汚泥削減方法
【課題】活性汚泥処理方法において、活性汚泥中の微生物活性を高める低コストな汚泥減容剤を提供し、さらに汚泥を削減する汚泥削減方法を提供する。
【解決手段】本発明は、上記課題を解決するため、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法の構成、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする汚泥削減方法の構成とし、前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする汚泥削減方法の構成とした。また、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤の構成とした。
【解決手段】本発明は、上記課題を解決するため、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法の構成、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする汚泥削減方法の構成とし、前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする汚泥削減方法の構成とした。また、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤の構成とした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥処理方法において、微生物活性を高め汚泥を削減する汚泥削減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、家庭排水、各種産業から排出された汚水等の被処理水の処理方法として、微生物（酵母、カビ、藍藻、放線菌など各種細菌、植物性プランクトン、動物性プランクトンなど活性汚泥処理に用いられる有用微細動植物を含むものとする。）による活性汚泥処理方法が用いられてきた。
【０００３】
図１２に示すように、ワムシに代表される原生動物などの有用な微生物相を形成することにより、活性汚泥は活性化され、汚泥の低減、悪臭の抑制、処理水の水質向上が可能とされている。
【０００４】
活性汚泥中の微生物を活性化させるため、微生物に資化される栄養素、取り分けビタミン類を活性汚泥に添加する手法が１９７０年代から研究され、多数の論文（非特許文献１〜１６）が発表されている。
【０００５】
非特許文献１〜１６に記載のビタミンの作用・効果等を図１３にまとめた。非特許文献１には、糸状性細菌の発生抑制としてビタミンＢ１、Ｂ１２が作用しており、代表的な糸状性細菌であるｔｙｐｅ０２１Ｎを捕食する有用原生動物トリティグモストマ ククルルスの成長因子にビタミンＢ１、Ｂ１２が必須であることが報告されている。
【０００６】
また、活性汚泥中でビタミンB群を必要とする微生物種については工業排水、生活排水などの各分野で調査されており（非特許文献３）、製紙業、石油化学業、廃棄物処理場で多くのビタミンB群を必要とする微生物の存在が報告されている（非特許文献２、９）。図１４は、非特許文献２を引用したもので、産業別活性汚泥中のビタミンB群を必要とする微生物種の存在比率である。
【０００７】
さらに、非特許文献７〜１３にはビタミンＢ群が活性汚泥に必要不可欠であると報告されている。また非特許文献１４〜１６にはビタミンＢ群を活性汚泥に添加した場合、活性汚泥の活性が高まるとことが報告されている。
【０００８】
しかし、ビタミンなどの栄養素を別途、活性汚泥に添加する手法はコストが嵩み実現性がなかった。
【０００９】
他方、特許文献１には、排水処理施設の処理機能に悪影響を及ぼすことなく、余剰汚泥の低減化を図ることを目的として、茶葉またはその浸出液あるいは、茶葉に含まれるアミノ酸等の微生物活性化成分及びタンニン等の汚泥可溶化成分からなる組成物を、バイオマスに接触させることを特徴とする排水処理施設の汚泥低減化方法が開示されている。
【００１０】
また、特許文献２には、海水および淡水底面の汚泥を、環境に負荷をかけることなく、簡便かつ高効率に、工業的規模で処理するための浄化処理装置が開示されている。特に請求項１には、海水または淡水底面の汚泥を浄化処理するための装置であって、少なくとも、海底汚泥を含有する汚泥を充填し、ビタミン類を添加して分解反応を行うための第１反応槽が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−１５５６８号公報
【特許文献２】特開２００３−４７９９６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Y.Inamori,Y.Kuniyasu, R.Sudo, and M.Koga Control of the growth of filamentousmicroorganisms using predacous ciliated protozoa. Water Science Technology.1991;23 963-971
【非特許文献２】J.E.Burgess,J.Quarmby, and T.Stephenson Role of micronutrients in activated sludge-basedbiotreatment of industrial effluents. Biotechnology Advances 17(1999)49-47
【非特許文献３】LindG, Schade M, Metzner G, Lemmer H Use of vitamins in biological waste watertreatment. GWF-Wasser/Abwasser 1994;135:595-600.
【非特許文献４】SingletonJ. Microbial metabolism of xenobiotics:Fundamental and applied research. J ChemTechnol Biotechnol 1994;59:9-23.
【非特許文献５】WoodDK, Tchobanoglous G. Trace elements in biological waste treatment. J Wat PollutControl Fed 1975;47:1933-45.
【非特許文献６】GostickN. A study of the effect of substrate composition on the settlement ofactivated sludge PhD Thesis, Cranfield University, U.K. 1991.
【非特許文献７】BeardsleyML, Coffey JM Bioaugmentation: optimizing biological wastewater treatment.Pollution Engineering 1985;December:30-3.
【非特許文献８】JEBurgess, J Quarmby and T Stephenson Vitamin addition: an option for sustainableactivated sludge process effluent quality. Journal of Industrial Microbiology& Biotechnology (2000) 24, 267-274
【非特許文献９】HildeLemmer, George Lind, Gerhard Metzner, Lutz Nitschke and Margit Schade Vitaminaddition in biological wastewater treatment Water Science and Technology Volume37, Issues 4-5, 1998, Pages 395-398
【非特許文献１０】KidderGW, Dewey VC. Studies on the biochemistry of Tetrahymena XIII. B vitamin requirements. Arch Biochem 1949;21:66-73.
【非特許文献１１】SchormullerJ. Vitamins as growth material for bacteria. A comprehensive review. Z LebensmUntersuchung undForschung 1948;88:408-36.
【非特許文献１２】VoigtMN, Eitenmiller RR, Ware GO. Vitamin analysis by microbial and protozoanorganisms: response to vitaminconcentration, incubation time and assay vessel size. J Food Sci1979;43:1418-23.
【非特許文献１３】YamadaK, Kawasaki T. Properties of the thiamine transport system in Escherichia coli.J Bact 1980;141:254-61.
【非特許文献１４】LemmerH, Nitschke L. Vitamin content of four sludge fractions in the activated sludgewaste water treatment process. Water Res 1994;28:737-9
【非特許文献１５】LemmerH. Biological additives for waste water treatment-Theory and practice.Munchener Beitrage zur Abwasser-, Fischerei- und Flusbiologie 1992;46:254-82.
