母乳におけるＴｈ２アジュバント活性の評価方法、及び母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法
【課題】 母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を評価するための簡便な方法を提供すること
【解決手段】 母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を、母乳刺激による樹状細胞の分化誘導活性を指標に、簡便に評価できることを見出した
【解決手段】 母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を、母乳刺激による樹状細胞の分化誘導活性を指標に、簡便に評価できることを見出した
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の分化誘導活性を利用して、母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価する方法、及び該評価に基づいて、母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境要因と免疫応答のインターフェイスとして、樹状細胞（Dendritic cells：ＤＣ）が重要な役割を演じていることが明らかとなりつつある。樹状細胞とは、造血幹細胞起源の単球から分化した細胞で、マクロファージやＢ細胞と共に、主要な抗原提示細胞（antigen-presenting cells：ＡＰＣ）として知られている。樹状細胞は、ナイーブＴ細胞に抗原を提示して該ナイーブＴ細胞の一次応答を誘導できる、唯一のプロフェッショナル抗原提示細胞（professional APC）として機能しており、特にヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）への分化誘導には、樹状細胞による抗原提示が必須とされている。樹状細胞による抗原提示は、食作用により取り込まれたタンパク質抗原がペプチドへと断片化され、該ペプチド（抗原ペプチド）がＭＨＣクラスＩ分子やＭＨＣクラスII分子と結合し、該樹状細胞表面に輸送されることにより行われる。
【０００３】
一方、上記のような抗原提示に関与するタンパク質抗原とは異なり、抗原非特異的に樹状細胞の抗原提示機能を増加させ、免疫応答を増強するタンパク質抗原以外の活性物質も知られている。このような物質をアジュバントと呼ぶ。アジュバントは、未熟樹状細胞（immature DC:ｉＤＣ）表面上の特定のToll-like receptor（ＴＬＲ）と結合する。そのシグナルが細胞内に伝達されることにより当該未熟樹状細胞は活性化され、成熟樹状細胞（mature DC：ｍＤＣ）へと分化する（例えば、非特許文献１参照）。成熟樹状細胞にはいくつかのタイプが知られており、それぞれがナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対して異なる分化誘導活性を有している。一般に、Ｔｈ１（T helper 1）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ１、Ｔｈ２（T helper 2）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ２、Ｔｈ１７（T helper 17）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ１７、Ｔｒ（T regulatory）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣｒと呼ぶ。そして、未熟樹状細胞をＤＣ１に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ１アジュバント、ＤＣ２に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ２アジュバント、ＤＣ１７に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ１７アジュバント、ＤＣｒに分化させる活性を有するアジュバントをＴｒアジュバントと言う。
【０００４】
Ｔｈ１アジュバントとしては、主として細菌によって産生されるコレラ毒（choleratoxin：ＣＴ）等が、Ｔｈ２アジュバントとしては、住血吸虫由来のリン脂質であるフォスファチジルセリン（Phosphatidylserine）等が、Ｔｈ１７アジュバントとしては、カードラン（curdlan）等が、Ｔｒアジュバントとしては、リソ・フォスファチジルセリン（Lysophosphatidylserine）等が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
Ｔｈ細胞の機能の平衡状態が崩れること（Ｔｈインバランス）によって多くの免疫疾患が生じることが知られており、例えば、Ｔｈ１細胞の過剰活性化によって生じる疾患としては、関節リウマチやインスリン依存性糖尿病などの自己免疫疾患が、Ｔｈ２細胞の過剰活性化によって生じる疾患としては、アトピー性皮膚炎や喘息などのアレルギー性疾患が知られている。従って、アジュバントが、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をいずれのＴｈ細胞に分化誘導する活性を有するかは、免疫応答反応において、さらには免疫疾患の治療においても重要となってくる。
【０００６】
我々の生活を取り巻く環境物質や化学物質等の特定物質の中には、アジュバントとしての免疫応答修飾活性を有するものが多数存在する。実際、それらの特定物質のうちいくつかに関しては、アトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息等のアレルギー疾患の原因因子であることが知られており、現在でも人間の健康的な生活を脅かしている。従って、特定物質が有するアジュバント活性を評価すること、特に、いずれのＴｈ細胞に対するアジュバント活性を有するかを評価することは、特定物質の人体に与える影響を予測する上でも重要であり、また特定物質を含む工業製品等の安全性や、特定物質を含む薬剤等の有効性を確認する上でも極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００６／０５４４１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】TakedaK, Akira S. Toll receptors and pathogen resistance. Cell Microbiol2003;5:143-153.
【非特許文献２】vander Kleij D, Latz E, Brouwers JF, Kruize YC, Schmitz M, Kurt-Jones EA, EspevikT, de Jong EC, Kapsenberg ML, Golenbock DT, Tielens AG, Yazdanbakhsh M. A novelhost-parasite lipid cross-talk. J Biol Chem. 2002;277（50）:48122-48129.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を簡便に評価する方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このような方法を確立することにより、母乳がアトピー性皮膚炎などの疾患を発症させる危険性を、簡便に評価する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を、母乳刺激による樹状細胞の分化誘導活性を指標に、簡便に評価できることを見出した。特に、母乳で刺激して得た成熟樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度は、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価するための有効な指標となった。また、本発明者らは、この方法で評価した、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性が、アトピー性皮膚炎に罹患した子供を持つ母親の、出産直後の母乳において有意に高い値を示すことを見出した。従って、母乳中のＴｈ２アジュバント活性に基づいて、乳児におけるアトピー性皮膚炎などの疾患の発症危険性を評価し、これら疾患の予防を行うことが可能である。
【００１１】
即ち、本発明は、樹状細胞の分化誘導活性を利用した、母乳が有するＴｈ２アジュバント活性の評価方法、及び該評価に基づく、アトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症危険性の評価方法に関し、より詳しくは、
（１） 未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により前記未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することにより、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを特徴とする、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価方法、
（２） 成熟樹状細胞の解析が、前記成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することにより行われる、（１）に記載の評価方法、
（３） 未熟樹状細胞がヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞由来である、（１）に記載の評価方法、
（４） 母乳が出産直後のものである、（１）に記載の評価方法、
（５） 母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、（１）から（４）のいずれかに記載の方法により評価することを含む、前記母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法、及び
（６） Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患がアトピー性皮膚炎である、（５）に記載の評価方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を簡便に評価することが可能となった。これにより、将来乳児がアトピー性皮膚炎を発症する危険性の高い母乳を、特に、出産直後の母乳を検体として、簡便に検査し、同定することが可能となった。本発明は、アトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症予防に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＭＡ処理したＴＨＰ−１細胞を、母乳で刺激し、該細胞内のｃＡＭＰ濃度をＥＬＩＳＡにて定量し、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定にて解析した結果を示すグラフである。「ＡＤ（＋）」は、生後６カ月目にアトピー性皮膚炎を発症した群の母乳を示し、「ＡＤ（−）」は、生後６カ月目にアトピー性皮膚炎を発症しなかった群の母乳を示す。母乳は、いずれの群においても、生後４日目のものを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（Ｔｈ２アジュバント活性評価方法）
本発明のＴｈ２アジュバント活性評価方法は、未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することによって、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを含み、必要に応じて適宜選択したその他の工程等を含む。
＜未熟樹状細胞の分化誘導＞
本発明に用いる未熟樹状細胞は、培養細胞、単球、あるいは幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導することにより調製することができる。
Ａ．培養細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
本発明者らは、ＫＧ−１細胞を用いてＴｈ細胞に対するアジュバント活性を評価する方法を開発したが（特許文献１）、本発明における、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価においては、特に、ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞（以下、単に「ＴＨＰ−１細胞」という）を用いることが好ましい。
【００１５】
ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、例えば、ＴＨＰ−１細胞をフォルボールエステル等の分化誘導成分を添加した培地で培養する方法が挙げられる。
【００１６】
ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する培地としては、例えば、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の培地にＦＣＳ等の血清を１０〜２０％程度含む通常細胞培養液に５０ｎｇ／ｍＬ程度のフォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（以下、「ＰＭＡ」とする）を添加したものを用いることができる。培地をＴＨＰ−１未熟樹状細胞分化誘導液として、ＴＨＰ−１細胞を、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２日間程度で培養し、ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞へと分化させることができる。
Ｂ．単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
（Ｉ）単球の調製方法
未熟樹状細胞の分化誘導において用いる単球としては、末梢血、臍帯血、骨髄液、及びその他の組織から調製される単球が挙げられる。単球を調製する方法の一例を、以下に説明する。
【００１７】
（ｉ）末梢血からの単球の調製方法
末梢血からの単球の調製方法としては、健常個体から末梢血をヘパリン採取し、末梢血からFicoll−Paque等を用いた密度勾配遠心法により単核球層を回収し、末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：以下、「ＰＢＭＣｓ」とする）を分離し、次いで、ＰＢＭＣｓからＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。
【００１８】
ＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、文献（Kalinski P,Hilkens CM,Snijders A,Snijdewint FG, and Kapsenberg ML. IL-12-deficient dendritic cells, generated in the presence of prostaglandin E2, promote type 2 cytokine production in maturing human naive T helper cells. J Immunol 1997 159: 28-35.）に記載された方法を利用することができる。また、市販のＣＤ１４＋細胞分離キット等を用い、抗体標識されたＣＤ１４＋細胞を分離してもよい。ＣＤ１４＋細胞分離キットとしては、例えば、MACS Microbeads（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）が挙げられる。
【００１９】
（ii）臍帯血からの単球の調製方法
臍帯血からの単球の調製方法としては、健常個体の正常分娩後に摘出した胎盤にヘパリンを添加した上で、胎盤から臍帯血を採取し、この臍帯血から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。臍帯血から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、特開２００２−６９００１号公報に記載の方法や前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
【００２０】
（iii）骨髄液からの単球の調製方法
骨髄液からの単球の調製方法としては、健常個体より骨髄液を採取し、骨髄液から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。骨髄液から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
【００２１】
（iv）組織からの単球の調製方法
単球の調製に用いる組織としては、特に制限はなく、例えば、脾臓、リンパ節、扁桃、及び肝臓などが挙げられる。組織からの単球の調製法としては、健常個体より特定臓器又は特定器官の組織の一部を採取し、組織を無菌的に組織破砕器（tissue grinder）などの適当な器具を用いて単一細胞化した後、破砕液中の細胞破壊物片（debris）を濾過除去し、遠心分離によって主として単一細胞からなる細胞群を得て、細胞群から単核球を分離し、単核球よりＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。細胞群から単核球を分離し、単核球よりＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
（II）調製した単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」とする）及びＩＬ−４を介した刺激により、単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法が挙げられ、例えば、特許公報（米国特許第６，４７９，２８６号明細書）及び文献（Sallusto F and Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by
granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 1994;179:1109-1118）に記載した方法を利用することができる。
【００２２】
単球を未熟樹状細胞に分化誘導する際に用いられる培地としては、通常細胞培養液にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したもの（以下、「成熟樹状細胞分化誘導液」という）が好ましい。通常細胞培養液としては、例えば、イスコフ培地（以下、「ＩＭＤＭ」とする）、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」とする）、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地に、牛胎児血清（fetal calf serum：ＦＣＳ、Fetal bovine serum：ＦＢＳ）等の１０％血清を添加したものが挙げられる。通常細胞培養液に添加するＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の添加量としては、５０〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、それぞれ同濃度で添加されることがより好ましい。
【００２３】
単球は、成熟樹状細胞分化誘導液を用い、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で５〜７日間培養することにより、未熟樹状細胞へと分化させることができる。
【００２４】
ＧＭ−ＣＳＦは、ヒト、またはヒト以外の生物種の組換えタンパク質、あるいはそれらの生体から精製したものであってもよいが、ヒト由来の単球を分化させる場合、ヒト由来のＧＭ−ＣＳＦを使用することが好ましい。同様に、他の各生物種の単球に関しては、それと同一の生物種由来のものを使用することが好ましい。
【００２５】
ＩＬ−４は、ヒト、またはヒト以外の生物種の組換えタンパク質、あるいはそれらの生体から精製したものであってもよい。ヒト由来の単球を分化させる場合、ヒト由来のＩＬ−４を使用することが好ましい。同様に、他の各生物種の単球に関しては、それと同一の生物種由来のものを使用することが好ましい。
Ｃ．幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、例えば、ＥＳ細胞を、Ｍ−ＣＳＦ産生能の欠損したフィーダー細胞、またはそれと同程度の機能を有するフィーダー培地と共に通常細胞培養液中で５日程度培養し、ＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインを培養液中に添加してさらに５日間程度培養した後、培養液中の処理済ＥＳ細胞を回収し、さらに５〜１４日間程度培養する方法が挙げられる。Ｍ−ＣＳＦ産生能の欠損したフィーダー細胞としては、例えば、マウスＯＰ９０を用いることができる。
＜成熟樹状細胞の分化誘導＞
分化誘導により得られた未熟樹状細胞に、母乳を加えて培養することにより、母乳の刺激で未熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化誘導させることができる。
【００２６】
未熟樹状細胞を刺激する母乳としては特に制限はないが、後述するアトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症危険性評価の検体として利用する場合には、出産直後のものであることが好ましい。ここで「出産直後」とは、出産後２週間以内、好ましくは１週間以内（例えば、４日以内）を意味する。
【００２７】
未熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化誘導させる培養には、未熟樹状細胞の分化誘導おいて用いた通常細胞培養液を用いることができる。通常細胞培養液に、母乳と未熟樹状細胞とを混合した成熟樹状細胞分化誘導液中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で３０分から３時間程度培養する。このとき、通常細胞培養液と未熟樹状細胞のみからなり、母乳を加えない培養液（以下、「成熟樹状細胞分化対照液」という）を同時に調製し、成熟樹状細胞分化誘導液と同条件で培養してもよい。培養に用いる未熟樹状細胞の細胞数は、通常細胞培養液３００μＬに対して、１×１０５個程度が好ましい。
＜成熟樹状細胞の解析＞
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の解析においては、特に、成熟樹状細胞の分化の質が解析される。ここで「成熟樹状細胞の分化の質」とは、成熟樹状細胞分化誘導液中に含まれる成熟樹状細胞のサブセットの比率を意味し、具体的には、ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ１７、及びＤＣｒの比率を意味する。例えば、ＤＣ２の特性がみられる成熟樹状細胞の比率が高い場合、用いた母乳が、Ｔｈ２アジュバント活性を有すると評価される。このＴｈ２アジュバント活性の強さは、成熟樹状細胞のサブセットの比率の偏りの程度（Ｔｈ２への傾きの強さ）又は成熟樹状細胞のＭＬＲ誘導活性の強さ（ＭＬＲ誘導によるＴｈ細胞の増殖応答の強さ）の測定により評価することができる。本発明における「Ｔｈ２アジュバント活性の評価」は、Ｔｈ２アジュバント活性の有無の評価及び該活性の強さ（程度）の評価の双方を含む意である。
【００２８】
成熟樹状細胞の分化の質を解析する実施形態としては、例えば、成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定、成熟樹状細胞の表面抗原の測定、成熟樹状細胞が産生する液性因子の測定、及び成熟樹状細胞のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する分化誘導活性の評価などが挙げられる。成熟樹状細胞の表面抗原の測定においては、例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド発現プロファイル（特に、デルタ１／デルタ４遺伝子の発現量比）を測定することが好ましい。また、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する分化誘導活性の評価は、例えば、成熟樹状細胞によって分化誘導されたＴｈ細胞のタイプの判定や、成熟樹状細胞により分化誘導されたＴｈ細胞のＭＬＲ（Mixed Lymphocyte Reaction）誘導による増殖応答の強さの測定、により行うことができる。
【００２９】
以下、成熟樹状細胞の分化の質を解析する各実施形態を説明する。
〔ｃＡＭＰ濃度の測定〕
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
【００３０】
細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｃＡＭＰ感受性蛍光色素を用い、該蛍光色素の蛍光強度を測定する方法が挙げられる。この測定には、CatchPointTM Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit（Molecular Devices社製）等の市販のキットを使用してもよい。
【００３１】
本態様においては、成熟樹状細胞分化誘導液由来の樹状細胞と成熟樹状細胞分化対照液由来の樹状細胞の各々の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定し、それらの濃度の差異（変化）に基づいて、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。例えば、成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度が、成熟樹状細胞分化対照液中（無刺激）の成熟樹状内のｃＡＭＰ濃度よりも高いとき（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上であるとき）、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）はＤＣ２であると判定され、母乳がＴｈ２アジュバント活性を有すると評価することができる。
〔表面抗原の測定〕
