標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析の性能を改善する方法
【構成】標識物としてパーオキシダーゼに用い、ラジカル安定化剤（増感剤）存在下にルミノール／過酸化水素の化学発光反応を起こさせ、生体成分を測定する場合、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を存在させ、発光量を検出・測定する。
【効果】非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、及び／又は特異的発光反応すなわちシグナル量を増強させ、したがって、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させ、あるいは発光を持続安定化させることができる。測定値の信頼性の向上に寄与する。
【効果】非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、及び／又は特異的発光反応すなわちシグナル量を増強させ、したがって、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させ、あるいは発光を持続安定化させることができる。測定値の信頼性の向上に寄与する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標識物としてパーオキシダーゼに用いる化学発光分析の性能を改善する方法に関するもので、臨床検査分野等における生体微量成分の分析・定量に有用である。
【０００２】
【従来の技術】分析対象物質を感度よく検出・測定する方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特異結合試薬（予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識しておく場合が多い）を検体と反応させ、引き続いて標識物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生じる信号を検出・測定する方法（いわゆる、酵素免疫測定法等）が知られている。また、この酵素免疫測定法には、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法が知られている。
【０００３】パーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生じる信号を効率よく測定する方法として、パーオキシダーゼにより触媒されるルミノール／過酸化水素の化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ルミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感剤として用いられる（Methods in Enzymology,Vol.133,p.331-353,1986；特開平２−２９１２９９号公報）。
【０００４】一方、パーオキシダーゼの活性はポリオキシエチレンエーテル類の添加により増大することも知られており（Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 1981; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 1981)、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキシエチレンエーテル類を含有させ、Ｓ／Ｎ比もしくは測定感度を高める方法も開示されている（特表平２−５０３０２９号公報）。
【０００５】また従来、抗体の非特異的反応をブロックする目的で、アルブミン等の蛋白質を固相担体に固定化することはよく行われている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】分析対象物質が生体の超微量物質等である場合には、上記の方法よりも更に感度の高い方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更に感度の高い方法を開発すること目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラジカル安定化剤（増感剤）の存在下にパーオキシダーゼを用いる化学発光分析において、非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（以下、ノイズともいう。）を低下させ、及び／又は特異的発光反応（以下、シグナルともいう。）を増強させ、すなわち、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させる方法を種々検討したところ、反応液中の発光量を検出・測定する際に反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を添加すると、上記目的を達成することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は下記の（１）〜（８）に関する。
（１）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（２）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳を存在させる、化学発光免疫分析の性能を改善する方法。
（３）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に卵白アルブミンを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（４）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に蛋白質分解物を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（５）蛋白質分解物がカゼイン分解物である上記（１）又は（４）の方法。
（６）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に糖アルコールを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（７）糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである上記（１）又は上記（６）の方法。
（８）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオン性界面活性剤を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【０００９】本発明における化学発光分析は、ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定する分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェスターン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【００１０】本発明で用いられるパーオキシダーゼは、西洋ワサビの塩基性アイソザイムが好適である。西洋ワサビの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの型が知られているが、これらの中ではＣ型が最も好ましい。
【００１１】発光反応に用いられるルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。
【００１２】本発明に用いられるラジカル安定化剤としては、ｐ−ヨードフェノール、４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノール等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾール等のベンゾチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジル）−プロピルスルホン酸塩等がある。
【００１３】これらのラジカル安定化剤の存在下にパーオキシダーゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行うと、ラジカル安定化剤が増感剤ラジカルとなり、この増感剤ラジカルがルミノールと反応し発光する。
