植物レクチンタンパク質の生産方法
【課題】植物レクチンタンパク質を効率的かつ安定的に生産するための手段を提供する。
【解決手段】ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法に関する。
【解決手段】ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物レクチンタンパク質を効率的に大量生産するための技術を提供する。
本発明また、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的に大量生産するための技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは糖鎖と特異的に結合するタンパク質であり、細胞の凝集や糖複合体を沈降させる性質を有する。レクチンは動植物界に広く存在している。レクチンは、近年の糖鎖研究の展開に伴い重要度が増しており、医学や生物学におけるツールとして様々な場面で利用されている。
【０００３】
本発明者らはゴーヤ（「ツルレイシ」とも呼ばれる; Momordica charantia）由来のレクチンを単離し、アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を特定している（特許文献１）。
【０００４】
現在市販されているレクチンの大部分は植物等から抽出し精製されたものである。しかしながら、このような分離法による製造方法では、原料が天然物であるためにロット間の品質の差異や供給量に対する懸念がある。
【０００５】
一方、天然物由来のタンパク質を効率的に生産するための技術として本発明者らはこれまでに、転写因子をコードする遺伝子が、当該転写因子の発現に最も適した染色体上の位置に組み込まれた形質転換体（細胞）をはじめに作出し、得られた形質転換体に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたウイルスベクターを導入すれば、高効率でウイルスベクターを誘導発現し、緑色蛍光タンパク質を高発現する形質転換体（細胞）を高確率で作出できることを見出し、特許出願している（特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、植物レクチンタンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて効率的に生産する技術は未だに確立されていない。従来の微生物を用いた発現系は、植物レクチンタンパク質の機能を保持した状態で発現させることが困難であった。また、植物による従来の発現系では、宿主植物にとって導入する植物レクチンタンパク質が生育に好ましくないものであるため、生産可能な植物レクチンの種類が限定されるという問題があった。
【０００７】
一方、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質は、ウイルスベクターを用いて細胞に生産させることは従来困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−３９００６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２２８号公報
【特許文献３】特許第３７５２２２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、植物レクチンタンパク質を効率的かつ安定的に生産するための手段を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的かつ安定的に生産するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１２】
（２）上記ホルモンが、エストロジェンまたはステロイドホルモンであることを特徴とする（１）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１３】
（３）上記エストロジェンで活性化される性質を有する転写因子としてＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲを用い、上記転写誘導型プロモーターとしてＯＬｅｘＡ−４６を用いることを特徴とする（２）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１４】
（４）上記ウイルスベクターは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１５】
（５）上記ウイルスベクターが、植物ウイルス由来であることを特徴とする（４）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１６】
（６）上記ウイルスベクターが、植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来であることを特徴とする（５）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１７】
（７）上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする（６）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１８】
（８）上記ウイルスベクターが、トマトモザイクウイルスベクターまたはタバコモザイクウイルスベクターであることを特徴とする（７）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１９】
（９）上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、（１）〜（８）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２０】
（１０）上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合していることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２１】
（１１）上記リボザイム配列が、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列、またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする（１０）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２２】
（１２）上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２３】
（１３）上記宿主細胞および形質転換体が、植物体または植物由来培養細胞であることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２４】
（１４）上記植物由来培養細胞がタバコ由来細胞であることを特徴とする（１３）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
（１５）上記タバコ由来細胞がタバコＢＹ２細胞であることを特徴とする（１４）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２５】
（１６）上記宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
上記転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
上記転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される、
ことを特徴とする、（１）〜（１５）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２６】
（１７）上記植物レクチンタンパク質がゴーヤ由来レクチンタンパク質である、（１）〜（１６）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
（１８）（１）〜（１７）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体。
【００２７】
（１９）（１８）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を用いることを特徴とする植物レクチンタンパク質の生産方法。
（２０）（１）〜（１７）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法を行うためのキット。
【００２８】
（２１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２９】
（２２）生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子である、（２１）のタンパク質生産用形質転換体の生産方法
【００３０】
（２３）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片であって、上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、タンパク質発現用ＤＮＡ断片と
が遺伝子ＤＮＡに導入されていることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法により提供される植物レクチンタンパク質生産用形質転換体により、植物レクチンタンパク質を効率的かつ安定的に生産することが可能である。本発明の方法により生産される植物レクチンタンパク質は、植物から分離された植物レクチンタンパク質と実質的に同一の活性を維持している。
【００３２】
本発明により提供されるウイルスベクターを用いて形質転換された細胞は、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的かつ安定的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１（ａ）はｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分の構造を示す。図１（ｂ）はｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分の構造を示す。
【図２−１】図２−１はＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの構造を示す。
【図２−２】図２−２はＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの構造を示す（図２−１のつづき）。
【図３】図３は本発明の発現系由来レクチンの電気泳動の結果を示す。
【図４】図４（a）はｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）の一部分の構造を示す。図４（ｂ）はｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅの一部分の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の実施の形態について具体的に説明する。
（Ａ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法（以下、本形質転換体の生産方法と称する）は、（１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を細胞に導入する第一形質転換工程と、（２）前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、（３）ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなる。以下、工程ごとに説明する。
【００３５】
（Ａ−１）第一形質転換工程
本第一形質転換工程では、ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、該転写因子の発現を担うプロモーター（転写因子発現用プロモーター）とを連結して構築したＤＮＡ断片（転写因子発現用ＤＮＡ断片）を、適当な宿主細胞に導入する工程である。当該工程によって、後述するウイルスベクター発現用プロモーターの転写誘導を行なう転写因子を安定的に高発現する形質転換体（細胞）の生産（作出）を行なう。すなわち宿主細胞の転写因子の発現に最適な染色体上の位置に、該転写因子をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換体（細胞）候補を生産（作出）する工程である。
【００３６】
＜転写因子発現用ＤＮＡ断片＞
次に本第一形質転換工程で使用する転写因子発現用ＤＮＡ断片について説明する。転写因子発現用ＤＮＡ断片は、転写因子発現用プロモーターの下流に転写因子をコードする遺伝子が連結されている。またこの他、ベクター配列、ターミネーター、薬剤耐性マーカー等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。かかる転写因子発現用ＤＮＡ断片の構築方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。
【００３７】
ここで転写因子発現用プロモーターは、転写因子を発現することが可能なものであれば特に限定されるものではなく、また恒常的にプロモーター活性を有するもの（以下、恒常的プロモーターと称する）であってもよいし、さらに転写因子によってプロモーター活性が誘導されるものであってもよい。ただし、転写因子の発現をさらに別の転写因子で制御することは、植物レクチンタンパク質の発現系自体が複雑化すること、コスト面で不利等の理由により、上記転写発現用プロモーターとしては、恒常的プロモーターの方がより好ましいといえる。恒常的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＰＧ１０−９０（Ishige, F., Takaichi, M., Foster, R.,Chua, N. H. and Oeda, K.(1999) A G-box motif(GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants. Plant J. 20, 127-133. 参照）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター等が挙げられる。
【００３８】
一方、使用する転写因子は、ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子であって、後述する第二形質転換工程において導入する植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片中に含まれるプロモーターを転写誘導するものであれば特に限定されない。転写因子を活性化するホルモンとしては、エストロジェン、ステロイドホルモン、エクジソン等が挙げられる。かかる転写因子は、ホルモンが存在しない状態においては不活性型でありプロモーターの転写誘導を行なうことができないが、ホルモンが存在することによって活性型に変化しプロモーターの転写誘導を行なうことができる。この性質を利用すれば植物レクチンタンパク質の生産をより綿密に制御できるため、より安全に植物レクチンタンパク質の生産を行なうことができるといえる。すなわち、植物レクチンタンパク質生産を行なう必要がないとき、あるいは植物レクチンタンパク質生産を行なってはいけないときには、植物レクチンタンパク質生産系にホルモンを添加しなければよい。
【００３９】
かかるホルモンによって活性化される性質を有する転写因子、および該転写因子によって転写誘導されるプロモーターの組み合わせとしては、例えば、ステロイドホルモンで活性化される転写因子であるＧＶＧと該転写因子によって転写誘導されるプロモーターである６ｘＵＡＳｇａｌ４の組み合わせ、エストロジェンで活性化される転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲと該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターであるＯＬｅｘＡ−４６（Zuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 参照）の組み合わせ、エクジソンで活性化される転写因子であるエクジソンレセプターGR Act and DBDとヘルペスウイルストランスアクチベーションドメインHecR LBDのキメラタンパク質と該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターＧＲＥの組み合わせ等が挙げられる。ただし、植物レクチンタンパク質生産用の宿主として植物体および植物細胞を利用する場合においては、活性化に用いるホルモンによる宿主への悪影響が少ないという理由からエストロジェンで活性化される転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲと該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターであるＯＬｅｘＡ−４６の組み合わせが好ましいといえる。
【００４０】
図１（ａ）に転写因子発現用ＤＮＡの一例を示す。図１（ａ）は、形質転換用ベクターであるＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分を示している。同図中左から転写因子発現用の恒常的プロモーターＰＧ１０−９０、その下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ、その３’末端にターミネーター配列ＴＥ９、またその下流に薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子Ｈｙｇｒがある。
【００４１】
＜転写因子発現用ＤＮＡ断片を導入する宿主細胞およびＤＮＡ断片導入方法＞
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片が導入される宿主細胞は特に限定されるものではなく、動物由来細胞であっても植物由来細胞であってもよい。ただし、植物由来細胞は、動物由来細胞に比して、増殖速度が速くコンタミネーションのリスクが少ない点、培地作成費用が非常に安価であるという点において、植物由来細胞がより好ましい。なお、動物由来細胞および植物由来細胞とは、細胞、組織、並びに器官も含む意味である。特に液体培地等で培養可能な細胞（培養細胞）が好ましい。
【００４２】