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の細胞表面に発現した表面抗原を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。本態様においては、培養後の成熟樹状細胞分化誘導液中及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる成熟細胞の表面抗原をそれぞれ測定し、比較してもよい。ここで「表面抗原の測定」とは、表面抗原の検出、同定、及び定量の少なくともいずれかを行うことをいう。
【００３２】
測定される表面抗原としては、成熟樹状細胞が種々のサブセットで特異的に発現する表面抗原、及び種々のサブセットによって発現比率が異なる表面抗原であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。測定される表面抗原としては、前記Ｎｏｃｔｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ、Ｄｅｌｔａ（デルタ））の他、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＯＸ４０Ｌ等が挙げられる。
【００３３】
表面抗原の測定方法としては、例えば、成熟樹状細胞分化誘導液由来の樹状細胞と、成熟樹状細胞分化対照液由来の樹状細胞のそれぞれに対して、表面抗原を特異的に認識する蛍光抗体によって抗体染色をする方法が挙げられる。蛍光抗体としては、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（Phycoerythrin）等で標識された市販の適当な表面抗原抗体を使用してもよい。
【００３４】
抗体染色した各樹状細胞における細胞表面上の表面抗原の発現量は、フロー・サイトメトリー（flow cytometry:以下ＦＣＭという）を利用して測定することができる。ＦＣＭ解析法は、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson社製）等の市販の機器を用いて行ってもよい。
【００３５】
また、表面抗原の測定においては、成熟樹状細胞中の表面抗原遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を検出し、該表面抗原遺伝子の発現量を測定する方法を利用することもできる。表面抗原遺伝子の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光物質及び放射性同位元素等を標識とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法が挙げられる。なお、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された表面抗原遺伝子を定量する方法としては、例えば、内部標準となる遺伝子量に対する相対値として評価する方法、検量線を設定することによって絶対的定量を行う方法が挙げられる。
【００３６】
以下、好ましい態様であるＮｏｔｃｈリガンドの発現プロファイルの解析について、より詳細に説明する。
【００３７】
表面抗原の解析が、成熟樹状細胞のＮｏｔｃｈリガンド発現プロファイルの解析の場合、特に、Ｎｏｔｃｈリガンドとして、デルタ１遺伝子及びデルタ４遺伝子の発現量を定量し、両遺伝子の発現量比を求めることが好ましい。求めた発現量比に基づき、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）を判定し、前記母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。ここで「デルタ１遺伝子及びデルタ４遺伝子の発現」とは、これら遺伝子の転写レベルにおける発現及び翻訳レベルにおける発現の双方を含む意である。
【００３８】
転写レベルで発現量を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光物質及び放射性同位元素等を標識とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法が挙げられる。なお、増幅された遺伝子を定量する場合、例えば、内部標準となる遺伝子量に対する相対値として、あるいは検量線を設定することによる絶対値として、評価することができる。
【００３９】
翻訳レベルで発現量を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法が挙げられる。
【００４０】
定量の結果、成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞の（デルタ１遺伝子発現量）／（デルタ４遺伝子発現量）の値が、成熟樹状細胞分化対照液中の前記成熟樹状細胞よりも大きいとき、あるいは（デルタ１遺伝子発現量）／（デルタ４遺伝子発現量）の値が１０以上であるとき、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）はＤＣ２であると判定され、母乳がＴｈ２アジュバント活性を有すると評価することができる。
〔液性因子の測定〕
分化誘導された成熟樹状細胞によって産生される液性因子を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。本態様においては、培養後の成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる液性因子をそれぞれ測定し、比較してもよい。ここで「液性因子の測定」とは、液性因子の検出、同定、及び定量の少なくともいずれかを行うことをいう。
【００４１】
液性因子の測定対象としては、成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液をそのまま使用してもよく、遠心分離、又は濾過することにより成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液から成熟樹状細胞や不溶物を除いた溶液を使用してもよく、さらには成熟樹状細胞自体であってもよい。
【００４２】
成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる液性因子の測定方法としては、目的の液性因子を特異的に定量可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法による定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出して定量する方法、Bio-Plex（BIO-RAD社製）を用いる方法が挙げられる。また、液性因子の測定においては、成熟樹状細胞中の液性因子ｍＲＮＡ量の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ等により測定してもよい。
【００４３】
測定される液性因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、成熟樹状細胞が種々のサブセットで特異的に産生する液性因子、種々のサブセットによって産生能が異なる液性因子であることが好ましい。このような液性因子としては、例えば、ＤＣ１が産生するＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＤＣ２が産生するＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１８、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＤＣｒが産生するＴＧＦ−β、並びにＤＣ２及びＤＣｒが産生するＩＬ−１０が挙げられる。
【００４４】
既知の成熟樹状細胞サブセットと前記液性因子産生能との関係に基づいて、液性因子の測定結果から成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）を判定し、判定した成熟樹状細胞の分化の質から母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
〔Ｔｈ細胞のタイプの判定〕
成熟樹状細胞の解析は、成熟樹状細胞の作用によってナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化誘導されたＴｈ細胞のタイプを判定することにより行うことができる。Ｔｈ細胞のタイプは、Ｔｈ細胞の培養上清におけるサイトカイン（ケモカインを含む。以下、同様）の測定や、Ｔｈ細胞におけるケモカインレセプターの発現の測定により、判定することができる。
【００４５】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製には、ＰＢＭＣｓを用いることができる。ＰＢＭＣｓは、ヒト由来のものが好ましいが、ヒト以外の哺乳動物由来のものであってもよい。例えば、ブタ由来であるゼノＰＢＭＣｓであってもよい。これらのＰＢＭＣｓは、末梢血液から分離されたものであってもよい。
【００４６】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製で用いるヒト由来のＰＢＭＣｓは、ＨＬＡ−ＤＲタイピングによってアロ（同種異型）ＰＢＭＣｓであることを事前に確認したものであってもよい。ＨＬＡ−ＤＲタイピングは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１に関して行うことが好ましい。また、ＨＬＡ−ＤＲタイピングには、市販のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型タイピング試薬を用いることができる。
【００４７】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製において、ＰＢＭＣｓからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するために、ネガティブ選択法を用いてもよい。ネガティブ選択法においては、まず、ＰＢＭＣｓより抗体非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）の抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ１２３、抗ＴＣＲγ／δ、抗ＣＤ２３５ａ等の抗体マイクロビーズカクテルからなる市販のＣＤ４＋Ｔ細胞分離キットを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離してもよい。続いて、分離した抗体非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞よりＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を分離する。ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）のＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞分離キットを用いてＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を除去することによって分離してもよい。この方法により、最終的に得られた抗体非標識ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞として用いることができる。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞は、文献（Kalinski P, Schuitemaker JH, Hilkens CM and Kapsenberg ML. Prostaglandin E2 induces the final maturation of IL-12-deficient CD1a＋CD83＋ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation. J Immunol. 1998;161:2804-2809）に記載の方法により分離することもできる。
【００４８】
Ｔｈ細胞の分化誘導は、分化誘導された樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養によって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）を誘導させると共に、分化圧を加えることにより行うことができる。
【００４９】
樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養は、一般的な培養細胞培養条件下で行うことができる。例えば、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの市販の適当な培地に、１０％ＦＣＳまたはＦＢＳを添加した通常培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で培養してもよい。成熟樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養の期間は、６〜８日間程度が好ましい。具体的には、非特許文献２に記載の方法により共培養することができる。
【００５０】