【非特許文献１６】SarfertF, Eikelboom DH, Klein B, Kowalsky H, Lemmer H, Matsche N, Popp W, Reinnarth G,Wagner F. Biological additives in waste watertreatment-bacteria-enzymes-vitamins-algal preparations. Korrespondez Abwasser1990;7:793-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明は、活性汚泥処理方法において、活性汚泥中の微生物活性を高める低コストな汚泥減容剤を提供し、さらに汚泥を削減する汚泥削減方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記の課題を解決するために、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法の構成とし、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、細胞外にアルギン酸を分泌することを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とし、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とし、前記培養が、純粋培養した後、濃縮し、濃縮液をｐＨ１０に調整し、１日〜５日間開放状態で放置することを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。
【００１５】
また、前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。なお、汚泥１トンに対して２０ｇより少ない場合には効果が希薄である。一方、２００ｇより多い場合であっても汚泥の削減効果は発揮するが頭打ちになり、費用が嵩み好ましくない。
【００１６】
また、前記アルギン酸がアルギン酸オリゴマーであることを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。また前記アルギン酸オリゴマーが、β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の合計が３〜１０残基であることを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とした。
【００１７】
さらに、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤の構成とした。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、上記構成であるので以下の効果を発揮する。光合成により増殖したバイノスを乾燥し粉末化した物を用いることにより、汚泥中の微生物相を最適化し、低コストで活性汚泥を活性化するビタミン源を提供するとともに、それにより活性汚泥の削減が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】バイノス（Ａ）とクロレラ（Ｂ）の透過型電子顕微鏡像（１０，０００倍）である。
【図２】バイノスと各種試料のビタミンＢ群の含有量の比較表である。
【図３】バイノス培養液の微分干渉顕微鏡像（４００倍）である。
【図４】バイノス培養物の細胞溶解物及びアルギン酸ナトリウム（標準品）のＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定結果（スペクトル）である。
【図５】汚泥活性化確認実験の結果である。
【図６】汚泥活性化後の瀑気槽液の顕微鏡像（１００倍）である。
【図７】バイノスパウダー添加による汚泥削減化実験の結果である。
【図８】汚泥削減化実験後の残存した汚泥の成分分析結果である。
【図９】曝気槽のＤＧＧＥ解析結果である。
【図１０】ＤＧＧＥ解析時の活性汚泥の顕微鏡写真である。
【図１１】アルギン酸オリゴマーの微生物増殖に対する影響を調べた結果である。
【図１２】汚泥削減メカニズムの説明図である。
【図１３】ビタミンＢ群の微生物に対する作用をまとめた表である。
【図１４】活性汚泥中でビタミンＢ群を必要とする微生物の割合である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、バイノス（Ａ）とクロレラ（Ｂ）の透過型電子顕微鏡像（１０，０００倍）である。バイノスとは、光合成緑藻類のパラクロレラ属微細藻類パラクロレラ・エスピー・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓ、以下「バイノス」という。）のことである。
【００２１】
その内の１種については、発明者等が、既に岐阜県内の工場排水処理場から新たに単離し、（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、２００８年２月２８日付けで寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９が付与されている。今現在入手可能である。
【００２２】
光合成緑藻類には、図１（Ｂ）に示したサプリメントとして利用されるクロレラ、重油を生産するボトリオコッカス、アスタキサンチンを生産することで知られるヘマトコッカスなどが含まれる。
【００２３】
発明者等が単離したＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株は、分裂時間約７．８時間と早く、光合成能力が非常に高い。また、クロロフィル量が一般的なクロレラと比べ、乾燥重量１００ｇあたりの２倍以上含まれている。
【００２４】
特に、クロロフィルｂがクロレラに比べ極めて多く（約８倍）で、深部水環境でも青色を効率的に利用し、光合成が可能である。また、代謝物として、多種多量のビタミンＢ群を代謝する（図２）。また、一般的なクロレラは細胞最外層に厚い細胞壁を有しているが、バイノスは細胞壁が非常に薄いことが特徴である。
【００２５】
図２は、バイノスと各種試料のビタミンＢ群の含有量の比較表である。表ＡがビタミンＢ１、ＢがビタミンＢ２、ＣがビタミンＢ６、ＤがビタミンＢ１２である。バイノスについては、開放系での培養物を凍結乾燥したものである。
【００２６】
図２に示すように、バイノスの乾燥物（以下、バイノスパウダーという。）のビタミンＢ群の含有量は次の通りである。なお、図２のデーターはＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株のものである。
【００２７】
ビタミンＢ１は５８５．００ｍｇ／乾燥１００ｇ（小麦胚芽の約３２１倍）、ビタミンＢ２は３０．０ｍｇ／乾燥１００ｇ（豚・肝臓の約１７倍）、ビタミンＢ６は４７５．００ｍｇ／乾燥１００ｇ（ニンニクの約３１７倍）、ビタミンＢ１２は１０，０００μｇ／乾燥１００ｇ（アマノリの約１３０倍）である。バイノスは、他の試料に比べビタミンＢ群の含有量が非常に多く、ビタミン源として極めて有効であると言える。
【００２８】
図３は、バイノス培養液の微分干渉顕微鏡像（４００倍）である。試料は、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の純培養液を開放系で拡大培養したときの培養液を用いた。
【００２９】
バイノスの培養液は以下のようにして調整した。液体培地；ＫＮＯ３（２．５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（７．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７．５／Ｌ）、ＣａＣｌ２（２．５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（２０ｇ／Ｌ）の各水溶液を１０ｍＬずつ９４０ｍＬ蒸留水に添加し、１％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３を１滴及びＡｒｎｏｎｓ Ａ５溶液を２ｍＬ添加し、ｐＨを６．５に調整した後、１２１℃、１５分間のオートクレーブ処置した。
【００３０】
平板培地；固体培地は、前記液体培地のｐＨ調整前に、１．５％（ｗ／ｖ）寒天を加えて前記同様に調整した。また、種々の容量の液体培地は上記比率で適宜作ることができる。なお、単一コロニーの判定にはＬＢ培地を使用し、植菌してコンタミネーションの有無で判断する。
【００３１】
培養条件；バイノスの培養は、前記培養液にバイノスの純粋培養液、又は開放系での培養液を種菌として添加し、室温〜３０℃、明条件（最低７００Ｌｕｘ、好ましくは約２，０００〜２０，０００Ｌｕｘ程度、最も好ましくは約３，０００〜８，０００Ｌｕｘ）、好気的条件（振とう培養など）下で行った。