また由来となる動物としては、特に限定されるものでないが、ヒト、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、チャイニーズハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、メダカやゼブラフィッシュ等の魚類、カイコ、夜蛾（Spodoptera frugiperda）等が挙げられる。一方由来となる植物としては、特に限定されるものではないが、イネ、シロイナズナ、オオムギ、コムギ、タバコ、トマト、キュウリ、ダイズ、ジャガイモ、トウモロコシ、ニチニチソウ、シロイヌナズナ、アルファルファが挙げられる。その他、枯草菌や乳酸菌などの菌類、酵母など単細胞生物が宿主細胞として利用できる。
【００４３】
また動物由来細胞の例としては特に限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、メラノーマ細胞、マウス３Ｔ３細胞が挙げられる。また植物由来細胞の例としては、タバコＢＹ２細胞、ジャガイモ由来、イネ由来、サツマイモ由来、ダイズ由来、パセリ由来、シロイヌナズナ由来、コムギ由来、トウモロコシ由来細胞、ニチニチソウ由来細胞が挙げられる。
【００４４】
後述する実施例において、タバコＢＹ２細胞を宿主として用いている。タバコＢＹ２細胞(Toshiyuki nagata, Yasuyuki Nemoto, and Seiichiro Hasezawa “Tobacco BY-2 Cell Line as the “Hela” Cell in the Cell Biology of Higher Plants” International Review of cytology, vol.132, p.p. 1-30 (1992) 、および http://www.riken.go.jp/r-world/info/release/press/2003/030620/ 参照)は、植物培養細胞株としては、世界中で最も広く用いられているものであり、最も増殖速度が速いこと、遺伝子操作が容易なこと、大量培養を容易に行うことができるという理由から採用した。
【００４５】
また、転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞へ導入する形質転換方法は特に限定されるものではなく、宿主細胞の種類に応じた適切な形質転換方法を用いればよい。例えば、特別なベクター配列を有しないＤＮＡ断片を導入する場合には、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。また植物由来細胞への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができ、本発明でもアグロバクテリウム法を好適に用いることができる。ただしアグロバクテリウム法を用いて形質転換する場合には、本発明にかかるＤＮＡ断片を含むＴｉプラスミドを構築する必要がある。またその他プロトプラスト／スフェロプラスト法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４６】
ただし転写因子発現用ＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。転写因子発現用ＤＮＡ断片がゲノムに組み込まれることにより、細胞分裂後の娘細胞にもベクターの構成に含まれる遺伝子を確実に伝達することが可能となり、転写因子（タンパク質）の生産効率を維持することが可能となるからである。ゲノムは染色体（核ゲノム）に限定されるものではなく、ミトコンドリアゲノムや葉緑体ゲノムも含まれる。
【００４７】
また転写因子発現用ＤＮＡ断片が宿主細胞に導入されたか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、各種マーカーを用いればよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと組み換え植物ウイルス遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。例えば後述する実施例においては、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｈｙｇr）を用いており、ハイグロマイシンを含有する培地中で、形質転換候補株を培養することにより、生育してきた細胞株を形質転換体として選抜することが可能となる。その他のマーカーとしては、ビアラホス耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー等が植物細胞の選抜に有効であり、ピューロマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、ＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等が動物細胞の選抜には有効である。さらに酵母などでは、ウラシル要求性マーカーをはじめとする栄養要求性マーカーを選抜に用いることができる。但しこれら形質転換体の選抜方法は、限定されるものではなく、発現ベクターを導入する宿主等に応じて適宜選択して用いればよい。その他、宿主細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入したタンパク質（転写因子）の遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、目的タンパク質（転写因子）をコードする遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、該遺伝子の導入を確認することができる。
【００４８】
（Ａ−２）選抜工程
本形質転換体の生産方法における第２工程として、当該選抜工程がある。当該選抜工程では、上記第一形質転換工程によって得られた形質転換体（細胞）の中から前記転写因子を安定的に高発現する形質転換体（細胞）の選抜を行なう。すなわち転写因子の発現に最適な宿主細胞の染色体上の位置に、該転写因子をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換体（細胞）を選抜（スクリーニング）する工程である。
【００４９】
当該選抜工程における具体的選抜方法は上記第一形質転換工程で得られた形質転換体（細胞）の中から目的とする転写因子を安定的に高発現する形質転換体を選抜する方法であれば特に限定されるものではない。
【００５０】
例えば、形質転換体（細胞）から発現タンパク質を抽出し、該転写因子特異抗体を用いてその発現量を検出する方法として、ウエスタンブロット法、エライザ法、ドットブロット法等が適用可能である。また、形質転換体（細胞）から発現ＲＮＡを抽出し、該転写因子の遺伝子配列に相補的なプローブを用いて転写因子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法として、例えばノーザンブロット法、ドットブロット法等が適用可能である。さらに、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法等によって該転写因子ｍＲＮＡの発現量を検出することも可能である。
【００５１】
（Ａ−３）第二形質転換工程
当該第二形質転換工程は、上記選抜工程により選抜された転写因子を高発現する形質転換体（細胞）（以下、転写因子高発現形質転換体（細胞）と称する）に、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子高発現形質転換体が発現する転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を導入する工程である。あらかじめ選抜された、転写因子を高発現する形質転換体に、目的とする植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたウイルスベクターのｃＤＮＡを導入することにより、高確率に植物レクチンタンパク質を高生産する形質転換体（細胞）を生産することができる。
【００５２】
＜植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片＞
本植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片は、形質転換体（細胞）に植物レクチンタンパク質を生産させるために使用するＤＮＡ断片であり、少なくともＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子高発現形質転換体（細胞）が発現する転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとからなる。この他、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子挿入用のクローニングサイト（好ましくはマルチクローニングサイト）・ベクター配列・ターミネーター・薬剤耐性マーカー等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。かかる転写因子発現用ＤＮＡ断片の調製方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。
【００５３】
転写誘導型プロモーターは、転写因子高発現形質転換体が生産する転写因子に応じて選択すればよく、その組み合わせの一例については、（Ａ−１）第一形質転換工程の項で述べたとおりである。
【００５４】
細胞に生産させる植物レクチンタンパク質は特に限定されない。例えば、ゴーヤ由来抗Ｈレクチン（配列番号１及び２）、コムギ由来ＷＧＡ、トウゴマ由来ＲＣＡ、ピーナツ由来ＰＮＡ、タチナタマメ由来ＣｏｎＡ、ダイズ由来ＳＢＡ、ハリエニシダ由来ＵＥＡ、ジャガイモ由来ＳＴＬ等の種々の植物レクチンタンパク質が例示できる。
【００５５】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子を用いて植物レクチンタンパク質の転写誘導を行う本発明の方法は、各種植物に由来するレクチンタンパク質を生産するための形質転換体の生産に用いることができる。植物レクチンには細胞毒性を示すものがあり、異種発現系を構築することが困難であるが、この問題は、恒常的発現プロモーターではなく誘導型の発現プロモーターを用いることにより解消される。プロモーターとして植物において良く用いられている恒常的発現プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス由来35Sリボソーム発現プロモーター；PCaMV35S）を用いて植物レクチンの発現を試みたところ、レクチンの蓄積量は極めて低い結果となった。また、作製した細胞を長期間継代培養すると、細胞が暗黒色に変色し、増殖性が著しく低下した。これは、継代培養している間もレクチンを生産し続ける為であると推察される。ホルモンにて発現調整が可能な誘導型プロモーターを使用することにより、細胞を十分に増殖させた後にレクチンを発現させることが可能となり、生産能力が著しく向上する。また、継代培養を行っている間は、発現を抑制させることができるため、植物レクチンが細胞に悪影響を与えることなく、継代培養を行うことが可能である。なかでも、宿主細胞として植物由来培養細胞（特に好ましくは、ＢＹ２細胞等のタバコ由来細胞）を用いる実施形態は、各種植物に由来するレクチンタンパク質を生産するための形質転換体の生産に特に適している。植物レクチンの発現は、異種発現系において一般的に用いられている微生物宿主（大腸菌や酵母）にて構築している例は少ない。これは、植物レクチンを微生物細胞で発現させることがタンパク質フォールディングや翻訳後修飾の違いにより困難であるからと推察される。植物細胞を宿主として用いることにより、この問題は解消される。植物細胞として好適なものは、細胞増殖性が極めて高いタバコBY-2細胞である。植物細胞を宿主として用いることにより、フォールディングや翻訳後修飾などが正常に行われ、種子由来のものと同様の糖鎖特異性を示す植物レクチンが生産可能となる。したがって、本発明の発現系、特に、宿主細胞として植物由来培養細胞（特に好ましくは、ＢＹ２細胞等のタバコ由来細胞）を用いる発現系は、実施例において用いられたゴーヤ由来抗Ｈレクチンタンパク質の発現だけでなく、他の植物に由来するレクチンタンパク質の発現にも適した発現系であるといえる。
【００５６】
ウイルスベクターとしては、ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来のウイルスベクターであれば特に限定されるものではなく、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを用いることができる。中でも細胞内でｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ自体がｍＲＮＡとして機能するという理由から、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来のウイルスベクターであることが特に好ましい。
【００５７】
また、ウイルスベクターは植物ウイルス由来のウイルスベクターに限定されるものではなく、動物ウイルス、ファージを含むあらゆるＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを用いることが可能である。しかしながら、植物細胞に植物レクチンタンパク質を生産させる目的で使用する場合には、植物ウイルス由来のウイルスベクターであることが好ましく、中でも植物のサイレンシングを抑制する因子（サプレッサー）を持つウイルス由来のウイルスベクターであることが特に好ましい。サイレンシングのサプレッサーを持つウイルスベクターを用いることにより、増幅の後半においてもｍＲＮＡが分解される現象が生じない。サイレンシングのサプレッサーを持つ植物ウイルスとしては、例えば、ポティ属（Potyvirus属）ウイルス、ククモウイルス属（Cucumovirus属）ウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）)、ポテックスウイルス属（Potexvirus属）ウイルス（例えばジャガイモＸウイルス(ＰＶＸ)）、トンブスウイルス属（Tombusvirus属）ウイルス(例えばトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、Cymbidiumu ringspot virus （ＣｙｍＲＳＶ）)、カルモウイルス属（Carmovirus属）ウイルス(例えば、Turnip crinkle virus （ＴＣＶ）)、トバモウイルス属（Tobamovirus属）ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ））が挙げられる。
【００５８】
また上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端には、リボザイム配列が結合していることが好ましい。形質転換体の細胞内でｃＤＮＡから転写されるウイルスＲＮＡの３’末端に付加されウイルスの複製能力低下の原因となるターミネーター由来の配列やポリＡ配列を切断することができるからである。その結果ウイルスの複製能力の低下を防止することができ、植物レクチンタンパク質の高生産が可能となる。結合されるリボザイム配列は、上記３’末端に付加された余分な配列を切断できるものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列（GenBank accession No. X77627他）またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列（GenBank accession No. M17439）を用いることができる。
【００５９】
また植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子と置換されていることが特に好ましい。この部位に植物レクチンタンパク質遺伝子を挿入することによりウイルスの外被タンパク質が産生されなくなり、増幅されるウイルス遺伝子は粒子化されず他の植物に感染することがなくなるため、ウイルスの外界への飛散という問題を解消することが可能となる。
【００６０】
更に、ウイルスベクターにおいて、ウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）をコードする遺伝子が削除されており、ＭＰサブゲノムプロモーター領域を構成する塩基の少なくとも一部が、複製酵素である１８０Ｋタンパク質のアミノ酸配列は変えないように置換されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが他の塩基配列に置換されて無効化されており、かつ、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子が植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子に置換されていることが好ましい。本発明者らは、この特徴を有するウイルスベクターをＭＰＤベクターと称する（ＭＰが削除（Delete）されているため）。ＭＰＤベクターから発現されるウイルスＲＮＡは従来の旧型ベクターと同様のウイルス複製能力を持つ。なおＭＰ遺伝子は誘導ウイルスベクターシステムでは不必要な遺伝子である。ＭＰＤベクターは、ＭＰ遺伝子が削除されているためにｃＤＮＡの鎖長は短い。このため、ＭＰＤベクターは宿主細胞において複製され易くかつ植物におけるｃＤＮＡの転写の効率が高いものと考えられる。
【００６１】
図１（ｂ）に植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例を示す。図１（ｂ）は、形質転換用ベクターであるＴｉプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分を示している。同図中左からエストロジェンによって活性化される融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲによって転写誘導されるプロモーターＯＬｅｘＡ−４６、その下流にゴーヤ由来抗Ｈレクチン遺伝子（以下、ＭＣＬ遺伝子と称する）を組み込んだトマトモザイクウイルスベクターＴｏＭＶ−ＭＣＬ ｃＤＮＡ、その３’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスリボザイム配列Ｓ−Ｒｚ、さらに３５Ｓターミネーター配列３５ＳＴ、またその下流に薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子Ｋａｎｒがある。なお、上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の転写因子高発現形質転換体への導入方法は、（Ａ−１）第一形質転換工程の項で述べた方法と同様に行なえばよい。
【００６２】
