液体カルコゲナイド組成物ならびにそれを製造および使用する方法
本発明は、カルコゲナイドまたはその塩を含む新規かつ安定な液体組成物を提供する。これらの組成物については、虚血または低酸素傷害の処置および防止ばかりでなく、生物物質の保存など、種々の目的で使用することができる。一実施形態では、本発明は、薬学的に許容されるキャリア内に安定な液体医薬カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む組成物であって、該カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物または塩の濃度、ｐＨおよび酸化生成物が前記液体医薬組成物の保存後も許容基準の範囲内にとどまる、組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００７年３月２３日に出願された米国仮出願第６０／８９７，７２７号および２００６年１０月５日に出願された米国仮出願第６０／８９４，９００号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、全般的には液体カルコゲナイド組成物に関し、より詳細にはカルコゲナイドを含む安定な液体医薬組成物に関する。本発明はさらに、傷害、疾患および早期の死亡から細胞および動物を保護するそうした組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の説明
カルコゲン元素、すなわち、周期表第６族（ただし、オキシドを除く）の元素を含む化合物は一般に、「カルコゲナイド」または「カルコゲナイド化合物」と呼ばれる。カルコゲン元素には、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）およびポロニウム（Ｐｏ）がある。普通のカルコゲナイドは、Ｓ、ＳｅおよびＴｅの１種または複数種に加えて他の元素を含む。
【０００４】
最近、カルコゲナイドで処置すると、生物物質のステイシスが誘導され、生物物質が低酸素および虚血傷害から保護されることが明らかにされている。こうした研究では、酸素消費の強力な阻害剤である硫化水素（Ｈ２Ｓ）ガスにより代謝が抑えられ、低酸素傷害からマウスおよびラットが保護され得ることが証明された（特許文献１）。硫化水素ガスは一般に医療ガスと考えられておらず、こうした結果は予想外であるが、多くの動物およびヒト疾患、特に低酸素および虚血に関係する疾患および傷害を処置または防止できる大きな可能性を示している。
【０００５】
ある種のカルコゲナイド化合物（硫化水素およびセレン化水素など）は、酸素と化学反応する能力があるため酸素の存在下で安定ではなく、酸化されて化学変化を起こす。たとえば、スルフィドは、化学変化を起こすと安定性が低下し、有効期間が短くなり、さらに製造、保存または使用の過程で酸化生成物が混入する恐れがあることから、医薬品としての使用が制限される。スルフィドの酸化剤としては、酸素、二酸化炭素および酸化生成物（スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素など）の混合物を生成し得る固有の金属不純物が考えられる。このように、スルフィドは保存中に急速に酸化されるため、医薬剤としての使用が制限される。
【０００６】
カルコゲナイドによる処置が必要な細胞または患者に薬理効果を与えるため、安定していて、簡便かつ再現性よく製造でき、標準的な投与経路を対象とする最終剤形が求められている。当該技術分野においてスルフィドを含む医薬組成物など、カルコゲナイドの安定な液体医薬組成物が望まれているのは明らかである。スルフィドは、Ｈ２Ｓあるいはその塩（たとえば、ＮａＨＳ、Ｎａ２Ｓなど）のように−２価の原子価状態にある硫黄と定義され、たとえば、緊急時の当該分野における処置剤として疾患の処置のための管理された医療環境において、あるいは重篤な傷害または生命を脅かす医学的事象に伴う救命救急医療において手軽に患者に投与できる。本発明は、新規かつ安定なカルコゲナイドの液体医薬組成物を提供することでこうしたニーズに応える。本明細書では、この組成物が低酸素および／または虚血状態のほか、他の傷害および疾患状態に起因する傷害および死から動物を保護することが証明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０５／０４１６５５号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、カルコゲナイドの液体組成物と同組成物の調製方法および使用方法とを提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容されるキャリア内に安定な液体医薬カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む組成物であって、該カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物または塩の濃度、ｐＨおよび酸化生成物が前記液体医薬組成物の保存後も許容基準の範囲内にとどまる、組成物を提供する。
【００１０】
種々の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される。
【００１１】
他の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、濃度が９５ｍＭ〜１５０ｍＭである。
【００１３】
該カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩がスルフィドである特定の実施形態では、該スルフィドは、ｗ／ｖで、約８０％〜約１００％、約９０％〜１００％または約９５％〜１００％の範囲の量で存在する。
【００１４】
特定の実施形態では、この液体は水酸化ナトリウムである。
【００１５】
ある実施形態では、この組成物のｐＨは６．５〜８．５の範囲にある。
【００１６】
一実施形態では、この組成物の酸素含有量は５μＭ以下である。
【００１７】
一実施形態では、この組成物は、ポリスルフィド、スルフィット、スルファートおよびチオスルファートから選択される１種または複数種の酸化生成物をさらに含む。酸化生成物は、（０％〜１．０％）の範囲のスルファートまたは（０％〜１．０％）の範囲のスルフィットまたは（０％〜１％）の範囲のポリスルフィドまたは（０％〜１．０％）の範囲のチオスルファートであってもよい。
【００１８】
保存期間は、（２３°〜２７°）の範囲で約３ヶ月であってもよいし、（２３°〜２７°）の範囲で６ヶ月であってもよい。
【００１９】
一実施形態では、組成物の浸透圧モル濃度は、２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲にある。組成物は、等張でもほぼ等張でもよい。
【００２０】
ある実施形態では、組成物を不透過性の容器に保存する。
【００２１】
他の実施形態では、組成物はキレート剤をさらに含む。キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）でもデフェロキサミンでもよい。ＤＴＰＡは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲で存在してもよい。デフェロキサミンは、０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で存在してもよい。
【００２２】
一実施形態では、この組成物はｐＨ改変剤（ｐＨ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をさらに含む。ｐＨ改変剤については、二酸化炭素、水酸化ナトリウム、塩酸または硫化水素からなる群より選択してもよい。
【００２３】
別の実施形態では、この組成物は還元剤をさらに含む。還元剤については、ジチオスレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）またはグルタチオンからなる群より選択してもよい。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の量は、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲でもよい。グルタチオンの量は、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲でもよい。
【００２４】
さらなる実施形態では、この組成物はフリーラジカルスカベンジャーをさらに含む。フリーラジカルスカベンジャーは、（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）（Ｔｒｏｌｏｘ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）からなる群より選択してもよい。フリーラジカルスカベンジャーは、スピントラップ剤（ｓｐｉｎ−ｔｒａｐ ａｇｅｎｔ）であってもよい。フリーラジカルスカベンジャーは、Ｎ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）からなる群より選択してもよい。
【００２５】
別の実施形態では、この組成物は防腐剤をさらに含む。防腐剤は、ベンジルアルコール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンまたは塩化ベンザルコニウムからなる群より選択してもよい。防腐剤は、ベンジルアルコール（０％〜２．０％）（ｗ／ｖ）、フェノール（０％〜０．５％）（ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、エチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、プロピルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、ブチルパラベン（０％〜０．４％）（ｗ／ｖ）、塩化ベンザルコニウム、（０％〜０．０２％）（ｗ／ｖ）の範囲で存在してもよい。
【００２６】
一実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物は、ｐＨが６．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、３ヶ月間の保存後に０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２７】
関連する実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物は、ｐＨが６．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、５ヶ月間の保存後に０％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２８】
関連するさらなる実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物（ｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）のｐＨが７．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、５ヶ月間の保存後に１％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２９】
本発明はさらに、動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物を調製する方法であって、
（ａ）１当量の硫化水素ガスを１当量の液体に溶解し、それによりスルフィド組成物を製造すること；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物のｐＨを６．５〜８．５の範囲のｐＨに調整すること
を含み、それにより該組成物から動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物を生成する、方法も提供する。
【００３０】
ある実施形態では、ｐＨを、１つまたは複数または塩化水素、二酸化炭素、水酸化ナトリウムおよび硫化水素を加えて調整する。他の実施形態では、ｐＨを、窒素、二酸化炭素および／または硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整する。また、ｐＨを、窒素と二酸化炭素の組み合わせまたは窒素と硫化水素の組み合わせをステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整してもよい。さらに、硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解してｐＨを調整しても構わない。
【００３１】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物の浸透圧モル濃度を２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整することをさらに含んでもよい。
【００３２】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物を不活性雰囲気または希ガス下で遮光バイアルに分注することをさらに含んでもよい。
【００３３】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物に賦形剤を加えることをさらに含んでもよい。
【００３４】
この方法の特定の実施形態では、約６ヶ月間の酸素含有量は５μＭ以下である。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物を含む１つまたは複数の容器を含むキットを含み、該組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である。
【００３６】
一実施形態では、容器は、琥珀色バイアルのように遮光性がある。別の実施形態では、容器はガス不透過性である。
【００３７】
ある種のキットでは、組成物を不活性雰囲気または希ガス下で該容器に保存する。
【００３８】
特定の実施形態では、不活性ガスまたは希ガスは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）またはラドン（Ｒｎ）であってもよい。
【００３９】
関連するさらに別の実施形態では、本発明は、虚血または低酸素状態にさらされた生物学的物質のヒト疾患または傷害を処置する方法であって、生物学的物質を有効量のカルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００４０】
種々の実施形態では、その接触を、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ）、小胞体内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒａｌｌｙ）、経口、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）においてか、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄により行う。
【００４１】
特定の実施形態では、該カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される。
【００４２】
特定の実施形態では、該カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される。
【００４３】
一実施形態では、虚血または低酸素状態は、生物学的物質の傷害、生物学的物質に悪影響を及ぼす疾患の発症もしくは進行または生物学的物質の大量出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｎｇ）に起因する。
【００４４】
別の実施形態では、生物学的物質を、傷害の前、疾患の発症もしくは進行の前または生物学的物質の大量出血の前に組成物と接触させる。
【００４５】
異なる実施形態では、生物学的物質を、傷害の後、疾患の発症もしくは進行の後または生物学的物質の大量出血の後に組成物と接触させる。
【００４６】
一実施形態では、傷害は外部の物理的原因に起因する。
【００４７】
特定の実施形態では、傷害は手術である。
【００４８】
ある実施形態では、生物学的物質における傷害、疾患の発症もしくは進行または大量出血に起因する損傷または死から生物学的物質を保護する一定の量および期間で生物学的物質を組成物と接触させる。
【００４９】
関連する実施形態では、生物学的物質は、細胞、組織、器官、生命体および動物からなる群より選択される。具体的な実施形態では、生物学的物質は動物であり、さらに具体的な実施形態では、その動物は、哺乳動物またはヒトである。
【００５０】
一実施形態では、生物学的物質は、血小板を含む。
【００５１】
別の実施形態では、生物学的物質を移植する。
【００５２】
なお別の実施形態では、生物学的物質は、再灌流障害の危険がある。
【００５３】
特定の一実施形態では、生物学的物質は、出血性ショックの危険がある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】スルフィドの濃度が酸素分子の濃度よりも高いとき（［スルフィド］＞［Ｏ２］）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲で検出されるスルフィドの酸化種を示す図である。
【図２】ｐＨ７．０〜９．０の範囲のスルフィド水溶液中で検出される酸化生成物を示す図である。
【図３】Ｈ２Ｓの液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）の３種類の調製物におけるスルフィドのレベルを経時的に示すグラフである。
【図４】Ｈ２Ｓの組成物（液体医薬組成物ＩＶ）におけるスルフィドの安定性を、合成キレート剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を使用して製造した組成物と、使用せずに製造した組成物で１２９日間にわたり比較したグラフである。
【図５Ａ】無酸素環境においてＤＴＰＡの非存在下で調製した硫化水素（Ｈ２Ｓ）の液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）中の、１２９日間にわたり測定した酸化生成物（すなわち、スルフィット、ポリスルフィド、チオスルファート、スルファートおよび３７分に同定された未知の酸化生成物）のレベルを示すグラフである。
【図５Ｂ】無酸素環境においてＤＴＰＡの存在下で調製した硫化水素（Ｈ２Ｓ）の液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）中の、１２９日間にわたり測定した酸化生成物（すなわち、スルフィット、ポリスルフィド、チオスルファート、スルファートおよび３７分に同定された未知の酸化生成物）のレベルを示すグラフである。
【図６】１２９日間にわたって所定の間隔で測定したスルフィドの液体組成物、９７ｍＭのＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）のｐＨレベルを示すグラフである。
【図７Ａ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射後の尿中におけるチオスルファート排出量を示すグラフである。グラフは、表示した投与後の時点でラット尿中において測定されたチオスルファートの量を示す。
【図７Ｂ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射後の尿中におけるスルファート排出量を示すグラフである。グラフは、表示した投与後の時点でラット尿中において測定されたスルファートの量を示す。
【図８Ａ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射（１ｍｇ／ｋｇ）後にラットにおいて２４０分間にわたり測定したチオスルファートの血中レベルを示すグラフである。この研究では、血液を頸動脈から採取し、サンプルをＰＦＢＢｒで誘導体化し、ＧＣ−ＭＳにより解析した。
【図８Ｂ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射（１ｍｇ／ｋｇ）後にラットにおいて２４０分間にわたり測定したスルフィドの血中レベルを示すグラフである。この研究では、血液を頸動脈から採取し、サンプルをＰＦＢＢｒで誘導体化し、ＧＣ−ＭＳにより解析した。
【図９】Ｎａ２Ｓ（液体医薬組成物Ｉ）を注入し、低酸素状態（４％Ｏ２）にさらしたマウス（ＭＪＶＣ０７）の中核体温を経時的に示すグラフである。注入の開始時間および中止時間と低酸素状態への曝露開始時間および中止時間とを表示してある。
【図１０】低酸素（４％Ｏ２）にさらしたＣ５７ＢＬ／６マウスの、経時的に測定した生存率を、ビヒクルを注入したマウスとＮａ２Ｓ（液体医薬組成物Ｉ）の注入で処置したマウスで比較したカプランマイヤーグラフである。
【図１１】表示量の液体医薬組成物ＩＶで処置したマウスの血清中ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベルを示すグラフである。ＡＳＴのレベルは、検査対象の最高濃度（３．０ｍｇ／ｋｇ）で統計学的に有意な低下が認められた。ＡＬＴのレベルは、ビヒクルと比較して３つの処置群（０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）で低下した。統計学的に有意なｐ値０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）を表示してある。
【図１２】表示量のスルフィドの液体医薬組成物で処置したマウスのＬＶ（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）比またはＡＡＲ（ａｒｅａ ａｔ ｒｉｓｋ）比を示すグラフである。統計学的に有意なｐ値０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）を表示してある。
【図１３Ａ】液体医薬組成物ＩＶの存在下または非存在下で氷冷リンゲル液により処置したブタの中核体温を示すグラフである。ｐ値を示してある２つの実験から得られた結果を示す。
【図１３Ｂ】液体医薬組成物ＩＶの存在下または非存在下で氷冷リンゲル液により処置したブタの中核体温を示すグラフである。ｐ値を示してある２つの実験から得られた結果を示す。
【図１４】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶの存在下で虚血および再灌流を施したブタの梗塞サイズを示すグラフである。
【図１５】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶの存在下で虚血に反応したイヌの前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ：ｐｒｅｌｏａｄ ｒｅｃｒｕｉｔａｂｌｅ ｓｔｒｏｋｅ ｗｏｒｋ）の減少を示すグラフである。
【図１６】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶで前処置した動物のＡＡＲ比（ｐｅｃｅｎｔ）またはＬＶ比（ｐｅｃｅｎｔ）を示すグラフである。
【図１７Ａ】左心室機能が対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパス前後の動物であることを示す。対照ビヒクルまたは非経口硫化水素の存在下における心肺バイパス前後両方の動物の左心室ｄＰ／ｄＴを示すグラフである。
【図１７Ｂ】左心室機能が対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパス前後の動物であることを示す。対照ビヒクルまたは非経口硫化水素の存在下における心肺バイパス前後両方の動物のＰＲＳＷを示すグラフである。
【図１８】インビボでの内皮細胞機能を示すグラフで、対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下での心肺バイパス前後の動物のＤＣＢＦ（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）［％］を示す。
【図１９Ａ】対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下のエキソビボでの内皮機能を示す。対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパスを使用してまたは使用せずにアセチルコリンに反応する血管弛緩を示すグラフである。
【図１９Ｂ】対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下のエキソビボでの内皮機能を示す。対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパスを使用してまたは使用せずにＳＮＰに反応する血管弛緩を示すグラフである
【発明を実施するための形態】
【００５５】
カルコゲナイドを含む組成物とその調製および使用に有用な方法とを提供する。この組成物は、安定なカルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしく前駆体の液体組成物であり、通常は、液体での製造および保存の過程で酸化生成物を生成する酸化反応により治療薬としての有効性が損なわれる。本発明の液体組成物は、有効期間が長く、簡便かつ再現性よく製造され、標準的な投与経路に合わせて設計されており、液体またはガス状カルコゲナイド組成物が以前に考えられていた疾患および症候の処置および防止にも優れている。本発明に関しては、生物学的物質にステイシスまたはプレステイシスを誘導する方法ばかりでなく生物学的物質を疾患または傷害、特に虚血または低酸素傷害から保護する方法における使用を意図している。
【００５６】
Ａ．安定なカルコゲナイド液体医薬組成物
本発明は、カルコゲナイドを含む安定な液体組成物およびその調製に有用な方法を対象とする。本発明では、医薬組成物に対する「液体」という語は、「水性」という語を含むものとする。
【００５７】
一態様では、本発明は、安定な液体医薬組成物であって、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含み、該液体医薬組成物を事前に指定した期間保存した後、該カルコゲナイドの濃度、ｐＨおよび酸化生成物が許容基準（限界値、数値範囲または記載した各試験の他の基準）の範囲内にとどまる、組成物に関する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「安定な」とは、活性カルコゲナイド組成物の濃度、そのｐＨおよび／またはカルコゲナイド酸化生成物が許容基準の範囲内にとどまることをいう。
【００５９】
「許容基準」とは、原薬または製剤がその使用目的に対して有効と判定される際に準拠すべき一連の基準をいう。本明細書で使用する場合、許容基準は、哺乳動物に使用する製剤を対象として規定された各検査、分析手順に関する参考文献および適切な尺度のリストである。たとえば、カルコゲナイドの安定な液体医薬組成物の許容基準とは、原薬、ｐＨおよび酸化生成物のレベルについて事前設定された一連の範囲をいい、安定性試験に基づき個々の薬剤組成物の医薬品としての使用を認めるものである。許容基準は、局所用途および化粧用途の基準など、他の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の基準と異なってもよい。許容可能な標準は、業種ごとに規定されるのが一般的である。
【００６０】
