植物において表皮特異的なトランスジェニック発現を行うためのプロモーター
本発明は、その制御下で、植物において表皮特異的に導入遺伝子を発現させることができるプロモーター領域に関する。本発明はまた、前記プロモーターを含む組換え核酸分子、これらの核酸分子で形質転換されたトランスジェニックな植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。本発明はさらに、本発明に係るプロモーターを含む核酸分子、病原体抵抗性を媒介する核酸配列または導入遺伝子、これらの核酸分子で形質転換された植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その制御下で植物において導入遺伝子が表皮特異的に発現することができるプロモーター領域に関する。さらに、本発明は、前記プロモーター領域を含む組換え核酸分子、前記核酸分子を用いて形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。さらに、本発明は、本発明に係るプロモーターを含む核酸分子、病原体抵抗性を媒介することができる核酸配列または導入遺伝子、前記核酸分子を用いて形質転換された植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写開始点の上流に位置し、それによって転写の開始点および開始頻度が決定され、それにより、制御下の遺伝子の発現レベルおよび発現パターンが決定される遺伝子のＤＮＡ領域は通常、プロモーターと呼ばれる。ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを活性化する特異的な転写因子は、基本転写複合体とともに転写を開始するために、プロモーターに結合する。プロモーターの有効性は、付加的なＤＮＡ配列、すなわちエンハンサー配列によってしばしば高められるとともに調節される。このエンハンサー配列の位置は、プロモーターの位置と違って固定されていない。この調節エレメントは、発現される遺伝子の上流、下流、またはイントロン中に位置することができる。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術において、プロモーターは、通常は該プロモーターによって自然に調節される遺伝子ではない導入遺伝子の発現を制御するために、発現ベクター中に挿入される。遺伝子工学を用いて移入された遺伝子がどの時点で、どのタイプの組織で、また、どれくらいの強度で発現されるかを決定するプロモーターの特異性は、本願ではかなり重要である。
【０００４】
植物育種において、特定の有利な諸特性を有用な植物に伝達するために組換えＤＮＡ技術がしばしば使用される。これは、例えば病原体抵抗性の向上によって収率を上昇させ、または収穫作物の諸特性を改善すると期待されている。トランスジェニック産物の存在が一部の組織の正常な生理的過程に負の影響を与える可能性があることから、本願において、移入された遺伝子が偏在的に発現されるのではなく、形質転換された活性が必要とされる組織中でのみ発現されることが多くの場合望ましい。すなわち、例えば、偏在的に有効な３５Ｓプロモーターの制御下で陰イオン性のペルオキシダーゼを過剰に発現させると、根の成長の低下が起こり、したがって、発達する根の質量も低下することから、トランスジェニックタバコ植物がしおれることが示されている（ラグリミニ（Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ）他（１９９７年） Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏｎ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第３３巻（第５号）、８８７〜８９５ページ）。同様に偏在的に有効なユビキチンプロモーターの制御下でｓｐｉ２ペルオキシダーゼを過剰に発現させると、コントロール植物と比べて、上胚軸の発達が低減し、縦方向の成長が低減する（エルフストランド（Ｅｌｆｓｔｒａｎｄ），Ｍ．他（２００１年）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｓｐｉ２ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｒｗａｙ ｓｐｒｕｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏｔａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２０巻（第７号）５９６〜６０３ページ）。生理的過程に対する負の影響とは無関係に、抵抗性育種では、収穫された植物部分にトランスジェニック産物も存在することを防ぐことが多くの場合期待される。
【０００５】
したがって、組織特異的に、または誘導的に機能するプロモーターが、過去数年間に単離されている。組織特異的プロモーターは、例えば、種子、塊茎、および果実に特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターは、例えば、化学誘導、光誘導、または他の刺激によって活性化され得る。
【０００６】
表皮において遺伝子発現を特異的に調節することも望ましい。表皮は、高等植物の地上の器官の末端組織である。したがって、表皮の役目は、一方では植物に水および栄養物を交換させることであり、もう一方では、病原体が植物中に侵入するのを防止することである。これらの機能は、適切なプロモーターおよび後者によって制御される遺伝子の助けを借りて表皮中での遺伝子発現を改変することによって、特異的に調節され得る。
【０００７】
表皮特異的プロモーターは、双子葉植物では既に説明されている。すなわち、ろう状物質の合成の際の縮合酵素をコードするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＣＥＲ６（ＣＵＴ１）遺伝子のプロモーターが、β−グルクロニダーゼ受容体遺伝子の表皮特異的な発現を引き起こすことができることが示されている（フーカー（Ｈｏｏｋｅｒ）他（２００２年）、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＥＲ６ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｕｔｉｃｕｌａｒ ｗａｘ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１２９巻（第４号）、１５６８〜１５８０ページ；クンスト（Ｋｕｎｓｔ）他（２０００年）、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＣＵＴ１ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．第２８巻（第６号）、６５１〜６５４ページ）。
【０００８】
しかし、単子葉類、特にイネ科植物（コウボウ）で導入遺伝子を発現するのに特に好適である単子葉植物の適切な表皮特異的プロモーターは、これまで首尾良く同定することができなかった。したがって、これまでは、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターに似た構成的プロモーターが表皮でタンパク質を発現するのに使用されていた（例えば、オルダク（Ｏｌｄａｃｈ）他（２００１年）、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｇａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第１４巻（第７号）、８３２〜８３８ページを参照のこと）。しかし、前述したように、この方法は、表皮以外の他の組織または器官にトランスジェニック産物が存在することから、トランスジェニック植物に望ましくない副次的作用をもたらす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、単子葉類、好ましくは穀類植物における表皮特異的な遺伝子発現を可能にする手段を提供することが、本発明の根本的な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題は、特許請求の範囲を特徴とする実施形態を提供することによって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
したがって、本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡｌ（ＧＳＴＡ１）遺伝子のプロモーター由来の第１の配列、およびＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン由来の第２の配列を含み、植物の表皮に対する特異性を有するプロモーター領域に関する。ＧＳＴＡ１は、ドゥドラー（Ｄｕｄｌｅｒ）他（１９９１年）、Ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第４巻（第１号）、１４〜１８ページに記載されている遺伝子に関係している。具体的には、これらの遺伝子は、コムギ由来の遺伝子である。しかし、これらは、類似の発現パターンおよび類似の遺伝子産物を有する他の穀類植物、特に、オオムギからの相同遺伝子でもよい。ＷＩＲ１ａは、ブル（Ｂｕｌｌ）他（１９９２年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｅｆｅｎｓｅ，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第５巻（第６号）、５１６〜５１９ページで記載されている遺伝子を示す。
【００１２】
好ましくは、第１の配列は配列番号１であり、第２の配列は配列番号２である。
第１の配列と第２の配列との間には、さらに、長さが１０ｂｐ〜１０００ｂｐ、好ましくは２０ｂｐ〜８００ｂｐ、特に好ましくは３０ｂｐ〜５００ｂｐ、最も好ましくは４０ｂｐ〜３００ｂｐの非翻訳配列が存在してもよい。
【００１３】
特に好ましくは、本発明に係るプロモーター領域は、
ａ）配列番号３で与えられる核酸配列を含むプロモーター領域、
ｂ）配列番号３で与えられる核酸配列の機能部分を含むプロモーター領域、または
ｃ）ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる核酸配列とハイブリダイズする配列を有するプロモーター領域からなる群から選択されるプロモーター領域である。
【００１４】
本発明の範囲内では、プロモーター領域は、コード配列（導入遺伝子）の発現に必要とされる制御配列を含む核酸配列と理解される。制御配列は、コード配列の発現、すなわち、特に発現レベルおよびパターンを決定する遺伝子の一部を形成する。この制御配列は、転写複合体を形成するために特異的な転写因子およびＲＮＡポリメラーゼが結合して集まり、プロモーター領域によって制御されている核酸配列の転写を効果的に開始する少なくとも一つの配列モチーフを有する。
【００１５】
本発明に係るプロモーター領域は、コムギ由来のＧＳＴＡ１遺伝子のプロモーターを、コムギ由来のＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン配列と融合させることによって、新しい諸特性を有するプロモーターが製造され得るという観察に基づいている。
【００１６】
大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をレポーター遺伝子として有するコムギの葉における一過性のレポーター遺伝子アッセイで、ＷＩＲ１ａのプロモーターと、イントロンと、ＧＳＴプロモーターとの様々な組合せが試験された。驚くべきことに、ＧＳＴプロモーターとＷＩＲ１ａイントロンとが、レポーター遺伝子活性に対して相乗効果を有することが示された。転写活性の上昇は、偏在的に発現される３５Ｓプロモーターによって実現される転写活性に匹敵していた。
【００１７】
本発明の範囲内では、「表皮特異的な」という用語は、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列が、植物の芽の表皮で発現されることを意味すると理解される。本発明の意味では、特に、本発明に係るプロモーター領域が、他の細胞型と比べて表皮での外来遺伝子の発現を促進し、且つ他の細胞型と比べて少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍など、有意な発現の増大を引き起こす場合も、表皮特異性が与えられる。この発現レベルは、従来のｉｎ ｓｉｔｕな検出技術を用いて測定され得る。
【００１８】
「植物の表皮」という用語は当業者に公知である。補完的な情報は、例えば、シュトラースブルガー（Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｂｏｔａｎｉｋ、第３５版、２００２年、スペクトラム大学出版（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）のような植物解剖学または植物生理学に関する任意の書籍に見出され得る。
【００１９】
現在では驚くべきことに、コムギ由来のＧＳＴＡ１遺伝子の制御配列と、コムギ由来のＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン配列との双方を含むプロモーター領域が、その制御下にあるコード核酸配列の表皮特異的な発現を引き起こすことが判明している。
【００２０】
配列番号３で示される核酸配列を有するプロモーター領域に加えて、本発明はまた、前記配列の機能部分を有し、それらが制御するコード核酸配列のうちの一つを植物中で表皮特異的に発現させるプロモーター領域にも関する。
【００２１】
この文脈において、「機能部分」とは、転写複合体が、わずかに異なる核酸配列ではあるものの、なお結合し、表皮特異的な発現を引き起こすことができる配列を意味すると理解される。プロモーター配列の機能部分は、野生型と比べてそのプロモーター活性が低減または増大されている前記プロモーターの変異体も含む。具体的には、機能部分は当然、配列番号３で与えられるプロモーター領域の配列の天然または人工の変異体を意味するとも理解される。突然変異は、一つまたは複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、交換、および／または挿入を含む。本発明の範囲内において、プロモーター領域の機能部分は、配列番号３の天然に存在する変異体、ならびに例えば化学合成によって得られる人工ヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
どんな場合でも、使用されるプロモーターはＴＡＴＡボックス（配列番号１および３中の２１６３〜２１６９位）を含み、好ましくは２つのＣＡＡＴボックス（配列番号１および３中の１０４７〜１０５１、または１８９５〜１８９９位）も含む。さらに、このプロモーターは、以下の配列モチーフのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび３つ、特に好ましくは少なくとも４つ、５つ、および６つ、最も好ましくは少なくとも７つまたは８つを含む。
【００２３】
ａ）ＧＴＧＧＧＧＧ
ｂ）ＡＣＧＴＧＧＡ
ｃ）ＴＣＣＡＣＣＴ
ｄ）ＴＡＴＣＣＡＴ
ｅ）ＣＡＴＧＣＡＴＧ
ｆ）ＴＧＴＡＡＡＧ
ｇ）ＣＣＴＡＣＣＡ
ｈ）ＡＡＴＡＧＴＡ
好ましくは、この配列モチーフは、配列番号１および３中の以下の位置に対応する位置に配置されている。
【００２４】
ａ）１８５〜１９１ｂｐおよび２１７〜２２３ｂｐ
ｂ）４５５〜４６１ｂｐ
ｃ）５０８〜５１４ｂｐ
ｄ）５６４〜５７０ｂｐ
ｅ）１５１４〜１５２１ｂｐ
ｆ）１５２０〜１５２６ｂｐ
ｇ）１５６９〜１５７５ｂｐ
ｈ）１６１０〜１６１６ｂｐ
プロモーター領域の変異体のプロモーター活性は、コード配列が検査対象のプロモーター領域の制御下にあるマーカー遺伝子の助けを借りて測定され得る。適切なマーカー遺伝子は、例えば、大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、例えば、エクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やフォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子のような蛍光遺伝子、または大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子である。絶対的なプロモーター活性は、野生型の植物との比較により決定される。組織特異性または細胞特異性は、それぞれの組織または細胞における前述のマーカー遺伝子の発現速度を比較することによって容易に決定され得る。
【００２５】
本発明はまた、ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を有するプロモーター領域にも関する。本発明の文脈において、「ストリンジェントな条件のもとでのハイブリダイゼーション」という用語は、特異的なハイブリダイゼーションを確実に起こすのに十分な厳密さを有する条件のもと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでハイブリダイゼーションが行われることを意味する。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者には公知であり、文献から知られ得る（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、コールドスプリングハーバー研究所出版会（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、［米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）所在］）。
【００２６】
「特異的にハイブリダイズする」とは通常、特定のヌクレオチド配列が（例えば全）ＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物の形で存在する場合に、ある分子が、ストリンジェントな条件のもとで前記配列と優先的に結合することを意味する。「ストリンジェントな条件」という用語は通常、ある核酸配列がその標的配列と優先的に結合し、他の配列にはかなり低い程度しか結合せず、または全く結合しないと考えられる条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列にある程度依存しており、様々な状況によって異なると考えられる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。通常、所定の一定のイオン強度および所定のｐＨ値における特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く温度が維持されるように、ストリンジェントな条件が選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的な分子の５０％がその標的配列に平衡状態でハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ値、および核酸濃度のもとでの）温度である。一般に、ストリンジェントな条件は、短い分子（すなわち、例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合、７．０〜８．３のｐＨ値で塩濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の任意の塩）であり、温度が少なくとも３０℃である条件である。さらに、ストリンジェントな条件は、例えばホルムアミドのような不安定化剤の添加によって実現され得る。
【００２７】
適切なストリンジェントな条件は、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他にも記載されている。上記を参照されたい。すなわち、ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件のもとで起こり得る。
【００２８】
ハイブリダイゼーションバッファー：２×ＳＳＣ、１０×デンハルト液（フィコール（Ｆｉｋｏｌｌ）４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ、１：１：１の比）、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、または０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、６５℃〜６８℃のハイブリダイゼーション温度。
【００２９】
洗浄バッファー：０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。６５℃〜６８℃の洗浄温度。