【００３２】
なお、バイノスは、淡水又はＬＢ培地等の一般的な培地中で、好気的条件下にて生育可能である。
【００３３】
図３の丸で囲まれた中の球状物がバイノスである。点線で囲まれ部分はバイノスの分泌物で、アルギン酸である（図４）。抽出物内には、無数の微生物群（共生微生物群）が確認できる。
【００３４】
図４は、バイノス培養物の細胞溶解物及びアルギン酸ナトリウム（標準品）のＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定結果（スペクトル）である。
【００３５】
上述の液体培地で純粋培養したバイノス（２ｇ／Ｌ）に、Ｎａ２ＣＯ３を終濃度で２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、細胞を溶解させた。この溶解物を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み回収し、０．４μｍフィルターにて濾過した。前記フィルター上の残渣を、１Ｎ ＨＣｌ及び１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、ＦＴ−ＩＲ測定に供した。
【００３６】
バイノス抽出物のスペクトルをアルギン酸ナトリウム（標準品）のスペクトルと比較したところ、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株が細胞外に分泌する分泌物はアルギン酸であることが明らかになった。
【００３７】
アルギン酸は、褐藻などに含まれる分子量２０万〜３０万の多糖類で、食物繊維の一種である。ほかに紅藻のサンゴモ、一部の細菌（アゾトバクターなど）が部分的に酢酸エステル化されたアルギン酸を生成するとされるが、これらによる工業的生産は未だ成功していないとされる。
【００３８】
純粋のアルギン酸は白ないし淡黄色で、繊維状、顆粒状または粉末状の形態をとる。水に不溶性であるが、アルギン酸ナトリウムなどの可溶性塩として抽出され、食品添加物その他の目的で利用される。
【００３９】
β−Ｄ−マンヌロン酸
(M) とそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸
(G) の２種のいずれもカルボキシル基をもつ単糖ブロックが、（１−４）−結合した直線状のポリマーである。Ｍ、Ｇブロックの量比は起源により異なる。
【００４０】
MとGが交互につながったブロックが最も柔軟性があり、中性に近いｐＨで溶けやすい。Gからなるブロックは固く、６残基以上からなるGブロックは２価カチオン（Ｃａ２＋など）と安定な複合体の３次元ゲルを形成する。
【００４１】
発明者等は、単離したバイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株において、緑藻類として初めてアルギン酸を生合成することを発見し、既に特許出願をしている。
【００４２】
以下、添付の図面を参照し、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【実施例１】
【００４３】
図５は、汚泥の活性化確認実験の結果である。曝気槽の活性汚泥を５００ｍＬ量り取り、１０ｍｇの乾燥バイノスパウダーを添加し、ＤＯ値（ｍｇ／Ｌ）が飽和状態になるまで８００ｒｐｍで攪拌した後、攪拌速度を２００ｒｐｍにし、ＤＯ値の推移を３０分毎に測定した。なお、ＤＯ値とは、溶存酸素濃度のことである。
【００４４】
その結果、図５に示した通り、バイノスパウダーを添加（●）することで実験開始３０分後にＤＯ値がバイノスパウダー無添加のコントロール（■）に比べ急激に低下していることから、微生物の呼吸量が倍増していることが分かる。従って、バイノスパウダーの添加によって活性汚泥中の微生物群が活性化されたことが明らかになった。
【００４５】
図６は、汚泥活性化後の曝気槽液の顕微鏡像（１００倍）である。活性汚泥にビタミンB群を添加することにより、汚泥中の微生物群が最適化されることはよく知られている（非特許文献７〜１３）。そこで、図５で使用したバイノスパウダーを添加した実験サンプルを、７日間放置し、微生物群の変化を観察した。
【００４６】
その結果、図６に示す通り、バイノスパウダー添加前（Ａ）では原生動物（ワムシ、ゾウリムシ）はわずかしか確認できなかったが、バイノスパウダー添加後（Ｃ）では原生動物（ワムシ、ゾウリムシ）の個体数と種類が増加していた。その処理水においてはバイノスパウダー無添加に比べ透明感が向上していた。微生物群の最適化により処理水の水質が向上されることは、非特許文献３〜５でも報告されている。
【実施例２】
【００４７】
次に、バイノスパウダーの添加によって汚泥が削減されるか調べた。汚泥濃縮槽の汚泥１Ｌに対してバイノスパウダー０．３ｍｇ添加（汚泥１ｇに対してバイノスパウダー０．０２ｍｇ添加に相当）し、マグネティックスターラーにて攪拌（４００ｒｐｍ）し、日毎にＭＬＳＳを測定した。ＭＬＳＳの測定は、１９９７年版「下水試験方法」上巻第６節［活性汚泥浮遊物質］の測定方法に準じて行った。なお、ＭＬＳＳ（Mixed
liquor Suspended Solid）とは、一般に曝気槽内の活性汚泥浮遊物質で、重量法（ｍｇ／Ｌ）で表示される。その結果を図７、図８に示す。
【００４８】
図７は、バイノスパウダー添加による汚泥削減化実験の結果である。図７のＭＳＳＬの測定結果より、汚泥発生量の約４０％削減（６日目）が確認できた。
【００４９】
図８は、汚泥削減化実験後の残存した汚泥の成分分析結果である。図７の６日目のサンプルを強熱減量試験に供した。強熱減量試験は、ＪＩＳ Ｋ０１０２ １４．５［強熱減量］に準じておこなった。
【００５０】
図８の強熱減量試験の結果、無添加の有機物が約１１，０００ｍｇ／Ｌであるところ、バイノスパウダーを添加することで有機物が約５，０００であり、バイノスパウダーの添加によって有機物の約５５％が分解されたことが確認できた。
【実施例３】
【００５１】
活性汚泥にバイノスパウダーを添加し活性汚泥の微生物相変化をＤＧＧＥ(Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法)で調べた。
【００５２】
（１）バイノス培養方法（大量培養）
上述の平板培地にて、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の単一コロニー釣菌し、同平板培地に上述の条件で拡線培養する。増殖した少量のＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株を試験管中の上述の液体培地１〜１０ｍＬに植え継ぎ増殖させ、さらに５０〜１０００倍の同液体培地（フラスコ）に植え継ぎ振とう培養し、第１次培養液を調整する。試験管培養からフラスコ培養まで約７日間要する。
【００５３】
次に、第１次培養液（例えば２００Ｌ）を約１０倍（２，０００Ｌ）の上述の液体培地の浴槽に植え継ぎ７日間静地（又は対流或いはエアレーション）下で培養して第２次培養液を調整する。
【００５４】
さらに、第２次培養液（２，０００Ｌ）を約１０倍（２０，０００Ｌ）の上述の培養液槽に植え継ぎ７日間静地（又は対流或いはエアレーション）下で培養して大量培養液を調整する。
【００５５】
そして、大量培養液からＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株を凝集沈殿にて濃縮物を得る。凝集沈殿には、カチオン系の高分子凝集剤を用いた。続いて、濃縮物にＮａＯＨ溶液などを添加して、濃縮物をｐＨ１０に調整する。ｐＨ１０に調節するのは、細胞外分泌多糖類であるアルギン酸をより多く分泌させるためである。
【００５６】
その後、濃縮物を開放系で１〜５日間、望ましくは３日間放置し、最終培養物を得る。開放系で培養することで、落下菌がＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の分泌物であるアルギン酸を資化する。共生菌としてはShewanellaやRhizobiumなどが確認されている。培地中に上記のようなビタミンＢ群を積極的に生産する細菌群が豊富に含まれるため、培養物中のビタミンの蓄積含量も増加する。
【００５７】
（２）バイノスパウダーの調整
上述のように培養して得た最終培養物を、真空乾燥、スプレードライヤー、凍結乾燥法などで乾燥してバイノスパウダーが得られる。得られたバイノスパウダーは、汚泥の活性化剤として汚泥に添加する。バイノスパウダーは、乾燥工程により細胞が傷つき、或いは破砕され、菌体内蓄積物が溶出し易くなっており、ビタミンＢ源、そしてアルギン酸源として有効である。
【００５８】
（３）活性汚泥への添加方法
