植物用薬剤
【課題】植物の細菌性病気の予防や治癒に効果のある、薬剤を提供する。
【解決手段】バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）を混合培養して、得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有し、発酵中間物質、発酵残渣物質、バチルス胞子を含む発酵混合物から、希エタノールや水等の溶媒に溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状として植物用薬剤として用いる。
【解決手段】バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）を混合培養して、得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有し、発酵中間物質、発酵残渣物質、バチルス胞子を含む発酵混合物から、希エタノールや水等の溶媒に溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状として植物用薬剤として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の細菌性病気の予防や治癒や害虫駆除に効果のある植物用薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、養鶏場や養豚場、牛舎等では、その効率を追求する余り、それらの家畜や家禽類は極めて限られた生活空間に押し込められて、生産の目的にのみ合致する飼育方法により生産されている。従って、それらの家畜、家禽類は、生活環境と飼育よりくる種々のストレスに悩まされ、健康状態の低下を招いたり、伝染性疾病の集団発生を見る頻度が高くなっている。更に、配合飼料原料に由来する病原菌や、化学物質による弊害や罹病、またそれらを予防する目的で添加される化学薬物による免疫低下や副作用的障害の発現がある。また、伝染性疾病に対しては各種のサルファ剤や抗生物質が投与されるのが常であり、それら薬物に対する耐性菌の出現もあり、その効果の低下と体内に残留するそれら薬物が食物を通じて人体内に摂取され、種々の弊害が危惧される。このように、家畜、家禽の生産性の低下（罹病リスク）と化学物質や抗生物質等による品質の低下は大きな損失をもたらすものであり、化学療法に依存しない防疫対策が強く望まれている。一方、植物栽培においても、農薬の消費拡大による環境汚染や食物汚染の問題が大きな社会問題になってきている。そして、無農薬栽培や有機栽培の動きも活発になってきているが、一朝一夕に切り換えることは不可能である。そこで、環境汚染や食物汚染を生起しない植物用薬剤の出現が希求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、環境汚染や食物汚染を生起しない安全な植物用薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、植物用薬剤において、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有することを特徴とするものである。また、本発明は、植物用薬剤において、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたペプチドの代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合物から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状としたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の植物用薬剤は、植物に散布して病虫害や病原菌を駆除したり、免疫を向上するのに用いて良好であり、植物の細菌性の病気を予防、治癒や、又は害虫の駆除に用いて、効果がある。
【０００６】
この優れた効果を示すのは、全て、バチルス殊にバチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラス由来のポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物の作用、或いはそれらとあいまって、バチルス自体の病原菌や腐敗菌を直接攻撃する特性による結果である。また、発酵混合物やその有効成分の投与を続けることにより、ある程度の期間は効果を持続すること可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の優先化した混合培養によるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を含有する発酵混合物、または、それらから分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物（以下、代謝物等と言う）を、動物用薬剤として飼料に添加して、豚や鶏に投与したところ、これらの家畜や家禽類が本来的に持っている様々な免疫機能が活性化されるとともにストレスが緩和され、ウイルスや細菌による感染を防御することを確認した。
【０００８】
この発酵混合物は、バチルス属細菌特にバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの両者が優占化した汚水処理汚泥や、これらが比較的高密度に含まれる腐葉土等を種菌とし、これを栄養源とともに培養槽に植菌し、曝気と栄養添加により胞子化と分解と言う増殖工程を繰り返してバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスを高密度化し、得られた汚泥を乾燥して得るものである。或いはこの汚泥を更に発酵させて菌体の細胞膜や原生動物の死骸等の有機物を分解してバチルスを更に高密度化した発酵汚泥を乾燥して得るものである。
【０００９】
この増殖工程や発酵処理中、ことに発酵処理中において、バチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスはライフ時間が短いため優占化が進行し、バチルス属細菌の殆どがこれらで占められる。そして、動物用薬剤となる物質中のバチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスの濃度は１０10〜１０12個／ｇオーダーになる。これらの汚泥中に、他のバチルス属細菌例えばバチルス・サブチリスや酵母が少量存在していてもかまわない。要は、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスが優占化しておればよい。尚、バチルス・ツリンゲンシスは菌体サイズが１．２μｍφ以上で澱粉、糖質、一部菌株でカゼインを分解資化するがグックドミートを分解できず、一方バチルス・プミラスは菌体サイズが１．１μｍφ以下でクックドミート・カゼインを分解資化し、澱粉を分解しないことから、他のバチルス属細菌と別異的に同定される。
【００１０】
即ち、本発明でいう発酵混合物とは、前記したようにバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養の結果得られた、ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を含む、発酵中間物質や発酵残渣物質、バチルス胞子などからなる混合物をいう。ここに代謝物とは、菌体の活動や胞子化、殊に胞子化に伴い分泌されるものを言い、これには抗生作用を有する環状ペプチドや一部のポリペプチドなどが含まれる。また生成物とは、栄養源の分解物や該分解物同志の反応生成物例えばアンモニア、硫化水素、アミノ酸、アミノ酸とカルボシル基を有する物質との反応により生じるポリペプチドなどが含まれる。そして、発酵混合物中に含まれているポリペプチドや環状ペプチド等を含む代謝物や生成物は、希エタノールや水等の溶媒に溶出させ、それらのみを回収して薬剤として利用できる。更に、発酵混合物には、籾殻炭等の発酵副原料やその消化物も含まれる。そして、その特徴は極めて高濃度の代謝物を含有していることにある。即ち、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスは、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化と言う増殖サイクルを繰り返し行なって優先化し、その活動や胞子化に伴い分泌される代謝物の濃度を増大させるものである。