好ましくは、このようなプロモーター変異体は、配列番号３で示される全ＤＮＡ配列に関して、配列番号３中で与えられるプロモーター配列またはその一部分に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このようなプロモーター配列の配列同一性は、配列番号３で与えられる核酸配列との比較によって決定される。長さが異なる２つの核酸配列が互いに比較される場合、好ましくは、配列同一性は、長い方の配列の対応するヌクレオチド残基と同一である、短い方の配列のヌクレオチド残基の比率に合致することが好ましい。
【００３０】
配列同一性は通常、例えばＣＬＵＳＴＡＬのような様々なアライメントプログラムによって決定される。通常、当業者は、配列同一性を決定するのに適切なアルゴリスムを自由に使うことができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ（例えば、「標準ヌクレオチド−ヌクレオチドＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｎ］」のリンク）でアクセス可能なプログラムも使用され得る。
【００３１】
配列番号３について上記に与えられた同一性の比率の程度は、配列番号１および２で示される、本発明に係るプロモーター領域の第１および第２の配列にも当てはまる。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係るプロモーター領域は、配列番号３で与えられる２５５２ヌクレオチドの全配列を有する。
【００３２】
本発明はまた、本発明に係るプロモーター領域のキメラ遺伝子、および天然には本発明に係るプロモーター領域によって調節されていない発現が、キメラ遺伝子中では本発明に係るプロモーター領域によって調節されている、有効に結合したコード配列のキメラ遺伝子、ならびに前記キメラ遺伝子を含む組換え核酸分子に関する。
【００３３】
「発現が本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列」という用語は、プロモーター領域が活性な細胞において、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列の発現が、野生型細胞と比べて、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも５０倍に増大され得ることを意味する。
【００３４】
発現が本発明に係る核酸配列によって調節されている核酸配列は、導入遺伝子のコード領域、例えば、遺伝子産物が表皮中で望まれる耐性遺伝子でもよい。導入遺伝子の発現により、それにコードされる遺伝子産物の含有量は、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍に増大され得る。
【００３５】
しかし、本発明に係るプロモーター領域は、遺伝子産物が表皮中に通常より少なく存在し、または全く存在しないことが期待される特定の遺伝子の表皮特異的なサイレンシングを実現するために、ＲＮＡ干渉用のＲＮＡｉ構築物にも使用され得る。当然、本発明に係るプロモーター領域を使用した典型的なアンチセンスまたはコサプレッション構築物を用いても、後者を実現することができる。サイレンシング構築物によって、内在性遺伝子の発現は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％低減される。
【００３６】
ＲＮＡ干渉に使用されることになっている構築物中には通常、転写に続いて２本鎖ＲＮＡを形成する回文構造のＤＮＡ配列がある。ダイサー酵素によって前記２本鎖ＲＮＡが処理され、内在性ＲＮＡに結合するとともに、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と協力してその分解を引き起こす、より短いＲＮＡ断片が形成される（ハノン（Ｈａｎｎｏｎ）（２００２年）ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｄ．第４１８巻、２４４〜２５１ページ）。
【００３７】
内在性遺伝子の発現に対する遺伝子サイレンシング構築物の効果は、当業者に周知である従来の分子生物学的方法によって検出され得る。すなわち、ＲＮＡレベルの検査にはノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ法が利用可能であり、タンパク質は、ウェスタンブロット分析、免疫蛍光法、または、タンパク質が酵素であることを条件として酵素アッセイにより検出され得る。
【００３８】
本発明の範囲内において、「導入遺伝子」という用語は、その遺伝子産物が、表皮中に供給されることになり、または、遺伝子サイレンシングで抑制されることになる遺伝子をまとめて示す。
【００３９】
好ましくは、表皮は、病原体が植物中に侵入する際に越えなければならない最初の層であることから、発現が本発明に係るプロモーターによって調節されている核酸配列は、病原体抵抗性を媒介する核酸配列である。
【００４０】
本発明の範囲内において、「組換え核酸分子」という用語は、本発明に係るキメラ遺伝子または本発明に係るプロモーター領域を含み、植物細胞および植物中で、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列のプロモーター依存的な発現を引き起こすことができるベクターを意味すると理解される。好ましい実施形態において、本発明に係る組換え核酸分子は、転写終結配列をさらに含む。本願において、「転写終結配列」は、コード配列の下流末端に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるＤＮＡ配列を意味すると理解される。
【００４１】
さらに、本発明は、以下の工程、
ａ）本発明に係るプロモーター領域がコード配列と有効に結合して、その中に存在している組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により、それらの植物を増殖させる工程とを備え、
本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【００４２】
高等植物およびその細胞中への外来遺伝子の導入準備のために、それぞれ、大腸菌に対する複製シグナル、および形質転換された細菌細胞を選別するためのマーカー遺伝子を含む多数のクローニングベクターが利用可能である。このようなベクターの例として、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などがある。キメラ遺伝子は、ベクターの適切な制限部位に導入され得る。
【００４３】
次に、得られたプラスミドを使用して、大腸菌を形質転換する。形質転換された大腸菌細胞を適切な培地中で培養し、続いて回収および溶解し、プラスミドを再度得る。制限分析、ゲル電気泳動、さらに生化学−分子生物学的方法が、得られたプラスミドＤＮＡの特性を決定するための分析方法として一般に使用される。各操作の後に、プラスミドＤＮＡは切断可能であり、それから得られたＤＮＡ断片は他のＤＮＡ配列と結合可能である。
【００４４】
既に述べたように、植物宿主細胞中にＤＮＡを導入するために様々な技術が利用可能であり、当業者は、各事例に適した方法を苦もなく決定することができる。前記技術は、形質転換媒体としてアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用するＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、インジェクション、エレクトロポレーション、単離されたＤＮＡのプロトプラスト中への直接的な遺伝子移入、遺伝子銃法によるＤＮＡの導入、ならびにこれまでの数年間に十分に確立されており、植物分子生物学および植物バイオテクノロジーのそれぞれの技術分野の技術者の標準の能力の範囲に属する別の実行可能な手段を含む。遺伝子銃による遺伝子移入法は、特に単子葉植物で使用される。この点で、当業者は、例えば、バシル（Ｖａｓｉｌ）他（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、６６７〜６７４ページ；バシル（Ｖａｓｉｌ）他（１９９３年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１巻、１１５３〜１１５８ページ；ネーラ（Ｎｅｈｒａ）他（１９９４年）Ｐｌａｎｔ Ｊ．第５巻、２８５〜２９７ページ；ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）他（１９９４年）Ｐｌａｎｔ Ｊ、第５巻、２９９〜３０７ページ；アルトピター（Ａｌｔｐｅｔｅｒ）他（１９９６年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第１６巻、１２〜１７ページ；オルチズ（Ｏｒｔｉｚ）他（１９９６年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第１５巻、８７７〜８１ページ；ラスコーゴーント（Ｒａｓｃｏ−Ｇａｕｎｔ）他（２００１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．第５２巻、８６５〜８７４ページで、誘導に関する有用な情報を確認することができる。
【００４５】
植物細胞中へのＤＮＡのインジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、使用されるプラスミドそれ自体に対して特別な要求はない。これは、直接的な遺伝子移入にも当てはまる。例えば、ｐＵＣ誘導体のような、単純なプラスミドが使用可能である。
【００４６】
しかし、植物全体が、この方法で形質転換された細胞から再生されることになる場合には、選択マーカー遺伝子が存在することが推奨される。標準的な選択マーカーは当業者に公知であり、適切なマーカーを選択することは困難ではない。
【００４７】
植物細胞中に所望の遺伝子が導入される方法では、さらに別のＤＮＡ配列が必要とされることがある。例えば、植物細胞を形質転換するためにＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが使用される場合は、フランキング領域を形成するために、右端および左端であることが多いが、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド中に含まれるＴ−ＤＮＡの少なくとも右端が、導入されることになっている遺伝子と結合されていなければならない。アグロバクテリアが形質転換に使用される場合は、導入されることになっているＤＮＡは、特定のプラスミド、すなわち実際には中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングされなければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同な配列を有することから、相同組換えによって、アグロバクテリアのＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド中に組み込まれ得る。前記プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの移行に必要とされるｖｉｒ領域も含む。しかし、中間ベクターはアグロバクテリア中で複製することができない。ヘルパープラスミドを用いて、中間ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンスに移入され得る（接合）。しかし、バイナリーベクターは、大腸菌中でもアグロバクテリア中でも複製することができる。これらは、左右のＴ−ＤＮＡボーダー領域に囲まれた、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これらは、アグロバクテリア中に直接形質転換され得る。宿主細胞の役目を果たすアグロバクテリウムは、Ｔ−ＤＮＡ内部に、植物細胞中に移行されるキメラ遺伝子を有するプラスミドを含んでいなければならない。追加のＴ−ＤＮＡも存在可能である。このような方法で形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞の形質転換に使用される。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は鋭意検討されており、植物の形質転換に関する一般的に知られた調査論文および手引書で十分に説明されている。単子葉植物の場合は、例えば、チェン（Ｃｈｅｎｇ）他（１９９７年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１５巻、９７１〜９８０ページ；カンナ（Ｋｈａｎｎａ）およびダガード（Ｄａｇｇａｒｄ）（２００３年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ第２１巻、４２９〜４３６ページ；ウー（Ｗｕ）他（２００３年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２１巻、６５９〜６６８ページ；フー（Ｈｕ）他（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２１巻、１０１０〜１０１９ページで記載されているように、アグロバクテリウムを媒介とした有効な遺伝子移入を行うには、改変したプロトコールが適用されなければならない。植物細胞中にＤＮＡを移行させるために、賢明には、植物外植片がアグロバクテリウム・チュメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに培養され得る。次に、形質転換された細胞を選別するための抗生物質または殺生剤を含有することができる適切な培地中で、感染された植物物質（例えば、葉片、茎の断片、根、ならびに、プロトプラストまたは懸濁培養された植物細胞）から植物全体が再生され得る。
【００４８】
導入ＤＮＡは、植物細胞のゲノムに組み込まれた後は通常、そこで安定であり、初めに形質転換された細胞の子孫でも維持される。導入されたＤＮＡは通常、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサート、グリホサート、ストレプトマイシン、スルホニル尿素、ゲンタマイシン、またはホスフィノトリシン、および形質転換された植物細胞に対するその他のもののような殺生剤または抗生物質に対する抵抗性を媒介する選択マーカーを含む。したがって、個別に選択されるマーカーは、導入されるＤＮＡを欠いている細胞と比較して、形質転換された細胞の選択を可能にしなければならない。このためには、栄養マーカーまたはスクリーニングマーカー（ＧＦＰ、すなわち緑色蛍光タンパク質など）のような代替マーカーも適している。当然、選択マーカーも完全に取り除かれ得るが、比較的高度なスクリーニングが必要である。マーカーを含まないトランスジェニック植物が望まれる場合は、当業者は、後でマーカー遺伝子を除去することを可能にする戦略、例えば、共形質転換または配列特異的なリコンビナーゼも自由に使用できる。
【００４９】
トランスジェニック植物細胞からのトランスジェニック植物の再生は、既知の栄養培地を用いる従来の再生法に従って実施される。次に、この方法で得られた植物が、発現が本発明に係るプロモーターによって制御される導入核酸配列の存在および組織特異性、または前記核酸配列の影響を受けた内在性のＲＮＡおよびタンパク質を目的としたＰＣＲ分析、ブロット分析のような分子生物学的方法を含む従来の方法によって検査され得る。
【００５０】
さらに、本発明は、本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列を含み、前記核酸配列を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物に関する。
好ましくは、本発明に係る植物は、単子葉類、特にライムギ、トウモロコシ、およびオートムギなどの穀類植物、特に好ましくはコムギまたはオオムギ、ならびにプロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような前記植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに前記植物のトランスジェニックな子孫である。しかし、本発明に係るプロモーター領域は、導入遺伝子を表皮特異的に発現する対応する植物を製造するために、例えば、飼料用のイネ科植物のような他のイネ科植物（ドジョウツナギ）でも使用され得る。
【００５１】
エピクチクラワックスを産生するための遺伝子も、植物の耐乾燥性を高めるために、本発明に係る表皮特異的プロモーターの制御下で発現され得る。さらに、紫外線耐性を高めるためにアントシアニンまたは他の紫外線吸収物質を産生するための遺伝子も、本発明に係るプロモーターの制御下で発現され得る。上記に既に論じたように、病原体抵抗性遺伝子は、好ましくは本発明に係るプロモーターの制御下で発現される。
【００５２】
植物に感染し、それによって植物の代謝に悪影響を及ぼす細菌、ウイルス、および真菌は特に植物病原体と呼ばれる。
これらの植物病原体の一つは、特に、コムギおよびオオムギのような穀類植物でウドンコ病および褐変症を引き起こす真菌である。感染の程度によって、これらの病害は相当な収穫量低下（最大５０％）を引き起こす可能性がある。
【００５３】
従来、前述の病害および別の植物真菌病は、地下水中への浸透および食物連鎖での蓄積のような不利益を有することが知られている殺真菌薬によって制御されている。
しかし、ここ数年間に、ある特定の病原因子またはいくつかの病原因子に対する抵抗性を媒介することができるいくつかの遺伝子が同定された。本願において「病原体抵抗性の媒介」という用語は、前記遺伝子の発現が増大された植物が、前記遺伝子の発現が通常どおりである植物と比べて、特定の病原体による感染の影響を受けにくいことを意味する。病原体抵抗性を媒介する遺伝子のうちには、発現が病原体の感染によって活性化されるような遺伝子もある。
【００５４】
これらの遺伝子のうちには、ペルオキシダーゼおよびシュウ酸エステル酸化酵素がある。ジャーミン様タンパク質（ｇｅｒｍｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のファミリーに属するシュウ酸エステル酸化酵素は、シュウ酸の酸化を触媒し、それによって過酸化水素が形成される。過酸化水素は殺菌性の役割を果たすとともに細胞壁の木質化を促進することができ、それによって病害虫の侵入が防がれる。さらに、これは、低濃度で高感受性の細胞死を引き起こすことができる。ペルオキシダーゼは、細胞基質を酸化し、それによって解毒するために、酸素分子または過酸化水素分子を使用する。
【００５５】
植物の表皮中でシュウ酸エステル酸化酵素およびペルオキシダーゼが発現することにより、それに対する抵抗性を媒介することができる病原体としては、例えば、ウドンコ病菌、フザリウム属、リンコスポリウム・セカリス（ｒｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、ピレノホラ・テレス（ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）が挙げられる。病原体に対する抵抗性を媒介することができる他の遺伝子は、キチナーゼ、Ａｇ−ＡＦＰ、ＧＳＴＡ１、およびＷＩＲ１ａである。
【００５６】
本発明に係るプロモーター領域の助けを借りて、トランスジェニック植物の表皮中で前記酵素をコードしている核酸配列を発現させることによって、病原体抵抗性を高めた植物を得ることができる。
【００５７】
病原体抵抗性を媒介する遺伝子とは対照的に、病原体の侵入を促進する植物固有の遺伝子もある。これらの一つは、７回膜貫通型受容体をコードするＭｌｏ遺伝子であり、これは、表皮中へのウドンコ病菌の侵入を促進するようである。この場合、植物中への真菌の侵入を防止するために、Ｍｌｏ遺伝子の発現を阻害することが適切である。これは、例えば、上述のＲＮＡｉ法を用いて実施され得る。植物中への真菌の侵入を防止するのにＭｌｏ遺伝子の発現を阻害することが適切であるということは、Ｍｌｏ−ｄｓＲＮＡで被覆されたタングステン粒子が撃ち込まれたオオムギの葉片中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで示された（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他（２０００年）、Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｃｅｒｅａｌｓ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、第２４巻（第６号）、８９５〜９０３ページ）。しかし、トランスジェニック植物でＭｌｏ発現を表皮特異的に阻害することが同じ効果を有するということは、これまで示されていない。
【００５８】
病原体と植物との相互作用を媒介し、それによって植物中への病原体の侵入を促進することができる別の植物遺伝子は、例えば、アミノ酸もしくは糖輸送体または転化酵素である。前記遺伝子は、遺伝子サイレンシングの標的としても適切である。したがって、本発明は、
ａ）本発明に係るプロモーターが、病原体抵抗性を媒介する核酸配列と有効に結合してその中に存在している組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、病原体抵抗性を有する植物の製造方法に関する。
