母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる医薬および栄養組成物
【課題】 母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることで、消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することを可能とする、安全性に優れ日常的に汎用できる医薬および栄養組成物を提供する
【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤である。：Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。当該ＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。
【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤である。：Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。当該ＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れ日常的に汎用でき且つ母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる医薬および栄養組成物を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび哺乳類の乳汁、すなわち母乳には分泌型ＩｇＡが含まれている。分泌型ＩｇＡは血清中のＩｇＡとは異なり、Ｊ鎖を含んだ二量体（ｄｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ）と多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ：ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメイン（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＣ）が結合した形で存在している。ＩｇＡには可変部と呼ばれる抗原結合部位が存在し、細菌、ウイルスなどの微生物や食物タンパクをはじめとする様々な外来抗原に結合し、それらが腸管の粘膜面から生体内へ侵入するのを防いでいる。出産後母体外に出た新生児の免疫機構は未成熟であり不十分であるために、感染症に対するリスクが非常に高い。そのため、母乳中のＩｇＡは新生児の腸管において生体防御に重要な役割を担っている。
【０００３】
例えば、母乳中ＩｇＡの抗体価の評価結果から、母乳中にはＴｅｔａｎｕｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｄｉｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｓｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ、Ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓｅｓ １，−２，−３、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ1，−Ｂ5，−Ｂ9、ＥＣＨＯ ｖｉｒｕｓｅｓ ６，−９、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓなど多くの細菌やウイルスなどに対する抗原特異的なＩｇＡが含まれている（非特許文献１）。母乳中のＩｇＡが感染防御に働くことは疫学調査によっても確認されており、例えば母乳中のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ特異的ＩｇＡがＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染を予防することが示唆されている（非特許文献２）。また、母乳中の牛乳タンパク質特異的ＩｇＡが牛乳アレルギーの発症を予防する可能性も示唆されている（非特許文献３）。さらに、母乳中ＩｇＡにはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅのｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎに対する特異的ＩｇＡが含まれており、抗毒素作用を発揮する可能性も示唆されている（非特許文献１）。
【０００４】
したがって、母乳中の抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加することができれば、母乳を摂取する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防できると考えられる。
【０００５】
母乳中の抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる方法としては、ブタにおいて細菌やウイルスに対するワクチンを経口、または乳腺に直接投与する方法が検討されている。しかし、ヒトにおいては未だ実用化の段階には無く、安全性の面からも課題が残されている（非特許文献４）。そこで、ヒト母乳中のＩｇＡを増加させる、より安全な方法として食品成分を用いる方法が考案されているが、これらの効果は母乳中の総ＩｇＡ量を増加させる例に限られており、細菌やウイルスなどに対する抗原特異的なＩｇＡ抗体価を増加させた例は見あたらない。すなわち、これまでに妊娠ブタにカゼインフォスフォペプチド分離物（ＣＰＰ−Ｉ）を投与することで、ブタ乳中の総ＩｇＡ濃度が１．５倍に増加すること（非特許文献５）、および妊婦への魚油の投与が母乳中の総ＩｇＡ濃度を増加させる可能性（非特許文献６）が示されているに過ぎない。
【非特許文献１】母乳哺育、ｐ３２４〜ｐ３３６、（１９８３）、加藤英夫ら編、メディアサイエンス社
【非特許文献２】Ｌａｎｃｅｔ、ｖｏｌ ３４２、ｐ１２１、（１９９３）、ＪＥ Ｔｈｏｍａｓら
【非特許文献３】Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ ７７、ｐ３４１〜ｐ３４７、（１９８６）、Ｍａｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｓ ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｒ
【非特許文献４】Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ、ｖｏｌ ４８０、ｐ２７９−２８６、（２０００）、Ｈ Ｓａｌｍｏｎ
【非特許文献５】Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ、ｖｏｌ ５７、ｐ４８６−４８９、（２００２）、Ｈ Ｋｉｔａｍｕｒａら
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、ｖｏｌ ３４、ｐ１２３７−１２４２、（２００４）、ＪＡ Ｄｕｎｓｔａｎら