【００１１】
バチルス・プミラスが、抗菌物質や抗生物質、生理活性物質を産生することは知られている（特公昭５７−６９１３、特公昭６１−１２９１４、特許２５６４７９）。また、バチルス・ツリンゲンシスが線虫類毒素を産生することも知られている（特開昭６４−６７１９２）。しかし、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスを混合培養すること、及び混合培養の結果、動物用の免疫賦活、感染予防、抗ストレスに著効のある物質を高濃度に産生すること、更に代謝物が相乗的に作用することは知られていない。また、バチルス・ツリンゲンシスが免疫賦活物質を産生することも知られていない。
【００１２】
一般に、バチルスは好気性ないし通性嫌気性条件と適度の温度と湿度のもとで、蛋白質、糖質、脂質、尿素・尿酸等の栄養分を、菌種に応じて分解資化して成長し、増殖条件の欠如とともに内胞子を形成し、やがて解体して胞子となる。胞子は悪環境条件にも強く、生命を維持して増殖条件の出現とともに発芽して、同様の過程を繰り返して菌密度（胞子密度）を高める。そして、菌が代謝して増殖するに際して、代謝物を産出する。
【００１３】
中でも、バチルス・ツリンゲンシスは殊に多糖類の分解性能に優れ、バチルス・プミラスは単糖類や蛋白質の分解性能に優れる。従って、この両者を混合培養した場合、栄養分解の分担が行なわれ、相互に助長し合って増殖する。そして、貧栄養状態を出現させた場合、桿菌状態や糸状体にあるバチルスは死滅するが、残存していたバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの胞子が生命を維持しており、バチルス死細胞壁や細胞質、胞子の脱け殻等に含まれる多糖類はバチルス・ツリンゲンシスが分解・資化し、分解により得られた単糖類や蛋白質はバチルス・プミラスが分解・資化し、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスが相互に助長し合って優先化していく。そして、増殖過程を繰り返した結果、これらバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの菌体や胞子密度は１０10〜１０12個／ｇにも及ぶが、貧栄養状態（消化発酵、貧栄養下での発酵）を繰り返し出現させた場合には、休眠胞子としてその密度が１０2 〜１０4 個／ｇと自然分布状態にまで減少している。但し、この貧栄養増殖過程でも代謝物等は更に高濃度化される。
【００１４】
この発酵混合物から、溶媒を用いて代謝物等の有効成分を溶出（抽出）し、これを液状のまま或いは更に乾燥して粉状にして動物用薬剤或いは植物用薬剤を得る。溶媒としては、水か希エタノールが最も好ましい。この薬剤は、飼育動物の免疫賦活、感染予防、抗ストレス効果や、植物の細菌性病気の予防、治癒及び害虫駆除に著効がある。発酵混合物から有効成分を溶出した残りは、発酵に用いた籾殻済等の発酵副資材やその消化物、バチルス胞子などから構成されることから、土壌改良剤として用いるとよい。尚、動物体内においてバチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスが発芽して活動したり、動物に有害な影響を及ぼすことは皆無である（ＥＰＡ報告、ＷＨＯ報告等）。また、バチルス胞子はその状態で動物体内を通過するに過ぎないことも実験で確かめられている。
【００１５】
上述した動物用薬剤の対象となる動物には、豚や牛等の家畜や犬、猫等の愛玩用動物、鶏やウズラ、アヒル等の家禽や愛玩用鳥類、動物園での飼育動物などの全てが含まれる。感染症とは、豚丹毒、浮腫症、牛や豚の炭疽病、牛の結核病、鶏の雛白痢などの細菌性疾病、豚コレラ、豚の日本脳炎、牛のイバラキ病、牛流行熱、鶏のニューカッスル病などのウイルス性疾病のほか、すべてのウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染症を言う。尚、本発明の飼料は特に限定されるものではなく、家畜や家禽その他の動物の種類に応じて使用される飼料であれば、どのような飼料でも構わない。
【００１６】
これらの感染症は、病原菌やウイルスに起因することは勿論であるが、現在では過密養豚、狭いゲージ内での養鶏などの過密で劣悪な環境での飼育が常態であり、ストレスによる病原菌抵抗力や免疫の低下も大きな要因の一つである。例えば、豚ではストレスから下痢を起こしたり尻尾の噛み切りが起きるし、鶏では脱羽毛や下痢などを起こす。また、サルモネラ菌による汚染にも深刻なものがある。そのため、現状ではそれらの対策上、薬漬けの養豚、養鶏が行なわれることになる。これに対し、本発明の発酵混合物は抗ストレス効果があり、これらストレスによる現象の根絶ないし低減化が図れ、養豚、養鶏等のリスクは大きく低減する。更に、畜舎や鶏舎より発生する悪臭は近隣に対して悪臭公害をもたらし、各所において大きな社会問題をもたらしている。本発明の発酵混合物を投与すると、豚舎などかり発生する悪臭は消滅する。これは、悪臭を発生させる嫌気性菌や腐敗菌、病原菌の大部分が、バチルスやその代謝物等により駆逐されるためである。更に、この悪臭によって、ハエが大量発生し、病気の伝染を助長する機会が増えるのが常態であるが、本発明の発酵混合物は、ポリペプチドや環状ペプチド等を含む代謝物を有効成分とするため殺菌・殺虫効果を有するため、ハエの発生が防がれ、衛生的な畜舎に改善される。このように、本発明の発酵混合物は、病原菌等に起因する疾病を予防治療する以外に、抗ストレス作用や排泄物の低臭気化に効果があるものである。更に、ハエ等の害虫は激減し、鶏舎内や畜舎内に発生せず、また寄りつかなくなる。
【００１７】
発酵混合物の投与量としては、１ｍｇ〜１００ｍｇ／日・体重１ｋｇの範囲で有効であり、望ましくは５〜１５ｍｇ／日・体重１ｋｇ、更に望ましくは、８〜１３ｍｇ／日・体重１ｋｇである。発酵混合物に代えて、発酵混合物から分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を用いると投与量は少なくてすむ。この場合、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養〜消化発酵〜溶出分離したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を、動物の体重１ｋｇ当たり１日量として０．０４〜５ｍｇを飼料に混合して投与することが最も望ましい。投与は、直接与えるほか飲み水に混入したり飼料や嗜好品に配合するなどして行なわれるが、飼料等に配合するのが一般的である。投与は毎日連続して行なうことが望ましいが、７日サイクル以内での間断投与する方法もある。尚、バチルスは乾燥状態（水分３０％以下）では発芽せず胞子状態を保つ。また、動物体内では消化器系を通過するのみであり、代謝物の優れた働きにより病原菌を攻撃したり高い整腸作用を発現し、動物の健康の維持、増進、更に感染症の予防と治療、抗ストレス能の向上に有効である。本発明は、この薬剤を植物に適用したものであり、植物の防疫や害虫予防・駆除には、代謝物等を２０〜５００ｍｇ／リットル含有する水溶液を作成し、散布すると有効である。
【実施例】
【００１８】
（実施例 １） 発酵混合物が病原菌を抑制したり滅菌する作用の確認
