水溶性ＰＱＱグルコース脱水素酵素の生産方法
【課題】 水溶性ＰＱＱＧＤＨの新規製造方法を提供すること。
【解決手段】 補酵素ＰＱＱの生合成能力を有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主としてＰＱＱＧＤＨを生産する。
【解決手段】 補酵素ＰＱＱの生合成能力を有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主としてＰＱＱＧＤＨを生産する。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の生産方法に関する。
【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨはこれまでに当該酵素を生産するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓを培養し、当該培養物からＰＱＱＧＤＨを抽出する方法と、さらにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来のＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を汎用的に用いられている大腸菌の発現ベクターに挿入し、これを大腸菌に形質転換し、形質転換された大腸菌を培養したのち、その培養物からＰＱＱＧＤＨを抽出する方法がしられていた。
【発明が解決しようとする課題】ＰＱＱＧＤＨを大量に生産するためには組み換えＤＮＡ技術にもとづいたＰＱＱＧＤＨを含む形質転換された大腸菌を用いる方法がすぐれていた。しかし、大腸菌はＰＱＱＧＤＨの補酵素であるＰＱＱを生合成する能力を有していないことから、活性を有するＰＱＱＧＤＨを生産するためには高価なＰＱＱを培養液に添加する必要があった。
【課題を解決するための手段】本発明者はこれまで組み換えＤＮＡ実験に用いられていた微生物を検索した結果、大腸菌の発現ベクターが用いることのできる微生物のうちでＫｌｅｂｓｉｅｌｌｌａ属の細菌がＰＱＱを合成できることに注目した。すなわち、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌に大腸菌でＰＱＱＧＤＨの生産に用いていた発現ベクターを形質転換すれば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の菌体が生産するＰＱＱによって組み換え生産されるＰＱＱＧＤＨが補酵素と結合した活性のあるＰＱＱＧＤＨとして生産できることを見いだした。
【発明の実施の形態】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１大腸菌発現ベクター、ｐＴｒｃ９９Ａに抗生物質カナマイシン耐性遺伝子を導入したｐＴｒｃ９９Ｋを作成した。このベクターのマルチクローニングサイトにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子を挿入し、これをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ４１８株にエレクトロポレーション法によって形質転換した。得られた形質転換体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＣＴＣ４１８はカナマイシン耐性株として選択した。
実施例２大腸菌発現ベクターｐＴｒｃ９９ＫにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子が挿入されたベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ４１８をＰＱＱを含まない培地、例えばＬ−培地にて培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分をえることができる。得られた水溶性画分をイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどにより精製する。生産されるＰＱＱＧＤＨの量は同じ条件で大腸菌を宿主として用いて培養したときの生産量とほぼ同等であった。しかし、大腸菌を宿主として生産した場合、培地にＰＱＱを添加しない限り、生産されたＰＱＱＧＤＨは活性を示す、活性型としては生産されない。しかし、本発明によって生産されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主として生産されたＰＱＱＧＤＨは培地にＰＱＱを添加していないにもかかわらず、当該細菌が生産しているＰＱＱによってＰＱＱと結合した活性型ＰＱＱＧＤＨとして生産される。
実施例３Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主として生産されたＰＱＱＧＤＨのＮ−末端配列を解析したところ、グラム陰性細菌のペリプラズムに分泌生産されるためのＰＱＱＧＤＨのＮ−末端に存在するシグナルペプチドは切除され、大腸菌あるいはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおいて生産されているＰＱＱＧＤＨと同じＮ−末端配列であった。
【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の生産方法に関する。
【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨはこれまでに当該酵素を生産するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓを培養し、当該培養物からＰＱＱＧＤＨを抽出する方法と、さらにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来のＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を汎用的に用いられている大腸菌の発現ベクターに挿入し、これを大腸菌に形質転換し、形質転換された大腸菌を培養したのち、その培養物からＰＱＱＧＤＨを抽出する方法がしられていた。
【発明が解決しようとする課題】ＰＱＱＧＤＨを大量に生産するためには組み換えＤＮＡ技術にもとづいたＰＱＱＧＤＨを含む形質転換された大腸菌を用いる方法がすぐれていた。しかし、大腸菌はＰＱＱＧＤＨの補酵素であるＰＱＱを生合成する能力を有していないことから、活性を有するＰＱＱＧＤＨを生産するためには高価なＰＱＱを培養液に添加する必要があった。