室内実験室にて、容量２Ｌの模擬曝気槽に曝気槽流入水（活性汚泥）を１Ｌ量り取り、曝気槽内ＤＯ１〜３ｍｇ／Ｌ程度になるようにエアレーションを７日間行った。２４時間毎に上記（２）で調整したバイノスパウダーを全活性汚泥量に対して０．０２％（ｗ／ｗ）添加した。
【００５９】
活性汚泥は、fill
and draw法によって回分式に適宜供給した。ＴＯＣ、ＭＬＳＳ、強熱減量、酸素利用速度（１９９７年版「下水試験方法」上巻１０節［酸素利用速度］）、汚泥脱水性の測定を行った。
【００６０】
（４）ＤＧＧＥ解析
ＤＧＧＥ解析は以下のように行った。前記（３）で調整した４日目の活性汚泥１ｍＬを１．５ｍＬの遠心チューブにとり、１分間１３５０ｒｐｍで遠心し、汚泥を凝集させる。この汚泥からのＤＮＡの抽出にはＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコル通りにＤＮＡを抽出させた。その後、ＤＮＡ溶液を０．１μｇ／μＬに調整し、これをＤＧＧＥ解析のＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応では１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅させた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列を以下に記す。
【００６１】
フォワード（Ｆ）：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacggggaggcagcag
リバース（Ｒ） ：attaccgcggctggtgg
【００６２】
ＰＣＲはTakara
ExTaq PCR kitを用い、プロトコル通りにパーキンエルマー社製サーマルサイクラー９７００を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクルは９４℃５分→３０サイクル（９４℃０．５分→５５℃０．５分→７２℃０．５分）→７２℃５分→１０℃にて行った。
【００６３】
ＰＣＲ反応産物は、１％アガロースゲル電気泳動にて目的遺伝子が増幅されていることを確認した後、バイオラッド社製のＤｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍを用いてＤＧＧＥ解析を行った。変性ゲルは添付のプロトコル通りに作成し、変性剤の濃度勾配を３５−６０％とした。電気泳動は６０Ｖにて最低１０時間ほど行った後、サイバーゴールド（フナコシ社製）を用いてゲルを染色した。染色したゲルはＧＢＯＸ（フナコシ社製）を用いて写真撮影を行った。
【００６４】
図９に、活性汚泥に（１）で調整したバイノスパウダーを添加したときのＤＧＧＥ解析結果を示す。レーンＭはサイズマーカー（（株）ニッポンジーン社、ＤＧＧＥマーカーＩ）、レーン１はコントロールで、活性汚泥にバイノスパウダーの添加なしで処理した処理物（４）である。レーン２がコントロールと同一の活性汚泥にバイノスパウダーを添加した後処理（４）した処理物である。
【００６５】
図９の白線で囲まれたエリア（Ａ）は、バイノスパウダーの添加により特異的に出願する微生物のバンドである。エリア（Ｂ）は、バイノスパウダーの添加により菌数が増加した微生物のバンドである。エリア（Ｃ）は、バイノスパウダーの添加により菌数が減少した微生物のバンドである。
【００６６】
図９の結果から、バイノスパウダーを汚泥に添加することで、分子生物学的な側面からも汚泥中の微生物相の変化が確認できた。
【００６７】
図１０は、ＤＧＧＥ解析時（７日目）の活性汚泥の顕微鏡写真である。図１０（Ａ）はバイノスパウダー無添加のコントロールで、図１０（Ｂ）、（Ｃ）がバイノスパウダー添加区の写真である。図１０（Ｃ）に示されたように、バイノスパウダーを汚泥に添加することで、糸状細菌を捕食する原生動物（ヒルガタワムシなど）の増殖が確認できた。当該試験においては、実験施設の汚泥を約２４％削減（ＭＳＳＬ値）できた。
【実施例４】
【００６８】
図１１は、アルギン酸オリゴマーの微生物増殖に対する影響を調べた結果である。微生物とした糸状性の藍藻Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ（以下、オシラトリアという。）を使用した。オシラトリアは、富栄養化が進んだ湖沼等において大量に発生するアオコを構成する代表的な種である。
【００６９】
試験方法は、試験槽（容量３０Ｌ）にサンプル水２０Ｌを量り取り、バイノス分泌物の投入試験区、未投入区（コントロール）を設けた。試験槽は攪拌機にて６００ｒｐｍで攪拌を行い、毎日の生物数を測定した。
【００７０】
実験に使用したサンプル水は、茨城県企業局県南水道事務所 霞ヶ浦浄水場施設内の着水井からサンプリングした。個体数の測定方法は、トーマ血球計にサンプル水５μＬを量り取り、光学顕微鏡を用いて倍率２００倍で全視野１０反復の平均値からオシラトリア、Phormidiumの数を定量した。
【００７１】
■はコントロールで、○はコントロールと同組成の培地に、バイノスから分泌されているアルギン酸オリゴマーを毎日３ｍｇ／Ｌ培地に添加した。バイノスが分泌するアルギン酸にはオリゴマーが含まれている。
【００７２】
実験の結果、コントロール■においては、０〜４日まで固体数が減少し、５日目に増殖が観られるもののその後急速に菌数が減少している。一方、アルギン酸オリゴマーを添加した培地○においては、０〜５日目まで増殖は見られないもののその増殖に転じている。
【００７３】
このことから、アルギン酸オリゴマーには微生物増殖を促進する作用があることが明らかになった。
【００７４】
従って、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株等のバイノスが細胞外に分泌するアルギン酸、特にアルギンオリゴマーが、共生微生物の増殖を促進させ、それら共生微生物においてもビタミンＢ群の生合成が行われ、バイノス純粋培養で蓄積されるビタミンＢ群より、開放系で培養したバイノスパウダーにおいてより多量のビタミンＢ群が蓄積されるものと思われる。
【００７５】
バイノスの開放系での拡大培養物は、活性汚泥中の分解作用に有効な微生物の増殖を菌体分泌物であるアルギン酸、取り分けアルギン酸オリゴマーの効果、さらにビタミンＢ群の効果により、促進させ低コストで汚泥の活性剤としての効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明である汚泥削減方法は、下水処理場、食品、薬品、繊維業界などの各種産業から排出される汚泥を削減することを可能にし、汚泥処理費用、エネルギーを削減し、温暖化防止も期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥処理方法において、微生物活性を高め汚泥を削減する汚泥削減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、家庭排水、各種産業から排出された汚水等の被処理水の処理方法として、微生物（酵母、カビ、藍藻、放線菌など各種細菌、植物性プランクトン、動物性プランクトンなど活性汚泥処理に用いられる有用微細動植物を含むものとする。）による活性汚泥処理方法が用いられてきた。
【０００３】
図１２に示すように、ワムシに代表される原生動物などの有用な微生物相を形成することにより、活性汚泥は活性化され、汚泥の低減、悪臭の抑制、処理水の水質向上が可能とされている。
【０００４】
活性汚泥中の微生物を活性化させるため、微生物に資化される栄養素、取り分けビタミン類を活性汚泥に添加する手法が１９７０年代から研究され、多数の論文（非特許文献１〜１６）が発表されている。
【０００５】
非特許文献１〜１６に記載のビタミンの作用・効果等を図１３にまとめた。非特許文献１には、糸状性細菌の発生抑制としてビタミンＢ１、Ｂ１２が作用しており、代表的な糸状性細菌であるｔｙｐｅ０２１Ｎを捕食する有用原生動物トリティグモストマ ククルルスの成長因子にビタミンＢ１、Ｂ１２が必須であることが報告されている。
【０００６】
また、活性汚泥中でビタミンB群を必要とする微生物種については工業排水、生活排水などの各分野で調査されており（非特許文献３）、製紙業、石油化学業、廃棄物処理場で多くのビタミンB群を必要とする微生物の存在が報告されている（非特許文献２、９）。図１４は、非特許文献２を引用したもので、産業別活性汚泥中のビタミンB群を必要とする微生物種の存在比率である。
【０００７】
さらに、非特許文献７〜１３にはビタミンＢ群が活性汚泥に必要不可欠であると報告されている。また非特許文献１４〜１６にはビタミンＢ群を活性汚泥に添加した場合、活性汚泥の活性が高まるとことが報告されている。
【０００８】
しかし、ビタミンなどの栄養素を別途、活性汚泥に添加する手法はコストが嵩み実現性がなかった。
【０００９】