許容基準には様々あるが、本明細書に記載の値または範囲が米国食品医薬品局が公表する医薬品製造管理および品質管理基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に適合すれば許容基準に含まれる。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのｐＨの範囲が７．４〜９．０、６．５〜８．５または６．５〜９．０である。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点での重量オスモル濃度の範囲が２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであるか、浸透圧モル濃度の範囲が２５０〜３３０ｍＯｓｍ／Ｌである。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのスルフィド濃度が５．０〜６．０ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのカルコゲナイド濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌまたは９５〜１５０ｍＭの範囲内である。他の実施形態の場合、許容基準では、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点で全スルフィドおよびその酸化生成物に対してスルフィドが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％重量／体積存在する。関連する実施形態では、酸化生成物は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点で全スルフィドおよび酸化生成物に対して１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％以下の濃度で存在する。
【００６１】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、医療または獣医療の現場でヒトまたは動物に投与する際、分子的実体および組成物がアレルギー反応または類似の予期しない反応を起こさないことをいう。
【００６２】
「カルコゲナイド」または「カルコゲナイド化合物」とは、カルコゲン元素、すなわち、周期表第６族（ただし、オキシドを除く）の元素を含む化合物をいう。これらの元素には、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）およびポロニウム（Ｐｏ）がある。具体的なカルコゲナイドおよびその塩として、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳ、ＢａＳ、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
「カルコゲナイド前駆体」とは、たとえば、生物物質に曝露したとき、あるいは曝露後すぐに一定の条件下で硫化水素（Ｈ２Ｓ）のようなカルコゲナイドを生成することができる化合物および薬をいう。そうした前駆体は、１つまたは複数の酵素または化学反応によりＨ２Ｓまたは別のカルコゲナイドを生成する。ある実施形態では、カルコゲナイド前駆体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）、メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）、メルカプトエタノール、チオシアナート、シアン化水素、メタンチオール（ＭｅＳＨ）または二硫化炭素（ＣＳ２）である。ある実施形態では、カルコゲナイド前駆体は、ＣＳ２、ＭｅＳＨまたはＤＭＳである。
【００６４】
一実施形態では、以下の式によりＨ２Ｓ供与体である水硫化ナトリウム（ＮａＨＳ）の水溶液中での自然解離によりＨ２Ｓを生成する：
【００６５】
【化１】
ある実施形態では、カルコゲナイド化合物は硫黄を含むのに対し、別の実施形態では、セレン、テルルまたはポロニウムを含む。ある実施形態では、カルコゲナイド化合物は、１つまたは複数の露出したスルフィド基を含む。特定の実施形態では、こうしたカルコゲナイド化合物は、露出したスルフィド基を１、２、３、４、５、６またはそれ以上含むか、そこから導き出せる任意の範囲で含むと考えられる。特定の実施形態では、そうしたスルフィド含有化合物は、ＣＳ２（二硫化炭素）である。ある実施形態では、カルコゲナイドは塩であり、好ましくはカルコゲンが−２酸化状態にある塩である。本発明の実施形態に包含されるスルフィド塩として、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化水素カリウム（ＫＨＳ）、硫化リチウム（Ｌｉ２Ｓ）、硫化ルビジウム（Ｒｂ２Ｓ）、硫化セシウム（Ｃｓ２Ｓ）、硫化アンモニウム（（ＮＨ４）２Ｓ）、硫化水素アンモニウム（ＮＨ４）ＨＳ、硫化ベリリウム（ＢｅＳ）、硫化マグネシウム（ＭｇＳ）、硫化カルシウム（ＣａＳ）、硫化ストロンチウム（ＳｒＳ）、硫化バリウム（ＢａＳ）および同種のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
スルフィドが不安定な化合物であることは当該技術分野において周知であり、このクラスの化合物を安定化すべく多くの試みがなされてきた。特に、スルフィドの酸化による酸化生成物は、測定することができる。このため、液体組成物中でのスルフィドの保存過程で生成される酸化生成物の範囲については、本明細書に記載のおよび当該技術分野において周知の標準的な解析方法を用いて酸化生成物のレベルを経時的に測定することで容易に判定することができる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「酸化生成物」とは、たとえば、スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素など、スルフィドの化学変化によって生じる生成物をいう。そうしたスルフィドの酸化による生成物は、（酸化などより）加工、製造または保存に伴い生じる可能性がある。
【００６８】
「保存の過程で」とは、液体カルコゲナイド組成物を調製してから患者または生物物質に投与するまでの期間をいう。本発明の液体医薬組成物については、調製してから直ちに被検体に投与しなくてもよい。調製後はこの組成物をむしろ、液状、半固体状、ゼラチン状、固体状または被検体への投与に好適な他の形状のまま保存のためパッケージングする。ある実施形態では、保存の期間は、１ヶ月〜１２ヶ月、１ヶ月〜６ヶ月または２ヶ月〜５ヶ月である。
【００６９】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の方法および賦形剤を用いて薬学的投与用に調製してもよい。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）；２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
【００７０】
本発明の液体医薬組成物は、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を任意の所望の濃度で含んでもよい。濃度に関しては、たとえば、処置対象の生物物質のタイプおよび投与経路に応じて、簡便なやり方で適切な期間にわたり有効量が送達されるように容易に最適化できる。いくつかの実施形態では、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体濃度は、０．００１ｍＭ〜５，０００ｍＭの範囲、１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲、５０〜５００ｍＭの範囲、７５〜２５０ｍＭの範囲または９５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲にある。
【００７１】
本発明の液体医薬組成物は、濃度が１ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲にあるスルフィドからなるカルコゲナイドをさらに含む。別の実施形態では、スルフィドの濃度は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲にある。
【００７２】
ある実施形態では、本発明の液体カルコゲナイド組成物中のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度は、（標準温度と圧力（ＳＴＰ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で）約、少なくとも約あるいは多くても約０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７．３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０ｍＭもしくＭまたはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。硫化水素ガスの場合、たとえば、いくつかの実施形態では、濃度は、（ＳＴＰで）約０．０１〜約０．５Ｍであってもよい。
【００７３】
モル濃度は、体積当たりの重量に容易に変換することができる。したがって、上記のモル濃度の範囲はいずれも、たとえば、ｍｇ／ｍｌで記載することができる。このため、ある実施形態では、本発明の液体カルコゲナイド組成物のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌまたは１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。他の実施形態では、濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌまたは約１０ｍｇ／ｍｌ、あるいは１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌである。
【００７４】
本発明の一態様では、液体医薬組成物は、液体中に溶解したカルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む。一実施形態では、この液体は、水（Ｈ２Ｏ）であり、他の実施形態では、この液体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）またはリンゲル液など、生理的適合性がより高い溶液である。さらなる実施形態では、この液体は水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、液体医薬組成物が、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体の飽和溶液であることを意図している。
【００７６】
本明細書において限定せずに用いる場合、「％」という語は、（ｗ／ｖ、ｖ／ｖまたはｗ／ｗの場合と同様）液体に固体を溶かした溶液の重量体積比（ｗ／ｖ）、液体にガスを溶かした溶液の重量体積比（ｗ／ｖ）、液体に液体を解かした溶液の体積比（ｖ／ｖ）および固体と半固体の混合物の重量（ｗ／ｗ）を意味する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍｉａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）；２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
【００７７】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、８０％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９０％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９５％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９８％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。
【００７８】
一実施形態では、本発明のカルコゲナイド液体医薬組成物のｐＨは（３．０〜１２．０）の範囲にあるのに対し、他の実施形態では、ｐＨは、（５．０〜９．０）の範囲にある。液体医薬組成物のｐＨを、生理的適合性の範囲に調整しても構わない。たとえば、一実施形態では、液体医薬組成物のｐＨは、６．５〜８．５の範囲にある。他の実施形態では、本発明の液体医薬組成物のｐＨは、７．５〜８．５または７．４〜９．０の範囲にある。
【００７９】
一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０μＭ〜５μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０μＭ〜３μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０．０１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０．００１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、酸化生成物をさらに含んでもよい。本発明の酸化生成物として、スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素があるが、これに限定されるものではない。種々の実施形態では、これらの酸化生成物の１つまたは複数は、１０％未満、６．０％未満、３．０％未満、１．０％未満、０．５％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満または０．０１％未満の量で存在する。
【００８１】
一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８２】
一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、０％〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、１％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８３】
一実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８４】
一実施形態では、酸化生成物は、（０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在するポリスルフィドを含む。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８５】
一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲に。
【００８６】
一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８７】
一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。
【００８８】
液体医薬組成物（製剤）については、哺乳動物への投与前の保存の過程で安定な状態が続くことが好ましいことを当業者であれば理解するであろう。一実施形態では、液体医薬組成物の保存は約３ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約６ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約１２ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。
【００８９】
一実施形態では、液体医薬組成物の保存は約３ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約６ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約１２ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。
【００９０】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物の調製方法は、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度を２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整することをさらに含む。一実施形態では、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度は、２４０〜３６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌまたは等張性の範囲にある。特定の実施形態では、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲にあるか、組成物の重量オスモル濃度が２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲にある。ＮａＣｌを賦形剤として用いて重量オスモル濃度を調整してもよい。
【００９１】
ある実施形態では、投与時の疼痛が緩和され、高浸透圧または低浸透圧組成物に起因して起こり得る溶血作用を最小限に抑えられるため、液体医薬組成物は等張であることが望ましい。したがって、本発明の安定化組成物は、保存安定性が高いばかりでなく、酸およびその酸の塩の形からなる従来の他の緩衝系を用いた製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と比較して投与時に疼痛が実質的に緩和されるという利点も付加されている。
【００９２】
一実施形態では、安定な液体医薬組成物を不透過性の容器にパッケージングする。「不透過性容器」とは、ガス分子の通過に対する永続的なバリアとなる容器をいう。不透過性容器は当業者に知られており、ガス不透過性構成材料を含む「点滴バッグ」または密封ガラスバイアルがあるが、これに限定されるものではない。液体医薬組成物は、不活性雰囲気または希ガス不透過性の容器にパッケージングすればよい。希ガスとは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒｎ）をいう。不活性ガスとは、窒素（Ｎ２）をいう。「不活性雰囲気」という語は、容器内の窒素またはアルゴン雰囲気をいう。液体医薬組成物については、たとえば、琥珀色バイアルのような遮光バイアルまたは容器にパッケージングしてもよい。一実施形態では、ガラスアンプルに組成物をシールして保存してもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、保存期間が１〜１２ヶ月またはそれ以上となる保存過程でのカルコゲナイドの酸化防止用に添加される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、保存期間は１〜６ヶ月である。いくつかの実施形態では、保存期間は３〜６ヶ月である。いくつかの実施形態では、保存期間は４〜５ヶ月である。本発明の実施形態では、賦形剤を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。好適な賦形剤は多くある。例として、キレート剤、ｐＨ改変剤、還元剤、酸化防止剤、スピントラップ剤および防腐剤がある。
【００９４】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、任意にキレート剤またはキレート剤を含んでもよい。キレートは、金属イオンと錯化剤の水溶性錯体である。キレートは、ほとんどの場合、溶液中で容易に解離せずに、不活性錯体を形成する。ただし、レービル錯体では、金属イオンが容易に交換され得る。遷移元素の金属錯体がよく知られているが、キレート化は、もっと広範囲の元素内で起こる。金属錯体を生成するキレート剤は、金属イオン封鎖剤とも呼ばれる。キレート剤は一般に、−Ｏ、−ＮＨ２または−ＣＯＯ−など、金属に一対の電子を供与する少なくとも２つの官能基を持つ。さらに、これらの基は、金属と環形成できる位置にある。天然のキレート剤の例として、多糖類などの炭水化物、複数の配位基を持つ有機酸、脂質、ステロイド、アミノ酸および関連化合物、ペプチド、ホスファート、ヌクレオチド、テトラピロール、フェリオキサミン、イオノフォア（グラミシジン、モネンシン、バリノマイシンなど）およびフェノール類が挙げられる。合成キレート剤の例として、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸五ナトリウム塩（ＤＴＰＡ５）、ＣａＤＴＰＡＨ、ジメルカプロール（ＢＡＬ：Ｂｒｉｔｉｓｈ ａｎｔｉ−Ｌｅｗｉｓｉｔｅ）、デフェロキサミン、デスフェラール、２，２’−ビピリジルジメルカプトプロパノールエチレンジアミノ四酢酸、エチレンジオキシジエチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉｎｉｔｒｉｌｏ−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＣａＮａ２エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、イオノフォア、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、オルトフェナントロリン、サリチル酸、サクシマー（メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸、（ＤＭＳＡ：ｍｅｓｏ−２，３−ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸三ナトリウム（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９５】
一実施形態では、合成キレート剤はＤＴＰＡである。ある実施形態では、ＤＴＰＡの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。一実施形態では、ＤＴＰＡは、０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲にある。一実施形態では、合成キレート剤は、ＤＴＰＡ５からなる。ある実施形態では、ＤＴＰＡ５の濃度は、（０．０００１％〜０．１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＤＴＰＡ５は、（０％〜１．０％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、ＤＴＰＡ５は、（０％〜０．０１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９６】
一実施形態では、合成キレート剤はＣａＤＴＰＡである。ある実施形態では、ＣａＤＴＰＡの濃度は、（０．０００１％〜０．１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある（ｉｓ ｉｓ）。一実施形態では、ＣａＤＴＰＡは、（０％〜０．０１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＣａＤＴＰＡは、（０％〜１．０％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９７】
一実施形態では、合成キレート剤はデフェロキサミンである。ある実施形態では、デフェロキサミンの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。一実施形態では、デフェロキサミンは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲にある。
【００９８】
一実施形態では、合成キレート剤はＥＤＴＡである。ある実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。ある実施形態、ＥＤＴＡは、０％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＥＤＴＡは、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＥＤＴＡは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、ＥＤＴＡは、０％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９９】
本発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｍａｙ）の液体医薬組成物は、１種または複数種のｐＨ改変剤をさらに含んでもよい。ｐＨ改変剤には、炭酸亜鉛、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、マレイン酸カルシウム、オレイン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム、酢酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、リン酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、マレイン酸マグネシウム、オレイン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、酢酸亜鉛、リン酸水素亜鉛、リン酸亜鉛、乳酸亜鉛、マレイン酸亜鉛、オレイン酸亜鉛、シュウ酸亜鉛などの無機塩類およびこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。他のｐＨ改変剤として、たとえば、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸、酒石酸、二酸化炭素、炭酸、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、トロメタミン、オロト酸および塩酸が挙げられる。一実施形態では、ｐＨ改変剤は水酸化ナトリウムである。
【０１００】
ｐＨ改変剤については、もともと酸性または塩基性である溶液に加えると緩衝剤の役割を果たし、溶液を別のｐＨに変更し維持できることを当業者であれば理解する（以下を参照：Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００６）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｓｔａｈｌ，Ｐ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｃ．ｅｄ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｗｉｌｅｙ（２００２））。特定の実施形態では、ｐＨ改変剤は、緩衝剤としての役割を果たし、二酸化炭素または硫化水素からなる。
【０１０１】
ある実施形態では、本発明の医薬組成物は、たとえば、グルタチオン（米国特許第６，５８６，４０４号を参照）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＳＥＰ）、ｌ−システイン、システインまたはメチオニンなど、還元剤であるもう１つの賦形剤を含む。一実施形態では、還元剤は、グルタチオン（以下を参照；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）２５：６１２−６２８）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｌ；（２００２）１３２：１２１−３０）またはジチオエリトリトール（ＤＴＥ：ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）である。ある実施形態では、グルタチオンの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭまたはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。ある実施形態では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲で存在する（ｗｈｉｃｈ ｐｒｅｓｅｎｔ）。ある実施形態では、還元剤は、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）であり、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。
【０１０２】
