検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
【課題】蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法において、より高感度かつ定量性の高い検出を可能とする。
【解決手段】蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法において、蛍光標識として、蛍光色素分子１５を、この蛍光色素分子１５から生じる蛍光Ｌｆを透過させる透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いる。そして、蛍光物質Ｆを光導波モードの染み出しによるエバネッセント波Ｅｗによって励起する。
【解決手段】蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法において、蛍光標識として、蛍光色素分子１５を、この蛍光色素分子１５から生じる蛍光Ｌｆを透過させる透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いる。そして、蛍光物質Ｆを光導波モードの染み出しによるエバネッセント波Ｅｗによって励起する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものであり、特に詳細には光導波モードを利用した検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。
【０００４】
また、非特許文献１に示すように、金属層のプラズモンによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより１ｐＭを切るような高感度検出が可能である蛍光法、いわゆる表面プラズモン電場増強蛍光分光法（ＳＰＦ）も報告されている。
【０００５】
さらに、非特許文献２に示すように、エバネッセント波の染み出し長の長い光導波モードによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより、高感度検出が可能であるという報告もされている。
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【非特許文献２】坪井一真、外２名、「光導波モード増強蛍光観察を用いたカテコールアミンの高感度検出」、第５４回応用物理学関係連合講演会講演予稿集、応用物理学会、２００７年、ｐ．１３７８（２８ｐ−ＳＡ−４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、一般的にさらなるＳ／Ｎ比の向上が望まれており、ノイズの低減のみではなく、蛍光強度の増幅も必要とされている。
【０００７】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、より高感度かつ定量性の高い検出を可能とする検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による検出方法は、
誘電体プレートの一面に、金属層と光導波層とをこの順に有するセンサチップを用意し、
光導波層上に被検出物質および蛍光標識物質を含む試料を接触させると共に、
誘電体プレートと金属層との界面に対し、誘電体プレート側から全反射条件を満たすように励起光を入射して、この界面に第１のエバネッセント波を発生せしめ、
第１のエバネッセント波を、光導波層内で光導波モードと結合させることにより、光導波層の上面に第２のエバネッセント波を発生せしめ、
第２のエバネッセント波により、蛍光標識物質の蛍光標識を励起し、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する方法であって、
蛍光標識として、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させる透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とするものである。
【０００９】
ここで、「蛍光標識物質」は、蛍光標識が付与された被検出物質であってもよいし、蛍光標識が付与された、被検出物質と競合する競合物質であってもよい。すなわち、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識が付与された被検出物質のことを意味し、競合法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識が付与された、被検出物質と競合する競合物質のことを意味するものとする。本発明の検出方法は、サンドイッチ法、競合法のいずれの方法によるアッセイにも対応可能である。
【００１０】
「蛍光標識の励起に起因して生じる光」とは、蛍光標識が励起することにより直接的または間接的に生じる光であって、その光の発生量と励起した蛍光標識の数量との間に相関性を有するものを意味するものとする。
【００１１】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み定性的な量のみならず、定量的な量を検出することも意味するものとする。
【００１２】
また、蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００１３】
本発明による検出方法において、蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることがより好ましい。なお、本明細書において、蛍光物質の粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
【００１４】
また、蛍光物質の表面に上記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００１５】
そして、光導波層は、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【００１６】
さらに、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出することが好ましく、或いは、励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することにより上記界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出することが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明による検出用試料セルは、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、このプレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、
光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
センサチップ部より上流側の流路内に固定された、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１８】
さらに、本発明による検出用キットは、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、このプレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、流路内に流下される標識用溶液であって、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質を含む標識用溶液とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１９】
なお、本発明による検出用試料セルおよび検出用キットにおいて、第２の結合物質が修飾された蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２０】
ここで、「蛍光物質」は、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなるものである。
【００２１】
また、蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００２２】
本発明による検出用試料セルおよび検出用キットにおいて、蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることがより好ましい。
【００２３】
また、蛍光物質の表面に上記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００２４】
そして、光導波層は、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明による検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットでは、蛍光物質の励起に光導波モードを利用した光導波モード増強蛍光分光法（ｏｐｔｉｃａｌ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｏｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＯＷＦ）を用いる。より具体的には、蛍光物質の励起を、従来ＳＰＦで用いられていた励起光の全反射によって生じるエバネッセント波（第１のエバネッセント波）ではなく、光導波モードの染み出しによるエバネッセント波（第２のエバネッセント波）によって行う。この第２のエバネッセント波は、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長（検出面表面における電場増強度が１／ｅになるまでの長さ）が長いという特徴を有する。
【００２６】
この結果、染み出し長の長い第２のエバネッセント波を最大限利用して、蛍光物質内の蛍光色素分子を効率よく励起することができ、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２８】
本発明は、光導波モードを利用する。そこで図１を用いて、光導波モードおよびこの光導波モードを利用したＯＷＦについてまず簡単に説明する。
【００２９】
なお、光導波モードとは、ある有限の空間内に光が閉じこめられて伝搬していく状態のことで、誘電体等の光導波路内の多重反射に基づくものである。最も良く知られている光導波モードとしては光ファイバ内の光の伝搬状態が挙げられる。光ファイバは、屈折率が低いファイバ状(通常非常に細長い円筒型)の材料の中心に屈折率の高い部位(通常、コアと呼ばれる)を形成し、この屈折率差によって生じる光の反射によって、光をコア中に閉じ込めて伝搬させる。屈折率の低い物質(空気や真空状態も含む)に挟まれた板状の材料中を光が伝搬するスラブ型光導波路も良く知られている。
【００３０】
図１に、ＯＷＦにおいて光導波モードを発現するためのセンサチップの例を示す。このセンサチップ３は、誘電体プリズム１１、および誘電体プリズム１１の上面に順に設けられた金属層１２ａと光導波層１２ｂとからなる。このとき、光導波層１２ｂの上側(表面側)が、光導波層１２ｂよりも屈折率の低い物質（例えば空気や水）に触れている場合、光導波層１２ｂはスラブ型光導波路と似た構造となる。そして、このような光導波層１２ｂに光が閉じ込められて伝搬する状態が、本発明における光導波モードとなる。
【００３１】
このセンサチップ３に、ＳＰＦで用いる光学系と同様の光学系を用いて入射光Ｌｏを照射することにより、入射光Ｌｏの全反射によって生じるエバネッセント波（第１のエバネッセント波）が光導波層１２ｂ内で多重反射を起こし光導波モードとなる。そして、この光導波モードの染み出しによるエバネッセント波（第２のエバネッセント波）が光導波層１２ｂ上に生じることとなる。
【００３２】
すなわち、誘電体プリズム１１と金属層１２ａとの界面に対し全反射条件を満たすように誘電体プリズム１１側から入射された入射光Ｌｏは、誘電体プリズム１１を透過しこの界面で全反射して、光導波層１２ｂ側に第１のエバネセント波を生じせしめる。この第１のエバネセント波を生じせしめた状態で入射光Ｌｏの入射角度を変化させると、ある特定の入射角度で第１のエバネセント波が光導波層１２ｂ内を伝搬するようになる。このような状態を、「第１のエバネセント波が光導波モードと結合する」、或いは「光導波モードが誘起される」と表現する。第１のエバネセント波が光導波モードと結合すると、第１のエバネセント波の一部又は全部が、光導波層１２ｂ内を伝搬すると共にその中に閉じ込められる。そして、その閉じ込められた光の一部が光導波層１２ｂの外部に染み出して、前述した第２のエバネッセント波となるのである。
【００３３】
ＯＷＦでは、上記のように発生した第２のエバネッセント波を用いて、光導波層１２ｂ上の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識を励起し、この蛍光標識の励起に起因して生じる蛍光を検出し、検出された蛍光量に基づいて被検出物質の量を検出する。
【００３４】
なお、光導波モードは必ずしも１つではなく、入射光Ｌｏの波長、光導波層１２ｂの層厚および屈折率等の条件により、特定の入射角度の異なる位置に複数の光導波モードを有する場合がある。図１には、ＴＥ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ）モードにおける、０次（基準）の光導波モード（ＴＥ０）、１次の光導波モード（ＴＥ１）、２次の光導波モード（ＴＥ２）のｙ成分電場の状態も概念的に示している。なお、併せてＳＰＲによる電場の状態も概念的に示している
この特定の入射角度は、反射光（全反射した入射光Ｌｏ）をモニタリングすることにより確認することができる。これは、第１のエバネセント波が光導波モードと結合するときに、反射光が急激に増減するためである。
【００３５】
例えば図２は、ｐ偏光入射光の入射角度と反射光の反射率の関係を示した概念図である。図２には、４カ所の反射率の鋭い減少（ディップ）が見られる（θｃは臨界角）。このような反射率のディップの原因は主に２つある。
【００３６】
１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に起因するものであり、図２のθｒの入射角度で生じる反射率のディップがこれに対応する。ＳＰＲは、負の誘電率を持つ金属、特にＡｕ、Ａｇ等の貴金属などを金属層として用いた場合に生じる現象であり、光導波層が無くても生じる現象である。
【００３７】
そしてもう１つが、光導波モードに起因するものであり、図２のθ０、θ１、θ２の入射角度で生じる反射率のディップがこれに対応する。この反射率のディップは、図１に示す光導波層が無い場合や光導波層が薄い場合には生じない。光導波モードが発生する光導波層の最低の厚さは、入射光の波長や偏光状態、そして光導波層の屈折率等によって異なる。一般的に光導波層の屈折率が大きければ薄くても良く、入射光の波長が短い場合も薄くて良い。一方、光導波層の屈折率が小さい場合や入射光の波長が長い場合は、厚い光導波層が要求される。
【００３８】
上記のように、このＳＰＲと光導波モードは同様の光学系で観測することができるが、一般的にＳＰＲが生じる角度と、第１のエバネセント波が光導波モードと結合する角度とは異なる。またＳＰＲに起因する反射率の増減は、一般的に入射光がｐ偏光の場合のみに生じる現象であるが、光導波モードに起因する反射率の増減は、ｐ偏光およびｓ偏光の両方の場合で生じる。さらに、一般的に反射率の増減が光導波モードに起因する場合は、光導波層の層厚が厚いほど特定の入射角度の異なる位置により多くの光導波モード（高次の光導波モード）が生じうる点、ｓ偏光入射光では逆に鋭く増加する（上に凸のピークを有する）点も特徴である。
【００３９】
また、第２のエバネッセント波は、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長が長いという特徴を有する。そして、高次の光導波モードほど光の閉じ込め効果が小さくなり染み出し長が長くなる。
【００４０】
＜第１の実施形態＞
以上を踏まえ図面を参照して、本発明の第１の実施形態に係る検出方法およびそれに用いられる蛍光検出装置について説明する。図３Ａは装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００４１】
本実施形態に係る検出方法は、誘電体プレート１１の一面に、金属層１２ａと光導波層１２ｂとをこの順に有するセンサチップ１０を用意し、光導波層１２ｂ上に被検出物質Ａおよび蛍光標識物質を含む試料を接触させると共に、誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対し、誘電体プレート１１側から全反射条件を満たすように励起光Ｌｏを入射して、この界面に第１のエバネッセント波（図示省略）を発生せしめ、第１のエバネッセント波を、光導波層１２ｂ内で光導波モードと結合させることにより、光導波層１２ｂの上面に第２のエバネッセント波Ｅｗを発生せしめ、第２のエバネッセント波Ｅｗにより、蛍光標識物質の蛍光物質Ｆを励起し、蛍光物質Ｆの励起により生じる蛍光を検出し、検出された蛍光量に基づいて被検出物質の量を検出するものである。
【００４２】
そして、上記の検出方法を実施する本実施形態に係る蛍光検出装置１は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に順に設けられた金属層１２ａおよび光導波層１２ｂとを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面で全反射条件となる入射角度で、誘電体プレート１１通して励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、光導波層１２ｂに接触している試料Ｓ中に蛍光物質Ｆが付与された被検出物質が存在する場合に、この蛍光物質Ｆから生じる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００４３】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面から上記界面にて励起光Ｌｏが全反射角以上で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、第１のエバネッセント波を効果的に誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射する。