他方、特許文献１には、排水処理施設の処理機能に悪影響を及ぼすことなく、余剰汚泥の低減化を図ることを目的として、茶葉またはその浸出液あるいは、茶葉に含まれるアミノ酸等の微生物活性化成分及びタンニン等の汚泥可溶化成分からなる組成物を、バイオマスに接触させることを特徴とする排水処理施設の汚泥低減化方法が開示されている。
【００１０】
また、特許文献２には、海水および淡水底面の汚泥を、環境に負荷をかけることなく、簡便かつ高効率に、工業的規模で処理するための浄化処理装置が開示されている。特に請求項１には、海水または淡水底面の汚泥を浄化処理するための装置であって、少なくとも、海底汚泥を含有する汚泥を充填し、ビタミン類を添加して分解反応を行うための第１反応槽が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−１５５６８号公報
【特許文献２】特開２００３−４７９９６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Y.Inamori,Y.Kuniyasu, R.Sudo, and M.Koga Control of the growth of filamentousmicroorganisms using predacous ciliated protozoa. Water Science Technology.1991;23 963-971
【非特許文献２】J.E.Burgess,J.Quarmby, and T.Stephenson Role of micronutrients in activated sludge-basedbiotreatment of industrial effluents. Biotechnology Advances 17(1999)49-47
【非特許文献３】LindG, Schade M, Metzner G, Lemmer H Use of vitamins in biological waste watertreatment. GWF-Wasser/Abwasser 1994;135:595-600.
【非特許文献４】SingletonJ. Microbial metabolism of xenobiotics:Fundamental and applied research. J ChemTechnol Biotechnol 1994;59:9-23.
【非特許文献５】WoodDK, Tchobanoglous G. Trace elements in biological waste treatment. J Wat PollutControl Fed 1975;47:1933-45.
【非特許文献６】GostickN. A study of the effect of substrate composition on the settlement ofactivated sludge PhD Thesis, Cranfield University, U.K. 1991.
【非特許文献７】BeardsleyML, Coffey JM Bioaugmentation: optimizing biological wastewater treatment.Pollution Engineering 1985;December:30-3.
【非特許文献８】JEBurgess, J Quarmby and T Stephenson Vitamin addition: an option for sustainableactivated sludge process effluent quality. Journal of Industrial Microbiology& Biotechnology (2000) 24, 267-274
【非特許文献９】HildeLemmer, George Lind, Gerhard Metzner, Lutz Nitschke and Margit Schade Vitaminaddition in biological wastewater treatment Water Science and Technology Volume37, Issues 4-5, 1998, Pages 395-398
【非特許文献１０】KidderGW, Dewey VC. Studies on the biochemistry of Tetrahymena XIII. B vitamin requirements. Arch Biochem 1949;21:66-73.
【非特許文献１１】SchormullerJ. Vitamins as growth material for bacteria. A comprehensive review. Z LebensmUntersuchung undForschung 1948;88:408-36.
【非特許文献１２】VoigtMN, Eitenmiller RR, Ware GO. Vitamin analysis by microbial and protozoanorganisms: response to vitaminconcentration, incubation time and assay vessel size. J Food Sci1979;43:1418-23.
【非特許文献１３】YamadaK, Kawasaki T. Properties of the thiamine transport system in Escherichia coli.J Bact 1980;141:254-61.
【非特許文献１４】LemmerH, Nitschke L. Vitamin content of four sludge fractions in the activated sludgewaste water treatment process. Water Res 1994;28:737-9
【非特許文献１５】LemmerH. Biological additives for waste water treatment-Theory and practice.Munchener Beitrage zur Abwasser-, Fischerei- und Flusbiologie 1992;46:254-82.
【非特許文献１６】SarfertF, Eikelboom DH, Klein B, Kowalsky H, Lemmer H, Matsche N, Popp W, Reinnarth G,Wagner F. Biological additives in waste watertreatment-bacteria-enzymes-vitamins-algal preparations. Korrespondez Abwasser1990;7:793-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明は、活性汚泥処理方法において、活性汚泥中の微生物活性を高める低コストな汚泥減容剤を提供し、さらに汚泥を削減する汚泥削減方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記の課題を解決するために、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法の構成とし、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、細胞外にアルギン酸を分泌することを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とし、前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とし、前記培養が、純粋培養した後、濃縮し、濃縮液をｐＨ１０に調整し、１日〜５日間開放状態で放置することを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。
【００１５】
また、前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。なお、汚泥１トンに対して２０ｇより少ない場合には効果が希薄である。一方、２００ｇより多い場合であっても汚泥の削減効果は発揮するが頭打ちになり、費用が嵩み好ましくない。
【００１６】
また、前記アルギン酸がアルギン酸オリゴマーであることを特徴とする前記何れかに記載の汚泥削減方法の構成とした。また前記アルギン酸オリゴマーが、β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の合計が３〜１０残基であることを特徴とする前記汚泥削減方法の構成とした。
【００１７】