上記本形質転換体（細胞）の生産方法は種々の植物レクチンタンパク質の発現系に適用可能である。当該生産方法により、人工的に遺伝子に変異を加えて調製される新規糖鎖認識特異性をもつレクチンの効率的な生産が可能となる。
【００６３】
本形質転換体（細胞）の生産方法の特に好ましい実施形態としては
宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
転写因子発現用ＤＮＡ断片、および植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される
ことを特徴とする実施形態が挙げられる。この実施形態によれば、植物レクチンタンパク質を、天然物中と同様の活性を維持しつつ、特に効率的に生産することが可能である。
【００６４】
通常、ウイルスベクターは導入する遺伝子のサイズが増加するにしたがい複製能力が低下することが知られている。しかしながら、植物レクチンは遺伝子ＤＮＡのサイズが比較的大きい（1.5k）にもかかわらず、本発明の方法によれば、予想に反して植物レクチンタンパク質を高発現可能な形質転換体を生産することができた。この理由は明らかではないが、本発明の発現系は、ウイルスベクターを用いるにも関わらず、予想に反して植物レクチンの発現に適していることが確認された。In vitro転写したウイルスベクターをＢＹＩＩプロトプラストに接種した場合にはＭＰを欠失させる効果はほとんど認められないが、形質転換体においてはレクチンをはじめ1ｋｂを越えるタンパク質はＭＰＤベクターでのみ効率よく生産することができた。本ベクターは従来ベクターでは効率よく合成することができなかった遺伝子ＤＮＡの塩基配列が１ｋｂを越えるレクチン以外の２種のタンパク質（アラビドプシスのクチナーゼ、ヒトアクチン）を合成することに成功している。すなわち、本ベクターを用いた形質転換細胞は、植物レクチンタンパク質に限らず、アラビドプシスのクチナーゼ、ヒトアクチン等の、遺伝子ＤＮＡの塩基配列が１ｋｂを越える（好ましくは、２ｋｂ以下である）タンパク質を効率的に生産することが可能である。
【００６５】
また、下記に示す実施例では、通常の２倍の数のセルラインを選抜し、その結果、特に高い発現を示すラインを一つえることに成功した。本結果より、比較的サイズの大きなレクチンに対しても、同様に、多くのラインから選抜することにより、特に優れた形質転換体を選抜できる可能性が高まることが考えられ、このことは、植物レクチン全般に応用可能であると思われる。したがって、第二形質転換工程において得られた形質転換体から、所望の植物レクチン発現能力を有する形質転換体を選抜するためにはセルライン２００以上であることが好ましいといえる。
【００６６】
（Ｂ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体およびその利用
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体（以下、本形質転換体）は、上記本形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体（細胞）である。本形質転換体は、転写因子をコードする遺伝子およびウイルスベクターをコードする遺伝子の両者が、それぞれ発現に最適な染色体上の位置に組み込まれた形質転換体であるため、本形質転換体を用いることによって、植物レクチンタンパク質を高生産することができる。
【００６７】
また本発明にかかる植物レクチンタンパク質の生産方法（以下、本植物レクチンタンパク質の生産方法）は、本形質転換体を用いることを特徴としている。すなわち、本植物レクチンタンパク質の生産方法は、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が導入された本形質転換体から植物レクチンタンパク質を回収することにより行なう。さらに植物レクチンタンパク質をより大量に取得するためには、本形質転換体の数を培養・栽培・育成等によって増加させ、増加させた本形質転換体から植物レクチンタンパク質を回収することにより行なうことが好ましい。本形質転換体の培養・栽培・育成条件等は特に限定されるものではなく、本形質転換体に好適な条件を適宜選択して用いればよい。植物由来培養細胞を培養する際の培地としては特に限定されるものではないが、無機塩類、炭素源、ビタミン類、アミノ酸が加えられている場合がある。さらに、ココナツミルクや酵母エキスを加えて成長を促進させる場合がある。その他、オーキシンとサイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン等の植物ホルモンを添加する場合がある。また培養条件であるが、光、温度、通気の有無等を培養する細胞に応じて最適なものを採用すればよい。例えば、タバコＢＹ２細胞を培養条件の一例としては、３７０ｍｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｍｇ／ｌチアミン塩酸、３％スクロース、０．２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含むＭＳ培地を用い、暗所、２６℃、１３５回転／分で旋回振盪培養後、１／１００量を一週間ごとに継代することが挙げられる。
【００６８】
また、本形質転換体の種類としては特に限定されるものではなく、植物・動物の個体であっても、植物・動物由来培養細胞であってもよい。ただし、迅速に大量に植物レクチンタンパク質を生産するためには、形質転換体は培養可能な細胞（培養細胞）であることが好ましい。さらには、細胞の取り扱いのしやすさ・培地が安価である等の理由から、植物由来培養細胞であることが好ましい。上記植物由来培養細胞としては、例えばタバコ由来ＢＹ２細胞が挙げられる。
【００６９】
（Ｃ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産キット
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産キット（以下、本キットと称する）は、上記本形質転換体の生産方法を行なうためのキットである。本キットを構成するものについては特に限定されるものではないが、転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片、および／またはＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片により構成されていることが好ましい。具体的には本キットが、転写因子発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）、および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺにより構成されている例が挙げられる。
【００７０】
本キットの利用者は、（ａ）転写因子発現用ＤＮＡ断片を適当な宿主細胞に導入する工程、（ｂ）その形質転換体の中から転写因子を高発現する形質転換体を選抜する工程、（ｃ）該形質転換体に植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を導入する工程を経て植物レクチンタンパク質生産用形質転換体が得られることとなる。なお本キットに含まれる転写因子発現用ＤＮＡ断片に植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法は、遺伝子工学的手法により行なえばよい。
【００７１】
さらに本キットは、上記転写因子高発現形質転換体および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片により構成されていることが好ましい。より具体的には後述する実施例において取得した転写因子高発現形質転換体の一例である転写因子高発現タバコＢＹ２細胞、および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺにより構成されている例が挙げられる。
【００７２】
転写因子高発現形質転換体が既に取得されているため、本キットの利用者は上記（ｃ）のみを行なえばよく、より迅速かつ簡便に植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を得ることができる。
【００７３】
この他本キットには、例えば、細胞、培地、制限酵素、修飾酵素類、転写誘導用化学物質（ステロイドホルモン、エストロジェン等）、培養フラスコ、アグロバクテリウム（植物細胞の場合）等が含まれていてもよい。
【００７４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７５】
1. ゴーヤレクチン遺伝子（MCL）発現系の作製方法
（１）転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクター（以下転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターと称する）として、ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）を用いた。ｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）は、恒常的プロモーターＰG10-90の下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲをコードする遺伝子と、ターミネーターＴE9とを連結し、さらに薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇr）を組み込んで構築した。図１（ａ）にｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分の構造を模式図として示した。
【００７６】
なお、ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）、恒常的プロモーターＰG10-90、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ、ターミネーターＴE9、Ｈｙｇrはいずれも公知の方法により調製可能である。ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）は、Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T., Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084に記載されている。恒常的プロモーターＰG10-90はIshige, F., Takaichi, M., Foster, R.,Chua, N. H. and Oeda, K.(1999) A G-box motif(GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants. Plant J. 20, 127-133に記載されている。ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ及びターミネーターＴE9はZuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 に記載されている。
【００７７】
（２）植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の外被タンパク質をコードする遺伝子を、ＭＣＬをコードする遺伝子（配列表の配列番号１、以下、ＭＣＬ遺伝子と称する）で置換したＴｏＭＶ変異体を用いた。配列番号1の塩基配列のうち２３番〜１６６４番の塩基配列をＭＣＬ遺伝子として用いた。
【００７８】
ＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの塩基配列を図２及び配列表の配列番号３に示す。図２において、下線を引いた箇所はＴｏＭＶのｃＤＮＡの塩基配列から変更した箇所である。下線部（ｂ）は移行タンパク質（ＭＰ）遺伝子を削除し、ＭＰサブゲノムプロモーター領域の塩基配列を変更した（ただし複製酵素である１８０Ｋタンパク質のアミノ酸配列は変えないように変更した）箇所である。下線部（ｄ）は外被タンパク質（ＣＰ）の開始コドンをＡＴＣに置換して無効化した箇所である。（ｅ）で示す箇所は外来遺伝子クローニング用に導入されたＰｍｅＩサイトである。下線部（ｆ）はＭＣＬをコードするＭＣＬ遺伝子（配列番号１の第２３番〜１６６４番塩基）を示す。下線部（ｈ）はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）をコードする塩基配列である。枠により強調した箇所（ｊ）、（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）はいずれも構築に関与する制限酵素サイトであって、（ｊ）はＳｐｅＩのサイトであり、（ａ）はＫｐｎＩのサイトであり、（ｃ）はＮｃｏＩのサイトであり、（ｅ）はＰｍｅＩのサイトであり、（ｇ）および（ｉ）はＢｓｔＥＩＩのサイトである。
【００７９】
図２に示すＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡを含有するプラスミドは次の手順で作成した。
（１）ＫｐｎＩ（ａ）からＮｃｏＩ（ｃ）までの領域を人工合成した。
（２）ＮｃｏＩ（ｃ）からＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）までの領域のＰＣＲ断片を、外被タンパク質（ＣＰ）の開始コドン（ＡＴＧ）をＡＴＣに置換した変異を導入して作成した。具体的には、Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T., Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084に記載されているプラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いてＮｃｏＩ（ｃ）からＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）までの領域のＰＣＲ断片を作成した。
フォワードプライマー: 5'-GACCCATGGGAAGTTGTTGATGAGTTCA-3’
リバースプライマー: 5'-TATGGTTACCGTTTAAACAAAAACACAAATTGCGATGGAGAAGTGATTGAGTAAGAGATATTTAATACGAATCA-3’
フォワードプライマー中、細下線部がＮｃｏＩサイト（ｃ）に対応する配列である。
【００８０】
リバースプライマー中、細下線部がクローニングサイトＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）に対応する配列であり、太下線部がＡＴＧからＡＴＣへの変異を導入するための配列である。
【００８１】
プラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）のうち、本発明に関連する部分の構造を図４（ａ）に示す。ｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）に含まれるＴｏＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡは、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の外被タンパク質をコードする遺伝子を、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子で置換したＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡである。
【００８２】
（３）プラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）において、ＫｐｎＩからＢｓｔＥＩＩまでの部分を、上記（１）で得られたＫｐｎＩ（ａ）−ＮｃｏＩ（ｃ）ＤＮＡ断片と、上記（２）で得られたＮｃｏＩ（ｃ）−ＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）ＤＮＡ断片とに入れ替えた（３点ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
【００８３】
（４）上記（３）で得られたプラスミドのＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）部位に、ゴーヤ由来抗Ｈレクチン（ＭＣＬ）のＤＮＡ断片（５’端ＰｍｅＩ、３’端ＢｓｔＥＩＩ）とＨｉｓ−ｔａｇのＤＮＡ断片（５’−ＧＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧ−３’と５’−ＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧ−３’をアニールしたもの）を挿入した（３点ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
【００８４】
５’端にＰｍｅＩサイト、３’端にＢｓｔＥＩＩサイトがそれぞれ導入されたＭＣＬのＤＮＡ断片は、ＭＣＬをコードするＤＮＡ（特許文献１）を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより作製した。
フォワードプライマー: 5'-ATAGTTTAAACATGAGAATGAGAGTGTTAG-3’
リバースプライマー: 5'-TATGGTGACCAATAGAACACCGTCCATT-3’
【００８５】
（５）上記（４）で得られたプラスミドのＳｐｅＩ−ＡｖｒＩＩの領域を切り出し、ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−ＳｐｅのＳｐｅＩ部位に挿入した。ここで用いたプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅは、上記（２）で言及した文献に記載されており、エストロジェンで転写誘導可能なプロモーターＯＬｅｘＡ−４６（Zuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 参照）を有するＴｉプラスミドにおいて、ＯＬｅｘＡ−４６の下流に、ＴｏＭＶの5’末端からＳｐｅＩサイトまでの領域（図２の5’端から（ｊ）までの領域に相当する）が組み込まれたものである。ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅのうち、本発明に関連する部分の構造を図４（ｂ）に示す。
【００８６】
こうして、植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクター（以下、植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターと称する）ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺを構築した。図１（ｂ）にｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分の構造を模式図として示した。