試験方法：ａ大腸菌（Ｏ１５７菌株）、ｂサルモネラ菌を白金耳で採取し、それぞれ平面培地に植菌し、３９℃で３日間無菌恒温箱内で培養した。これを、比較水準とする。これと並行して、
（１）ａ’：大腸菌平面培地上に更に発酵混合物溶液（発酵混合物０．５ｇ／無菌水１０ｍｌをホモナジナイザーで均一混合したもの）０．１ｍｌを分取して塗布する。３９℃で３日間無菌箱内で培養した。
（２）ｂ’：サルモネラ菌平面培地上に、更に発酵混合物溶液０．１ｍｌを分取して塗布し、３９℃で３日間無菌箱内で培養した。
（３）ａ''：大腸菌平面培地上に、発酵混合物上澄液（発酵混合物溶液を、６０００ｃ／ｓで１５分間遠心分離したものの上澄み液（菌の代謝生産物のみを含む）を０．１ｍｌ分取して塗布し、同様に培養した。
（４）ｂ''：サルモネラ菌平面培地上に、発酵混合物上澄液を０．１ｍｌ分取して塗布し、同様に培養した。尚、ここに平面培地とは、グルコース０．８％、ニュートリエントブロス０．８％、食塩０．６％、寒天１．５％で作成した。
試験結果：
（１） ａ及びｂは、それぞれ大腸菌、サルモネラ菌のコロニーが大発生し、平面培地全面を覆った。
（２） ａ’及びｂ’は、それぞれ発酵混合物溶液を塗布した面に大腸菌、サルモネラ菌のコロニーは増殖せず、逆にバチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラスのコロニーが大発生した。
（３） ａ''及びｂ''は、それぞれ発酵混合物上澄液を塗布した部分にのみ、大腸菌、サルモネラ菌のコロニーの発生がなく、その他の残余面では、それぞれ大腸菌、サルモネラ菌のコロニーが大増殖した。
上の結果は、（２）において、バチルス・ツリンゲンシス及びバチルス・プミラスがその代謝産物の作用と併せて、大腸菌、サルモネラ菌を溶菌し、更にそれらも栄養として消化して増殖したことを示し、更に、（３）において、バチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラスの代謝産物が、大腸菌、サルモネラ菌を抑制又は溶菌する作用を有することを示している。
【００１９】
（実施例 ２） 発酵混合物が病原菌を抑制したり滅菌する作用の確認
試験方法：
大規模養鶏場内で、遊休中の古い小型鶏舎２棟（各１２００羽）を用いて、適正な発酵混合物投与水準を求めるとともに、その効果の確認を行なった。まず、Ａ棟の幼鶏１２００羽（白色レグホン）は、従来通りの養鶏を行ない、これを比較水準とした。Ｂ棟の幼鶏１２００羽（白色レグホン）には、配合飼料に発酵混合物（バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養）を配合して与えた。投与量は、下記水準１〜水準６の通りである。実験期間は、Ａ、Ｂとも１８ケ月である。
水準１：発酵混合物 １ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準２：発酵混合物 １０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準３：発酵混合物 ２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準４：発酵混合物 ３０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準５：発酵混合物 ５０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準６：発酵混合物 １００ｍｇ／体重１ｋｇ・日
【００２０】
試験結果：
本発明の各水準及び比較水準における平均体重、産卵率、感染症の有無、脱羽毛、悪臭の結果を、表１に示した。表１から明らかなように、Ａ棟（比較水準）では下痢の発生が認められ、鶏も汚れた状態であり、脱羽毛が激しく、全体的に皮膚の露呈がある。また産卵率の低下も大きかった。これは、環境によるストレスと判断される。また、生育も大きなバラツキが認められる。これに対し、Ｂ棟では、水準２以上で病気の発生は皆無であり、脱羽毛も見られず、鶏の汚れもなく美しい。更に、生育もよく産卵開始も順調で産卵率も良い。殊に、水準２、３が優れている。卵の黄身も卵殻も固い。卵殻が固くなるのは、発酵混合物に含まれるペプチドの働きによりＣａ吸収が向上した結果と考えられる。また、実験区の鶏舎内には、バエの発生は無かった。
【表１】
【００２１】
上の結果より、鶏糞中のバチルスが悪臭成分を分解資化し、未消化栄養も分解資化し、更に、腐敗菌や病原菌が抑制又は消滅していることが明らかとなった。尚、鶏糞については、実施例１に用いた平面培地に希釈培養し、位相差顕微鏡により発生したコロニーについて計測したが、バチルス・ツリンゲンシスが３×１０8 個／ｇｒ、バチルス・プミラスが５×１０8 個／ｇｒであった。これらのバチルスは、生体に危害を加えることなく、納豆菌、ビフズス菌等と同様であり、鶏の腸内細菌の構成が良くなっていた。また、発酵混合物の投与水準では、１０〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日で十分有効であることが判明した。
【００２２】
（実施例 ３） 養豚への効用の確認実験（ブドウ状球菌に対するバチルスの働き）
予備調査：
豚の場合、トンコロ病といわれるほど、豚の感染症には恐ろしいものがある。そこで、発熱と急性下痢を伴う伝染病に侵された豚舎の排泄物を採取し、その１ｇ（ウエット）を分取し、無菌水１００ｍｌで希釈して病原菌種菌として希釈培養した。これを、ブロス０．８％、グルコース０．８％、食塩０．６％、寒天１．５％の平面培地に植菌して比較水準とし、更に、その上に実施例１で用いた発酵混合物上澄液、並びに発酵混合物溶液を塗布した後、３９℃、３日間無菌箱内で培養した。次いで、発生したコロニーにつき、その特徴毎に分類しながら、位相差顕微鏡で観察した。
【００２３】
その結果を、表２に示す。これは、発酵混合物に含まれる代謝産物がブドウ状球菌に極めて有効であり、植菌されたバチルスはブドウ状球菌を溶菌したり増殖を抑制する。また、豚舎内の排泄物には連鎖状球菌も認められたが、発酵混合物上澄液塗布水準及び発酵混合物溶液塗布水準では、連鎖状球菌も認められなかった。
【表２】
【００２４】
（実施例 ４） 養豚への効用の確認実験
試験方法：
面積３０ｍ2 のケージ４個を用意し、それぞれのケージに生後２ケ月の子豚を１０頭ずつ入れた。まず、Ｎｏ．１のケージは従来水準ケージとし、通常の配合飼料を、毎日３ケ月間与えた。Ｎｏ．２ケージの子豚には、発酵混合物１０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を毎日３ケ月間与えた。同様に、Ｎｏ．３ケージの子豚には発酵混合物２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を、Ｎｏ．４ケージの子豚には発酵混合物５０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を３ケ月間毎日与えた。
【００２５】
試験結果：
実験結果を表３に示すが、まず、発酵混合物投与水準では感染症の発生は皆無であり、豚の成長もよい。また、ストレスによる尾の噛切りも同様にゼロであった。更に、豚舎にハエの発生することもなく、良好な養豚環境になった。更に、各ケージ毎に排泄物の細菌検査を希釈培養により分析した結果、Ｎｏ．１の比較水準では腸ビブルス菌が確認されたが、反面バチルス属細菌は３×１０3 に止まった。Ｎｏ．２以下は全て腸ビブルス菌は認められず、逆にバチルス属細菌はバチルス・ツリンゲンシスが８×１０8 個／ｇｒ、バチルス・プミラスが１７×１０8 個／ｇｒが検出された。更に、発酵混合物投与中止後の２ケ月にわたり観察を続けたが、感染症の発生は認められなかった。これは、免疫の向上を意味するものである。
【表３】
【００２６】
（実施例 ５） 発酵混合物の有効成分の抽出