さらに、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤の構成とした。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、上記構成であるので以下の効果を発揮する。光合成により増殖したバイノスを乾燥し粉末化した物を用いることにより、汚泥中の微生物相を最適化し、低コストで活性汚泥を活性化するビタミン源を提供するとともに、それにより活性汚泥の削減が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】バイノス（Ａ）とクロレラ（Ｂ）の透過型電子顕微鏡像（１０，０００倍）である。
【図２】バイノスと各種試料のビタミンＢ群の含有量の比較表である。
【図３】バイノス培養液の微分干渉顕微鏡像（４００倍）である。
【図４】バイノス培養物の細胞溶解物及びアルギン酸ナトリウム（標準品）のＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定結果（スペクトル）である。
【図５】汚泥活性化確認実験の結果である。
【図６】汚泥活性化後の瀑気槽液の顕微鏡像（１００倍）である。
【図７】バイノスパウダー添加による汚泥削減化実験の結果である。
【図８】汚泥削減化実験後の残存した汚泥の成分分析結果である。
【図９】曝気槽のＤＧＧＥ解析結果である。
【図１０】ＤＧＧＥ解析時の活性汚泥の顕微鏡写真である。
【図１１】アルギン酸オリゴマーの微生物増殖に対する影響を調べた結果である。
【図１２】汚泥削減メカニズムの説明図である。
【図１３】ビタミンＢ群の微生物に対する作用をまとめた表である。
【図１４】活性汚泥中でビタミンＢ群を必要とする微生物の割合である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、バイノス（Ａ）とクロレラ（Ｂ）の透過型電子顕微鏡像（１０，０００倍）である。バイノスとは、光合成緑藻類のパラクロレラ属微細藻類パラクロレラ・エスピー・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓ、以下「バイノス」という。）のことである。
【００２１】
その内の１種については、発明者等が、既に岐阜県内の工場排水処理場から新たに単離し、（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、２００８年２月２８日付けで寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９が付与されている。今現在入手可能である。
【００２２】
光合成緑藻類には、図１（Ｂ）に示したサプリメントとして利用されるクロレラ、重油を生産するボトリオコッカス、アスタキサンチンを生産することで知られるヘマトコッカスなどが含まれる。
【００２３】
発明者等が単離したＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株は、分裂時間約７．８時間と早く、光合成能力が非常に高い。また、クロロフィル量が一般的なクロレラと比べ、乾燥重量１００ｇあたりの２倍以上含まれている。
【００２４】
特に、クロロフィルｂがクロレラに比べ極めて多く（約８倍）で、深部水環境でも青色を効率的に利用し、光合成が可能である。また、代謝物として、多種多量のビタミンＢ群を代謝する（図２）。また、一般的なクロレラは細胞最外層に厚い細胞壁を有しているが、バイノスは細胞壁が非常に薄いことが特徴である。
【００２５】
図２は、バイノスと各種試料のビタミンＢ群の含有量の比較表である。表ＡがビタミンＢ１、ＢがビタミンＢ２、ＣがビタミンＢ６、ＤがビタミンＢ１２である。バイノスについては、開放系での培養物を凍結乾燥したものである。
【００２６】
図２に示すように、バイノスの乾燥物（以下、バイノスパウダーという。）のビタミンＢ群の含有量は次の通りである。なお、図２のデーターはＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株のものである。
【００２７】
ビタミンＢ１は５８５．００ｍｇ／乾燥１００ｇ（小麦胚芽の約３２１倍）、ビタミンＢ２は３０．０ｍｇ／乾燥１００ｇ（豚・肝臓の約１７倍）、ビタミンＢ６は４７５．００ｍｇ／乾燥１００ｇ（ニンニクの約３１７倍）、ビタミンＢ１２は１０，０００μｇ／乾燥１００ｇ（アマノリの約１３０倍）である。バイノスは、他の試料に比べビタミンＢ群の含有量が非常に多く、ビタミン源として極めて有効であると言える。
【００２８】
図３は、バイノス培養液の微分干渉顕微鏡像（４００倍）である。試料は、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の純培養液を開放系で拡大培養したときの培養液を用いた。
【００２９】
バイノスの培養液は以下のようにして調整した。液体培地；ＫＮＯ３（２．５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（７．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７．５／Ｌ）、ＣａＣｌ２（２．５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（２０ｇ／Ｌ）の各水溶液を１０ｍＬずつ９４０ｍＬ蒸留水に添加し、１％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３を１滴及びＡｒｎｏｎｓ Ａ５溶液を２ｍＬ添加し、ｐＨを６．５に調整した後、１２１℃、１５分間のオートクレーブ処置した。
【００３０】
平板培地；固体培地は、前記液体培地のｐＨ調整前に、１．５％（ｗ／ｖ）寒天を加えて前記同様に調整した。また、種々の容量の液体培地は上記比率で適宜作ることができる。なお、単一コロニーの判定にはＬＢ培地を使用し、植菌してコンタミネーションの有無で判断する。
【００３１】
培養条件；バイノスの培養は、前記培養液にバイノスの純粋培養液、又は開放系での培養液を種菌として添加し、室温〜３０℃、明条件（最低７００Ｌｕｘ、好ましくは約２，０００〜２０，０００Ｌｕｘ程度、最も好ましくは約３，０００〜８，０００Ｌｕｘ）、好気的条件（振とう培養など）下で行った。
【００３２】
なお、バイノスは、淡水又はＬＢ培地等の一般的な培地中で、好気的条件下にて生育可能である。
【００３３】
図３の丸で囲まれた中の球状物がバイノスである。点線で囲まれ部分はバイノスの分泌物で、アルギン酸である（図４）。抽出物内には、無数の微生物群（共生微生物群）が確認できる。
【００３４】
図４は、バイノス培養物の細胞溶解物及びアルギン酸ナトリウム（標準品）のＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定結果（スペクトル）である。
【００３５】
上述の液体培地で純粋培養したバイノス（２ｇ／Ｌ）に、Ｎａ２ＣＯ３を終濃度で２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、細胞を溶解させた。この溶解物を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み回収し、０．４μｍフィルターにて濾過した。前記フィルター上の残渣を、１Ｎ ＨＣｌ及び１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、ＦＴ−ＩＲ測定に供した。
【００３６】
バイノス抽出物のスペクトルをアルギン酸ナトリウム（標準品）のスペクトルと比較したところ、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株が細胞外に分泌する分泌物はアルギン酸であることが明らかになった。
【００３７】
アルギン酸は、褐藻などに含まれる分子量２０万〜３０万の多糖類で、食物繊維の一種である。ほかに紅藻のサンゴモ、一部の細菌（アゾトバクターなど）が部分的に酢酸エステル化されたアルギン酸を生成するとされるが、これらによる工業的生産は未だ成功していないとされる。
【００３８】
純粋のアルギン酸は白ないし淡黄色で、繊維状、顆粒状または粉末状の形態をとる。水に不溶性であるが、アルギン酸ナトリウムなどの可溶性塩として抽出され、食品添加物その他の目的で利用される。
【００３９】
β−Ｄ−マンヌロン酸
(M) とそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸
(G) の２種のいずれもカルボキシル基をもつ単糖ブロックが、（１−４）−結合した直線状のポリマーである。Ｍ、Ｇブロックの量比は起源により異なる。
【００４０】
MとGが交互につながったブロックが最も柔軟性があり、中性に近いｐＨで溶けやすい。Gからなるブロックは固く、６残基以上からなるGブロックは２価カチオン（Ｃａ２＋など）と安定な複合体の３次元ゲルを形成する。