【００８７】
このプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺは、図１（ｂ）に示すように、エストロジェンで転写誘導可能なプロモーターＯＬｅｘＡ−４６を有するＴｉプラスミドにおいて、ＯＬｅｘＡ−４６の下流に、ＴｏＭＶ変異体（図２）のｃＤＮＡが連結され、さらにその３’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列Ｓ−Ｒｚ（GenBank accession No. M17439）、３５Ｓターミネーター（３５ＳＴ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が組み込まれた構造を有する。
【００８８】
（３）第一形質転換工程：転写因子発現用ＤＮＡ断片の宿主細胞への導入
転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）を、タバコＢＹ２細胞にアグロバクテリウム法により導入した。まずｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）をエレクトロポレーション法によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４系統に導入した。これをカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＡＢ ｓｕｃｒｏｓｅ培地で前培養した。次にタバコＢＹ２細胞と混合してシャーレに移し、２６℃、暗所で４２〜４８時間静置してタバコＢＹ２細胞を形質転換した。タバコＢＹ２細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２０ｍｇ／ｌ）を含むタバコＢＹ２細胞用固形培地に広げ、形質転換タバコＢＹ２細胞を増殖させた。
【００８９】
（４）選抜工程：転写因子高発現形質転換体の選抜
形質転換タバコＢＹ２細胞のうち、ノーザンブロット法の結果、転写因子の発現量の高い細胞ライン（ＥＲ４３）を選抜した。ここで「細胞ライン」とは、形質転換細胞を増殖させることにより形成された個々のコロニーのことを意味する。
【００９０】
（５）第二形質転換工程：植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の導入
上記で得られた転写因子高発現タバコＢＹ２細胞ライン（ＥＲ４３）に、ウイルスベクター（ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺ）をアグロバクテリウム法により導入し形質転換細胞（カルス）を１９２ライン得た。
【００９１】
（６）組換えウイルス高発現形質転換カルスの選抜
得られた１９２ラインの形質転換カルスは、エストロジェン（０．０１ｍＭ）を添加したＢＹ２個体培地に移植し、移植２日後にカルスから全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＴｏＭＶの３’非翻訳領域約２００塩基に相補的なＤＩＧＲＮＡプローブを用いてノーザン分析を行った。その結果、ウイルスＲＮＡの蓄積量の多い４ライン（１０−１−３−１１−１３、１０−１−３−１２−９、１０−１−３−５−１７、１０−１−３−１４−２０）を選抜し、選抜したカルスを１５ｍｌの液体培地に移し、細胞が飽和した後、１／１００量になるように継代培養した。継代７日後１／１００量になるようにさらに継代培養し、同様の継代培養により細胞を維持した。
【００９２】
（７）ＭＣＬの誘導発現
上記で得られた４ラインの各形質転換細胞を１／１００量になるよう継代し、継代培養後７日間前培養した細胞を、新しい培地に１／３０量になるように移した。３日間培養した後、エストロジェンを終濃度が０．０１ｍＭとなるように加え、さらに４日間培養した後ＭＣＬを抽出し、ヒト赤血球凝集（ＨＡ）活性を検出した。その結果、１０−１−３−１１−１３株において最も高いＨＡ活性が認められた。
【００９３】
上記において、転写因子高発現タバコＢＹ２細胞ラインＥＲ４３を形質転換して取得したＭＣＬ高発現細胞（１０−１−３−１１−１３株）を用いて、ＭＣＬのエストロジェンによる誘導発現を試みた。１０−１−３−１１−１３株を１／１００量になるよう継代し、前培養を３日間行なった培養液に対して、エストロジェンを終濃度０．０１ｍＭ添加しＭＣＬの誘導発現を行なった。エストロジェン添加後４８時間の１０−１−３−１１−１３株から全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法によりＴｏＭＶに特異的なＲＮＡを検出した。解析には、ＴｏＭＶの３’非翻訳領域約２００塩基に相補的なＲＮＡプローブを用いた。プローブのラベリングは、ロシュ・ディアグノスティック社のＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行なった。検出には、同社のＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒを用い、それぞれキットのマニュアルに従って行なった。また、エストロジェン添加後４８時間の１０−１−３−１１−１３株から全タンパク質を抽出し、ＨＡ活性の検出を行なった。その結果、エストロジェンによるＴｏＭＶの明らかな転写誘導およびＨＡ活性の検出が確認された。１０−１−３−１１−１３株は、増殖と発現誘導を行い、以降のレクチン抽出および評価に用いた。
【００９４】
２．発現系由来レクチンの評価
（１）発現系由来レクチンの抽出
１０−１−３−１１−１３株の培養液から細胞破砕装置またはフレンチプレスを用いてレクチンを抽出し、１０，０００×ｇで３０分間、遠心分離後の上清を粗抽出液とした。
【００９５】
（２）発現系由来粗抽出液のヒト赤血球凝集（ＨＡ）活性
この粗抽出液についてレクチン活性を評価した。レクチン活性は、連続希釈法によるヒトＨＡ活性により測定した。すなわち、マイクロタイタープレートを用いて被検体のＰＢＳによる２倍希釈列を作製し、これに等量の３％ヒト赤血球浮遊液（オーソ社製）を加えて、室温で３０分間反応させ、肉眼で凝集の有無を判定した。その結果、発現系由来粗抽出液のヒトＯ型ＨＡ活性は２５６ ｔｉｔｅｒを示した。これは、恒常的発現プロモーターｐＨ３５ＣＧによる発現系を用いた下記比較例（粗抽出液の力価８）に比べて大幅に改善したものであった。本培養液１ Ｌから得られるレクチン活性量は、乾燥種子２００−３００ ｇから得られる抽出液の活性量に相当するものと推定された。適度に希釈した本粗抽出液のＡ１、Ａ２、ＢおよびＯの各血液型に対して、それぞれ２、８、８、１６の力価を示し、種子由来レクチンの場合と特性が類似していたことから、種子由来レクチン遺伝子が機能を保持したまま発現していることが推定された。
【００９６】
（３）発現系由来レクチンの精製
上記（１）で得られた粗抽出液は、ＰＢＳに対して透析した後、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速にてガラクトースセファロースカラム（３０ｍＬ）に流し、ガラクトースに親和性のある成分を吸着させた。このカラムをＰＢＳにて十分に洗浄後、０．２Ｍガラクトースを含むＰＢＳを流すことにより吸着したガラクトース結合画分を溶出させた。この溶出画分は蒸留水に対して透析し凍結乾燥した。凍結乾燥により得られた粉末をＰＢＳに溶解したものは、ヒトＯ型ＨＡ活性を有していたことから、レクチンであると認められた。約９０ｍＬの培養液からは、約１ｍｇ（ＰＢＳに１ ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した際の力価は２，０４８）の発現系由来レクチンが得られた。
【００９７】
（４）発現系由来レクチンの電気泳動特性
還元条件化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、発現系由来レクチンは、種子由来レクチンの４本のバンドのうちの２本が強く観察された（図３）。
【００９８】
（５）発現系由来レクチンの血球特異性
発現系由来レクチンおよび比較のために用いた種子由来レクチンはＰＢＳにて希釈し、Ｏ型赤血球に対する力価を３２ ｔｉｔｅｒに調整した。発現系由来レクチンのＡ１、Ａ２、ＢおよびＯの各血液型に対するＨＡ活性は、それぞれ４、１６、８、３２の力価を示し、種子由来レクチンの場合と同等であった（表１）。
【００９９】
（６）発現系由来レクチンの糖鎖特異性
発現系由来レクチンの糖鎖特異性は、各種糖類によるＨＡ阻害試験により評価した。（５）で調整した各レクチン溶液の１２．５μｌは、終濃度が１００ｍＭから０．０１ｍＭになるように希釈した糖類溶液の１２．５μｌと混和後、室温で１時間攪拌した。その後、３％ヒトＯ型赤血球浮遊液を添加し、３０分後に凝集の有無を肉眼判定し、血球の凝集を阻害した最低濃度を最低ＨＡ阻害濃度として求めた。なお、用いた糖類は、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ラクトース、ラクト−Ｎ−ビオース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン、ヒトＢ抗原三糖、ヒトＡ抗原三糖、ヒトＨ抗原二糖、ヒトＨ抗原三糖、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラフィノース、Ｄ−フルクトース、スクロース、マルトース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオースである。その結果、両者の糖鎖特異性は極めて類似し（表２）、Ｈ抗原三糖に対して高い特異性を示した。以上のことから、本発現系に導入されたレクチン遺伝子は、その機能を保持したまま発現していることが確認された。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
比較例
恒常発現プロモーターを用いたゴーヤ由来レクチンタンパク質の発現
ＭＣＬのｃＤＮＡを、バイナリーベクターｐＨ３５ＣＧ（インプランタイノベーションズ）を用いて、微粒子発射装置により、タバコＢＹ−２（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｖ． Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ−２）細胞の懸濁液中で発現させた。当該ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに連結されたＭＣＬのｃＤＮＡと、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターとを含む。ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を、ＮＯＳプロモーターに連結する。当該ベクターにより金粒子（直径１．５〜３μｍ、アルドリッチケミカル）を被覆した。減圧空気：−０．１ＭＰａ、標的距離：９．６ｃｍ、ヘリウム圧：５Ｋｇ／ｃｍ２の条件で、１試験区当り１回の発射を実施した。発射を受けた細胞は、５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する固化ＬＳ培地上に載せ、続いて、１４日間、同一の培地上において数回継代培養を行った。選択的条件での継代培養を５０日間行った後、ロータリーシェーカーにより、１００ｍｌのＬＳ培地を加えた５００ｍｌ容三角フラスコ中で２７℃にて１０日間、ハイグロマイシン耐性細胞を培養した。懸濁した細胞を集め、Ｔｉｓｓｕｅ ｒｕｐｔｏｒ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて破砕した。破砕された細胞を、２０，０００×ｇにて１０分間遠心沈降させた。上澄み液の赤血球凝集活性を、上記の手順で測定した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物レクチンタンパク質を効率的に大量生産するための技術を提供する。
本発明また、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的に大量生産するための技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは糖鎖と特異的に結合するタンパク質であり、細胞の凝集や糖複合体を沈降させる性質を有する。レクチンは動植物界に広く存在している。レクチンは、近年の糖鎖研究の展開に伴い重要度が増しており、医学や生物学におけるツールとして様々な場面で利用されている。
【０００３】
本発明者らはゴーヤ（「ツルレイシ」とも呼ばれる; Momordica charantia）由来のレクチンを単離し、アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を特定している（特許文献１）。
【０００４】
現在市販されているレクチンの大部分は植物等から抽出し精製されたものである。しかしながら、このような分離法による製造方法では、原料が天然物であるためにロット間の品質の差異や供給量に対する懸念がある。
【０００５】
一方、天然物由来のタンパク質を効率的に生産するための技術として本発明者らはこれまでに、転写因子をコードする遺伝子が、当該転写因子の発現に最も適した染色体上の位置に組み込まれた形質転換体（細胞）をはじめに作出し、得られた形質転換体に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたウイルスベクターを導入すれば、高効率でウイルスベクターを誘導発現し、緑色蛍光タンパク質を高発現する形質転換体（細胞）を高確率で作出できることを見出し、特許出願している（特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、植物レクチンタンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて効率的に生産する技術は未だに確立されていない。従来の微生物を用いた発現系は、植物レクチンタンパク質の機能を保持した状態で発現させることが困難であった。また、植物による従来の発現系では、宿主植物にとって導入する植物レクチンタンパク質が生育に好ましくないものであるため、生産可能な植物レクチンの種類が限定されるという問題があった。
【０００７】
一方、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質は、ウイルスベクターを用いて細胞に生産させることは従来困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−３９００６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２２８号公報
【特許文献３】特許第３７５２２２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、植物レクチンタンパク質を効率的かつ安定的に生産するための手段を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的かつ安定的に生産するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１２】
（２）上記ホルモンが、エストロジェンまたはステロイドホルモンであることを特徴とする（１）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１３】
（３）上記エストロジェンで活性化される性質を有する転写因子としてＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲを用い、上記転写誘導型プロモーターとしてＯＬｅｘＡ−４６を用いることを特徴とする（２）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１４】
（４）上記ウイルスベクターは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１５】
（５）上記ウイルスベクターが、植物ウイルス由来であることを特徴とする（４）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１６】
（６）上記ウイルスベクターが、植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来であることを特徴とする（５）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１７】
（７）上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする（６）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１８】
（８）上記ウイルスベクターが、トマトモザイクウイルスベクターまたはタバコモザイクウイルスベクターであることを特徴とする（７）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００１９】
（９）上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、（１）〜（８）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２０】
（１０）上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合していることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２１】
（１１）上記リボザイム配列が、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列、またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする（１０）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２２】
（１２）上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２３】
（１３）上記宿主細胞および形質転換体が、植物体または植物由来培養細胞であることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２４】
（１４）上記植物由来培養細胞がタバコ由来細胞であることを特徴とする（１３）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