発酵混合物に希エチルアルコール又は水を加え、超音波或いは浸透拡販して有効成分であるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を溶解抽出する。これを、遠心分離法または膜濾過法等により固液分離し、液中に溶解ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を、そのまま或いは低温で蒸発乾固して粉状として動植物に直接投与したり、或いは飼料に混合して与えたり、或いは、植物の細菌性の病気や害虫駆除に、動植物の皮膚病等外患部に直接噴霧して治癒する。
【００２７】
本実施例では、三次工程処理発酵混合物、消化工程処理発酵混合物をそれぞれ１００ｇを秤量し、エチルアルコール（１：３）５００ｍｌを加えて、超音波（５０ＫＨｚ）に入れ、１５分間溶出する。溶出液は、別のビーカーに保存し、再度エチルアルコール１００ｍｌと蒸留水１００ｍｌを加え、再び超音波槽で溶出する。さらに、同様の操作を繰り返し、蒸留水で洗浄して全量を１リットルとした。この溶出液を遠心分離（１０００Ｇ×１５分）にかけて固液分離し、上部の溶出液を得た。
【００２８】
次いで、この溶出液１００ｍｌを蒸発皿にとり、４５℃の恒温槽内で乾燥し、ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や発酵混合物を蒸発残渣として定量した。その結果、
三次工程処理 ６．９０％
消化工程処理 ８．３６％
であった。
このように、発酵混合物中にはポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物が高濃度に含有されていた。また、溶出液は透明度が高く、沈澱物や浮遊物を含まないが、酸を滴下して酸性にすると、タンパク質は速やかに凝固して沈澱を生じた。しかし、沈澱を形成したタンパク質は比較的にみて分子量の大きなものに限られ、分子量の小さなものは沈澱を形成していないことが想定されたが、溶出液中にタンパク質が溶解していることを確認できた。尚、分子量の小さなペプチドは溶解状態にあると考えられた。
【００２９】
（実施例 ６） 溶出成分投与による鶏の健康維持と悪臭の追放
実施例１において、発酵混合物有効成分がサルモネラ菌を滅菌することが確認されたことから、発酵混合物の有効成分が病原菌を滅菌する作用を有することが明らかとなり、その作用を利用して動植物の細菌性疾病を予防したり、治癒することが考えられた。そこで、薩摩地鶏４０００羽の大形鶏舎において、希釈溶出液による鶏の健康維持と鶏舎につきものの悪臭（腐敗菌による）の改善を行なった。
【００３０】
即ち、鶏舎内ケージ列ごとに５水準を設定し、幼鶏の飼育開始より３ケ月にわたり、飲料水として与えた。水準は、比較水準（水道水）、実験１（発酵混合物０．５ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験２（発酵混合物１ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験３（発酵混合物３ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験４（発酵混合物５ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）である。各水準飲料水中の溶出成分濃度は、比較水準が０ｐｐｍ、実験１が３８ｐｐｍ、実験２が７５ｐｐｍ、実験３が２２５ｐｐｍ、実験４が３７５ｐｐｍであった。また、比較水準区と実験水準区の仕切りは、ビニールシートで隔壁を設置した。
【００３１】
本実験の結果は、表４に示す通りであり、発酵混合物の溶出成分（ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物）が病気の発生を予防したり、ハエ等の害虫を駆除して幼鶏の健康を維持することが明らかとなった。また、鶏舎内外に及ぶ悪臭についても、比較水準区では激しいものがあり、防護マスクと防護メガネなしに立ち入ることはできなかった。更に、ハエの大発生が常に進行しており、このような劣悪な環境で飼育される鶏には大きな危険が内在していると言える。これに対し、実験区では全ての水準でハエや悪臭の発生がなく、鶏の健康状態も常に良好であった。実験結果より、溶出成分３８ｐｐｍ以上を含有する飲料水を与えることにより、高い効果を発現することが確認された。尚、比較水準の幼鶏には、飼育に際して予防接種を行なった。
【表４】
【００３２】
（実施例 ７） 溶出成分投与による豚の防疫
面積３０ｍ2 のケージを４個用意した。各ケージには、表５の通り平均体重１０．５ｋｇの子豚を投入し、６０日間飼育テストを行なった。尚、溶出成分投与は、予め発酵混合物１０ｋｇを１００リットルの水に溶出し、その上澄み水をタンクに保存しておき、実験水準区には飼料に投入して毎日投与した。また、溶出液中には、溶出成分６．９ｇ／リットルを含有していた。
【００３３】
結果は、表５に示す通りであり、微量の溶出成分を毎日投与することにより、感染症の予防、免疫の向上が認められた。他方、比較水準では、豚のストレスによるものと思われる挙動が激しくなり、食欲の減退〜昂進の変動、豚同士の争い、騒鳴度の高まり、下痢症状の発生と抗生物質投与の繰り返し、成育のバラツキ、等が認められた。実験区では過密飼育ストレスも認められなかったことより、溶出成分中には抗ストレス作用があることも判明した。また、豚の屎尿中に、比較水準では連鎖状球菌が検出されたが、実験区では検出されなかった（希釈培養１０2 ）。尚、実験区では、豚舎の悪臭も大きく改善された。
【表５】
【００３４】
（実施例 ８） 溶出成分散布による植物害虫の駆除と防除
実施例７で使用した溶出液を水で１０倍に希釈し、噴霧器により植物に散布して病害虫や病原菌を駆除して健康を回復した。アブラムシやハマキムシの大発生した梅林に対して、毎朝、希釈溶出液１リットル／３．３ｍ2 の噴霧散布を７日間継続したところ、これらの害虫の明らかな衰退が認められ、さらに７日間延長して散布したところ、アブラムシ、ハマキムシとも消滅して梅の木は健康を回復した。
【００３５】
また、百日紅に貝殻虫がつき、冬期に３度にわたる石灰硫黄剤の散布を行なったが、根治せず初夏の到来とともに貝殻虫が発生するとともに炭素病も発生した。この百日紅に対して、その根本周辺に発酵混合物を埋設し、幹・枝葉部には希釈溶出液を噴霧器による散布を１５日間続けて貝殻虫、炭疽病ともに根治した。
【００３６】
野菜類では、根瘤病の定着した畠ではその消毒に焼畠や殺菌剤散布、抗生物質散布等の努力が払われるものの、これを根治することは困難である。根瘤病定着畠に対して、発酵混合物を散布し、表土を耕うん機で混合して発酵混合物を混入する。さらに、元肥（有機肥料）を施肥してキャベツ苗を作付けした。これにより、希釈溶出液を１０ｍ2 当たり１リットル／１０日の割合で噴霧器による散布を収穫まで続けたところ、根瘤病は発生しなかった。また、土壌の細菌検査を行なったが根瘤菌は消滅していた。よって、交互作付けの白菜についても消毒を行なわず作付けし、希釈溶出液の噴霧器によに散布を２回／月で行なうのみとしたが、根瘤病の発生はなかった。また、胡瓜のスリップス駆除に用いても効果的であった。
【００３７】