【００４４】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に順に金属層１２ａおよび光導波層１２ｂが成膜されたものである。
【００４５】
金属層１２ａは、所定領域に開口を有するマスクを誘電体プレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法やスパッタ法等で成膜形成することができる。金属層１２ａの層厚は、金属層１２ａの材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属層１２ａとしてＡｕ膜を用いる場合には、金属層１２ａの層厚は４０ｎｍ±３０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４０ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属層１２ａは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。ここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００４６】
光導波層１２ｂは、金属層１２ａ上に形成されるものであり、金属層１２ａと同様の方法により形成することができる。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとしてシリコン酸化膜を用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。そして、光導波層１２ｂは、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。上記光導波材料としては、ＳｉＯ２ 、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマー等が挙げられる。このような積層構造とすることにより、第２のエバネッセント波Ｅｗの染み出し長を制御することができる。さらに、内部光導波層が金属層１２ａおよび内部金属層に挟まれた構造（共振器構造）を構成することにより光閉じ込めによる増強効果、および表面に内部金属層が存在する場合には、条件下によってはプラズモンによる増強効果も期待できる。
【００４７】
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料Ｓを保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料Ｓを測定する場合には、試料保持部１３を備えない態様であってもよい。
【００４８】
以下、本実施形態に係る検出方法および蛍光検出装置を用いた蛍光検出の原理について説明する。まず、本実施形態に係る蛍光物質Ｆの励起方法は以下の通りである。
励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、この界面上に生じる第１のエバネッセント波（図示省略）が光導波モードと結合して、光導波層１２ｂ上の液体試料Ｓ側に第２のエバネッセント波Ｅｗが誘起される。この第２のエバネッセント波Ｅｗにより光導波層１２ｂ表面に電場増強領域が形成される。このとき、第２のエバネッセント波Ｅｗによる電場増強領域内に蛍光物質Ｆが存在する場合には、その蛍光物質Ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。なお、この電場増強領域外の蛍光物質Ｆは励起されず蛍光Ｌｆを発しない。光検出器３０は、この蛍光Ｌｆを検出する。
【００４９】
本実施形態では、蛍光物質Ｆは、複数の蛍光色素分子１５を内包するものであるため、従来の蛍光色素分子１５単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【００５０】
なお、蛍光物質Ｆは粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、蛍光色素分子１５からの蛍光Ｌｆを透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００５１】
上記構成の蛍光検出装置１を用いた検出方法でのセンシングについて説明する。
【００５２】
まず、センサチップ１０の光導波層１２ｂ上に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。光導波層１２ｂ上には抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１（第１の結合物質）が修飾されている。試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２（第２の結合物質）が表面に修飾された蛍光物質Ｆが流される。この場合、光導波層１２ｂに表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光物質Ｆに表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、抗体Ａに対して互いに別の結合部位（エピトープ）に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０から励起光Ｌｏが照射され、光検出器３０により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器３０によって所定の蛍光Ｌｆが検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料Ｓ中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識（蛍光物質Ｆ）を添加しておいてもよい。
【００５３】
蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％Ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％Ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
以上の工程により、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素分子１５を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００５４】
以下、本実施形態における作用を説明する。
本発明では、蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料により包含してなる蛍光物質を用いることにより、染み出し長の長い第２のエバネッセント波を最大限利用して、蛍光物質内の蛍光色素分子を効率よく励起することができ、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【００５５】
また、第１のエバネッセント波を用いて蛍光検出を行う場合には、この第１のエバネッセント波の短い染み出し長が問題である。すなわち、第１のエバネッセント波の染み出し長は励起光の波長程度であり、その電場増強度は検出面（表面プラズモンを誘起する金属層）表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰する。したがって、蛍光信号強度を稼ぐために、複数の蛍光色素分子が内包されている蛍光物質を使用してもそれらを効率よく励起することができない。これが蛍光信号強度の低下やばらつきの原因となる。
【００５６】
しかしながら、本発明に係る検出方法では、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長が長い第２のエバネッセント波を利用して、効率よく蛍光物質の励起を行う。したがって、従来のＳＰＦを用いた場合に比して、試料液の流れや立体障害等により蛍光物質の位置（検出面表面からの距離）にばらつきが生じたとしても、蛍光物質に内包される蛍光色素分子を効率よく励起することができ、蛍光信号強度の低下およびばらつきを抑制して、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【００５７】
また、第２のエバネッセント波は、励起光の入射角度や光導波層の層厚によって、光導波モードの次数を変化させその染み出し長を変化させることができる。したがって、本発明に係る検出方法では、測定条件や蛍光物質の粒経等に応じて、第２のエバネッセント波の染み出し長を制御することが可能である。
【００５８】
さらに、バイオセンシングにおけるノイズは、試料内に存在するタンパク等の非特異吸着が主要因で、吸着のメカニズムは検出面とタンパク間との疏水的な相互作用がメインである。そのため、例えばＳＰＲにおいては、金膜表面の表面修飾による親水化が高感度検出における大きな問題となっており、実際にこれらの非特異吸着の問題を解消し実用化するための発明が多く出願されている。それに対し本発明において、光導波層としてＳｉＯ２膜を用いた場合には、ＳｉＯ２が著しい親水性を有するため、非特異吸着はほとんど存在せず、複雑な表面修飾を行うことなくノイズを下げることが可能となる。
【００５９】
一方、光導波層が積層構造の最表面に内部金属層を有している場合には、この内部金属層による蛍光色素分子の金属消光の影響が強くなるため、内部金属層と蛍光色素分子との距離を精密に制御する必要がある。金属消光の影響の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、内部金属層と蛍光色素分子１５との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが好ましい。このような制御は、一般的にはポリマー膜、ＳｉＯ２膜、ＳＡＭ膜もしくはＣＭＤ膜のようなバリア層を金属層上に設けることにより行われているが、面倒かつ煩雑であり実用にはあまり向いていない。しかしながら、本発明において、蛍光物質が、蛍光色素分子を充分多く含有する場合には、内部金属層上に金属消光防止のための膜を設けなくても、必然的に内部金属層と多くの蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。これにより従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
【００６０】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態の検出方法および装置について図３Ｂを参照して説明する。図３Ｂに示す放射光検出装置１’は、第1の実施形態の蛍光検出装置１と光検出器３０の配置位置が異なる。具体的に放射光検出装置１’は、光検出器３０を、蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することによって誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出するように配置したものである。ここでは、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してあり、第１の実施形態と同様の要素についての説明は特に必要のない限り省略する。
【００６１】
以下、本実施形態に係る検出方法の原理について説明する。
第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、この界面上に生じる第１のエバネッセント波（図示省略）が光導波モードと結合して、光導波層１２ｂ上の液体試料Ｓ側に第２のエバネッセント波Ｅｗが誘起される。この第２のエバネッセント波Ｅｗにより光導波層１２ｂ表面に電場増強領域が形成される。このとき、第２のエバネッセント波Ｅｗによる電場増強領域内に蛍光物質Ｆが存在する場合には、その蛍光物質Ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。なお、この電場増強領域外の蛍光物質Ｆは励起されず蛍光Ｌｆを発しない。そして、光導波層１２ｂ上で生じた蛍光Ｌｆが、金属層１２ａに表面プラズモンを励起することによって、誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ特定の角度で放射光Ｌｅが放射される（この現象をSurface Plasmon-Coupled Emission（ＳＰＣＥ）という。）。光検出器３０は、この放射光Ｌｅを検出するように配置されている。
【００６２】
放射光Ｌｅは蛍光Ｌｆが金属層１２ａの特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光Ｌｆの波長に応じてその結合する波数が定まるため、その波数に応じて放射光Ｌｅの放射角度が定まる。通常、励起光Ｌｏの波長と蛍光Ｌｆの波長とは異なることから、蛍光Ｌｆにより励起される表面プラズモンは励起光Ｌｏにより励起される表面プラズモンとは異なる波数に起因するものであるため、放射光Ｌｅは励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射される。
【００６３】
本実施形態の検出方法においても、被検出物質Ａに、蛍光標識として蛍光物質Ｆを付与して第１の実施形態と同様のセンシングを行う。したがって、本実施形態においても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６４】
さらに、本実施形態では、ＳＰＣＥを利用することにより、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【００６５】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図４〜６を参照して説明する。ここでは、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００６６】
図４に示す蛍光検出装置２は、蛍光検出装置２における検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌｏを照射させる励起光照射光学２０と、蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００６７】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）からなる光源２１と、試料セル５０の基台５１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とに加え、光源２１から出射された励起光Ｌｏを集光しプリズム２２の一面から入射させるレンズ２４およびミラー２５からなる導光部材と、半導体レーザ光源２１を駆動するドライバ２８とを備えている。
【００６８】
図５Ａは、試料セル５０の構成を示す平面図、図５Ｂは試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、液体試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した液体試料Ｓを排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ５３により構成された流路５２を上部に有する基台５１は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台５１はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。
【００６９】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体Ｂ２（第２の結合物質）が表面修飾された蛍光物質Ｆ（以下、標識２次抗体という）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体Ｂ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体Ｂ２と特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１および第２の測定エリア５８，５９がセンサチップ部に相当する。なお、図４においては、液体試料Ｓが注入されて抗体が標識２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために、標識２次抗体吸着エリア５７にはもはや標識２次抗体は存在していない。本例では、センサチップ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【００７０】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の基台５１上にはそれぞれ金属層および光導波層として、Ａｕ膜（図示省略）およびＳｉＯ２膜（５８ｂおよび５９ｂ）が形成されている。第１の測定エリア５８のＳｉＯ２膜５８ｂ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＳｉＯ２膜５９ｂ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。上記標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質（標識２次抗体Ｂ２）と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｂ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００７１】
試料セル５０は、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの蛍光検出測定の後、第２の測定エリア５９を蛍光検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光検出を行うように構成されている。
【００７２】