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の様に、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる安全性の高い方法は未だ実用化段階には無い。一方、近年、新生児に対する母乳哺育の有効性が明らかになるに連れ、世界的に母乳哺育が推進されており、母乳中の感染防御成分の濃度を高める方法を開発することは、母乳を授乳する新生児の健康維持に貢献する上でも意義深い。
【０００７】
従って、本発明は、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることで、母乳を授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することを可能とする、安全性に優れ日常的に汎用できる医薬および栄養組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題について鋭意検討したところ、本発明者等は特定種類のフラクトオリゴ糖を有効成分として含むＩｇＡ産生増強剤を周産期のマウスに投与することで、授乳期間の２／３以上の期間において乳中の総ＩｇＡ濃度および抗原特異的ＩｇＡ抗体価が増加することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、ある特定種類のフラクトオリゴ糖を主成分とする医薬および栄養組成物を提供することで、上記課題を解決することが可能となった。
【００１０】
本発明のある態様としては、下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤である：
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。
【００１１】
上記のフラクトオリゴ糖としては、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）ｆｒｕｃｔｏｓｙｌβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１−ケストース）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）2β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（ニストース）およびＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）3β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１F−β−フラクトフラノシルニストース）から選択される少なくとも１種以上を含んでなる混合物であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明の別の態様としては、上記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤の有効量を含有せしめた妊産婦・授乳婦用栄養組成物である。
【００１３】
上記の態様においては、有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％であることが好ましい。また、有効成分のフラクトオリゴ糖量が０．１〜３０ｇ／日であることが好ましい。
【００１４】
本発明によるＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。
【発明の効果】
【００１５】
上記した本発明の構成によるＩｇＡ産生増強剤は、使用法が簡便であり且つ高い効果を示し、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることができる。すなわち、特定種類のフラクトオリゴ糖を含有する増強剤を摂取させることで、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。
【００１７】
本発明で用いるフラクトオリゴ糖は、フラクトースが２分子以上連結した構造をもつオリゴ糖で、一般式（Ｉ）で表される。
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）
【００１８】
一般式（Ｉ）において、ｎ＝１のフラクトオリゴ糖として１−ケストース（ＧＦ２）、ｎ＝２のフラクトオリゴ糖としてニストース（ＧＦ３）、そしてｎ＝３のフラクトオリゴ糖として１F−β−フラクトフラノシルニストース（ＧＦ４）があげられる。本発明の有効成分であるフラクトオリゴ糖は、ＧＦ２、ＧＦ３、およびＧＦ４から選択される少なくとも１種以上を含む混合物であることが好ましく、ＧＦ２を含むことがより好ましい。
【００１９】
本発明で用いるフラクトオリゴ糖の混合物の構成比（重量）としては、本発明はこれには限定されないが、グルコースおよびショ糖が０〜５％、ＧＦ２が２９〜４１％、ＧＦ３が４４〜５６％、ＧＦ４が６〜１４％であることが好ましい。
【００２０】
本発明に用いるフラクトオリゴ糖は化学合成品でもよく、または、ショ糖を原料とし転移酵素（Ａｕｒｅｏｂａｃｉｄｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどのカビのβ−ｆｒｕｃｔｏ−ｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）を用いて大量生産され、市販されているものを用いることも出来る。例えば、メイオリゴ（登録商標）（明治製菓、日本）、ＡＣＩＬＩＧＨＴ（登録商標）（Ｂｅｇｈｉｎ Ｍｅｉｊｉ−Ｆｒａｎｃｅ）、ＮＵＴＲＡＦＬＯＲＡ（登録商標）（ＧＴＣ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ−Ｕ．Ｓ．Ａ）等があげられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤は、フラクトオリゴ糖それ自身（液状または粉末状）で、また、他の活性物質と共に、あるいは他の薬理学的な活性物質と共に用いることができる。形態は、例えば、錠剤、被覆錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液または分散性粉末による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発明のＩｇＡ産生増強剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２２】
本発明によるＩｇＡ産生増強剤の摂取量としては、妊産婦または授乳婦の年齢、身体状態等に依存して変化するが、通常、フラクトオリゴ糖として２０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であることが好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を含有するＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。また本発明の薬剤を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価の増強効果を簡便に得ることができる。