園芸用としては、多種類の害虫の駆除や病原菌の消毒に用いて有効であるが、一例として、ガーベラのクロカビ病で壊滅状態となっていたガーベラ群に希釈溶出液を噴霧器散布して１００％再生できた。また、薔薇の饂飩粉病、黒星病に対しても殺菌効果を発現してこれらを根治する。その他、栽培が難しいと言われるセントポーリアについても、希釈溶出液を週１回程度散布することにより、病気の発生をなくし、順調に成育させることができる。これらの諸現象は、発酵混合物中の有効成分が殺虫、殺菌のみでなく、植物の免疫を向上した結果であると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の細菌性病気の予防や治癒や害虫駆除に効果のある植物用薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、養鶏場や養豚場、牛舎等では、その効率を追求する余り、それらの家畜や家禽類は極めて限られた生活空間に押し込められて、生産の目的にのみ合致する飼育方法により生産されている。従って、それらの家畜、家禽類は、生活環境と飼育よりくる種々のストレスに悩まされ、健康状態の低下を招いたり、伝染性疾病の集団発生を見る頻度が高くなっている。更に、配合飼料原料に由来する病原菌や、化学物質による弊害や罹病、またそれらを予防する目的で添加される化学薬物による免疫低下や副作用的障害の発現がある。また、伝染性疾病に対しては各種のサルファ剤や抗生物質が投与されるのが常であり、それら薬物に対する耐性菌の出現もあり、その効果の低下と体内に残留するそれら薬物が食物を通じて人体内に摂取され、種々の弊害が危惧される。このように、家畜、家禽の生産性の低下（罹病リスク）と化学物質や抗生物質等による品質の低下は大きな損失をもたらすものであり、化学療法に依存しない防疫対策が強く望まれている。一方、植物栽培においても、農薬の消費拡大による環境汚染や食物汚染の問題が大きな社会問題になってきている。そして、無農薬栽培や有機栽培の動きも活発になってきているが、一朝一夕に切り換えることは不可能である。そこで、環境汚染や食物汚染を生起しない植物用薬剤の出現が希求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、環境汚染や食物汚染を生起しない安全な植物用薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、植物用薬剤において、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有することを特徴とするものである。また、本発明は、植物用薬剤において、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたペプチドの代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合物から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状としたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の植物用薬剤は、植物に散布して病虫害や病原菌を駆除したり、免疫を向上するのに用いて良好であり、植物の細菌性の病気を予防、治癒や、又は害虫の駆除に用いて、効果がある。
【０００６】
この優れた効果を示すのは、全て、バチルス殊にバチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラス由来のポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物の作用、或いはそれらとあいまって、バチルス自体の病原菌や腐敗菌を直接攻撃する特性による結果である。また、発酵混合物やその有効成分の投与を続けることにより、ある程度の期間は効果を持続すること可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために、バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の優先化した混合培養によるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を含有する発酵混合物、または、それらから分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物（以下、代謝物等と言う）を、動物用薬剤として飼料に添加して、豚や鶏に投与したところ、これらの家畜や家禽類が本来的に持っている様々な免疫機能が活性化されるとともにストレスが緩和され、ウイルスや細菌による感染を防御することを確認した。
【０００８】
この発酵混合物は、バチルス属細菌特にバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの両者が優占化した汚水処理汚泥や、これらが比較的高密度に含まれる腐葉土等を種菌とし、これを栄養源とともに培養槽に植菌し、曝気と栄養添加により胞子化と分解と言う増殖工程を繰り返してバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスを高密度化し、得られた汚泥を乾燥して得るものである。或いはこの汚泥を更に発酵させて菌体の細胞膜や原生動物の死骸等の有機物を分解してバチルスを更に高密度化した発酵汚泥を乾燥して得るものである。
【０００９】
この増殖工程や発酵処理中、ことに発酵処理中において、バチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスはライフ時間が短いため優占化が進行し、バチルス属細菌の殆どがこれらで占められる。そして、動物用薬剤となる物質中のバチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスの濃度は１０10〜１０12個／ｇオーダーになる。これらの汚泥中に、他のバチルス属細菌例えばバチルス・サブチリスや酵母が少量存在していてもかまわない。要は、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスが優占化しておればよい。尚、バチルス・ツリンゲンシスは菌体サイズが１．２μｍφ以上で澱粉、糖質、一部菌株でカゼインを分解資化するがグックドミートを分解できず、一方バチルス・プミラスは菌体サイズが１．１μｍφ以下でクックドミート・カゼインを分解資化し、澱粉を分解しないことから、他のバチルス属細菌と別異的に同定される。
【００１０】
即ち、本発明でいう発酵混合物とは、前記したようにバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養の結果得られた、ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を含む、発酵中間物質や発酵残渣物質、バチルス胞子などからなる混合物をいう。ここに代謝物とは、菌体の活動や胞子化、殊に胞子化に伴い分泌されるものを言い、これには抗生作用を有する環状ペプチドや一部のポリペプチドなどが含まれる。また生成物とは、栄養源の分解物や該分解物同志の反応生成物例えばアンモニア、硫化水素、アミノ酸、アミノ酸とカルボシル基を有する物質との反応により生じるポリペプチドなどが含まれる。そして、発酵混合物中に含まれているポリペプチドや環状ペプチド等を含む代謝物や生成物は、希エタノールや水等の溶媒に溶出させ、それらのみを回収して薬剤として利用できる。更に、発酵混合物には、籾殻炭等の発酵副原料やその消化物も含まれる。そして、その特徴は極めて高濃度の代謝物を含有していることにある。即ち、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスは、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化と言う増殖サイクルを繰り返し行なって優先化し、その活動や胞子化に伴い分泌される代謝物の濃度を増大させるものである。
【００１１】
バチルス・プミラスが、抗菌物質や抗生物質、生理活性物質を産生することは知られている（特公昭５７−６９１３、特公昭６１−１２９１４、特許２５６４７９）。また、バチルス・ツリンゲンシスが線虫類毒素を産生することも知られている（特開昭６４−６７１９２）。しかし、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスを混合培養すること、及び混合培養の結果、動物用の免疫賦活、感染予防、抗ストレスに著効のある物質を高濃度に産生すること、更に代謝物が相乗的に作用することは知られていない。また、バチルス・ツリンゲンシスが免疫賦活物質を産生することも知られていない。
【００１２】