上記構成の蛍光検出装置２を用いた検出方法の原理は、第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても蛍光標識として蛍光物質を用いて、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質Ｆの励起を行っているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。
【００７３】
さらに、この第３の実施形態の蛍光検出装置２および検出方法を利用した、センシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図６を参照して説明する。
【００７４】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図６中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図６中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が付与された蛍光物質とが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体Ｂ２が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体Ｂ２を洗い流す。
【００７５】
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。標識２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は標識２次抗体Ｂ２の流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この蛍光信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することができる。
【００７６】
図４〜６では、第１の測定エリア５８に固定されている１次抗体Ｂ１は、光導波層５８ｂ表面に２次元的に設けられているが、図７Ａに示すように、光導波層５８ｂ上のメンブレンの３次元的に広がった領域に１次抗体Ｂ１が固定化されていてもよいし、図７Ｂに示すように、光導波層５８ｂ表面に、表面積を広げるための構造７０を設けてその上に１次抗体Ｂ１が３次元的に固定化されていてもよい。
【００７７】
構造７０はポリスチレン、ガラスなどの透光性物質であればなんでもよいが、後述する第２のエバネッセント波の擾乱を起こさないように、屈折率が低く、構造体の大きさ（厚さ）が小さいものが好ましい。作製方法は蒸着法、スパッタ法、スピンコートなどの方法で薄膜を作り、その後、プラズマ処理や溶剤処理によって表面をランダムに粗くする方法、あるいは直径１０〜５００ｎｍ程度のポリスチレン微粒子を光導波層５８ｂ表面に物理吸着や化学結合により固定化させる方法がある。
【００７８】
さて、第３の実施形態で示したような、マイクロ流路中で流路壁面に蛍光物質を標識として固定化するアッセイを行うとき、流路内の蛍光物質の運動は拡散が支配的になる。蛍光物質の拡散時間はその粒径によって顕著な違いが現れることから、蛍光物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。なお、以下においては、蛍光物質が球状であるとして粒径の範囲を導出した。
【００７９】
蛍光物質の拡散時間τは、式（１）で表される。
τ＝ｈ2／Ｄ ・・・（１）
ここで、ｈ：拡散距離、Ｄ：拡散定数である。
【００８０】
アインシュタイン−ストークスの式（２）を用いると、蛍光物質の流体力学半径ｄから拡散定数Ｄが求まるので、サンドイッチ形成に必要な１次抗体までの距離（拡散距離）ｈだけ拡散するのに要する拡散時間τが得られる。拡散距離ｈは流路内の２次元平面上にサンドイッチを形成する場合は流路の高さを表し、メンブレンなどの３次元構造内にサンドイッチを形成する場合は３次元構造上に固定されている１次抗体までの距離を表す。
Ｄ＝ＫBＴ／３πηｄ ・・・（２）
ここで、ＫB：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒の粘性、ｄ：流体力学半径である。
【００８１】
図８は、サンドイッチ形成に必要な１次抗体までの距離ｈを３０μｍとし、蛍光物質の直径φに対する、蛍光物質が距離３０μｍ拡散するのに要する時間を図示したものである。一般に、診断レベルで実用的なアッセイ時間は１０分以下である。図８から、３０μｍの高さのマイクロ流路で１０分以下のアッセイ時間を達成するためには、蛍光物質の粒径はφ５３００ｎｍ以下が有効であるといえる。このことから、マイクロ流路での反応においては、蛍光物質の粒径がφ５３００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００８２】
さらに、光導波モード増強による蛍光検出にあたり、蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱を考慮する必要がある。
既述のように、蛍光物質の材質には水溶媒（屈折率ｎ＝１．３３）より屈折率の高いポリスチレンやガラスを用いている。例えばポリスチレンの屈折率ｎ＝１．５９〜１．６０である。このような高屈折率の蛍光物質が光導波層近傍に位置することによって第２のエバネッセント波の発生が阻害される場合がある。この現象を例えばプリズム層１０１、金属層１０２ａ（屈折率ｎ＜１）、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ（屈折率ｎ＝１．４５〜１．４６）、溶媒層１０３の４層に分けた多層膜近似で考察した。図９ＡはＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上に水溶媒層のみである場合に、図９ＢはＳｉＯ２光導波層１０２ｂにポリスチレンの蛍光物質１０４が存在する場合に、プリズム層１０１側から光ビームを入射してＳｉＯ２光導波層１０２ｂ表面に生じせしめた電場Ｅを模式的に示している。
プリズム層１０１、溶媒層１０３（１０３’）は十分な膜厚があり、プリズム層１０１、金属層１０２ａおよびＳｉＯ２光導波層１０２ｂの屈折率、膜厚がすでに決まっていると仮定すると、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ表面上に誘起される第２のエバネッセント波の状態はＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上の溶媒屈折率によって決まる。図１０は、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上に水溶媒層のみである場合（実線で示す）と、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上にポリスチレン層が存在する場合（破線で示す）について、励起光の界面への入射角度と反射率との関係をシミュレーションにより求めたグラフである。このグラフから溶媒側に水溶媒層がある場合には、第２のエバネッセント波が発生する共鳴角が存在するが、ポリスチレン層がある場合には第２のエバネッセント波が発生しない（共鳴角が現れない）ことがわかる。
これは、第１のエバネッセント波がＳｉＯ２光導波層１０２ｂ内で光導波モードと結合するための条件が満たされなくなったためである。すなわち、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ（屈折率ｎ＝１．４５）は、両側を屈折率の小さい金属層１０２ａ（屈折率ｎ＜１）および水溶媒（屈折率ｎ＝１．３３）によって挟まれることにより、光導波路としての役割を果たしていたが、水溶媒側にポリスチレン（屈折率ｎ＝１．５９）が存在することにより、この界面で全反射が生じなくなったためである。このことから、屈折率の高い蛍光物質(ポリスチレンやガラス製)を用いてアッセイを行い、光導波層１０２ｂ近傍に蛍光物質が固定されると、第２のエバネッセント波の発生が阻害されてその電場強度が低減してしまい、蛍光測定ができなくなると推察される（図９Ｂ）。
【００８３】
このような、蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱を考慮に入れ、蛍光物質の粒径と蛍光量との関係をシミュレーションした結果を図１１に示す。粒径が大きくなれば内包される蛍光分子数が増えるので、粒径が４００ｎｍまでは蛍光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径５００ｎｍを超えると急激に蛍光量が減少していくことが分かった。これは、粒径５００ｎｍを超えると上述の蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱が大きくなってくるためである。図１１から、蛍光物質の粒径の増加による蛍光量の増加と蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱とを考慮し、蛍光物質の好適な粒径を判断する必要がある。したがって、蛍光量が最大ピークを示した粒径３００ｎｍの蛍光量から、蛍光物質の粒径を、１桁程度以上蛍光量が落ちないようにするために７０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲とすることが好ましく、０．５桁程度以上蛍光量が落ちないようにするために１００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲とすることがより好ましい。なお、上記においては、蛍光物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、蛍光物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。
【００８４】
さらに、流路内で１次抗体を固定するための３次元構造を作成する手間を省き、簡素化した２次元平面上でアッセイを行うとき、蛍光物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。
【００８５】
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として１ｐＭ（ピコモーラ：×１０-12ｍｏｌ／ｌ）程度は必要であるといわれている。そこで、この１ｐＭ以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ２桁、すなわち、１００ｐＭまで検出できる感度特性を目標値として蛍光物質の好ましい粒径を導出した。
１ｐＭの抗原濃度の検体について、アッセイ時の条件を検出領域の直径を１ｍｍ（面積３．１ｍｍ2）、流路を流下する検体量を３０μｌ（この検体量は一般的な簡易血液診断装置において、流路に流す前の前処理後、あるいはメンブレンフィルターによって血球分離された後の標準的な値である。）、抗原捕捉率を０．２％（一般的に抗原捕捉率は、０．２％〜２％程度であることから、ここでは、捕捉率が最低であった場合でも検出可能とするため、０．２％に設定した。）とすると、１．２×１０4個／ｍｍ2の抗原を検出領域に固定し検出できればよい。ここで、１．２×１０4個／ｍｍ2を目標固定量とする。一方、落射蛍光検出装置（ＬＡＳ−４０００、落射蛍光式、富士フイルム社製）を用いて測定した、前述の手順で作製した蛍光物質（直径３００ｎｍ、励起波長５４２ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍ）の検量線データを図１２に示す。ここでは中心波長５２０ｎｍの緑色ＬＥＤの励起光を用い、緑色蛍光用フィルタを通して蛍光を検出した結果を示している。このときの検出限界密度はエラーバーが蛍光検出装置のバックグラウンド値の３σ(σは標準偏差)と交わった１.０×１０3個／ｍｍ2であった。
【００８６】
この結果、φ３００ｎｍの蛍光物質を用いると目標固定量（１．２×１０4個／ｍｍ2）の１２分の１の固定量で検出可能であるといえ、１ｐＭ以下の抗原濃度で抗原検出が可能となる高感度化が達成できていることが明らかとなった。また、この結果から、蛍光物質の粒径を３００ｎｍより小さくしても１ｐＭの検体について測定可能であることが明らかである。同一密度で蛍光色素分子が内包されている場合、蛍光物質１個あたりの蛍光発光量は蛍光物質半径の三乗（ｒ3）に比例する。従って、φ１３０ｎｍの蛍光物質を用いた場合、１個あたりの蛍光量はφ３００ｎｍの蛍光物質の１／１２倍になるが１ｐＭの抗原濃度での検出が十分可能であるといえる。ここから、１ｐＭの抗原濃度での検出を行うための蛍光物質粒径の下限値はφ１３０ｎｍ程度と定められる。なお、ここでは、蛍光物質中の蛍光色素分子密度が略一定であると想定している。
一方、蛍光物質の粒径を大きくすると内包される蛍光色素分子量が増加するため蛍光信号強度も増大し検出光量の点で有利になるが、２次元平面上の一定面積に固定できる蛍光物質の個数は立体障害の観点から固定量に限界がある。ダイナミックレンジ２桁として１００ｐＭを検出上限濃度とすると、固定量は１．２×１０6個／ｍｍ2となる。このとき、１つの抗原に対し１つの蛍光物質が結合するとして最密充填となる大きさは、φ５００ｎｍである。このことから目標固定量を実現できる蛍光物質の上限サイズはφ５００ｎｍである。
以上の観点から、蛍光物質のさらに好ましい粒径は１３０ｎｍ〜５００ｎｍである。
【００８７】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法として、本発明の一実施形態の検出用キットを用いた方法について図１３および１４を参照して説明する。図１３および１４において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００８８】
図１３Ａは検出用キット６０の試料セル６１の構成を示す平面図、図１３Ｂは試料セル６１の側断面図、図１３Ｃは標識用溶液入りアンプル６２を示す図である。
【００８９】
検出用キット６０は、試料セル６１と、蛍光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３とを備えている。
【００９０】
試料セル６１は、試料セル６１内に２次抗体Ｂ２で表面修飾した蛍光物質Ｆを物理吸着した物理吸着エリアを備えない点でのみ上述の第３の実施形態の試料セル５０と異なり、その他は試料セル５０と略同一の構成である。
【００９１】
蛍光検出装置としては図４に示した第３の実施形態のものを同様に用いることができ、本実施形態の検出用キット６０を用いれば、第３の実施形態の場合と同様に被検出物質に蛍光物質による標識がなされ、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質の励起を行うため、同様に精度の高い測定を行うことができる。
【００９２】
さらに、この検出用キット６０を用いた場合の蛍光検出装置２におけるセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
【００９３】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、標識２次抗体Ｂ２が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００９４】
このように、血液Ｓｏを注入口から注入し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１および２次抗体Ｂ２と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。標識２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は標識２次抗体Ｂ２の流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この蛍光信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正してもよい。
【００９５】
蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００９６】
上述の各実施形態においては蛍光標識として、多数の蛍光色素分子１５と蛍光色素分子１５を内包する透光材料１６とからなる蛍光物質Ｆを用いる形態について説明したが、図１５に示すように、さらに、蛍光物質Ｆの表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられていてもよい。金属被膜１９は、透光材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部透光材料１６が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができ、層厚としては１５ｎｍ程度が好ましい。
蛍光物質Ｆの表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０の光導波層１２ｂ上に発生した第２のエバネッセント波が蛍光物質Ｆの金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子１５をさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質Ｆのような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
この金属被膜された蛍光物質Ｆ’は、例えば、この金属被膜１９上に抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２を修飾し、上述の第１の実施形態から第４の実施形態における蛍光物質Ｆと同様にして利用することができる。
【００９７】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【００９８】
さて、上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光Ｌｏとしては、図１６に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属層１１２ａとの界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、光導波層上に第２のエバネッセント波を励起することができる。光導波層上への試料供給の前後において、光導波層上の媒質の屈折率が変化し、そのために光導波モードが誘起される共鳴角が変化する。このため、上述の実施形態のように平行光を励起光Ｌｏとして用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図１６に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを励起光Ｌｏとして用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００９９】