【００５９】
好ましくは、病原体抵抗性を媒介する核酸配列は、ペルオキシダーゼもしくはシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子のコード領域、または内在性Ｍｌｏ−ＲＮＡを阻害する配列である。
【００６０】
以下の実施例は本発明を例示するのに役立つが、限定するものとして理解されるべきではない。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例では、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（２００１年）の書籍に従って（上記を参照されたい）、当技術分野で公知である大腸菌による形質転換、制限消化、ライゲーション、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲなどの分子生物学の標準的な方法を実施した。すべてのＰＣＲ反応において、プルーフリーディングポリメラーゼのＰｗｏ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用した。
【００６２】
１）ＧＳＴＡ１プロモーターおよびＷＩＲ１ａイントロンからのプロモーター構築物の製造（ｐＰＳ１８）
以下の前駆構築物、すなわちｐＰＳ１、ｐＰＳ３、ｐＰＳ１５を経て、いくつかの工程で製造した。一過性のアッセイで直接試験され得るように、すべての構築物はＧＵＳレポーター遺伝子を含んでいた。
【００６３】
ｐＰＳ１：
ＰｓｔＩを用いて、ＷＩＲ１ａ遺伝子の１．９ｋｂのプロモーター断片を組換型ｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）クローンから切り出し、ＧＵＳ遺伝子の前方にある発現カセットのＰｓｔＩ制限部位中にクローニングした。この発現カセットはｐブルースクリプトをベースとし、その後にコムギＧＳＴＡ１遺伝子の転写ターミネーターが続くＧＵＳ遺伝子を含んでいた。ＧＵＳ遺伝子およびＧＳＴＡ１転写ターミネーターは、使用される最終構築物にはもはや含まれないことから（実施例２を参照のこと）、この発現カセットの詳細な説明を省略する。得られる構築物は、翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳを含有していた。
【００６４】
ｐＰＳ３：
アダプタープライマー５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＴＣ ＣＡＣおよび５’ＴＡＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＧＡＡを用いて約２４０ｂｐのＰＣＲ断片を製造し、その端を（アダプターを介して）ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで切断した。ゲノム性のＷＩＲ１ａクローンは、ＰＣＲの鋳型としての機能を果たした。ＰＣＲ断片は、ＷＩＲ１ａの最初のエキソンの最後の１５アミノ酸と、スプライス受容部位を含むイントロンとを含有していた。このＰＣＲ断片をｐＰＳ１に連結し、ＰｓｔＩ（部分的に）およびＳｍａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。得られた構築物は、ＧＵＳ遺伝子の前方にＷＩＲ１イントロンを含む翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳを含有していた。さらに、（シグナルペプチドを除去することによって）翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳの分泌を防ぐために、ＷＩＲ１ａの最初のエキソンの１８番〜３５番のアミノ酸の欠失を導入した。
【００６５】
ｐＰＳ１５：
ＷＩＲ１ａプロモーターをＧＳＴＡ１プロモーターのＰＣＲ断片で置き換えた。このために、ＸｈｏＩおよびＳｎａＢＩでｐＰＳ３を（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクターのバンドを精製した。ゲノムＧＳＴＡ１クローン由来のアダプタープライマー５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣおよび５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＴＡＣ ＧＴＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＣＣＧ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＣＡを用いるＰＣＲによって、長さが約２．３ｋｂのＧＳＴＡ１プロモーター断片を増幅させ、ＸｈｏＩおよびＳｎａＢＩで端を切断した。このＰＣＲ断片をゲル溶出させたｐＰＳ３バンドに連結して、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のＧＵＳとの翻訳融合物を得た。
【００６６】
ｐＰＳ１８：
ＰｓｔＩおよびＳｎａＢＩでｐＰＳ１５を（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクターのバンドを精製し、２本鎖オリゴヌクレオチド（５’ＧＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＣＧ ＣＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＣＡおよび５’ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＴ）と連結した。これにより、翻訳開始部位の周辺（翻訳開始部位の４６ｂｐ上流〜５３ｂｐ下流）に位置するＷＩＲ１ａ遺伝子の部分を、翻訳開始コドンＡＴＧを含まないＷＩＲ１ａ遺伝子の４２ｂｐの５’ＵＴＲで置き換えた。得られた構築物は、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のＧＵＳとの転写融合物を含んでいた。
【００６７】
２）使用する構築物の製造
ａ）発現ベクターｐＰＳ２４（本発明に係るプロモーターの制御下にあるシュウ酸エステル酸化酵素の発現）
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を含むコムギｇｆ−２．８遺伝子の長さ７４５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ断片（シュウ酸エステル酸化酵素；アクセッション番号Ｍ６３２２３）を植物発現カセットｐＧＹ１中にサブクローニングして、ｐジャーミン構築物を得た（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９９年に記述されている）。このクローニングのために、ｐＧＹ１中の制限部位ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いて断片を連結することができるように、シュウ酸エステル酸化酵素断片を中間ベクター中に連結した。
【００６８】
ｐジャーミンから、シュウ酸エステル酸化酵素遺伝子およびＣａｍＶ ３５Ｓターミネーターを含むとともに長さが約１ｋｂのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲル電気泳動を用いて精製したベクターｐＰＳ１８中に連結した。得られた構築物は、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子との転写融合物を含んでいた。ｐＰＳ１８と比べると、この構築物は、ＧＳＴＡ１転写ターミネーターはもはや含まないが、ＣａｍＶ ３５Ｓ遺伝子の転写ターミネーターを含んでいた。
【００６９】
ｂ）発現ベクターｐＰＳ４１（本発明に係るプロモーターの制御下にあるＴＡＰＥＲＯの発現）
ｐＷＩＲ３（ＣａｍＶ ３５ＳプロモーターとＴＡＰＥＲＯの転写融合物とを含む；シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９９年）から、長さ約１．２ｋｂのＴＡＰＥＲＯ断片を、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩを用い、制限消化によって単離した。
【００７０】
ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いて精製したベクターｐＰＳ２４中にＴＡＰＥＲＯ断片を連結した。これにより、シュウ酸エステル酸化酵素遺伝子がＴＡＰＥＲＯ遺伝子に置き換えられた、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧｓｔＡ１プロモーター制御下のＴＡＰＥＲＯ遺伝子（アクセッション番号Ｘ５６０１１）との転写融合物が得られた。ｐＰＳ２４と同様に、ｐＰＳ４１はＣａｍＶ ３５Ｓ遺伝子の転写ターミネーターを含んでいた。
【００７１】
ｃ）発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉ（本発明に係るプロモーターの制御下にあるＭｌｏ−ＲＮＡｉ構築物の発現）
まず初めに、ベクターｐＧＥＭ ＴｅａｓｙにサブクローニングされているオオムギからのＭｌａ１耐性遺伝子の３番目のイントロン（約１．１ｋｂ）を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて単離し、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断されたベクターｐＢＳｗ４１（キャンダス・エリオット（Ｃａｎｄａｃｅ Ｅｌｌｉｏｔｔ）が論文の範囲内でクローニングされた一部分のＴａＭｌｏ１ ｃＤＮＡを含むｐブルースクリプト誘導体；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＡＦ３６１９３３）中に連結した。
【００７２】
この構築物から、Ｍｌａ１イントロンを、ＴａＭｌｏ１遺伝子のコード配列の一部分とともに約１．５５ｋｂのＰｓｔＩ／ＭｓｃＩ断片（断片１）として単離した。これと並行して、ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドＴ３（ｐブルースクリプト用の標準の配列決定用プライマー）およびＴａＭｌｏ１−１（５’ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＧＡ ＡＡＴ ＧＴＧ Ｃ ３’、下線部はＳｐｈＩ制限部位）を用いて、プラスミドｐＢＳｗ４１から約４５０ｂｐの断片を増幅させた。続いて、制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩを用いてＰＣＲ断片を消化した（断片２）。ベクターｐＰＳ２４（プロモーター＋シュウ酸エステル酸化酵素、上記参照）をＳｍａＩおよびＳｐｈＩによる制限消化によって開き、切り取られたシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子断片を廃棄した。その後すぐに、３つの構成要素のライゲーション（ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）で、上述の断片１および２を、ＳｍａＩ／ＳｐｈＩで切断したｐＰＳ２４ベクター中に連結した。このライゲーションでは、ＭｓｃＩおよびＳｍａＩで切断された構成要素の両末端は、双方ともいわゆる平滑末端であるため適合しやすい。得られた構築物（ｐＴａＭｌｏ１ ＲＮＡｉ）は、約３００ｂｐのＴａＭｌｏ１遺伝子、ならびにＭｌａ１イントロンによって分離された「逆方向反復」としての約１５０ｂｐのポリリンカー／アダプター配列を含む。この転写単位の制御は、ＧＳＴＡ１プロモーターの支配下にある。
【００７３】
注記：歴史的な理由から本願ではＴａＭｌｏ１と称するこの遺伝子は、後に、ＴａＭｌｏ Ａ１と名付けられた（エリオット（Ｅｌｌｉｏｔｔ）他、２００２年）。Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第１５巻：１０６９〜１０７７ページ（２００２年）。
【００７４】
３）コムギ植物の形質転換
植物室で、短日条件（１０時間／日、約６００マイクロモル（６００マイクロアインシュタイン））のもと、昼間１５℃、夜間１２℃で４０日間、続いて、温室中で、１８／１６℃および少なくとも１６時間の光周期の条件で、コムギ植物（ボブホワイト栽培品種）を栽培した。穂をすぐに使用し、または４℃で最大５日間貯蔵した。穂から取った穀果を、７０％エタノールで２分間、次いで５％次亜塩素酸ナトリウム溶液／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１５〜２０分間表面滅菌し、最後に無菌の２回蒸留水で４回洗浄した。
【００７５】
０．５〜１５ｍｍの大きさの未熟胚を無菌状態で穀果から取り出して準備し、胚盤が上の方を向くように、ペトリ皿のカルス誘導培地（２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、４０ｇのマルトース一水和物、５００ｍｇ／ｌのＬ−グルタミン、１００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、５μＭのＣｕＳＯ４、および０．２５％フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）を含むムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ）による基本培地（１９６２年））上に並べた。２５℃、暗所で培養物をインキュベートした。
【００７６】
胚の単離５〜７日後に、遺伝子銃による形質転換を実施した。粒子発射の４〜６時間前に、既に増殖している胚を水ポテンシャルの低い新しい培地（上記のように、０．３Ｍマンニトールを添加）へ移し、２５℃、暗所でインキュベートした。
【００７７】
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子を含むプラスミドｐＡＨＣ２０（クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）およびクァイル（Ｑｕａｉｌ）１９９６年）を、モル比１：１で同時形質転換しようとするベクターと混合した。次に、全体で１０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、６０ｍｇ／ｌの金懸濁液２５μｌの粒子に沈着させた。１回の発射につき、５μｌエタノール中の３０μｇの粒子をマイクロキャリア表面に塗布した。ＤｕＰｏｎｔ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅの製造業者の仕様書に従って発射を行った。
【００７８】
粒子発射の１２〜１６時間後に、（胚の前培養の場合は）新しいカルス誘導培地に外植片を移し、２５℃、暗所で１０日間インキュベートした。
次に、そのカルスを分化培地（２０ｇ／ｌのスクロース、５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５％フィタゲル、および３ｍｇ／ｌのビアラホスを含むムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）（１９６２年）による基本培地）に移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でインキュベートした。
【００７９】
２週間後に、褐色化していないカルスを再生培地（２０ｇ／ｌのスクロース、０．２５％フィタゲル、および４ｍｇ／ｌのビアラホスを含むムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）（１９６２年）による基本培地）へ移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でさらにインキュベートした。
【００８０】
さらに２週間後、成長した芽を間引きし、再生培地を入れた培養管に移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でさらに培養した。
【００８１】
スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）他（１９９０年）による葉抽出物のＰＡＴ活性試験によって、または、候補植物のゲノムＤＮＡから導入遺伝子に特異的な配列を増幅すること、および／もしくは対応するプローブを用いたサザンブロットによって、形質転換された再生体の同定を行った。
【００８２】
基本となる物質の品質によって、この方法の形質転換効率は、培養胚１００個当たりトランスジェニック植物が０．５〜３つであった。
４）ｐＰＳ２４構築物を有する植物におけるｉｎ ｓｉｔｕでのシュウ酸エステル酸化酵素活性
ボブホワイト野生型植物またはＴ３世代のｐＰＳ２４トランスジェニックコムギ植物の葉片に真空内でシュウ酸エステル酸化酵素検出溶液（２．５ｍＭのシュウ酸、３．５ｍＭの遊離のＥＤＴＡ、０．６ｍｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトール、５０μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ、２０％（ｖ／ｖ）のエタノール、Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ４．０に調整）を染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートした。検出溶液を除去した後、４℃水中でさらに２４時間、これらの葉をインキュベートした。続いて、葉を手で横に裂いて薄い切片にし、顕微鏡で観察した。ツァイス・アキシオフォット（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ）を１００倍の拡大率で用いて、位相差光学顕微鏡での観察を行った。シュウ酸エステル酸化酵素が発現している細胞の細胞壁は紫色に染色される。
【００８３】
５）ノーザンブロット分析による、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物中のＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出
ともに止め葉（ｆｌａｇ ｌｅａｆ）段階のボブホワイト植物およびＴ２世代のｐＰＳ４１トランスジェニック植物の葉（それぞれ、新鮮重（ＦＷ）約１ｇ）を、細粉が形成されるまで液体窒素中でホモジナイズした。この粉末を３ｍｌのＲＮＡ抽出バッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０；０．２５ＭのＮａ−ＥＤＴＡ；５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）および１．５ｍｌのバッファー飽和フェノール（１５ｍｌのプラスチック製試験管）に加え、よく振とうした。４０００ｒｐｍ〜５０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間、抽出物を遠心分離した（スイング型、ヘラウス・バリフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｖａｒｉｆｕｇｅ））。１．５ｍｌのクロロホルムを（上清を捨てずに）加え、試験管を数回逆さにした。４０００ｒｐｍ〜５０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間、抽出物を再度遠心分離し、上清を注意深く新しい試験管（１５ｍｌのプラスチック製試験管）に注いだ。６ＭのＬｉＣｌ ３ｍｌを加えて、ＲＮＡを沈降させた（一晩、４℃）。１２５００ｒｐｍ、４℃で３０分間、沈降したＲＮＡを遠心分離し（固定ローター、ハームル（Ｈｅｒｍｌｅ）Ｚ３６０Ｋ）、ＲＮＡ沈殿物を５００〜１０００μｌの７０％エタノール中に溶かし（ＲＮＡは溶解しない）、エッペンドルフ試験管に移した。このサンプルを１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し（固定ローター、エッペンドルフ遠心分離機５４１７Ｒ）、上清を除去した。このＲＮＡ沈殿物を３７℃で５分間乾燥させ、１００μｌ〜２００μｌのＴＥ中に溶かし、７５℃で５〜１０分間溶解させた。標準プロトコール（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、上記を参照されたい）に従って、ホルムアルデヒド含有ゲルにおけるＲＮＡの変性アガロースゲル電気泳動およびナイロン膜（ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））への移行を実施した。１サンプル当たり１０μｇのＲＮＡを使用した。
【００８４】