一般に、バチルスは好気性ないし通性嫌気性条件と適度の温度と湿度のもとで、蛋白質、糖質、脂質、尿素・尿酸等の栄養分を、菌種に応じて分解資化して成長し、増殖条件の欠如とともに内胞子を形成し、やがて解体して胞子となる。胞子は悪環境条件にも強く、生命を維持して増殖条件の出現とともに発芽して、同様の過程を繰り返して菌密度（胞子密度）を高める。そして、菌が代謝して増殖するに際して、代謝物を産出する。
【００１３】
中でも、バチルス・ツリンゲンシスは殊に多糖類の分解性能に優れ、バチルス・プミラスは単糖類や蛋白質の分解性能に優れる。従って、この両者を混合培養した場合、栄養分解の分担が行なわれ、相互に助長し合って増殖する。そして、貧栄養状態を出現させた場合、桿菌状態や糸状体にあるバチルスは死滅するが、残存していたバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの胞子が生命を維持しており、バチルス死細胞壁や細胞質、胞子の脱け殻等に含まれる多糖類はバチルス・ツリンゲンシスが分解・資化し、分解により得られた単糖類や蛋白質はバチルス・プミラスが分解・資化し、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスが相互に助長し合って優先化していく。そして、増殖過程を繰り返した結果、これらバチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの菌体や胞子密度は１０10〜１０12個／ｇにも及ぶが、貧栄養状態（消化発酵、貧栄養下での発酵）を繰り返し出現させた場合には、休眠胞子としてその密度が１０2 〜１０4 個／ｇと自然分布状態にまで減少している。但し、この貧栄養増殖過程でも代謝物等は更に高濃度化される。
【００１４】
この発酵混合物から、溶媒を用いて代謝物等の有効成分を溶出（抽出）し、これを液状のまま或いは更に乾燥して粉状にして動物用薬剤或いは植物用薬剤を得る。溶媒としては、水か希エタノールが最も好ましい。この薬剤は、飼育動物の免疫賦活、感染予防、抗ストレス効果や、植物の細菌性病気の予防、治癒及び害虫駆除に著効がある。発酵混合物から有効成分を溶出した残りは、発酵に用いた籾殻済等の発酵副資材やその消化物、バチルス胞子などから構成されることから、土壌改良剤として用いるとよい。尚、動物体内においてバチルス・ツリンゲンシスやバチルス・プミラスが発芽して活動したり、動物に有害な影響を及ぼすことは皆無である（ＥＰＡ報告、ＷＨＯ報告等）。また、バチルス胞子はその状態で動物体内を通過するに過ぎないことも実験で確かめられている。
【００１５】
上述した動物用薬剤の対象となる動物には、豚や牛等の家畜や犬、猫等の愛玩用動物、鶏やウズラ、アヒル等の家禽や愛玩用鳥類、動物園での飼育動物などの全てが含まれる。感染症とは、豚丹毒、浮腫症、牛や豚の炭疽病、牛の結核病、鶏の雛白痢などの細菌性疾病、豚コレラ、豚の日本脳炎、牛のイバラキ病、牛流行熱、鶏のニューカッスル病などのウイルス性疾病のほか、すべてのウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染症を言う。尚、本発明の飼料は特に限定されるものではなく、家畜や家禽その他の動物の種類に応じて使用される飼料であれば、どのような飼料でも構わない。
【００１６】
これらの感染症は、病原菌やウイルスに起因することは勿論であるが、現在では過密養豚、狭いゲージ内での養鶏などの過密で劣悪な環境での飼育が常態であり、ストレスによる病原菌抵抗力や免疫の低下も大きな要因の一つである。例えば、豚ではストレスから下痢を起こしたり尻尾の噛み切りが起きるし、鶏では脱羽毛や下痢などを起こす。また、サルモネラ菌による汚染にも深刻なものがある。そのため、現状ではそれらの対策上、薬漬けの養豚、養鶏が行なわれることになる。これに対し、本発明の発酵混合物は抗ストレス効果があり、これらストレスによる現象の根絶ないし低減化が図れ、養豚、養鶏等のリスクは大きく低減する。更に、畜舎や鶏舎より発生する悪臭は近隣に対して悪臭公害をもたらし、各所において大きな社会問題をもたらしている。本発明の発酵混合物を投与すると、豚舎などかり発生する悪臭は消滅する。これは、悪臭を発生させる嫌気性菌や腐敗菌、病原菌の大部分が、バチルスやその代謝物等により駆逐されるためである。更に、この悪臭によって、ハエが大量発生し、病気の伝染を助長する機会が増えるのが常態であるが、本発明の発酵混合物は、ポリペプチドや環状ペプチド等を含む代謝物を有効成分とするため殺菌・殺虫効果を有するため、ハエの発生が防がれ、衛生的な畜舎に改善される。このように、本発明の発酵混合物は、病原菌等に起因する疾病を予防治療する以外に、抗ストレス作用や排泄物の低臭気化に効果があるものである。更に、ハエ等の害虫は激減し、鶏舎内や畜舎内に発生せず、また寄りつかなくなる。
【００１７】
発酵混合物の投与量としては、１ｍｇ〜１００ｍｇ／日・体重１ｋｇの範囲で有効であり、望ましくは５〜１５ｍｇ／日・体重１ｋｇ、更に望ましくは、８〜１３ｍｇ／日・体重１ｋｇである。発酵混合物に代えて、発酵混合物から分離・精製したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を用いると投与量は少なくてすむ。この場合、バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養〜消化発酵〜溶出分離したポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を、動物の体重１ｋｇ当たり１日量として０．０４〜５ｍｇを飼料に混合して投与することが最も望ましい。投与は、直接与えるほか飲み水に混入したり飼料や嗜好品に配合するなどして行なわれるが、飼料等に配合するのが一般的である。投与は毎日連続して行なうことが望ましいが、７日サイクル以内での間断投与する方法もある。尚、バチルスは乾燥状態（水分３０％以下）では発芽せず胞子状態を保つ。また、動物体内では消化器系を通過するのみであり、代謝物の優れた働きにより病原菌を攻撃したり高い整腸作用を発現し、動物の健康の維持、増進、更に感染症の予防と治療、抗ストレス能の向上に有効である。本発明は、この薬剤を植物に適用したものであり、植物の防疫や害虫予防・駆除には、代謝物等を２０〜５００ｍｇ／リットル含有する水溶液を作成し、散布すると有効である。
【実施例】
【００１８】
（実施例 １） 発酵混合物が病原菌を抑制したり滅菌する作用の確認
試験方法：ａ大腸菌（Ｏ１５７菌株）、ｂサルモネラ菌を白金耳で採取し、それぞれ平面培地に植菌し、３９℃で３日間無菌恒温箱内で培養した。これを、比較水準とする。これと並行して、
（１）ａ’：大腸菌平面培地上に更に発酵混合物溶液（発酵混合物０．５ｇ／無菌水１０ｍｌをホモナジナイザーで均一混合したもの）０．１ｍｌを分取して塗布する。３９℃で３日間無菌箱内で培養した。
（２）ｂ’：サルモネラ菌平面培地上に、更に発酵混合物溶液０．１ｍｌを分取して塗布し、３９℃で３日間無菌箱内で培養した。
（３）ａ''：大腸菌平面培地上に、発酵混合物上澄液（発酵混合物溶液を、６０００ｃ／ｓで１５分間遠心分離したものの上澄み液（菌の代謝生産物のみを含む）を０．１ｍｌ分取して塗布し、同様に培養した。
（４）ｂ''：サルモネラ菌平面培地上に、発酵混合物上澄液を０．１ｍｌ分取して塗布し、同様に培養した。尚、ここに平面培地とは、グルコース０．８％、ニュートリエントブロス０．８％、食塩０．６％、寒天１．５％で作成した。
試験結果：
（１） ａ及びｂは、それぞれ大腸菌、サルモネラ菌のコロニーが大発生し、平面培地全面を覆った。
（２） ａ’及びｂ’は、それぞれ発酵混合物溶液を塗布した面に大腸菌、サルモネラ菌のコロニーは増殖せず、逆にバチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラスのコロニーが大発生した。