本発明の液体医薬組成物は任意に、フリーラジカルスカベンジャーまたは酸化防止剤を含んでもよい。フリーラジカルスカベンジャーまたは酸化防止剤の例として、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ−α酢酸トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）、メラトニン、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、メラトニン、、亜ジチオン酸塩、ピロ亜硫酸塩、システイン、二亜硫酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオエチレングリコール、Ｌ−トレオアスコブ酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、レシチン、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニドール、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ヒドロキシコマリン、ブチル化ヒドロキシトルエン、セファルム、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、没食子酸ラウリル、プロピルヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシブチルロフェノン、ジメチルフェノール、、レシチン、エタノールアミン、メグルミンおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない（米国特許出願公開第２００５／０１０６２１４号を参照）。
【０１０３】
一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲にある。（以下を参照：Ｓｗａｄｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４），１４１：３９７）。
【０１０４】
一実施形態では、酸化防止薬は、スピントラップ剤である。スピントラップ剤の例として、Ｎ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）（以下を参照：Ｋｏｔａｋｅ，Ｙ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ（１９９９）４８１）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）（Ｇａｒｉｂｏｌｄｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２９：６３３；Ｍｉｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ．（Ｔｏｋｙｏ）（２０００）４１：１０３；Ｍｏｔａ−Ｆｉｌｉｐｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｈｏｃｋ １２：２５５Ｒ：２２−４１；Ｓ：３９〜２６ ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）（以下を参照：Ｌａｐｃｈａｋら、Ｓｔｒｏｋｅ（２００１）３２：１４７−５３）；（二ナトリウム−［（ｔｅｒｔ−ブチルイミノ）メチル］ベンゼン−１，３−ジスルホナートＮ−オキシド（ＮＸＹ−０５９）（以下を参照：Ｌａｐｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ（２００３）９：２５３−６２）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、スピントラップ剤は、０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在するＴＥＭＰＯである。いくつかの実施形態では、スピントラップ剤はＴＥＭＰＯであり、１００ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在する。別の実施形態では、スピントラップ剤はＴＥＭＰＯであり、０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在する。
【０１０６】
本発明のカルコゲナイド組成物は任意に、防腐剤を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「防腐剤」という語は、微生物の増殖の防止に用いる化合物を意味するものである。そうした化合物の例として、以下に限定されるものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェエノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、チメロサール、メタクレゾール、ミリスチルγ−塩化ピコリニウム、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チオグリセロール、チメロサール、チモールおよびメチル、エチル、プロピルまたはブチルパラベンおよび当業者に公知のこれら以外ものが挙げられる。こうした防腐剤を、記載されているような許容可能な医療慣行に従って通常の濃度で液体カルゴゲナイド組成物に用いる。（以下を参照：Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００６）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，ＤＢ，Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。ある実施形態、防腐剤は、ベンジルアルコールであり、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、防腐剤はベンジルアルコールであり、０％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、防腐剤は、０％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲のフェノールである。ある実施形態では、防腐剤は、（０．０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のメチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のエチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のプロピルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．４％（ｗ／ｖ）の範囲のブチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲の塩化ベンザルコニウムである。
【０１０７】
一実施形態では、賦形剤を組み合わせてポリスルフィドの形成を低減する。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減させる賦形剤の組み合わせは、０％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲の亜硫酸ナトリウムおよび０％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲のＥＤＴＡを含む。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減する賦形剤の組み合わせは、亜硫酸ナトリウムとＤＴＰＡ５である。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減する賦形剤の組み合わせは、亜硫酸ナトリウム、ＤＴＰＡ５およびベンジルアルコールである。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、０．０１ｍｇ／ｍｌ以下の鉄、１０、５、２．７、２．５または１ＥＵ／ｍｌ以下のエンドトキシン、１０、５または１ｐｐｍ未満の硫化カルボニルおよび５、２．５または１ｐｐｍ未満の二硫化炭素を含む。
【０１０９】
これらの材料は食品添加剤および加工助剤として一般に受け入れられているうえ、そうした用途に関する米国食品医薬品局の「一般に安全と認められる」（すわたち「ＧＲＡＳ：ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ」）基準を達成している。このため、上述のいくつかは好ましいものである。
【０１１０】
本発明は、本発明の液体医薬組成物を含むキットをさらに含む。ある実施形態では、そうしたキットは、本発明の液体医薬組成物を保存する１つまたは複数の容器を含む。一実施形態では、不活性ガスまたは希ガス下で組成物を容器に保存する。この容器についてはシールし、不透過性かつ遮光性の容器（琥珀色バイアルなど）を含む（ａ ｓｅａｌｅｄ ａｎｄ ｈａｓ ａｎｄ ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ｅ．ｇ．，ａｎ ａｍｂｅｒ ｖｉａｌ））。
【０１１１】
Ｂ．液体医薬組成物の調製方法
本発明の方法の種々の実施形態によれば、生物学的物質に本発明の液体医薬組成物を、たとえば、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下、小胞体内、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）において与えるか、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄により与える。
【０１１２】
液体中に溶解したカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体を既知の望ましい濃度で含む組成物または非経口投与用の組成物を意図している。「非経口」とは、消化管を経由せずに物質を投与する任意の経路をいう。一般に、液体カルコゲナイド組成物については、たとえば、カルコゲナイドガス（Ｈ２Ｓなど）を組成物に接触（溶解または注入など）させ、ガス分子を適切なｐＨ改変剤からなる液体に溶解させることで製造すればよい。一実施形態では、カルコゲナイドガスは緩衝剤であり、薬学的に許容されるキャリアからなる液体に溶解させる。さらなる実施形態では、液体医薬組成物は、単一の賦形剤または賦形剤の組み合わせを加えて記載のように調製されるカルコゲナイドガス溶液からなる。
【０１１３】
組成物に溶解するガスの量については、以下に限定されるものではないが、たとえば、液体または溶液のガス溶解性、液体または溶液の化学組成、その温度、その圧力、そのｐＨ、組成物中の化学品のｐＫＡ、そのイオン強度、さらにはガスの濃度、ガスを溶液に接触させる程度（溶解または注入の速度または持続時間など）など、多くの可変要素によって異なることを当業者であれば認識するであろう。非経口投与用の液体または溶液中のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度に関しては、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の安定性については、液体カルコゲナイド組成物の調製または製造後の様々な時間間隔でその濃度を測定することで判定することができ、出発濃度と比較してカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度が低下すると、カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の減少または化学変換が示唆される。
【０１１４】
あるいは、最も多く含まれるカルコゲナイド化合物（またはその塩または前駆体）の化学変化（酸化など）により引き起こされる化学物質の経時的な変化を管理された保存条件（温度、湿度、光曝露など）下で測定して液体カルコゲナイド医薬組成物の安定性を判定してもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、カルコゲナイドの塩の形を滅菌水または食塩水（０．９％塩化ナトリウム）に溶解し、薬学的に許容される非経口製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、大槽内、腹腔内および皮内など）剤形を得て液体カルコゲナイド組成物を生成する。別の実施形態では、液体医薬組成物を、経口、経鼻（吸入またはエアロゾル）、頬粘膜または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与剤形に製剤する。非経口用液体剤形をある種のｐＨに緩衝して、カルコゲナイド化合物の溶解性を高めたり、カルコゲナイド化合物のイオン化状態に影響を与えたりしてもよい。硫化水素またはセレン化水素の場合、以下に限定されるものではないが、ナトリウム、カルシウム、バリウム、リチウムまたはカリウムなど、当業者に公知の多くの塩の形のどれでも構わない。一実施形態では、硫化ナトリウムまたはセレン化ナトリウムを無菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５〜８．５の範囲に調整して被検体に投与可能な既知の濃度の溶液を得る。
【０１１６】
種々の実施形態では、液体または溶液をカルコゲナイド化合物と接触させる前に酸素を還元してある、液体または溶液中で液体カルコゲナイド組成物を調製する。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物の調製方法は、医薬組成物の製造および保存の各局面で酸素含有量を限定することをさらに含む。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０μＭ〜５μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０μＭ〜３μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０．００１μＭ〜０．１μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０．１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。
【０１１７】
ある種のカルコゲナイド化合物（硫化水素、セレン化水素など）は、酸素と化学反応する能力があり酸化および化学変化を起こすため、酸素の存在下で安定ではない。したがって、以下に限定されるものではないが、液体または溶液への陰圧の印加（真空脱気（ｖａｃｕｕｍ ｄｅｇａｓｉｎｇ））あるいは溶液または液体を試薬と接触させ酸素を結合または「キレート化」させて溶液から酸素を効率的に除去するなど、当該技術分野において公知の方法を用いて、酸素を液体または溶液から除去してもよい。
【０１１８】
一実施形態では、液体カルコゲナイド組成物を不透過性の容器に保存する。これは特に、溶液からすでに酸素を除去してあるときに、カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の酸化を抑制または防止するのに望ましい。さらに、不透過性の容器で保存すれば、液体または溶液のカルコゲナイドガスの酸化生成物を抑えて、溶解したカルコゲナイドの濃度を一定に保つこともできる。不透過性容器については当業者に知られており、ガス不透過性の構成材料を含む「点滴バッグ」または密封ガラスバイアルがあるが、これに限定されるものではない。気密性保存容器内での空気への曝露を防ぐため、閉める前に容器に窒素またはアルゴンなどの不活性ガスまたは希ガスを導入しておいてもよい。
【０１１９】
他の関連する実施形態では、液体医薬組成物を琥珀色バイアルなどの耐光性または遮光の容器またはバイアルに保存する。好ましくは組成物をガラスバイアルにパッケージングする。ガラスバイアルは、組成物の酸化分解を防止／遅延させるため、たとえば、窒素のような不活性雰囲気の若干強い圧力で満たし、さらに光の侵入を防止することで組成物の光化学的劣化を防止するようになっていることが好ましい。これは、琥珀色バイアルを用いることで最も効果的に実現することができる。多くの静脈注射液が酸素に感受性であるため、溶液を無酸素環境で保存できる容器系については、よく知られている。たとえば、充填およびシールプロセスの過程で酸素をパージするガラス容器を用いてもよい。別の実施形態では、酸素が入らないようにシールする上包装に封入できる可撓性のプラスチック容器が有用である。基本的に、酸素が液体医薬組成物と相互作用できないようにするのであればどのような容器を用いてもよい。（米国特許第６，４５８，７５８号を参照）一実施形態では、容器は、１種または複数種の酸素スカベンジャーを含む。たとえば、酸素をスカベンジする組成物については、生成物を支持または保持する手段の内面のコーティングまたは内層として塗布すれば、酸素の透過に対するバリアとなり得る（米国特許第５，４９２，７４２号を参照）。
【０１２０】
一実施形態では、本発明は、溶液中にカルコゲナイド塩を溶解することを含む、医薬組成物の調製方法を含む。一実施形態では、カルコゲナイド塩は、硫化ナトリウムである。別の実施形態では、カルコゲナイドおよび塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳ、ＢａＳであるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、この液体は水またはリン酸緩衝生理食塩水である。一実施形態では、この液体は水酸化カリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液である。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、ガス状のカルコゲナイド、たとえば、Ｈ２Ｓ（硫化水素）を液体に注入することを含む、医薬組成物の調製方法を含む。一実施形態では、この液体は、水酸化カリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液である。
【０１２２】
種々の実施形態では、本発明のカルコゲナイドを含む液体医薬組成物の調製方法は、組成物のｐＨを調整するステップをさらにも含む。ある実施形態では、塩化水素、二酸化炭素、窒素または硫化水素の１種または複数種を加えてｐＨを調整する。別の実施形態では、窒素、二酸化炭素または硫化水素またはこれらの任意の組み合わせを組成物に溶解してｐＨを調整する。一実施形態では、窒素と二酸化炭素の組み合わせまたは窒素と硫化水素の組み合わせを組成物に溶解してｐＨを調整する。ある実施形態では、硫化水素を水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムに溶解して溶液のｐＨを調整する。一実施形態では、１当量の硫化水素溶液を１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解する。
【０１２３】
さらに、本明細書に記載の方法は、金属キレート剤、フリーラジカルスカベンジャーおよび／または還元剤の１種または複数種を加えることをさらにも含んでもよい。本発明の特定の方法では、液体カルコゲナイド組成物を保持する入れ物を含む、ｐＨ測定用、ガス添加用アクセスポートおよび外部雰囲気と接触せずに分注できるアクセスポート付きの密封容器内で液体カルコゲナイド組成物を製造する。一実施形態では、その入れ物は、摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコである。一実施形態では、入れ物に窒素ガスまたはアルゴンガスを流して酸素含有量を最小限に抑え０．００μＭ〜３μＭの範囲とする。ある実施形態、入れ物内の酸素含有量の測定値が０．０１μＭ〜０．０３μＭである。液体カルコゲナイド組成物の最終スルフィド濃度については、ＮａＯＨの初濃度から判定する。たとえば、安定性の向上（ＤＴＰＡ）または浸透圧モル濃度のバランス（ＮａＣｌ）を確保する任意の所望の添加剤と共に、ＮａＯＨ溶液を三つ口フラスコに加える。撹拌しながら５ｐｓｉで１５分間アルゴン溶解して、この溶液から酸素を除去する。この溶液に、溶液のｐＨが７．６〜７．８の範囲になるまで硫化水素ガス（Ｈ２Ｓ）を撹拌しながら溶解する。一実施形態では、許容されるｐＨ範囲は、７．５〜８．０である。酸素が溶液に入らないようアルゴンでヘッドスペースを最大限満たして、この溶液をアルゴン陽圧下でフラスコからバイアルまたはビンに分注する。分注バイアルまたはビンを、アルゴンが常時流されるグローブボックスに入れて酸素を最小限に抑え０．００μＭ〜０．５μＭの範囲とする。分注前に各ビンまたはバイアルにアルゴンを流しておく。バイアルおよびビンは安定性を高めるため褐色のガラス製で、これをテフロン（登録商標）ライナー付きシリコンまたはゴムで覆われたキャップで閉じ、クラウンキャップクリンパーを用いてプラスチックキャップでシールし、密閉する。一実施形態では、バイアルおよびビンはホウケイ酸ガラスからなる。一実施形態では、バイアルおよびビンは二酸化ケイ素からなる。
【０１２４】
Ｃ．液体医薬組成物の使用方法
本発明の液体医薬組成物を用いて、ガス状のカルコゲナイド（国際公開第２００５／０４１６５５号を参照）または液体カルコゲナイド組成物で処置されたことがある任意の疾患または障害など、種々の疾患および障害の処置または予防を行ってもよい。たとえば、動物モデルでは、硫化ナトリウムによる処置が、心筋梗塞、敗血症（以下を参照：Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ（２００３）：４７：１５５）、硬変における血管異常（以下を参照：Ｆｉｏｒｕｃｃｉ Ｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（２００５）４２：５３９）の有望な治療薬として、心臓保護剤として（以下を参照：（以下を参照；Ｇｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍ（２００４）３１３：３６２）、神経保護剤として（以下を参照：Ｑｕ Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ．（２００６）８８９）、心筋虚血再灌流障害において（以下を参照：Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ（２００６）１０１：５３）、血管石灰化の抑制のため（以下を参照：Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．（２００６）２７：２９９）、薬剤処置による胃障害の緩和のため（以下を参照：Ｆｉｏｒｕｃｃｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００５）１２９：１２１０）、好中球接着の抑制のため、白血球による炎症の調節のため（以下を参照：Ｚａｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．（２００６）２０：２１１８−２１２０）、勃起不全（以下を参照：Ｓｒｉｌａｔｈａ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００６）５３５：２８０）、過敏性腸症候群において（Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ Ｅ．ら、ＪＰＥＴ（２００６）３１９：４４７）、炎症後の過敏症における抗侵害受容作用のため用いられている。治療用途および関連情報のさらなる例を表Ｉにまとめてある。さらに、この組成物については、種々の生物物質においてステイシスまたはプレステイシスを誘導するために用いてもよく、虚血または低酸素に起因する傷害の処置または予防に用いてもよい。
【０１２５】
「生物物質」という語は、細胞、組織、器官および／または生命体およびこれらの任意の組み合わせなど、任意の生きた生物学的物質をいう。本発明の方法については、生命体の部分（細胞内、組織内および／または１つもしくは複数の器官内など）で実施してもよいし（その部分が生命体内にとどまっているか、生命体から除去されているかは問わない）、生命体全体で実施してもよいことを意図している。さらに、細胞および組織の文脈では、均一および不均一な細胞集団も本発明の実施形態の被検体であってもよいことを意図している。「インビボにおける生物物質」という語は、インビボの、すなわち、そのまま生命体内あるか、生命体に結合している生物物質をいう。さらに、「生物物質」という語は、「生物学的物質」という語と同義であることも理解されよう。ある実施形態では、１つまたは複数の細胞、組織または器官が生命体から分離されていることを意図している。「単離された」という語を用いて、そうした生物物質を説明することができる。本発明の方法は、インビボおよび／または単離された生物物質で実施してもよいことを意図している。
【０１２６】
本発明の方法により処置される細胞は、真核細胞でも原核細胞でもよい。ある実施形態では、細胞は真核細胞である。より詳細には、いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞として、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、フェレット、雌ウシ、ヒツジまたはウマ由来の細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明の細胞は、２倍体であってもよいが、場合によっては、１倍体（性細胞）であってもよい。さらに、細胞は、倍数体、異数体または無核であってもよい。細胞は、心臓、肺、腎臓、肝臓、骨髄、膵臓、皮膚、骨、静脈、動脈、角膜、血液、小腸、大腸、脳、脊髄、平滑筋、骨格筋、卵巣、精巣、子宮および臍帯など、特定の組織または器官由来であってもよい。ある実施形態では、細胞は、血小板、骨髄球、赤血球、リンパ球、脂肪細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、グリア細胞、ニューロン、分泌細胞、バリア機能細胞、収縮性細胞、吸収細胞、粘膜細胞、輪部細胞（角膜由来）、幹細胞（全能性、多能性または複能性）、未受精もしくは受精卵母細胞または精子などの細胞型の１つとして特徴付けられてもよい。
【０１２７】
通常の単純な意味に従い「組織」および「器官」という語を用いている。組織は細胞からなるが、「組織」という語は、一定の種類の構造材料を形成する類似細胞の集合体をいうことが理解されよう。さらに、器官は、組織の特定のタイプである。ある実施形態では、組織または器官を「単離する」が、これは組織または器官が生命体内にないことを意味する。
【０１２８】
「低酸素」および「低酸素の」という語は、酸素レベルが正常未満である環境をいう。通常の生理学的濃度の酸素が細胞、組織または器官に供給されないと、低酸素が引き起こされる。「正常酸素」とは、該当する個々の細胞型、細胞状態または組織の酸素が通常の生理学的濃度であることをいう。「無酸素」は、酸素がないことをいう。「低酸素状態」は、細胞、器官または生命体の低酸素に到る状態をいう。これらの状態は、細胞型および組織または器官内の細胞の個々の構造または位置ばかりでなく、細胞の代謝状態によって異なる。本発明では、低酸素状態は、酸素濃度が通常の大気条件であるか、あるいはそれ未満の２０．８、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０％未満の状態を含む。あるいは、これらの数字は、１気圧（１０１．３ｋＰａ）での気圧に対する割合を表してもよい。「無酸素」は、酸素がないことをいう。酸素濃度がゼロパーセントであれば、無酸素状態である。したがって、低酸素状態は無酸素状態を含むが、いくつかの実施形態で実現する低酸素状態は、０．５％以上である。本明細書で使用する場合、「正常酸素状態」は、約２０．８％あるいはそれ以上の酸素濃度とする。
【０１２９】
水は、標準温度と圧力（ＳＴＰ）で空気に触れると２８０μＭの溶解酸素を含む。ある実施形態では、本明細書に記載のおよび当業者に公知の方法を用いてカルコゲナイド液体医薬組成物を水中で製剤化し、水中の酸素レベルが低酸素状態に低下すると、すなわち、水中の酸素が２８０μＭ未満に低下になると、「製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）低酸素」が生じる。
【０１３０】
別の実施形態では、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）低酸素は、酸素濃度が通常の大気条件であるか、あるいはそれ未満の２０．８、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０％未満である状態を含む。あるいは、これらの数字は、１気圧（１０１．３ｋＰａ）での気圧に対する割合を表してもよい。
【０１３１】
低酸素または無酸素を達成する標準的な方法は十分確立しており、化学触媒の力を借りてチャンバーから酸素を除去する環境チャンバーを用いることを含む。そうしたチャンバーについては、たとえば、ＧＡＳＰＡＫ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ＋Ｃａｒｂｏｎ Ｄｉｏｘｉｄｅ ＥｎｖｅｌｏｐｅｓまたはＢＩＯ−ＢＡＧ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＣｈａｍｂｅｒｓとしてＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）から市販されている。あるいは、チャンバー内の空気を窒素など酸素以外のガスと交換して酸素を取り除いてもよい。酸素濃度については、たとえば、ＦＹＲＩＴＥ Ｏｘｙｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂａｃｈａｒａｃｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）を用いて判定することができる。