分化誘導されたＴｈ細胞に、シグナル１（ＣＤ３、及びカルシウムイオノフォア等を介した刺激）及びシグナル２（ＣＤ２８、及びフォルボルエステルアセテート等を介した刺激）を惹起させることにより、Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させることができる。
【００５１】
Ｔｈ細胞としては、ＭＬＲ誘導により増殖させたＴｈ細胞を用いることができる。サイトカイン産生刺激は、Ｔｈ細胞においてシグナル１及びシグナル２の少なくともいずれかを惹起させる刺激であればよい。例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（以下ａｎｔｉ−ＣＤ３ｍＡｂとする）と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（以下ａｎｔｉ−ＣＤ２８ｍＡｂとする）を用いて、それぞれシグナル1とシグナル２を惹起させてもよい。Ｔｈ細胞に、通常培養液に両シグナルを惹起させるための物質を加えた培養液（これを「サイトカイン産生培養液」という）及び当該物質を加えない以外はサイトカイン産生培養液と同一組成の培養液（これを「サイトカイン産生対照液」という）をそれぞれ別個に加え、適当な条件下で（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で１６時間）培養し、（Ａ）産生されたサイトカイン、あるいは（Ｂ）Ｔｈ細胞において発現するケモカインレセプター、を測定することで、Ｔｈ細胞の分化の質を判定することができる。
（Ａ）サイトカイン測定
Ｔｈ１細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βが挙げられ、Ｔｈ２細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３が挙げられ、Ｔｈ１７細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ１３が挙げられ、Ｔｒ細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βが挙げられる。
【００５２】
測定されるサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ１３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β、及びＧＭ−ＣＳＦの少なくともいずれかが好ましいが、これらに限定されるものではなく、分化したＴｈ細胞が産生する他のサイトカインであってもよい。
【００５３】
サイトカインの測定には、サイトカイン産生培養液及びサイトカイン産生対照液中をそのまま使用してもよいし、サイトカイン産生培養液及びサイトカイン産生対照液の遠心分離や濾過によって得られる上清を使用してもよい。
【００５４】
サイトカインの測定は、各サイトカインを特異的に認識する抗体を利用したＥＬＩＳＡ法によって行ってもよい。または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、それぞれの因子を特異的に認識する抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によって検出し定量することもできる。Bio-Plex（BIO-RAD社）もしくはそれと類似の分析システムを有する製品によって定量してもよい。
【００５５】
Ｔｈ細胞の分化の質は、サイトカイン産生培養液中（また、場合によってはサイトカイン産生対照液中）における各々のサイトカイン（Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒ細胞等によって産生されるサイトカイン）の測定結果を比較し、各々のサイトカイン量の差異（変化）を解析することによって判定することができる。また、各々のサイトカインの量比から判定することもできる。Ｔｈ２アジュバント活性は、例えば、Ｔｈ１細胞が産生するサイトカイン量とＴｈ２細胞が産生するサイトカインケモカインレセプター量との比（例えば、ＩＬ−５／ＩＦＮ−γ）に基づいて、評価することができる。
（Ｂ）ケモカインレセプター測定
Ｔｈ１細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５が挙げられ、Ｔｈ２細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＣＣＲ８が挙げられ、Ｔｈ１７細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ６が挙げられる。
【００５６】
測定されるケモカインレセプターとしては、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＣＣＲ８、ＣＣＲ６の少なくともいずれかが好ましいが、これらに限定されるものではなく、分化したＴｈ細胞が発現する他の１種以上のケモカインレセプターであってもよい。
【００５７】
ケモカインレセプターの測定方法としては、例えば、前記した表面抗原の測定方法と同様の方法を利用することができる。
【００５８】
Ｔｈ２アジュバント活性は、例えば、Ｔｈ１細胞が発現するケモカインレセプターとＴｈ２細胞が発現するケモカインレセプターとの発現量比から、評価することができる。
〔Ｔｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さの測定〕
成熟樹状細胞の解析は、成熟樹状細胞により分化誘導されたＴｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さを測定することにより行うことができる。Ｔｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さから、成熟樹状細胞のＭＬＲ誘導活性の強さを評価することができる。本態様において用いるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製は、前記した通りであり、Ｔｈ細胞の分化誘導は、以下に説明する以外の操作は、前記した通りである。
【００５９】
Ｔｈ細胞の分化誘導のために、樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養を行う際には、対照試料として、樹状細胞を含まないこと以外は共培養を行う試料と同一である試料を対照試料として同時に調製し、同一条件下で培養してもよい（ここで、共培養を行う試料とその対照試料をそれぞれ「ＭＬＲ誘導試料」と「ＭＬＲ誘導対照試料」と称する）。
【００６０】
ＭＬＲ誘導によるＴｈ細胞の増殖応答を評価するために、細胞に放射性同位体と取り込ませた後、シンチレーション・カウンターで測定する手法を利用することができる。この場合は、ＭＬＲ誘導試料とＭＬＲ誘導対照試料を、適当な条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で５〜６日間）で培養した後、培養液にトリチウム−チミジン（以下、「３Ｈ−チミジン」とする）を添加する。続いて、３Ｈ−チミジンをナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、あるいはＴｈ細胞に取り込ませるために、それまでと同一の条件でさらに培養する。添加後の培養期間は、４時間から１日程度が好ましい。続いて、それぞれの試料中の細胞を遠心によって回収し、細胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン以外の３Ｈ−チミジンを除くため、バッファー等で十分に洗浄する。洗浄後の各試料中の細胞における３Ｈ−チミジンの取り込みは、例えば、適当なシンチレータを試料に加え、液体シンチレーション・カウンターを用いて測定することができる。
【００６１】
ＭＬＲ誘導試料中の細胞とＭＬＲ誘導対照試料中の細胞のトリチウム強度を比較し、ＭＬＲ誘導による増殖応答の強さ（細胞数の一次微分値）を算出することによって、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
（Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法）
本発明のＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法は、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、上記本発明のＴｈ２アジュバント活性評価方法により評価することを含む。本発明において「Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患」とは、生体内におけるＴｈ２細胞の過剰活性化で、Ｔｈ細胞の機能の平衡状態が崩れることによって発症する疾患を言う。本発明の危険性評価方法において、危険性評価の対象となる疾患としては、Ｔｈ２アジュバント活性に起因して発症するものである限り、特に制限はないが、好ましくは、アトピー性皮膚炎である。また、本発明において「疾患を発症させる危険性の評価」とは、疾患を発症させる危険性の有無の評価及び該危険性の程度の評価の双方を含む意である。
【００６２】
本発明の危険性評価方法においては、母乳を上記Ｔｈ２アジュバント活性評価方法により評価した結果、母乳にＴｈ２アジュバント活性があると評価された場合、その母乳は、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性があると評価される。本発明の危険性評価方法においては、Ｔｈ２アジュバント活性を評価する対照として、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症していない乳児の母乳における当該活性の値を用いることができる。成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞内のＴｈ２アジュバント活性が、対照値のＴｈ２アジュバント活性よりも高いとき（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上であるとき）、母乳検体にＴｈ２アジュバント活性があると評価される。この評価に基づいて、乳児における、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症を予防することが可能である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１） 成熟樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度を指標とした母乳におけるＴｈ２アジュバント活性の評価
ＴＨＰ-１細胞をＰＭＡ５０ｎｇ/ｍｌで２日間刺激した。ＰＭＡで処理したＴＨＰ-１細胞（DC-like line）を母乳で３０分間刺激し、細胞内のｃＡＭＰ濃度をＥＬＩＳＡにて定量した。定量に用いた母乳は、生後６ヶ月の時点でアトピー性皮膚炎を発症した群(AD(+)）５５例及び発症しなかった群（AD(-)）５５例の生後４日目における母乳である。
【００６５】
定量した結果をＭａｎｎ-ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定にて解析した。アトピー性皮膚炎患者が、生直後に摂取した母乳は、Ｔｈ２アジュバント活性の指標の一つであるｃＡＭＰ濃度が有意に高い値を示した。
【００６６】
なお、「ＰＭＡで処理したＴＨＰ-１細胞＋母乳」のｃＡＭＰ濃度から「母乳のみ」のｃＡＭＰ濃度を引いた値を、ＰＭＡ処理したＴＨＰ-１細胞の細胞内に誘導されたｃＡＭＰ濃度とした。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明したように、本発明によれば、母乳のＴｈ２アジュバント活性を簡便に評価することが可能となる。これにより、母乳が、乳児に対して、アトピー性皮膚炎などのＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価が可能となり、これら疾患の発症の予防に、大きく貢献するものと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の分化誘導活性を利用して、母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価する方法、及び該評価に基づいて、母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境要因と免疫応答のインターフェイスとして、樹状細胞（Dendritic cells：ＤＣ）が重要な役割を演じていることが明らかとなりつつある。樹状細胞とは、造血幹細胞起源の単球から分化した細胞で、マクロファージやＢ細胞と共に、主要な抗原提示細胞（antigen-presenting cells：ＡＰＣ）として知られている。樹状細胞は、ナイーブＴ細胞に抗原を提示して該ナイーブＴ細胞の一次応答を誘導できる、唯一のプロフェッショナル抗原提示細胞（professional APC）として機能しており、特にヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）への分化誘導には、樹状細胞による抗原提示が必須とされている。樹状細胞による抗原提示は、食作用により取り込まれたタンパク質抗原がペプチドへと断片化され、該ペプチド（抗原ペプチド）がＭＨＣクラスＩ分子やＭＨＣクラスII分子と結合し、該樹状細胞表面に輸送されることにより行われる。