【００４１】
発明者等は、単離したバイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株において、緑藻類として初めてアルギン酸を生合成することを発見し、既に特許出願をしている。
【００４２】
以下、添付の図面を参照し、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【実施例１】
【００４３】
図５は、汚泥の活性化確認実験の結果である。曝気槽の活性汚泥を５００ｍＬ量り取り、１０ｍｇの乾燥バイノスパウダーを添加し、ＤＯ値（ｍｇ／Ｌ）が飽和状態になるまで８００ｒｐｍで攪拌した後、攪拌速度を２００ｒｐｍにし、ＤＯ値の推移を３０分毎に測定した。なお、ＤＯ値とは、溶存酸素濃度のことである。
【００４４】
その結果、図５に示した通り、バイノスパウダーを添加（●）することで実験開始３０分後にＤＯ値がバイノスパウダー無添加のコントロール（■）に比べ急激に低下していることから、微生物の呼吸量が倍増していることが分かる。従って、バイノスパウダーの添加によって活性汚泥中の微生物群が活性化されたことが明らかになった。
【００４５】
図６は、汚泥活性化後の曝気槽液の顕微鏡像（１００倍）である。活性汚泥にビタミンB群を添加することにより、汚泥中の微生物群が最適化されることはよく知られている（非特許文献７〜１３）。そこで、図５で使用したバイノスパウダーを添加した実験サンプルを、７日間放置し、微生物群の変化を観察した。
【００４６】
その結果、図６に示す通り、バイノスパウダー添加前（Ａ）では原生動物（ワムシ、ゾウリムシ）はわずかしか確認できなかったが、バイノスパウダー添加後（Ｃ）では原生動物（ワムシ、ゾウリムシ）の個体数と種類が増加していた。その処理水においてはバイノスパウダー無添加に比べ透明感が向上していた。微生物群の最適化により処理水の水質が向上されることは、非特許文献３〜５でも報告されている。
【実施例２】
【００４７】
次に、バイノスパウダーの添加によって汚泥が削減されるか調べた。汚泥濃縮槽の汚泥１Ｌに対してバイノスパウダー０．３ｍｇ添加（汚泥１ｇに対してバイノスパウダー０．０２ｍｇ添加に相当）し、マグネティックスターラーにて攪拌（４００ｒｐｍ）し、日毎にＭＬＳＳを測定した。ＭＬＳＳの測定は、１９９７年版「下水試験方法」上巻第６節［活性汚泥浮遊物質］の測定方法に準じて行った。なお、ＭＬＳＳ（Mixed
liquor Suspended Solid）とは、一般に曝気槽内の活性汚泥浮遊物質で、重量法（ｍｇ／Ｌ）で表示される。その結果を図７、図８に示す。
【００４８】
図７は、バイノスパウダー添加による汚泥削減化実験の結果である。図７のＭＳＳＬの測定結果より、汚泥発生量の約４０％削減（６日目）が確認できた。
【００４９】
図８は、汚泥削減化実験後の残存した汚泥の成分分析結果である。図７の６日目のサンプルを強熱減量試験に供した。強熱減量試験は、ＪＩＳ Ｋ０１０２ １４．５［強熱減量］に準じておこなった。
【００５０】
図８の強熱減量試験の結果、無添加の有機物が約１１，０００ｍｇ／Ｌであるところ、バイノスパウダーを添加することで有機物が約５，０００であり、バイノスパウダーの添加によって有機物の約５５％が分解されたことが確認できた。
【実施例３】
【００５１】
活性汚泥にバイノスパウダーを添加し活性汚泥の微生物相変化をＤＧＧＥ(Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法)で調べた。
【００５２】
（１）バイノス培養方法（大量培養）
上述の平板培地にて、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の単一コロニー釣菌し、同平板培地に上述の条件で拡線培養する。増殖した少量のＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株を試験管中の上述の液体培地１〜１０ｍＬに植え継ぎ増殖させ、さらに５０〜１０００倍の同液体培地（フラスコ）に植え継ぎ振とう培養し、第１次培養液を調整する。試験管培養からフラスコ培養まで約７日間要する。
【００５３】
次に、第１次培養液（例えば２００Ｌ）を約１０倍（２，０００Ｌ）の上述の液体培地の浴槽に植え継ぎ７日間静地（又は対流或いはエアレーション）下で培養して第２次培養液を調整する。
【００５４】
さらに、第２次培養液（２，０００Ｌ）を約１０倍（２０，０００Ｌ）の上述の培養液槽に植え継ぎ７日間静地（又は対流或いはエアレーション）下で培養して大量培養液を調整する。
【００５５】
そして、大量培養液からＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株を凝集沈殿にて濃縮物を得る。凝集沈殿には、カチオン系の高分子凝集剤を用いた。続いて、濃縮物にＮａＯＨ溶液などを添加して、濃縮物をｐＨ１０に調整する。ｐＨ１０に調節するのは、細胞外分泌多糖類であるアルギン酸をより多く分泌させるためである。
【００５６】
その後、濃縮物を開放系で１〜５日間、望ましくは３日間放置し、最終培養物を得る。開放系で培養することで、落下菌がＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株の分泌物であるアルギン酸を資化する。共生菌としてはShewanellaやRhizobiumなどが確認されている。培地中に上記のようなビタミンＢ群を積極的に生産する細菌群が豊富に含まれるため、培養物中のビタミンの蓄積含量も増加する。
【００５７】
（２）バイノスパウダーの調整
上述のように培養して得た最終培養物を、真空乾燥、スプレードライヤー、凍結乾燥法などで乾燥してバイノスパウダーが得られる。得られたバイノスパウダーは、汚泥の活性化剤として汚泥に添加する。バイノスパウダーは、乾燥工程により細胞が傷つき、或いは破砕され、菌体内蓄積物が溶出し易くなっており、ビタミンＢ源、そしてアルギン酸源として有効である。
【００５８】
（３）活性汚泥への添加方法
室内実験室にて、容量２Ｌの模擬曝気槽に曝気槽流入水（活性汚泥）を１Ｌ量り取り、曝気槽内ＤＯ１〜３ｍｇ／Ｌ程度になるようにエアレーションを７日間行った。２４時間毎に上記（２）で調整したバイノスパウダーを全活性汚泥量に対して０．０２％（ｗ／ｗ）添加した。
【００５９】
活性汚泥は、fill
and draw法によって回分式に適宜供給した。ＴＯＣ、ＭＬＳＳ、強熱減量、酸素利用速度（１９９７年版「下水試験方法」上巻１０節［酸素利用速度］）、汚泥脱水性の測定を行った。
【００６０】
（４）ＤＧＧＥ解析
ＤＧＧＥ解析は以下のように行った。前記（３）で調整した４日目の活性汚泥１ｍＬを１．５ｍＬの遠心チューブにとり、１分間１３５０ｒｐｍで遠心し、汚泥を凝集させる。この汚泥からのＤＮＡの抽出にはＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコル通りにＤＮＡを抽出させた。その後、ＤＮＡ溶液を０．１μｇ／μＬに調整し、これをＤＧＧＥ解析のＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応では１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅させた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列を以下に記す。
【００６１】
フォワード（Ｆ）：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacggggaggcagcag
リバース（Ｒ） ：attaccgcggctggtgg
【００６２】
ＰＣＲはTakara
ExTaq PCR kitを用い、プロトコル通りにパーキンエルマー社製サーマルサイクラー９７００を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクルは９４℃５分→３０サイクル（９４℃０．５分→５５℃０．５分→７２℃０．５分）→７２℃５分→１０℃にて行った。
【００６３】
ＰＣＲ反応産物は、１％アガロースゲル電気泳動にて目的遺伝子が増幅されていることを確認した後、バイオラッド社製のＤｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍを用いてＤＧＧＥ解析を行った。変性ゲルは添付のプロトコル通りに作成し、変性剤の濃度勾配を３５−６０％とした。電気泳動は６０Ｖにて最低１０時間ほど行った後、サイバーゴールド（フナコシ社製）を用いてゲルを染色した。染色したゲルはＧＢＯＸ（フナコシ社製）を用いて写真撮影を行った。
【００６４】