【００１４】反応のｐＨは高いほど発光量は強くなるが、パーオキシダーゼの触媒能に依存しない発光が増大するので、両者を考慮して７.０〜１１.０の範囲で行うとよい。
【００１５】本発明に用いる脱脂粉乳は市販品が使用できる。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％（重量／容量％、以下、同じ）、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１６】本発明に用いる卵白アルブミンは市販品が使用できる。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１７】本発明に用いる蛋白質分解物としては、カゼイン、大豆蛋白質等の蛋白質の酵素分解物や酸分解物等がある。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１８】本発明に用いる糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、リビトール、アラビトール、エリスリトール等の６〜４単糖アルコールがある。その濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜１０％、好ましくは０．２５％〜２．０％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、１０％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１９】本発明に用いる非イオン性界面活性剤としては、アシルソルビタン、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、オクチルフェノールエチレンオキサイド、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類等があり、これらはアトラス パウダー社（Atlas Powder Co.）製造のスパン２０（ソルビタンモノラウレート）、スパン４０（ソルビタンモノパルミテート）、スパン６０（ソルビタンモノオレエート）、スパン８０（ソルビタンモノステアレート）、スパン８５（ソルビタントリオレエート）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ツイーン４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、ツイーン６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ツイーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ツイーン８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート）、ブリッジ ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）及びブリッジ ５８（ポリオキシエチレンセチルエーテル）等、ローム アンド ハース社(Rohm & Haas Co.)製造のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）及びトリトンＸ−４０５（ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル）等、あるいはシグマ社からノニデットＰ−４０（オクチルフェノールエチレンオキサイド）の商品名で販売されている非イオン性界面活性剤等を入手できる。
【００２０】また、非イオン性界面活性剤の添加濃度は、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．００１〜２．０％、より好ましくは０．０１〜０．５％の範囲である。濃度が０．００１％未満でも、２％を超えても、Ｓ／Ｎ比を向上させる効果は少ない。
【００２１】以上の添加剤のなかで、脱脂粉乳はノイズ量を著しく低減させる効果が特徴的である。卵白アルブミンは、シグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させ、生じた発光を安定的に持続させ、更に発光基質溶液の保存安定性を高める効果が特徴的である。蛋白質分解物はシグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させる効果がある。糖アルコールはシグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させる効果がある。非イオン性界面活性剤はノイズ量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、シグナル量を増加させる効果が特徴的である。
【００２２】
【実施例】
実施例１ 試薬ブランク（ノイズ）に及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール、又は非イオン性界面活性剤の効果添加剤無添加（対照）の試験は以下のように操作した。すなわち、外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０；以下、発光用ホウ酸緩衝液という。）１００μｌ、２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液(日立化成(株)社製)５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社製、MLR-100)を用いて、化学発光量を２０分間経時的に測定した。
【００２３】一方、添加剤添加の試験は、発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに脱脂粉乳、卵白アルブミン、カゼイン分解物、糖アルコール、又は非イオン性界面活性剤を反応液の最終濃度で下記の表１に示す濃度で含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用い、上記と同様に操作した。その結果、試薬ブランクは反応の間（２０分間）いずれもほぼ一定であった。また、反応時間１０分ににおける試薬ブランク（ノイズ）は表１に示す通りであった。
【００２４】
【表１】
表１ 試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖 アルコール、又は非イオン性界面活性剤の効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント 無添加（対照） ─ ２４０ 脱脂粉乳 ０．０５ ５０ 〃 ０．１０ ３０ 卵白アルブミン ０．０５ １２０ 〃 ０．１０ １００ カゼイン分解物 ０．０５ １４０ 〃 ０．１０ ２００ マンニトール ０．２５ １２０ ０．４５ ６５ ソルビトール ０．４５ ６５ ツィーン２０ ０．０５ ２３３ ツィーン８０ ０．０５ ２３６ トリトンＸ−１００ ０．０５ ２３４ ノニデットＰ−４０ ０．０５ ２３９ ブリッジ３５ ０．０５ ２３８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２５】表１の結果から、脱脂粉乳は試薬ブランクを著しく低減させ、卵白アルブミン、カゼイン分解物及び糖アルコールは試薬ブランクを中程度に低減させるが、ツィーン２０等の非イオン性界面活性剤は試薬ブランクにほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
【００２６】実施例２ 脱脂粉乳及びツィーン２０の存在下、試薬ブランク値（ノイズ）に及ぼす糖アルコールの効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、０．１％脱脂粉乳及び０．２％ツィーン２０含有の発光用ホウ酸緩衝液１００μｌ、２ｍＭ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、下記表２に示した濃度のマンニトールもしくはソルビトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、以下実施例１と同様に操作し、化学発光量を測光した。対照としては、糖アルコールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌの代わりに、糖アルコールを含有しない４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した（表２）。