（１５）上記タバコ由来細胞がタバコＢＹ２細胞であることを特徴とする（１４）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２５】
（１６）上記宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
上記転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
上記転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される、
ことを特徴とする、（１）〜（１５）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２６】
（１７）上記植物レクチンタンパク質がゴーヤ由来レクチンタンパク質である、（１）〜（１６）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
（１８）（１）〜（１７）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体。
【００２７】
（１９）（１８）の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を用いることを特徴とする植物レクチンタンパク質の生産方法。
（２０）（１）〜（１７）のいずれかの植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法を行うためのキット。
【００２８】
（２１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【００２９】
（２２）生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子である、（２１）のタンパク質生産用形質転換体の生産方法
【００３０】
（２３）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片であって、上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、タンパク質発現用ＤＮＡ断片と
が遺伝子ＤＮＡに導入されていることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法により提供される植物レクチンタンパク質生産用形質転換体により、植物レクチンタンパク質を効率的かつ安定的に生産することが可能である。本発明の方法により生産される植物レクチンタンパク質は、植物から分離された植物レクチンタンパク質と実質的に同一の活性を維持している。
【００３２】
本発明により提供されるウイルスベクターを用いて形質転換された細胞は、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子によりコードされるタンパク質を効率的かつ安定的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１（ａ）はｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分の構造を示す。図１（ｂ）はｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分の構造を示す。
【図２−１】図２−１はＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの構造を示す。
【図２−２】図２−２はＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの構造を示す（図２−１のつづき）。
【図３】図３は本発明の発現系由来レクチンの電気泳動の結果を示す。
【図４】図４（a）はｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）の一部分の構造を示す。図４（ｂ）はｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅの一部分の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の実施の形態について具体的に説明する。
（Ａ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法（以下、本形質転換体の生産方法と称する）は、（１）ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を細胞に導入する第一形質転換工程と、（２）前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、（３）ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなる。以下、工程ごとに説明する。
【００３５】
（Ａ−１）第一形質転換工程
本第一形質転換工程では、ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、該転写因子の発現を担うプロモーター（転写因子発現用プロモーター）とを連結して構築したＤＮＡ断片（転写因子発現用ＤＮＡ断片）を、適当な宿主細胞に導入する工程である。当該工程によって、後述するウイルスベクター発現用プロモーターの転写誘導を行なう転写因子を安定的に高発現する形質転換体（細胞）の生産（作出）を行なう。すなわち宿主細胞の転写因子の発現に最適な染色体上の位置に、該転写因子をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換体（細胞）候補を生産（作出）する工程である。
【００３６】
＜転写因子発現用ＤＮＡ断片＞
次に本第一形質転換工程で使用する転写因子発現用ＤＮＡ断片について説明する。転写因子発現用ＤＮＡ断片は、転写因子発現用プロモーターの下流に転写因子をコードする遺伝子が連結されている。またこの他、ベクター配列、ターミネーター、薬剤耐性マーカー等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。かかる転写因子発現用ＤＮＡ断片の構築方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。
【００３７】
ここで転写因子発現用プロモーターは、転写因子を発現することが可能なものであれば特に限定されるものではなく、また恒常的にプロモーター活性を有するもの（以下、恒常的プロモーターと称する）であってもよいし、さらに転写因子によってプロモーター活性が誘導されるものであってもよい。ただし、転写因子の発現をさらに別の転写因子で制御することは、植物レクチンタンパク質の発現系自体が複雑化すること、コスト面で不利等の理由により、上記転写発現用プロモーターとしては、恒常的プロモーターの方がより好ましいといえる。恒常的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＰＧ１０−９０（Ishige, F., Takaichi, M., Foster, R.,Chua, N. H. and Oeda, K.(1999) A G-box motif(GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants. Plant J. 20, 127-133. 参照）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター等が挙げられる。
【００３８】
一方、使用する転写因子は、ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子であって、後述する第二形質転換工程において導入する植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片中に含まれるプロモーターを転写誘導するものであれば特に限定されない。転写因子を活性化するホルモンとしては、エストロジェン、ステロイドホルモン、エクジソン等が挙げられる。かかる転写因子は、ホルモンが存在しない状態においては不活性型でありプロモーターの転写誘導を行なうことができないが、ホルモンが存在することによって活性型に変化しプロモーターの転写誘導を行なうことができる。この性質を利用すれば植物レクチンタンパク質の生産をより綿密に制御できるため、より安全に植物レクチンタンパク質の生産を行なうことができるといえる。すなわち、植物レクチンタンパク質生産を行なう必要がないとき、あるいは植物レクチンタンパク質生産を行なってはいけないときには、植物レクチンタンパク質生産系にホルモンを添加しなければよい。
【００３９】
かかるホルモンによって活性化される性質を有する転写因子、および該転写因子によって転写誘導されるプロモーターの組み合わせとしては、例えば、ステロイドホルモンで活性化される転写因子であるＧＶＧと該転写因子によって転写誘導されるプロモーターである６ｘＵＡＳｇａｌ４の組み合わせ、エストロジェンで活性化される転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲと該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターであるＯＬｅｘＡ−４６（Zuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 参照）の組み合わせ、エクジソンで活性化される転写因子であるエクジソンレセプターGR Act and DBDとヘルペスウイルストランスアクチベーションドメインHecR LBDのキメラタンパク質と該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターＧＲＥの組み合わせ等が挙げられる。ただし、植物レクチンタンパク質生産用の宿主として植物体および植物細胞を利用する場合においては、活性化に用いるホルモンによる宿主への悪影響が少ないという理由からエストロジェンで活性化される転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲと該転写因子によって転写誘導可能なプロモーターであるＯＬｅｘＡ−４６の組み合わせが好ましいといえる。
【００４０】
図１（ａ）に転写因子発現用ＤＮＡの一例を示す。図１（ａ）は、形質転換用ベクターであるＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分を示している。同図中左から転写因子発現用の恒常的プロモーターＰＧ１０−９０、その下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ、その３’末端にターミネーター配列ＴＥ９、またその下流に薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子Ｈｙｇｒがある。
【００４１】
＜転写因子発現用ＤＮＡ断片を導入する宿主細胞およびＤＮＡ断片導入方法＞
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片が導入される宿主細胞は特に限定されるものではなく、動物由来細胞であっても植物由来細胞であってもよい。ただし、植物由来細胞は、動物由来細胞に比して、増殖速度が速くコンタミネーションのリスクが少ない点、培地作成費用が非常に安価であるという点において、植物由来細胞がより好ましい。なお、動物由来細胞および植物由来細胞とは、細胞、組織、並びに器官も含む意味である。特に液体培地等で培養可能な細胞（培養細胞）が好ましい。
【００４２】
また由来となる動物としては、特に限定されるものでないが、ヒト、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、チャイニーズハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、メダカやゼブラフィッシュ等の魚類、カイコ、夜蛾（Spodoptera frugiperda）等が挙げられる。一方由来となる植物としては、特に限定されるものではないが、イネ、シロイナズナ、オオムギ、コムギ、タバコ、トマト、キュウリ、ダイズ、ジャガイモ、トウモロコシ、ニチニチソウ、シロイヌナズナ、アルファルファが挙げられる。その他、枯草菌や乳酸菌などの菌類、酵母など単細胞生物が宿主細胞として利用できる。
【００４３】
また動物由来細胞の例としては特に限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、メラノーマ細胞、マウス３Ｔ３細胞が挙げられる。また植物由来細胞の例としては、タバコＢＹ２細胞、ジャガイモ由来、イネ由来、サツマイモ由来、ダイズ由来、パセリ由来、シロイヌナズナ由来、コムギ由来、トウモロコシ由来細胞、ニチニチソウ由来細胞が挙げられる。
【００４４】
後述する実施例において、タバコＢＹ２細胞を宿主として用いている。タバコＢＹ２細胞(Toshiyuki nagata, Yasuyuki Nemoto, and Seiichiro Hasezawa “Tobacco BY-2 Cell Line as the “Hela” Cell in the Cell Biology of Higher Plants” International Review of cytology, vol.132, p.p. 1-30 (1992) 、および http://www.riken.go.jp/r-world/info/release/press/2003/030620/ 参照)は、植物培養細胞株としては、世界中で最も広く用いられているものであり、最も増殖速度が速いこと、遺伝子操作が容易なこと、大量培養を容易に行うことができるという理由から採用した。
【００４５】
また、転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞へ導入する形質転換方法は特に限定されるものではなく、宿主細胞の種類に応じた適切な形質転換方法を用いればよい。例えば、特別なベクター配列を有しないＤＮＡ断片を導入する場合には、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。また植物由来細胞への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができ、本発明でもアグロバクテリウム法を好適に用いることができる。ただしアグロバクテリウム法を用いて形質転換する場合には、本発明にかかるＤＮＡ断片を含むＴｉプラスミドを構築する必要がある。またその他プロトプラスト／スフェロプラスト法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４６】
ただし転写因子発現用ＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。転写因子発現用ＤＮＡ断片がゲノムに組み込まれることにより、細胞分裂後の娘細胞にもベクターの構成に含まれる遺伝子を確実に伝達することが可能となり、転写因子（タンパク質）の生産効率を維持することが可能となるからである。ゲノムは染色体（核ゲノム）に限定されるものではなく、ミトコンドリアゲノムや葉緑体ゲノムも含まれる。
【００４７】
また転写因子発現用ＤＮＡ断片が宿主細胞に導入されたか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、各種マーカーを用いればよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと組み換え植物ウイルス遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。例えば後述する実施例においては、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｈｙｇr）を用いており、ハイグロマイシンを含有する培地中で、形質転換候補株を培養することにより、生育してきた細胞株を形質転換体として選抜することが可能となる。その他のマーカーとしては、ビアラホス耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー等が植物細胞の選抜に有効であり、ピューロマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、ＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等が動物細胞の選抜には有効である。さらに酵母などでは、ウラシル要求性マーカーをはじめとする栄養要求性マーカーを選抜に用いることができる。但しこれら形質転換体の選抜方法は、限定されるものではなく、発現ベクターを導入する宿主等に応じて適宜選択して用いればよい。その他、宿主細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入したタンパク質（転写因子）の遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、目的タンパク質（転写因子）をコードする遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、該遺伝子の導入を確認することができる。
【００４８】
（Ａ−２）選抜工程
本形質転換体の生産方法における第２工程として、当該選抜工程がある。当該選抜工程では、上記第一形質転換工程によって得られた形質転換体（細胞）の中から前記転写因子を安定的に高発現する形質転換体（細胞）の選抜を行なう。すなわち転写因子の発現に最適な宿主細胞の染色体上の位置に、該転写因子をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換体（細胞）を選抜（スクリーニング）する工程である。
【００４９】
当該選抜工程における具体的選抜方法は上記第一形質転換工程で得られた形質転換体（細胞）の中から目的とする転写因子を安定的に高発現する形質転換体を選抜する方法であれば特に限定されるものではない。
【００５０】
例えば、形質転換体（細胞）から発現タンパク質を抽出し、該転写因子特異抗体を用いてその発現量を検出する方法として、ウエスタンブロット法、エライザ法、ドットブロット法等が適用可能である。また、形質転換体（細胞）から発現ＲＮＡを抽出し、該転写因子の遺伝子配列に相補的なプローブを用いて転写因子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法として、例えばノーザンブロット法、ドットブロット法等が適用可能である。さらに、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法等によって該転写因子ｍＲＮＡの発現量を検出することも可能である。
【００５１】
（Ａ−３）第二形質転換工程