キット（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を用いるランダムプライム標識法に従って、３２Ｐ−ｄＣＴＰによる放射性プローブ標識を実施した。６５℃で一晩、ＣＨＵＲＣＨバッファー（０．５Ｍリン酸Ｎａ ｐＨ７．２；１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ；７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；１ｍＭ Ｎａ２ＥＴＤＡ）中でハイブリダイゼーションを実施した。６５℃、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣ；０．１５ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中で１５分間、ブロットを２回洗浄し、続いて、ホスフォイメージャースクリーンに１６〜４８時間曝露した。曝露されたスクリーンをホスフォイメージャー装置（富士フイルム（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）ＦＬＡ３０００）を用いてスキャンし、ＴＩＦＦ形式の画像ファイルとして出力した。
【００８５】
６）ウェスタンブロット分析による、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物中のＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出
共に止め葉段階のボブホワイト植物およびＴ２世代のｐＰＳ４１トランスジェニック植物の葉の先端を、ＩＷＦバッファー（３２ｍＭリン酸Ｎａ；８４ｍＭクエン酸；ｐＨ２．８；スパチュラ先端量のポリビニルピロリドン）中でホモジナイズした。１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、このホモジネートを遠心分離した。上清を０．５ｇ／ｍｌの酢酸アンモニウムと混合し、４℃で一晩、酸可溶性タンパク質を沈降させた。
【００８６】
１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間、このタンパク質を遠心分離した。タンパク質沈殿物を５０μｌ／ｇのＦＧ再懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５；２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に溶かした。４倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファー５μｌを２０μｌのサンプルに加え、このサンプルを、ブロモフェノールブルーの色が青色に変わるまで（１〜５μｌの）Ｔｒｉｓ飽和溶液と混合した。各レーンについて、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のミニゲル装置を用いる標準の方法に従って、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％分離ゲル）において、１２．５μｌの煮沸したサンプルを分離した。
【００８７】
電気泳動に続いて、ゲルを（ローディングコントロールとして）クーマシー染色し、または標準の方法に従ってニトロセルロース膜に移した（ブロットした）。標準の方法に従って、この膜を、オオムギ由来のＰｒｘ８タンパク質（ＴＡＰＥＲＯに相同なタンパク質）に対して標的化した第１のポリクローナル抗体とともに（希釈率１：２０００）、続いて、ウサギ抗体に対して標的化し、アルカリホスファターゼを結合した第２の抗体（希釈率１：２０００）とともにインキュベートした。局在的なアルカリホスファターゼ活性を利用して（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色溶液；調製済みの錠剤（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）））、ＴＡＰＥＲＯタンパク質のバンドを検出した。
【００８８】
７）ノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析による、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出
実施例５で説明したようにして、ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析を実施した。製造業者の仕様書に従い、「Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）」装置（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、［ドイツ国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在］を用いて、リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。
【００８９】
８）ｐＰＳ４１またはｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニック植物におけるウドンコ病抵抗性
抵抗性試験のために、温室で栽培されて新しく出てきた止め葉が十分に発達している成熟したｐＰＳ４１またはｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ植物を使用した。同時に栽培した野生型植物のボブホワイト栽培品種が、コントロールとしての役目を果たした。止め葉の先端半分を切断し、大きさ２０ｘ２０ｃｍのポリカーボネート皿中の、２０ピーピーエム（百万分率）のベンズイミダゾールと混合した０．５％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）上に広げた。１皿当たり、１つのトランスジェニック亜系統（各２０枚の葉）ならびにボブホワイト野生型（各６枚の葉）を広げた。４枚の十分に接種されたコムギの葉の胞子を接種箱（ｔｏｗｅｒ）に吹き入れることによって、接種培地中で葉片にウドンコ病菌胞子を接種した。５分後に皿を取り出して蓋を閉め、間接昼光のもと、２０℃でインキュベートした。接種の７日後、クラス評価システム（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９５年）を用いてウドンコ病菌の感染を評価した。それぞれのフィトアガープレート上にあるコントロールの葉を参照して、抵抗性を算出した。
【００９０】
文献：
Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5: 213-218.
Elliott et al., (2002). Molecular Plant Microbe Interactions 15: 1069-1077.
Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497.
Schweizer, P.,Vallelian-Bindschedler, L., and Mosinger, E. (1995). Heat-induced resistance in barley to the powdery mildew fungusErysiphe graminis f sp. hordei, Physiological and Molecular Plant Pathology 47, 51-66.
Schweizer, P.,Pokorny, J.,Abderhalden,O., and Dudler, R. (1999). A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat, Mol Plant-Microbe Interact12, 647-654.
Spencer et al. (1990) TAG 79: 625-631.
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＧＳＴＡ１プロモーターの核酸配列（配列番号１）を示す図。
【図２】ＷＩＲ１ａイントロンの核酸配列（配列番号２）を示す図。
【図３】好ましいプロモーター領域の核酸配列（配列番号３）を示す図。
【図４】ＴＡＰＥＲＯ（ペルオキシダーゼ）ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号４）を示す図。
【図５】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、核酸配列（配列番号５）を示す図。
【図６】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、核酸配列（配列番号５）を示す図（図５の続き）。
【図７】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図８】ジャーミン９ｆ−２．８（シュウ酸エステル酸化酵素）ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号６）を示す図。
【図９】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、核酸配列（配列番号７）を示す図。
【図１０】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、核酸配列（配列番号７）を示す図（図９の続き）。
【図１１】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図１２】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ構築物の配列（配列番号８）を示す図。
【図１３】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、核酸配列（配列番号９）を示す図。
【図１４】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、核酸配列（配列番号９）を示す図（図１３の続き）。
【図１５】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図１６】ｐＰＳ２４トランスジェニック植物におけるiｎ ｓｉｔｕでのシュウ酸エステル酸化酵素活性を示す図。ボブホワイト（Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）野生型植物（ＢＷ）ならびにトランスジェニック系統１５７番および１７０番の葉を横方向に切り、ｉｎ ｓｉｔｕでシュウ酸エステル酸化酵素活性を検出した。左の列は、シュウ酸基質との反応を示す。右の列はシュウ酸基質が無い場合のコントロール反応を示す。紫の強い着色は、トランスジェニック系統の表皮におけるシュウ酸エステル酸化酵素活性を示唆している。
【図１７】（ａ）は、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物におけるＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出を示す図であって、ノーザンブロットによる検出を示す図。ノーザンブロットにＷＩＲ３サンプルをハイブリダイゼーションすることによる、ｐＰＳ４１構築物を有するＴ２世代のトランスジェニックコムギ系統からのＴＡＰＥＲＯ ＲＮＡ蓄積の検出。各場合において、成植物の段階の４種の選択された系統の２種の亜系統ならびに野生型（ＢＷ）を分析した。葉１は止め葉を示す。葉２〜４は、次第に成長した葉を示す。ＴａＧｅｒ−４プローブは、ストレス誘導性コムギ遺伝子のグループにハイブリダイズし、ＴＡＰＥＲＯ過剰発現の多面発現性の副次的作用を試験するために使用された。著しい副次的作用は認められなかった。ＥｔＢｒは、臭化エチジウムで染色されたゲルのローディングコントロールを示す。（ｂ）は、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物におけるＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出を示す図であって、ウェスタンブロットによる検出を示す図。ウェスタンブロットに抗体を反応させることによる、ｐＰＳ４１構築物を有するＴ２世代のトランスジェニックコムギ系統のＴＡＰＥＲＯタンパク質蓄積の検出。ＴＡＰＥＲＯトランスジェニック産物の予想されるサイズは３１ｋＤである。ボブホワイトの葉３では、基礎活性の高まったＴＡＰＥＲＯ遺伝子を観察することができた。葉１は止め葉を示す。クーマシー染色は、クーマシーブルーＲ２５０で染色されたゲルのローディングコントロールを示す。
【図１８】（ａ）は、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、ノーザンブロット分析による検出を示す図。特異的なプローブによるｐＰＳ２４またはｐＰＳ４１構築物を有するトランスジェニック植物の葉の表皮におけるシュウ酸エステル酸化酵素（左）およびＴａＰＥＲＯ（右）ｍＲＮＡの蓄積の検出。Ｗは、葉全体から得たＲＮＡを示す。Ｅは、葉の表皮から得たＲＮＡを示す。ＥｔＢｒは、ローディングコントロールとしての臭化エチジウムで染色されたゲルを示す。２６ＳＲＮＡは、ブロットとローディングコントロールとしての２６ＳリボゾームＲＮＡに対するプローブとのその後のハイブリダイゼーションを示す。（ｂ）は、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、リアルタイム逆ＰＣＲ法による検出による検出を示す図。（構築物ｐＰＳ４１で形質転換された）トランスジェニック系統２０１３番の葉全体および表皮中のＴａＰＥＲＯｍＲＮＡの濃度を測定した。構成的に発現されるコントロール遺伝子ＵＢＣ（ユビキチン結合酵素）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）を用いてデータを標準化した。葉全体で残っている発現は、除去されていない上部の葉の表皮および師部からのものである（プロモーターの副活性）。
【図１９】表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、リアルタイム逆ＰＣＲ法による検出による検出を示す図。成植物の段階の野生型植物（ボブホワイト）および（ｐＰＳ４１構築物で形質転換された）トランスジェニック系統２０１３番および２１５１番を分析した。プロモーターは、特に葉および穂で強く発現される。茎および根では、導入遺伝子は全く発現されず、または弱くしか発現されない。
【図２０】ｐＰＳ４１トランスジェニック植物のウドンコ病菌に対する抵抗性の調査を示す図。成植物の止め葉を切り取り、ボブホワイト野生型植物とともに、切断葉のアッセイでコムギのウドンコ病菌を接種した。接種の７日後に、ウドンコ病菌の感染を評価した。Ｔ２世代およびＴ３世代の植物を用いた３回の独立した接種実験の平均値を示している。亜系統２０８８／２は、ＴＡＰＥＲＯを全く発現せず、抵抗性は高まっていない。「非サイレンシング」の平均値は、２０８８／２以外のすべての系統およびすべての実験の平均値を示す。
【図２１】ｐＰＳ４１トランスジェニック植物の芽の成長を示す図。Ｔ２世代の植物をボブホワイト野生型植物とともに植え、成植物段階で写真を撮影した。
【図２２】ｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニック植物のウドンコ病菌に対する抵抗性の調査を示す図。Ｔ２世代の成植物の止め葉を切り取り、ボブホワイト野生型植物とともに、切断葉のアッセイでコムギのウドンコ病菌を接種した。接種の７日後に、ウドンコ病菌の感染を評価した。各事例において、１系統につき２種の亜系統を試験した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その制御下で植物において導入遺伝子が表皮特異的に発現することができるプロモーター領域に関する。さらに、本発明は、前記プロモーター領域を含む組換え核酸分子、前記核酸分子を用いて形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。さらに、本発明は、本発明に係るプロモーターを含む核酸分子、病原体抵抗性を媒介することができる核酸配列または導入遺伝子、前記核酸分子を用いて形質転換された植物および植物細胞、ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写開始点の上流に位置し、それによって転写の開始点および開始頻度が決定され、それにより、制御下の遺伝子の発現レベルおよび発現パターンが決定される遺伝子のＤＮＡ領域は通常、プロモーターと呼ばれる。ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを活性化する特異的な転写因子は、基本転写複合体とともに転写を開始するために、プロモーターに結合する。プロモーターの有効性は、付加的なＤＮＡ配列、すなわちエンハンサー配列によってしばしば高められるとともに調節される。このエンハンサー配列の位置は、プロモーターの位置と違って固定されていない。この調節エレメントは、発現される遺伝子の上流、下流、またはイントロン中に位置することができる。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術において、プロモーターは、通常は該プロモーターによって自然に調節される遺伝子ではない導入遺伝子の発現を制御するために、発現ベクター中に挿入される。遺伝子工学を用いて移入された遺伝子がどの時点で、どのタイプの組織で、また、どれくらいの強度で発現されるかを決定するプロモーターの特異性は、本願ではかなり重要である。
【０００４】
植物育種において、特定の有利な諸特性を有用な植物に伝達するために組換えＤＮＡ技術がしばしば使用される。これは、例えば病原体抵抗性の向上によって収率を上昇させ、または収穫作物の諸特性を改善すると期待されている。トランスジェニック産物の存在が一部の組織の正常な生理的過程に負の影響を与える可能性があることから、本願において、移入された遺伝子が偏在的に発現されるのではなく、形質転換された活性が必要とされる組織中でのみ発現されることが多くの場合望ましい。すなわち、例えば、偏在的に有効な３５Ｓプロモーターの制御下で陰イオン性のペルオキシダーゼを過剰に発現させると、根の成長の低下が起こり、したがって、発達する根の質量も低下することから、トランスジェニックタバコ植物がしおれることが示されている（ラグリミニ（Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ）他（１９９７年） Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏｎ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第３３巻（第５号）、８８７〜８９５ページ）。同様に偏在的に有効なユビキチンプロモーターの制御下でｓｐｉ２ペルオキシダーゼを過剰に発現させると、コントロール植物と比べて、上胚軸の発達が低減し、縦方向の成長が低減する（エルフストランド（Ｅｌｆｓｔｒａｎｄ），Ｍ．他（２００１年）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｓｐｉ２ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｒｗａｙ ｓｐｒｕｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏｔａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２０巻（第７号）５９６〜６０３ページ）。生理的過程に対する負の影響とは無関係に、抵抗性育種では、収穫された植物部分にトランスジェニック産物も存在することを防ぐことが多くの場合期待される。
【０００５】
したがって、組織特異的に、または誘導的に機能するプロモーターが、過去数年間に単離されている。組織特異的プロモーターは、例えば、種子、塊茎、および果実に特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターは、例えば、化学誘導、光誘導、または他の刺激によって活性化され得る。
【０００６】
表皮において遺伝子発現を特異的に調節することも望ましい。表皮は、高等植物の地上の器官の末端組織である。したがって、表皮の役目は、一方では植物に水および栄養物を交換させることであり、もう一方では、病原体が植物中に侵入するのを防止することである。これらの機能は、適切なプロモーターおよび後者によって制御される遺伝子の助けを借りて表皮中での遺伝子発現を改変することによって、特異的に調節され得る。
【０００７】