【００２７】
【表２】
表２ 脱脂粉乳及びツィーン２０存在下、試薬ブランクに及ぼす糖アルコ ールの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 糖アルコール 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント 無添加（対照） ０．０ ３０ マンニトール ０．２５ １５ 〃 ０．４５ ８ ソルビトール ０．４５ ８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２８】表２の結果から、脱脂粉乳及びツィーン２０の存在下において、マンニトール及びソルビトールはいずれも試薬ブランクを更に低下させることが分かる。
【００２９】実施例３ マンニトール存在下、試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物を０.１０％（最終濃度：０.０５％）又は０.２％（最終濃度：０．１％）含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−(２'−メチル)チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトール含有の４ｍＭ過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液(日立化成(株)社製)５０μｌをとり、以下実施例１と同様に操作し、化学発光量を測光した。対照としては、脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物を含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに、これらを含有しない発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した(表３)。
【００３０】
【表３】
表２ マンニトール存在下、試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブ ミン、蛋白質分解物の効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 蛋白質又は 最終濃度 試薬ブランク 蛋白質分解物 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント なし（対照） ０．０ ７０ 脱脂粉乳 ０．０５ ２０ 〃 ０．１０ １０ 卵白アルブミン ０．０５ ３０ 〃 ０．１０ ２４ カゼイン分解物 ０．０５ ３５ 〃 ０．１０ ５４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３１】表３の結果から、マンニトール存在下、脱脂粉乳、卵白アルブミン及びカゼイン分解物はいずれも、試薬ブランクを低下させることが分かる。これらの中で脱脂粉乳が試薬ブランクを最も著しく低下させた。
【００３２】実施例４ シグナル量に及ぼすマンニトールの効果特異的反応に基づくシグナル量は、添加物無添加（対照）では以下のようにして求めた。すなわち、外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼ(東洋紡グレードＩ-Ｃ)で標識した抗エンドセリン１単クローン抗体(ヤマサ醤油(株)社製，MCA ET-02)の１０万倍希釈溶液(希釈液：発光用ホウ酸緩衝液を使用)１００μｌ、２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて発光量を、混合直後、１分後、２分後、３分後、４分後及び５分後にそれぞれ測定した。一方、マンニトールを添加した場合は、４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌの代わりに、マンニトールを含有（最終濃度で０．２５％）する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液を用いて、上記と同様に操作した（表４）。
【００３３】表４の結果から、測光開始後５分間は、無添加（対照）に比べマンニトールを添加したほうがシグナル量はやや強いことが分かる。測光開始後５分間を越えた時間では、両者間に大きな差はなかった。
【００３４】
【表４】
表４ シグナル量に及ぼすマンニトールの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 時間（分) シ グ ナ ル 量 無添加（対照） ０．２５％マンニトール ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ルミカウント ルミカウント ０ １３８２ １４９５ １ １４６１ １５４４ ２ １４８０ １５５３ ３ １４８８ １５４６ ４ １４８９ １５２９ ５ １４８５ １５１１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３５】実施例５ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす非イオン性界面活性剤の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：表５に示す各非イオン性界面活性剤を最終濃度で０．０２〜１．０％含有する発光用ホウ酸緩衝液を使用）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌを順次加え、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、化学発光量を測定した。
【００３６】対照としては、各非イオン性界面活性剤含有の発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに、これを含有しない発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した。図１に、各非イオン性界面活性剤（最終濃度で０．０５％）含有及び不含有（対照）の場合のシグナル量の時間経過を示した。なお、試薬ブランクは反応時間２０分の間はほぼ一定であった。また、表５に、反応時間１０分における試薬ブランク（ノイズ）、シグナル量及びＳ／Ｎ比を示した。
【００３７】
【表５】
表５ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす 非イオン性界面活性剤の効果━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━界面活性剤 最終濃度 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント ルミカウントなし（対照） ─ ２７８ ４５０ １．６２ツィーン２０ ０.０２ ２３８ １３１１ ５．５１ ０.０５ ３０２ １３６３ ４．５１ ０.１０ ３３４ １３０３ ３．９０ツィーン８０ ０.０２ ３０３ １２９３ ４．２７ ０.０５ ４０２ １３５４ ３．３７ ０.１０ ３６２ １２５７ ３．４７トリトンX-100 ０.０２ ３６６ １３３１ ３．６４ ０.０５ ３９０ １３５７ ３．４８ ０.１０ ２７０ １２３３ ４．５７ノニデットP40 ０.０２ ３３９ １１９７ ３．５３ ０.０５ ３４０ １１９５ ３．５１ ０.１０ ４０４ １２８３ ３．１８ブリッジ３５ ０.０２ ２９０ １０５８ ３．６５ ０.０５ ３１０ １１５５ ３．７３ ０.１０ ３４８ １２２９ ３．５３━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３８】図１及び表５の結果から、ツイーン２０、ツイーン８０、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０又はブリッジ３５を添加したものは、これらを添加しないもの（対照）に比べ、（試薬ブランクにはほとんど影響を及ぼしていないが）シグナル量が４〜５倍に増加しており、Ｓ／Ｎ比も同様に無添加（対照）に比べ高まっていることが分かる。
【００３９】実施例６ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の共存の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：最終濃度０．０５％脱脂粉乳及び最終濃度０．０５％の各非イオン性界面活性剤を含有する発光用ホウ酸緩衝液を用いた。）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、化学発光量を測定した。