【００２４】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を含有するＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用食品組成物中に、有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％含むように調整することが好ましい。
【００２５】
栄養組成物として使用する場合には、具体的には、各種飲食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、妊産婦・授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に本発明の薬剤を添加し、これを摂取してもよい。本有効成分をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の栄養組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。
【００２６】
その他の成分についても特に限定されないが、本発明の薬剤を含有する栄養組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【００２７】
フラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤の栄養組成物中に含ませるべき有効量は、成人で有効成分のフラクトオリゴ糖量として０．１〜３０ｇ／日、好ましくは０．５〜１１ｇ／日である。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
〈材料および方法〉
実験動物は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ社）を用いた。マウスはＳＬＣ社にて繁殖および飼育した。本発明のフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤としては、メイオリゴＰ（登録商標、明治製菓株式会社製、１−ケストース、ニストース、１Ｆ−β−フルクトフラノシルニストースの混合物、純度９５％以上）またはメイオリゴCR（１−ケストース、純度９７％以上）を用いた。
【００２９】
妊娠０日目（プラグ確認日）のＢＡＬＢ／ｃマウスを２群（ｎ＝６〜１１）に分け、カゼイン精製飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ、１０Ｇｌｙにてγ線滅菌済み。）、またはカゼイン精製飼料に含まれるショ糖の５％を上記フラクトオリゴ糖（メイオリゴＰまたはメイオリゴCR）に置き換えた飼料（以下「実験飼料（フラクトオリゴ糖）」、または「実験飼料（ケストース）」と称す。）を自由摂取により投与した。
【００３０】
出産後、母マウス１匹当たりの仔マウスの匹数を６〜８匹に合わせ、更に前記のカゼイン精製飼料、または実験飼料（フラクトオリゴ糖）を継続して投与した。飲水は水道水を自由摂取させた。出産７日目および１４日目に母マウスから乳を採取した。
【００３１】
乳の採取（搾乳）は以下の手順で行った。即ち、搾乳の８〜１２時間前に仔を母マウスから離し貯乳させ、搾乳の１５分前にオキシトシン１単位を皮下注射した。エーテル麻酔下またはイソフルラン麻酔下にて手指で乳首を刺激し、キャピラリー管で母乳を採取した得られた乳は−４０℃で保存した。
【００３２】
総ＩｇＡ濃度の測定は以下の方法により行った。抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９６９）を０．１５Ｍリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で５００倍希釈し、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ４３９４５４）の各ウェルに希釈した抗体を１００μｌずつ入れ４℃で一晩静置した。翌日各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした。マウス乳またはマウスＩｇＡ標準品（ＩＣＮ社、６４３３４１）を適当な濃度に希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを各ウェルに１００μｌ添加し４℃で一晩インキュベートした。翌日ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９７８）を１万倍希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを１００μｌ添加し、２時間インキュベートした（室温）。０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ ４３−４３２２、１ｍｇ／ｍｌ）を１０００倍希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したもの１００μｌを添加し１時間インキュベートした（室温）。０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、４−ニトロフェニルリン酸（東京化成工業 Ｎ０２４１）をジエタノールアミンバッファーで１ｍｇ／ｍｌに溶解し、これを１００μｌずつウェルに添加し３０分反応させた。５Ｎ ＮａＯＨ２５μｌを添加して反応を停止させたのち、測定波長４０５ｎｍ、対照波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。二元配置分散分析により危険率１％または５％で有意差を判定した。マウス乳中のＩｇＡ濃度を図１〜４、表１〜４に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
【００３７】
菌体抗原溶液の調製は以下の方法で行った。日本ＳＬＣ社のＢＡＬＢ／ｃマウスから糞便を採取し、バクテロイデス菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ. OB７１７８、明治乳業）を単離した。バクテロイデス菌をGAM培地（日水製薬、ＧＡＭブイヨン、ｃｏｄｅ０５４２２）で３７℃、一晩嫌気培養した後、菌体を生理食塩水で３回洗浄した。洗浄した菌体を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後、菌体をPBSで洗浄し、６６０ｎｍの吸光度（光路長１ｃｍ）が１．０になるように炭酸バッファー（ｐH９．６）で希釈した。
【００３８】
母乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価の測定は以下の方法で行った。９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ４３９４５４）の各ウェルに希釈した菌体抗原溶液を１００μｌずつ入れ４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳで2時間ブロッキングした。マウス乳を100倍に希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを各ウェルに１００μｌ添加し４℃で一晩インキュベートした。翌日ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９７８）を１万倍希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを１００μｌ添加し、２時間インキュベートした（室温）。０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ ４３−４３２２、１ｍｇ／ｍｌ）を１０００倍希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したもの１００μｌを添加し１時間インキュベートした（室温）。０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、４−ニトロフェニルリン酸（東京化成工業 Ｎ０２４１）をジエタノールアミンバッファーで１ｍｇ／ｍｌに溶解し、これを１００μｌずつウェルに添加し発色させた。５Ｎ ＮａＯＨ２５μｌを添加して反応を停止させたのち、測定波長４０５ｎｍ、対照波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。二元配置分散分析により危険率１％または５％で有意差を判定した。マウス母乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価（抗ＯＢ７１７８抗体価）を図５，６、表５，６に示す。バクテロイデス菌特異的IｇA抗体価＝（A―B）―（C−D）とした。Aはバクテロイデス菌コーティング時の４０５nmの測定値、Bはバクテロイデス菌コーティング時の４９５nmの測定値、Cはバクテロイデス菌非コーティング時の４０５nmの測定値、Dはバクテロイデス菌非コーティング時の４９５nmの測定値である。
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
〈結果および考察〉
上記の方法により妊娠授乳期の母マウスにフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースを有効成分とする本発明によるＩｇＡ産生増強剤を投与したところ、授乳開始７日目、および１４日目において乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価が有意に増加することが確認された。グラフ及び表から分かるように、乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価は、対照群に対して本発明のＩｇＡ産生増強剤群（即ちフラクトオリゴ糖群またはケストース群）の方がおよそ１．５〜３倍高いことが確認できた。マウスの授乳期間は出産後、約２０日間であることから、妊娠授乳期のフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースの投与は、授乳期間の２／３以上の期間において乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることが明らかとなった。
バクテロイデス菌はヒト糞便中の細菌の８０％以上を占める常在細菌であり、通常の状態では無害であるが、消化管粘膜が損傷を受けた場合等に、消化管穿孔、腹膜炎、卵管炎、肝膿瘍、敗血症などの原因菌となる。したがって、妊娠授乳期のフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースの投与は、乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管におけるバクテロイデス菌の感染を防止することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明による新規なＩｇＡ産生増強剤は、使用法が簡便であり且つ高い効果を示すことが分かった。すなわち、特定種類のフラクトオリゴ糖または１−ケストースを含有する増強剤を妊産婦および授乳婦が摂取することで、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することを可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図２】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図３】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図４】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図５】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中バクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を示す図である。
【図６】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中バクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れ日常的に汎用でき且つ母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる医薬および栄養組成物を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび哺乳類の乳汁、すなわち母乳には分泌型ＩｇＡが含まれている。分泌型ＩｇＡは血清中のＩｇＡとは異なり、Ｊ鎖を含んだ二量体（ｄｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ）と多量体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ：ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメイン（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＣ）が結合した形で存在している。ＩｇＡには可変部と呼ばれる抗原結合部位が存在し、細菌、ウイルスなどの微生物や食物タンパクをはじめとする様々な外来抗原に結合し、それらが腸管の粘膜面から生体内へ侵入するのを防いでいる。出産後母体外に出た新生児の免疫機構は未成熟であり不十分であるために、感染症に対するリスクが非常に高い。そのため、母乳中のＩｇＡは新生児の腸管において生体防御に重要な役割を担っている。
【０００３】