また、上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイについて説明したが、本発明の検出方法および装置、試料セルおよび測定キットはサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイの場合にも適用することができる。
【０１００】
図１７Ａ〜Ｃを参照して、競合法について簡単に説明する。
図１７Ａに示すように、例えば、抗原Ａと同一の免疫反応を示す２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）を蛍光物質Ｆに修飾させておく。光導波層１２ｂ上には、抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３といずれとも特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）を固定化しておく。２次抗体Ｃ３が修飾された蛍光物質Ｆを所定濃度で、抗原Ａと混合し、光導波層１２ｂ上に固定化された１次抗体Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原Ａと蛍光物質Ｆとの混合時における蛍光物質Ｆの濃度は既知である。
【０１０１】
競合法では、図１７Ｂに示すように、抗原Ａの濃度が高ければ、１次抗体Ｃ１と結合する２次抗体Ｃ３の量が少なく、すなわち光導波層１２ｂ上の蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなる。一方、図１７Ｃに示すように、抗原Ａの濃度が低ければ、１次抗体Ｃ１と結合する２次抗体Ｃ３の量が多く、すなわち光導波層１２ｂ上の蛍光物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は抗原Ａにエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１０２】
図１８は、本発明の他の実施形態の試料セル５０’を用いた競合法によるアッセイ手順を示す図である。試料セル５０’は、第３の実施形態の蛍光検出装置２において、試料セル５０に換えて用いることができる。試料セル５０とは、流路内に備えられている抗体が異なり、本試料セル５０’は競合法によるアッセイに適用されるものである。
【０１０３】
試料セル５０’においては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）が表面修飾された蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、抗原Ａおよび標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１が固定された第１の測定エリア５８’、抗原Ａとは結合せず標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。
【０１０４】
第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’の基台５１上にはそれぞれ金属層および光導波層として、Ａｕ膜（図示省略）およびＳｉＯ２膜（５８ｂおよび５９ｂ）が形成されている。第１の測定エリア５８’のＳｉＯ２膜５８ｂ上にはさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＳｉＯ２膜５９ｂ上にはさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｃ３と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリア５９’には１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。上記標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質（標識２次抗体Ｃ３）と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９’に標識２次抗体Ｃ３、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【０１０５】
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０’の注入口５４ａから注入し、アッセイを行う手順について図１８を参照して説明する。
【０１０６】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１８において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１８において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体Ｃ３が付与された蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体Ｃ３の一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体Ｃ３が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体Ｃ３を洗い流す。
【０１０７】
このように、血液Ｓｏを注入口から注入し、第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの蛍光強度を検出することにより、抗原Ａの有無および／またはその濃度を検出することができる。
【０１０８】
本実施形態の試料セルを用いた検出方法においても蛍光標識として蛍光物質を用い、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質の励起を行っているから、上記各実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で精度の高い測定を行うことができる。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例１〜３のセンサチップ上に蛍光物質（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ、粒経：２００ｎｍあるいは５００ｎｍ）を固定し、光導波モードによる電場増強を実施した場合について、電場増強度（励起光の強度に対する、電場増強場の強度の割合）および蛍光信号増強度（比較例で得られる蛍光信号量に対する、実施例で得られる蛍光信号量の割合）の評価を行った。なお、実施例１〜３において、励起光の波長は７８０ｎｍ、誘電体プリズムの材質は石英、センサチップ上の媒質は水である。
【０１１０】
＜実施例１＞
図１９Ａに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（６００ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１１】
＜実施例２＞
図１９Ｂに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）、金膜（５ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１２】
＜実施例３＞
図１９Ｃに示すように、石英プリズム上に金膜（３０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）、金膜（３０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１３】
＜比較例＞
一般的に用いられる表面プラズモンによる電場増強を比較例とした。すなわち図１９Ｄに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）を有するセンサチップを用いて表面プラズモンを誘起した。
【０１１４】
図２０は、実施例１〜３および比較例における電場増強度とセンサチップ表面からの距離との関係を示す図である。また、参考のために粒経が２００ｎｍの蛍光物質も模式的に図示している。これにより、光導波モードによる第２のエバネッセント波は、表面プラズモンによる第１のエバネッセント波に比して、減衰の程度が緩やかでその染み出し長（センサチップ表面における電場増強度が１／ｅになるまでの長さ）が長いことがわかる。例えば、比較例における染み出し長はおよそ２００ｎｍであるのに対し、実施例１における染み出し長はおよそ４５０ｎｍである。また、実施例２および３における染み出し長は、５００ｎｍを超える染み出し長を有する。つまり、第２のエバネッセント波は第１のエバネッセント波に比して染み出し長が長いこと、そして光導波層を積層構造として厚くすることにより染み出し長がより長くすることができることが実証された。
【０１１５】
一方図２１は、実施例１〜３および比較例における蛍光信号増強度を示す図である。２００ｎｍの蛍光物質を用いた比較例で得られた蛍光信号量を基準にして、その他の場合について何倍の蛍光信号量が得られたかを示している。２００ｎｍの蛍光物質を用いた実施例では、蛍光信号増強度は２．４〜３．２という結果となった。ある程度の増強度は得られているが、実施例間ではそれほど大きな変化はなかった。これは、励起され蛍光を発する、蛍光物質中に包含される蛍光色素分子の数に限りがあるためと考えられる。このことを示すように、５００ｎｍの蛍光物質を用いた実施例では、蛍光信号増強度は実施例１で２８．９倍、実施例２で３５．９倍、実施例３で４９．２倍という結果になった。
【０１１６】
以上により、光導波モードによる電場増強を利用する本発明に係る検出方法を用いれば、５００ｎｍという大きな蛍光物質を蛍光標識に用いても、蛍光物質に内包される蛍光色素分子を効率よく励起することができ、蛍光信号強度の低下およびばらつきを抑制して、より高感度かつ定量性の高い検出が可能であることが実証された。
【０１１７】
＜設計変更＞
上記第３および第４の実施形態においては、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、蛍光物質に内包される蛍光色素分子から生じる蛍光を用いる場合について述べてきたが、これらの実施形態はこのような場合に限られるものではない。すなわち、上記第３および第４の実施形態においても、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、蛍光物質に内包される蛍光色素分子から生じる蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することにより誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出することによって、測定をすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】光導波モードを誘起するための光学配置の例を示す概略断面図
【図２】光導波モードの発生と入射光の入射角度の関係を示す概略図
【図３Ａ】第１の実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図３Ｂ】第２の実施形態による放射光検出装置を示す概略構成図
【図４】第３の実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図５】第３の実施形態の試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図６】第３の実施形態による試料セルを用いたアッセイ手順を示す図
【図７Ａ】光導波層上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その１）
【図７Ｂ】光導波層上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その２）
【図８】蛍光物質の粒径に対する拡散時間を示すグラフ
【図９Ａ】光導波層上に水溶媒層がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図９Ｂ】光導波層上に蛍光物質がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図１０】図９ＡおよびＢの場合の入射角度と反射率との関係を示すグラフ
【図１１】蛍光物質の粒径と蛍光量の関係を示す図
【図１２】蛍光物質の検量線データを示す図
【図１３】第４の実施形態の検出用キットの（Ａ）試料セルを示す平面図、（Ｂ）試料セルを示す側断面図および（Ｃ）標識用溶液を示す図
【図１４】検出用キットを用いた場合のアッセイ手順を示す図
【図１５】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１６】励起光照射光学系の他の例を示す図
【図１７】競合法の原理を説明するための模式図
【図１８】第３の実施形態による試料セルを用いた競合法アッセイ手順を示す図
【図１９】（Ａ）実施例１（Ｂ）実施例２（Ｃ）実施例３（Ｄ）比較例におけるセンサチップの構造を示す概略断面図
【図２０】実施例における電場増強度とセンサチップ表面からの距離の関係を示す図
【図２１】実施例における蛍光信号増強度を示す図
【符号の説明】
【０１１９】
１、２ 蛍光検出装置
１’ 放射光検出装置
３、１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ａ 金属層
１２ｂ 光導波層
１３ 試料保持部
１５ 蛍光色素分子
１６ 透光材料
１９ 金属被膜
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
Ｆ 蛍光物質
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｓ 試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものであり、特に詳細には光導波モードを利用した検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。
【０００４】
また、非特許文献１に示すように、金属層のプラズモンによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより１ｐＭを切るような高感度検出が可能である蛍光法、いわゆる表面プラズモン電場増強蛍光分光法（ＳＰＦ）も報告されている。
【０００５】
さらに、非特許文献２に示すように、エバネッセント波の染み出し長の長い光導波モードによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより、高感度検出が可能であるという報告もされている。
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【非特許文献２】坪井一真、外２名、「光導波モード増強蛍光観察を用いたカテコールアミンの高感度検出」、第５４回応用物理学関係連合講演会講演予稿集、応用物理学会、２００７年、ｐ．１３７８（２８ｐ−ＳＡ−４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、一般的にさらなるＳ／Ｎ比の向上が望まれており、ノイズの低減のみではなく、蛍光強度の増幅も必要とされている。
【０００７】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、より高感度かつ定量性の高い検出を可能とする検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による検出方法は、
誘電体プレートの一面に、金属層と光導波層とをこの順に有するセンサチップを用意し、
光導波層上に被検出物質および蛍光標識物質を含む試料を接触させると共に、
誘電体プレートと金属層との界面に対し、誘電体プレート側から全反射条件を満たすように励起光を入射して、この界面に第１のエバネッセント波を発生せしめ、
第１のエバネッセント波を、光導波層内で光導波モードと結合させることにより、光導波層の上面に第２のエバネッセント波を発生せしめ、
第２のエバネッセント波により、蛍光標識物質の蛍光標識を励起し、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する方法であって、
蛍光標識として、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させる透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とするものである。
【０００９】
ここで、「蛍光標識物質」は、蛍光標識が付与された被検出物質であってもよいし、蛍光標識が付与された、被検出物質と競合する競合物質であってもよい。すなわち、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識が付与された被検出物質のことを意味し、競合法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識が付与された、被検出物質と競合する競合物質のことを意味するものとする。本発明の検出方法は、サンドイッチ法、競合法のいずれの方法によるアッセイにも対応可能である。
【００１０】
「蛍光標識の励起に起因して生じる光」とは、蛍光標識が励起することにより直接的または間接的に生じる光であって、その光の発生量と励起した蛍光標識の数量との間に相関性を有するものを意味するものとする。
【００１１】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み定性的な量のみならず、定量的な量を検出することも意味するものとする。
【００１２】
