン酸（dITP）およびデオキシグアニン三リン酸（dGTP）を補充したＰＣＲ反応混合物を使用したＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００８１】
ヒトゲノムＤＮＡ１マイクロリットル（Promega、２０ｎｇ／□ｌ）を、１×ＰＣＲバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびにミトコンドリア遺伝子、ＭＡＲＳに特異的であるフォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ各５０ｎｇからなる最終２５□ｌの反応容積で増幅した。ＰＣＲでは、２００マイクロモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを使用し、また、反応物に、以下の限定量のｄＩＴＰおよびｄＧＴＰを補充した。
レーン１：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ、対照反応
レーン２：１８０□ＭのｄＧＴＰおよび２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン３：１６０□ＭのｄＧＴＰおよび４０□ＭのｄＩＴＰ
レーン４：１２０□ＭのｄＧＴＰおよび８０□ＭのｄＩＴＰ
レーン５：８０□ＭのｄＧＴＰおよび１２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン６：４０□ＭのｄＧＴＰおよび１６０□ＭのｄＩＴＰ
レーン７：２０□ＭのｄＧＴＰおよび１８０□ＭのｄＩＴＰ
レーン８：０□ＭのｄＧＴＰおよび２００□ＭのｄＩＴＰ
レーン９：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ、鋳型なし
【００８２】
反応物を９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の３０サイクル間、ＰＣＲ増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。結果は、ｄＧＴＰが、ｄＩＴＰで完全に補われている場合には（レーン8）、増幅産物が検出されなかったということを示す。このことは、増幅反応では、ｄＩＴＰが、ｄＧＴＰを全く置換できないことを示す。
【００８３】
図２は、図１から得られたＰＣＲ産物のエンドヌクレアーゼＶ酵素消化の結果を示す。
【００８４】
ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒプライマーを用いて事前に増幅された９マイクロリットルのアンプリコン（図１参照のこと）を、１□ｌのエンドヌクレアーゼＶ（10U/□l）を用いて消化した。試料を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、９５℃で５分間不活化し、５□ｌの産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。
【００８５】
消化に使用した試料は、以下とした：
レーン１：２００□ＭのｄＧＴＰおよび０□ＭのｄＩＴＰ（対照反応）
レーン２：８０□ＭのｄＧＴＰおよび１２０□ＭのｄＩＴＰ
レーン３：４０□ＭのｄＧＴＰおよび１６０□ＭのｄＩＴＰ
レーン４：２０□ＭのｄＧＴＰおよび１８０□ＭのｄＩＴＰ
【００８６】
１０ユニットのエンドヌクレアーゼＶは、限定量のｄＧＴＰおよびｄＩＴＰを使用して作製したアンプリコンを部分的にまたは完全に消化するとわかった。対照的に、２００□ＭのｄＧＴＰのみを使用した対照反応物は消化されないままであった。
【００８７】
図３は、「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後のＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００８８】
図２から得られた、エンドヌクレアーゼＶ処理されたＰＣＲ産物または「汚染物質」を段階希釈した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promegaカタログ番号Ｍ７５０５）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ５０ｎｇを含むＰＣＲ反応において増幅した。
【００８９】
反応物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の５、１０、１５および２０サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。５、１０、１５および２０サイクルのＰＣＲの完了時に、反応を中止し、試料の１セットが除去され得るよう、試料を１５℃で浸漬した。試料の１セットが除去された時点でＰＣＲプロトコールを再開し、アガロースゲルで可視化した。
【００９０】
増幅される汚染物質の量は、以下とした：
レーン１：ニート汚染物質、未希釈
レーン２：１：１０希釈の汚染物質
レーン３：１：１００希釈の汚染物質
レーン４：１：１０００希釈の汚染物質
レーン５：１：１００００希釈の汚染物質
レーン６：鋳型なし対照
【００９１】
図４は、「汚染物質」のエンドヌクレアーゼＶ処理後の２０および２５サイクルのＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００９２】
図２から得られたエンドヌクレアーゼＶ処理されたＰＣＲ産物または「汚染物質」を段階希釈した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promega）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、それぞれ５０ｎｇからなるＰＣＲ反応において増幅した。反応物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の２０または２５サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。図３とは異なり、ＰＣＲ反応は中断しなかった。
【００９３】
増幅される汚染物質の量は以下とした：
レーン１：ニート汚染物質、未希釈
レーン２：１：１０希釈の汚染物質
レーン３：１：１００希釈の汚染物質
レーン４：１：１０００希釈の汚染物質
レーン５：１：１００００希釈の汚染物質
レーン６：１：１０００００希釈の汚染物質
【００９４】
図５は、「汚染物質」の排除に対する可変エンドヌクレアーゼＶ濃度の効果を示す。
【００９５】
ヒトゲノムＤＮＡ１マイクロリットル（Promega、２０ｎｇ／□ｌ）を、１×ＰＣＲバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびにミトコンドリア遺伝子、ＭＡＲＳに特異的であるフォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−３Ｒ、それぞれ５０ｎｇからなる最終２５□ｌの反応容積で増幅した。ＰＣＲでは、２００マイクロモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを使用し、また、反応物に、以下の限定量のｄＩＴＰおよびｄＧＴＰを補充した。
【００９６】
ＰＣＲ産物を、１０ユニット（１）、５ユニット（２）、２．５ユニット（３）および１．２５ユニット（４）のエンドヌクレアーゼＶを用いて３７℃で１５分間処理した。ニートまたは段階希釈「汚染物質」１マイクロリットルを、１×ＰＣＲマスターミックス（Promega）、フォワードおよびリバースプライマー、ＭＴ−１ＦおよびＭＴ−４Ｒ、５０ｎｇを含むＰＣＲ反応において増幅した。反応物は、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および６５℃で３０秒間の５サイクル間、増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。
【００９７】