【００４０】対照としては、脱脂粉乳及び各非イオン性界面活性剤含有の発光用ホウ酸緩衝液の代わりに、これらを含有しない発光用ホウ酸緩衝液を用いて、上記と同様に操作して測定した。図２にシグナル量の時間的変化を示した。なお、試薬ブランクは反応時間２０分の間はほぼ一定であった。また、表６には反応時間１０分における試薬ブランク（ノイズ）、シグナル量及びＳ／Ｎ比を示した。
【００４１】表６の結果から、脱脂粉乳及びツイーン２０、ツイーン８０もしくはトリトンＸ−１００の組合せは、無添加（対照）に比べ、発光量が３〜７倍に増加しており、更にＳ／Ｎ比は脱脂粉乳によるノイズ低減の効果とも合わさって無添加（対照）の約２０倍にも高まっていることが分かる。
【００４２】
【表６】
表６ 試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の共存の効果━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━脱脂粉乳又は界面活性剤 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ルミカウント ルミカウントなし（対照） ２５４ ４６７ １．８４脱脂粉乳＋ツィーン２０ ２７ １０７５ ３９．８１脱脂粉乳＋ツィーン８０ ２７ ９９４ ３６．８１脱脂粉乳＋トリトンX-100 ２７ １１７９ ４３．６７━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４３】実施例７ マンニトール存在下、シグナル量の安定的持続に及ぼす卵白アルブミン及び非イオン性界面活性剤の共存の効果黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)に、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：最終濃度０．０５％卵白アルブミン及び最終濃度０．０５％のツィーン２０を含有する発光用ホウ酸緩衝液を用いた。）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、経時的に化学発光量を測定した。比較として、卵白アルブミンの代わりに同濃度（最終濃度０．０５％）の脱脂粉乳を用いたほかは、上記と同様に操作した。図３にシグナル量の経時的変化を示した。卵白アルブミンの添加は脱脂粉乳に比べ、シグナル量が安定し持続することが分かった。
【００４４】実施例８ 卵白アルブミン又は脱脂粉乳含有の過酸化学水素試液の保存安定性卵白アルブミン含有の過酸化水素試薬と脱脂粉乳の含有の過酸化水素試薬の保存安定性を比較した。卵白アルブミン含有の過酸化水素試薬は、１％マンニトール、０．１５％卵白アルブミン、０．１％ツィーン２０及び４ｍＭ 過酸化水素をそれぞれ含むように、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で適宜希釈し、調製した。また、脱脂粉乳の含有の過酸化水素試薬は、１％マンニトール、０．０７５％脱脂粉乳、０．１％ツィーン２０及び４ｍＭ 過酸化水素をそれぞれ含むように、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で適宜希釈し、調製した。上記の両過酸化水素試薬を、３７℃で保管し、そのうちの一定量を経時的にサンプリングし、これを用いて化学発光反応させ、発光量を測定した。
【００４５】化学発光反応は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体を０．０７５％卵白アルブミン(生化学工業社製)含有の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で１００万倍に希釈したのち、これを１００μｌとり、次いで２ｍＭ 4-[4'-(2'-メチル)チアゾリル]フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ及び上記の過酸化水素試液５０μｌ及び２０ｍＭルミノール溶液(日立化成工業(株)社製)５０μｌをこの順に、黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)に注入し、撹拌し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社製，MLR-100)を用いて測光し、９分後の発光量を測定値とした（図４）。図４から、脱脂粉乳よりも卵白アルブミンのほうが酸化水素試薬の保存安定性に効果的である。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、ラジカル安定化剤の存在下にパーオキシダーゼを用いる化学発光免疫分析の性能を改善する方法であって、非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、及び／又は特異的発光反応すなわちシグナル量を増強させ、したがって、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させ、発光を持続安定させ、あるいは試薬の保存安定性を高めるもので、測定値の信頼性の向上に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】マンニトール存在下、種々の非イオン性界面活性剤を共存（最終濃度で０．０５％）させたときの試薬ブランク及びシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図２】マンニトール存在下、脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の両者を共存（いずれも最終濃度で０．０５％）させたときの試薬ブランク及びシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図３】マンニトール及び非イオン性界面活性剤存在下、卵白アルブミン又は脱脂粉乳を共存（最終濃度で０．０５％）させたときのシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図４】卵白アルブミン又は脱脂粉乳含有の過酸化学水素試液の保存安定性を示すグラフである。
【符号の説明】
図１及び図２において、
□─□：ツィーン ２０
■─■：ツィーン ８０
△─△：トリトン Ｘ−１００
▲─▲：ノニデット Ｐ−４０
◇─◇：ブリッジ ３５
●─●：無添加（対照）
図３において、
□─□：卵白アルブミン
●─●：脱脂粉乳
図４において、
◆─◆：卵白アルブミン
◇─◇：脱脂粉乳
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標識物としてパーオキシダーゼに用いる化学発光分析の性能を改善する方法に関するもので、臨床検査分野等における生体微量成分の分析・定量に有用である。
【０００２】
【従来の技術】分析対象物質を感度よく検出・測定する方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特異結合試薬（予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識しておく場合が多い）を検体と反応させ、引き続いて標識物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生じる信号を検出・測定する方法（いわゆる、酵素免疫測定法等）が知られている。また、この酵素免疫測定法には、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法が知られている。
【０００３】パーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生じる信号を効率よく測定する方法として、パーオキシダーゼにより触媒されるルミノール／過酸化水素の化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ルミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感剤として用いられる（Methods in Enzymology,Vol.133,p.331-353,1986；特開平２−２９１２９９号公報）。