【０１３２】
一実施形態では、「有効量」という語は、測定可能な結果を達成できる量をいう。一実施形態では、「有効量」は、たとえば、第２相または第３相の比較臨床試験において医学的処置が必要なヒト被験者に投与した際に、事前に設定した臨床エンドポイント（死亡率など）に対して統計学的に有意な利益が得られる量である。有効量は、疾患または傷害に反応した生物物質の生存性を高める量であるか、生物物質のステイシスまたはプレステイシスを誘導する量である。
【０１３３】
当然のことながら、組織または器官においてステイシスまたはプレステイシスを誘導する際の有効量とは、組織または器官の細胞呼吸の全体量で判定した、組織または器官のステイシスまたはプレステイシスを誘導する量である。したがって、たとえば、特定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物への曝露後、心臓の酸素消費レベル（心臓細胞の全体に関する）が少なくとも約２倍（すなわち、５０％）低下する場合、その特定量は、心臓にステイシスを誘導する有効量であることが理解されよう。同様に、生命体にステイシスまたはプレステイシスを誘導する有効量も、ステイシスまたはプレステイシスに関するある特定のパラメーターの全体または総合レベルについて評価した量である。生命体の特定部分を標的にする場合を除き、生命体にステイシスまたはプレステイシスを誘導する際の有効量は、生命体全体のステイシスまたはプレステイシスを全体的に誘導する量であることも理解されよう。さらに、有効量は、ステイシスまたはプレステイシスを誘導するのに十分な量であってもよいし、たとえば、別の化合物、傷害または病状のような別の薬または刺激と組み合わせてステイシスまたはプレステイシスを誘導するのに十分な量であってもよいことも理解されよう。
【０１３４】
ある実施形態では、本発明の方法および組成物は、処置対象の生物学的物質にステイシスまたはプレステイシスを誘導する。本明細書で使用する場合、「ステイシス」とは、生物学的物質は生きているが、生物物質による二酸化炭素生成の速度または量が少なくとも５０％（すなわち、２倍）低下すること；生物物質による酸素消費の速度または量が少なくとも５０％低下すること；および運動または移動性が少なくとも１０％低下すること（精細胞または心臓もしくは四肢など運動する細胞または組織、あるいは全生命体にステイシスを誘導する際にのみ適用）（「細胞呼吸指標」と総称される）の１つまたは複数を特徴とする低代謝状態をいう。
【０１３５】
本発明のある実施形態では、生物物質による酸素消費速度は、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００倍またはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下することを意図している。あるいは、本発明の実施形態については、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲のように、生物物質による酸素消費速度の低下率という観点から検討してもよいことを意図している。
【０１３６】
酸素消費を測定するにはどのようなアッセイを用いてもよいが、典型的なアッセイでは、閉鎖環境を利用し、環境に導入した酸素と一定時間後に環境内残っている酸素の差の測定を行う。生物物質による二酸化炭素の生成を測定して酸素消費量を判定してもよいこともさらに意図している。したがって、二酸化炭素の生成が減少する場合は、酸素消費の減少に相当することになる。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「プレステイシス」とは、生物物質がステイシスに到るのに通過しなければならない低代謝状態をいう。プレステイシスは、生物学的物質内の代謝低下の規模がステイシスとして定義されるものより小さいことを特徴とする。有効な化合物を用いてステイシスを達成するには、生物物質は生物物質における酸素消費およびＣＯ２生成の低下が５０％未満に分類される低代謝状態を必ず通過しなければならない。代謝または細胞呼吸が５０％未満の程度に低下するそうした一連の現象を、「プレステイシス」の状態と呼ぶ。
【０１３８】
さらに、種々の実施形態では、プレステイシスは、正常な生理的状態と比較して代謝活性の１つまたは複数の指標の低下が１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以下であることを特徴とする。他の実施形態では、プレステイシスは、別の刺激に呼応してステイシスへの移行を強化または促進し得ること、あるいは、傷害に起因する損傷、疾患の発症もしくは進行または出血、特に不可逆的組織損傷、出血性ショックもしくは死亡に到る可能性がある出血からの生物物質の生存を向上させる、またはそれから生物物質を保護できることを特徴とする。本明細書に明示的に例示した本発明の方法は「ステイシス」の誘導に言及する場合があるが、そうした方法を、「プレステイシス」の誘導に容易に適合させることができることと、本発明がそうしたプレステイシスの誘導方法を意図していることとが理解されよう。さらに、ステイシスの誘導に用いた同じ方法および組成物を用いて、その組成物をステイシスの誘導に使用するよりもより少ない投与量および／またはより短い時間で生物物質に与えることで、プレステイシスを誘導してもよい。
【０１３９】
本発明の方法によれば、ステイシスまたはプレステイシスは一時的および／または可逆的であるのが一般的であり、これは、ある程度経った時点で生物物質がステイシスの特徴をもはや示さなくなることと、生物学的物質が死んだり分解したりするほどに処置が有毒でないことを意味する。
【０１４０】
本発明の方法の種々の実施形態によれば、ステイシスまたはプレステイシスを誘導するには、直接ステイシスそのものを誘導する一定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物で生物物質を処置するか、あるいは、それ自体はステイシスまたはプレステイシスを誘導しないものの、代わりに、以下に限定されるものではないが、傷害、疾患、低酸素症、過剰な出血または本明細書に記載するような１種または複数種の有効な化合物による処置などの別の刺激に呼応して、生物物質がステイシスを達成する能力を促進または強化する、またはそれを達成するのに要する時間を短縮する、一定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物で生物物質を処置する。
【０１４１】
ある実施形態では、本発明の液体医薬組成物を用いて虚血または低酸素状態にさらされた生物物質の傷害の処置または予防を行う。一実施形態では、こうした方法を用いて、傷害、外傷または救命医療の処置を受けたことがある、受けている、あるいはそうした処置の影響を受けやすい患者を処置する。傷害の原因は、外的侵襲（熱傷、創傷、切断、銃創または手術による外傷、腹部手術、前立腺手術など）、内的侵襲（敗血症性ショック、脳卒中または心停止、血行の急激な低下を引き起こす心発作など）または低温または放射線への曝露など非侵襲的ストレスによる血行の低下であってもよい。傷害は、細胞レベルでは細胞、組織および／または器官を低酸素にさらすことになり、それによりプログラムされた細胞死、すなわち「アポトーシス」の誘導につながることが多い。
【０１４２】
故に、本発明は、組織、器官、四肢、さらに生命体全体を傷害の有害な作用から保護する手段としてそれらを本発明の液体カルコゲナイド組成物と有効量で接触させることを意図している。診察をすぐに受けられない特定のシナリオでは、こうすることで、患者が適切な診察を受けられるまで患者のために「時間を稼ぐ」ことができる。さらに、本発明は、創傷治癒および組織再生の遅延をもたらす恐れがある生物学的プロセスを阻止／遅延することで、組織再生および創傷治癒を誘導する方法も意図している。この文脈では、四肢または生命体に相当な創傷があるシナリオにおいて生物物質を液体カルコゲナイド組成物と接触させ、治癒および再生を阻害する生物学的プロセスに対処することで創傷治癒および組織再生プロセスを支援する。本発明の方法を実行して創傷治癒だけでなく、心停止または脳卒中および出血性ショックなどの外傷を防止または処置してもよい。本発明は、開胸手術（ｔｈｏｒｏａｃｏｔｏｍｙ）、開腹手術および脾臓の処置または心臓手術、動脈瘤、手術、脳手術および同種のものなど救急の外科的手技による外傷の危険に対して重要な意味を持つ。
【０１４３】
ある実施形態では、本発明の方法を実行して心停止または脳卒中の生存性を向上させてもよく、それに起因する虚血傷害を防止してもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、心停止または脳卒中の患者またはその危険性がある患者の生存性を向上させる、またはそうした患者の虚血傷害を緩和する方法であって、心筋梗塞、心停止または脳卒中の前、その後あるいはその前後両方に液体カルコゲナイド組成物を有効量で患者に与えることを含む、方法を含む。
【０１４４】
本明細書で使用する場合、「疾患の処置」という語は、疾患、症候または障害を発症した患者の管理および看護をいう。処置の目的は、疾患、症候または障害の有害作用の減弱にある。処置は、有効な化合物を投与して疾患、症候または障害を除去または制御すると共に疾患、症候または障害に伴う症状または合併症を緩和することを含む。
【０１４５】
ある実施形態では、本発明の方法は、虚血もしくは低酸素傷害または疾患による侵襲の前に、たとえば、患者などの生物学的物質に前処置を行うことを含む。こうした方法については、虚血または低酸素を引き起こす可能性がある傷害または疾患が事前に予定または選択されているか、それが生じるであろうと事前に予測されているときに用いてもよい。例として、自然にあるいは手技の結果、失血が起こる可能性がある大手術、血液の酸素化が不十分になるか、血液の血管送達が減少する可能性がある心肺バイパス（冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ：ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ）術の場合と同様）、または臓器移植が必要な移植患者に輸送および移植するため提供臓器を摘出する前に行われる臓器提供者の処置においてが挙げられるが、これに限定されるものではない。例として、傷害または疾患の進行の危険性が内在する（血管形成術後の不安定狭心症、大外傷または失血後に出血している動脈瘤、出血性卒中においてなど）病態または医療診断検査により危険性が診断される可能性がある病態が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４６】
さらに、本発明のさらなる実施形態は、失血、あるいは適切な血液供給の欠如などによるこれ以外の細胞または組織への酸素補給の不足から、生存性を向上させることおよび不可逆的組織損傷を防止することに関する。これは、たとえば、実際の失血の結果であってもよいし、細胞または組織への血流の閉塞が引き起こす症候または疾患、生命体の局所または全体の血圧を低下させる症候または疾患、血液により運ばれる酸素量を減少させる症候または疾患、あるいは血液中の酸素運搬細胞の数を減少せる症候または疾患によるものでもよい。関連する可能性がある症候および疾患として、凝血および塞栓、嚢胞、増殖、腫瘍、貧血（鎌状赤血球貧血など）、血友病、これ以外の血液凝固に関連する疾患（フォンウィルブランドまたはＩＴＰ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａなど）およびアテローム性動脈硬化が挙げられるが、これに限定されるものではない。そうした症候および疾患は、傷害、疾患または症候が原因で本質的に生命体の細胞または組織に低酸素または無酸素状態をきたすものも含む。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、出血性ショックを起こしている生物学的物質の傷害または損傷を防止してその物質の生存性を向上させる方法であって、出血性ショックの危険性があるまたはその状態にある生物学的物質を、有効量の液体カルコゲナイド組成物とできる限り速やかに、理想的には傷害から１時間以内に接触させることを含む、方法を提供する。この方法を用いれば、患者を管理された環境（手術など）へ搬送することができ、傷害の当初の原因に対処し、その後患者を管理された方法で正常な機能に戻すことが可能になる。この適応症の場合、傷害後の１時間は「ゴールデンアワー」と呼ばれ、成功を収めるうえで決定的に重要である。
【０１４８】
様々な他の実施形態では、本発明の方法を、虚血または低酸素に伴う神経変性疾患の処置、低体温の処置、過剰増殖性障害の処置および免疫障害の処置に用いてもよい。他の様々な実施形態では、生物学的症候は、神経疾患、循環器疾患、代謝疾患、感染症、肺疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患および免疫関連疾患のいずれか１つまたはこれらの組み合わせである。
【０１４９】
ある実施形態では、本発明の方法を用いて、たとえば、単離された細胞、組織および器官など、低酸素または虚血状態にさられたエキソビボの生物物質の生存性を向上させる。そうしたエキソビボの生物学的物質の具体的な例として、血小板および他の血液製剤ならびに移植される組織および器官が挙げられる。
【０１５０】
一実施形態では、たとえば、低温保存および保存の過程で細胞株または実験用生命体を意図的に低酸素または虚血状態にさらす場合など、実験室または調査の状況で本発明の方法を用いて生物学的物質の生存性を向上させる。たとえば、細胞、組織または器官を、本発明の液体カルコゲナイド組成物の存在下で保存または輸送してもよい。本発明の方法を用いて提供組織および器官の生存性を高め、それにより提供組織を移植患者に移植してから血流を回復させるまでの時間を引き延ばしてもよい。こうした方法は、他の保存剤および酸素灌流の使用など現在の保存方法と併用してもよい。本発明は、血小板（特定の実施形態では、無酸素環境で保存された血小板を含む）の生存性を高める方法であって、保存過程で血小板を有効量の液体カルコゲナイド組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【０１５１】
さらに、本発明は、非生存の生物学的物質の保存と、非生物学的物質の保存またはその有効期間の延長のための方法および組成物も提供する。こうした方法は、非生存の生物物質または非生物学的物質を液体カルコゲナイド組成物と接触させることを含む。
【０１５２】
ある実施形態では、または生物学的物質に与える有効な化合物の量は、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍｇ、ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｍ２あるいはそこから導き出せる任意の範囲であってもよい。あるいは、その量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲で表してもよい。
【０１５３】
本発明の種々の実施形態では、生物学的物質を本発明の液体医薬組成物に、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約３０秒間、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、１、２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上およびその任意の範囲または任意の組み合わせで曝露する。
【０１５４】
さらに、投与が静脈内である場合、以下のパラメーターを適用してもよいことを意図している。約、少なくとも約あるいは多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００滴／分またはμ滴／分あるいはそこから導き出せる任意の範囲の流量。いくつかの実施形態では、溶液の量を、液体カルコゲナイド組成物の濃度に応じて体積で規定する。時間の量は、約、少なくとも約あるいは多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、１、２、３、４、５、６、７日間、１、２、３、４、５週間および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月あるいはそこから導き出せる任意の範囲であってもよい。
【０１５５】
全体としてまたは単一セッションで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍｌもしくはリットルまたはその任意の範囲の量を投与してもよい。
【０１５６】
以下に限定されるものではないが、本明細書で言及した、および／または出願データシートに列挙した上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物についてはすべて、その全体を参考として本明細書に援用する。
【０１５７】
（実施例１）
液体医薬組成物Ｉ〜ＩＶの方法および製造
４つのカルコゲナイド液体医薬組成物を下記のように調製した。
【０１５８】
脱酸素水を用いて原液を調製した。脱酸素水については、空気を真空除去し、圧縮窒素（９９．９９％）で３０分間溶解して酸素を除去した。２．５ＭのＮａ２Ｓの飽和原液を、無酸素の脱イオン蒸留水ですすいだＮａ２Ｓ＊９Ｈ２Ｏ結晶（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ＃５４２５）から調製した。この原液をしっかりとシールし遮光して保存した。ＨＣｌの２２０ｍＭの原液については、濃酸（ＦＩＳＨＥＲ＃Ａ１４４−２１２）を希釈して調製し、圧縮窒素で溶解することで酸素を除去した。
【０１５９】
無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で液体医薬組成物を調製した。ｐＨメーター、バブラーおよびスターラー付きの反応器をグローブボックス内に置いた。グローブボックス内の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。本発明の液体医薬組成物の調製方法は、医薬組成物の製造および保存の各局面で酸素含有量を制限し、酸素が医薬組成物中で０μＭ〜５μＭの範囲で測定されるものである。
【０１６０】
液体医薬組成物を、各口に以下の特徴を持つ摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコ（Ｗｉｌｍａｄ Ｌａｂｓ）で調製した：
ａ）中央オリフィスとｏリングのあるプラスチックキャップが付いた汎用アダプター。このアダプターにｐＨプローブを装着しＯリングでシールした。
【０１６１】
ｂ）ホース継手と中央オリフィスおよびＯリングのあるプラスチックキャップとが付いた汎用アダプター。このアダプターに、ガラスフリットを用いてガス分散チューブを装着した。分散チューブを圧縮ガスボンベに連結し、このチューブを用い圧縮窒素で溶解して溶液から酸素を除去し、Ｈ２Ｓと窒素の混合物でｐＨを中和した。ホース継手にプラスチックチューブを装着し圧力を逃がした。これらの２つの連結を逆にして窒素陽圧下でフラスコの内容物を分注した。
【０１６２】
ｃ）第３の口を摺り合わせの栓でシールし、これを用いてＮａ２Ｓ溶液または水をフラスコに加えた。
【０１６３】
１．液体医薬組成物Ｉ−Ｎａ２Ｓ九水和物
液体医薬組成物Ｉを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素の脱イオン蒸留水を三つ口フラスコに加え、撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１６４】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて２００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１６５】
ｃ）２００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を、撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１６６】
ｄ）２２０ｍＭのＨＣｌを、圧縮窒素で溶解し撹拌しながら、最終ｐＨが７．８〜８．０になるまで加えた。
【０１６７】
ｅ）脱酸素脱イオン水を加えて最終濃度１００ｍＭのＮａ２Ｓを得た。
【０１６８】
２．液体医薬組成物ＩＩ−Ｎａ２Ｓ九水和物
液体医薬組成物ＩＩを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素脱イオン水を三つ口フラスコに加え、撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１６９】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１７０】
ｃ）１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１７１】
ｄ）この溶液を、ｐＨが７．８になるまで圧縮窒素とＣＯ２との５０／５０混合物（９９．９％）でバブリングした。
【０１７２】
３．液体医薬組成物ＩＩＩ−Ｈ２Ｓおよび窒素を含むＮａ２Ｓ
液体医薬組成物ＩＩＩを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素脱イオン水を、三つ口フラスコに加え撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１７３】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１７４】
ｃ）１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を、撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１７５】
ｄ）この溶液を、ｐＨが８．２になるまで圧縮窒素とＨ２Ｓの５０／５０混合物でバブリングした。この結果、最終濃度が９０ｍＭのスルフィドを得た。
【０１７６】
４．液体医薬組成物ＩＶ−Ｈ２Ｓ
液体医薬組成物ＩＶの最終スルフィド濃度をＮａＯＨの初濃度により判定した。液体医薬組成物ＩＶを以下のステップで調製した：
ａ）５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲の溶液に溶かしたＮａＯＨを添加剤（ＤＴＰＡ、酸化防止剤）と一緒に三つ口フラスコに加えた（図１。）
ｂ）撹拌しながらアルゴンにて５ｐｓｉで１５分間バブリングして、この溶液から酸素を除去した。
【０１７７】
ｃ）この溶液にＨ２Ｓを、ｐＨが７．７（または７．６〜７．８の範囲）に低下するまで撹拌しながらバブリングした。
【０１７８】
ｄ）フラスコのヘッドスペースにアルゴンを流した。
【０１７９】
ｅ）褐色の分注ビンまたはバイアルを、アルゴンが常時流されるグローブボックス内に置き、各ビンまたはバイアルにアルゴンを流した。
【０１８０】
ｆ）製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）をアルゴン下で分注して無酸素環境を維持した。
【０１８１】
この溶液の安定性を、スルフィド濃度、ｐＨおよび吸光度スペクトル（ポリスルフィド形成）を測定してモニターした。追加のアッセイを行い、スルフィット、スルファート、チオスルファートおよび硫黄元素を含む酸化生成物をモニターした。
【０１８２】
窒素陽圧下の密封グローブボックス内で三つ口フラスコから液体医薬組成物を分注した。琥珀色バイアルまたは褐色ビンを不活性アルゴンまたは窒素雰囲気で若干強い圧力で満たし、液体医薬組成物の酸化分解を防止／遅延し、クラウンキャップクリンパー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｚ１１２９７６）を用いてテフロン（登録商標）／シリコンライナー付きプラスチックキャップまたは中央テフロン（登録商標）ライナー付きのシリコンセプタム付きプラスチックキャップでシールし、密閉した。
【０１８３】
（実施例２）
カルコゲナイド液体医薬組成物を無酸素環境で製造すると、スルフィドが安定し、スルフィドの酸素化生成物が減少する
スルフィドが酸素に触れると、図１および図２に示すような種々の酸化生成物が生成される。（以下を参照：Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９７２），ｐ．５２９−５３７；Ｋｏｔｒｏｎａｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２），ｐ．２４２０−２４２８；Ｂｅａｕｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９８４）；ｐ．２５−９７）
無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で製造したときの液体医薬組成物ＩＶの３つの製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）における安定性を検査した。この研究では、グローブボックス内および溶液中の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。液体医薬組成物を実施例１に記載されているように調製した。
【０１８４】
（１）９７ｍＭ、ｐＨ７．６２、２７３ｍＯｓｍ；（２）９８ｍＭ、ｐＨ７．７１、２９１ｍＯｓｍおよび（３）９８ｍＭ、ｐＨ７．７５、２７６ｍＯｓｍなど、液体医薬組成物ＩＶの３つの調製物を調製した。そこの組成物を検査し、無酸素環境で調製するとスルフィドの安定性が向上し、測定可能な酸化生成物が減少するかどうか判定した。液体医薬組成物を、窒素ガスを流してボックス内の酸素含有量を最低限（０．０２μＭ）に抑えた密封グローブボックス内の反応装置で製造した。非経口液体医薬組成物のスルフィドのレベルおよび酸化生成物（ポリスルフィド、スルフィット、チオスルファート、スルファートおよび未知のピーク）を１２９日間にわたって解析した。
【０１８５】
スルフィドをイオン選択電気化学（ＩＳＥ：Ｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で測定した。イオン選択電気化学（ＩＳＥ）は、イオン種を測定する手法である。その電極は、イオンが膜の表面に結合する、イオン種特異的な膜を含んでいた。膜に結合したイオンの量から、溶液中のイオン濃度によって異なる電位差を確認した。スルフィドのレベルは、測定期間にわたり対照に対して１００％の状態が続いた（図３）。
【０１８６】
スルフィット、チオスルファートおよびスルファートについては、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ：Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に解析した。イオン種の解析のためイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）を用いて、二相系におけるサンプル成分のマイグレーションの違いを測定した。固定相との相互作用が弱かったサンプル成分は、カラムで費やす時間が短くなる。イオンが注入から検出までカラムで費やす時間は保持時間と呼ばれ、成分確認の尺度となるのに対し、ピークの高さまたは面積は、成分濃度の尺度となる。このアッセイでのスルファートの検出上限は＜０．０８％であり、潜在的なスルファート値の範囲は、０％〜＜０．０８％と考えられた。ポリスルフィドについては、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘにて３７０ｎＭで測定し、蒸留水Ｈ２Ｏと比較した（以下を参照：Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｗｉｌｅｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７７，ｐ．１１１４−１１２０；Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｍ．Ｒ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７９，ｐ．１４０６−１４１４；Ｔｏｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｏｌｏｇｙ．１９９７，ｐ．９３−１０３；Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７２，ｐ．５２９−５３７；Ｋｏｔｒｏｎａｒｏｕ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９２，ｐ．２４２０−２４２８）。検出された酸化生成物の量を図５Ａに示す。