例えば、母乳中ＩｇＡの抗体価の評価結果から、母乳中にはＴｅｔａｎｕｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｄｉｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｓｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ、Ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓｅｓ １，−２，−３、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ1，−Ｂ5，−Ｂ9、ＥＣＨＯ ｖｉｒｕｓｅｓ ６，−９、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓなど多くの細菌やウイルスなどに対する抗原特異的なＩｇＡが含まれている（非特許文献１）。母乳中のＩｇＡが感染防御に働くことは疫学調査によっても確認されており、例えば母乳中のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ特異的ＩｇＡがＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染を予防することが示唆されている（非特許文献２）。また、母乳中の牛乳タンパク質特異的ＩｇＡが牛乳アレルギーの発症を予防する可能性も示唆されている（非特許文献３）。さらに、母乳中ＩｇＡにはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅのｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎに対する特異的ＩｇＡが含まれており、抗毒素作用を発揮する可能性も示唆されている（非特許文献１）。
【０００４】
したがって、母乳中の抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加することができれば、母乳を摂取する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防できると考えられる。
【０００５】
母乳中の抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる方法としては、ブタにおいて細菌やウイルスに対するワクチンを経口、または乳腺に直接投与する方法が検討されている。しかし、ヒトにおいては未だ実用化の段階には無く、安全性の面からも課題が残されている（非特許文献４）。そこで、ヒト母乳中のＩｇＡを増加させる、より安全な方法として食品成分を用いる方法が考案されているが、これらの効果は母乳中の総ＩｇＡ量を増加させる例に限られており、細菌やウイルスなどに対する抗原特異的なＩｇＡ抗体価を増加させた例は見あたらない。すなわち、これまでに妊娠ブタにカゼインフォスフォペプチド分離物（ＣＰＰ−Ｉ）を投与することで、ブタ乳中の総ＩｇＡ濃度が１．５倍に増加すること（非特許文献５）、および妊婦への魚油の投与が母乳中の総ＩｇＡ濃度を増加させる可能性（非特許文献６）が示されているに過ぎない。
【非特許文献１】母乳哺育、ｐ３２４〜ｐ３３６、（１９８３）、加藤英夫ら編、メディアサイエンス社
【非特許文献２】Ｌａｎｃｅｔ、ｖｏｌ ３４２、ｐ１２１、（１９９３）、ＪＥ Ｔｈｏｍａｓら
【非特許文献３】Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ ７７、ｐ３４１〜ｐ３４７、（１９８６）、Ｍａｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｓ ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｒ
【非特許文献４】Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ、ｖｏｌ ４８０、ｐ２７９−２８６、（２０００）、Ｈ Ｓａｌｍｏｎ
【非特許文献５】Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ、ｖｏｌ ５７、ｐ４８６−４８９、（２００２）、Ｈ Ｋｉｔａｍｕｒａら
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、ｖｏｌ ３４、ｐ１２３７−１２４２、（２００４）、ＪＡ Ｄｕｎｓｔａｎら
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の様に、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させる安全性の高い方法は未だ実用化段階には無い。一方、近年、新生児に対する母乳哺育の有効性が明らかになるに連れ、世界的に母乳哺育が推進されており、母乳中の感染防御成分の濃度を高める方法を開発することは、母乳を授乳する新生児の健康維持に貢献する上でも意義深い。
【０００７】
従って、本発明は、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることで、母乳を授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することを可能とする、安全性に優れ日常的に汎用できる医薬および栄養組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題について鋭意検討したところ、本発明者等は特定種類のフラクトオリゴ糖を有効成分として含むＩｇＡ産生増強剤を周産期のマウスに投与することで、授乳期間の２／３以上の期間において乳中の総ＩｇＡ濃度および抗原特異的ＩｇＡ抗体価が増加することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、ある特定種類のフラクトオリゴ糖を主成分とする医薬および栄養組成物を提供することで、上記課題を解決することが可能となった。
【００１０】
本発明のある態様としては、下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤である：
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。
【００１１】
上記のフラクトオリゴ糖としては、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）ｆｒｕｃｔｏｓｙｌβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１−ケストース）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）2β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（ニストース）およびＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）3β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１F−β−フラクトフラノシルニストース）から選択される少なくとも１種以上を含んでなる混合物であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明の別の態様としては、上記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤の有効量を含有せしめた妊産婦・授乳婦用栄養組成物である。