また、蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００１３】
本発明による検出方法において、蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることがより好ましい。なお、本明細書において、蛍光物質の粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
【００１４】
また、蛍光物質の表面に上記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００１５】
そして、光導波層は、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【００１６】
さらに、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出することが好ましく、或いは、励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することにより上記界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出することが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明による検出用試料セルは、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、このプレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、
光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
センサチップ部より上流側の流路内に固定された、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１８】
さらに、本発明による検出用キットは、
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、このプレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、流路内に流下される標識用溶液であって、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質を含む標識用溶液とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１９】
なお、本発明による検出用試料セルおよび検出用キットにおいて、第２の結合物質が修飾された蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２０】
ここで、「蛍光物質」は、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなるものである。
【００２１】
また、蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００２２】
本発明による検出用試料セルおよび検出用キットにおいて、蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることがより好ましい。
【００２３】
また、蛍光物質の表面に上記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
【００２４】
そして、光導波層は、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明による検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットでは、蛍光物質の励起に光導波モードを利用した光導波モード増強蛍光分光法（ｏｐｔｉｃａｌ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｏｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＯＷＦ）を用いる。より具体的には、蛍光物質の励起を、従来ＳＰＦで用いられていた励起光の全反射によって生じるエバネッセント波（第１のエバネッセント波）ではなく、光導波モードの染み出しによるエバネッセント波（第２のエバネッセント波）によって行う。この第２のエバネッセント波は、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長（検出面表面における電場増強度が１／ｅになるまでの長さ）が長いという特徴を有する。
【００２６】
この結果、染み出し長の長い第２のエバネッセント波を最大限利用して、蛍光物質内の蛍光色素分子を効率よく励起することができ、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２８】
本発明は、光導波モードを利用する。そこで図１を用いて、光導波モードおよびこの光導波モードを利用したＯＷＦについてまず簡単に説明する。
【００２９】
なお、光導波モードとは、ある有限の空間内に光が閉じこめられて伝搬していく状態のことで、誘電体等の光導波路内の多重反射に基づくものである。最も良く知られている光導波モードとしては光ファイバ内の光の伝搬状態が挙げられる。光ファイバは、屈折率が低いファイバ状(通常非常に細長い円筒型)の材料の中心に屈折率の高い部位(通常、コアと呼ばれる)を形成し、この屈折率差によって生じる光の反射によって、光をコア中に閉じ込めて伝搬させる。屈折率の低い物質(空気や真空状態も含む)に挟まれた板状の材料中を光が伝搬するスラブ型光導波路も良く知られている。
【００３０】
図１に、ＯＷＦにおいて光導波モードを発現するためのセンサチップの例を示す。このセンサチップ３は、誘電体プリズム１１、および誘電体プリズム１１の上面に順に設けられた金属層１２ａと光導波層１２ｂとからなる。このとき、光導波層１２ｂの上側(表面側)が、光導波層１２ｂよりも屈折率の低い物質（例えば空気や水）に触れている場合、光導波層１２ｂはスラブ型光導波路と似た構造となる。そして、このような光導波層１２ｂに光が閉じ込められて伝搬する状態が、本発明における光導波モードとなる。
【００３１】
このセンサチップ３に、ＳＰＦで用いる光学系と同様の光学系を用いて入射光Ｌｏを照射することにより、入射光Ｌｏの全反射によって生じるエバネッセント波（第１のエバネッセント波）が光導波層１２ｂ内で多重反射を起こし光導波モードとなる。そして、この光導波モードの染み出しによるエバネッセント波（第２のエバネッセント波）が光導波層１２ｂ上に生じることとなる。
【００３２】
すなわち、誘電体プリズム１１と金属層１２ａとの界面に対し全反射条件を満たすように誘電体プリズム１１側から入射された入射光Ｌｏは、誘電体プリズム１１を透過しこの界面で全反射して、光導波層１２ｂ側に第１のエバネセント波を生じせしめる。この第１のエバネセント波を生じせしめた状態で入射光Ｌｏの入射角度を変化させると、ある特定の入射角度で第１のエバネセント波が光導波層１２ｂ内を伝搬するようになる。このような状態を、「第１のエバネセント波が光導波モードと結合する」、或いは「光導波モードが誘起される」と表現する。第１のエバネセント波が光導波モードと結合すると、第１のエバネセント波の一部又は全部が、光導波層１２ｂ内を伝搬すると共にその中に閉じ込められる。そして、その閉じ込められた光の一部が光導波層１２ｂの外部に染み出して、前述した第２のエバネッセント波となるのである。
【００３３】
ＯＷＦでは、上記のように発生した第２のエバネッセント波を用いて、光導波層１２ｂ上の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識を励起し、この蛍光標識の励起に起因して生じる蛍光を検出し、検出された蛍光量に基づいて被検出物質の量を検出する。
【００３４】
なお、光導波モードは必ずしも１つではなく、入射光Ｌｏの波長、光導波層１２ｂの層厚および屈折率等の条件により、特定の入射角度の異なる位置に複数の光導波モードを有する場合がある。図１には、ＴＥ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ）モードにおける、０次（基準）の光導波モード（ＴＥ０）、１次の光導波モード（ＴＥ１）、２次の光導波モード（ＴＥ２）のｙ成分電場の状態も概念的に示している。なお、併せてＳＰＲによる電場の状態も概念的に示している
この特定の入射角度は、反射光（全反射した入射光Ｌｏ）をモニタリングすることにより確認することができる。これは、第１のエバネセント波が光導波モードと結合するときに、反射光が急激に増減するためである。
【００３５】
例えば図２は、ｐ偏光入射光の入射角度と反射光の反射率の関係を示した概念図である。図２には、４カ所の反射率の鋭い減少（ディップ）が見られる（θｃは臨界角）。このような反射率のディップの原因は主に２つある。
【００３６】
１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に起因するものであり、図２のθｒの入射角度で生じる反射率のディップがこれに対応する。ＳＰＲは、負の誘電率を持つ金属、特にＡｕ、Ａｇ等の貴金属などを金属層として用いた場合に生じる現象であり、光導波層が無くても生じる現象である。
【００３７】
そしてもう１つが、光導波モードに起因するものであり、図２のθ０、θ１、θ２の入射角度で生じる反射率のディップがこれに対応する。この反射率のディップは、図１に示す光導波層が無い場合や光導波層が薄い場合には生じない。光導波モードが発生する光導波層の最低の厚さは、入射光の波長や偏光状態、そして光導波層の屈折率等によって異なる。一般的に光導波層の屈折率が大きければ薄くても良く、入射光の波長が短い場合も薄くて良い。一方、光導波層の屈折率が小さい場合や入射光の波長が長い場合は、厚い光導波層が要求される。
【００３８】
上記のように、このＳＰＲと光導波モードは同様の光学系で観測することができるが、一般的にＳＰＲが生じる角度と、第１のエバネセント波が光導波モードと結合する角度とは異なる。またＳＰＲに起因する反射率の増減は、一般的に入射光がｐ偏光の場合のみに生じる現象であるが、光導波モードに起因する反射率の増減は、ｐ偏光およびｓ偏光の両方の場合で生じる。さらに、一般的に反射率の増減が光導波モードに起因する場合は、光導波層の層厚が厚いほど特定の入射角度の異なる位置により多くの光導波モード（高次の光導波モード）が生じうる点、ｓ偏光入射光では逆に鋭く増加する（上に凸のピークを有する）点も特徴である。
【００３９】
また、第２のエバネッセント波は、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長が長いという特徴を有する。そして、高次の光導波モードほど光の閉じ込め効果が小さくなり染み出し長が長くなる。
【００４０】
＜第１の実施形態＞
以上を踏まえ図面を参照して、本発明の第１の実施形態に係る検出方法およびそれに用いられる蛍光検出装置について説明する。図３Ａは装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００４１】
本実施形態に係る検出方法は、誘電体プレート１１の一面に、金属層１２ａと光導波層１２ｂとをこの順に有するセンサチップ１０を用意し、光導波層１２ｂ上に被検出物質Ａおよび蛍光標識物質を含む試料を接触させると共に、誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対し、誘電体プレート１１側から全反射条件を満たすように励起光Ｌｏを入射して、この界面に第１のエバネッセント波（図示省略）を発生せしめ、第１のエバネッセント波を、光導波層１２ｂ内で光導波モードと結合させることにより、光導波層１２ｂの上面に第２のエバネッセント波Ｅｗを発生せしめ、第２のエバネッセント波Ｅｗにより、蛍光標識物質の蛍光物質Ｆを励起し、蛍光物質Ｆの励起により生じる蛍光を検出し、検出された蛍光量に基づいて被検出物質の量を検出するものである。
【００４２】
そして、上記の検出方法を実施する本実施形態に係る蛍光検出装置１は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に順に設けられた金属層１２ａおよび光導波層１２ｂとを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面で全反射条件となる入射角度で、誘電体プレート１１通して励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、光導波層１２ｂに接触している試料Ｓ中に蛍光物質Ｆが付与された被検出物質が存在する場合に、この蛍光物質Ｆから生じる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００４３】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面から上記界面にて励起光Ｌｏが全反射角以上で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、第１のエバネッセント波を効果的に誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射する。
【００４４】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に順に金属層１２ａおよび光導波層１２ｂが成膜されたものである。
【００４５】
金属層１２ａは、所定領域に開口を有するマスクを誘電体プレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法やスパッタ法等で成膜形成することができる。金属層１２ａの層厚は、金属層１２ａの材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属層１２ａとしてＡｕ膜を用いる場合には、金属層１２ａの層厚は４０ｎｍ±３０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４０ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属層１２ａは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。ここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００４６】
光導波層１２ｂは、金属層１２ａ上に形成されるものであり、金属層１２ａと同様の方法により形成することができる。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとしてシリコン酸化膜を用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。そして、光導波層１２ｂは、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることが好ましく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。上記光導波材料としては、ＳｉＯ２ 、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマー等が挙げられる。このような積層構造とすることにより、第２のエバネッセント波Ｅｗの染み出し長を制御することができる。さらに、内部光導波層が金属層１２ａおよび内部金属層に挟まれた構造（共振器構造）を構成することにより光閉じ込めによる増強効果、および表面に内部金属層が存在する場合には、条件下によってはプラズモンによる増強効果も期待できる。
【００４７】
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料Ｓを保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料Ｓを測定する場合には、試料保持部１３を備えない態様であってもよい。
【００４８】
以下、本実施形態に係る検出方法および蛍光検出装置を用いた蛍光検出の原理について説明する。まず、本実施形態に係る蛍光物質Ｆの励起方法は以下の通りである。
励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、この界面上に生じる第１のエバネッセント波（図示省略）が光導波モードと結合して、光導波層１２ｂ上の液体試料Ｓ側に第２のエバネッセント波Ｅｗが誘起される。この第２のエバネッセント波Ｅｗにより光導波層１２ｂ表面に電場増強領域が形成される。このとき、第２のエバネッセント波Ｅｗによる電場増強領域内に蛍光物質Ｆが存在する場合には、その蛍光物質Ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。なお、この電場増強領域外の蛍光物質Ｆは励起されず蛍光Ｌｆを発しない。光検出器３０は、この蛍光Ｌｆを検出する。
【００４９】
本実施形態では、蛍光物質Ｆは、複数の蛍光色素分子１５を内包するものであるため、従来の蛍光色素分子１５単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【００５０】
なお、蛍光物質Ｆは粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、蛍光色素分子１５からの蛍光Ｌｆを透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００５１】
上記構成の蛍光検出装置１を用いた検出方法でのセンシングについて説明する。
【００５２】