【０１８７】
（実施例３）
ＤＴＰＡの存在下または非存在下でのポリスルフィド形成で測定される液体医薬組成物ＩＶの安定性
合成キレート剤でスルフィドの液体医薬組成物の安定性を高められるかどうかを調べた。２つの液体医薬組成物（液体医薬組成物ＩＶ）を、無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で調製した。液体カルコゲナイド組成物を、ｐＨ測定用、ガス添加用アクセスポートと外部雰囲気と接触させずに分注することができるポートとがある、液体カルコゲナイド組成物を保持する摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコ（入れ物）を含む密封容器内で製造した。入れ物に窒素ガスまたはアルゴンガスを流し、酸素含有量を最小限に抑えた。これらの医薬組成物の最終スルフィド濃度をＮａＯＨの初濃度により判定した。
【０１８８】
ＮａＯＨ溶液を、添加剤を一切使用せずに、あるいは安定性を高めるためＤＴＰＡを用いて三つ口フラスコに入れた。どちらの製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）にもＮａＣｌを含ませ浸透圧モル濃度のバランスを取り、撹拌しながらアルゴンにて５ｐｓｉで１５分間溶解して溶液から酸素を除去した。グローブボックス内の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。検査対象の液体医薬組成物、９７ｍＭのスルフィドＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）を、合成キレート剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（１ｍＭ）を使用してあるいは使用せずに作製した。スルフィドおよびポリスルフィドのレベルを、０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）を用いてピーク吸光度３７０ｎｍで測定値した。図４に示すように、１ｍＭのＤＴＰＡが存在した場合、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）におけるスルフィドの安定性が１２９日目に向上した。
【０１８９】
酸化生成物のスルフィット（ｕＭ）、スルファート（ｕＭ）、チオスルファート（ｕＭ）および３７分で測定された未知の生成物（Ｕ）を１２９日目に測定した。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、１ｍＭのＤＴＰＡが存在した場合、酸化生成物のレベルが１２９日目に低下した。１２９日間の終了時に測定されるポリスルフィド形成は、全スルフィド濃度に対して０．０３％未満である。
【０１９０】
（実施例４）
スルフィドの液体医薬組成物におけるｐＨは安定している
硫化水素は、弱い二塩基酸であり、溶液中で３つの形（Ｈ２Ｓ、ＨＳ−およびＳ２−）で存在している。溶液中の硫黄種の割合は、ｐＨによって異なる。ｐＨ７では、ＨＳ−が主要な種である。ｐＨ７未満ではＨ２Ｓが支配的な種となる（以下を参照：Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＤＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７７，ｐ．１１１４−１１２０）。
【０１９１】
液体医薬組成物ＩＶにおけるスルフィドの製剤安定性を検査するため、１２９日間の特定の時点でｐＨを測定した。１００ｍＭのスルフィドＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）の液体医薬組成物を、窒素ガスを流してボックス内の酸素含有量を最低限（測定値０．０２μＭ未満）に抑えた密封グローブボックス内の反応装置で製造した。ｐＨメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてｐＨを、０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に測定した。ｐＨは、平均値が７．６８±０．０４（平均と標準偏差）と１２９日間にわたって安定していた（図６）。
【０１９２】
商業的に許容可能な様々な温度および期間で保存した後、濃度、ｐＨおよび重量オスモル濃度など、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ：Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の許容基準に適合した硫化ナトリウムの液体医薬組成物を調製した。
【０１９３】
（実施例５）
液体医薬組成物ＩＶの投与後のラット尿におけるスルフィドおよび酸化生成物の検出
齧歯動物を用いて尿中のスルフィド酸化生成物の代謝プロファイルを測定した。ラットの尿における酸化生成物のチオスルファートおよびスルファートのレベルを測定し、その後、液体医薬組成物ＩＶ（９８ｍＭのスルフィド、ｐＨ７．６５、２９３ｍ／Ｏｓｍｏｌ）を静脈内ボーラス投与した。
【０１９４】
１０〜１１週の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０グラム）（Ｔａｃｏｎｉｃ），Ｐｒｕｎｅｄａｌｅ，カリフォルニア州）を麻酔（１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）し、２つの頸静脈カテーテル（ＪＶＣ：ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ ｃａｔｈｅｔｅｒ）および尿道カニューレを埋植した。実験の期間中、麻酔を維持した。液体医薬組成物ＩＶ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のボーラス投与量を、頸静脈カテーテルを介して注射した。実験の期間中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、インフュージョンポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて３ｍＬ／時間の速度で注入した。注射前（時＝０）および投与後６０分まで１５分間隔で尿サンプルを採取し、解析のため４℃で保存した。
【０１９５】
尿中のチオスルファートおよびスルファートのレベルを、イオンクロマトグラフィー（Ｍｅｔｒｏｓｅｐ Ａ ｓｕｐｐ５カラムを備えたＭｅｔｒｏｈｍ ＡＧ８６１ ＩＣ）により解析した。尿サンプルをＩＣ溶離液（３．２ｍＭの炭酸ナトリウム／１．０ｍＭの炭酸水素ナトリウム）で１：２０に希釈した。６０分後に排泄されたチオスルファートのレベルは、３００μＭに上昇した（図７Ａ）。排泄されたスルファートのレベルは、６０分間にわたり平均２２±３ｍＭであった（図７Ｂ）。これらのデータから、スルフィド酸化生成物のチオスルファートおよびスルファートが尿中に排泄され、イオンクロマトグラフィーで検出可能であることが示される。
【０１９６】
（実施例６）
液体医薬組成物ＩＶの投与後のラット血中におけるスルフィドおよびチオスルファートの検出
液体医薬組成物ＩＶの静脈内ボーラス投与後に誘導体化法およびＧＣ−ＭＳ解析を用いて、ラット血中のスルフィドおよびチオスルファートのレベルを測定した。
【０１９７】
頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）および頸動脈カニューレ（ＣＡＣ：ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｃａｎｎｕｌａ）を挿入した１０〜１１週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット３匹（３２６〜３５０）グラム（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｐｒｕｎｅｄａｌｅ，ＣＡ）を用いた。この動物を、実験手順を開始する前の５〜６日間、温度と湿度が制御された環境で回復および馴化させた。食物および水を自由に与えた。
【０１９８】
各ラットからベースライン血液サンプル（約０．３ｍｌ）を、頸動脈カニューレを介して２３ｇのルアースタブアダプターを装着したヘパリンコーティング１ｍｌシリンジに採取した。サンプリング後、対応する量の食塩水を、続いて１００μｌのヘパリン溶液（ヘパリン加デキストロース５０ＩＵ／ｍｌ）を、頸動脈カニューレを介して動物にゆっくりと注射した。ボーラス投与量（１ｍｇ／ｋｇ 静脈内）の液体医薬組成物ＩＶ（９８ｍＭのスルフィド、ｐＨ７．６５、２９３ｍＯｓｍ）を、頸静脈カテーテルを介して注射した。頸動脈カテーテルによる投与後、２３ｇのルアースタブアダプターを装着したヘパリンコーティング１ｍＬシリンジを用いて血液（約０．３ｍＬ）をすぐに採取した。記載の通り血液サンプルをすぐに処理した。サンプリング後、対応する量の食塩水を、頸動脈カテーテルを介して動物にゆっくりと注射した。血液サンプリングを注射後１０分、３０分、６０分、２時間および４時間後に繰り返した。
【０１９９】
０．２ｍｌのラット血液をシリンジで採取し、５％ＮａＣｌ、２００ｍＭのアスコルビン酸（新たに調製）、２０ｍＭのペンタフルオロベンジルブロミド（ＰＦＢＢｒ：ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌｂｒｏｍｉｄｅ）のアセトン溶液を含む９ｍｌの琥珀色バイアルにすぐに加えた。調製物をスクリューキャップ（ＰＴＦＥ被覆セプタム付き）で閉じ、１分間ボルテックスした。この混合物を１５分インキュベートさせ、次いで各バイアルに、無酸素の四ホウ酸ナトリウム飽和水に溶かした５ｍＭのテトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド溶液、酢酸エチルに溶かした２５ｍＭのヨウ素溶液、酢酸エチルに溶かした５０ｍＭのペンタフルオロベンジルブロミド溶液に加えた。この調製物を３０秒間ボルテックスし、次いで５分間インキュベートした。次に１００ｍｇのリン酸二水素カリウムを加え、この溶液を３０秒ボルテックスした。次にこの溶液を１時間インキュベートし、反応を終了させ、その後、２５００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清（有機相）を除去し、ＧＣ／ＭＳによる解析のため完全に乾燥させた。（Ｋａｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）３３：２１７；Ｋａｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９１）１５：１４８）．
これらの結果から、ＰＦＢ−Ｂｒ誘導体化法を用いて、ボーラス投与量の液体医薬組成物ＩＶを静脈内注射したラットの血中でスルフィドおよびチオスルファートを同時に検出することができることが示される（図８Ａおよび図８Ｂ）。２４０分間の研究期間にわたりスルフィドのレベルを血液から収集し、最高血中濃度には１０分で到達した（図８Ｂ）。
【０２００】
（実施例７）
液体医薬組成物は低酸素状態での生存を向上させる
ガス状Ｈ２Ｓによる処置は、低酸素状態での動物の生存能力を向上させることが明らかになっている。しかしながら、直ちに生命を脅かす傷害が遠隔地で生じた場合など、一定の環境下では、カルコゲナイド液体医薬組成物で患者を処置できれば非常に都合がよい。実施例Ｉに記載されているように液体スルフィド組成物を調製し、低酸素環境での動物の生存能力を向上できるどうかを検査した。
【０２０１】
実験の一セットでは、頸静脈にカテーテル（ＪＶＣ）を埋め込んだ雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５〜６週齢）（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて、この動物に１ｍＬまたは５ｍＬのルアーロックシリンジＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）で液体スルフィド液体医薬組成物を注入して３種類の液体医薬組成物を検査した。Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＤＳ）社製のＩＰＴＴ−３００トランスポンダーを用いて体温をモニターした。実験の少なくとも２４時間前にトランスポンダーを動物の背部に皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。トランスポンダーを介してＢＭＤＳ社製のＤＡＳ−６００８データ収集モジュールでマウスの体温を記録し、データをコンピュータースプレッドシートに入力し、時間に対してプロットした。
【０２０２】
インフュージョンポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により留置カテーテルを介して液体医薬組成物を各マウスに投与した。皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまでマウスに注入した。体温が３３℃まで低下する前にマウスが苦痛の徴候を示した場合、注入を１０分間停止し、前の速度よりも遅い速度で再開した。動物の体温が３３℃以下に低下したら、注入を停止し、マウスを低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に移した。
【０２０３】
第１の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＪＶＣ０７）にｐＨ７．７５の液体Ｎａ２Ｓ溶液（液体医薬組成物Ｉ）を注入した。この例の液体医薬組成物Ｉの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を脱酸素脱イオンＨ２Ｏで濃度４３ｍＭに希釈し、ｐＨのモニタリングと、ほとんど空気接触のないガス添加とが可能な摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコで３０分間撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解することにより、この溶液から酸素を除去して行った。溶液のｐＨをＮ２で溶解し撹拌しながら、２２０ｍＭのＨＣｌを用いて７．７５に調整した。最終溶液（液体医薬組成物Ｉ）をアルゴン下で琥珀色バイアルに分注してヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。液体医薬組成物Ｉの調製に使用したＮａ２Ｓの飽和原液それ自体は、脱酸素脱イオンＨ２Ｏ１ミリリットル当たり約１．０ｇの洗浄Ｎａ２Ｓ結晶を溶解して調製し、この原液を遮光し、密栓して保存しておいた。
【０２０４】
マウスに０．８ｍＭ／ｋｇのＨ２Ｓ液体医薬組成物Ｉを、皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまで注入速度６．４μＬ／分で６０分間にわたって有効用量にて注入した（図９）。次いで注入を停止し、１分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。１時間後、マウスを低酸素チャンバーから取り出し、ケージに収容し、モニターした。マウスは、処置後に苦痛の徴候をまったく示さなかった。これに対し、対照ビヒクルで処置したマウスは、死亡した（図１０）。
【０２０５】
第２の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＣＡＴ０８）に、ｐＨ８．２のＮａ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＩ）を注入した。液体医薬組成物ＩＩの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を脱酸素脱イオンＨ２Ｏで濃度４１ｍＭに希釈し、摺り合わせ備品（ｇｒｏｕｎｄ ｆｉｔｔｉｎｇｓ）付きの三つ口フラスコで３０分間撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解することにより、この溶液から酸素を除去して行った。ＮａＣｌを加えて、この溶液の最終浸透圧モル濃度を３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌに調整した。Ｎ２およびＣＯ２の５０／５０混合物で溶解してｐＨを調整した。最終溶液（液体医薬組成物ＩＩ）をできるだけ空気に触れないように琥珀色バイアルまたはビンに分注し、ヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。
【０２０６】
マウスに最初の注入速度８μＬ／分で６２分間注入を行った。３０分の注入後、苦痛の徴候が観察されたため注入を４μＬ／分に減らした。４μＬ／分で１２分間注入後、体温が３３℃に下がるまで注入速度を６μＬ／分に上げた。注入を停止し、５分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。マウスは、低酸素雰囲気で６０分間生存した。
【０２０７】
第３の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＪＶＣ０３）にＮａ２Ｓ（Ｈ２Ｓおよび窒素で緩衝処理）の液体Ｐ医薬組成物ＩＩＩ（ｐＨ８．３５）を注入した。この例では、液体医薬組成物ＩＩＩの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を６５ｍＭに希釈し、摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコで３０分撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解してこの希釈溶液から酸素を除去し、Ｎ２およびＨ２Ｓの５０／５０混合物で溶解することでｐＨを調整して行った。最終溶液（液体医薬組成物ＩＩＩ）をできるだけ空気に触れないように琥珀色バイアルまたはビンに分注し、ヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。
【０２０８】
マウスにＮａ２Ｓ（Ｈ２Ｓおよび窒素で緩衝処理）液体医薬組成物ＩＩＩを注入速度４．３μＬ／分で６０分間にわたり注入した。体温が３３℃まで低下したとき注入を停止し、１分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。マウスは、４．０％低酸素で５３分生存した。
【０２０９】
マウスを液体Ｈ２Ｓで処置したときに得られた結果と対照的に、ビヒクルを注入（１０μＬ／分）した対照（未処置）雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（平均体重２２グラム）は、４．０％Ｏ２でわずか平均７分しか生存せず、体温の低下は平均でわずか０．０６±０．３８℃にとどまった。
【０２１０】
別の実験では、実験化合物の処置をまったく受けたことがないカニューレ挿入雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＲＪＶＣ４０）（３１０グラム、Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて、ｐＨ７．９の液体医薬組成物（５０ｍＭのＨ２Ｓ）（液体医薬組成物ＩＶ）の保護作用を検査した。この動物に血管内留置カテーテルを外科的に埋植し、任意の手順の前にストレスおよび疾患の徴候について調べた。手順の前に動物の体重を測定し、体重をケージカードに記載した。Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＤＳ）社製のＩＰＴＴ−３００トランスポンダーを用いて体温をモニターした。実験の少なくとも２４時間前にトランスポンダーを動物の背部に皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。トランスポンダーを介してＢＭＤＳ社製のＤＡＳ−６００８データ収集モジュールでマウスの体温を記録し、データをコンピュータースプレッドシートに入力し、時間に対してプロットした。
【０２１１】
苦痛の徴候および皮下に埋植したＩＰＴＴ−３００トランスポンダーで測定した体温の低下をモニターしながら、ラットに、インフュージョンポンプ（Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により留置カテーテルを介してｐＨ７．９の５０ｍＭのＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）を２８３分間にわたり注入した。開始の注入速度は６．５μＬ／分で、皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまで１５分ごとに６．５μＬ／分ずつ上昇させた。動物が苦痛の徴候を示した際、注入を１０分間停止し、前の速度よりも遅い１３．０μＬ／分速度で再開した。体温が３３℃まで低下したとき注入を停止し、８分以内にこの動物を低酸素雰囲気（３．５％Ｏ２）に置いた。動物は３２分間生存した。低酸素チャンバー内で測定した体温は２．５℃低下した。
【０２１２】
４匹（未処置）の雄性ＳＤラット（平均体重３４２グラム；ハーラン（Ｈａｒｌａｎ））の対照群は、３．５％Ｏ２で平均１５±４分生存し、体温は平均１．６±０．２℃低下した。
【０２１３】
これらの実験から、硫化水素の液体医薬組成物には、低酸素状態で動物の生存能力を向上させる保護作用があることが確認される。さらに、この結果からは、Ｈ２Ｓの液体医薬組成物の投与は、たとえば、傷害または疾患により誘発される低酸素または虚血状態にある患者、あるいはその危険性がある患者にとって有益であり、生物学的物質を低酸素傷害または虚血傷害から保護し、これを防ぐ手段となることも確認される。
【０２１４】
（実施例８）
スルフィドの液体医薬組成物は、マウスの肝虚血再灌流障害モデルにおいて肝傷害からの細胞保護効果をもたらす
マウスの肝虚血再灌流（Ｉ／Ｒ：ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に細胞保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、肝虚血後および５時間の再灌流期間の直前に液体医薬組成物ＩＶ（スルフィド、９５ｍＭ、ｐＨ７．９２）を腹腔内ボーラス投与すると、血清中で測定される肝トランスアミナーゼのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が減少し、病理組織スコアが改善することが証明される。一方、ビヒクルで処置しても、肝Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２１５】
これらの研究で用いたマウスは、８〜１０週のＣ５７−ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）であった。食物および水を自由に与えた。実験手順を開始する前に温度および湿度が管理された環境で被検動物を馴化させた。
【０２１６】
マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔し、外科的手技の過程で加温を維持し、肝虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を誘導した。具体的には、正中切開し、肝臓を露出させ、ヘパリンを注射し、血液凝固を防止した。肝動脈と門脈をともに微小動脈瘤鉗子でクランプし、肝臓の左側葉および中葉を虚血状態にした。肝臓を腹膜腔内の元の位置に維持して４５分間虚血を行い、０．９％生理食塩水に浸したガーゼで湿性を保った。対照マウスにはシャム手術を行ったが、微小動脈瘤鉗子で肝血流量を減少させなかった。４５分後、微小動脈瘤鉗子を除去した。５時間の肝再灌流後に分光光度法および市販されている試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて血清中の肝トランスアミナーゼのレベル（ＡＳＴまたはＡＬＴ）を検査した。
【０２１７】
マウスの肝虚血再灌流障害被検動物を無作為に４群に割り付けた。群１はビヒクル処置；群２は０．３ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；群３は１．０ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置および群４は３．０ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置であった。図１１に示すように、ＡＳＴのレベルは、検査対象の最高濃度（３．０ｍｇ／ｋｇ）で統計学的に有意な低下が認められた。３つの処置群（０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）でビヒクルと比較してＡＬＴのレベルが低下した。
【０２１８】
（実施例９）
スルフィドの液体医薬組成物は、マウスの心筋虚血再灌流モデルにおいて心保護効果をもたらす
マウスの心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、虚血後および２４時間の再灌流期間の５分前に液体医薬組成物ＩＶ（９５ｍＭ、ｐＨ７．６５）を左心室腔にボーラス投与すると、危険領域に占める割合で心筋虚血が減少し、心筋梗塞サイズが縮小したことが明らかにされる。関連研究では、研究開始の２４時間前に液体医薬組成物ＩＶをプレコンディショニングボーラス投与量で投与すると、心筋梗塞サイズ（危険領域に占める割合）（心筋梗塞）が有意に縮小した（図１６）。一方、ビヒクルで処置しても、心筋Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２１９】
これらの研究で用いたマウスは、８〜１０週のＣ５７−ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）であった。食物および水を自由に与えた。実験手順を開始する前に温度および湿度が管理された環境で被検動物を馴化させた。
【０２２０】
マウスをケタミンおよびペントバルビタールナトリウムで麻酔し、外科的手技の過程で加温を維持し、心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を誘導した。マウスを手術台に腹側で置き、経口挿管し、モデル６８３齧歯動物用人工呼吸器に接続した（一回換気量は２．２ｍＬ、呼吸数は毎分１２２回、人工呼吸器サイドポート経由で１００％酸素を補給。）（Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。胸部を開き、近位左主冠動脈を露出させ、結紮した。心筋および冠動脈閉塞を３０分間維持し、続いて縫合糸を除去し、２４時間再灌流した。
【０２２１】
虚血後の再灌流から２４時間後、マウスを麻酔し、挿管し、齧歯動物用人工呼吸器に接続した。エバンスブルー色素を、総頸動脈に通したカテーテルに注入した。胸骨正中切開を行い、左主冠動脈を前と同じ場所で再結紮した。エバンスブルー色素で可視化して虚血ゾーンを非虚血ゾーンと区別し、心臓を速やかに切除し、短軸に沿って連続的に切断して１ｍｍの５枚の切片とし、これを１．０％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃にて５分間インキュベートし、危険ゾーン内の生存心筋と非生存心筋を区別した。５枚の心筋スライス（１ｍｍ）をそれぞれ秤量し、サンプル内容を知らされていない観察者がコンピューター支援面積測定を用いて梗塞領域、危険領域（ＡＡＲ）および非虚血性左心室を評価した。左心室の危険領域（ＡＡＲ）および梗塞サイズの判定のすべての手順（以下を参照：Ｊｏｎｅｓ，ＳＰ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００４））．２８６：Ｈ２７６−Ｈ２８２）。
【０２２２】