【００１３】
上記の態様においては、有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％であることが好ましい。また、有効成分のフラクトオリゴ糖量が０．１〜３０ｇ／日であることが好ましい。
【００１４】
本発明によるＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。
【発明の効果】
【００１５】
上記した本発明の構成によるＩｇＡ産生増強剤は、使用法が簡便であり且つ高い効果を示し、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることができる。すなわち、特定種類のフラクトオリゴ糖を含有する増強剤を摂取させることで、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。
【００１７】
本発明で用いるフラクトオリゴ糖は、フラクトースが２分子以上連結した構造をもつオリゴ糖で、一般式（Ｉ）で表される。
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）
【００１８】
一般式（Ｉ）において、ｎ＝１のフラクトオリゴ糖として１−ケストース（ＧＦ２）、ｎ＝２のフラクトオリゴ糖としてニストース（ＧＦ３）、そしてｎ＝３のフラクトオリゴ糖として１F−β−フラクトフラノシルニストース（ＧＦ４）があげられる。本発明の有効成分であるフラクトオリゴ糖は、ＧＦ２、ＧＦ３、およびＧＦ４から選択される少なくとも１種以上を含む混合物であることが好ましく、ＧＦ２を含むことがより好ましい。
【００１９】
本発明で用いるフラクトオリゴ糖の混合物の構成比（重量）としては、本発明はこれには限定されないが、グルコースおよびショ糖が０〜５％、ＧＦ２が２９〜４１％、ＧＦ３が４４〜５６％、ＧＦ４が６〜１４％であることが好ましい。
【００２０】
本発明に用いるフラクトオリゴ糖は化学合成品でもよく、または、ショ糖を原料とし転移酵素（Ａｕｒｅｏｂａｃｉｄｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどのカビのβ−ｆｒｕｃｔｏ−ｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）を用いて大量生産され、市販されているものを用いることも出来る。例えば、メイオリゴ（登録商標）（明治製菓、日本）、ＡＣＩＬＩＧＨＴ（登録商標）（Ｂｅｇｈｉｎ Ｍｅｉｊｉ−Ｆｒａｎｃｅ）、ＮＵＴＲＡＦＬＯＲＡ（登録商標）（ＧＴＣ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ−Ｕ．Ｓ．Ａ）等があげられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤は、フラクトオリゴ糖それ自身（液状または粉末状）で、また、他の活性物質と共に、あるいは他の薬理学的な活性物質と共に用いることができる。形態は、例えば、錠剤、被覆錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液または分散性粉末による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発明のＩｇＡ産生増強剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２２】
本発明によるＩｇＡ産生増強剤の摂取量としては、妊産婦または授乳婦の年齢、身体状態等に依存して変化するが、通常、フラクトオリゴ糖として２０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であることが好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を含有するＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用栄養組成物として、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳、妊産婦・授乳婦用食品等に配合して利用できる他、周産期動物用飼料への利用が可能である。また本発明の薬剤を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価の増強効果を簡便に得ることができる。
【００２４】
一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を含有するＩｇＡ産生増強剤は、妊産婦・授乳婦用食品組成物中に、有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％含むように調整することが好ましい。
【００２５】
栄養組成物として使用する場合には、具体的には、各種飲食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、妊産婦・授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に本発明の薬剤を添加し、これを摂取してもよい。本有効成分をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の栄養組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。
【００２６】
その他の成分についても特に限定されないが、本発明の薬剤を含有する栄養組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【００２７】
フラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤の栄養組成物中に含ませるべき有効量は、成人で有効成分のフラクトオリゴ糖量として０．１〜３０ｇ／日、好ましくは０．５〜１１ｇ／日である。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
〈材料および方法〉
実験動物は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ社）を用いた。マウスはＳＬＣ社にて繁殖および飼育した。本発明のフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤としては、メイオリゴＰ（登録商標、明治製菓株式会社製、１−ケストース、ニストース、１Ｆ−β−フルクトフラノシルニストースの混合物、純度９５％以上）またはメイオリゴCR（１−ケストース、純度９７％以上）を用いた。
【００２９】
妊娠０日目（プラグ確認日）のＢＡＬＢ／ｃマウスを２群（ｎ＝６〜１１）に分け、カゼイン精製飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ、１０Ｇｌｙにてγ線滅菌済み。）、またはカゼイン精製飼料に含まれるショ糖の５％を上記フラクトオリゴ糖（メイオリゴＰまたはメイオリゴCR）に置き換えた飼料（以下「実験飼料（フラクトオリゴ糖）」、または「実験飼料（ケストース）」と称す。）を自由摂取により投与した。