【０００４】一方、パーオキシダーゼの活性はポリオキシエチレンエーテル類の添加により増大することも知られており（Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 1981; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 1981)、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキシエチレンエーテル類を含有させ、Ｓ／Ｎ比もしくは測定感度を高める方法も開示されている（特表平２−５０３０２９号公報）。
【０００５】また従来、抗体の非特異的反応をブロックする目的で、アルブミン等の蛋白質を固相担体に固定化することはよく行われている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】分析対象物質が生体の超微量物質等である場合には、上記の方法よりも更に感度の高い方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更に感度の高い方法を開発すること目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラジカル安定化剤（増感剤）の存在下にパーオキシダーゼを用いる化学発光分析において、非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（以下、ノイズともいう。）を低下させ、及び／又は特異的発光反応（以下、シグナルともいう。）を増強させ、すなわち、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させる方法を種々検討したところ、反応液中の発光量を検出・測定する際に反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を添加すると、上記目的を達成することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は下記の（１）〜（８）に関する。
（１）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（２）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳を存在させる、化学発光免疫分析の性能を改善する方法。
（３）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に卵白アルブミンを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（４）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に蛋白質分解物を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（５）蛋白質分解物がカゼイン分解物である上記（１）又は（４）の方法。
（６）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に糖アルコールを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
（７）糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである上記（１）又は上記（６）の方法。
（８）ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオン性界面活性剤を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【０００９】本発明における化学発光分析は、ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定する分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェスターン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【００１０】本発明で用いられるパーオキシダーゼは、西洋ワサビの塩基性アイソザイムが好適である。西洋ワサビの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの型が知られているが、これらの中ではＣ型が最も好ましい。
【００１１】発光反応に用いられるルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。
【００１２】本発明に用いられるラジカル安定化剤としては、ｐ−ヨードフェノール、４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノール等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾール等のベンゾチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジル）−プロピルスルホン酸塩等がある。
【００１３】これらのラジカル安定化剤の存在下にパーオキシダーゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行うと、ラジカル安定化剤が増感剤ラジカルとなり、この増感剤ラジカルがルミノールと反応し発光する。
【００１４】反応のｐＨは高いほど発光量は強くなるが、パーオキシダーゼの触媒能に依存しない発光が増大するので、両者を考慮して７.０〜１１.０の範囲で行うとよい。
【００１５】本発明に用いる脱脂粉乳は市販品が使用できる。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％（重量／容量％、以下、同じ）、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１６】本発明に用いる卵白アルブミンは市販品が使用できる。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１７】本発明に用いる蛋白質分解物としては、カゼイン、大豆蛋白質等の蛋白質の酵素分解物や酸分解物等がある。その用いる濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１８】本発明に用いる糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、リビトール、アラビトール、エリスリトール等の６〜４単糖アルコールがある。その濃度は少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．０１〜１０％、好ましくは０．２５％〜２．０％の範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上させる効果が少なく、１０％を超えると特異的発光反応を抑えるため好ましくない。
【００１９】本発明に用いる非イオン性界面活性剤としては、アシルソルビタン、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、オクチルフェノールエチレンオキサイド、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類等があり、これらはアトラス パウダー社（Atlas Powder Co.）製造のスパン２０（ソルビタンモノラウレート）、スパン４０（ソルビタンモノパルミテート）、スパン６０（ソルビタンモノオレエート）、スパン８０（ソルビタンモノステアレート）、スパン８５（ソルビタントリオレエート）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ツイーン４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、ツイーン６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ツイーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ツイーン８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート）、ブリッジ ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）及びブリッジ ５８（ポリオキシエチレンセチルエーテル）等、ローム アンド ハース社(Rohm & Haas Co.)製造のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）及びトリトンＸ−４０５（ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル）等、あるいはシグマ社からノニデットＰ−４０（オクチルフェノールエチレンオキサイド）の商品名で販売されている非イオン性界面活性剤等を入手できる。