結果は、ｄＩＴＰは、ヌクレオチドミックス中にいくらかの残存するｄＧＴＰが、依然としてある限り、ＰＣＲ増幅の間に効率的に組み込まれ得ることおよびｄＩＴＰを含有するＰＣＲ産物の完全消化は、エンドヌクレアーゼＶの使用によって達成できること（図１および２参照のこと）を示す。さらに、図２に示されるように、アンプリコンが希釈されず、続いて、再増幅された場合でさえ、消化された産物の再増幅が、２０サイクルの増幅後にＰＣＲ産物をもたらさないので、図３および図４に示されるように、反応混合物に、１８０μＭ／２０μＭの濃度のｄＩＴＰ／ｄＧＴＰを補充することは、ＰＣＲ産物の完全分解をもたらす（図３参照のこと）。図５は、増幅反応におけるエンドヌクレアーゼＶの濃度を低下させ、１．２５ユニットのみの酵素が使用される場合でさえ、依然として、増幅の大幅な低減を達成することが可能であることを示す。
【００９８】
ＰＣＲ増幅
プライマー、酵素、バッファー、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋および鋳型ＤＮＡなど、必要な要素すべてを含有するＰＣＲプレミックスを準備する。標準ＰＣＲ試薬に加え、反応物にｄＩＴＰおよびエンドヌクレアーゼＶを補充する。準備反応の間に、ミックスが、事前の反応に由来するアンプリコン（ｄＩＴＰを含む）で汚染された場合には、この汚染物質は、反応物を３７℃で約１５分間加熱することによって、ＰＣＲの開始に先立って除去できる。このプレインキュベーション工程は、鋳型ＤＮＡまたはＰＣＲプライマーに影響を及ぼさないが、これはこれらの要素のどちらも、ｄＩＴＰを含まないからである。ｄＩＴＰは、増幅された物質中にのみ組み込まれる。次の工程は、増幅間近の試料を分解しないようエンドヌクレアーゼＶを不活化することであった。不活性化は、最初の９５℃で３分間の変性工程の間に実施された。変性後、やはりｄＩＴＰを含有する新規アンプリコンを産生するＰＣＲ反応を、標準法で実施し、次いで、これを任意の適した手段によって逐次分析すればよい。
【００９９】
当業者には当然のことながら、特定の実施形態において示される本発明に、広く記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、多数の変法および／または改変を行うことができる。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、例示的と考えられるべきであって、制限的と考えられるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅反応においてキャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用。
【請求項２】
非天然塩基が、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそれらのデオキシ三リン酸類似体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
非天然塩基が、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシキサントシン三リン酸（ｄＸＴＰ）またはデオキシオキサノシン（ｄＯＴＰ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
非天然塩基が、イノシンまたはデオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
酵素が、エンドヌクレアーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
エンドヌクレアーゼが、中温性または熱安定性細菌由来のエンドヌクレアーゼＶである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
増幅反応が、正常核酸または重亜硫酸塩処理核酸の線形または指数関数的複製である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
（ａ）デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシキサントシン三リン酸（ｄＸＴＰ）またはデオキシオキサノシン（ｄＯＴＰ）、またはそれらの組合せ、
（ｂ）デオキシグアニン三リン酸（ｄＧＴＰ）デオキシアデニン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）を包含するデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、
（ｃ）イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素、および
（ｄ）熱安定性ポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物。
【請求項１０】
デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）を含む、請求項９に記載の増幅反応混合物。
【請求項１１】
ｄＩＴＰ、ｄＸＴＰまたはｄＯＴＰの濃度と比較して、制限濃度の１種または複数のｄＮＴＰを含有する、請求項９または１０に記載の反応混合物。
【請求項１２】
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素が、エンドヌクレアーゼである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１３】
酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
熱安定性ポリメラーゼが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、それらの突然変異体およびキメラからなる群から選択される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１５】
熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈ、５Ｄ４およびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１由来のＫＯＤから選択される、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１６】
増幅のためのプライマーまたはプライマーセットをさらに含有する、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１７】
核酸増幅の間に起こり得るキャリーオーバー汚染を排除する方法であって、
増幅される核酸鋳型を含有する試料を提供する工程と、
増幅反応のための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
請求項９から１５のいずれか一項に記載の増幅混合物を提供する工程と、
反応混合物中の、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する任意のアンプリコンが、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素によって分解されるよう、インキュベーション反応を実施する工程と、
インキュベートされた反応混合物を、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素を不活化する温度で加熱する工程と、
核酸鋳型から所望の産物を増幅するために増幅反応を実施する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
増幅産物を処理または分析する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
処理または分析する工程が、増幅産物の、配列、メチル化状態、大きさ、長さを決定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
処理または分析する工程が、増幅産物の、ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション、消化、リアルタイム増幅、アレイベースのアプローチ、ＲＦＬＰ分析を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、天然および重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡまたはそれらの組合せを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