当該第二形質転換工程は、上記選抜工程により選抜された転写因子を高発現する形質転換体（細胞）（以下、転写因子高発現形質転換体（細胞）と称する）に、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子高発現形質転換体が発現する転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を導入する工程である。あらかじめ選抜された、転写因子を高発現する形質転換体に、目的とする植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたウイルスベクターのｃＤＮＡを導入することにより、高確率に植物レクチンタンパク質を高生産する形質転換体（細胞）を生産することができる。
【００５２】
＜植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片＞
本植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片は、形質転換体（細胞）に植物レクチンタンパク質を生産させるために使用するＤＮＡ断片であり、少なくともＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子高発現形質転換体（細胞）が発現する転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとからなる。この他、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子挿入用のクローニングサイト（好ましくはマルチクローニングサイト）・ベクター配列・ターミネーター・薬剤耐性マーカー等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。かかる転写因子発現用ＤＮＡ断片の調製方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。
【００５３】
転写誘導型プロモーターは、転写因子高発現形質転換体が生産する転写因子に応じて選択すればよく、その組み合わせの一例については、（Ａ−１）第一形質転換工程の項で述べたとおりである。
【００５４】
細胞に生産させる植物レクチンタンパク質は特に限定されない。例えば、ゴーヤ由来抗Ｈレクチン（配列番号１及び２）、コムギ由来ＷＧＡ、トウゴマ由来ＲＣＡ、ピーナツ由来ＰＮＡ、タチナタマメ由来ＣｏｎＡ、ダイズ由来ＳＢＡ、ハリエニシダ由来ＵＥＡ、ジャガイモ由来ＳＴＬ等の種々の植物レクチンタンパク質が例示できる。
【００５５】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子を用いて植物レクチンタンパク質の転写誘導を行う本発明の方法は、各種植物に由来するレクチンタンパク質を生産するための形質転換体の生産に用いることができる。植物レクチンには細胞毒性を示すものがあり、異種発現系を構築することが困難であるが、この問題は、恒常的発現プロモーターではなく誘導型の発現プロモーターを用いることにより解消される。プロモーターとして植物において良く用いられている恒常的発現プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス由来35Sリボソーム発現プロモーター；PCaMV35S）を用いて植物レクチンの発現を試みたところ、レクチンの蓄積量は極めて低い結果となった。また、作製した細胞を長期間継代培養すると、細胞が暗黒色に変色し、増殖性が著しく低下した。これは、継代培養している間もレクチンを生産し続ける為であると推察される。ホルモンにて発現調整が可能な誘導型プロモーターを使用することにより、細胞を十分に増殖させた後にレクチンを発現させることが可能となり、生産能力が著しく向上する。また、継代培養を行っている間は、発現を抑制させることができるため、植物レクチンが細胞に悪影響を与えることなく、継代培養を行うことが可能である。なかでも、宿主細胞として植物由来培養細胞（特に好ましくは、ＢＹ２細胞等のタバコ由来細胞）を用いる実施形態は、各種植物に由来するレクチンタンパク質を生産するための形質転換体の生産に特に適している。植物レクチンの発現は、異種発現系において一般的に用いられている微生物宿主（大腸菌や酵母）にて構築している例は少ない。これは、植物レクチンを微生物細胞で発現させることがタンパク質フォールディングや翻訳後修飾の違いにより困難であるからと推察される。植物細胞を宿主として用いることにより、この問題は解消される。植物細胞として好適なものは、細胞増殖性が極めて高いタバコBY-2細胞である。植物細胞を宿主として用いることにより、フォールディングや翻訳後修飾などが正常に行われ、種子由来のものと同様の糖鎖特異性を示す植物レクチンが生産可能となる。したがって、本発明の発現系、特に、宿主細胞として植物由来培養細胞（特に好ましくは、ＢＹ２細胞等のタバコ由来細胞）を用いる発現系は、実施例において用いられたゴーヤ由来抗Ｈレクチンタンパク質の発現だけでなく、他の植物に由来するレクチンタンパク質の発現にも適した発現系であるといえる。
【００５６】
ウイルスベクターとしては、ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来のウイルスベクターであれば特に限定されるものではなく、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを用いることができる。中でも細胞内でｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ自体がｍＲＮＡとして機能するという理由から、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来のウイルスベクターであることが特に好ましい。
【００５７】
また、ウイルスベクターは植物ウイルス由来のウイルスベクターに限定されるものではなく、動物ウイルス、ファージを含むあらゆるＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを用いることが可能である。しかしながら、植物細胞に植物レクチンタンパク質を生産させる目的で使用する場合には、植物ウイルス由来のウイルスベクターであることが好ましく、中でも植物のサイレンシングを抑制する因子（サプレッサー）を持つウイルス由来のウイルスベクターであることが特に好ましい。サイレンシングのサプレッサーを持つウイルスベクターを用いることにより、増幅の後半においてもｍＲＮＡが分解される現象が生じない。サイレンシングのサプレッサーを持つ植物ウイルスとしては、例えば、ポティ属（Potyvirus属）ウイルス、ククモウイルス属（Cucumovirus属）ウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）)、ポテックスウイルス属（Potexvirus属）ウイルス（例えばジャガイモＸウイルス(ＰＶＸ)）、トンブスウイルス属（Tombusvirus属）ウイルス(例えばトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、Cymbidiumu ringspot virus （ＣｙｍＲＳＶ）)、カルモウイルス属（Carmovirus属）ウイルス(例えば、Turnip crinkle virus （ＴＣＶ）)、トバモウイルス属（Tobamovirus属）ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ））が挙げられる。
【００５８】
また上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端には、リボザイム配列が結合していることが好ましい。形質転換体の細胞内でｃＤＮＡから転写されるウイルスＲＮＡの３’末端に付加されウイルスの複製能力低下の原因となるターミネーター由来の配列やポリＡ配列を切断することができるからである。その結果ウイルスの複製能力の低下を防止することができ、植物レクチンタンパク質の高生産が可能となる。結合されるリボザイム配列は、上記３’末端に付加された余分な配列を切断できるものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列（GenBank accession No. X77627他）またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列（GenBank accession No. M17439）を用いることができる。
【００５９】
また植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子と置換されていることが特に好ましい。この部位に植物レクチンタンパク質遺伝子を挿入することによりウイルスの外被タンパク質が産生されなくなり、増幅されるウイルス遺伝子は粒子化されず他の植物に感染することがなくなるため、ウイルスの外界への飛散という問題を解消することが可能となる。
【００６０】
更に、ウイルスベクターにおいて、ウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）をコードする遺伝子が削除されており、ＭＰサブゲノムプロモーター領域を構成する塩基の少なくとも一部が、複製酵素である１８０Ｋタンパク質のアミノ酸配列は変えないように置換されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが他の塩基配列に置換されて無効化されており、かつ、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子が植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子に置換されていることが好ましい。本発明者らは、この特徴を有するウイルスベクターをＭＰＤベクターと称する（ＭＰが削除（Delete）されているため）。ＭＰＤベクターから発現されるウイルスＲＮＡは従来の旧型ベクターと同様のウイルス複製能力を持つ。なおＭＰ遺伝子は誘導ウイルスベクターシステムでは不必要な遺伝子である。ＭＰＤベクターは、ＭＰ遺伝子が削除されているためにｃＤＮＡの鎖長は短い。このため、ＭＰＤベクターは宿主細胞において複製され易くかつ植物におけるｃＤＮＡの転写の効率が高いものと考えられる。
【００６１】
図１（ｂ）に植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例を示す。図１（ｂ）は、形質転換用ベクターであるＴｉプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分を示している。同図中左からエストロジェンによって活性化される融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲによって転写誘導されるプロモーターＯＬｅｘＡ−４６、その下流にゴーヤ由来抗Ｈレクチン遺伝子（以下、ＭＣＬ遺伝子と称する）を組み込んだトマトモザイクウイルスベクターＴｏＭＶ−ＭＣＬ ｃＤＮＡ、その３’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスリボザイム配列Ｓ−Ｒｚ、さらに３５Ｓターミネーター配列３５ＳＴ、またその下流に薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子Ｋａｎｒがある。なお、上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の転写因子高発現形質転換体への導入方法は、（Ａ−１）第一形質転換工程の項で述べた方法と同様に行なえばよい。
【００６２】
上記本形質転換体（細胞）の生産方法は種々の植物レクチンタンパク質の発現系に適用可能である。当該生産方法により、人工的に遺伝子に変異を加えて調製される新規糖鎖認識特異性をもつレクチンの効率的な生産が可能となる。
【００６３】
本形質転換体（細胞）の生産方法の特に好ましい実施形態としては
宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
転写因子発現用ＤＮＡ断片、および植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される
ことを特徴とする実施形態が挙げられる。この実施形態によれば、植物レクチンタンパク質を、天然物中と同様の活性を維持しつつ、特に効率的に生産することが可能である。
【００６４】
通常、ウイルスベクターは導入する遺伝子のサイズが増加するにしたがい複製能力が低下することが知られている。しかしながら、植物レクチンは遺伝子ＤＮＡのサイズが比較的大きい（1.5k）にもかかわらず、本発明の方法によれば、予想に反して植物レクチンタンパク質を高発現可能な形質転換体を生産することができた。この理由は明らかではないが、本発明の発現系は、ウイルスベクターを用いるにも関わらず、予想に反して植物レクチンの発現に適していることが確認された。In vitro転写したウイルスベクターをＢＹＩＩプロトプラストに接種した場合にはＭＰを欠失させる効果はほとんど認められないが、形質転換体においてはレクチンをはじめ1ｋｂを越えるタンパク質はＭＰＤベクターでのみ効率よく生産することができた。本ベクターは従来ベクターでは効率よく合成することができなかった遺伝子ＤＮＡの塩基配列が１ｋｂを越えるレクチン以外の２種のタンパク質（アラビドプシスのクチナーゼ、ヒトアクチン）を合成することに成功している。すなわち、本ベクターを用いた形質転換細胞は、植物レクチンタンパク質に限らず、アラビドプシスのクチナーゼ、ヒトアクチン等の、遺伝子ＤＮＡの塩基配列が１ｋｂを越える（好ましくは、２ｋｂ以下である）タンパク質を効率的に生産することが可能である。
【００６５】
また、下記に示す実施例では、通常の２倍の数のセルラインを選抜し、その結果、特に高い発現を示すラインを一つえることに成功した。本結果より、比較的サイズの大きなレクチンに対しても、同様に、多くのラインから選抜することにより、特に優れた形質転換体を選抜できる可能性が高まることが考えられ、このことは、植物レクチン全般に応用可能であると思われる。したがって、第二形質転換工程において得られた形質転換体から、所望の植物レクチン発現能力を有する形質転換体を選抜するためにはセルライン２００以上であることが好ましいといえる。
【００６６】
（Ｂ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体およびその利用
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体（以下、本形質転換体）は、上記本形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体（細胞）である。本形質転換体は、転写因子をコードする遺伝子およびウイルスベクターをコードする遺伝子の両者が、それぞれ発現に最適な染色体上の位置に組み込まれた形質転換体であるため、本形質転換体を用いることによって、植物レクチンタンパク質を高生産することができる。
【００６７】
また本発明にかかる植物レクチンタンパク質の生産方法（以下、本植物レクチンタンパク質の生産方法）は、本形質転換体を用いることを特徴としている。すなわち、本植物レクチンタンパク質の生産方法は、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が導入された本形質転換体から植物レクチンタンパク質を回収することにより行なう。さらに植物レクチンタンパク質をより大量に取得するためには、本形質転換体の数を培養・栽培・育成等によって増加させ、増加させた本形質転換体から植物レクチンタンパク質を回収することにより行なうことが好ましい。本形質転換体の培養・栽培・育成条件等は特に限定されるものではなく、本形質転換体に好適な条件を適宜選択して用いればよい。植物由来培養細胞を培養する際の培地としては特に限定されるものではないが、無機塩類、炭素源、ビタミン類、アミノ酸が加えられている場合がある。さらに、ココナツミルクや酵母エキスを加えて成長を促進させる場合がある。その他、オーキシンとサイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン等の植物ホルモンを添加する場合がある。また培養条件であるが、光、温度、通気の有無等を培養する細胞に応じて最適なものを採用すればよい。例えば、タバコＢＹ２細胞を培養条件の一例としては、３７０ｍｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｍｇ／ｌチアミン塩酸、３％スクロース、０．２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含むＭＳ培地を用い、暗所、２６℃、１３５回転／分で旋回振盪培養後、１／１００量を一週間ごとに継代することが挙げられる。
【００６８】
また、本形質転換体の種類としては特に限定されるものではなく、植物・動物の個体であっても、植物・動物由来培養細胞であってもよい。ただし、迅速に大量に植物レクチンタンパク質を生産するためには、形質転換体は培養可能な細胞（培養細胞）であることが好ましい。さらには、細胞の取り扱いのしやすさ・培地が安価である等の理由から、植物由来培養細胞であることが好ましい。上記植物由来培養細胞としては、例えばタバコ由来ＢＹ２細胞が挙げられる。
【００６９】
（Ｃ）本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産キット
本発明にかかる植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産キット（以下、本キットと称する）は、上記本形質転換体の生産方法を行なうためのキットである。本キットを構成するものについては特に限定されるものではないが、転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片、および／またはＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片により構成されていることが好ましい。具体的には本キットが、転写因子発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）、および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺにより構成されている例が挙げられる。
【００７０】
本キットの利用者は、（ａ）転写因子発現用ＤＮＡ断片を適当な宿主細胞に導入する工程、（ｂ）その形質転換体の中から転写因子を高発現する形質転換体を選抜する工程、（ｃ）該形質転換体に植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を導入する工程を経て植物レクチンタンパク質生産用形質転換体が得られることとなる。なお本キットに含まれる転写因子発現用ＤＮＡ断片に植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法は、遺伝子工学的手法により行なえばよい。