【０００３】
一方、上記のような抗原提示に関与するタンパク質抗原とは異なり、抗原非特異的に樹状細胞の抗原提示機能を増加させ、免疫応答を増強するタンパク質抗原以外の活性物質も知られている。このような物質をアジュバントと呼ぶ。アジュバントは、未熟樹状細胞（immature DC:ｉＤＣ）表面上の特定のToll-like receptor（ＴＬＲ）と結合する。そのシグナルが細胞内に伝達されることにより当該未熟樹状細胞は活性化され、成熟樹状細胞（mature DC：ｍＤＣ）へと分化する（例えば、非特許文献１参照）。成熟樹状細胞にはいくつかのタイプが知られており、それぞれがナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対して異なる分化誘導活性を有している。一般に、Ｔｈ１（T helper 1）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ１、Ｔｈ２（T helper 2）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ２、Ｔｈ１７（T helper 17）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣ１７、Ｔｒ（T regulatory）細胞を誘導する成熟樹状細胞をＤＣｒと呼ぶ。そして、未熟樹状細胞をＤＣ１に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ１アジュバント、ＤＣ２に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ２アジュバント、ＤＣ１７に分化させる活性を有するアジュバントをＴｈ１７アジュバント、ＤＣｒに分化させる活性を有するアジュバントをＴｒアジュバントと言う。
【０００４】
Ｔｈ１アジュバントとしては、主として細菌によって産生されるコレラ毒（choleratoxin：ＣＴ）等が、Ｔｈ２アジュバントとしては、住血吸虫由来のリン脂質であるフォスファチジルセリン（Phosphatidylserine）等が、Ｔｈ１７アジュバントとしては、カードラン（curdlan）等が、Ｔｒアジュバントとしては、リソ・フォスファチジルセリン（Lysophosphatidylserine）等が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
Ｔｈ細胞の機能の平衡状態が崩れること（Ｔｈインバランス）によって多くの免疫疾患が生じることが知られており、例えば、Ｔｈ１細胞の過剰活性化によって生じる疾患としては、関節リウマチやインスリン依存性糖尿病などの自己免疫疾患が、Ｔｈ２細胞の過剰活性化によって生じる疾患としては、アトピー性皮膚炎や喘息などのアレルギー性疾患が知られている。従って、アジュバントが、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をいずれのＴｈ細胞に分化誘導する活性を有するかは、免疫応答反応において、さらには免疫疾患の治療においても重要となってくる。
【０００６】
我々の生活を取り巻く環境物質や化学物質等の特定物質の中には、アジュバントとしての免疫応答修飾活性を有するものが多数存在する。実際、それらの特定物質のうちいくつかに関しては、アトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息等のアレルギー疾患の原因因子であることが知られており、現在でも人間の健康的な生活を脅かしている。従って、特定物質が有するアジュバント活性を評価すること、特に、いずれのＴｈ細胞に対するアジュバント活性を有するかを評価することは、特定物質の人体に与える影響を予測する上でも重要であり、また特定物質を含む工業製品等の安全性や、特定物質を含む薬剤等の有効性を確認する上でも極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００６／０５４４１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】TakedaK, Akira S. Toll receptors and pathogen resistance. Cell Microbiol2003;5:143-153.
【非特許文献２】vander Kleij D, Latz E, Brouwers JF, Kruize YC, Schmitz M, Kurt-Jones EA, EspevikT, de Jong EC, Kapsenberg ML, Golenbock DT, Tielens AG, Yazdanbakhsh M. A novelhost-parasite lipid cross-talk. J Biol Chem. 2002;277（50）:48122-48129.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を簡便に評価する方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このような方法を確立することにより、母乳がアトピー性皮膚炎などの疾患を発症させる危険性を、簡便に評価する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、母乳のＴｈ細胞に対するアジュバント活性を、母乳刺激による樹状細胞の分化誘導活性を指標に、簡便に評価できることを見出した。特に、母乳で刺激して得た成熟樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度は、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価するための有効な指標となった。また、本発明者らは、この方法で評価した、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性が、アトピー性皮膚炎に罹患した子供を持つ母親の、出産直後の母乳において有意に高い値を示すことを見出した。従って、母乳中のＴｈ２アジュバント活性に基づいて、乳児におけるアトピー性皮膚炎などの疾患の発症危険性を評価し、これら疾患の予防を行うことが可能である。
【００１１】
即ち、本発明は、樹状細胞の分化誘導活性を利用した、母乳が有するＴｈ２アジュバント活性の評価方法、及び該評価に基づく、アトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症危険性の評価方法に関し、より詳しくは、
（１） 未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により前記未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することにより、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを特徴とする、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価方法、
（２） 成熟樹状細胞の解析が、前記成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することにより行われる、（１）に記載の評価方法、
（３） 未熟樹状細胞がヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞由来である、（１）に記載の評価方法、
（４） 母乳が出産直後のものである、（１）に記載の評価方法、
（５） 母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、（１）から（４）のいずれかに記載の方法により評価することを含む、前記母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法、及び
（６） Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患がアトピー性皮膚炎である、（５）に記載の評価方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を簡便に評価することが可能となった。これにより、将来乳児がアトピー性皮膚炎を発症する危険性の高い母乳を、特に、出産直後の母乳を検体として、簡便に検査し、同定することが可能となった。本発明は、アトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症予防に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＭＡ処理したＴＨＰ−１細胞を、母乳で刺激し、該細胞内のｃＡＭＰ濃度をＥＬＩＳＡにて定量し、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定にて解析した結果を示すグラフである。「ＡＤ（＋）」は、生後６カ月目にアトピー性皮膚炎を発症した群の母乳を示し、「ＡＤ（−）」は、生後６カ月目にアトピー性皮膚炎を発症しなかった群の母乳を示す。母乳は、いずれの群においても、生後４日目のものを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（Ｔｈ２アジュバント活性評価方法）
本発明のＴｈ２アジュバント活性評価方法は、未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することによって、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを含み、必要に応じて適宜選択したその他の工程等を含む。
＜未熟樹状細胞の分化誘導＞
本発明に用いる未熟樹状細胞は、培養細胞、単球、あるいは幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導することにより調製することができる。
Ａ．培養細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
本発明者らは、ＫＧ−１細胞を用いてＴｈ細胞に対するアジュバント活性を評価する方法を開発したが（特許文献１）、本発明における、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価においては、特に、ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞（以下、単に「ＴＨＰ−１細胞」という）を用いることが好ましい。
【００１５】
ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、例えば、ＴＨＰ−１細胞をフォルボールエステル等の分化誘導成分を添加した培地で培養する方法が挙げられる。
【００１６】
ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する培地としては、例えば、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の培地にＦＣＳ等の血清を１０〜２０％程度含む通常細胞培養液に５０ｎｇ／ｍＬ程度のフォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（以下、「ＰＭＡ」とする）を添加したものを用いることができる。培地をＴＨＰ−１未熟樹状細胞分化誘導液として、ＴＨＰ−１細胞を、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２日間程度で培養し、ＴＨＰ−１細胞を未熟樹状細胞へと分化させることができる。
Ｂ．単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
（Ｉ）単球の調製方法
未熟樹状細胞の分化誘導において用いる単球としては、末梢血、臍帯血、骨髄液、及びその他の組織から調製される単球が挙げられる。単球を調製する方法の一例を、以下に説明する。
【００１７】
（ｉ）末梢血からの単球の調製方法
末梢血からの単球の調製方法としては、健常個体から末梢血をヘパリン採取し、末梢血からFicoll−Paque等を用いた密度勾配遠心法により単核球層を回収し、末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：以下、「ＰＢＭＣｓ」とする）を分離し、次いで、ＰＢＭＣｓからＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。
【００１８】
ＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、文献（Kalinski P,Hilkens CM,Snijders A,Snijdewint FG, and Kapsenberg ML. IL-12-deficient dendritic cells, generated in the presence of prostaglandin E2, promote type 2 cytokine production in maturing human naive T helper cells. J Immunol 1997 159: 28-35.）に記載された方法を利用することができる。また、市販のＣＤ１４＋細胞分離キット等を用い、抗体標識されたＣＤ１４＋細胞を分離してもよい。ＣＤ１４＋細胞分離キットとしては、例えば、MACS Microbeads（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）が挙げられる。