データを、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアバージョン５．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて事後的なボンフェローニ分析により２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）で解析した。データを平均値±平均値の標準誤差として報告する。ｐ値が０．０５未満の場合に有意と見なした。
【０２２３】
マウスの心筋虚血再灌流モデル被検群の動物１０〜１３匹を以下の４つの処置群に無作為に割り付けた。群１：ビヒクル処置；群２：５０μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；群３：１００μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；および群４：５００μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置。この研究では、虚血の３０分および２４時間の再灌流期間の前に液体医薬組成物ＩＶ（９７ｍＭ、ｐＨ７．６５）を左心室腔にボーラス投与すると、５０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ用量投与処置群において危険領域に占める割合で心筋梗塞サイズが縮小した（図１２）。試験対象の最高濃度（５００μｇ／ｋｇ）で処置した動物４匹が生存した。ビヒクルでは心筋Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２２４】
第２の実験では、動物を手術および虚血の２４時間前に、ボーラス投与量の液体医薬組成物ＩＶで前処置（プレコンディショニング投与）した。液体（ｌｑｕｉｄ）医薬組成物で前処置（１００μｇ／ｋｇ）すると、梗塞サイズの有意な縮小が測定され、心筋壊死に対する保護作用が得られた（図１６）。
【０２２５】
（実施例１０）
大型哺乳動物において軽度の低体温を誘導するための、液体医薬組成物ＩＶの方法および使用
液体医薬組成物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶが齧歯動物の中核体温を抑制することはすでに証明されている（実施例７）。心停止においては、心臓手術時の患者の広範囲な虚血の神経保護剤として、さらに再灌流障害の軽減を目的として軽度の低体温誘導が用いられている（以下を参照：Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００３），１０８：１１８−１２１０）。この研究では、軽度の低体温モデルを用いて液体医薬組成物ＩＶが大型動物の体温を低下させるという仮説を確認した。液体医薬組成物ＩＶを雌性ブタの２つのコホートに６０分にわたり投与し、体温の変化率を経時的に測定した。
【０２２６】
雌性ブタ（２０〜２５ｋｇ）を収容し、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に記載されているように適切な管理を施した。温度を６１〜８１°Ｆおよび相対湿度を３０〜７０％に維持するように環境管理内容を設定した。明暗各１２時間周期として、部屋の換気回数を最低でも１０回／時間とした。
【０２２７】
ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２．０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを筋肉内（ＩＭ：ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ）投与して動物を麻酔した。次いで、すぐに各動物に挿管し、イソフルラン吸入剤（０．５〜２．５％）を用いて麻酔状態を維持した。吸入麻酔については、従量式レスピレーターまたは再呼吸装置により送達した。静脈内カテーテルを、乳酸加リンゲル液（１０ｍｌ／ｋｇ／時間）および任意の必要な救命救急薬（投与の薬剤、用量、経路および部位を手術ファイルに記述した）の投与のため頸静脈に留置した。イソフルラン濃度、酸素の割合、ＳａＯ２％、脈拍、呼吸数および毛細血管再充満時間を１５分ごとに手作業で記録した。血圧およびＥＫＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ）を、研究を通じてモニターした。中核体温については、中核体温を得るため動物の食道に挿入した食道温度プローブを用いてモニターした。
【０２２８】
動物５〜６匹の２つのコホートを記載のように麻酔した。ＥＫＧ、動脈圧および中核（腹部）温度を測定した。動物を３０分間のベースライン期間中麻酔状態に維持した。３０分間のベースライン期間後、被検ブタにリンゲル液と、別の静脈ラインを通じてビヒクルまたはリンゲル液と、別の静脈ラインを通じて液体医薬組成物ＩＶとを６０分間注入（２．５ｍｇ／ｋｇ／時間）した。動物を６０分間の注入期間中観察した。中核温度を１秒間隔で測定した。６０分間の注入の後、麻酔から回復前の４０分間動物を観察した。
【０２２９】
肝臓直下の腹部に配置した温度プローブから中核温度を記録した。ＰｏｗｅｒＬａｂデータ収集器具およびソフトウェアを用いてデータを直接コンピューターに取り込んだ。氷冷乳酸リンゲル液を１時間注入する過程で記録したデータポイントを、回帰分析のためＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにエクスポートした。
【０２３０】
全体の温度変化および変化速度（回帰直線勾配）について群平均を計算し、スチューデントのｔ検定で比較検討した。
【０２３１】
これらの実験から、ブタ（２０〜２５ｋｇ）では、液体医薬組成物ＩＶが低体温誘導処置により誘導される低体温の程度を高めることが確認される。液体医薬組成物ＩＶを投与すると、ビヒクルと比較して中核体温に統計学的に有意な変化が生じる（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。データによって、大型動物に低体温を誘導するうえで液体医薬組成物ＩＶが有効であることが明らかにされる。
【０２３２】
（実施例１１）
液体医薬組成物ＩＶはブタの心筋梗塞モデルにおいて局所虚血を減少させる
ブタの心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、虚血後（１２０分の再灌流期間の５分前に開始）に液体医薬組成物ＩＶ（１００ｍＭ、ｐＨ７．８０、２９２ｍＯｓｍ）のボーラス投与、続いて６０分の注入を左心室腔に行うと、危険領域に占める割合で心筋虚血が減少し、心筋梗塞サイズが縮小したことが明らかにされる。一方、ビヒクルで処置しても心筋Ｉ／Ｒ傷害モデルの保護効果はまったく得られなかった。
【０２３３】
動物を個別に収容した。食物および水を自由に与えた。実験はすべて、実験動物の管理と使用を規制する米国国立衛生研究所の指針に準じた。
【０２３４】
雌雄両性のブタ（３５〜４５ｋｇ）を塩酸ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で鎮静させ、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射で麻酔した。イソフルランからなる全身麻酔を、実験を通じて維持した。従量式ベンチレーターを用いて気管内挿管により換気（酸素４０％；一回換気量１０００ｍＬ；換気回数１２回／分；終末呼気陽圧３ｃｍ Ｈ２Ｏ；吸気時間と呼気時間の比１／２）を与えた。静脈アクセスおよびＩＶ注射のため右大腿静脈をカニューレ処置し、動脈血のサンプリングおよび動脈内圧のモニタリングのため右総または浅大腿動脈をカニューレ処置した。ヘパリンナトリウムおよび１％リドカインを開胸の前に投与した。ヘパリンを実験の終了時まで３０分ごとに投与した。胸骨正中切開により心嚢を露出させ、開放して心膜クレイドルを形成した。カテーテル付きマノメーターを心尖部から左心室（ＬＶ）に導入し、ＬＶ圧を記録した。血管を適切に露出させてから、左前下行枝またはその大きな対角枝の遠位１／３のあたりに血管ループを通した。血管ループを締めて冠動脈を閉塞させ、次いで、モスキート鉗子でクランプし安定させた。心筋表面の局所チアノーゼにより心筋虚血を視覚的に確認した。
【０２３５】
ブタを無作為に群分けし、４５分の局所虚血（閉塞）、続いて１２０分の再灌流を施した。動脈圧（収縮期圧、拡張期圧、平均血圧）、心拍数、局所的な短縮率（ＬＶ ｄＰ／ｄｔ）および心筋組織血流を、Ａｃｑｕｉｒｅ Ｐｌｕｓプロセッサーボードおよび左心室圧解析ソフトウェアおよびＧｏｕｌｄ ＥＣＧ／Ｂｉｏｔａｃｈを用いて実験を通じて連続的に取得した（ＰＯ−ＮＥ−ＭＡＨデジタルデータ収集システム，（Ｇｏｕｌｄ，Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｅｗ，ＯＨ）。液体医薬組成物ＩＶまたはビヒクルを、冠動脈鉗子を除去し始める５分前から投与し（ボーラス（１００ｍｃｇ／ｋｇ）および１ｍｇ／ｋｇ／時間注入）、再灌流期間中に６０分間注入を継続した。
【０２３６】
局所心筋機能を、虚血領域から約１０ｍｍ離れた心内膜下層に埋植した超音波プローブ（２．０ｍｍ）を用いてソノミクロメトリー（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，カナダ）で評価した。プローブについては、２対を心臓の短軸と平行に設置し、ポリプロピレンステッチ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＧ）で心外膜に取り付けた。実験の終了までプローブをそのままにしておいた。拡張末期ポイントおよび収縮末期ポイントを正確に識別するため、後処理ソフトウェア（ＳｏｎｏＶｉｅｗ，Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，カナダ）を用いてデジタルデータを点検した。正常洞調律の少なくとも３回の心周期において測定を行い、次いで平均した。呼吸の影響を排除するためデータ収集中はベンチレーターを停止させた。拡張末期セグメント長（ＥＤＬ：ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）を正のＬＶ ｄＰ／ｄｔの開始時に、収縮末期セグメント長（ＥＳＬ：ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）を負のｄＰ／ｄｔのピーク時に測定した。局所収縮性を局所心筋短縮率（ＳＳ：ｓｅｇｍｅｎｔ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）で評価した。壁運動異常を、拡張期終了後の心筋の隆起と定義される収縮期隆起（ＳＢ：ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｂｕｌｇｉｎｇ）として評価した。収縮期駆出後の短縮は、収縮後短縮（ＰＳＳ：ｐｏｓｔｓｙｓｔｏｌｉｃ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）である。ＳＳ率の経時的変化を４〜５つの特有の水平距離および／または垂直距離の平均値±平均値の標準誤差から算出し、ベースラインに対する比で表し、個々の動物間のばらつきを最小限に抑えた。ＳＳの経時的変化を平衡値に対する比で表し、個々の動物間のばらつきを最小限に抑えた。
【０２３７】
血液ガスおよびヘマトクリットを、１０〜１５分ごとにコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）２３８ｐＨ／血液ガスアナライザーおよびコーニング２７０ＣＯ−オキシメーターを用いてモニターした。血液ガスおよび酸塩基パラメーターをＰＯ２＞１００ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３±０．３；および温度３７℃に維持した。
【０２３８】
実験の終了後に関連する動脈を結紮してからモナストリルブルー色素を大動脈に注射して、虚血危険領域を明確にした。梗塞サイズを、トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）により判定し、危険領域に対する比で表した。危険領域および梗塞ゾーンの面積をコンピューター化された面積測定（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）で測定した。
【０２３９】
左心室の危険領域（虚血ゾーン）および非虚血領域（対照ゾーン）からの心筋組織サンプル（およそ０．５ｇ）は、心外膜、心筋および心内膜組織で構成され、各実験の終了時に採取して２つのサンプルに分けておいた。虚血ゾーンサンプルと非虚血ゾーンサンプルの確認については、モナストリルブルー色素を注射して行った。サンプルを急速凍結するか、必要に応じて包埋した。
【０２４０】
血液サンプルを採取し、遠心し、および／または氷上で保存した。ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて統計解析を行った。すべての変数の平均値±平均値の標準誤差を示す。統計学的有意性を、群を「被験者間」要因とし、時間を「対象内」要因として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）で判定した。ボンフェローニ補正を用いて個々の時点での平均効果について群間の事後比較を行い、検査の多重性を調整した。梗塞サイズにおける群間の統計的な差をＡＮＯＶＡで評価した。線形回帰分析を行い、各群における局所心筋短縮率、梗塞サイズおよび局所虚血時間の関係を判定した。群間の回帰直線の差を一般線形モデルを用いて比較検討した。さらに、顕著な非線形（たとえば、二次）効果についても一般線形モデルを用いて検査した。ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意と見なした。
【０２４１】
この研究では、４５分間の虚血および１２０分間の再灌流期間の５分前に液体医薬組成物ＩＶを左心室腔にボーラス投与し、続いて６０分間注入を行うことで、危険領域に占める割合で心筋梗塞サイズが縮小した（図１４）。心筋Ｉ／Ｒ傷害においてビヒクルの保護効果は、まったく得られなかった。
【０２４２】
（実施例１２）
液体医薬組成物ＩＶは、イヌにおける心肺バイパス後の心機能を保護する
現在まで、一般的な心臓手術の大部分は、心筋保護下の心停止により体外循環を用いて行われている。心機能不全が臨床的に明らかでない場合でも、圧−容積関係を用いたヒト研究に記載されているように心筋収縮力の低下が起こる可能性がある。さらに、術後合併症として冠血管内皮および末梢血管機能の傷害が見られる場合もある。さらに、体外循環は、放出されるフリーラジカルとの全身性の炎症反応を引き起こし、二次的な臓器傷害につながることも知られている。
【０２４３】
培養筋細胞、灌流心臓において、および心筋梗塞の齧歯動物モデルにおいて硫化水素が心保護作用を発揮し得るという証拠が得られつつある（たとえば、Ｐａｎ，ＴＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４０：１１９−３０（２００６）；Ｂｉａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１６：６７０−８（２００６）；Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０１：５３−６０（２００６）；ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：２６１−８（２００７）を参照）。スルフィドによる保護作用の機序として、細胞エネルギーの保存、炎症経路のダウンレギュレーション、酸化防止作用による細胞保護が挙げられる。本研究では、心肺バイパスのイヌモデルを用いてＨ２Ｓの液体医薬組成物の有望な心保護効果を検査し、この化合物が、臨床的に適切なバイパス手術モデルの心血管系機能に作用するかどうかを判定した。さらに、血管機能および心筋のエネルギー状態に対する硫化水素の作用も判定した。
【０２４４】
心停止（虚血；Ｓｚａｂｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２５：８２５−３２（２００４））の確立したモデルを用いてイヌの２つのコホートで心肺バイパス中にスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、各動物に９０分間心肺バイパス（ＣＢＰ：ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ）（３０分間ＣＢＰの後、６０分間の心停止）を行い、動脈流を回復させて６０分間再灌流を行った。心停止および再灌流の過程で液体医薬組成物ＩＶを注入すると、前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）で測定した心機能が保護された。一方、ビヒクルで処置しても、心停止（虚血）モデルの心保護効果はまったく得られなかった。
【０２４５】
イヌを２群に無作為に割り付け、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈおよび国立衛生研究所の指針に従って人道的なケアを行った。イヌにプロピオニルプロマジンを前投薬し、ペントバルビタールで麻酔し、臭化パンクロニウムで維持し、気管内に挿管した。換気については、室内空気とＯ２の混合物、換気回数１２〜１５回／分とし、毎分の一回換気量１５ｍｌ／ｋｇで開始した。動脈血炭酸ガス分圧のレベルを３５〜４０ｍｍＨｇに維持した。大腿動脈および大腿静脈をカニューレ処置し、大動脈圧（ＡｏＰ：ａｏｒｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を記録し、生化学解析のため血液サンプルを採取した。基本的に静脈内補液をリンゲル液で行った（１ｍｌ／分／ｋｇ）。補液は、カリウム、炭酸水素および過剰塩基の値に応じて塩化カリウムおよび炭酸水素ナトリウムの投与を含む（８．４％）。カテコールアミンも、他のホルモン物質または昇圧物質も投与しなかった。
【０２４６】
液体医薬組成物ＩＶ（１００ｍＭ、ｐＨ７．７１、２９２ｍＯｓｍ）あるいはビヒクルを含む被験物質を６０分間の心停止および６０分間の再灌流期間中に注入した（１ｍｇ／ｋｇ／時間注入）。
【０２４７】
左前側方開胸後、大血管を切除した。左鎖骨下動脈を動脈灌流のためカニューレ処置し、抗凝固を維持するためヘパリンを投与した。静脈カニューレを右心房に留置した。体外回路（バイパス）については、熱交換器、静脈血貯血槽、ローラーポンプおよび膜型人工肺で構成され、ヘパリンおよび炭酸水素ナトリウムと共に乳酸リンゲル液溶液で刺激した。心肺バイパス（ＣＰＢ）の開始後、動物の体温を２８℃まで冷やした。大動脈を遮断し、心臓を２５ｍｌ／ｋｇのＨＴＫ溶液（ｍｍｏｌ単位：１５ＮａＣｌ、９ＫＣＩ、４ＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、１８ヒスチジンヒドロクロリド一水和物、１８０ヒスチジン、２トリプトファン、３０マンニトール、０．０１５ＣａＣｌ２、１カリウム−水素−２−オキソペンタンジオアト、Ｈ２Ｏ）で停止させた。
【０２４８】
心停止／灌流の間、ポンプ流量を調整して灌流圧を３５〜４０ｍｍＨｇ超に維持した。復温をクランプから４０分後に開始し、心停止から６０分後に大動脈のクランプを外し、バイパス回路で心臓に血液を再灌流させた。必要に応じて、４０ＪのＤＣ（ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ）除細動で心室細動を抑えた。
【０２４９】
研究後、換気を１００％酸素で再開した。動脈遮断の解除から２０分後にすべての動物を、強心薬療法を用いずにＣＰＢから離脱させた。ＣＢＰ前および再灌流の６０分後に機能の測定を行い、記録した。さらに、実験終了時に高エネルギーリン酸の分析のため心筋プローブも回収した。
【０２５０】
左右心室の収縮期圧（ＬＶＥＳＰ：ｌｅｆｔ ｅｎｄ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）および拡張期圧（ＬＶＥＤＰ：Ｌｅｆｔ ｅｎｄ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）ならびに容積をそれぞれ、肺動脈を通る圧力−コンダクタンス複合カテーテルで測定した。一回拍出量（ＳＶ：ｓｔｒｏｋｅ ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。１ｍｌの高張食塩水を肺動脈または上大静脈に急速注射して並列コンダクタンスを推計した。大静脈を閉塞させて一連の圧−容積ループを得た。左右心室の収縮末期圧−容積関係および前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）の傾きおよび切片を、心筋収縮力の負荷非依存性指標として算出した。
【０２５１】
左前下行動脈の冠血流を、血管周囲の超音波流量プローブで測定した。アセチルコリン（ＡＣＨ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、１０−７Ｍ）を冠動脈内単回ボーラス投与した後、冠血管内皮依存性血管拡張を評価し、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ：ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ、１０−４Ｍ）を冠動脈内単回ボーラス投与した後、内皮非依存性血管拡張を評価した。血管反応をベースラインの冠血管抵抗に対する変化率で表した。
【０２５２】
心収縮機能を再灌流後の圧−容積ループ解析で測定した。ビヒクルあるいは液体医薬組成物ＩＶによる注入をＣＢＰから３０分後に開始し、実験の終了まで継続した（１ｍｇ／ｋｇ／時間の用量で合計２時間静脈内注入）。すべての動物に６０分間の心停止（虚血）および合計９０分間の心肺バイパスを施した。虚血に対応してビヒクルで処置した群では前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）が減少した。心停止および再灌流中の液体医薬組成物ＩＶの注入では、ベースラインと比較した前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）の変化で測定した心保護が確認された（図１５）。
【０２５３】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の含量を、酵素反応速度アッセイにより標準的な測光で評価した。さらに、単離した冠状動脈環で内皮依存性と非依存性の弛緩も調べた。インビボ実験の終了後、心臓を切除し、冠動脈を単離して、冷たい（＋４℃）Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（１１８ｍＭのＮａＣｌ、４，７ｍＭのＫＣｌ、１，２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１，２のｍＭｍｇＳＯ４、１，７７ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１，４ｍＭのグルコース；ｐＨ＝７，４）に浸した。冠動脈を、外膜周囲の脂肪および周囲の結合組織から調製および洗浄し、手術用顕微鏡を用いて横に切断し幅４ｍｍの環にした。単離した大動脈環を、３７℃のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液２５ｍｌを含み、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を通気させた別の器官槽（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のステンレス製フックに掛けた。調製中は、内皮を損傷しないように特に注意を払った。等尺性収縮を、アイソメトリックフォーストランスデューサー（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて記録し、ＩＯＸソフトウェアシステム（ＥＭＫＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｒｉｓ，フランス）を用いてデジタル化し、保存し、表示した。この環を２ｇの静止張力下に置き、６０分平衡処理した。Ｕ４６６１９（５×１０−７Ｍ）を用いて安定なプラトーに達するまで環を前接触させ、内皮依存性拡張物質アセチルコリン（ＡＣｈ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、１０−９〜１０−４Ｍ）および内皮非依存性拡張物質ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ：ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ、１０−１０〜１０−５Ｍ）を累積濃度で加えて弛緩反応を調べた。弛緩を、Ｕ４６６１９により誘導された収縮に対する比で表わす。
【０２５４】
心拍数（ＨＲ：ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ）、ＭＡＰ（ｍｅａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＣＯ（ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）
およびＣＢＦを表２に示す。処置群ではベースラインの心拍数がやや上昇したが、その他の点では差は認められなかった。ＭＡＰは、ＣＰＢ後に３群すべてで低下傾向を示したが、２つの処置群で有意であった（ｐ＜０．０５）。ＣＯは群間および経時的に大きな差を示さなかった。ＣＢＦは、ベースライン時に３群すべてで類似していた。ＣＰＢ後に対照群で大きく減少したのに対し、２つの処置群では変化がなかった。血行動態変数には群間および経時的に差がなかった。
【０２５５】
左心室機能に関するベースライン値に群間差はなかった。対照群ではＣＰＢ後、左心室ｄＰ／ｄｔとＰＲＳＷがともに有意に低下したが、Ｈ２Ｓにより一部回復した（図１５および図１７）。
【０２５６】
ＣＰＢ前のインビボでの内皮機能に差はなかった。ＣＰＢ後のアセチルコリンに対する反応は、対照群で有意に低下したが、Ｈ２Ｓにより一部消出した（図１９。）。ＳＮＰに対する反応については群間および経時的に差がなかった。
【０２５７】
アセチルコリン（ＡＣｈ）に前接触させた動脈環の内皮依存性の血管弛緩は、対照環（ＣＰＢを使用しない動物、過去の対照）と比較して有意に阻害され、Ｈ２Ｓ処置群では完全に防止された（図１９）。ＳＮＰ後の内皮依存性の血管弛緩には群間差はなかった。
【０２５８】
実験終了時に取得した心筋ＡＴＰの測定値は、硫化水素の存在下で対照ビヒクルと比較して有意に上昇した。一方、ＡＤＰおよびＡＭＰのレベルには変化がなかった（表３）。
【０２５９】
これらのデータから、大型動物モデルを用いた心肺バイパスでは、Ｈ２Ｓの液体製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で処置すると、心筋保護下の心停止後の虚血後心筋機能および内皮機能が改善することが明らかにされる。こうした有益な効果は、Ｈ２Ｓの酸化防止効果、抗炎症効果、血行動態効果および細胞保護効果あるいはこれらの組み合わせに起因する可能性がある。
【０２６０】
（実施例１３）
硫化水素は、大動脈閉塞による虚血再灌流障害に起因するＤＮＡの損傷を緩和する
胸部大動脈閉塞による虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の臨床的に適切なブタモデルを用いてＨ２ＳドナーであるＮａＨＳ注入の細胞保護効果を調べた。
【０２６１】
ＮａＨＳ（ｎ＝６；２ｍｇ／ｋｇ×時間、大動脈閉塞の２時間前に開始し、８時間の再灌流まで継続）あるいはビヒクル（ｎ＝６）のどちらかに無作為に割り付けた後、麻酔下で換気し装置を埋め込んだブタに、鎖骨下動脈すぐ下流および大動脈分岐上流に留置した膨張可能なバルーンを用いて３０分の大動脈閉塞を行った。大動脈閉塞中、平均動脈圧（ＭＡＰ）を、エスモロール、ニトログリセリンおよびＡＴＰの静脈内投与で閉塞前のレベルの８０〜１２０％に維持した。再灌流の初期にノルアドレナリンの持続静脈内投与を調節して、ＭＡＰがベースラインレベルの８０％を超えるように維持した。全血サンプルのＤＮＡの損傷を単細胞ゲル電気泳動（アルカリコメットアッセイ）で評価した。表４に示すデータは、中央値（範囲）であり、群内の差をフリードマンの順位によるＡＮＯＶＡで検査し、群間の差を対応のない順位和検定で検査した。
【０２６２】
ＮａＨＳ注入の結果、心拍数および心拍出量が有意に減少した。一方、血圧および一回拍出量は影響を受けなかった。ＮａＨＳにより、血行動態の目標値を達成するのに必要なノルアドレナリンの必要量が減少し、グルコース代謝回転が低下し、Ｉ／ＲによるＤＮＡの損傷が十分に抑制された（コメットアッセイのテールモーメント、＃ｐ＜０．０５対注入前、§ｐ＜０．０５対ビヒクル）。