インキュベーション反応を、０℃〜７０℃の温度で１秒〜９０分間実施する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
温度が約３７℃で、約１５分間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
加熱工程が、７０℃〜９５℃である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸鋳型が、重亜硫酸塩で処理される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
増幅反応においてキャリーオーバー汚染物質を排除するための、非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素を伴う非天然塩基の増幅反応における使用。
【請求項２】
非天然塩基が、イノシン、キサントシン、オキサノシン、デオキシヌクレオチドまたはそれらのデオキシ三リン酸類似体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
非天然塩基が、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシキサントシン三リン酸（ｄＸＴＰ）またはデオキシオキサノシン（ｄＯＴＰ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
非天然塩基が、イノシンまたはデオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
酵素が、エンドヌクレアーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
エンドヌクレアーゼが、中温性または熱安定性細菌由来のエンドヌクレアーゼＶである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
増幅反応が、正常核酸または重亜硫酸塩処理核酸の線形または指数関数的複製である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
（ａ）デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシキサントシン三リン酸（ｄＸＴＰ）またはデオキシオキサノシン（ｄＯＴＰ）、またはそれらの組合せ、
（ｂ）デオキシグアニン三リン酸（ｄＧＴＰ）デオキシアデニン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）を包含するデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、
（ｃ）イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素、および
（ｄ）熱安定性ポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物。
【請求項１０】
デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）を含む、請求項９に記載の増幅反応混合物。
【請求項１１】
ｄＩＴＰ、ｄＸＴＰまたはｄＯＴＰの濃度と比較して、制限濃度の１種または複数のｄＮＴＰを含有する、請求項９または１０に記載の反応混合物。
【請求項１２】
非天然塩基を含有する核酸を分解できる酵素が、エンドヌクレアーゼである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１３】
酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
熱安定性ポリメラーゼが、好熱性および中温性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、それらの突然変異体およびキメラからなる群から選択される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１５】
熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｔｔｈ、５Ｄ４およびサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）ＫＯＤ１由来のＫＯＤから選択される、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１６】
増幅のためのプライマーまたはプライマーセットをさらに含有する、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１７】
核酸増幅の間に起こり得るキャリーオーバー汚染を排除する方法であって、
増幅される核酸鋳型を含有する試料を提供する工程と、
増幅反応のための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
請求項９から１５のいずれか一項に記載の増幅混合物を提供する工程と、
反応混合物中の、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する任意のアンプリコンが、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素によって分解されるよう、インキュベーション反応を実施する工程と、
インキュベートされた反応混合物を、イノシン、キサントシンまたはオキサノシンを含有する核酸を分解できる酵素を不活化する温度で加熱する工程と、
核酸鋳型から所望の産物を増幅するために増幅反応を実施する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
増幅産物を処理または分析する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
処理または分析する工程が、増幅産物の、配列、メチル化状態、大きさ、長さを決定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
処理または分析する工程が、増幅産物の、ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション、消化、リアルタイム増幅、アレイベースのアプローチ、ＲＦＬＰ分析を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、天然および重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡまたはそれらの組合せを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
インキュベーション反応を、０℃〜７０℃の温度で１秒〜９０分間実施する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
温度が約３７℃で、約１５分間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
加熱工程が、７０℃〜９５℃である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸鋳型が、重亜硫酸塩で処理される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５０５８４５（Ｐ２０１１−５０５８４５Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８２８１（Ｐ２０１０−５３８２８１）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１８９１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９７０３
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１８９１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９７０３
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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