【課題を解決するための手段】本発明者はこれまで組み換えＤＮＡ実験に用いられていた微生物を検索した結果、大腸菌の発現ベクターが用いることのできる微生物のうちでＫｌｅｂｓｉｅｌｌｌａ属の細菌がＰＱＱを合成できることに注目した。すなわち、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌に大腸菌でＰＱＱＧＤＨの生産に用いていた発現ベクターを形質転換すれば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の菌体が生産するＰＱＱによって組み換え生産されるＰＱＱＧＤＨが補酵素と結合した活性のあるＰＱＱＧＤＨとして生産できることを見いだした。
【発明の実施の形態】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１大腸菌発現ベクター、ｐＴｒｃ９９Ａに抗生物質カナマイシン耐性遺伝子を導入したｐＴｒｃ９９Ｋを作成した。このベクターのマルチクローニングサイトにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子を挿入し、これをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ４１８株にエレクトロポレーション法によって形質転換した。得られた形質転換体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＣＴＣ４１８はカナマイシン耐性株として選択した。
実施例２大腸菌発現ベクターｐＴｒｃ９９ＫにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子が挿入されたベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ４１８をＰＱＱを含まない培地、例えばＬ−培地にて培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分をえることができる。得られた水溶性画分をイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどにより精製する。生産されるＰＱＱＧＤＨの量は同じ条件で大腸菌を宿主として用いて培養したときの生産量とほぼ同等であった。しかし、大腸菌を宿主として生産した場合、培地にＰＱＱを添加しない限り、生産されたＰＱＱＧＤＨは活性を示す、活性型としては生産されない。しかし、本発明によって生産されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主として生産されたＰＱＱＧＤＨは培地にＰＱＱを添加していないにもかかわらず、当該細菌が生産しているＰＱＱによってＰＱＱと結合した活性型ＰＱＱＧＤＨとして生産される。
実施例３Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを宿主として生産されたＰＱＱＧＤＨのＮ−末端配列を解析したところ、グラム陰性細菌のペリプラズムに分泌生産されるためのＰＱＱＧＤＨのＮ−末端に存在するシグナルペプチドは切除され、大腸菌あるいはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおいて生産されているＰＱＱＧＤＨと同じＮ−末端配列であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の構造遺伝子を含む大腸菌発現ベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。
【請求項２】 請求項１において大腸菌発現ベクターが高発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡであるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ形質転換体。
【請求項３】 請求項１においてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の構造遺伝子を含む大腸菌発現ベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが特にＮＣＴＣ４１８株である形質転換体。
【請求項４】 請求項１〜３に記載の形質転換体をもちいて生産されたＰＱＱＧＤＨ。
【請求項１】 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の構造遺伝子を含む大腸菌発現ベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。
【請求項２】 請求項１において大腸菌発現ベクターが高発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡであるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ形質転換体。
【請求項３】 請求項１においてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の構造遺伝子を含む大腸菌発現ベクターが形質転換されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが特にＮＣＴＣ４１８株である形質転換体。
【請求項４】 請求項１〜３に記載の形質転換体をもちいて生産されたＰＱＱＧＤＨ。
【公開番号】特開２００１−６１４７６（Ｐ２００１−６１４７６Ａ）
【公開日】平成１３年３月１３日（２００１．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−２８４６５０
【出願日】平成１１年８月３０日（１９９９．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１１年９月１６日〜９月１８日 社団法人日本生物工学会開催の「平成１１年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５９６１５３３５７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１３年３月１３日（２００１．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年８月３０日（１９９９．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１１年９月１６日〜９月１８日 社団法人日本生物工学会開催の「平成１１年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５９６１５３３５７）
【Ｆターム（参考）】
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