【００１９】
（ii）臍帯血からの単球の調製方法
臍帯血からの単球の調製方法としては、健常個体の正常分娩後に摘出した胎盤にヘパリンを添加した上で、胎盤から臍帯血を採取し、この臍帯血から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。臍帯血から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、特開２００２−６９００１号公報に記載の方法や前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
【００２０】
（iii）骨髄液からの単球の調製方法
骨髄液からの単球の調製方法としては、健常個体より骨髄液を採取し、骨髄液から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。骨髄液から単核球を分離し、単核球からＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
【００２１】
（iv）組織からの単球の調製方法
単球の調製に用いる組織としては、特に制限はなく、例えば、脾臓、リンパ節、扁桃、及び肝臓などが挙げられる。組織からの単球の調製法としては、健常個体より特定臓器又は特定器官の組織の一部を採取し、組織を無菌的に組織破砕器（tissue grinder）などの適当な器具を用いて単一細胞化した後、破砕液中の細胞破壊物片（debris）を濾過除去し、遠心分離によって主として単一細胞からなる細胞群を得て、細胞群から単核球を分離し、単核球よりＣＤ１４＋細胞を分離する方法が挙げられる。細胞群から単核球を分離し、単核球よりＣＤ１４＋細胞を分離する方法としては、例えば、前記（ｉ）と同様の方法を利用することができる。
（II）調製した単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」とする）及びＩＬ−４を介した刺激により、単球を未熟樹状細胞に分化誘導する方法が挙げられ、例えば、特許公報（米国特許第６，４７９，２８６号明細書）及び文献（Sallusto F and Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by
granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 1994;179:1109-1118）に記載した方法を利用することができる。
【００２２】
単球を未熟樹状細胞に分化誘導する際に用いられる培地としては、通常細胞培養液にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したもの（以下、「成熟樹状細胞分化誘導液」という）が好ましい。通常細胞培養液としては、例えば、イスコフ培地（以下、「ＩＭＤＭ」とする）、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」とする）、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地に、牛胎児血清（fetal calf serum：ＦＣＳ、Fetal bovine serum：ＦＢＳ）等の１０％血清を添加したものが挙げられる。通常細胞培養液に添加するＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の添加量としては、５０〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、それぞれ同濃度で添加されることがより好ましい。
【００２３】
単球は、成熟樹状細胞分化誘導液を用い、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で５〜７日間培養することにより、未熟樹状細胞へと分化させることができる。
【００２４】
ＧＭ−ＣＳＦは、ヒト、またはヒト以外の生物種の組換えタンパク質、あるいはそれらの生体から精製したものであってもよいが、ヒト由来の単球を分化させる場合、ヒト由来のＧＭ−ＣＳＦを使用することが好ましい。同様に、他の各生物種の単球に関しては、それと同一の生物種由来のものを使用することが好ましい。
【００２５】
ＩＬ−４は、ヒト、またはヒト以外の生物種の組換えタンパク質、あるいはそれらの生体から精製したものであってもよい。ヒト由来の単球を分化させる場合、ヒト由来のＩＬ−４を使用することが好ましい。同様に、他の各生物種の単球に関しては、それと同一の生物種由来のものを使用することが好ましい。
Ｃ．幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法
幹細胞を未熟樹状細胞に分化誘導する方法としては、例えば、ＥＳ細胞を、Ｍ−ＣＳＦ産生能の欠損したフィーダー細胞、またはそれと同程度の機能を有するフィーダー培地と共に通常細胞培養液中で５日程度培養し、ＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインを培養液中に添加してさらに５日間程度培養した後、培養液中の処理済ＥＳ細胞を回収し、さらに５〜１４日間程度培養する方法が挙げられる。Ｍ−ＣＳＦ産生能の欠損したフィーダー細胞としては、例えば、マウスＯＰ９０を用いることができる。
＜成熟樹状細胞の分化誘導＞
分化誘導により得られた未熟樹状細胞に、母乳を加えて培養することにより、母乳の刺激で未熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化誘導させることができる。
【００２６】
未熟樹状細胞を刺激する母乳としては特に制限はないが、後述するアトピー性皮膚炎などＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症危険性評価の検体として利用する場合には、出産直後のものであることが好ましい。ここで「出産直後」とは、出産後２週間以内、好ましくは１週間以内（例えば、４日以内）を意味する。
【００２７】
未熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化誘導させる培養には、未熟樹状細胞の分化誘導おいて用いた通常細胞培養液を用いることができる。通常細胞培養液に、母乳と未熟樹状細胞とを混合した成熟樹状細胞分化誘導液中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で３０分から３時間程度培養する。このとき、通常細胞培養液と未熟樹状細胞のみからなり、母乳を加えない培養液（以下、「成熟樹状細胞分化対照液」という）を同時に調製し、成熟樹状細胞分化誘導液と同条件で培養してもよい。培養に用いる未熟樹状細胞の細胞数は、通常細胞培養液３００μＬに対して、１×１０５個程度が好ましい。
＜成熟樹状細胞の解析＞
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の解析においては、特に、成熟樹状細胞の分化の質が解析される。ここで「成熟樹状細胞の分化の質」とは、成熟樹状細胞分化誘導液中に含まれる成熟樹状細胞のサブセットの比率を意味し、具体的には、ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ１７、及びＤＣｒの比率を意味する。例えば、ＤＣ２の特性がみられる成熟樹状細胞の比率が高い場合、用いた母乳が、Ｔｈ２アジュバント活性を有すると評価される。このＴｈ２アジュバント活性の強さは、成熟樹状細胞のサブセットの比率の偏りの程度（Ｔｈ２への傾きの強さ）又は成熟樹状細胞のＭＬＲ誘導活性の強さ（ＭＬＲ誘導によるＴｈ細胞の増殖応答の強さ）の測定により評価することができる。本発明における「Ｔｈ２アジュバント活性の評価」は、Ｔｈ２アジュバント活性の有無の評価及び該活性の強さ（程度）の評価の双方を含む意である。
【００２８】
成熟樹状細胞の分化の質を解析する実施形態としては、例えば、成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定、成熟樹状細胞の表面抗原の測定、成熟樹状細胞が産生する液性因子の測定、及び成熟樹状細胞のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する分化誘導活性の評価などが挙げられる。成熟樹状細胞の表面抗原の測定においては、例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド発現プロファイル（特に、デルタ１／デルタ４遺伝子の発現量比）を測定することが好ましい。また、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対する分化誘導活性の評価は、例えば、成熟樹状細胞によって分化誘導されたＴｈ細胞のタイプの判定や、成熟樹状細胞により分化誘導されたＴｈ細胞のＭＬＲ（Mixed Lymphocyte Reaction）誘導による増殖応答の強さの測定、により行うことができる。
【００２９】
以下、成熟樹状細胞の分化の質を解析する各実施形態を説明する。
〔ｃＡＭＰ濃度の測定〕
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
【００３０】
細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｃＡＭＰ感受性蛍光色素を用い、該蛍光色素の蛍光強度を測定する方法が挙げられる。この測定には、CatchPointTM Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit（Molecular Devices社製）等の市販のキットを使用してもよい。
【００３１】
本態様においては、成熟樹状細胞分化誘導液由来の樹状細胞と成熟樹状細胞分化対照液由来の樹状細胞の各々の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定し、それらの濃度の差異（変化）に基づいて、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。例えば、成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度が、成熟樹状細胞分化対照液中（無刺激）の成熟樹状内のｃＡＭＰ濃度よりも高いとき（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上であるとき）、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）はＤＣ２であると判定され、母乳がＴｈ２アジュバント活性を有すると評価することができる。
〔表面抗原の測定〕
分化誘導により得られた成熟樹状細胞の細胞表面に発現した表面抗原を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。本態様においては、培養後の成熟樹状細胞分化誘導液中及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる成熟細胞の表面抗原をそれぞれ測定し、比較してもよい。ここで「表面抗原の測定」とは、表面抗原の検出、同定、及び定量の少なくともいずれかを行うことをいう。
【００３２】
測定される表面抗原としては、成熟樹状細胞が種々のサブセットで特異的に発現する表面抗原、及び種々のサブセットによって発現比率が異なる表面抗原であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。測定される表面抗原としては、前記Ｎｏｃｔｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ、Ｄｅｌｔａ（デルタ））の他、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＯＸ４０Ｌ等が挙げられる。
【００３３】
表面抗原の測定方法としては、例えば、成熟樹状細胞分化誘導液由来の樹状細胞と、成熟樹状細胞分化対照液由来の樹状細胞のそれぞれに対して、表面抗原を特異的に認識する蛍光抗体によって抗体染色をする方法が挙げられる。蛍光抗体としては、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（Phycoerythrin）等で標識された市販の適当な表面抗原抗体を使用してもよい。
【００３４】
抗体染色した各樹状細胞における細胞表面上の表面抗原の発現量は、フロー・サイトメトリー（flow cytometry:以下ＦＣＭという）を利用して測定することができる。ＦＣＭ解析法は、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson社製）等の市販の機器を用いて行ってもよい。
【００３５】