【００３０】
出産後、母マウス１匹当たりの仔マウスの匹数を６〜８匹に合わせ、更に前記のカゼイン精製飼料、または実験飼料（フラクトオリゴ糖）を継続して投与した。飲水は水道水を自由摂取させた。出産７日目および１４日目に母マウスから乳を採取した。
【００３１】
乳の採取（搾乳）は以下の手順で行った。即ち、搾乳の８〜１２時間前に仔を母マウスから離し貯乳させ、搾乳の１５分前にオキシトシン１単位を皮下注射した。エーテル麻酔下またはイソフルラン麻酔下にて手指で乳首を刺激し、キャピラリー管で母乳を採取した得られた乳は−４０℃で保存した。
【００３２】
総ＩｇＡ濃度の測定は以下の方法により行った。抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９６９）を０．１５Ｍリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で５００倍希釈し、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ４３９４５４）の各ウェルに希釈した抗体を１００μｌずつ入れ４℃で一晩静置した。翌日各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした。マウス乳またはマウスＩｇＡ標準品（ＩＣＮ社、６４３３４１）を適当な濃度に希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを各ウェルに１００μｌ添加し４℃で一晩インキュベートした。翌日ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９７８）を１万倍希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを１００μｌ添加し、２時間インキュベートした（室温）。０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ ４３−４３２２、１ｍｇ／ｍｌ）を１０００倍希釈（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したもの１００μｌを添加し１時間インキュベートした（室温）。０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、４−ニトロフェニルリン酸（東京化成工業 Ｎ０２４１）をジエタノールアミンバッファーで１ｍｇ／ｍｌに溶解し、これを１００μｌずつウェルに添加し３０分反応させた。５Ｎ ＮａＯＨ２５μｌを添加して反応を停止させたのち、測定波長４０５ｎｍ、対照波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。二元配置分散分析により危険率１％または５％で有意差を判定した。マウス乳中のＩｇＡ濃度を図１〜４、表１〜４に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
【００３７】
菌体抗原溶液の調製は以下の方法で行った。日本ＳＬＣ社のＢＡＬＢ／ｃマウスから糞便を採取し、バクテロイデス菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ. OB７１７８、明治乳業）を単離した。バクテロイデス菌をGAM培地（日水製薬、ＧＡＭブイヨン、ｃｏｄｅ０５４２２）で３７℃、一晩嫌気培養した後、菌体を生理食塩水で３回洗浄した。洗浄した菌体を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後、菌体をPBSで洗浄し、６６０ｎｍの吸光度（光路長１ｃｍ）が１．０になるように炭酸バッファー（ｐH９．６）で希釈した。
【００３８】
母乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価の測定は以下の方法で行った。９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ４３９４５４）の各ウェルに希釈した菌体抗原溶液を１００μｌずつ入れ４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳで2時間ブロッキングした。マウス乳を100倍に希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを各ウェルに１００μｌ添加し４℃で一晩インキュベートした。翌日ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５６９７８）を１万倍希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したものを１００μｌ添加し、２時間インキュベートした（室温）。０．１％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ ４３−４３２２、１ｍｇ／ｍｌ）を１０００倍希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して希釈）したもの１００μｌを添加し１時間インキュベートした（室温）。０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄後、４−ニトロフェニルリン酸（東京化成工業 Ｎ０２４１）をジエタノールアミンバッファーで１ｍｇ／ｍｌに溶解し、これを１００μｌずつウェルに添加し発色させた。５Ｎ ＮａＯＨ２５μｌを添加して反応を停止させたのち、測定波長４０５ｎｍ、対照波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。二元配置分散分析により危険率１％または５％で有意差を判定した。マウス母乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価（抗ＯＢ７１７８抗体価）を図５，６、表５，６に示す。バクテロイデス菌特異的IｇA抗体価＝（A―B）―（C−D）とした。Aはバクテロイデス菌コーティング時の４０５nmの測定値、Bはバクテロイデス菌コーティング時の４９５nmの測定値、Cはバクテロイデス菌非コーティング時の４０５nmの測定値、Dはバクテロイデス菌非コーティング時の４９５nmの測定値である。
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
〈結果および考察〉
上記の方法により妊娠授乳期の母マウスにフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースを有効成分とする本発明によるＩｇＡ産生増強剤を投与したところ、授乳開始７日目、および１４日目において乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価が有意に増加することが確認された。グラフ及び表から分かるように、乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価は、対照群に対して本発明のＩｇＡ産生増強剤群（即ちフラクトオリゴ糖群またはケストース群）の方がおよそ１．５〜３倍高いことが確認できた。マウスの授乳期間は出産後、約２０日間であることから、妊娠授乳期のフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースの投与は、授乳期間の２／３以上の期間において乳中の総ＩｇＡ濃度およびバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を増加させることが明らかとなった。