まず、センサチップ１０の光導波層１２ｂ上に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。光導波層１２ｂ上には抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１（第１の結合物質）が修飾されている。試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２（第２の結合物質）が表面に修飾された蛍光物質Ｆが流される。この場合、光導波層１２ｂに表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光物質Ｆに表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、抗体Ａに対して互いに別の結合部位（エピトープ）に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０から励起光Ｌｏが照射され、光検出器３０により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器３０によって所定の蛍光Ｌｆが検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料Ｓ中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識（蛍光物質Ｆ）を添加しておいてもよい。
【００５３】
蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％Ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％Ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
以上の工程により、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素分子１５を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００５４】
以下、本実施形態における作用を説明する。
本発明では、蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料により包含してなる蛍光物質を用いることにより、染み出し長の長い第２のエバネッセント波を最大限利用して、蛍光物質内の蛍光色素分子を効率よく励起することができ、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【００５５】
また、第１のエバネッセント波を用いて蛍光検出を行う場合には、この第１のエバネッセント波の短い染み出し長が問題である。すなわち、第１のエバネッセント波の染み出し長は励起光の波長程度であり、その電場増強度は検出面（表面プラズモンを誘起する金属層）表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰する。したがって、蛍光信号強度を稼ぐために、複数の蛍光色素分子が内包されている蛍光物質を使用してもそれらを効率よく励起することができない。これが蛍光信号強度の低下やばらつきの原因となる。
【００５６】
しかしながら、本発明に係る検出方法では、第１のエバネッセント波に比して、電場減衰の程度が緩やかで染み出し長が長い第２のエバネッセント波を利用して、効率よく蛍光物質の励起を行う。したがって、従来のＳＰＦを用いた場合に比して、試料液の流れや立体障害等により蛍光物質の位置（検出面表面からの距離）にばらつきが生じたとしても、蛍光物質に内包される蛍光色素分子を効率よく励起することができ、蛍光信号強度の低下およびばらつきを抑制して、より高感度かつ定量性の高い検出が可能となる。
【００５７】
また、第２のエバネッセント波は、励起光の入射角度や光導波層の層厚によって、光導波モードの次数を変化させその染み出し長を変化させることができる。したがって、本発明に係る検出方法では、測定条件や蛍光物質の粒経等に応じて、第２のエバネッセント波の染み出し長を制御することが可能である。
【００５８】
さらに、バイオセンシングにおけるノイズは、試料内に存在するタンパク等の非特異吸着が主要因で、吸着のメカニズムは検出面とタンパク間との疏水的な相互作用がメインである。そのため、例えばＳＰＲにおいては、金膜表面の表面修飾による親水化が高感度検出における大きな問題となっており、実際にこれらの非特異吸着の問題を解消し実用化するための発明が多く出願されている。それに対し本発明において、光導波層としてＳｉＯ２膜を用いた場合には、ＳｉＯ２が著しい親水性を有するため、非特異吸着はほとんど存在せず、複雑な表面修飾を行うことなくノイズを下げることが可能となる。
【００５９】
一方、光導波層が積層構造の最表面に内部金属層を有している場合には、この内部金属層による蛍光色素分子の金属消光の影響が強くなるため、内部金属層と蛍光色素分子との距離を精密に制御する必要がある。金属消光の影響の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、内部金属層と蛍光色素分子１５との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが好ましい。このような制御は、一般的にはポリマー膜、ＳｉＯ２膜、ＳＡＭ膜もしくはＣＭＤ膜のようなバリア層を金属層上に設けることにより行われているが、面倒かつ煩雑であり実用にはあまり向いていない。しかしながら、本発明において、蛍光物質が、蛍光色素分子を充分多く含有する場合には、内部金属層上に金属消光防止のための膜を設けなくても、必然的に内部金属層と多くの蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。これにより従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
【００６０】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態の検出方法および装置について図３Ｂを参照して説明する。図３Ｂに示す放射光検出装置１’は、第1の実施形態の蛍光検出装置１と光検出器３０の配置位置が異なる。具体的に放射光検出装置１’は、光検出器３０を、蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することによって誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出するように配置したものである。ここでは、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してあり、第１の実施形態と同様の要素についての説明は特に必要のない限り省略する。
【００６１】
以下、本実施形態に係る検出方法の原理について説明する。
第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、この界面上に生じる第１のエバネッセント波（図示省略）が光導波モードと結合して、光導波層１２ｂ上の液体試料Ｓ側に第２のエバネッセント波Ｅｗが誘起される。この第２のエバネッセント波Ｅｗにより光導波層１２ｂ表面に電場増強領域が形成される。このとき、第２のエバネッセント波Ｅｗによる電場増強領域内に蛍光物質Ｆが存在する場合には、その蛍光物質Ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。なお、この電場増強領域外の蛍光物質Ｆは励起されず蛍光Ｌｆを発しない。そして、光導波層１２ｂ上で生じた蛍光Ｌｆが、金属層１２ａに表面プラズモンを励起することによって、誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ特定の角度で放射光Ｌｅが放射される（この現象をSurface Plasmon-Coupled Emission（ＳＰＣＥ）という。）。光検出器３０は、この放射光Ｌｅを検出するように配置されている。
【００６２】
放射光Ｌｅは蛍光Ｌｆが金属層１２ａの特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光Ｌｆの波長に応じてその結合する波数が定まるため、その波数に応じて放射光Ｌｅの放射角度が定まる。通常、励起光Ｌｏの波長と蛍光Ｌｆの波長とは異なることから、蛍光Ｌｆにより励起される表面プラズモンは励起光Ｌｏにより励起される表面プラズモンとは異なる波数に起因するものであるため、放射光Ｌｅは励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射される。
【００６３】
本実施形態の検出方法においても、被検出物質Ａに、蛍光標識として蛍光物質Ｆを付与して第１の実施形態と同様のセンシングを行う。したがって、本実施形態においても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６４】
さらに、本実施形態では、ＳＰＣＥを利用することにより、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【００６５】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図４〜６を参照して説明する。ここでは、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００６６】
図４に示す蛍光検出装置２は、蛍光検出装置２における検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌｏを照射させる励起光照射光学２０と、蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【００６７】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）からなる光源２１と、試料セル５０の基台５１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とに加え、光源２１から出射された励起光Ｌｏを集光しプリズム２２の一面から入射させるレンズ２４およびミラー２５からなる導光部材と、半導体レーザ光源２１を駆動するドライバ２８とを備えている。
【００６８】
図５Ａは、試料セル５０の構成を示す平面図、図５Ｂは試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、液体試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した液体試料Ｓを排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ５３により構成された流路５２を上部に有する基台５１は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台５１はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。
【００６９】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体Ｂ２（第２の結合物質）が表面修飾された蛍光物質Ｆ（以下、標識２次抗体という）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体Ｂ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体Ｂ２と特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１および第２の測定エリア５８，５９がセンサチップ部に相当する。なお、図４においては、液体試料Ｓが注入されて抗体が標識２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために、標識２次抗体吸着エリア５７にはもはや標識２次抗体は存在していない。本例では、センサチップ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【００７０】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の基台５１上にはそれぞれ金属層および光導波層として、Ａｕ膜（図示省略）およびＳｉＯ２膜（５８ｂおよび５９ｂ）が形成されている。第１の測定エリア５８のＳｉＯ２膜５８ｂ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＳｉＯ２膜５９ｂ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。上記標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質（標識２次抗体Ｂ２）と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｂ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００７１】
試料セル５０は、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの蛍光検出測定の後、第２の測定エリア５９を蛍光検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光検出を行うように構成されている。
【００７２】
上記構成の蛍光検出装置２を用いた検出方法の原理は、第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても蛍光標識として蛍光物質を用いて、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質Ｆの励起を行っているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。
【００７３】
さらに、この第３の実施形態の蛍光検出装置２および検出方法を利用した、センシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図６を参照して説明する。
【００７４】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図６中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図６中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が付与された蛍光物質とが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体Ｂ２が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体Ｂ２を洗い流す。
【００７５】
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。標識２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は標識２次抗体Ｂ２の流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この蛍光信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することができる。
【００７６】
図４〜６では、第１の測定エリア５８に固定されている１次抗体Ｂ１は、光導波層５８ｂ表面に２次元的に設けられているが、図７Ａに示すように、光導波層５８ｂ上のメンブレンの３次元的に広がった領域に１次抗体Ｂ１が固定化されていてもよいし、図７Ｂに示すように、光導波層５８ｂ表面に、表面積を広げるための構造７０を設けてその上に１次抗体Ｂ１が３次元的に固定化されていてもよい。
【００７７】
構造７０はポリスチレン、ガラスなどの透光性物質であればなんでもよいが、後述する第２のエバネッセント波の擾乱を起こさないように、屈折率が低く、構造体の大きさ（厚さ）が小さいものが好ましい。作製方法は蒸着法、スパッタ法、スピンコートなどの方法で薄膜を作り、その後、プラズマ処理や溶剤処理によって表面をランダムに粗くする方法、あるいは直径１０〜５００ｎｍ程度のポリスチレン微粒子を光導波層５８ｂ表面に物理吸着や化学結合により固定化させる方法がある。
【００７８】
さて、第３の実施形態で示したような、マイクロ流路中で流路壁面に蛍光物質を標識として固定化するアッセイを行うとき、流路内の蛍光物質の運動は拡散が支配的になる。蛍光物質の拡散時間はその粒径によって顕著な違いが現れることから、蛍光物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。なお、以下においては、蛍光物質が球状であるとして粒径の範囲を導出した。
【００７９】
蛍光物質の拡散時間τは、式（１）で表される。
τ＝ｈ2／Ｄ ・・・（１）
ここで、ｈ：拡散距離、Ｄ：拡散定数である。
【００８０】
アインシュタイン−ストークスの式（２）を用いると、蛍光物質の流体力学半径ｄから拡散定数Ｄが求まるので、サンドイッチ形成に必要な１次抗体までの距離（拡散距離）ｈだけ拡散するのに要する拡散時間τが得られる。拡散距離ｈは流路内の２次元平面上にサンドイッチを形成する場合は流路の高さを表し、メンブレンなどの３次元構造内にサンドイッチを形成する場合は３次元構造上に固定されている１次抗体までの距離を表す。
Ｄ＝ＫBＴ／３πηｄ ・・・（２）
ここで、ＫB：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒の粘性、ｄ：流体力学半径である。
【００８１】
図８は、サンドイッチ形成に必要な１次抗体までの距離ｈを３０μｍとし、蛍光物質の直径φに対する、蛍光物質が距離３０μｍ拡散するのに要する時間を図示したものである。一般に、診断レベルで実用的なアッセイ時間は１０分以下である。図８から、３０μｍの高さのマイクロ流路で１０分以下のアッセイ時間を達成するためには、蛍光物質の粒径はφ５３００ｎｍ以下が有効であるといえる。このことから、マイクロ流路での反応においては、蛍光物質の粒径がφ５３００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００８２】
さらに、光導波モード増強による蛍光検出にあたり、蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱を考慮する必要がある。