【００７１】
さらに本キットは、上記転写因子高発現形質転換体および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片により構成されていることが好ましい。より具体的には後述する実施例において取得した転写因子高発現形質転換体の一例である転写因子高発現タバコＢＹ２細胞、および／または植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の一例であるｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺにより構成されている例が挙げられる。
【００７２】
転写因子高発現形質転換体が既に取得されているため、本キットの利用者は上記（ｃ）のみを行なえばよく、より迅速かつ簡便に植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を得ることができる。
【００７３】
この他本キットには、例えば、細胞、培地、制限酵素、修飾酵素類、転写誘導用化学物質（ステロイドホルモン、エストロジェン等）、培養フラスコ、アグロバクテリウム（植物細胞の場合）等が含まれていてもよい。
【００７４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７５】
1. ゴーヤレクチン遺伝子（MCL）発現系の作製方法
（１）転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクター（以下転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターと称する）として、ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）を用いた。ｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）は、恒常的プロモーターＰG10-90の下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲをコードする遺伝子と、ターミネーターＴE9とを連結し、さらに薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇr）を組み込んで構築した。図１（ａ）にｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）の一部分の構造を模式図として示した。
【００７６】
なお、ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）、恒常的プロモーターＰG10-90、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ、ターミネーターＴE9、Ｈｙｇrはいずれも公知の方法により調製可能である。ＴｉプラスミドｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）は、Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T., Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084に記載されている。恒常的プロモーターＰG10-90はIshige, F., Takaichi, M., Foster, R.,Chua, N. H. and Oeda, K.(1999) A G-box motif(GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants. Plant J. 20, 127-133に記載されている。ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ及びターミネーターＴE9はZuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 に記載されている。
【００７７】
（２）植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターの構築
トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の外被タンパク質をコードする遺伝子を、ＭＣＬをコードする遺伝子（配列表の配列番号１、以下、ＭＣＬ遺伝子と称する）で置換したＴｏＭＶ変異体を用いた。配列番号1の塩基配列のうち２３番〜１６６４番の塩基配列をＭＣＬ遺伝子として用いた。
【００７８】
ＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡの塩基配列を図２及び配列表の配列番号３に示す。図２において、下線を引いた箇所はＴｏＭＶのｃＤＮＡの塩基配列から変更した箇所である。下線部（ｂ）は移行タンパク質（ＭＰ）遺伝子を削除し、ＭＰサブゲノムプロモーター領域の塩基配列を変更した（ただし複製酵素である１８０Ｋタンパク質のアミノ酸配列は変えないように変更した）箇所である。下線部（ｄ）は外被タンパク質（ＣＰ）の開始コドンをＡＴＣに置換して無効化した箇所である。（ｅ）で示す箇所は外来遺伝子クローニング用に導入されたＰｍｅＩサイトである。下線部（ｆ）はＭＣＬをコードするＭＣＬ遺伝子（配列番号１の第２３番〜１６６４番塩基）を示す。下線部（ｈ）はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）をコードする塩基配列である。枠により強調した箇所（ｊ）、（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）はいずれも構築に関与する制限酵素サイトであって、（ｊ）はＳｐｅＩのサイトであり、（ａ）はＫｐｎＩのサイトであり、（ｃ）はＮｃｏＩのサイトであり、（ｅ）はＰｍｅＩのサイトであり、（ｇ）および（ｉ）はＢｓｔＥＩＩのサイトである。
【００７９】
図２に示すＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡを含有するプラスミドは次の手順で作成した。
（１）ＫｐｎＩ（ａ）からＮｃｏＩ（ｃ）までの領域を人工合成した。
（２）ＮｃｏＩ（ｃ）からＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）までの領域のＰＣＲ断片を、外被タンパク質（ＣＰ）の開始コドン（ＡＴＧ）をＡＴＣに置換した変異を導入して作成した。具体的には、Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T., Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084に記載されているプラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いてＮｃｏＩ（ｃ）からＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）までの領域のＰＣＲ断片を作成した。
フォワードプライマー: 5'-GACCCATGGGAAGTTGTTGATGAGTTCA-3’
リバースプライマー: 5'-TATGGTTACCGTTTAAACAAAAACACAAATTGCGATGGAGAAGTGATTGAGTAAGAGATATTTAATACGAATCA-3’
フォワードプライマー中、細下線部がＮｃｏＩサイト（ｃ）に対応する配列である。
【００８０】
リバースプライマー中、細下線部がクローニングサイトＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）に対応する配列であり、太下線部がＡＴＧからＡＴＣへの変異を導入するための配列である。
【００８１】
プラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）のうち、本発明に関連する部分の構造を図４（ａ）に示す。ｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）に含まれるＴｏＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡは、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の外被タンパク質をコードする遺伝子を、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子で置換したＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡである。
【００８２】
（３）プラスミドｐｉＬ．ｅｒＧ３（ＳＦ３）ＳＲｚ（Ａｖｒ）において、ＫｐｎＩからＢｓｔＥＩＩまでの部分を、上記（１）で得られたＫｐｎＩ（ａ）−ＮｃｏＩ（ｃ）ＤＮＡ断片と、上記（２）で得られたＮｃｏＩ（ｃ）−ＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）ＤＮＡ断片とに入れ替えた（３点ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
【００８３】
（４）上記（３）で得られたプラスミドのＰｍｅＩ（ｅ）／ＢｓｔＥＩＩ（ｉ）部位に、ゴーヤ由来抗Ｈレクチン（ＭＣＬ）のＤＮＡ断片（５’端ＰｍｅＩ、３’端ＢｓｔＥＩＩ）とＨｉｓ−ｔａｇのＤＮＡ断片（５’−ＧＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧ−３’と５’−ＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧ−３’をアニールしたもの）を挿入した（３点ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
【００８４】
５’端にＰｍｅＩサイト、３’端にＢｓｔＥＩＩサイトがそれぞれ導入されたＭＣＬのＤＮＡ断片は、ＭＣＬをコードするＤＮＡ（特許文献１）を鋳型とし、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより作製した。
フォワードプライマー: 5'-ATAGTTTAAACATGAGAATGAGAGTGTTAG-3’
リバースプライマー: 5'-TATGGTGACCAATAGAACACCGTCCATT-3’
【００８５】
（５）上記（４）で得られたプラスミドのＳｐｅＩ−ＡｖｒＩＩの領域を切り出し、ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−ＳｐｅのＳｐｅＩ部位に挿入した。ここで用いたプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅは、上記（２）で言及した文献に記載されており、エストロジェンで転写誘導可能なプロモーターＯＬｅｘＡ−４６（Zuo J, Niu QW, Chua NH. “An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene exprssion in transgenic plants.” Plant J.2000, 24: 265-273 参照）を有するＴｉプラスミドにおいて、ＯＬｅｘＡ−４６の下流に、ＴｏＭＶの5’末端からＳｐｅＩサイトまでの領域（図２の5’端から（ｊ）までの領域に相当する）が組み込まれたものである。ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ５’−Ｓｐｅのうち、本発明に関連する部分の構造を図４（ｂ）に示す。
【００８６】
こうして、植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞（タバコＢＹ２細胞）に導入するためのベクター（以下、植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターと称する）ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺを構築した。図１（ｂ）にｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺの一部分の構造を模式図として示した。
【００８７】
このプラスミドｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺは、図１（ｂ）に示すように、エストロジェンで転写誘導可能なプロモーターＯＬｅｘＡ−４６を有するＴｉプラスミドにおいて、ＯＬｅｘＡ−４６の下流に、ＴｏＭＶ変異体（図２）のｃＤＮＡが連結され、さらにその３’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列Ｓ−Ｒｚ（GenBank accession No. M17439）、３５Ｓターミネーター（３５ＳＴ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が組み込まれた構造を有する。
【００８８】
（３）第一形質転換工程：転写因子発現用ＤＮＡ断片の宿主細胞への導入
転写因子発現用ＤＮＡ断片導入用ベクターｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）を、タバコＢＹ２細胞にアグロバクテリウム法により導入した。まずｐＥＲ８（−Ｓｔｕ）をエレクトロポレーション法によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４系統に導入した。これをカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＡＢ ｓｕｃｒｏｓｅ培地で前培養した。次にタバコＢＹ２細胞と混合してシャーレに移し、２６℃、暗所で４２〜４８時間静置してタバコＢＹ２細胞を形質転換した。タバコＢＹ２細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２０ｍｇ／ｌ）を含むタバコＢＹ２細胞用固形培地に広げ、形質転換タバコＢＹ２細胞を増殖させた。
【００８９】
（４）選抜工程：転写因子高発現形質転換体の選抜
形質転換タバコＢＹ２細胞のうち、ノーザンブロット法の結果、転写因子の発現量の高い細胞ライン（ＥＲ４３）を選抜した。ここで「細胞ライン」とは、形質転換細胞を増殖させることにより形成された個々のコロニーのことを意味する。
【００９０】
（５）第二形質転換工程：植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片の導入
上記で得られた転写因子高発現タバコＢＹ２細胞ライン（ＥＲ４３）に、ウイルスベクター（ｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−ＣＯ．３−ＭＣＬ−Ｈｉｓ−ＳＲＺ）をアグロバクテリウム法により導入し形質転換細胞（カルス）を１９２ライン得た。
【００９１】
（６）組換えウイルス高発現形質転換カルスの選抜
得られた１９２ラインの形質転換カルスは、エストロジェン（０．０１ｍＭ）を添加したＢＹ２個体培地に移植し、移植２日後にカルスから全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＴｏＭＶの３’非翻訳領域約２００塩基に相補的なＤＩＧＲＮＡプローブを用いてノーザン分析を行った。その結果、ウイルスＲＮＡの蓄積量の多い４ライン（１０−１−３−１１−１３、１０−１−３−１２−９、１０−１−３−５−１７、１０−１−３−１４−２０）を選抜し、選抜したカルスを１５ｍｌの液体培地に移し、細胞が飽和した後、１／１００量になるように継代培養した。継代７日後１／１００量になるようにさらに継代培養し、同様の継代培養により細胞を維持した。
【００９２】
（７）ＭＣＬの誘導発現
上記で得られた４ラインの各形質転換細胞を１／１００量になるよう継代し、継代培養後７日間前培養した細胞を、新しい培地に１／３０量になるように移した。３日間培養した後、エストロジェンを終濃度が０．０１ｍＭとなるように加え、さらに４日間培養した後ＭＣＬを抽出し、ヒト赤血球凝集（ＨＡ）活性を検出した。その結果、１０−１−３−１１−１３株において最も高いＨＡ活性が認められた。
【００９３】
上記において、転写因子高発現タバコＢＹ２細胞ラインＥＲ４３を形質転換して取得したＭＣＬ高発現細胞（１０−１−３−１１−１３株）を用いて、ＭＣＬのエストロジェンによる誘導発現を試みた。１０−１−３−１１−１３株を１／１００量になるよう継代し、前培養を３日間行なった培養液に対して、エストロジェンを終濃度０．０１ｍＭ添加しＭＣＬの誘導発現を行なった。エストロジェン添加後４８時間の１０−１−３−１１−１３株から全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法によりＴｏＭＶに特異的なＲＮＡを検出した。解析には、ＴｏＭＶの３’非翻訳領域約２００塩基に相補的なＲＮＡプローブを用いた。プローブのラベリングは、ロシュ・ディアグノスティック社のＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行なった。検出には、同社のＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒを用い、それぞれキットのマニュアルに従って行なった。また、エストロジェン添加後４８時間の１０−１−３−１１−１３株から全タンパク質を抽出し、ＨＡ活性の検出を行なった。その結果、エストロジェンによるＴｏＭＶの明らかな転写誘導およびＨＡ活性の検出が確認された。１０−１−３−１１−１３株は、増殖と発現誘導を行い、以降のレクチン抽出および評価に用いた。
【００９４】
２．発現系由来レクチンの評価
（１）発現系由来レクチンの抽出
１０−１−３−１１−１３株の培養液から細胞破砕装置またはフレンチプレスを用いてレクチンを抽出し、１０，０００×ｇで３０分間、遠心分離後の上清を粗抽出液とした。
【００９５】
（２）発現系由来粗抽出液のヒト赤血球凝集（ＨＡ）活性
この粗抽出液についてレクチン活性を評価した。レクチン活性は、連続希釈法によるヒトＨＡ活性により測定した。すなわち、マイクロタイタープレートを用いて被検体のＰＢＳによる２倍希釈列を作製し、これに等量の３％ヒト赤血球浮遊液（オーソ社製）を加えて、室温で３０分間反応させ、肉眼で凝集の有無を判定した。その結果、発現系由来粗抽出液のヒトＯ型ＨＡ活性は２５６ ｔｉｔｅｒを示した。これは、恒常的発現プロモーターｐＨ３５ＣＧによる発現系を用いた下記比較例（粗抽出液の力価８）に比べて大幅に改善したものであった。本培養液１ Ｌから得られるレクチン活性量は、乾燥種子２００−３００ ｇから得られる抽出液の活性量に相当するものと推定された。適度に希釈した本粗抽出液のＡ１、Ａ２、ＢおよびＯの各血液型に対して、それぞれ２、８、８、１６の力価を示し、種子由来レクチンの場合と特性が類似していたことから、種子由来レクチン遺伝子が機能を保持したまま発現していることが推定された。