また、表面抗原の測定においては、成熟樹状細胞中の表面抗原遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を検出し、該表面抗原遺伝子の発現量を測定する方法を利用することもできる。表面抗原遺伝子の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光物質及び放射性同位元素等を標識とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法が挙げられる。なお、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された表面抗原遺伝子を定量する方法としては、例えば、内部標準となる遺伝子量に対する相対値として評価する方法、検量線を設定することによって絶対的定量を行う方法が挙げられる。
【００３６】
以下、好ましい態様であるＮｏｔｃｈリガンドの発現プロファイルの解析について、より詳細に説明する。
【００３７】
表面抗原の解析が、成熟樹状細胞のＮｏｔｃｈリガンド発現プロファイルの解析の場合、特に、Ｎｏｔｃｈリガンドとして、デルタ１遺伝子及びデルタ４遺伝子の発現量を定量し、両遺伝子の発現量比を求めることが好ましい。求めた発現量比に基づき、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）を判定し、前記母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。ここで「デルタ１遺伝子及びデルタ４遺伝子の発現」とは、これら遺伝子の転写レベルにおける発現及び翻訳レベルにおける発現の双方を含む意である。
【００３８】
転写レベルで発現量を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光物質及び放射性同位元素等を標識とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法が挙げられる。なお、増幅された遺伝子を定量する場合、例えば、内部標準となる遺伝子量に対する相対値として、あるいは検量線を設定することによる絶対値として、評価することができる。
【００３９】
翻訳レベルで発現量を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法が挙げられる。
【００４０】
定量の結果、成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞の（デルタ１遺伝子発現量）／（デルタ４遺伝子発現量）の値が、成熟樹状細胞分化対照液中の前記成熟樹状細胞よりも大きいとき、あるいは（デルタ１遺伝子発現量）／（デルタ４遺伝子発現量）の値が１０以上であるとき、成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）はＤＣ２であると判定され、母乳がＴｈ２アジュバント活性を有すると評価することができる。
〔液性因子の測定〕
分化誘導された成熟樹状細胞によって産生される液性因子を測定し、その結果に基づいて成熟樹状細胞の分化の質を判定することにより、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。本態様においては、培養後の成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる液性因子をそれぞれ測定し、比較してもよい。ここで「液性因子の測定」とは、液性因子の検出、同定、及び定量の少なくともいずれかを行うことをいう。
【００４１】
液性因子の測定対象としては、成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液をそのまま使用してもよく、遠心分離、又は濾過することにより成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液から成熟樹状細胞や不溶物を除いた溶液を使用してもよく、さらには成熟樹状細胞自体であってもよい。
【００４２】
成熟樹状細胞分化誘導液及び成熟樹状細胞分化対照液中に含まれる液性因子の測定方法としては、目的の液性因子を特異的に定量可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法による定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出して定量する方法、Bio-Plex（BIO-RAD社製）を用いる方法が挙げられる。また、液性因子の測定においては、成熟樹状細胞中の液性因子ｍＲＮＡ量の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ等により測定してもよい。
【００４３】
測定される液性因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、成熟樹状細胞が種々のサブセットで特異的に産生する液性因子、種々のサブセットによって産生能が異なる液性因子であることが好ましい。このような液性因子としては、例えば、ＤＣ１が産生するＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＤＣ２が産生するＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１８、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＤＣｒが産生するＴＧＦ−β、並びにＤＣ２及びＤＣｒが産生するＩＬ−１０が挙げられる。
【００４４】
既知の成熟樹状細胞サブセットと前記液性因子産生能との関係に基づいて、液性因子の測定結果から成熟樹状細胞の分化の質（サブセット）を判定し、判定した成熟樹状細胞の分化の質から母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
〔Ｔｈ細胞のタイプの判定〕
成熟樹状細胞の解析は、成熟樹状細胞の作用によってナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化誘導されたＴｈ細胞のタイプを判定することにより行うことができる。Ｔｈ細胞のタイプは、Ｔｈ細胞の培養上清におけるサイトカイン（ケモカインを含む。以下、同様）の測定や、Ｔｈ細胞におけるケモカインレセプターの発現の測定により、判定することができる。
【００４５】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製には、ＰＢＭＣｓを用いることができる。ＰＢＭＣｓは、ヒト由来のものが好ましいが、ヒト以外の哺乳動物由来のものであってもよい。例えば、ブタ由来であるゼノＰＢＭＣｓであってもよい。これらのＰＢＭＣｓは、末梢血液から分離されたものであってもよい。
【００４６】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製で用いるヒト由来のＰＢＭＣｓは、ＨＬＡ−ＤＲタイピングによってアロ（同種異型）ＰＢＭＣｓであることを事前に確認したものであってもよい。ＨＬＡ−ＤＲタイピングは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１に関して行うことが好ましい。また、ＨＬＡ−ＤＲタイピングには、市販のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型タイピング試薬を用いることができる。
【００４７】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製において、ＰＢＭＣｓからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するために、ネガティブ選択法を用いてもよい。ネガティブ選択法においては、まず、ＰＢＭＣｓより抗体非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）の抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ１２３、抗ＴＣＲγ／δ、抗ＣＤ２３５ａ等の抗体マイクロビーズカクテルからなる市販のＣＤ４＋Ｔ細胞分離キットを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離してもよい。続いて、分離した抗体非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞よりＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を分離する。ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach, Germany）のＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞分離キットを用いてＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を除去することによって分離してもよい。この方法により、最終的に得られた抗体非標識ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞として用いることができる。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞は、文献（Kalinski P, Schuitemaker JH, Hilkens CM and Kapsenberg ML. Prostaglandin E2 induces the final maturation of IL-12-deficient CD1a＋CD83＋ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation. J Immunol. 1998;161:2804-2809）に記載の方法により分離することもできる。
【００４８】
Ｔｈ細胞の分化誘導は、分化誘導された樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養によって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）を誘導させると共に、分化圧を加えることにより行うことができる。
【００４９】
樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養は、一般的な培養細胞培養条件下で行うことができる。例えば、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの市販の適当な培地に、１０％ＦＣＳまたはＦＢＳを添加した通常培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で培養してもよい。成熟樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養の期間は、６〜８日間程度が好ましい。具体的には、非特許文献２に記載の方法により共培養することができる。
【００５０】
分化誘導されたＴｈ細胞に、シグナル１（ＣＤ３、及びカルシウムイオノフォア等を介した刺激）及びシグナル２（ＣＤ２８、及びフォルボルエステルアセテート等を介した刺激）を惹起させることにより、Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させることができる。
【００５１】
Ｔｈ細胞としては、ＭＬＲ誘導により増殖させたＴｈ細胞を用いることができる。サイトカイン産生刺激は、Ｔｈ細胞においてシグナル１及びシグナル２の少なくともいずれかを惹起させる刺激であればよい。例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（以下ａｎｔｉ−ＣＤ３ｍＡｂとする）と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（以下ａｎｔｉ−ＣＤ２８ｍＡｂとする）を用いて、それぞれシグナル1とシグナル２を惹起させてもよい。Ｔｈ細胞に、通常培養液に両シグナルを惹起させるための物質を加えた培養液（これを「サイトカイン産生培養液」という）及び当該物質を加えない以外はサイトカイン産生培養液と同一組成の培養液（これを「サイトカイン産生対照液」という）をそれぞれ別個に加え、適当な条件下で（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で１６時間）培養し、（Ａ）産生されたサイトカイン、あるいは（Ｂ）Ｔｈ細胞において発現するケモカインレセプター、を測定することで、Ｔｈ細胞の分化の質を判定することができる。
（Ａ）サイトカイン測定
Ｔｈ１細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βが挙げられ、Ｔｈ２細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３が挙げられ、Ｔｈ１７細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ１３が挙げられ、Ｔｒ細胞が産生するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βが挙げられる。
【００５２】
測定されるサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ１３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β、及びＧＭ−ＣＳＦの少なくともいずれかが好ましいが、これらに限定されるものではなく、分化したＴｈ細胞が産生する他のサイトカインであってもよい。