表皮特異的プロモーターは、双子葉植物では既に説明されている。すなわち、ろう状物質の合成の際の縮合酵素をコードするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＣＥＲ６（ＣＵＴ１）遺伝子のプロモーターが、β−グルクロニダーゼ受容体遺伝子の表皮特異的な発現を引き起こすことができることが示されている（フーカー（Ｈｏｏｋｅｒ）他（２００２年）、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＥＲ６ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｕｔｉｃｕｌａｒ ｗａｘ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１２９巻（第４号）、１５６８〜１５８０ページ；クンスト（Ｋｕｎｓｔ）他（２０００年）、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＣＵＴ１ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．第２８巻（第６号）、６５１〜６５４ページ）。
【０００８】
しかし、単子葉類、特にイネ科植物（コウボウ）で導入遺伝子を発現するのに特に好適である単子葉植物の適切な表皮特異的プロモーターは、これまで首尾良く同定することができなかった。したがって、これまでは、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターに似た構成的プロモーターが表皮でタンパク質を発現するのに使用されていた（例えば、オルダク（Ｏｌｄａｃｈ）他（２００１年）、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｇａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第１４巻（第７号）、８３２〜８３８ページを参照のこと）。しかし、前述したように、この方法は、表皮以外の他の組織または器官にトランスジェニック産物が存在することから、トランスジェニック植物に望ましくない副次的作用をもたらす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、単子葉類、好ましくは穀類植物における表皮特異的な遺伝子発現を可能にする手段を提供することが、本発明の根本的な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題は、特許請求の範囲を特徴とする実施形態を提供することによって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
したがって、本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡｌ（ＧＳＴＡ１）遺伝子のプロモーター由来の第１の配列、およびＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン由来の第２の配列を含み、植物の表皮に対する特異性を有するプロモーター領域に関する。ＧＳＴＡ１は、ドゥドラー（Ｄｕｄｌｅｒ）他（１９９１年）、Ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第４巻（第１号）、１４〜１８ページに記載されている遺伝子に関係している。具体的には、これらの遺伝子は、コムギ由来の遺伝子である。しかし、これらは、類似の発現パターンおよび類似の遺伝子産物を有する他の穀類植物、特に、オオムギからの相同遺伝子でもよい。ＷＩＲ１ａは、ブル（Ｂｕｌｌ）他（１９９２年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｅｆｅｎｓｅ，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第５巻（第６号）、５１６〜５１９ページで記載されている遺伝子を示す。
【００１２】
好ましくは、第１の配列は配列番号１であり、第２の配列は配列番号２である。
第１の配列と第２の配列との間には、さらに、長さが１０ｂｐ〜１０００ｂｐ、好ましくは２０ｂｐ〜８００ｂｐ、特に好ましくは３０ｂｐ〜５００ｂｐ、最も好ましくは４０ｂｐ〜３００ｂｐの非翻訳配列が存在してもよい。
【００１３】
特に好ましくは、本発明に係るプロモーター領域は、
ａ）配列番号３で与えられる核酸配列を含むプロモーター領域、
ｂ）配列番号３で与えられる核酸配列の機能部分を含むプロモーター領域、または
ｃ）ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる核酸配列とハイブリダイズする配列を有するプロモーター領域からなる群から選択されるプロモーター領域である。
【００１４】
本発明の範囲内では、プロモーター領域は、コード配列（導入遺伝子）の発現に必要とされる制御配列を含む核酸配列と理解される。制御配列は、コード配列の発現、すなわち、特に発現レベルおよびパターンを決定する遺伝子の一部を形成する。この制御配列は、転写複合体を形成するために特異的な転写因子およびＲＮＡポリメラーゼが結合して集まり、プロモーター領域によって制御されている核酸配列の転写を効果的に開始する少なくとも一つの配列モチーフを有する。
【００１５】
本発明に係るプロモーター領域は、コムギ由来のＧＳＴＡ１遺伝子のプロモーターを、コムギ由来のＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン配列と融合させることによって、新しい諸特性を有するプロモーターが製造され得るという観察に基づいている。
【００１６】
大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をレポーター遺伝子として有するコムギの葉における一過性のレポーター遺伝子アッセイで、ＷＩＲ１ａのプロモーターと、イントロンと、ＧＳＴプロモーターとの様々な組合せが試験された。驚くべきことに、ＧＳＴプロモーターとＷＩＲ１ａイントロンとが、レポーター遺伝子活性に対して相乗効果を有することが示された。転写活性の上昇は、偏在的に発現される３５Ｓプロモーターによって実現される転写活性に匹敵していた。
【００１７】
本発明の範囲内では、「表皮特異的な」という用語は、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列が、植物の芽の表皮で発現されることを意味すると理解される。本発明の意味では、特に、本発明に係るプロモーター領域が、他の細胞型と比べて表皮での外来遺伝子の発現を促進し、且つ他の細胞型と比べて少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍など、有意な発現の増大を引き起こす場合も、表皮特異性が与えられる。この発現レベルは、従来のｉｎ ｓｉｔｕな検出技術を用いて測定され得る。
【００１８】
「植物の表皮」という用語は当業者に公知である。補完的な情報は、例えば、シュトラースブルガー（Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｂｏｔａｎｉｋ、第３５版、２００２年、スペクトラム大学出版（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）のような植物解剖学または植物生理学に関する任意の書籍に見出され得る。
【００１９】
現在では驚くべきことに、コムギ由来のＧＳＴＡ１遺伝子の制御配列と、コムギ由来のＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン配列との双方を含むプロモーター領域が、その制御下にあるコード核酸配列の表皮特異的な発現を引き起こすことが判明している。
【００２０】
配列番号３で示される核酸配列を有するプロモーター領域に加えて、本発明はまた、前記配列の機能部分を有し、それらが制御するコード核酸配列のうちの一つを植物中で表皮特異的に発現させるプロモーター領域にも関する。
【００２１】
この文脈において、「機能部分」とは、転写複合体が、わずかに異なる核酸配列ではあるものの、なお結合し、表皮特異的な発現を引き起こすことができる配列を意味すると理解される。プロモーター配列の機能部分は、野生型と比べてそのプロモーター活性が低減または増大されている前記プロモーターの変異体も含む。具体的には、機能部分は当然、配列番号３で与えられるプロモーター領域の配列の天然または人工の変異体を意味するとも理解される。突然変異は、一つまたは複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、交換、および／または挿入を含む。本発明の範囲内において、プロモーター領域の機能部分は、配列番号３の天然に存在する変異体、ならびに例えば化学合成によって得られる人工ヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
どんな場合でも、使用されるプロモーターはＴＡＴＡボックス（配列番号１および３中の２１６３〜２１６９位）を含み、好ましくは２つのＣＡＡＴボックス（配列番号１および３中の１０４７〜１０５１、または１８９５〜１８９９位）も含む。さらに、このプロモーターは、以下の配列モチーフのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび３つ、特に好ましくは少なくとも４つ、５つ、および６つ、最も好ましくは少なくとも７つまたは８つを含む。
【００２３】
ａ）ＧＴＧＧＧＧＧ
ｂ）ＡＣＧＴＧＧＡ
ｃ）ＴＣＣＡＣＣＴ
ｄ）ＴＡＴＣＣＡＴ
ｅ）ＣＡＴＧＣＡＴＧ
ｆ）ＴＧＴＡＡＡＧ
ｇ）ＣＣＴＡＣＣＡ
ｈ）ＡＡＴＡＧＴＡ
好ましくは、この配列モチーフは、配列番号１および３中の以下の位置に対応する位置に配置されている。
【００２４】
ａ）１８５〜１９１ｂｐおよび２１７〜２２３ｂｐ
ｂ）４５５〜４６１ｂｐ
ｃ）５０８〜５１４ｂｐ
ｄ）５６４〜５７０ｂｐ
ｅ）１５１４〜１５２１ｂｐ
ｆ）１５２０〜１５２６ｂｐ
ｇ）１５６９〜１５７５ｂｐ
ｈ）１６１０〜１６１６ｂｐ
プロモーター領域の変異体のプロモーター活性は、コード配列が検査対象のプロモーター領域の制御下にあるマーカー遺伝子の助けを借りて測定され得る。適切なマーカー遺伝子は、例えば、大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、例えば、エクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やフォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子のような蛍光遺伝子、または大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子である。絶対的なプロモーター活性は、野生型の植物との比較により決定される。組織特異性または細胞特異性は、それぞれの組織または細胞における前述のマーカー遺伝子の発現速度を比較することによって容易に決定され得る。
【００２５】
本発明はまた、ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を有するプロモーター領域にも関する。本発明の文脈において、「ストリンジェントな条件のもとでのハイブリダイゼーション」という用語は、特異的なハイブリダイゼーションを確実に起こすのに十分な厳密さを有する条件のもと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでハイブリダイゼーションが行われることを意味する。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者には公知であり、文献から知られ得る（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、コールドスプリングハーバー研究所出版会（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、［米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）所在］）。
【００２６】
「特異的にハイブリダイズする」とは通常、特定のヌクレオチド配列が（例えば全）ＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物の形で存在する場合に、ある分子が、ストリンジェントな条件のもとで前記配列と優先的に結合することを意味する。「ストリンジェントな条件」という用語は通常、ある核酸配列がその標的配列と優先的に結合し、他の配列にはかなり低い程度しか結合せず、または全く結合しないと考えられる条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列にある程度依存しており、様々な状況によって異なると考えられる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。通常、所定の一定のイオン強度および所定のｐＨ値における特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く温度が維持されるように、ストリンジェントな条件が選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的な分子の５０％がその標的配列に平衡状態でハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ値、および核酸濃度のもとでの）温度である。一般に、ストリンジェントな条件は、短い分子（すなわち、例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合、７．０〜８．３のｐＨ値で塩濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の任意の塩）であり、温度が少なくとも３０℃である条件である。さらに、ストリンジェントな条件は、例えばホルムアミドのような不安定化剤の添加によって実現され得る。
【００２７】
適切なストリンジェントな条件は、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他にも記載されている。上記を参照されたい。すなわち、ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件のもとで起こり得る。
【００２８】
ハイブリダイゼーションバッファー：２×ＳＳＣ、１０×デンハルト液（フィコール（Ｆｉｋｏｌｌ）４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ、１：１：１の比）、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、または０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、６５℃〜６８℃のハイブリダイゼーション温度。
【００２９】
洗浄バッファー：０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。６５℃〜６８℃の洗浄温度。
好ましくは、このようなプロモーター変異体は、配列番号３で示される全ＤＮＡ配列に関して、配列番号３中で与えられるプロモーター配列またはその一部分に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このようなプロモーター配列の配列同一性は、配列番号３で与えられる核酸配列との比較によって決定される。長さが異なる２つの核酸配列が互いに比較される場合、好ましくは、配列同一性は、長い方の配列の対応するヌクレオチド残基と同一である、短い方の配列のヌクレオチド残基の比率に合致することが好ましい。
【００３０】
配列同一性は通常、例えばＣＬＵＳＴＡＬのような様々なアライメントプログラムによって決定される。通常、当業者は、配列同一性を決定するのに適切なアルゴリスムを自由に使うことができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ（例えば、「標準ヌクレオチド−ヌクレオチドＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｎ］」のリンク）でアクセス可能なプログラムも使用され得る。
【００３１】
配列番号３について上記に与えられた同一性の比率の程度は、配列番号１および２で示される、本発明に係るプロモーター領域の第１および第２の配列にも当てはまる。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係るプロモーター領域は、配列番号３で与えられる２５５２ヌクレオチドの全配列を有する。
【００３２】
本発明はまた、本発明に係るプロモーター領域のキメラ遺伝子、および天然には本発明に係るプロモーター領域によって調節されていない発現が、キメラ遺伝子中では本発明に係るプロモーター領域によって調節されている、有効に結合したコード配列のキメラ遺伝子、ならびに前記キメラ遺伝子を含む組換え核酸分子に関する。
【００３３】
「発現が本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列」という用語は、プロモーター領域が活性な細胞において、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列の発現が、野生型細胞と比べて、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも５０倍に増大され得ることを意味する。
【００３４】
発現が本発明に係る核酸配列によって調節されている核酸配列は、導入遺伝子のコード領域、例えば、遺伝子産物が表皮中で望まれる耐性遺伝子でもよい。導入遺伝子の発現により、それにコードされる遺伝子産物の含有量は、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍に増大され得る。
【００３５】
しかし、本発明に係るプロモーター領域は、遺伝子産物が表皮中に通常より少なく存在し、または全く存在しないことが期待される特定の遺伝子の表皮特異的なサイレンシングを実現するために、ＲＮＡ干渉用のＲＮＡｉ構築物にも使用され得る。当然、本発明に係るプロモーター領域を使用した典型的なアンチセンスまたはコサプレッション構築物を用いても、後者を実現することができる。サイレンシング構築物によって、内在性遺伝子の発現は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％低減される。
【００３６】
ＲＮＡ干渉に使用されることになっている構築物中には通常、転写に続いて２本鎖ＲＮＡを形成する回文構造のＤＮＡ配列がある。ダイサー酵素によって前記２本鎖ＲＮＡが処理され、内在性ＲＮＡに結合するとともに、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と協力してその分解を引き起こす、より短いＲＮＡ断片が形成される（ハノン（Ｈａｎｎｏｎ）（２００２年）ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｄ．第４１８巻、２４４〜２５１ページ）。
【００３７】
内在性遺伝子の発現に対する遺伝子サイレンシング構築物の効果は、当業者に周知である従来の分子生物学的方法によって検出され得る。すなわち、ＲＮＡレベルの検査にはノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ法が利用可能であり、タンパク質は、ウェスタンブロット分析、免疫蛍光法、または、タンパク質が酵素であることを条件として酵素アッセイにより検出され得る。
【００３８】
本発明の範囲内において、「導入遺伝子」という用語は、その遺伝子産物が、表皮中に供給されることになり、または、遺伝子サイレンシングで抑制されることになる遺伝子をまとめて示す。
【００３９】
好ましくは、表皮は、病原体が植物中に侵入する際に越えなければならない最初の層であることから、発現が本発明に係るプロモーターによって調節されている核酸配列は、病原体抵抗性を媒介する核酸配列である。
【００４０】
本発明の範囲内において、「組換え核酸分子」という用語は、本発明に係るキメラ遺伝子または本発明に係るプロモーター領域を含み、植物細胞および植物中で、本発明に係るプロモーター領域の制御下にある核酸配列のプロモーター依存的な発現を引き起こすことができるベクターを意味すると理解される。好ましい実施形態において、本発明に係る組換え核酸分子は、転写終結配列をさらに含む。本願において、「転写終結配列」は、コード配列の下流末端に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるＤＮＡ配列を意味すると理解される。
【００４１】
さらに、本発明は、以下の工程、
ａ）本発明に係るプロモーター領域がコード配列と有効に結合して、その中に存在している組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により、それらの植物を増殖させる工程とを備え、
本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【００４２】
高等植物およびその細胞中への外来遺伝子の導入準備のために、それぞれ、大腸菌に対する複製シグナル、および形質転換された細菌細胞を選別するためのマーカー遺伝子を含む多数のクローニングベクターが利用可能である。このようなベクターの例として、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などがある。キメラ遺伝子は、ベクターの適切な制限部位に導入され得る。