【０２６３】
これらのデータから、Ｈ２ＳドナーであるＮａＨＳを注入すると、大動脈閉塞によるＩ／Ｒ傷害において有益であったことが明らかにされ、液体スルフィド製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）による処置で虚血傷害が防止されることが確認される。有益な効果は、本化合物の代謝調節効果と細胞保護効果の組み合わせに起因する可能性がある。
【０２６４】
【表１−１】
【０２６５】
【表１−２】
【０２６６】
【表１−３】
【０２６７】
【表２】
【０２６８】
【表３】
【０２６９】
【表４】
本明細書では説明のため本発明の特定の実施形態について記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変形が可能であることが上記から理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００７年３月２３日に出願された米国仮出願第６０／８９７，７２７号および２００６年１０月５日に出願された米国仮出願第６０／８９４，９００号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、全般的には液体カルコゲナイド組成物に関し、より詳細にはカルコゲナイドを含む安定な液体医薬組成物に関する。本発明はさらに、傷害、疾患および早期の死亡から細胞および動物を保護するそうした組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の説明
カルコゲン元素、すなわち、周期表第６族（ただし、オキシドを除く）の元素を含む化合物は一般に、「カルコゲナイド」または「カルコゲナイド化合物」と呼ばれる。カルコゲン元素には、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）およびポロニウム（Ｐｏ）がある。普通のカルコゲナイドは、Ｓ、ＳｅおよびＴｅの１種または複数種に加えて他の元素を含む。
【０００４】
最近、カルコゲナイドで処置すると、生物物質のステイシスが誘導され、生物物質が低酸素および虚血傷害から保護されることが明らかにされている。こうした研究では、酸素消費の強力な阻害剤である硫化水素（Ｈ２Ｓ）ガスにより代謝が抑えられ、低酸素傷害からマウスおよびラットが保護され得ることが証明された（特許文献１）。硫化水素ガスは一般に医療ガスと考えられておらず、こうした結果は予想外であるが、多くの動物およびヒト疾患、特に低酸素および虚血に関係する疾患および傷害を処置または防止できる大きな可能性を示している。
【０００５】
ある種のカルコゲナイド化合物（硫化水素およびセレン化水素など）は、酸素と化学反応する能力があるため酸素の存在下で安定ではなく、酸化されて化学変化を起こす。たとえば、スルフィドは、化学変化を起こすと安定性が低下し、有効期間が短くなり、さらに製造、保存または使用の過程で酸化生成物が混入する恐れがあることから、医薬品としての使用が制限される。スルフィドの酸化剤としては、酸素、二酸化炭素および酸化生成物（スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素など）の混合物を生成し得る固有の金属不純物が考えられる。このように、スルフィドは保存中に急速に酸化されるため、医薬剤としての使用が制限される。
【０００６】
カルコゲナイドによる処置が必要な細胞または患者に薬理効果を与えるため、安定していて、簡便かつ再現性よく製造でき、標準的な投与経路を対象とする最終剤形が求められている。当該技術分野においてスルフィドを含む医薬組成物など、カルコゲナイドの安定な液体医薬組成物が望まれているのは明らかである。スルフィドは、Ｈ２Ｓあるいはその塩（たとえば、ＮａＨＳ、Ｎａ２Ｓなど）のように−２価の原子価状態にある硫黄と定義され、たとえば、緊急時の当該分野における処置剤として疾患の処置のための管理された医療環境において、あるいは重篤な傷害または生命を脅かす医学的事象に伴う救命救急医療において手軽に患者に投与できる。本発明は、新規かつ安定なカルコゲナイドの液体医薬組成物を提供することでこうしたニーズに応える。本明細書では、この組成物が低酸素および／または虚血状態のほか、他の傷害および疾患状態に起因する傷害および死から動物を保護することが証明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０５／０４１６５５号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、カルコゲナイドの液体組成物と同組成物の調製方法および使用方法とを提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容されるキャリア内に安定な液体医薬カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む組成物であって、該カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物または塩の濃度、ｐＨおよび酸化生成物が前記液体医薬組成物の保存後も許容基準の範囲内にとどまる、組成物を提供する。
【００１０】
種々の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される。
【００１１】
他の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、濃度が９５ｍＭ〜１５０ｍＭである。
【００１３】
該カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩がスルフィドである特定の実施形態では、該スルフィドは、ｗ／ｖで、約８０％〜約１００％、約９０％〜１００％または約９５％〜１００％の範囲の量で存在する。
【００１４】
特定の実施形態では、この液体は水酸化ナトリウムである。
【００１５】
ある実施形態では、この組成物のｐＨは６．５〜８．５の範囲にある。
【００１６】
一実施形態では、この組成物の酸素含有量は５μＭ以下である。
【００１７】
一実施形態では、この組成物は、ポリスルフィド、スルフィット、スルファートおよびチオスルファートから選択される１種または複数種の酸化生成物をさらに含む。酸化生成物は、（０％〜１．０％）の範囲のスルファートまたは（０％〜１．０％）の範囲のスルフィットまたは（０％〜１％）の範囲のポリスルフィドまたは（０％〜１．０％）の範囲のチオスルファートであってもよい。
【００１８】
保存期間は、（２３°〜２７°）の範囲で約３ヶ月であってもよいし、（２３°〜２７°）の範囲で６ヶ月であってもよい。
【００１９】
一実施形態では、組成物の浸透圧モル濃度は、２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲にある。組成物は、等張でもほぼ等張でもよい。
【００２０】
ある実施形態では、組成物を不透過性の容器に保存する。
【００２１】
他の実施形態では、組成物はキレート剤をさらに含む。キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）でもデフェロキサミンでもよい。ＤＴＰＡは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲で存在してもよい。デフェロキサミンは、０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で存在してもよい。
【００２２】
一実施形態では、この組成物はｐＨ改変剤（ｐＨ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をさらに含む。ｐＨ改変剤については、二酸化炭素、水酸化ナトリウム、塩酸または硫化水素からなる群より選択してもよい。
【００２３】
別の実施形態では、この組成物は還元剤をさらに含む。還元剤については、ジチオスレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）またはグルタチオンからなる群より選択してもよい。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の量は、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲でもよい。グルタチオンの量は、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲でもよい。
【００２４】
さらなる実施形態では、この組成物はフリーラジカルスカベンジャーをさらに含む。フリーラジカルスカベンジャーは、（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）（Ｔｒｏｌｏｘ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）からなる群より選択してもよい。フリーラジカルスカベンジャーは、スピントラップ剤（ｓｐｉｎ−ｔｒａｐ ａｇｅｎｔ）であってもよい。フリーラジカルスカベンジャーは、Ｎ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）からなる群より選択してもよい。
【００２５】
別の実施形態では、この組成物は防腐剤をさらに含む。防腐剤は、ベンジルアルコール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンまたは塩化ベンザルコニウムからなる群より選択してもよい。防腐剤は、ベンジルアルコール（０％〜２．０％）（ｗ／ｖ）、フェノール（０％〜０．５％）（ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、エチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、プロピルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、ブチルパラベン（０％〜０．４％）（ｗ／ｖ）、塩化ベンザルコニウム、（０％〜０．０２％）（ｗ／ｖ）の範囲で存在してもよい。
【００２６】
一実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物は、ｐＨが６．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、３ヶ月間の保存後に０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２７】
関連する実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物は、ｐＨが６．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、５ヶ月間の保存後に０％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２８】
関連するさらなる実施形態では、１当量の硫化水素ガスを１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解し、その結果得られた組成物（ｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）のｐＨが７．５〜８．５の範囲、浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲、酸素含有量が５μＭ以下であり、５ヶ月間の保存後に１％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲の酸化生成物を含む。
【００２９】
本発明はさらに、動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物を調製する方法であって、
（ａ）１当量の硫化水素ガスを１当量の液体に溶解し、それによりスルフィド組成物を製造すること；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物のｐＨを６．５〜８．５の範囲のｐＨに調整すること
を含み、それにより該組成物から動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物を生成する、方法も提供する。
【００３０】
ある実施形態では、ｐＨを、１つまたは複数または塩化水素、二酸化炭素、水酸化ナトリウムおよび硫化水素を加えて調整する。他の実施形態では、ｐＨを、窒素、二酸化炭素および／または硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整する。また、ｐＨを、窒素と二酸化炭素の組み合わせまたは窒素と硫化水素の組み合わせをステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整してもよい。さらに、硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解してｐＨを調整しても構わない。
【００３１】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物の浸透圧モル濃度を２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整することをさらに含んでもよい。
【００３２】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物を不活性雰囲気または希ガス下で遮光バイアルに分注することをさらに含んでもよい。
【００３３】
この方法は、ステップ（ｂ）で得られた組成物に賦形剤を加えることをさらに含んでもよい。
【００３４】
この方法の特定の実施形態では、約６ヶ月間の酸素含有量は５μＭ以下である。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物を含む１つまたは複数の容器を含むキットを含み、該組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である。
【００３６】
一実施形態では、容器は、琥珀色バイアルのように遮光性がある。別の実施形態では、容器はガス不透過性である。
【００３７】
ある種のキットでは、組成物を不活性雰囲気または希ガス下で該容器に保存する。
【００３８】
特定の実施形態では、不活性ガスまたは希ガスは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）またはラドン（Ｒｎ）であってもよい。
【００３９】
関連するさらに別の実施形態では、本発明は、虚血または低酸素状態にさらされた生物学的物質のヒト疾患または傷害を処置する方法であって、生物学的物質を有効量のカルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００４０】
種々の実施形態では、その接触を、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ）、小胞体内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒａｌｌｙ）、経口、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）においてか、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄により行う。
【００４１】
特定の実施形態では、該カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される。
【００４２】
特定の実施形態では、該カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される。
【００４３】
一実施形態では、虚血または低酸素状態は、生物学的物質の傷害、生物学的物質に悪影響を及ぼす疾患の発症もしくは進行または生物学的物質の大量出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｎｇ）に起因する。
【００４４】
別の実施形態では、生物学的物質を、傷害の前、疾患の発症もしくは進行の前または生物学的物質の大量出血の前に組成物と接触させる。
【００４５】
異なる実施形態では、生物学的物質を、傷害の後、疾患の発症もしくは進行の後または生物学的物質の大量出血の後に組成物と接触させる。
【００４６】
一実施形態では、傷害は外部の物理的原因に起因する。
【００４７】
特定の実施形態では、傷害は手術である。
【００４８】
ある実施形態では、生物学的物質における傷害、疾患の発症もしくは進行または大量出血に起因する損傷または死から生物学的物質を保護する一定の量および期間で生物学的物質を組成物と接触させる。
【００４９】
関連する実施形態では、生物学的物質は、細胞、組織、器官、生命体および動物からなる群より選択される。具体的な実施形態では、生物学的物質は動物であり、さらに具体的な実施形態では、その動物は、哺乳動物またはヒトである。
【００５０】
一実施形態では、生物学的物質は、血小板を含む。
【００５１】
別の実施形態では、生物学的物質を移植する。
【００５２】
なお別の実施形態では、生物学的物質は、再灌流障害の危険がある。
【００５３】
特定の一実施形態では、生物学的物質は、出血性ショックの危険がある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】スルフィドの濃度が酸素分子の濃度よりも高いとき（［スルフィド］＞［Ｏ２］）、ｐＨ７．０〜９．０の範囲で検出されるスルフィドの酸化種を示す図である。
【図２】ｐＨ７．０〜９．０の範囲のスルフィド水溶液中で検出される酸化生成物を示す図である。
【図３】Ｈ２Ｓの液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）の３種類の調製物におけるスルフィドのレベルを経時的に示すグラフである。
【図４】Ｈ２Ｓの組成物（液体医薬組成物ＩＶ）におけるスルフィドの安定性を、合成キレート剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を使用して製造した組成物と、使用せずに製造した組成物で１２９日間にわたり比較したグラフである。
【図５Ａ】無酸素環境においてＤＴＰＡの非存在下で調製した硫化水素（Ｈ２Ｓ）の液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）中の、１２９日間にわたり測定した酸化生成物（すなわち、スルフィット、ポリスルフィド、チオスルファート、スルファートおよび３７分に同定された未知の酸化生成物）のレベルを示すグラフである。
【図５Ｂ】無酸素環境においてＤＴＰＡの存在下で調製した硫化水素（Ｈ２Ｓ）の液体組成物（液体医薬組成物ＩＶ）中の、１２９日間にわたり測定した酸化生成物（すなわち、スルフィット、ポリスルフィド、チオスルファート、スルファートおよび３７分に同定された未知の酸化生成物）のレベルを示すグラフである。
【図６】１２９日間にわたって所定の間隔で測定したスルフィドの液体組成物、９７ｍＭのＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）のｐＨレベルを示すグラフである。
【図７Ａ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射後の尿中におけるチオスルファート排出量を示すグラフである。グラフは、表示した投与後の時点でラット尿中において測定されたチオスルファートの量を示す。
【図７Ｂ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射後の尿中におけるスルファート排出量を示すグラフである。グラフは、表示した投与後の時点でラット尿中において測定されたスルファートの量を示す。
【図８Ａ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射（１ｍｇ／ｋｇ）後にラットにおいて２４０分間にわたり測定したチオスルファートの血中レベルを示すグラフである。この研究では、血液を頸動脈から採取し、サンプルをＰＦＢＢｒで誘導体化し、ＧＣ−ＭＳにより解析した。
【図８Ｂ】液体医薬組成物ＩＶのボーラス注射（１ｍｇ／ｋｇ）後にラットにおいて２４０分間にわたり測定したスルフィドの血中レベルを示すグラフである。この研究では、血液を頸動脈から採取し、サンプルをＰＦＢＢｒで誘導体化し、ＧＣ−ＭＳにより解析した。
【図９】Ｎａ２Ｓ（液体医薬組成物Ｉ）を注入し、低酸素状態（４％Ｏ２）にさらしたマウス（ＭＪＶＣ０７）の中核体温を経時的に示すグラフである。注入の開始時間および中止時間と低酸素状態への曝露開始時間および中止時間とを表示してある。
【図１０】低酸素（４％Ｏ２）にさらしたＣ５７ＢＬ／６マウスの、経時的に測定した生存率を、ビヒクルを注入したマウスとＮａ２Ｓ（液体医薬組成物Ｉ）の注入で処置したマウスで比較したカプランマイヤーグラフである。
【図１１】表示量の液体医薬組成物ＩＶで処置したマウスの血清中ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベルを示すグラフである。ＡＳＴのレベルは、検査対象の最高濃度（３．０ｍｇ／ｋｇ）で統計学的に有意な低下が認められた。ＡＬＴのレベルは、ビヒクルと比較して３つの処置群（０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）で低下した。統計学的に有意なｐ値０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）を表示してある。
【図１２】表示量のスルフィドの液体医薬組成物で処置したマウスのＬＶ（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）比またはＡＡＲ（ａｒｅａ ａｔ ｒｉｓｋ）比を示すグラフである。統計学的に有意なｐ値０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）を表示してある。
【図１３Ａ】液体医薬組成物ＩＶの存在下または非存在下で氷冷リンゲル液により処置したブタの中核体温を示すグラフである。ｐ値を示してある２つの実験から得られた結果を示す。
【図１３Ｂ】液体医薬組成物ＩＶの存在下または非存在下で氷冷リンゲル液により処置したブタの中核体温を示すグラフである。ｐ値を示してある２つの実験から得られた結果を示す。
【図１４】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶの存在下で虚血および再灌流を施したブタの梗塞サイズを示すグラフである。
【図１５】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶの存在下で虚血に反応したイヌの前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ：ｐｒｅｌｏａｄ ｒｅｃｒｕｉｔａｂｌｅ ｓｔｒｏｋｅ ｗｏｒｋ）の減少を示すグラフである。
【図１６】対照ビヒクルまたは液体医薬組成物ＩＶで前処置した動物のＡＡＲ比（ｐｅｃｅｎｔ）またはＬＶ比（ｐｅｃｅｎｔ）を示すグラフである。
【図１７Ａ】左心室機能が対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパス前後の動物であることを示す。対照ビヒクルまたは非経口硫化水素の存在下における心肺バイパス前後両方の動物の左心室ｄＰ／ｄＴを示すグラフである。
【図１７Ｂ】左心室機能が対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパス前後の動物であることを示す。対照ビヒクルまたは非経口硫化水素の存在下における心肺バイパス前後両方の動物のＰＲＳＷを示すグラフである。
【図１８】インビボでの内皮細胞機能を示すグラフで、対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下での心肺バイパス前後の動物のＤＣＢＦ（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）［％］を示す。
【図１９Ａ】対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下のエキソビボでの内皮機能を示す。対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパスを使用してまたは使用せずにアセチルコリンに反応する血管弛緩を示すグラフである。
【図１９Ｂ】対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下のエキソビボでの内皮機能を示す。対照ビヒクルまたは硫化水素の存在下で心肺バイパスを使用してまたは使用せずにＳＮＰに反応する血管弛緩を示すグラフである
【発明を実施するための形態】
【００５５】
カルコゲナイドを含む組成物とその調製および使用に有用な方法とを提供する。この組成物は、安定なカルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしく前駆体の液体組成物であり、通常は、液体での製造および保存の過程で酸化生成物を生成する酸化反応により治療薬としての有効性が損なわれる。本発明の液体組成物は、有効期間が長く、簡便かつ再現性よく製造され、標準的な投与経路に合わせて設計されており、液体またはガス状カルコゲナイド組成物が以前に考えられていた疾患および症候の処置および防止にも優れている。本発明に関しては、生物学的物質にステイシスまたはプレステイシスを誘導する方法ばかりでなく生物学的物質を疾患または傷害、特に虚血または低酸素傷害から保護する方法における使用を意図している。
【００５６】
Ａ．安定なカルコゲナイド液体医薬組成物
本発明は、カルコゲナイドを含む安定な液体組成物およびその調製に有用な方法を対象とする。本発明では、医薬組成物に対する「液体」という語は、「水性」という語を含むものとする。
【００５７】
一態様では、本発明は、安定な液体医薬組成物であって、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含み、該液体医薬組成物を事前に指定した期間保存した後、該カルコゲナイドの濃度、ｐＨおよび酸化生成物が許容基準（限界値、数値範囲または記載した各試験の他の基準）の範囲内にとどまる、組成物に関する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「安定な」とは、活性カルコゲナイド組成物の濃度、そのｐＨおよび／またはカルコゲナイド酸化生成物が許容基準の範囲内にとどまることをいう。
【００５９】
「許容基準」とは、原薬または製剤がその使用目的に対して有効と判定される際に準拠すべき一連の基準をいう。本明細書で使用する場合、許容基準は、哺乳動物に使用する製剤を対象として規定された各検査、分析手順に関する参考文献および適切な尺度のリストである。たとえば、カルコゲナイドの安定な液体医薬組成物の許容基準とは、原薬、ｐＨおよび酸化生成物のレベルについて事前設定された一連の範囲をいい、安定性試験に基づき個々の薬剤組成物の医薬品としての使用を認めるものである。許容基準は、局所用途および化粧用途の基準など、他の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の基準と異なってもよい。許容可能な標準は、業種ごとに規定されるのが一般的である。
【００６０】
許容基準には様々あるが、本明細書に記載の値または範囲が米国食品医薬品局が公表する医薬品製造管理および品質管理基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に適合すれば許容基準に含まれる。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのｐＨの範囲が７．４〜９．０、６．５〜８．５または６．５〜９．０である。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点での重量オスモル濃度の範囲が２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであるか、浸透圧モル濃度の範囲が２５０〜３３０ｍＯｓｍ／Ｌである。ある実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのスルフィド濃度が５．０〜６．０ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、許容基準は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点でのカルコゲナイド濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌまたは９５〜１５０ｍＭの範囲内である。他の実施形態の場合、許容基準では、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点で全スルフィドおよびその酸化生成物に対してスルフィドが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％重量／体積存在する。関連する実施形態では、酸化生成物は、４℃、２５℃または４０℃で０、１、２、３または４ヶ月間保存した時点で全スルフィドおよび酸化生成物に対して１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％以下の濃度で存在する。