【００５３】
サイトカインの測定には、サイトカイン産生培養液及びサイトカイン産生対照液中をそのまま使用してもよいし、サイトカイン産生培養液及びサイトカイン産生対照液の遠心分離や濾過によって得られる上清を使用してもよい。
【００５４】
サイトカインの測定は、各サイトカインを特異的に認識する抗体を利用したＥＬＩＳＡ法によって行ってもよい。または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、それぞれの因子を特異的に認識する抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によって検出し定量することもできる。Bio-Plex（BIO-RAD社）もしくはそれと類似の分析システムを有する製品によって定量してもよい。
【００５５】
Ｔｈ細胞の分化の質は、サイトカイン産生培養液中（また、場合によってはサイトカイン産生対照液中）における各々のサイトカイン（Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒ細胞等によって産生されるサイトカイン）の測定結果を比較し、各々のサイトカイン量の差異（変化）を解析することによって判定することができる。また、各々のサイトカインの量比から判定することもできる。Ｔｈ２アジュバント活性は、例えば、Ｔｈ１細胞が産生するサイトカイン量とＴｈ２細胞が産生するサイトカインケモカインレセプター量との比（例えば、ＩＬ−５／ＩＦＮ−γ）に基づいて、評価することができる。
（Ｂ）ケモカインレセプター測定
Ｔｈ１細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５が挙げられ、Ｔｈ２細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＣＣＲ８が挙げられ、Ｔｈ１７細胞が発現するケモカインレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ６が挙げられる。
【００５６】
測定されるケモカインレセプターとしては、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＣＣＲ８、ＣＣＲ６の少なくともいずれかが好ましいが、これらに限定されるものではなく、分化したＴｈ細胞が発現する他の１種以上のケモカインレセプターであってもよい。
【００５７】
ケモカインレセプターの測定方法としては、例えば、前記した表面抗原の測定方法と同様の方法を利用することができる。
【００５８】
Ｔｈ２アジュバント活性は、例えば、Ｔｈ１細胞が発現するケモカインレセプターとＴｈ２細胞が発現するケモカインレセプターとの発現量比から、評価することができる。
〔Ｔｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さの測定〕
成熟樹状細胞の解析は、成熟樹状細胞により分化誘導されたＴｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さを測定することにより行うことができる。Ｔｈ細胞のＭＬＲ誘導による増殖応答の強さから、成熟樹状細胞のＭＬＲ誘導活性の強さを評価することができる。本態様において用いるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の調製は、前記した通りであり、Ｔｈ細胞の分化誘導は、以下に説明する以外の操作は、前記した通りである。
【００５９】
Ｔｈ細胞の分化誘導のために、樹状細胞とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養を行う際には、対照試料として、樹状細胞を含まないこと以外は共培養を行う試料と同一である試料を対照試料として同時に調製し、同一条件下で培養してもよい（ここで、共培養を行う試料とその対照試料をそれぞれ「ＭＬＲ誘導試料」と「ＭＬＲ誘導対照試料」と称する）。
【００６０】
ＭＬＲ誘導によるＴｈ細胞の増殖応答を評価するために、細胞に放射性同位体と取り込ませた後、シンチレーション・カウンターで測定する手法を利用することができる。この場合は、ＭＬＲ誘導試料とＭＬＲ誘導対照試料を、適当な条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で５〜６日間）で培養した後、培養液にトリチウム−チミジン（以下、「３Ｈ−チミジン」とする）を添加する。続いて、３Ｈ−チミジンをナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、あるいはＴｈ細胞に取り込ませるために、それまでと同一の条件でさらに培養する。添加後の培養期間は、４時間から１日程度が好ましい。続いて、それぞれの試料中の細胞を遠心によって回収し、細胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン以外の３Ｈ−チミジンを除くため、バッファー等で十分に洗浄する。洗浄後の各試料中の細胞における３Ｈ−チミジンの取り込みは、例えば、適当なシンチレータを試料に加え、液体シンチレーション・カウンターを用いて測定することができる。
【００６１】
ＭＬＲ誘導試料中の細胞とＭＬＲ誘導対照試料中の細胞のトリチウム強度を比較し、ＭＬＲ誘導による増殖応答の強さ（細胞数の一次微分値）を算出することによって、母乳のＴｈ２アジュバント活性を評価することができる。
（Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法）
本発明のＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法は、母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、上記本発明のＴｈ２アジュバント活性評価方法により評価することを含む。本発明において「Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患」とは、生体内におけるＴｈ２細胞の過剰活性化で、Ｔｈ細胞の機能の平衡状態が崩れることによって発症する疾患を言う。本発明の危険性評価方法において、危険性評価の対象となる疾患としては、Ｔｈ２アジュバント活性に起因して発症するものである限り、特に制限はないが、好ましくは、アトピー性皮膚炎である。また、本発明において「疾患を発症させる危険性の評価」とは、疾患を発症させる危険性の有無の評価及び該危険性の程度の評価の双方を含む意である。
【００６２】
本発明の危険性評価方法においては、母乳を上記Ｔｈ２アジュバント活性評価方法により評価した結果、母乳にＴｈ２アジュバント活性があると評価された場合、その母乳は、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性があると評価される。本発明の危険性評価方法においては、Ｔｈ２アジュバント活性を評価する対照として、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症していない乳児の母乳における当該活性の値を用いることができる。成熟樹状細胞分化誘導液中の樹状細胞内のＴｈ２アジュバント活性が、対照値のＴｈ２アジュバント活性よりも高いとき（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上であるとき）、母乳検体にＴｈ２アジュバント活性があると評価される。この評価に基づいて、乳児における、Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患の発症を予防することが可能である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１） 成熟樹状細胞内のｃＡＭＰ濃度を指標とした母乳におけるＴｈ２アジュバント活性の評価
ＴＨＰ-１細胞をＰＭＡ５０ｎｇ/ｍｌで２日間刺激した。ＰＭＡで処理したＴＨＰ-１細胞（DC-like line）を母乳で３０分間刺激し、細胞内のｃＡＭＰ濃度をＥＬＩＳＡにて定量した。定量に用いた母乳は、生後６ヶ月の時点でアトピー性皮膚炎を発症した群(AD(+)）５５例及び発症しなかった群（AD(-)）５５例の生後４日目における母乳である。
【００６５】
定量した結果をＭａｎｎ-ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定にて解析した。アトピー性皮膚炎患者が、生直後に摂取した母乳は、Ｔｈ２アジュバント活性の指標の一つであるｃＡＭＰ濃度が有意に高い値を示した。
【００６６】
なお、「ＰＭＡで処理したＴＨＰ-１細胞＋母乳」のｃＡＭＰ濃度から「母乳のみ」のｃＡＭＰ濃度を引いた値を、ＰＭＡ処理したＴＨＰ-１細胞の細胞内に誘導されたｃＡＭＰ濃度とした。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明したように、本発明によれば、母乳のＴｈ２アジュバント活性を簡便に評価することが可能となる。これにより、母乳が、乳児に対して、アトピー性皮膚炎などのＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価が可能となり、これら疾患の発症の予防に、大きく貢献するものと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により前記未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することにより、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを特徴とする、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価方法。
【請求項２】
成熟樹状細胞の解析が、前記成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することにより行われる、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
未熟樹状細胞がヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞由来である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項４】
母乳が出産直後のものである、請求項１に記載の評価方法。
【請求項５】
母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、請求項１から４のいずれかに記載の方法により評価することを含む、前記母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法。
【請求項６】
Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項５に記載の評価方法。
【請求項１】
未熟樹状細胞を母乳で刺激し、該刺激により前記未熟樹状細胞から分化誘導された成熟樹状細胞を解析することにより、前記母乳が有するＴｈ２アジュバント活性を評価することを特徴とする、母乳のＴｈ２アジュバント活性の評価方法。
【請求項２】
成熟樹状細胞の解析が、前記成熟樹状細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することにより行われる、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
未熟樹状細胞がヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞由来である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項４】
母乳が出産直後のものである、請求項１に記載の評価方法。
【請求項５】
母乳におけるＴｈ２アジュバント活性を、請求項１から４のいずれかに記載の方法により評価することを含む、前記母乳がＴｈ２アジュバント活性に起因する疾患を発症させる危険性の評価方法。
【請求項６】
Ｔｈ２アジュバント活性に起因する疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項５に記載の評価方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２５２７５７（Ｐ２０１０−２５２７５７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０９５８６（Ｐ２００９−１０９５８６）
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１０月３０日 社団法人日本アレルギー学会発行の「アレルギー（（第５８回日本アレルギー学会秋季学術大会号）Ｖｏｌ．５７ Ｎｏ．９・１０ ２００８）」に発表
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１０月３０日 社団法人日本アレルギー学会発行の「アレルギー（（第５８回日本アレルギー学会秋季学術大会号）Ｖｏｌ．５７ Ｎｏ．９・１０ ２００８）」に発表
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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