【００４３】
次に、得られたプラスミドを使用して、大腸菌を形質転換する。形質転換された大腸菌細胞を適切な培地中で培養し、続いて回収および溶解し、プラスミドを再度得る。制限分析、ゲル電気泳動、さらに生化学−分子生物学的方法が、得られたプラスミドＤＮＡの特性を決定するための分析方法として一般に使用される。各操作の後に、プラスミドＤＮＡは切断可能であり、それから得られたＤＮＡ断片は他のＤＮＡ配列と結合可能である。
【００４４】
既に述べたように、植物宿主細胞中にＤＮＡを導入するために様々な技術が利用可能であり、当業者は、各事例に適した方法を苦もなく決定することができる。前記技術は、形質転換媒体としてアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用するＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、インジェクション、エレクトロポレーション、単離されたＤＮＡのプロトプラスト中への直接的な遺伝子移入、遺伝子銃法によるＤＮＡの導入、ならびにこれまでの数年間に十分に確立されており、植物分子生物学および植物バイオテクノロジーのそれぞれの技術分野の技術者の標準の能力の範囲に属する別の実行可能な手段を含む。遺伝子銃による遺伝子移入法は、特に単子葉植物で使用される。この点で、当業者は、例えば、バシル（Ｖａｓｉｌ）他（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、６６７〜６７４ページ；バシル（Ｖａｓｉｌ）他（１９９３年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１巻、１１５３〜１１５８ページ；ネーラ（Ｎｅｈｒａ）他（１９９４年）Ｐｌａｎｔ Ｊ．第５巻、２８５〜２９７ページ；ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）他（１９９４年）Ｐｌａｎｔ Ｊ、第５巻、２９９〜３０７ページ；アルトピター（Ａｌｔｐｅｔｅｒ）他（１９９６年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第１６巻、１２〜１７ページ；オルチズ（Ｏｒｔｉｚ）他（１９９６年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第１５巻、８７７〜８１ページ；ラスコーゴーント（Ｒａｓｃｏ−Ｇａｕｎｔ）他（２００１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．第５２巻、８６５〜８７４ページで、誘導に関する有用な情報を確認することができる。
【００４５】
植物細胞中へのＤＮＡのインジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、使用されるプラスミドそれ自体に対して特別な要求はない。これは、直接的な遺伝子移入にも当てはまる。例えば、ｐＵＣ誘導体のような、単純なプラスミドが使用可能である。
【００４６】
しかし、植物全体が、この方法で形質転換された細胞から再生されることになる場合には、選択マーカー遺伝子が存在することが推奨される。標準的な選択マーカーは当業者に公知であり、適切なマーカーを選択することは困難ではない。
【００４７】
植物細胞中に所望の遺伝子が導入される方法では、さらに別のＤＮＡ配列が必要とされることがある。例えば、植物細胞を形質転換するためにＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドが使用される場合は、フランキング領域を形成するために、右端および左端であることが多いが、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド中に含まれるＴ−ＤＮＡの少なくとも右端が、導入されることになっている遺伝子と結合されていなければならない。アグロバクテリアが形質転換に使用される場合は、導入されることになっているＤＮＡは、特定のプラスミド、すなわち実際には中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングされなければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同な配列を有することから、相同組換えによって、アグロバクテリアのＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド中に組み込まれ得る。前記プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの移行に必要とされるｖｉｒ領域も含む。しかし、中間ベクターはアグロバクテリア中で複製することができない。ヘルパープラスミドを用いて、中間ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンスに移入され得る（接合）。しかし、バイナリーベクターは、大腸菌中でもアグロバクテリア中でも複製することができる。これらは、左右のＴ−ＤＮＡボーダー領域に囲まれた、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これらは、アグロバクテリア中に直接形質転換され得る。宿主細胞の役目を果たすアグロバクテリウムは、Ｔ−ＤＮＡ内部に、植物細胞中に移行されるキメラ遺伝子を有するプラスミドを含んでいなければならない。追加のＴ−ＤＮＡも存在可能である。このような方法で形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞の形質転換に使用される。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は鋭意検討されており、植物の形質転換に関する一般的に知られた調査論文および手引書で十分に説明されている。単子葉植物の場合は、例えば、チェン（Ｃｈｅｎｇ）他（１９９７年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１５巻、９７１〜９８０ページ；カンナ（Ｋｈａｎｎａ）およびダガード（Ｄａｇｇａｒｄ）（２００３年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ第２１巻、４２９〜４３６ページ；ウー（Ｗｕ）他（２００３年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２１巻、６５９〜６６８ページ；フー（Ｈｕ）他（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第２１巻、１０１０〜１０１９ページで記載されているように、アグロバクテリウムを媒介とした有効な遺伝子移入を行うには、改変したプロトコールが適用されなければならない。植物細胞中にＤＮＡを移行させるために、賢明には、植物外植片がアグロバクテリウム・チュメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに培養され得る。次に、形質転換された細胞を選別するための抗生物質または殺生剤を含有することができる適切な培地中で、感染された植物物質（例えば、葉片、茎の断片、根、ならびに、プロトプラストまたは懸濁培養された植物細胞）から植物全体が再生され得る。
【００４８】
導入ＤＮＡは、植物細胞のゲノムに組み込まれた後は通常、そこで安定であり、初めに形質転換された細胞の子孫でも維持される。導入されたＤＮＡは通常、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサート、グリホサート、ストレプトマイシン、スルホニル尿素、ゲンタマイシン、またはホスフィノトリシン、および形質転換された植物細胞に対するその他のもののような殺生剤または抗生物質に対する抵抗性を媒介する選択マーカーを含む。したがって、個別に選択されるマーカーは、導入されるＤＮＡを欠いている細胞と比較して、形質転換された細胞の選択を可能にしなければならない。このためには、栄養マーカーまたはスクリーニングマーカー（ＧＦＰ、すなわち緑色蛍光タンパク質など）のような代替マーカーも適している。当然、選択マーカーも完全に取り除かれ得るが、比較的高度なスクリーニングが必要である。マーカーを含まないトランスジェニック植物が望まれる場合は、当業者は、後でマーカー遺伝子を除去することを可能にする戦略、例えば、共形質転換または配列特異的なリコンビナーゼも自由に使用できる。
【００４９】
トランスジェニック植物細胞からのトランスジェニック植物の再生は、既知の栄養培地を用いる従来の再生法に従って実施される。次に、この方法で得られた植物が、発現が本発明に係るプロモーターによって制御される導入核酸配列の存在および組織特異性、または前記核酸配列の影響を受けた内在性のＲＮＡおよびタンパク質を目的としたＰＣＲ分析、ブロット分析のような分子生物学的方法を含む従来の方法によって検査され得る。
【００５０】
さらに、本発明は、本発明に係るプロモーター領域によって調節されている核酸配列を含み、前記核酸配列を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物に関する。
好ましくは、本発明に係る植物は、単子葉類、特にライムギ、トウモロコシ、およびオートムギなどの穀類植物、特に好ましくはコムギまたはオオムギ、ならびにプロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような前記植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに前記植物のトランスジェニックな子孫である。しかし、本発明に係るプロモーター領域は、導入遺伝子を表皮特異的に発現する対応する植物を製造するために、例えば、飼料用のイネ科植物のような他のイネ科植物（ドジョウツナギ）でも使用され得る。
【００５１】
エピクチクラワックスを産生するための遺伝子も、植物の耐乾燥性を高めるために、本発明に係る表皮特異的プロモーターの制御下で発現され得る。さらに、紫外線耐性を高めるためにアントシアニンまたは他の紫外線吸収物質を産生するための遺伝子も、本発明に係るプロモーターの制御下で発現され得る。上記に既に論じたように、病原体抵抗性遺伝子は、好ましくは本発明に係るプロモーターの制御下で発現される。
【００５２】
植物に感染し、それによって植物の代謝に悪影響を及ぼす細菌、ウイルス、および真菌は特に植物病原体と呼ばれる。
これらの植物病原体の一つは、特に、コムギおよびオオムギのような穀類植物でウドンコ病および褐変症を引き起こす真菌である。感染の程度によって、これらの病害は相当な収穫量低下（最大５０％）を引き起こす可能性がある。
【００５３】
従来、前述の病害および別の植物真菌病は、地下水中への浸透および食物連鎖での蓄積のような不利益を有することが知られている殺真菌薬によって制御されている。
しかし、ここ数年間に、ある特定の病原因子またはいくつかの病原因子に対する抵抗性を媒介することができるいくつかの遺伝子が同定された。本願において「病原体抵抗性の媒介」という用語は、前記遺伝子の発現が増大された植物が、前記遺伝子の発現が通常どおりである植物と比べて、特定の病原体による感染の影響を受けにくいことを意味する。病原体抵抗性を媒介する遺伝子のうちには、発現が病原体の感染によって活性化されるような遺伝子もある。
【００５４】
これらの遺伝子のうちには、ペルオキシダーゼおよびシュウ酸エステル酸化酵素がある。ジャーミン様タンパク質（ｇｅｒｍｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のファミリーに属するシュウ酸エステル酸化酵素は、シュウ酸の酸化を触媒し、それによって過酸化水素が形成される。過酸化水素は殺菌性の役割を果たすとともに細胞壁の木質化を促進することができ、それによって病害虫の侵入が防がれる。さらに、これは、低濃度で高感受性の細胞死を引き起こすことができる。ペルオキシダーゼは、細胞基質を酸化し、それによって解毒するために、酸素分子または過酸化水素分子を使用する。
【００５５】
植物の表皮中でシュウ酸エステル酸化酵素およびペルオキシダーゼが発現することにより、それに対する抵抗性を媒介することができる病原体としては、例えば、ウドンコ病菌、フザリウム属、リンコスポリウム・セカリス（ｒｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、ピレノホラ・テレス（ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）が挙げられる。病原体に対する抵抗性を媒介することができる他の遺伝子は、キチナーゼ、Ａｇ−ＡＦＰ、ＧＳＴＡ１、およびＷＩＲ１ａである。
【００５６】
本発明に係るプロモーター領域の助けを借りて、トランスジェニック植物の表皮中で前記酵素をコードしている核酸配列を発現させることによって、病原体抵抗性を高めた植物を得ることができる。
【００５７】
病原体抵抗性を媒介する遺伝子とは対照的に、病原体の侵入を促進する植物固有の遺伝子もある。これらの一つは、７回膜貫通型受容体をコードするＭｌｏ遺伝子であり、これは、表皮中へのウドンコ病菌の侵入を促進するようである。この場合、植物中への真菌の侵入を防止するために、Ｍｌｏ遺伝子の発現を阻害することが適切である。これは、例えば、上述のＲＮＡｉ法を用いて実施され得る。植物中への真菌の侵入を防止するのにＭｌｏ遺伝子の発現を阻害することが適切であるということは、Ｍｌｏ−ｄｓＲＮＡで被覆されたタングステン粒子が撃ち込まれたオオムギの葉片中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで示された（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他（２０００年）、Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｃｅｒｅａｌｓ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、第２４巻（第６号）、８９５〜９０３ページ）。しかし、トランスジェニック植物でＭｌｏ発現を表皮特異的に阻害することが同じ効果を有するということは、これまで示されていない。
【００５８】
病原体と植物との相互作用を媒介し、それによって植物中への病原体の侵入を促進することができる別の植物遺伝子は、例えば、アミノ酸もしくは糖輸送体または転化酵素である。前記遺伝子は、遺伝子サイレンシングの標的としても適切である。したがって、本発明は、
ａ）本発明に係るプロモーターが、病原体抵抗性を媒介する核酸配列と有効に結合してその中に存在している組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、病原体抵抗性を有する植物の製造方法に関する。
【００５９】
好ましくは、病原体抵抗性を媒介する核酸配列は、ペルオキシダーゼもしくはシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子のコード領域、または内在性Ｍｌｏ−ＲＮＡを阻害する配列である。
【００６０】
以下の実施例は本発明を例示するのに役立つが、限定するものとして理解されるべきではない。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例では、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（２００１年）の書籍に従って（上記を参照されたい）、当技術分野で公知である大腸菌による形質転換、制限消化、ライゲーション、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲなどの分子生物学の標準的な方法を実施した。すべてのＰＣＲ反応において、プルーフリーディングポリメラーゼのＰｗｏ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用した。
【００６２】
１）ＧＳＴＡ１プロモーターおよびＷＩＲ１ａイントロンからのプロモーター構築物の製造（ｐＰＳ１８）
以下の前駆構築物、すなわちｐＰＳ１、ｐＰＳ３、ｐＰＳ１５を経て、いくつかの工程で製造した。一過性のアッセイで直接試験され得るように、すべての構築物はＧＵＳレポーター遺伝子を含んでいた。
【００６３】
ｐＰＳ１：
ＰｓｔＩを用いて、ＷＩＲ１ａ遺伝子の１．９ｋｂのプロモーター断片を組換型ｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）クローンから切り出し、ＧＵＳ遺伝子の前方にある発現カセットのＰｓｔＩ制限部位中にクローニングした。この発現カセットはｐブルースクリプトをベースとし、その後にコムギＧＳＴＡ１遺伝子の転写ターミネーターが続くＧＵＳ遺伝子を含んでいた。ＧＵＳ遺伝子およびＧＳＴＡ１転写ターミネーターは、使用される最終構築物にはもはや含まれないことから（実施例２を参照のこと）、この発現カセットの詳細な説明を省略する。得られる構築物は、翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳを含有していた。
【００６４】
ｐＰＳ３：
アダプタープライマー５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＴＣ ＣＡＣおよび５’ＴＡＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＧＡＡを用いて約２４０ｂｐのＰＣＲ断片を製造し、その端を（アダプターを介して）ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで切断した。ゲノム性のＷＩＲ１ａクローンは、ＰＣＲの鋳型としての機能を果たした。ＰＣＲ断片は、ＷＩＲ１ａの最初のエキソンの最後の１５アミノ酸と、スプライス受容部位を含むイントロンとを含有していた。このＰＣＲ断片をｐＰＳ１に連結し、ＰｓｔＩ（部分的に）およびＳｍａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。得られた構築物は、ＧＵＳ遺伝子の前方にＷＩＲ１イントロンを含む翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳを含有していた。さらに、（シグナルペプチドを除去することによって）翻訳融合物ＷＩＲ１ａ：：ＧＵＳの分泌を防ぐために、ＷＩＲ１ａの最初のエキソンの１８番〜３５番のアミノ酸の欠失を導入した。
【００６５】
ｐＰＳ１５：
ＷＩＲ１ａプロモーターをＧＳＴＡ１プロモーターのＰＣＲ断片で置き換えた。このために、ＸｈｏＩおよびＳｎａＢＩでｐＰＳ３を（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクターのバンドを精製した。ゲノムＧＳＴＡ１クローン由来のアダプタープライマー５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣおよび５’ＡＴＡ ＴＡＴ ＴＡＣ ＧＴＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＣＣＧ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＣＡを用いるＰＣＲによって、長さが約２．３ｋｂのＧＳＴＡ１プロモーター断片を増幅させ、ＸｈｏＩおよびＳｎａＢＩで端を切断した。このＰＣＲ断片をゲル溶出させたｐＰＳ３バンドに連結して、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のＧＵＳとの翻訳融合物を得た。
【００６６】
ｐＰＳ１８：
ＰｓｔＩおよびＳｎａＢＩでｐＰＳ１５を（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクターのバンドを精製し、２本鎖オリゴヌクレオチド（５’ＧＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＣＧ ＣＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＣＡおよび５’ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＴ）と連結した。これにより、翻訳開始部位の周辺（翻訳開始部位の４６ｂｐ上流〜５３ｂｐ下流）に位置するＷＩＲ１ａ遺伝子の部分を、翻訳開始コドンＡＴＧを含まないＷＩＲ１ａ遺伝子の４２ｂｐの５’ＵＴＲで置き換えた。得られた構築物は、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のＧＵＳとの転写融合物を含んでいた。
【００６７】
２）使用する構築物の製造
ａ）発現ベクターｐＰＳ２４（本発明に係るプロモーターの制御下にあるシュウ酸エステル酸化酵素の発現）