既述のように、蛍光物質の材質には水溶媒（屈折率ｎ＝１．３３）より屈折率の高いポリスチレンやガラスを用いている。例えばポリスチレンの屈折率ｎ＝１．５９〜１．６０である。このような高屈折率の蛍光物質が光導波層近傍に位置することによって第２のエバネッセント波の発生が阻害される場合がある。この現象を例えばプリズム層１０１、金属層１０２ａ（屈折率ｎ＜１）、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ（屈折率ｎ＝１．４５〜１．４６）、溶媒層１０３の４層に分けた多層膜近似で考察した。図９ＡはＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上に水溶媒層のみである場合に、図９ＢはＳｉＯ２光導波層１０２ｂにポリスチレンの蛍光物質１０４が存在する場合に、プリズム層１０１側から光ビームを入射してＳｉＯ２光導波層１０２ｂ表面に生じせしめた電場Ｅを模式的に示している。
プリズム層１０１、溶媒層１０３（１０３’）は十分な膜厚があり、プリズム層１０１、金属層１０２ａおよびＳｉＯ２光導波層１０２ｂの屈折率、膜厚がすでに決まっていると仮定すると、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ表面上に誘起される第２のエバネッセント波の状態はＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上の溶媒屈折率によって決まる。図１０は、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上に水溶媒層のみである場合（実線で示す）と、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ上にポリスチレン層が存在する場合（破線で示す）について、励起光の界面への入射角度と反射率との関係をシミュレーションにより求めたグラフである。このグラフから溶媒側に水溶媒層がある場合には、第２のエバネッセント波が発生する共鳴角が存在するが、ポリスチレン層がある場合には第２のエバネッセント波が発生しない（共鳴角が現れない）ことがわかる。
これは、第１のエバネッセント波がＳｉＯ２光導波層１０２ｂ内で光導波モードと結合するための条件が満たされなくなったためである。すなわち、ＳｉＯ２光導波層１０２ｂ（屈折率ｎ＝１．４５）は、両側を屈折率の小さい金属層１０２ａ（屈折率ｎ＜１）および水溶媒（屈折率ｎ＝１．３３）によって挟まれることにより、光導波路としての役割を果たしていたが、水溶媒側にポリスチレン（屈折率ｎ＝１．５９）が存在することにより、この界面で全反射が生じなくなったためである。このことから、屈折率の高い蛍光物質(ポリスチレンやガラス製)を用いてアッセイを行い、光導波層１０２ｂ近傍に蛍光物質が固定されると、第２のエバネッセント波の発生が阻害されてその電場強度が低減してしまい、蛍光測定ができなくなると推察される（図９Ｂ）。
【００８３】
このような、蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱を考慮に入れ、蛍光物質の粒径と蛍光量との関係をシミュレーションした結果を図１１に示す。粒径が大きくなれば内包される蛍光分子数が増えるので、粒径が４００ｎｍまでは蛍光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径５００ｎｍを超えると急激に蛍光量が減少していくことが分かった。これは、粒径５００ｎｍを超えると上述の蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱が大きくなってくるためである。図１１から、蛍光物質の粒径の増加による蛍光量の増加と蛍光物質による第２のエバネッセント波の擾乱とを考慮し、蛍光物質の好適な粒径を判断する必要がある。したがって、蛍光量が最大ピークを示した粒径３００ｎｍの蛍光量から、蛍光物質の粒径を、１桁程度以上蛍光量が落ちないようにするために７０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲とすることが好ましく、０．５桁程度以上蛍光量が落ちないようにするために１００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲とすることがより好ましい。なお、上記においては、蛍光物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、蛍光物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。
【００８４】
さらに、流路内で１次抗体を固定するための３次元構造を作成する手間を省き、簡素化した２次元平面上でアッセイを行うとき、蛍光物質の粒径の好ましい範囲を以下のように導出した。
【００８５】
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として１ｐＭ（ピコモーラ：×１０-12ｍｏｌ／ｌ）程度は必要であるといわれている。そこで、この１ｐＭ以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ２桁、すなわち、１００ｐＭまで検出できる感度特性を目標値として蛍光物質の好ましい粒径を導出した。
１ｐＭの抗原濃度の検体について、アッセイ時の条件を検出領域の直径を１ｍｍ（面積３．１ｍｍ2）、流路を流下する検体量を３０μｌ（この検体量は一般的な簡易血液診断装置において、流路に流す前の前処理後、あるいはメンブレンフィルターによって血球分離された後の標準的な値である。）、抗原捕捉率を０．２％（一般的に抗原捕捉率は、０．２％〜２％程度であることから、ここでは、捕捉率が最低であった場合でも検出可能とするため、０．２％に設定した。）とすると、１．２×１０4個／ｍｍ2の抗原を検出領域に固定し検出できればよい。ここで、１．２×１０4個／ｍｍ2を目標固定量とする。一方、落射蛍光検出装置（ＬＡＳ−４０００、落射蛍光式、富士フイルム社製）を用いて測定した、前述の手順で作製した蛍光物質（直径３００ｎｍ、励起波長５４２ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍ）の検量線データを図１２に示す。ここでは中心波長５２０ｎｍの緑色ＬＥＤの励起光を用い、緑色蛍光用フィルタを通して蛍光を検出した結果を示している。このときの検出限界密度はエラーバーが蛍光検出装置のバックグラウンド値の３σ(σは標準偏差)と交わった１.０×１０3個／ｍｍ2であった。
【００８６】
この結果、φ３００ｎｍの蛍光物質を用いると目標固定量（１．２×１０4個／ｍｍ2）の１２分の１の固定量で検出可能であるといえ、１ｐＭ以下の抗原濃度で抗原検出が可能となる高感度化が達成できていることが明らかとなった。また、この結果から、蛍光物質の粒径を３００ｎｍより小さくしても１ｐＭの検体について測定可能であることが明らかである。同一密度で蛍光色素分子が内包されている場合、蛍光物質１個あたりの蛍光発光量は蛍光物質半径の三乗（ｒ3）に比例する。従って、φ１３０ｎｍの蛍光物質を用いた場合、１個あたりの蛍光量はφ３００ｎｍの蛍光物質の１／１２倍になるが１ｐＭの抗原濃度での検出が十分可能であるといえる。ここから、１ｐＭの抗原濃度での検出を行うための蛍光物質粒径の下限値はφ１３０ｎｍ程度と定められる。なお、ここでは、蛍光物質中の蛍光色素分子密度が略一定であると想定している。
一方、蛍光物質の粒径を大きくすると内包される蛍光色素分子量が増加するため蛍光信号強度も増大し検出光量の点で有利になるが、２次元平面上の一定面積に固定できる蛍光物質の個数は立体障害の観点から固定量に限界がある。ダイナミックレンジ２桁として１００ｐＭを検出上限濃度とすると、固定量は１．２×１０6個／ｍｍ2となる。このとき、１つの抗原に対し１つの蛍光物質が結合するとして最密充填となる大きさは、φ５００ｎｍである。このことから目標固定量を実現できる蛍光物質の上限サイズはφ５００ｎｍである。
以上の観点から、蛍光物質のさらに好ましい粒径は１３０ｎｍ〜５００ｎｍである。
【００８７】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法として、本発明の一実施形態の検出用キットを用いた方法について図１３および１４を参照して説明する。図１３および１４において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００８８】
図１３Ａは検出用キット６０の試料セル６１の構成を示す平面図、図１３Ｂは試料セル６１の側断面図、図１３Ｃは標識用溶液入りアンプル６２を示す図である。
【００８９】
検出用キット６０は、試料セル６１と、蛍光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３とを備えている。
【００９０】
試料セル６１は、試料セル６１内に２次抗体Ｂ２で表面修飾した蛍光物質Ｆを物理吸着した物理吸着エリアを備えない点でのみ上述の第３の実施形態の試料セル５０と異なり、その他は試料セル５０と略同一の構成である。
【００９１】
蛍光検出装置としては図４に示した第３の実施形態のものを同様に用いることができ、本実施形態の検出用キット６０を用いれば、第３の実施形態の場合と同様に被検出物質に蛍光物質による標識がなされ、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質の励起を行うため、同様に精度の高い測定を行うことができる。
【００９２】
さらに、この検出用キット６０を用いた場合の蛍光検出装置２におけるセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
【００９３】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、標識２次抗体Ｂ２が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００９４】
このように、血液Ｓｏを注入口から注入し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１および２次抗体Ｂ２と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの蛍光信号を検出する。標識２次抗体Ｂ２と結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの蛍光信号は標識２次抗体Ｂ２の流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この蛍光信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの蛍光信号を補正してもよい。
【００９５】
蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００９６】
上述の各実施形態においては蛍光標識として、多数の蛍光色素分子１５と蛍光色素分子１５を内包する透光材料１６とからなる蛍光物質Ｆを用いる形態について説明したが、図１５に示すように、さらに、蛍光物質Ｆの表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられていてもよい。金属被膜１９は、透光材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部透光材料１６が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができ、層厚としては１５ｎｍ程度が好ましい。
蛍光物質Ｆの表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０の光導波層１２ｂ上に発生した第２のエバネッセント波が蛍光物質Ｆの金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子１５をさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質Ｆのような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
この金属被膜された蛍光物質Ｆ’は、例えば、この金属被膜１９上に抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２を修飾し、上述の第１の実施形態から第４の実施形態における蛍光物質Ｆと同様にして利用することができる。
【００９７】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【００９８】
さて、上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光Ｌｏとしては、図１６に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属層１１２ａとの界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、光導波層上に第２のエバネッセント波を励起することができる。光導波層上への試料供給の前後において、光導波層上の媒質の屈折率が変化し、そのために光導波モードが誘起される共鳴角が変化する。このため、上述の実施形態のように平行光を励起光Ｌｏとして用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図１６に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを励起光Ｌｏとして用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００９９】
また、上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイについて説明したが、本発明の検出方法および装置、試料セルおよび測定キットはサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイの場合にも適用することができる。
【０１００】
図１７Ａ〜Ｃを参照して、競合法について簡単に説明する。
図１７Ａに示すように、例えば、抗原Ａと同一の免疫反応を示す２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）を蛍光物質Ｆに修飾させておく。光導波層１２ｂ上には、抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３といずれとも特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）を固定化しておく。２次抗体Ｃ３が修飾された蛍光物質Ｆを所定濃度で、抗原Ａと混合し、光導波層１２ｂ上に固定化された１次抗体Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原Ａと蛍光物質Ｆとの混合時における蛍光物質Ｆの濃度は既知である。
【０１０１】
競合法では、図１７Ｂに示すように、抗原Ａの濃度が高ければ、１次抗体Ｃ１と結合する２次抗体Ｃ３の量が少なく、すなわち光導波層１２ｂ上の蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなる。一方、図１７Ｃに示すように、抗原Ａの濃度が低ければ、１次抗体Ｃ１と結合する２次抗体Ｃ３の量が多く、すなわち光導波層１２ｂ上の蛍光物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は抗原Ａにエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１０２】
図１８は、本発明の他の実施形態の試料セル５０’を用いた競合法によるアッセイ手順を示す図である。試料セル５０’は、第３の実施形態の蛍光検出装置２において、試料セル５０に換えて用いることができる。試料セル５０とは、流路内に備えられている抗体が異なり、本試料セル５０’は競合法によるアッセイに適用されるものである。
【０１０３】
試料セル５０’においては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）が表面修飾された蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、抗原Ａおよび標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１が固定された第１の測定エリア５８’、抗原Ａとは結合せず標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。
【０１０４】
第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’の基台５１上にはそれぞれ金属層および光導波層として、Ａｕ膜（図示省略）およびＳｉＯ２膜（５８ｂおよび５９ｂ）が形成されている。第１の測定エリア５８’のＳｉＯ２膜５８ｂ上にはさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＳｉＯ２膜５９ｂ上にはさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｃ３と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリア５９’には１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。上記標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質（標識２次抗体Ｃ３）と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、ＳｉＯ２膜５８ｂ・５９ｂ、液体試料Ｓなど光導波モードによる増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９’に標識２次抗体Ｃ３、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【０１０５】
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０’の注入口５４ａから注入し、アッセイを行う手順について図１８を参照して説明する。