【００２０】また、非イオン性界面活性剤の添加濃度は、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度とする。通常、その濃度は反応液の最終濃度で０．００１〜２．０％、より好ましくは０．０１〜０．５％の範囲である。濃度が０．００１％未満でも、２％を超えても、Ｓ／Ｎ比を向上させる効果は少ない。
【００２１】以上の添加剤のなかで、脱脂粉乳はノイズ量を著しく低減させる効果が特徴的である。卵白アルブミンは、シグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させ、生じた発光を安定的に持続させ、更に発光基質溶液の保存安定性を高める効果が特徴的である。蛋白質分解物はシグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させる効果がある。糖アルコールはシグナル量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、ノイズ量を低減させる効果がある。非イオン性界面活性剤はノイズ量に対しては殆ど影響を及ぼさないが、シグナル量を増加させる効果が特徴的である。
【００２２】
【実施例】
実施例１ 試薬ブランク（ノイズ）に及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール、又は非イオン性界面活性剤の効果添加剤無添加（対照）の試験は以下のように操作した。すなわち、外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.０；以下、発光用ホウ酸緩衝液という。）１００μｌ、２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液(日立化成(株)社製)５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社製、MLR-100)を用いて、化学発光量を２０分間経時的に測定した。
【００２３】一方、添加剤添加の試験は、発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに脱脂粉乳、卵白アルブミン、カゼイン分解物、糖アルコール、又は非イオン性界面活性剤を反応液の最終濃度で下記の表１に示す濃度で含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用い、上記と同様に操作した。その結果、試薬ブランクは反応の間（２０分間）いずれもほぼ一定であった。また、反応時間１０分ににおける試薬ブランク（ノイズ）は表１に示す通りであった。
【００２４】
【表１】
表１ 試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖 アルコール、又は非イオン性界面活性剤の効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント 無添加（対照） ─ ２４０ 脱脂粉乳 ０．０５ ５０ 〃 ０．１０ ３０ 卵白アルブミン ０．０５ １２０ 〃 ０．１０ １００ カゼイン分解物 ０．０５ １４０ 〃 ０．１０ ２００ マンニトール ０．２５ １２０ ０．４５ ６５ ソルビトール ０．４５ ６５ ツィーン２０ ０．０５ ２３３ ツィーン８０ ０．０５ ２３６ トリトンＸ−１００ ０．０５ ２３４ ノニデットＰ−４０ ０．０５ ２３９ ブリッジ３５ ０．０５ ２３８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２５】表１の結果から、脱脂粉乳は試薬ブランクを著しく低減させ、卵白アルブミン、カゼイン分解物及び糖アルコールは試薬ブランクを中程度に低減させるが、ツィーン２０等の非イオン性界面活性剤は試薬ブランクにほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
【００２６】実施例２ 脱脂粉乳及びツィーン２０の存在下、試薬ブランク値（ノイズ）に及ぼす糖アルコールの効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、０．１％脱脂粉乳及び０．２％ツィーン２０含有の発光用ホウ酸緩衝液１００μｌ、２ｍＭ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、下記表２に示した濃度のマンニトールもしくはソルビトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、以下実施例１と同様に操作し、化学発光量を測光した。対照としては、糖アルコールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌの代わりに、糖アルコールを含有しない４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した（表２）。
【００２７】
【表２】
表２ 脱脂粉乳及びツィーン２０存在下、試薬ブランクに及ぼす糖アルコ ールの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 糖アルコール 最終濃度 試薬ブランク ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント 無添加（対照） ０．０ ３０ マンニトール ０．２５ １５ 〃 ０．４５ ８ ソルビトール ０．４５ ８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２８】表２の結果から、脱脂粉乳及びツィーン２０の存在下において、マンニトール及びソルビトールはいずれも試薬ブランクを更に低下させることが分かる。
【００２９】実施例３ マンニトール存在下、試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物を０.１０％（最終濃度：０.０５％）又は０.２％（最終濃度：０．１％）含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−(２'−メチル)チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトール含有の４ｍＭ過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液(日立化成(株)社製)５０μｌをとり、以下実施例１と同様に操作し、化学発光量を測光した。対照としては、脱脂粉乳、卵白アルブミン又は蛋白質分解物を含有する発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに、これらを含有しない発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した(表３)。
【００３０】
【表３】
表２ マンニトール存在下、試薬ブランクに及ぼす脱脂粉乳、卵白アルブ ミン、蛋白質分解物の効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 蛋白質又は 最終濃度 試薬ブランク 蛋白質分解物 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント なし（対照） ０．０ ７０ 脱脂粉乳 ０．０５ ２０ 〃 ０．１０ １０ 卵白アルブミン ０．０５ ３０ 〃 ０．１０ ２４ カゼイン分解物 ０．０５ ３５ 〃 ０．１０ ５４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３１】表３の結果から、マンニトール存在下、脱脂粉乳、卵白アルブミン及びカゼイン分解物はいずれも、試薬ブランクを低下させることが分かる。これらの中で脱脂粉乳が試薬ブランクを最も著しく低下させた。
