【課題】目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法を提供する。
【解決手段】標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含み、核酸の複製が、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換され、標的配列からの複製された鎖の形成が、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利であることを特徴とする方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって、標的配列を含む核酸を高温にて、鎖置換活性を有する熱不安定性核酸ポリメラーゼ、添加剤、および一組のプライマーの存在下で、核酸の複製を促進する条件下でインキュベートすることを含み、核酸の複製が、複製された鎖を結果として生じ、複製中に、複製された核酸鎖のうち少なくとも１つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって置換され、標的配列からの複製された鎖の形成が、非標的配列からの複製された鎖の形成よりも有利であることを特徴とする方法。
【請求項２】
高温が、核酸ポリメラーゼが添加剤の非存在下で実質的にテンプレート依存性重合を行うことができない温度であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
高温が摂氏３０度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
高温が摂氏３２度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項５】
高温が摂氏３５度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項６】
高温が摂氏３７度より高い温度であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項７】
熱不安定性核酸ポリメラーゼがファイ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
熱不安定性核酸ポリメラーゼがファイ２９ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、または組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項９】
プライマーの組が少なくとも２種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
プライマーの組が少なくとも１０種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
プライマーの組が少なくとも５０種類のプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
プライマーの組が２００種類より多いプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
プライマーの組が１０２３種類より多いプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ長さ６ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ長さ８ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
プライマーの組に含まれるプライマーがそれぞれ８ヌクレオチドより長いことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
プライマーの組に含まれるプライマーのうち２種類以上が異なる長さであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
添加剤が糖または糖の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
添加剤がトレハロース、グルコース、スクロース、または組み合わせを含むことを特徴とする請求項１８の方法。
【請求項２０】
添加剤が糖、シャペロン、タンパク質、または組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
鎖置換複製が前記添加剤の存在下で行われることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
添加剤がトレハロースを含むことを特徴とする請求項２１の方法。
【請求項２３】
核酸、核酸ポリメラーゼ、添加剤、およびプライマーの組のインキュベートがデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率が、核酸が同一の核酸ポリメラーゼおよびプライマーの組の存在下でおよび高温以外は同一の条件下でインキュベートされる場合、標的配列から複製された鎖の非標的配列から複製された鎖に対する比率より小さいことを特徴とする請求項１〜２３のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で明らかに不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で相当に不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
高温が、添加剤、ｄＮＴＰ、およびテンプレート核酸の非存在下で核酸ポリメラーゼがそれ以上の温度で顕著に不活性化される温度であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【公開番号】特開２０１０−１５８２５０（Ｐ２０１０−１５８２５０Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４２０８６（Ｐ２０１０−４２０８６）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【分割の表示】特願２００５−５１０００７（Ｐ２００５−５１０００７）の分割
【原出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】