【０１０６】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１８において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１８において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体Ｃ３が付与された蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体Ｃ３の一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体Ｃ３が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体Ｃ３を洗い流す。
【０１０７】
このように、血液Ｓｏを注入口から注入し、第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの蛍光強度を検出することにより、抗原Ａの有無および／またはその濃度を検出することができる。
【０１０８】
本実施形態の試料セルを用いた検出方法においても蛍光標識として蛍光物質を用い、かつ第２のエバネッセント波を利用して蛍光物質の励起を行っているから、上記各実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で精度の高い測定を行うことができる。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例１〜３のセンサチップ上に蛍光物質（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ、粒経：２００ｎｍあるいは５００ｎｍ）を固定し、光導波モードによる電場増強を実施した場合について、電場増強度（励起光の強度に対する、電場増強場の強度の割合）および蛍光信号増強度（比較例で得られる蛍光信号量に対する、実施例で得られる蛍光信号量の割合）の評価を行った。なお、実施例１〜３において、励起光の波長は７８０ｎｍ、誘電体プリズムの材質は石英、センサチップ上の媒質は水である。
【０１１０】
＜実施例１＞
図１９Ａに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（６００ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１１】
＜実施例２＞
図１９Ｂに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）、金膜（５ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１２】
＜実施例３＞
図１９Ｃに示すように、石英プリズム上に金膜（３０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）、金膜（３０ｎｍ）、ＳｉＯ２膜（５５０ｎｍ）を順に有するセンサチップを用いた。
【０１１３】
＜比較例＞
一般的に用いられる表面プラズモンによる電場増強を比較例とした。すなわち図１９Ｄに示すように、石英プリズム上に金膜（５０ｎｍ）を有するセンサチップを用いて表面プラズモンを誘起した。
【０１１４】
図２０は、実施例１〜３および比較例における電場増強度とセンサチップ表面からの距離との関係を示す図である。また、参考のために粒経が２００ｎｍの蛍光物質も模式的に図示している。これにより、光導波モードによる第２のエバネッセント波は、表面プラズモンによる第１のエバネッセント波に比して、減衰の程度が緩やかでその染み出し長（センサチップ表面における電場増強度が１／ｅになるまでの長さ）が長いことがわかる。例えば、比較例における染み出し長はおよそ２００ｎｍであるのに対し、実施例１における染み出し長はおよそ４５０ｎｍである。また、実施例２および３における染み出し長は、５００ｎｍを超える染み出し長を有する。つまり、第２のエバネッセント波は第１のエバネッセント波に比して染み出し長が長いこと、そして光導波層を積層構造として厚くすることにより染み出し長がより長くすることができることが実証された。
【０１１５】
一方図２１は、実施例１〜３および比較例における蛍光信号増強度を示す図である。２００ｎｍの蛍光物質を用いた比較例で得られた蛍光信号量を基準にして、その他の場合について何倍の蛍光信号量が得られたかを示している。２００ｎｍの蛍光物質を用いた実施例では、蛍光信号増強度は２．４〜３．２という結果となった。ある程度の増強度は得られているが、実施例間ではそれほど大きな変化はなかった。これは、励起され蛍光を発する、蛍光物質中に包含される蛍光色素分子の数に限りがあるためと考えられる。このことを示すように、５００ｎｍの蛍光物質を用いた実施例では、蛍光信号増強度は実施例１で２８．９倍、実施例２で３５．９倍、実施例３で４９．２倍という結果になった。
【０１１６】
以上により、光導波モードによる電場増強を利用する本発明に係る検出方法を用いれば、５００ｎｍという大きな蛍光物質を蛍光標識に用いても、蛍光物質に内包される蛍光色素分子を効率よく励起することができ、蛍光信号強度の低下およびばらつきを抑制して、より高感度かつ定量性の高い検出が可能であることが実証された。
【０１１７】
＜設計変更＞
上記第３および第４の実施形態においては、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、蛍光物質に内包される蛍光色素分子から生じる蛍光を用いる場合について述べてきたが、これらの実施形態はこのような場合に限られるものではない。すなわち、上記第３および第４の実施形態においても、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、蛍光物質に内包される蛍光色素分子から生じる蛍光が金属層に表面プラズモンを励起することにより誘電体プレートと金属層との界面の誘電体プレート側へ放射される、表面プラズモンからの放射光を検出することによって、測定をすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】光導波モードを誘起するための光学配置の例を示す概略断面図
【図２】光導波モードの発生と入射光の入射角度の関係を示す概略図
【図３Ａ】第１の実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図３Ｂ】第２の実施形態による放射光検出装置を示す概略構成図
【図４】第３の実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図５】第３の実施形態の試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図６】第３の実施形態による試料セルを用いたアッセイ手順を示す図
【図７Ａ】光導波層上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その１）
【図７Ｂ】光導波層上に固定される抗体Ｂ１のその他の固定例（その２）
【図８】蛍光物質の粒径に対する拡散時間を示すグラフ
【図９Ａ】光導波層上に水溶媒層がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図９Ｂ】光導波層上に蛍光物質がある場合の電場Ｅを示す模式図
【図１０】図９ＡおよびＢの場合の入射角度と反射率との関係を示すグラフ
【図１１】蛍光物質の粒径と蛍光量の関係を示す図
【図１２】蛍光物質の検量線データを示す図
【図１３】第４の実施形態の検出用キットの（Ａ）試料セルを示す平面図、（Ｂ）試料セルを示す側断面図および（Ｃ）標識用溶液を示す図
【図１４】検出用キットを用いた場合のアッセイ手順を示す図
【図１５】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１６】励起光照射光学系の他の例を示す図
【図１７】競合法の原理を説明するための模式図
【図１８】第３の実施形態による試料セルを用いた競合法アッセイ手順を示す図
【図１９】（Ａ）実施例１（Ｂ）実施例２（Ｃ）実施例３（Ｄ）比較例におけるセンサチップの構造を示す概略断面図
【図２０】実施例における電場増強度とセンサチップ表面からの距離の関係を示す図
【図２１】実施例における蛍光信号増強度を示す図
【符号の説明】
【０１１９】
１、２ 蛍光検出装置
１’ 放射光検出装置
３、１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ａ 金属層
１２ｂ 光導波層
１３ 試料保持部
１５ 蛍光色素分子
１６ 透光材料
１９ 金属被膜
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
Ｆ 蛍光物質
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｓ 試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートの一面に、金属層と光導波層とをこの順に有するセンサチップを用意し、
前記光導波層上に試料を接触させることにより、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質を前記光導波層上に結合させると共に、
前記誘電体プレートと前記金属層との界面に対し、該誘電体プレート側から全反射条件を満たすように励起光を入射して、該界面に第１のエバネッセント波を発生せしめ、
前記第１のエバネッセント波を、前記光導波層内で光導波モードと結合させることにより、該光導波層の上面に第２のエバネッセント波を発生せしめ、
該第２のエバネッセント波により、前記蛍光標識物質の蛍光標識を励起し、
該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて前記被検出物質の量を検出する検出方法であって、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させる透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に表面プラズモンを励起することにより前記界面の前記誘電体プレート側へ放射される、前記表面プラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、該プレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、
前記光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記センサチップ部より上流側の前記流路内に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質とを備えてなることを特徴とする検出用試料セル。
【請求項１０】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載の検出用試料セル。
【請求項１１】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１０に記載の検出用試料セル。
【請求項１２】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項９から１１いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１３】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項９から１２いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項１３に記載の検出用試料セル。
【請求項１５】
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、該プレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、前記光導波層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される標識用溶液であって、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質を含む標識用溶液とを備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１６】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１５に記載の検出用キット。
【請求項１７】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１６に記載の検出用キット。
【請求項１８】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１５から１７いずれかに記載の検出用キット。
【請求項１９】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項１５から１８いずれかに記載の検出用キット。
【請求項２０】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項１９に記載の検出用キット。
【請求項１】
誘電体プレートの一面に、金属層と光導波層とをこの順に有するセンサチップを用意し、
前記光導波層上に試料を接触させることにより、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質を前記光導波層上に結合させると共に、
前記誘電体プレートと前記金属層との界面に対し、該誘電体プレート側から全反射条件を満たすように励起光を入射して、該界面に第１のエバネッセント波を発生せしめ、
前記第１のエバネッセント波を、前記光導波層内で光導波モードと結合させることにより、該光導波層の上面に第２のエバネッセント波を発生せしめ、
該第２のエバネッセント波により、前記蛍光標識物質の蛍光標識を励起し、
該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて前記被検出物質の量を検出する検出方法であって、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させる透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に表面プラズモンを励起することにより前記界面の前記誘電体プレート側へ放射される、前記表面プラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、該プレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、
前記光導波層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記センサチップ部より上流側の前記流路内に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質とを備えてなることを特徴とする検出用試料セル。
【請求項１０】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載の検出用試料セル。
【請求項１１】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１０に記載の検出用試料セル。
【請求項１２】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項９から１１いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１３】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項９から１２いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項１３に記載の検出用試料セル。
【請求項１５】
蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて被検出物質の量を検出する検出方法に使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、該プレートの試料接触面側の所定領域に順に設けられた金属層および光導波層からなるセンサチップ部と、前記光導波層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される標識用溶液であって、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された蛍光物質を含む標識用溶液とを備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１６】
前記蛍光物質の粒径が、５３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１５に記載の検出用キット。
【請求項１７】
前記蛍光物質の粒径が、１００ｎｍ〜７００ｎｍであることを特徴とする請求項１６に記載の検出用キット。
【請求項１８】
前記蛍光物質の表面に、前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項１５から１７いずれかに記載の検出用キット。
【請求項１９】
前記光導波層が、１層以上の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造を有するものであることを特徴とする請求項１５から１８いずれかに記載の検出用キット。
【請求項２０】
前記積層構造が、前記金属層側から順に前記内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることを特徴とする請求項１９に記載の検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１０−８２６３（Ｐ２０１０−８２６３Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６８６９０（Ｐ２００８−１６８６９０）
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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