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を含むコムギｇｆ−２．８遺伝子の長さ７４５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ断片（シュウ酸エステル酸化酵素；アクセッション番号Ｍ６３２２３）を植物発現カセットｐＧＹ１中にサブクローニングして、ｐジャーミン構築物を得た（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９９年に記述されている）。このクローニングのために、ｐＧＹ１中の制限部位ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いて断片を連結することができるように、シュウ酸エステル酸化酵素断片を中間ベクター中に連結した。
【００６８】
ｐジャーミンから、シュウ酸エステル酸化酵素遺伝子およびＣａｍＶ ３５Ｓターミネーターを含むとともに長さが約１ｋｂのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲル電気泳動を用いて精製したベクターｐＰＳ１８中に連結した。得られた構築物は、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧＳＴＡ１プロモーター制御下のシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子との転写融合物を含んでいた。ｐＰＳ１８と比べると、この構築物は、ＧＳＴＡ１転写ターミネーターはもはや含まないが、ＣａｍＶ ３５Ｓ遺伝子の転写ターミネーターを含んでいた。
【００６９】
ｂ）発現ベクターｐＰＳ４１（本発明に係るプロモーターの制御下にあるＴＡＰＥＲＯの発現）
ｐＷＩＲ３（ＣａｍＶ ３５ＳプロモーターとＴＡＰＥＲＯの転写融合物とを含む；シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９９年）から、長さ約１．２ｋｂのＴＡＰＥＲＯ断片を、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩを用い、制限消化によって単離した。
【００７０】
ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで（部分的に）消化し、アガロースゲル電気泳動を用いて精製したベクターｐＰＳ２４中にＴＡＰＥＲＯ断片を連結した。これにより、シュウ酸エステル酸化酵素遺伝子がＴＡＰＥＲＯ遺伝子に置き換えられた、イントロン含有ＷＩＲ１ａ遺伝子断片とＧｓｔＡ１プロモーター制御下のＴＡＰＥＲＯ遺伝子（アクセッション番号Ｘ５６０１１）との転写融合物が得られた。ｐＰＳ２４と同様に、ｐＰＳ４１はＣａｍＶ ３５Ｓ遺伝子の転写ターミネーターを含んでいた。
【００７１】
ｃ）発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉ（本発明に係るプロモーターの制御下にあるＭｌｏ−ＲＮＡｉ構築物の発現）
まず初めに、ベクターｐＧＥＭ ＴｅａｓｙにサブクローニングされているオオムギからのＭｌａ１耐性遺伝子の３番目のイントロン（約１．１ｋｂ）を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて単離し、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断されたベクターｐＢＳｗ４１（キャンダス・エリオット（Ｃａｎｄａｃｅ Ｅｌｌｉｏｔｔ）が論文の範囲内でクローニングされた一部分のＴａＭｌｏ１ ｃＤＮＡを含むｐブルースクリプト誘導体；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＡＦ３６１９３３）中に連結した。
【００７２】
この構築物から、Ｍｌａ１イントロンを、ＴａＭｌｏ１遺伝子のコード配列の一部分とともに約１．５５ｋｂのＰｓｔＩ／ＭｓｃＩ断片（断片１）として単離した。これと並行して、ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドＴ３（ｐブルースクリプト用の標準の配列決定用プライマー）およびＴａＭｌｏ１−１（５’ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＧＡ ＡＡＴ ＧＴＧ Ｃ ３’、下線部はＳｐｈＩ制限部位）を用いて、プラスミドｐＢＳｗ４１から約４５０ｂｐの断片を増幅させた。続いて、制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩを用いてＰＣＲ断片を消化した（断片２）。ベクターｐＰＳ２４（プロモーター＋シュウ酸エステル酸化酵素、上記参照）をＳｍａＩおよびＳｐｈＩによる制限消化によって開き、切り取られたシュウ酸エステル酸化酵素遺伝子断片を廃棄した。その後すぐに、３つの構成要素のライゲーション（ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）で、上述の断片１および２を、ＳｍａＩ／ＳｐｈＩで切断したｐＰＳ２４ベクター中に連結した。このライゲーションでは、ＭｓｃＩおよびＳｍａＩで切断された構成要素の両末端は、双方ともいわゆる平滑末端であるため適合しやすい。得られた構築物（ｐＴａＭｌｏ１ ＲＮＡｉ）は、約３００ｂｐのＴａＭｌｏ１遺伝子、ならびにＭｌａ１イントロンによって分離された「逆方向反復」としての約１５０ｂｐのポリリンカー／アダプター配列を含む。この転写単位の制御は、ＧＳＴＡ１プロモーターの支配下にある。
【００７３】
注記：歴史的な理由から本願ではＴａＭｌｏ１と称するこの遺伝子は、後に、ＴａＭｌｏ Ａ１と名付けられた（エリオット（Ｅｌｌｉｏｔｔ）他、２００２年）。Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．第１５巻：１０６９〜１０７７ページ（２００２年）。
【００７４】
３）コムギ植物の形質転換
植物室で、短日条件（１０時間／日、約６００マイクロモル（６００マイクロアインシュタイン））のもと、昼間１５℃、夜間１２℃で４０日間、続いて、温室中で、１８／１６℃および少なくとも１６時間の光周期の条件で、コムギ植物（ボブホワイト栽培品種）を栽培した。穂をすぐに使用し、または４℃で最大５日間貯蔵した。穂から取った穀果を、７０％エタノールで２分間、次いで５％次亜塩素酸ナトリウム溶液／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１５〜２０分間表面滅菌し、最後に無菌の２回蒸留水で４回洗浄した。
【００７５】
０．５〜１５ｍｍの大きさの未熟胚を無菌状態で穀果から取り出して準備し、胚盤が上の方を向くように、ペトリ皿のカルス誘導培地（２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、４０ｇのマルトース一水和物、５００ｍｇ／ｌのＬ−グルタミン、１００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、５μＭのＣｕＳＯ４、および０．２５％フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）を含むムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ）による基本培地（１９６２年））上に並べた。２５℃、暗所で培養物をインキュベートした。
【００７６】
胚の単離５〜７日後に、遺伝子銃による形質転換を実施した。粒子発射の４〜６時間前に、既に増殖している胚を水ポテンシャルの低い新しい培地（上記のように、０．３Ｍマンニトールを添加）へ移し、２５℃、暗所でインキュベートした。
【００７７】
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子を含むプラスミドｐＡＨＣ２０（クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）およびクァイル（Ｑｕａｉｌ）１９９６年）を、モル比１：１で同時形質転換しようとするベクターと混合した。次に、全体で１０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、６０ｍｇ／ｌの金懸濁液２５μｌの粒子に沈着させた。１回の発射につき、５μｌエタノール中の３０μｇの粒子をマイクロキャリア表面に塗布した。ＤｕＰｏｎｔ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅの製造業者の仕様書に従って発射を行った。
【００７８】
粒子発射の１２〜１６時間後に、（胚の前培養の場合は）新しいカルス誘導培地に外植片を移し、２５℃、暗所で１０日間インキュベートした。
次に、そのカルスを分化培地（２０ｇ／ｌのスクロース、５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５％フィタゲル、および３ｍｇ／ｌのビアラホスを含むムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）（１９６２年）による基本培地）に移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でインキュベートした。
【００７９】
２週間後に、褐色化していないカルスを再生培地（２０ｇ／ｌのスクロース、０．２５％フィタゲル、および４ｍｇ／ｌのビアラホスを含むムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）（１９６２年）による基本培地）へ移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でさらにインキュベートした。
【００８０】
さらに２週間後、成長した芽を間引きし、再生培地を入れた培養管に移し、２００マイクロモル（マイクロアインシュタイン）、１６時間の光周期条件下、２５℃でさらに培養した。
【００８１】
スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）他（１９９０年）による葉抽出物のＰＡＴ活性試験によって、または、候補植物のゲノムＤＮＡから導入遺伝子に特異的な配列を増幅すること、および／もしくは対応するプローブを用いたサザンブロットによって、形質転換された再生体の同定を行った。
【００８２】
基本となる物質の品質によって、この方法の形質転換効率は、培養胚１００個当たりトランスジェニック植物が０．５〜３つであった。
４）ｐＰＳ２４構築物を有する植物におけるｉｎ ｓｉｔｕでのシュウ酸エステル酸化酵素活性
ボブホワイト野生型植物またはＴ３世代のｐＰＳ２４トランスジェニックコムギ植物の葉片に真空内でシュウ酸エステル酸化酵素検出溶液（２．５ｍＭのシュウ酸、３．５ｍＭの遊離のＥＤＴＡ、０．６ｍｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトール、５０μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ、２０％（ｖ／ｖ）のエタノール、Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ４．０に調整）を染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートした。検出溶液を除去した後、４℃水中でさらに２４時間、これらの葉をインキュベートした。続いて、葉を手で横に裂いて薄い切片にし、顕微鏡で観察した。ツァイス・アキシオフォット（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ）を１００倍の拡大率で用いて、位相差光学顕微鏡での観察を行った。シュウ酸エステル酸化酵素が発現している細胞の細胞壁は紫色に染色される。
【００８３】
５）ノーザンブロット分析による、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物中のＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出
ともに止め葉（ｆｌａｇ ｌｅａｆ）段階のボブホワイト植物およびＴ２世代のｐＰＳ４１トランスジェニック植物の葉（それぞれ、新鮮重（ＦＷ）約１ｇ）を、細粉が形成されるまで液体窒素中でホモジナイズした。この粉末を３ｍｌのＲＮＡ抽出バッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０；０．２５ＭのＮａ−ＥＤＴＡ；５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）および１．５ｍｌのバッファー飽和フェノール（１５ｍｌのプラスチック製試験管）に加え、よく振とうした。４０００ｒｐｍ〜５０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間、抽出物を遠心分離した（スイング型、ヘラウス・バリフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｖａｒｉｆｕｇｅ））。１．５ｍｌのクロロホルムを（上清を捨てずに）加え、試験管を数回逆さにした。４０００ｒｐｍ〜５０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間、抽出物を再度遠心分離し、上清を注意深く新しい試験管（１５ｍｌのプラスチック製試験管）に注いだ。６ＭのＬｉＣｌ ３ｍｌを加えて、ＲＮＡを沈降させた（一晩、４℃）。１２５００ｒｐｍ、４℃で３０分間、沈降したＲＮＡを遠心分離し（固定ローター、ハームル（Ｈｅｒｍｌｅ）Ｚ３６０Ｋ）、ＲＮＡ沈殿物を５００〜１０００μｌの７０％エタノール中に溶かし（ＲＮＡは溶解しない）、エッペンドルフ試験管に移した。このサンプルを１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し（固定ローター、エッペンドルフ遠心分離機５４１７Ｒ）、上清を除去した。このＲＮＡ沈殿物を３７℃で５分間乾燥させ、１００μｌ〜２００μｌのＴＥ中に溶かし、７５℃で５〜１０分間溶解させた。標準プロトコール（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、上記を参照されたい）に従って、ホルムアルデヒド含有ゲルにおけるＲＮＡの変性アガロースゲル電気泳動およびナイロン膜（ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））への移行を実施した。１サンプル当たり１０μｇのＲＮＡを使用した。
【００８４】
キット（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を用いるランダムプライム標識法に従って、３２Ｐ−ｄＣＴＰによる放射性プローブ標識を実施した。６５℃で一晩、ＣＨＵＲＣＨバッファー（０．５Ｍリン酸Ｎａ ｐＨ７．２；１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ；７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；１ｍＭ Ｎａ２ＥＴＤＡ）中でハイブリダイゼーションを実施した。６５℃、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣ；０．１５ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中で１５分間、ブロットを２回洗浄し、続いて、ホスフォイメージャースクリーンに１６〜４８時間曝露した。曝露されたスクリーンをホスフォイメージャー装置（富士フイルム（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）ＦＬＡ３０００）を用いてスキャンし、ＴＩＦＦ形式の画像ファイルとして出力した。
【００８５】
６）ウェスタンブロット分析による、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物中のＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出
共に止め葉段階のボブホワイト植物およびＴ２世代のｐＰＳ４１トランスジェニック植物の葉の先端を、ＩＷＦバッファー（３２ｍＭリン酸Ｎａ；８４ｍＭクエン酸；ｐＨ２．８；スパチュラ先端量のポリビニルピロリドン）中でホモジナイズした。１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、このホモジネートを遠心分離した。上清を０．５ｇ／ｍｌの酢酸アンモニウムと混合し、４℃で一晩、酸可溶性タンパク質を沈降させた。
【００８６】
１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間、このタンパク質を遠心分離した。タンパク質沈殿物を５０μｌ／ｇのＦＧ再懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５；２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に溶かした。４倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファー５μｌを２０μｌのサンプルに加え、このサンプルを、ブロモフェノールブルーの色が青色に変わるまで（１〜５μｌの）Ｔｒｉｓ飽和溶液と混合した。各レーンについて、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のミニゲル装置を用いる標準の方法に従って、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％分離ゲル）において、１２．５μｌの煮沸したサンプルを分離した。
【００８７】
電気泳動に続いて、ゲルを（ローディングコントロールとして）クーマシー染色し、または標準の方法に従ってニトロセルロース膜に移した（ブロットした）。標準の方法に従って、この膜を、オオムギ由来のＰｒｘ８タンパク質（ＴＡＰＥＲＯに相同なタンパク質）に対して標的化した第１のポリクローナル抗体とともに（希釈率１：２０００）、続いて、ウサギ抗体に対して標的化し、アルカリホスファターゼを結合した第２の抗体（希釈率１：２０００）とともにインキュベートした。局在的なアルカリホスファターゼ活性を利用して（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色溶液；調製済みの錠剤（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）））、ＴＡＰＥＲＯタンパク質のバンドを検出した。
【００８８】
７）ノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析による、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出
実施例５で説明したようにして、ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析を実施した。製造業者の仕様書に従い、「Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）」装置（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、［ドイツ国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在］を用いて、リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。
【００８９】
８）ｐＰＳ４１またはｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニック植物におけるウドンコ病抵抗性
抵抗性試験のために、温室で栽培されて新しく出てきた止め葉が十分に発達している成熟したｐＰＳ４１またはｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ植物を使用した。同時に栽培した野生型植物のボブホワイト栽培品種が、コントロールとしての役目を果たした。止め葉の先端半分を切断し、大きさ２０ｘ２０ｃｍのポリカーボネート皿中の、２０ピーピーエム（百万分率）のベンズイミダゾールと混合した０．５％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）上に広げた。１皿当たり、１つのトランスジェニック亜系統（各２０枚の葉）ならびにボブホワイト野生型（各６枚の葉）を広げた。４枚の十分に接種されたコムギの葉の胞子を接種箱（ｔｏｗｅｒ）に吹き入れることによって、接種培地中で葉片にウドンコ病菌胞子を接種した。５分後に皿を取り出して蓋を閉め、間接昼光のもと、２０℃でインキュベートした。接種の７日後、クラス評価システム（シュバイツァー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）他、１９９５年）を用いてウドンコ病菌の感染を評価した。それぞれのフィトアガープレート上にあるコントロールの葉を参照して、抵抗性を算出した。
【００９０】
文献：
Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5: 213-218.