【００３２】実施例４ シグナル量に及ぼすマンニトールの効果特異的反応に基づくシグナル量は、添加物無添加（対照）では以下のようにして求めた。すなわち、外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼ(東洋紡グレードＩ-Ｃ)で標識した抗エンドセリン１単クローン抗体(ヤマサ醤油(株)社製，MCA ET-02)の１０万倍希釈溶液(希釈液：発光用ホウ酸緩衝液を使用)１００μｌ、２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて発光量を、混合直後、１分後、２分後、３分後、４分後及び５分後にそれぞれ測定した。一方、マンニトールを添加した場合は、４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌの代わりに、マンニトールを含有（最終濃度で０．２５％）する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液を用いて、上記と同様に操作した（表４）。
【００３３】表４の結果から、測光開始後５分間は、無添加（対照）に比べマンニトールを添加したほうがシグナル量はやや強いことが分かる。測光開始後５分間を越えた時間では、両者間に大きな差はなかった。
【００３４】
【表４】
表４ シグナル量に及ぼすマンニトールの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 時間（分) シ グ ナ ル 量 無添加（対照） ０．２５％マンニトール ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ルミカウント ルミカウント ０ １３８２ １４９５ １ １４６１ １５４４ ２ １４８０ １５５３ ３ １４８８ １５４６ ４ １４８９ １５２９ ５ １４８５ １５１１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３５】実施例５ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす非イオン性界面活性剤の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：表５に示す各非イオン性界面活性剤を最終濃度で０．０２〜１．０％含有する発光用ホウ酸緩衝液を使用）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌを順次加え、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、化学発光量を測定した。
【００３６】対照としては、各非イオン性界面活性剤含有の発光用ホウ酸緩衝液１００μｌの代わりに、これを含有しない発光用ホウ酸緩衝液１００μｌを用いて、上記と同様に操作して測定した。図１に、各非イオン性界面活性剤（最終濃度で０．０５％）含有及び不含有（対照）の場合のシグナル量の時間経過を示した。なお、試薬ブランクは反応時間２０分の間はほぼ一定であった。また、表５に、反応時間１０分における試薬ブランク（ノイズ）、シグナル量及びＳ／Ｎ比を示した。
【００３７】
【表５】
表５ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす 非イオン性界面活性剤の効果━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━界面活性剤 最終濃度 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ％ ルミカウント ルミカウントなし（対照） ─ ２７８ ４５０ １．６２ツィーン２０ ０.０２ ２３８ １３１１ ５．５１ ０.０５ ３０２ １３６３ ４．５１ ０.１０ ３３４ １３０３ ３．９０ツィーン８０ ０.０２ ３０３ １２９３ ４．２７ ０.０５ ４０２ １３５４ ３．３７ ０.１０ ３６２ １２５７ ３．４７トリトンX-100 ０.０２ ３６６ １３３１ ３．６４ ０.０５ ３９０ １３５７ ３．４８ ０.１０ ２７０ １２３３ ４．５７ノニデットP40 ０.０２ ３３９ １１９７ ３．５３ ０.０５ ３４０ １１９５ ３．５１ ０.１０ ４０４ １２８３ ３．１８ブリッジ３５ ０.０２ ２９０ １０５８ ３．６５ ０.０５ ３１０ １１５５ ３．７３ ０.１０ ３４８ １２２９ ３．５３━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３８】図１及び表５の結果から、ツイーン２０、ツイーン８０、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０又はブリッジ３５を添加したものは、これらを添加しないもの（対照）に比べ、（試薬ブランクにはほとんど影響を及ぼしていないが）シグナル量が４〜５倍に増加しており、Ｓ／Ｎ比も同様に無添加（対照）に比べ高まっていることが分かる。
【００３９】実施例６ マンニトール存在下、試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の共存の効果外側面にアルミ反射膜を蒸着したストリップ型マイクロウェルに、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：最終濃度０．０５％脱脂粉乳及び最終濃度０．０５％の各非イオン性界面活性剤を含有する発光用ホウ酸緩衝液を用いた。）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、化学発光量を測定した。
【００４０】対照としては、脱脂粉乳及び各非イオン性界面活性剤含有の発光用ホウ酸緩衝液の代わりに、これらを含有しない発光用ホウ酸緩衝液を用いて、上記と同様に操作して測定した。図２にシグナル量の時間的変化を示した。なお、試薬ブランクは反応時間２０分の間はほぼ一定であった。また、表６には反応時間１０分における試薬ブランク（ノイズ）、シグナル量及びＳ／Ｎ比を示した。
【００４１】表６の結果から、脱脂粉乳及びツイーン２０、ツイーン８０もしくはトリトンＸ−１００の組合せは、無添加（対照）に比べ、発光量が３〜７倍に増加しており、更にＳ／Ｎ比は脱脂粉乳によるノイズ低減の効果とも合わさって無添加（対照）の約２０倍にも高まっていることが分かる。
【００４２】
【表６】
表６ 試薬ブランク、シグナル量又はＳ／Ｎ比に及ぼす脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の共存の効果━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━脱脂粉乳又は界面活性剤 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ルミカウント ルミカウントなし（対照） ２５４ ４６７ １．８４脱脂粉乳＋ツィーン２０ ２７ １０７５ ３９．８１脱脂粉乳＋ツィーン８０ ２７ ９９４ ３６．８１脱脂粉乳＋トリトンX-100 ２７ １１７９ ４３．６７━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４３】実施例７ マンニトール存在下、シグナル量の安定的持続に及ぼす卵白アルブミン及び非イオン性界面活性剤の共存の効果黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)に、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体の１０万倍希釈溶液（希釈液：最終濃度０．０５％卵白アルブミン及び最終濃度０．０５％のツィーン２０を含有する発光用ホウ酸緩衝液を用いた。）１００μｌ、２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ、１．０％マンニトールを含有する４ｍＭ 過酸化水素／発光用ホウ酸緩衝液５０μｌ及び２０ｍＭ ルミノール溶液５０μｌをとり、撹拌混合し、化学発光測定装置を用いて２０分間、経時的に化学発光量を測定した。比較として、卵白アルブミンの代わりに同濃度（最終濃度０．０５％）の脱脂粉乳を用いたほかは、上記と同様に操作した。図３にシグナル量の経時的変化を示した。卵白アルブミンの添加は脱脂粉乳に比べ、シグナル量が安定し持続することが分かった。