バクテロイデス菌はヒト糞便中の細菌の８０％以上を占める常在細菌であり、通常の状態では無害であるが、消化管粘膜が損傷を受けた場合等に、消化管穿孔、腹膜炎、卵管炎、肝膿瘍、敗血症などの原因菌となる。したがって、妊娠授乳期のフラクトオリゴ糖混合物または１−ケストースの投与は、乳中のバクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管におけるバクテロイデス菌の感染を防止することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明による新規なＩｇＡ産生増強剤は、使用法が簡便であり且つ高い効果を示すことが分かった。すなわち、特定種類のフラクトオリゴ糖または１−ケストースを含有する増強剤を妊産婦および授乳婦が摂取することで、母乳中の総ＩｇＡ濃度および／または抗原特異的ＩｇＡ抗体価を増加させ、その結果、授乳する新生児の消化管における感染防御効果を増強し、あるいは新生児のアレルギー発症を予防することを可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図２】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図３】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図４】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中の総ＩｇＡ濃度を示す図である。
【図５】カゼイン精製飼料またはフラクトオリゴ糖添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中バクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を示す図である。
【図６】カゼイン精製飼料またはケストース添加実験試料を摂取した出産後ＢＡＬＢ／ｃマウスの母乳中バクテロイデス菌特異的ＩｇＡ抗体価を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤：
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。
【請求項２】
フラクトオリゴ糖がＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）ｆｒｕｃｔｏｓｙｌβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１−ケストース）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）2β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（ニストース）およびＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）3β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１F−β−フラクトフラノシルニストース）から選択される少なくとも１種以上を含んでなる混合物である請求項１記載のＩｇＡ産生増強剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＩｇＡ産生増強剤の有効量を含有せしめた妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【請求項４】
有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％である請求項３に記載の妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【請求項５】
有効成分のフラクトオリゴ糖量が０．１〜３０ｇ／日である請求項３または４に記載の妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるフラクトオリゴ糖を有効成分とするＩｇＡ産生増強剤：
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）nβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ （Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である。）。
【請求項２】
フラクトオリゴ糖がＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）ｆｒｕｃｔｏｓｙｌβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１−ケストース）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）2β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（ニストース）およびＧｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）3β（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（１F−β−フラクトフラノシルニストース）から選択される少なくとも１種以上を含んでなる混合物である請求項１記載のＩｇＡ産生増強剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＩｇＡ産生増強剤の有効量を含有せしめた妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【請求項４】
有効成分のフラクトオリゴ糖量が固形物重量に対して０．１〜７０重量％である請求項３に記載の妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【請求項５】
有効成分のフラクトオリゴ糖量が０．１〜３０ｇ／日である請求項３または４に記載の妊産婦・授乳婦用栄養組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１１５１６９（Ｐ２００８−１１５１６９Ａ）
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６４０７７（Ｐ２００７−２６４０７７）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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