（３） ａ''及びｂ''は、それぞれ発酵混合物上澄液を塗布した部分にのみ、大腸菌、サルモネラ菌のコロニーの発生がなく、その他の残余面では、それぞれ大腸菌、サルモネラ菌のコロニーが大増殖した。
上の結果は、（２）において、バチルス・ツリンゲンシス及びバチルス・プミラスがその代謝産物の作用と併せて、大腸菌、サルモネラ菌を溶菌し、更にそれらも栄養として消化して増殖したことを示し、更に、（３）において、バチルス・ツリンゲンシス、バチルス・プミラスの代謝産物が、大腸菌、サルモネラ菌を抑制又は溶菌する作用を有することを示している。
【００１９】
（実施例 ２） 発酵混合物が病原菌を抑制したり滅菌する作用の確認
試験方法：
大規模養鶏場内で、遊休中の古い小型鶏舎２棟（各１２００羽）を用いて、適正な発酵混合物投与水準を求めるとともに、その効果の確認を行なった。まず、Ａ棟の幼鶏１２００羽（白色レグホン）は、従来通りの養鶏を行ない、これを比較水準とした。Ｂ棟の幼鶏１２００羽（白色レグホン）には、配合飼料に発酵混合物（バチルス・ツリンゲンシスとバチルス・プミラスの混合培養）を配合して与えた。投与量は、下記水準１〜水準６の通りである。実験期間は、Ａ、Ｂとも１８ケ月である。
水準１：発酵混合物 １ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準２：発酵混合物 １０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準３：発酵混合物 ２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準４：発酵混合物 ３０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準５：発酵混合物 ５０ｍｇ／体重１ｋｇ・日
水準６：発酵混合物 １００ｍｇ／体重１ｋｇ・日
【００２０】
試験結果：
本発明の各水準及び比較水準における平均体重、産卵率、感染症の有無、脱羽毛、悪臭の結果を、表１に示した。表１から明らかなように、Ａ棟（比較水準）では下痢の発生が認められ、鶏も汚れた状態であり、脱羽毛が激しく、全体的に皮膚の露呈がある。また産卵率の低下も大きかった。これは、環境によるストレスと判断される。また、生育も大きなバラツキが認められる。これに対し、Ｂ棟では、水準２以上で病気の発生は皆無であり、脱羽毛も見られず、鶏の汚れもなく美しい。更に、生育もよく産卵開始も順調で産卵率も良い。殊に、水準２、３が優れている。卵の黄身も卵殻も固い。卵殻が固くなるのは、発酵混合物に含まれるペプチドの働きによりＣａ吸収が向上した結果と考えられる。また、実験区の鶏舎内には、バエの発生は無かった。
【表１】
【００２１】
上の結果より、鶏糞中のバチルスが悪臭成分を分解資化し、未消化栄養も分解資化し、更に、腐敗菌や病原菌が抑制又は消滅していることが明らかとなった。尚、鶏糞については、実施例１に用いた平面培地に希釈培養し、位相差顕微鏡により発生したコロニーについて計測したが、バチルス・ツリンゲンシスが３×１０8 個／ｇｒ、バチルス・プミラスが５×１０8 個／ｇｒであった。これらのバチルスは、生体に危害を加えることなく、納豆菌、ビフズス菌等と同様であり、鶏の腸内細菌の構成が良くなっていた。また、発酵混合物の投与水準では、１０〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日で十分有効であることが判明した。
【００２２】
（実施例 ３） 養豚への効用の確認実験（ブドウ状球菌に対するバチルスの働き）
予備調査：
豚の場合、トンコロ病といわれるほど、豚の感染症には恐ろしいものがある。そこで、発熱と急性下痢を伴う伝染病に侵された豚舎の排泄物を採取し、その１ｇ（ウエット）を分取し、無菌水１００ｍｌで希釈して病原菌種菌として希釈培養した。これを、ブロス０．８％、グルコース０．８％、食塩０．６％、寒天１．５％の平面培地に植菌して比較水準とし、更に、その上に実施例１で用いた発酵混合物上澄液、並びに発酵混合物溶液を塗布した後、３９℃、３日間無菌箱内で培養した。次いで、発生したコロニーにつき、その特徴毎に分類しながら、位相差顕微鏡で観察した。
【００２３】
その結果を、表２に示す。これは、発酵混合物に含まれる代謝産物がブドウ状球菌に極めて有効であり、植菌されたバチルスはブドウ状球菌を溶菌したり増殖を抑制する。また、豚舎内の排泄物には連鎖状球菌も認められたが、発酵混合物上澄液塗布水準及び発酵混合物溶液塗布水準では、連鎖状球菌も認められなかった。
【表２】
【００２４】
（実施例 ４） 養豚への効用の確認実験
試験方法：
面積３０ｍ2 のケージ４個を用意し、それぞれのケージに生後２ケ月の子豚を１０頭ずつ入れた。まず、Ｎｏ．１のケージは従来水準ケージとし、通常の配合飼料を、毎日３ケ月間与えた。Ｎｏ．２ケージの子豚には、発酵混合物１０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を毎日３ケ月間与えた。同様に、Ｎｏ．３ケージの子豚には発酵混合物２０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を、Ｎｏ．４ケージの子豚には発酵混合物５０ｍｇ／体重１ｋｇ・日の割合で添加した配合飼料を３ケ月間毎日与えた。
【００２５】
試験結果：
実験結果を表３に示すが、まず、発酵混合物投与水準では感染症の発生は皆無であり、豚の成長もよい。また、ストレスによる尾の噛切りも同様にゼロであった。更に、豚舎にハエの発生することもなく、良好な養豚環境になった。更に、各ケージ毎に排泄物の細菌検査を希釈培養により分析した結果、Ｎｏ．１の比較水準では腸ビブルス菌が確認されたが、反面バチルス属細菌は３×１０3 に止まった。Ｎｏ．２以下は全て腸ビブルス菌は認められず、逆にバチルス属細菌はバチルス・ツリンゲンシスが８×１０8 個／ｇｒ、バチルス・プミラスが１７×１０8 個／ｇｒが検出された。更に、発酵混合物投与中止後の２ケ月にわたり観察を続けたが、感染症の発生は認められなかった。これは、免疫の向上を意味するものである。
【表３】
【００２６】
（実施例 ５） 発酵混合物の有効成分の抽出
発酵混合物に希エチルアルコール又は水を加え、超音波或いは浸透拡販して有効成分であるポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を溶解抽出する。これを、遠心分離法または膜濾過法等により固液分離し、液中に溶解ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を、そのまま或いは低温で蒸発乾固して粉状として動植物に直接投与したり、或いは飼料に混合して与えたり、或いは、植物の細菌性の病気や害虫駆除に、動植物の皮膚病等外患部に直接噴霧して治癒する。
【００２７】
本実施例では、三次工程処理発酵混合物、消化工程処理発酵混合物をそれぞれ１００ｇを秤量し、エチルアルコール（１：３）５００ｍｌを加えて、超音波（５０ＫＨｚ）に入れ、１５分間溶出する。溶出液は、別のビーカーに保存し、再度エチルアルコール１００ｍｌと蒸留水１００ｍｌを加え、再び超音波槽で溶出する。さらに、同様の操作を繰り返し、蒸留水で洗浄して全量を１リットルとした。この溶出液を遠心分離（１０００Ｇ×１５分）にかけて固液分離し、上部の溶出液を得た。
【００２８】
次いで、この溶出液１００ｍｌを蒸発皿にとり、４５℃の恒温槽内で乾燥し、ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や発酵混合物を蒸発残渣として定量した。その結果、
三次工程処理 ６．９０％
消化工程処理 ８．３６％
であった。
このように、発酵混合物中にはポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物が高濃度に含有されていた。また、溶出液は透明度が高く、沈澱物や浮遊物を含まないが、酸を滴下して酸性にすると、タンパク質は速やかに凝固して沈澱を生じた。しかし、沈澱を形成したタンパク質は比較的にみて分子量の大きなものに限られ、分子量の小さなものは沈澱を形成していないことが想定されたが、溶出液中にタンパク質が溶解していることを確認できた。尚、分子量の小さなペプチドは溶解状態にあると考えられた。