【００４４】実施例８ 卵白アルブミン又は脱脂粉乳含有の過酸化学水素試液の保存安定性卵白アルブミン含有の過酸化水素試薬と脱脂粉乳の含有の過酸化水素試薬の保存安定性を比較した。卵白アルブミン含有の過酸化水素試薬は、１％マンニトール、０．１５％卵白アルブミン、０．１％ツィーン２０及び４ｍＭ 過酸化水素をそれぞれ含むように、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で適宜希釈し、調製した。また、脱脂粉乳の含有の過酸化水素試薬は、１％マンニトール、０．０７５％脱脂粉乳、０．１％ツィーン２０及び４ｍＭ 過酸化水素をそれぞれ含むように、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で適宜希釈し、調製した。上記の両過酸化水素試薬を、３７℃で保管し、そのうちの一定量を経時的にサンプリングし、これを用いて化学発光反応させ、発光量を測定した。
【００４５】化学発光反応は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗エンドセリン１単クローン抗体を０．０７５％卵白アルブミン(生化学工業社製)含有の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．０)で１００万倍に希釈したのち、これを１００μｌとり、次いで２ｍＭ 4-[4'-(2'-メチル)チアゾリル]フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μｌ及び上記の過酸化水素試液５０μｌ及び２０ｍＭルミノール溶液(日立化成工業(株)社製)５０μｌをこの順に、黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)に注入し、撹拌し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社製，MLR-100)を用いて測光し、９分後の発光量を測定値とした（図４）。図４から、脱脂粉乳よりも卵白アルブミンのほうが酸化水素試薬の保存安定性に効果的である。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、ラジカル安定化剤の存在下にパーオキシダーゼを用いる化学発光免疫分析の性能を改善する方法であって、非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、及び／又は特異的発光反応すなわちシグナル量を増強させ、したがって、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上させ、発光を持続安定させ、あるいは試薬の保存安定性を高めるもので、測定値の信頼性の向上に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】マンニトール存在下、種々の非イオン性界面活性剤を共存（最終濃度で０．０５％）させたときの試薬ブランク及びシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図２】マンニトール存在下、脱脂粉乳及び非イオン性界面活性剤の両者を共存（いずれも最終濃度で０．０５％）させたときの試薬ブランク及びシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図３】マンニトール及び非イオン性界面活性剤存在下、卵白アルブミン又は脱脂粉乳を共存（最終濃度で０．０５％）させたときのシグナル量の時間的変化を示すグラフである。
【図４】卵白アルブミン又は脱脂粉乳含有の過酸化学水素試液の保存安定性を示すグラフである。
【符号の説明】
図１及び図２において、
□─□：ツィーン ２０
■─■：ツィーン ８０
△─△：トリトン Ｘ−１００
▲─▲：ノニデット Ｐ−４０
◇─◇：ブリッジ ３５
●─●：無添加（対照）
図３において、
□─□：卵白アルブミン
●─●：脱脂粉乳
図４において、
◆─◆：卵白アルブミン
◇─◇：脱脂粉乳
【特許請求の範囲】
【請求項１】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項２】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳を存在させる、化学発光免疫分析の性能を改善する方法。
【請求項３】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に卵白アルブミンを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項４】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に蛋白質分解物を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項５】蛋白質分解物がカゼイン分解物である請求項１又は請求項４の方法。
【請求項６】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に糖アルコールを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項７】糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである請求項１又は請求項６の方法。
【請求項８】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオン性界面活性剤を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項１】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳、卵白アルブミン、蛋白質分解物、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤のうち、その一もしくは二以上を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項２】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂粉乳を存在させる、化学発光免疫分析の性能を改善する方法。
【請求項３】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に卵白アルブミンを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項４】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に蛋白質分解物を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項５】蛋白質分解物がカゼイン分解物である請求項１又は請求項４の方法。
【請求項６】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に糖アルコールを存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【請求項７】糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである請求項１又は請求項６の方法。
【請求項８】ラジカル安定化剤の存在下に、標識物であるパーオキシダーゼと、ルミノール及び過酸化水素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析において、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオン性界面活性剤を存在させる、化学発光分析の性能を改善する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開平６−２２７９５
【公開日】平成６年（１９９４）２月１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−７６０５４
【出願日】平成５年（１９９３）４月２日
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【公開日】平成６年（１９９４）２月１日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）４月２日
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
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