図９に、活性汚泥に（１）で調整したバイノスパウダーを添加したときのＤＧＧＥ解析結果を示す。レーンＭはサイズマーカー（（株）ニッポンジーン社、ＤＧＧＥマーカーＩ）、レーン１はコントロールで、活性汚泥にバイノスパウダーの添加なしで処理した処理物（４）である。レーン２がコントロールと同一の活性汚泥にバイノスパウダーを添加した後処理（４）した処理物である。
【００６５】
図９の白線で囲まれたエリア（Ａ）は、バイノスパウダーの添加により特異的に出願する微生物のバンドである。エリア（Ｂ）は、バイノスパウダーの添加により菌数が増加した微生物のバンドである。エリア（Ｃ）は、バイノスパウダーの添加により菌数が減少した微生物のバンドである。
【００６６】
図９の結果から、バイノスパウダーを汚泥に添加することで、分子生物学的な側面からも汚泥中の微生物相の変化が確認できた。
【００６７】
図１０は、ＤＧＧＥ解析時（７日目）の活性汚泥の顕微鏡写真である。図１０（Ａ）はバイノスパウダー無添加のコントロールで、図１０（Ｂ）、（Ｃ）がバイノスパウダー添加区の写真である。図１０（Ｃ）に示されたように、バイノスパウダーを汚泥に添加することで、糸状細菌を捕食する原生動物（ヒルガタワムシなど）の増殖が確認できた。当該試験においては、実験施設の汚泥を約２４％削減（ＭＳＳＬ値）できた。
【実施例４】
【００６８】
図１１は、アルギン酸オリゴマーの微生物増殖に対する影響を調べた結果である。微生物とした糸状性の藍藻Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ（以下、オシラトリアという。）を使用した。オシラトリアは、富栄養化が進んだ湖沼等において大量に発生するアオコを構成する代表的な種である。
【００６９】
試験方法は、試験槽（容量３０Ｌ）にサンプル水２０Ｌを量り取り、バイノス分泌物の投入試験区、未投入区（コントロール）を設けた。試験槽は攪拌機にて６００ｒｐｍで攪拌を行い、毎日の生物数を測定した。
【００７０】
実験に使用したサンプル水は、茨城県企業局県南水道事務所 霞ヶ浦浄水場施設内の着水井からサンプリングした。個体数の測定方法は、トーマ血球計にサンプル水５μＬを量り取り、光学顕微鏡を用いて倍率２００倍で全視野１０反復の平均値からオシラトリア、Phormidiumの数を定量した。
【００７１】
■はコントロールで、○はコントロールと同組成の培地に、バイノスから分泌されているアルギン酸オリゴマーを毎日３ｍｇ／Ｌ培地に添加した。バイノスが分泌するアルギン酸にはオリゴマーが含まれている。
【００７２】
実験の結果、コントロール■においては、０〜４日まで固体数が減少し、５日目に増殖が観られるもののその後急速に菌数が減少している。一方、アルギン酸オリゴマーを添加した培地○においては、０〜５日目まで増殖は見られないもののその増殖に転じている。
【００７３】
このことから、アルギン酸オリゴマーには微生物増殖を促進する作用があることが明らかになった。
【００７４】
従って、バイノスＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９株等のバイノスが細胞外に分泌するアルギン酸、特にアルギンオリゴマーが、共生微生物の増殖を促進させ、それら共生微生物においてもビタミンＢ群の生合成が行われ、バイノス純粋培養で蓄積されるビタミンＢ群より、開放系で培養したバイノスパウダーにおいてより多量のビタミンＢ群が蓄積されるものと思われる。
【００７５】
バイノスの開放系での拡大培養物は、活性汚泥中の分解作用に有効な微生物の増殖を菌体分泌物であるアルギン酸、取り分けアルギン酸オリゴマーの効果、さらにビタミンＢ群の効果により、促進させ低コストで汚泥の活性剤としての効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明である汚泥削減方法は、下水処理場、食品、薬品、繊維業界などの各種産業から排出される汚泥を削減することを可能にし、汚泥処理費用、エネルギーを削減し、温暖化防止も期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法。
【請求項２】
前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、細胞外にアルギン酸を分泌することを特徴とする請求項１に記載の汚泥削減方法。
【請求項３】
前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする請求項２に記載の汚泥削減方法。
【請求項４】
前記培養が、純粋培養した後、濃縮し、濃縮液をｐＨ１０に調整し、１日〜５日間開放状態で放置することを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項５】
前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項６】
前記アルギン酸が、アルギン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項２〜５の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項７】
前記アルギン酸オリゴマーが、β−Ｄ−マンヌロン酸(M)とα−Ｌ−グルロン酸(G)の合計が、３〜１０残基であることを特徴とする請求項６に記載の汚泥削減方法。
【請求項８】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤。
【請求項１】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、培養し、回収し、乾燥させたバイノスパウダーを汚泥に添加することを特徴とする汚泥削減方法。
【請求項２】
前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、細胞外にアルギン酸を分泌することを特徴とする請求項１に記載の汚泥削減方法。
【請求項３】
前記Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓが、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９６９であることを特徴とする請求項２に記載の汚泥削減方法。
【請求項４】
前記培養が、純粋培養した後、濃縮し、濃縮液をｐＨ１０に調整し、１日〜５日間開放状態で放置することを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項５】
前記バイノスパウダーの添加量が、汚泥１トン対して２０〜２００ｇであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項６】
前記アルギン酸が、アルギン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項２〜５の何れか１項に記載の汚泥削減方法。
【請求項７】
前記アルギン酸オリゴマーが、β−Ｄ−マンヌロン酸(M)とα−Ｌ−グルロン酸(G)の合計が、３〜１０残基であることを特徴とする請求項６に記載の汚泥削減方法。
【請求項８】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｂｉｎｏｓを、開放系で培養し、回収し、乾燥させたことを特徴とする余剰汚泥減容剤。
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１】
【図３】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１】
【図３】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１１１４０（Ｐ２０１１−１１１４０Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５７２１２（Ｐ２００９−１５７２１２）
【出願日】平成２１年７月１日（２００９．７．１）
【特許番号】特許第４５７３１８７号（Ｐ４５７３１８７）
【特許公報発行日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０６０６６０９８）株式会社日本バイオマス研究所 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１日（２００９．７．１）
【特許番号】特許第４５７３１８７号（Ｐ４５７３１８７）
【特許公報発行日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０６０６６０９８）株式会社日本バイオマス研究所 (8)
【Ｆターム（参考）】
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