【００９６】
（３）発現系由来レクチンの精製
上記（１）で得られた粗抽出液は、ＰＢＳに対して透析した後、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速にてガラクトースセファロースカラム（３０ｍＬ）に流し、ガラクトースに親和性のある成分を吸着させた。このカラムをＰＢＳにて十分に洗浄後、０．２Ｍガラクトースを含むＰＢＳを流すことにより吸着したガラクトース結合画分を溶出させた。この溶出画分は蒸留水に対して透析し凍結乾燥した。凍結乾燥により得られた粉末をＰＢＳに溶解したものは、ヒトＯ型ＨＡ活性を有していたことから、レクチンであると認められた。約９０ｍＬの培養液からは、約１ｍｇ（ＰＢＳに１ ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した際の力価は２，０４８）の発現系由来レクチンが得られた。
【００９７】
（４）発現系由来レクチンの電気泳動特性
還元条件化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、発現系由来レクチンは、種子由来レクチンの４本のバンドのうちの２本が強く観察された（図３）。
【００９８】
（５）発現系由来レクチンの血球特異性
発現系由来レクチンおよび比較のために用いた種子由来レクチンはＰＢＳにて希釈し、Ｏ型赤血球に対する力価を３２ ｔｉｔｅｒに調整した。発現系由来レクチンのＡ１、Ａ２、ＢおよびＯの各血液型に対するＨＡ活性は、それぞれ４、１６、８、３２の力価を示し、種子由来レクチンの場合と同等であった（表１）。
【００９９】
（６）発現系由来レクチンの糖鎖特異性
発現系由来レクチンの糖鎖特異性は、各種糖類によるＨＡ阻害試験により評価した。（５）で調整した各レクチン溶液の１２．５μｌは、終濃度が１００ｍＭから０．０１ｍＭになるように希釈した糖類溶液の１２．５μｌと混和後、室温で１時間攪拌した。その後、３％ヒトＯ型赤血球浮遊液を添加し、３０分後に凝集の有無を肉眼判定し、血球の凝集を阻害した最低濃度を最低ＨＡ阻害濃度として求めた。なお、用いた糖類は、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ラクトース、ラクト−Ｎ−ビオース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン、ヒトＢ抗原三糖、ヒトＡ抗原三糖、ヒトＨ抗原二糖、ヒトＨ抗原三糖、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラフィノース、Ｄ−フルクトース、スクロース、マルトース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオースである。その結果、両者の糖鎖特異性は極めて類似し（表２）、Ｈ抗原三糖に対して高い特異性を示した。以上のことから、本発現系に導入されたレクチン遺伝子は、その機能を保持したまま発現していることが確認された。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
比較例
恒常発現プロモーターを用いたゴーヤ由来レクチンタンパク質の発現
ＭＣＬのｃＤＮＡを、バイナリーベクターｐＨ３５ＣＧ（インプランタイノベーションズ）を用いて、微粒子発射装置により、タバコＢＹ−２（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｖ． Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ−２）細胞の懸濁液中で発現させた。当該ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに連結されたＭＣＬのｃＤＮＡと、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターとを含む。ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を、ＮＯＳプロモーターに連結する。当該ベクターにより金粒子（直径１．５〜３μｍ、アルドリッチケミカル）を被覆した。減圧空気：−０．１ＭＰａ、標的距離：９．６ｃｍ、ヘリウム圧：５Ｋｇ／ｃｍ２の条件で、１試験区当り１回の発射を実施した。発射を受けた細胞は、５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する固化ＬＳ培地上に載せ、続いて、１４日間、同一の培地上において数回継代培養を行った。選択的条件での継代培養を５０日間行った後、ロータリーシェーカーにより、１００ｍｌのＬＳ培地を加えた５００ｍｌ容三角フラスコ中で２７℃にて１０日間、ハイグロマイシン耐性細胞を培養した。懸濁した細胞を集め、Ｔｉｓｓｕｅ ｒｕｐｔｏｒ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて破砕した。破砕された細胞を、２０，０００×ｇにて１０分間遠心沈降させた。上澄み液の赤血球凝集活性を、上記の手順で測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２】
上記ホルモンが、エストロジェンまたはステロイドホルモンであることを特徴とする請求項１の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項３】
上記エストロジェンで活性化される性質を有する転写因子としてＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲを用い、上記転写誘導型プロモーターとしてＯＬｅｘＡ−４６を用いることを特徴とする請求項２の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項４】
上記ウイルスベクターは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項５】
上記ウイルスベクターが、植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項４の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項６】
上記ウイルスベクターが、植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項５の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項７】
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする請求項６の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項８】
上記ウイルスベクターが、トマトモザイクウイルスベクターまたはタバコモザイクウイルスベクターであることを特徴とする請求項７の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項９】
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１０】
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合していることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１１】
上記リボザイム配列が、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列、またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする請求項１０の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１２】
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１３】
上記宿主細胞および形質転換体が、植物体または植物由来培養細胞であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１４】
上記植物由来培養細胞がタバコ由来細胞であることを特徴とする請求項１３の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１５】
上記タバコ由来細胞がタバコＢＹ２細胞であることを特徴とする請求項１４の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１６】
上記宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
上記転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
上記転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される、
ことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１７】
上記植物レクチンタンパク質がゴーヤ由来レクチンタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を用いることを特徴とする植物レクチンタンパク質の生産方法。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法を行うためのキット。
【請求項２１】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２２】
生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子である、請求項２１のタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２３】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片であって、上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、タンパク質発現用ＤＮＡ断片と
が遺伝子ＤＮＡに導入されていることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体。
【請求項１】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなる植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とする植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２】
上記ホルモンが、エストロジェンまたはステロイドホルモンであることを特徴とする請求項１の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項３】
上記エストロジェンで活性化される性質を有する転写因子としてＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲを用い、上記転写誘導型プロモーターとしてＯＬｅｘＡ−４６を用いることを特徴とする請求項２の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項４】
上記ウイルスベクターは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを遺伝子とするウイルス由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項５】
上記ウイルスベクターが、植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項４の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項６】
上記ウイルスベクターが、植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来であることを特徴とする請求項５の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項７】
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする請求項６の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項８】
上記ウイルスベクターが、トマトモザイクウイルスベクターまたはタバコモザイクウイルスベクターであることを特徴とする請求項７の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項９】
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１０】
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合していることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１１】
上記リボザイム配列が、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列、またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする請求項１０の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１２】
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１３】
上記宿主細胞および形質転換体が、植物体または植物由来培養細胞であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１４】
上記植物由来培養細胞がタバコ由来細胞であることを特徴とする請求項１３の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１５】
上記タバコ由来細胞がタバコＢＹ２細胞であることを特徴とする請求項１４の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１６】
上記宿主細胞がタバコＢＹ２細胞であり、
上記転写因子がＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲであり、
上記転写誘導型プロモーターがＯＬｅｘＡ−４６であり、
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、植物レクチンタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであり、
上記ウイルスベクターのｃＤＮＡの３’末端に、リボザイム配列が結合しており、かつ
上記転写因子発現用ＤＮＡ断片、および上記植物レクチンタンパク質発現用ＤＮＡ断片が、アグロバクテリウム法により導入される、
ことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１７】
上記植物レクチンタンパク質がゴーヤ由来レクチンタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法によって生産された植物レクチンタンパク質生産用形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体を用いることを特徴とする植物レクチンタンパク質の生産方法。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項の植物レクチンタンパク質生産用形質転換体の生産方法を行うためのキット。
【請求項２１】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた形質転換体の中から前記転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片を、前記選抜工程によって選抜された形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなり、
上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターであることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２２】
生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、１ｋｂを越える鎖長のＤＮＡからなる遺伝子である、請求項２１のタンパク質生産用形質転換体の生産方法。
【請求項２３】
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用ＤＮＡ断片と、
ＲＮＡを遺伝子とするウイルスに、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのｃＤＮＡと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用ＤＮＡ断片であって、上記ウイルスベクターが、ウイルスの移行タンパク質をコードする遺伝子が削除されており、ウイルスの外被タンパク質の開始コドンが無効化されており、かつ、生産しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子に置換されて挿入されているウイルスベクターである、タンパク質発現用ＤＮＡ断片と
が遺伝子ＤＮＡに導入されていることを特徴とする、タンパク質生産用形質転換体。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１５６４０（Ｐ２０１１−１５６４０Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６２６７２（Ｐ２００９−１６２６７２）
【出願日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構、「地域イノベーション創出総合支援事業 重点地域研究開発推進プロジェクト」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構、「地域イノベーション創出総合支援事業 重点地域研究開発推進プロジェクト」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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