Elliott et al., (2002). Molecular Plant Microbe Interactions 15: 1069-1077.
Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497.
Schweizer, P.,Vallelian-Bindschedler, L., and Mosinger, E. (1995). Heat-induced resistance in barley to the powdery mildew fungusErysiphe graminis f sp. hordei, Physiological and Molecular Plant Pathology 47, 51-66.
Schweizer, P.,Pokorny, J.,Abderhalden,O., and Dudler, R. (1999). A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat, Mol Plant-Microbe Interact12, 647-654.
Spencer et al. (1990) TAG 79: 625-631.
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＧＳＴＡ１プロモーターの核酸配列（配列番号１）を示す図。
【図２】ＷＩＲ１ａイントロンの核酸配列（配列番号２）を示す図。
【図３】好ましいプロモーター領域の核酸配列（配列番号３）を示す図。
【図４】ＴＡＰＥＲＯ（ペルオキシダーゼ）ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号４）を示す図。
【図５】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、核酸配列（配列番号５）を示す図。
【図６】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、核酸配列（配列番号５）を示す図（図５の続き）。
【図７】ＴＡＰＥＲＯ発現ベクターｐＰＳ４１を示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図８】ジャーミン９ｆ−２．８（シュウ酸エステル酸化酵素）ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号６）を示す図。
【図９】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、核酸配列（配列番号７）を示す図。
【図１０】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、核酸配列（配列番号７）を示す図（図９の続き）。
【図１１】ジャーミン発現ベクターｐＰＳ２４を示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図１２】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ構築物の配列（配列番号８）を示す図。
【図１３】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、核酸配列（配列番号９）を示す図。
【図１４】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、核酸配列（配列番号９）を示す図（図１３の続き）。
【図１５】Ｍｌｏ−ＲＮＡｉ発現ベクターｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ ＲＮＡｉを示す図であって、ベクターマップを示す図。
【図１６】ｐＰＳ２４トランスジェニック植物におけるiｎ ｓｉｔｕでのシュウ酸エステル酸化酵素活性を示す図。ボブホワイト（Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）野生型植物（ＢＷ）ならびにトランスジェニック系統１５７番および１７０番の葉を横方向に切り、ｉｎ ｓｉｔｕでシュウ酸エステル酸化酵素活性を検出した。左の列は、シュウ酸基質との反応を示す。右の列はシュウ酸基質が無い場合のコントロール反応を示す。紫の強い着色は、トランスジェニック系統の表皮におけるシュウ酸エステル酸化酵素活性を示唆している。
【図１７】（ａ）は、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物におけるＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出を示す図であって、ノーザンブロットによる検出を示す図。ノーザンブロットにＷＩＲ３サンプルをハイブリダイゼーションすることによる、ｐＰＳ４１構築物を有するＴ２世代のトランスジェニックコムギ系統からのＴＡＰＥＲＯ ＲＮＡ蓄積の検出。各場合において、成植物の段階の４種の選択された系統の２種の亜系統ならびに野生型（ＢＷ）を分析した。葉１は止め葉を示す。葉２〜４は、次第に成長した葉を示す。ＴａＧｅｒ−４プローブは、ストレス誘導性コムギ遺伝子のグループにハイブリダイズし、ＴＡＰＥＲＯ過剰発現の多面発現性の副次的作用を試験するために使用された。著しい副次的作用は認められなかった。ＥｔＢｒは、臭化エチジウムで染色されたゲルのローディングコントロールを示す。（ｂ）は、ｐＰＳ４１トランスジェニック植物におけるＴＡＰＥＲＯ導入遺伝子の検出を示す図であって、ウェスタンブロットによる検出を示す図。ウェスタンブロットに抗体を反応させることによる、ｐＰＳ４１構築物を有するＴ２世代のトランスジェニックコムギ系統のＴＡＰＥＲＯタンパク質蓄積の検出。ＴＡＰＥＲＯトランスジェニック産物の予想されるサイズは３１ｋＤである。ボブホワイトの葉３では、基礎活性の高まったＴＡＰＥＲＯ遺伝子を観察することができた。葉１は止め葉を示す。クーマシー染色は、クーマシーブルーＲ２５０で染色されたゲルのローディングコントロールを示す。
【図１８】（ａ）は、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、ノーザンブロット分析による検出を示す図。特異的なプローブによるｐＰＳ２４またはｐＰＳ４１構築物を有するトランスジェニック植物の葉の表皮におけるシュウ酸エステル酸化酵素（左）およびＴａＰＥＲＯ（右）ｍＲＮＡの蓄積の検出。Ｗは、葉全体から得たＲＮＡを示す。Ｅは、葉の表皮から得たＲＮＡを示す。ＥｔＢｒは、ローディングコントロールとしての臭化エチジウムで染色されたゲルを示す。２６ＳＲＮＡは、ブロットとローディングコントロールとしての２６ＳリボゾームＲＮＡに対するプローブとのその後のハイブリダイゼーションを示す。（ｂ）は、表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、リアルタイム逆ＰＣＲ法による検出による検出を示す図。（構築物ｐＰＳ４１で形質転換された）トランスジェニック系統２０１３番の葉全体および表皮中のＴａＰＥＲＯｍＲＮＡの濃度を測定した。構成的に発現されるコントロール遺伝子ＵＢＣ（ユビキチン結合酵素）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）を用いてデータを標準化した。葉全体で残っている発現は、除去されていない上部の葉の表皮および師部からのものである（プロモーターの副活性）。
【図１９】表皮特異的なトランスジェニック発現の検出を示す図であって、リアルタイム逆ＰＣＲ法による検出による検出を示す図。成植物の段階の野生型植物（ボブホワイト）および（ｐＰＳ４１構築物で形質転換された）トランスジェニック系統２０１３番および２１５１番を分析した。プロモーターは、特に葉および穂で強く発現される。茎および根では、導入遺伝子は全く発現されず、または弱くしか発現されない。
【図２０】ｐＰＳ４１トランスジェニック植物のウドンコ病菌に対する抵抗性の調査を示す図。成植物の止め葉を切り取り、ボブホワイト野生型植物とともに、切断葉のアッセイでコムギのウドンコ病菌を接種した。接種の７日後に、ウドンコ病菌の感染を評価した。Ｔ２世代およびＴ３世代の植物を用いた３回の独立した接種実験の平均値を示している。亜系統２０８８／２は、ＴＡＰＥＲＯを全く発現せず、抵抗性は高まっていない。「非サイレンシング」の平均値は、２０８８／２以外のすべての系統およびすべての実験の平均値を示す。
【図２１】ｐＰＳ４１トランスジェニック植物の芽の成長を示す図。Ｔ２世代の植物をボブホワイト野生型植物とともに植え、成植物段階で写真を撮影した。
【図２２】ｐＷＩＲ５−ＴａＭｌｏ−ＲＮＡｉトランスジェニック植物のウドンコ病菌に対する抵抗性の調査を示す図。Ｔ２世代の成植物の止め葉を切り取り、ボブホワイト野生型植物とともに、切断葉のアッセイでコムギのウドンコ病菌を接種した。接種の７日後に、ウドンコ病菌の感染を評価した。各事例において、１系統につき２種の亜系統を試験した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＳＴＡ１遺伝子のプロモーター由来の第１の配列、およびＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン由来の第２の配列を含み、植物の表皮に対する特異性を有するプロモーター領域。
【請求項２】
前記第１の配列が配列番号１であり、前記第２の配列が配列番号２であることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター領域。
【請求項３】
ａ）配列番号３で与えられる核酸配列を含むプロモーター領域、
ｂ）配列番号３で与えられる該核酸配列の機能部分を含むプロモーター領域、および
ｃ）ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる該核酸配列とハイブリダイズする配列を有するプロモーター領域からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のプロモーター領域。
【請求項４】
コード配列と有効に連結している請求項１から３のいずれかに記載のプロモーター領域を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項５】
発現により、前記表皮中での前記コード配列にコードされたタンパク質の収量が増加することを特徴とする請求項４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
前記コード領域が耐性遺伝子由来であることを特徴とする請求項４または５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
前記コード配列が、ペルオキシダーゼまたはシュウ酸エステル酸化酵素をコードすることを特徴とする請求項５または６に記載のキメラ遺伝子または組換え核酸分子。
【請求項８】
発現が、前記表皮中の対応する内在性遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項９】
前記コード配列がアンチセンスの向きであることを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１０】
前記内在性遺伝子の発現の抑制がＲＮＡ干渉に起因することを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１１】
発現が抑制される前記遺伝子がＭｌｏ遺伝子であることを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載のキメラ遺伝子。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかに記載のプロモーター領域、または請求項４から１１のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む組換え核酸分子。
【請求項１３】
さらに転写終結配列を含む請求項１２に記載の組換え核酸分子。
【請求項１４】
ａ）請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの該組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、導入遺伝子を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子、あるいは請求項１４に記載の方法に従って製造された組換え核酸分子を含むトランスジェニック植物、ならびに、プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような該植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに該植物のトランスジェニックな子孫。
【請求項１６】
前記植物が単子葉植物である請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
前記植物がイネ科植物である請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
前記植物がコムギまたはオオムギである請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
植物中で導入遺伝子を表皮特異的に発現するための請求項１から３のいずれか一項に記載のプロモーター領域の使用方法。
【請求項２０】
前記導入遺伝子が耐性遺伝子である請求項１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの該組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、トランスジェニック植物の病原体抵抗性を高めるための方法。
【請求項２２】
請求項１２または１３のいずれか一項に気合いの組換え核酸分子、あるいは請求項２１に記載の方法に従って製造された組換え核酸分子を含む、病原体抵抗性が高められているトランスジェニック植物、ならびに、プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような該植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに該植物のトランスジェニックな子孫。
【請求項２３】
前記植物が単子葉植物である請求項２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
前記植物がイネ科植物である請求項２３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記植物がコムギまたはオオムギである請求項２４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
ウドンコ病菌に対して高い抵抗性を示すことを特徴とする請求項２２から２５のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１】
ＧＳＴＡ１遺伝子のプロモーター由来の第１の配列、およびＷＩＲ１ａ遺伝子のイントロン由来の第２の配列を含み、植物の表皮に対する特異性を有するプロモーター領域。
【請求項２】
前記第１の配列が配列番号１であり、前記第２の配列が配列番号２であることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター領域。
【請求項３】
ａ）配列番号３で与えられる核酸配列を含むプロモーター領域、
ｂ）配列番号３で与えられる該核酸配列の機能部分を含むプロモーター領域、および
ｃ）ストリンジェントな条件のもとで、配列番号３で与えられる該核酸配列とハイブリダイズする配列を有するプロモーター領域からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のプロモーター領域。
【請求項４】
コード配列と有効に連結している請求項１から３のいずれかに記載のプロモーター領域を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項５】
発現により、前記表皮中での前記コード配列にコードされたタンパク質の収量が増加することを特徴とする請求項４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
前記コード領域が耐性遺伝子由来であることを特徴とする請求項４または５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
前記コード配列が、ペルオキシダーゼまたはシュウ酸エステル酸化酵素をコードすることを特徴とする請求項５または６に記載のキメラ遺伝子または組換え核酸分子。
【請求項８】
発現が、前記表皮中の対応する内在性遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項９】
前記コード配列がアンチセンスの向きであることを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１０】
前記内在性遺伝子の発現の抑制がＲＮＡ干渉に起因することを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１１】
発現が抑制される前記遺伝子がＭｌｏ遺伝子であることを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載のキメラ遺伝子。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかに記載のプロモーター領域、または請求項４から１１のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む組換え核酸分子。
【請求項１３】
さらに転写終結配列を含む請求項１２に記載の組換え核酸分子。
【請求項１４】
ａ）請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの該組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、導入遺伝子を表皮特異的に発現するトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子、あるいは請求項１４に記載の方法に従って製造された組換え核酸分子を含むトランスジェニック植物、ならびに、プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような該植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに該植物のトランスジェニックな子孫。
【請求項１６】
前記植物が単子葉植物である請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
前記植物がイネ科植物である請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
前記植物がコムギまたはオオムギである請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
植物中で導入遺伝子を表皮特異的に発現するための請求項１から３のいずれか一項に記載のプロモーター領域の使用方法。
【請求項２０】
前記導入遺伝子が耐性遺伝子である請求項１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１２または１３に記載の組換え核酸分子を製造する工程と、
ｂ）ａ）からの該組換え核酸分子を植物細胞に移入する工程と、
ｃ）完全に形質転換された植物を再生させ、所望により該植物を増殖させる工程とを備える、トランスジェニック植物の病原体抵抗性を高めるための方法。
【請求項２２】
請求項１２または１３のいずれか一項に気合いの組換え核酸分子、あるいは請求項２１に記載の方法に従って製造された組換え核酸分子を含む、病原体抵抗性が高められているトランスジェニック植物、ならびに、プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、または挿し木のような該植物の形質転換部分およびそれらの形質転換された増殖物質、ならびに該植物のトランスジェニックな子孫。
【請求項２３】
前記植物が単子葉植物である請求項２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
前記植物がイネ科植物である請求項２３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記植物がコムギまたはオオムギである請求項２４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
ウドンコ病菌に対して高い抵抗性を示すことを特徴とする請求項２２から２５のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００７−５０７２１５（Ｐ２００７−５０７２１５Ａ）
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０１１５（Ｐ２００６−５３０１１５）
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５７６６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０３３８４３２８）
【出願人】（５０３２５９７３８）マクス−プランク−ゲゼルシヤフト・ツア・フエルデルング・デア・ビーゼンシヤフテン・イー・ブイ (1)
【出願人】（５０３１４８０９６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５７６６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０３３８４３２８）
【出願人】（５０３２５９７３８）マクス−プランク−ゲゼルシヤフト・ツア・フエルデルング・デア・ビーゼンシヤフテン・イー・ブイ (1)
【出願人】（５０３１４８０９６）
【Ｆターム（参考）】
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