【００２９】
（実施例 ６） 溶出成分投与による鶏の健康維持と悪臭の追放
実施例１において、発酵混合物有効成分がサルモネラ菌を滅菌することが確認されたことから、発酵混合物の有効成分が病原菌を滅菌する作用を有することが明らかとなり、その作用を利用して動植物の細菌性疾病を予防したり、治癒することが考えられた。そこで、薩摩地鶏４０００羽の大形鶏舎において、希釈溶出液による鶏の健康維持と鶏舎につきものの悪臭（腐敗菌による）の改善を行なった。
【００３０】
即ち、鶏舎内ケージ列ごとに５水準を設定し、幼鶏の飼育開始より３ケ月にわたり、飲料水として与えた。水準は、比較水準（水道水）、実験１（発酵混合物０．５ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験２（発酵混合物１ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験３（発酵混合物３ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）、実験４（発酵混合物５ｋｇ／ｍ3 で溶出した上澄み液）である。各水準飲料水中の溶出成分濃度は、比較水準が０ｐｐｍ、実験１が３８ｐｐｍ、実験２が７５ｐｐｍ、実験３が２２５ｐｐｍ、実験４が３７５ｐｐｍであった。また、比較水準区と実験水準区の仕切りは、ビニールシートで隔壁を設置した。
【００３１】
本実験の結果は、表４に示す通りであり、発酵混合物の溶出成分（ポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物）が病気の発生を予防したり、ハエ等の害虫を駆除して幼鶏の健康を維持することが明らかとなった。また、鶏舎内外に及ぶ悪臭についても、比較水準区では激しいものがあり、防護マスクと防護メガネなしに立ち入ることはできなかった。更に、ハエの大発生が常に進行しており、このような劣悪な環境で飼育される鶏には大きな危険が内在していると言える。これに対し、実験区では全ての水準でハエや悪臭の発生がなく、鶏の健康状態も常に良好であった。実験結果より、溶出成分３８ｐｐｍ以上を含有する飲料水を与えることにより、高い効果を発現することが確認された。尚、比較水準の幼鶏には、飼育に際して予防接種を行なった。
【表４】
【００３２】
（実施例 ７） 溶出成分投与による豚の防疫
面積３０ｍ2 のケージを４個用意した。各ケージには、表５の通り平均体重１０．５ｋｇの子豚を投入し、６０日間飼育テストを行なった。尚、溶出成分投与は、予め発酵混合物１０ｋｇを１００リットルの水に溶出し、その上澄み水をタンクに保存しておき、実験水準区には飼料に投入して毎日投与した。また、溶出液中には、溶出成分６．９ｇ／リットルを含有していた。
【００３３】
結果は、表５に示す通りであり、微量の溶出成分を毎日投与することにより、感染症の予防、免疫の向上が認められた。他方、比較水準では、豚のストレスによるものと思われる挙動が激しくなり、食欲の減退〜昂進の変動、豚同士の争い、騒鳴度の高まり、下痢症状の発生と抗生物質投与の繰り返し、成育のバラツキ、等が認められた。実験区では過密飼育ストレスも認められなかったことより、溶出成分中には抗ストレス作用があることも判明した。また、豚の屎尿中に、比較水準では連鎖状球菌が検出されたが、実験区では検出されなかった（希釈培養１０2 ）。尚、実験区では、豚舎の悪臭も大きく改善された。
【表５】
【００３４】
（実施例 ８） 溶出成分散布による植物害虫の駆除と防除
実施例７で使用した溶出液を水で１０倍に希釈し、噴霧器により植物に散布して病害虫や病原菌を駆除して健康を回復した。アブラムシやハマキムシの大発生した梅林に対して、毎朝、希釈溶出液１リットル／３．３ｍ2 の噴霧散布を７日間継続したところ、これらの害虫の明らかな衰退が認められ、さらに７日間延長して散布したところ、アブラムシ、ハマキムシとも消滅して梅の木は健康を回復した。
【００３５】
また、百日紅に貝殻虫がつき、冬期に３度にわたる石灰硫黄剤の散布を行なったが、根治せず初夏の到来とともに貝殻虫が発生するとともに炭素病も発生した。この百日紅に対して、その根本周辺に発酵混合物を埋設し、幹・枝葉部には希釈溶出液を噴霧器による散布を１５日間続けて貝殻虫、炭疽病ともに根治した。
【００３６】
野菜類では、根瘤病の定着した畠ではその消毒に焼畠や殺菌剤散布、抗生物質散布等の努力が払われるものの、これを根治することは困難である。根瘤病定着畠に対して、発酵混合物を散布し、表土を耕うん機で混合して発酵混合物を混入する。さらに、元肥（有機肥料）を施肥してキャベツ苗を作付けした。これにより、希釈溶出液を１０ｍ2 当たり１リットル／１０日の割合で噴霧器による散布を収穫まで続けたところ、根瘤病は発生しなかった。また、土壌の細菌検査を行なったが根瘤菌は消滅していた。よって、交互作付けの白菜についても消毒を行なわず作付けし、希釈溶出液の噴霧器によに散布を２回／月で行なうのみとしたが、根瘤病の発生はなかった。また、胡瓜のスリップス駆除に用いても効果的であった。
【００３７】
園芸用としては、多種類の害虫の駆除や病原菌の消毒に用いて有効であるが、一例として、ガーベラのクロカビ病で壊滅状態となっていたガーベラ群に希釈溶出液を噴霧器散布して１００％再生できた。また、薔薇の饂飩粉病、黒星病に対しても殺菌効果を発現してこれらを根治する。その他、栽培が難しいと言われるセントポーリアについても、希釈溶出液を週１回程度散布することにより、病気の発生をなくし、順調に成育させることができる。これらの諸現象は、発酵混合物中の有効成分が殺虫、殺菌のみでなく、植物の免疫を向上した結果であると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する植物用薬剤。
【請求項２】
バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合物から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状とした植物用薬剤。
【請求項１】
バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する植物用薬剤。
【請求項２】
バチルス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringensis ）とバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）の混合培養によって得られたポリペプチドや環状ペプチドを含む代謝物や生成物を有効成分として含有する発酵混合物から、溶媒を用いて前記代謝物や前記生成物を溶出させて液状とするか、或いは溶媒を除去して粉末状とした植物用薬剤。
【公開番号】特開２００７−１３７８８８（Ｐ２００７−１３７８８８Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４５６２２（Ｐ２００６−３４５６２２）
【出願日】平成１８年１２月２２日（２００６．１２．２２）
【分割の表示】特願平１０−３６６１２３の分割
【原出願日】平成１０年１２月７日（１９９８．１２．７）
【出願人】（０００１０５３５０）コーア株式会社 (201)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２２日（２００６．１２．２２）
【分割の表示】特願平１０−３６６１２３の分割
【原出願日】平成１０年１２月７日（１９９８．１２．７）
【出願人】（０００１０５３５０）コーア株式会社 (201)
【Ｆターム（参考）】
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