【００６１】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、医療または獣医療の現場でヒトまたは動物に投与する際、分子的実体および組成物がアレルギー反応または類似の予期しない反応を起こさないことをいう。
【００６２】
「カルコゲナイド」または「カルコゲナイド化合物」とは、カルコゲン元素、すなわち、周期表第６族（ただし、オキシドを除く）の元素を含む化合物をいう。これらの元素には、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）およびポロニウム（Ｐｏ）がある。具体的なカルコゲナイドおよびその塩として、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳ、ＢａＳ、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
「カルコゲナイド前駆体」とは、たとえば、生物物質に曝露したとき、あるいは曝露後すぐに一定の条件下で硫化水素（Ｈ２Ｓ）のようなカルコゲナイドを生成することができる化合物および薬をいう。そうした前駆体は、１つまたは複数の酵素または化学反応によりＨ２Ｓまたは別のカルコゲナイドを生成する。ある実施形態では、カルコゲナイド前駆体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）、メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）、メルカプトエタノール、チオシアナート、シアン化水素、メタンチオール（ＭｅＳＨ）または二硫化炭素（ＣＳ２）である。ある実施形態では、カルコゲナイド前駆体は、ＣＳ２、ＭｅＳＨまたはＤＭＳである。
【００６４】
一実施形態では、以下の式によりＨ２Ｓ供与体である水硫化ナトリウム（ＮａＨＳ）の水溶液中での自然解離によりＨ２Ｓを生成する：
【００６５】
【化１】
ある実施形態では、カルコゲナイド化合物は硫黄を含むのに対し、別の実施形態では、セレン、テルルまたはポロニウムを含む。ある実施形態では、カルコゲナイド化合物は、１つまたは複数の露出したスルフィド基を含む。特定の実施形態では、こうしたカルコゲナイド化合物は、露出したスルフィド基を１、２、３、４、５、６またはそれ以上含むか、そこから導き出せる任意の範囲で含むと考えられる。特定の実施形態では、そうしたスルフィド含有化合物は、ＣＳ２（二硫化炭素）である。ある実施形態では、カルコゲナイドは塩であり、好ましくはカルコゲンが−２酸化状態にある塩である。本発明の実施形態に包含されるスルフィド塩として、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化水素カリウム（ＫＨＳ）、硫化リチウム（Ｌｉ２Ｓ）、硫化ルビジウム（Ｒｂ２Ｓ）、硫化セシウム（Ｃｓ２Ｓ）、硫化アンモニウム（（ＮＨ４）２Ｓ）、硫化水素アンモニウム（ＮＨ４）ＨＳ、硫化ベリリウム（ＢｅＳ）、硫化マグネシウム（ＭｇＳ）、硫化カルシウム（ＣａＳ）、硫化ストロンチウム（ＳｒＳ）、硫化バリウム（ＢａＳ）および同種のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
スルフィドが不安定な化合物であることは当該技術分野において周知であり、このクラスの化合物を安定化すべく多くの試みがなされてきた。特に、スルフィドの酸化による酸化生成物は、測定することができる。このため、液体組成物中でのスルフィドの保存過程で生成される酸化生成物の範囲については、本明細書に記載のおよび当該技術分野において周知の標準的な解析方法を用いて酸化生成物のレベルを経時的に測定することで容易に判定することができる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「酸化生成物」とは、たとえば、スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素など、スルフィドの化学変化によって生じる生成物をいう。そうしたスルフィドの酸化による生成物は、（酸化などより）加工、製造または保存に伴い生じる可能性がある。
【００６８】
「保存の過程で」とは、液体カルコゲナイド組成物を調製してから患者または生物物質に投与するまでの期間をいう。本発明の液体医薬組成物については、調製してから直ちに被検体に投与しなくてもよい。調製後はこの組成物をむしろ、液状、半固体状、ゼラチン状、固体状または被検体への投与に好適な他の形状のまま保存のためパッケージングする。ある実施形態では、保存の期間は、１ヶ月〜１２ヶ月、１ヶ月〜６ヶ月または２ヶ月〜５ヶ月である。
【００６９】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の方法および賦形剤を用いて薬学的投与用に調製してもよい。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）；２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
【００７０】
本発明の液体医薬組成物は、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を任意の所望の濃度で含んでもよい。濃度に関しては、たとえば、処置対象の生物物質のタイプおよび投与経路に応じて、簡便なやり方で適切な期間にわたり有効量が送達されるように容易に最適化できる。いくつかの実施形態では、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体濃度は、０．００１ｍＭ〜５，０００ｍＭの範囲、１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲、５０〜５００ｍＭの範囲、７５〜２５０ｍＭの範囲または９５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲にある。
【００７１】
本発明の液体医薬組成物は、濃度が１ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲にあるスルフィドからなるカルコゲナイドをさらに含む。別の実施形態では、スルフィドの濃度は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲にある。
【００７２】
ある実施形態では、本発明の液体カルコゲナイド組成物中のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度は、（標準温度と圧力（ＳＴＰ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で）約、少なくとも約あるいは多くても約０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７．３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０ｍＭもしくＭまたはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。硫化水素ガスの場合、たとえば、いくつかの実施形態では、濃度は、（ＳＴＰで）約０．０１〜約０．５Ｍであってもよい。
【００７３】
モル濃度は、体積当たりの重量に容易に変換することができる。したがって、上記のモル濃度の範囲はいずれも、たとえば、ｍｇ／ｍｌで記載することができる。このため、ある実施形態では、本発明の液体カルコゲナイド組成物のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌまたは１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。他の実施形態では、濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌまたは約１０ｍｇ／ｍｌ、あるいは１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌである。
【００７４】
本発明の一態様では、液体医薬組成物は、液体中に溶解したカルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む。一実施形態では、この液体は、水（Ｈ２Ｏ）であり、他の実施形態では、この液体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）またはリンゲル液など、生理的適合性がより高い溶液である。さらなる実施形態では、この液体は水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、液体医薬組成物が、カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体の飽和溶液であることを意図している。
【００７６】
本明細書において限定せずに用いる場合、「％」という語は、（ｗ／ｖ、ｖ／ｖまたはｗ／ｗの場合と同様）液体に固体を溶かした溶液の重量体積比（ｗ／ｖ）、液体にガスを溶かした溶液の重量体積比（ｗ／ｖ）、液体に液体を解かした溶液の体積比（ｖ／ｖ）および固体と半固体の混合物の重量（ｗ／ｗ）を意味する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍｉａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）；２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
【００７７】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、８０％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９０％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９５％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、９８％〜１００％（ｗ／ｖ）で測定されるスルフィドを含む。
【００７８】
一実施形態では、本発明のカルコゲナイド液体医薬組成物のｐＨは（３．０〜１２．０）の範囲にあるのに対し、他の実施形態では、ｐＨは、（５．０〜９．０）の範囲にある。液体医薬組成物のｐＨを、生理的適合性の範囲に調整しても構わない。たとえば、一実施形態では、液体医薬組成物のｐＨは、６．５〜８．５の範囲にある。他の実施形態では、本発明の液体医薬組成物のｐＨは、７．５〜８．５または７．４〜９．０の範囲にある。
【００７９】
一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０μＭ〜５μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０μＭ〜３μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０．０１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。一実施形態では、医薬組成物中の酸素は、０．００１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、酸化生成物をさらに含んでもよい。本発明の酸化生成物として、スルフィット、スルファート、チオスルファート、ポリスルフィド、ジチオナート、ポリチオナートおよび硫黄元素があるが、これに限定されるものではない。種々の実施形態では、これらの酸化生成物の１つまたは複数は、１０％未満、６．０％未満、３．０％未満、１．０％未満、０．５％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満または０．０１％未満の量で存在する。
【００８１】
一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルフィットは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８２】
一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、０％〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、１％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のスルファートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８３】
一実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、酸化生成物のチオスルファートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８４】
一実施形態では、酸化生成物は、（０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在するポリスルフィドを含む。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリスルフィドは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８５】
一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のジチオナートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲に。
【００８６】
一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物のポリチオナートは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００８７】
一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、０％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、３．０％〜６．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、酸化生成物の硫黄元素は、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。
【００８８】
液体医薬組成物（製剤）については、哺乳動物への投与前の保存の過程で安定な状態が続くことが好ましいことを当業者であれば理解するであろう。一実施形態では、液体医薬組成物の保存は約３ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約６ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約１２ヶ月で、保存温度は１８℃〜２７℃の範囲にある。
【００８９】
一実施形態では、液体医薬組成物の保存は約３ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約６ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。別の実施形態では、液体医薬組成物の保存は約１２ヶ月で、保存温度は４℃〜２３℃の範囲にある。
【００９０】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物の調製方法は、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度を２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整することをさらに含む。一実施形態では、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度は、２４０〜３６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌまたは等張性の範囲にある。特定の実施形態では、液体医薬組成物の浸透圧モル濃度が２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲にあるか、組成物の重量オスモル濃度が２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲にある。ＮａＣｌを賦形剤として用いて重量オスモル濃度を調整してもよい。
【００９１】
ある実施形態では、投与時の疼痛が緩和され、高浸透圧または低浸透圧組成物に起因して起こり得る溶血作用を最小限に抑えられるため、液体医薬組成物は等張であることが望ましい。したがって、本発明の安定化組成物は、保存安定性が高いばかりでなく、酸およびその酸の塩の形からなる従来の他の緩衝系を用いた製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と比較して投与時に疼痛が実質的に緩和されるという利点も付加されている。
【００９２】
一実施形態では、安定な液体医薬組成物を不透過性の容器にパッケージングする。「不透過性容器」とは、ガス分子の通過に対する永続的なバリアとなる容器をいう。不透過性容器は当業者に知られており、ガス不透過性構成材料を含む「点滴バッグ」または密封ガラスバイアルがあるが、これに限定されるものではない。液体医薬組成物は、不活性雰囲気または希ガス不透過性の容器にパッケージングすればよい。希ガスとは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒｎ）をいう。不活性ガスとは、窒素（Ｎ２）をいう。「不活性雰囲気」という語は、容器内の窒素またはアルゴン雰囲気をいう。液体医薬組成物については、たとえば、琥珀色バイアルのような遮光バイアルまたは容器にパッケージングしてもよい。一実施形態では、ガラスアンプルに組成物をシールして保存してもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、保存期間が１〜１２ヶ月またはそれ以上となる保存過程でのカルコゲナイドの酸化防止用に添加される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、保存期間は１〜６ヶ月である。いくつかの実施形態では、保存期間は３〜６ヶ月である。いくつかの実施形態では、保存期間は４〜５ヶ月である。本発明の実施形態では、賦形剤を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。好適な賦形剤は多くある。例として、キレート剤、ｐＨ改変剤、還元剤、酸化防止剤、スピントラップ剤および防腐剤がある。
【００９４】
一実施形態では、本発明の液体医薬組成物は、任意にキレート剤またはキレート剤を含んでもよい。キレートは、金属イオンと錯化剤の水溶性錯体である。キレートは、ほとんどの場合、溶液中で容易に解離せずに、不活性錯体を形成する。ただし、レービル錯体では、金属イオンが容易に交換され得る。遷移元素の金属錯体がよく知られているが、キレート化は、もっと広範囲の元素内で起こる。金属錯体を生成するキレート剤は、金属イオン封鎖剤とも呼ばれる。キレート剤は一般に、−Ｏ、−ＮＨ２または−ＣＯＯ−など、金属に一対の電子を供与する少なくとも２つの官能基を持つ。さらに、これらの基は、金属と環形成できる位置にある。天然のキレート剤の例として、多糖類などの炭水化物、複数の配位基を持つ有機酸、脂質、ステロイド、アミノ酸および関連化合物、ペプチド、ホスファート、ヌクレオチド、テトラピロール、フェリオキサミン、イオノフォア（グラミシジン、モネンシン、バリノマイシンなど）およびフェノール類が挙げられる。合成キレート剤の例として、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸五ナトリウム塩（ＤＴＰＡ５）、ＣａＤＴＰＡＨ、ジメルカプロール（ＢＡＬ：Ｂｒｉｔｉｓｈ ａｎｔｉ−Ｌｅｗｉｓｉｔｅ）、デフェロキサミン、デスフェラール、２，２’−ビピリジルジメルカプトプロパノールエチレンジアミノ四酢酸、エチレンジオキシジエチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉｎｉｔｒｉｌｏ−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＣａＮａ２エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、イオノフォア、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、オルトフェナントロリン、サリチル酸、サクシマー（メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸、（ＤＭＳＡ：ｍｅｓｏ−２，３−ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸三ナトリウム（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９５】
一実施形態では、合成キレート剤はＤＴＰＡである。ある実施形態では、ＤＴＰＡの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。一実施形態では、ＤＴＰＡは、０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲にある。一実施形態では、合成キレート剤は、ＤＴＰＡ５からなる。ある実施形態では、ＤＴＰＡ５の濃度は、（０．０００１％〜０．１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＤＴＰＡ５は、（０％〜１．０％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、ＤＴＰＡ５は、（０％〜０．０１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９６】
一実施形態では、合成キレート剤はＣａＤＴＰＡである。ある実施形態では、ＣａＤＴＰＡの濃度は、（０．０００１％〜０．１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある（ｉｓ ｉｓ）。一実施形態では、ＣａＤＴＰＡは、（０％〜０．０１％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＣａＤＴＰＡは、（０％〜１．０％）（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９７】
一実施形態では、合成キレート剤はデフェロキサミンである。ある実施形態では、デフェロキサミンの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。一実施形態では、デフェロキサミンは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲にある。
【００９８】
一実施形態では、合成キレート剤はＥＤＴＡである。ある実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。ある実施形態、ＥＤＴＡは、０％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＥＤＴＡは、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。別の実施形態では、ＥＤＴＡは、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、ＥＤＴＡは、０％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００９９】
本発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｍａｙ）の液体医薬組成物は、１種または複数種のｐＨ改変剤をさらに含んでもよい。ｐＨ改変剤には、炭酸亜鉛、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、マレイン酸カルシウム、オレイン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム、酢酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、リン酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、マレイン酸マグネシウム、オレイン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、酢酸亜鉛、リン酸水素亜鉛、リン酸亜鉛、乳酸亜鉛、マレイン酸亜鉛、オレイン酸亜鉛、シュウ酸亜鉛などの無機塩類およびこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。他のｐＨ改変剤として、たとえば、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸、酒石酸、二酸化炭素、炭酸、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、トロメタミン、オロト酸および塩酸が挙げられる。一実施形態では、ｐＨ改変剤は水酸化ナトリウムである。
【０１００】
ｐＨ改変剤については、もともと酸性または塩基性である溶液に加えると緩衝剤の役割を果たし、溶液を別のｐＨに変更し維持できることを当業者であれば理解する（以下を参照：Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００６）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｓｔａｈｌ，Ｐ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｃ．ｅｄ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｗｉｌｅｙ（２００２））。特定の実施形態では、ｐＨ改変剤は、緩衝剤としての役割を果たし、二酸化炭素または硫化水素からなる。
【０１０１】
ある実施形態では、本発明の医薬組成物は、たとえば、グルタチオン（米国特許第６，５８６，４０４号を参照）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＳＥＰ）、ｌ−システイン、システインまたはメチオニンなど、還元剤であるもう１つの賦形剤を含む。一実施形態では、還元剤は、グルタチオン（以下を参照；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）２５：６１２−６２８）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｌ；（２００２）１３２：１２１−３０）またはジチオエリトリトール（ＤＴＥ：ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）である。ある実施形態では、グルタチオンの濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭまたはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。ある実施形態では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の濃度は、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲で存在する（ｗｈｉｃｈ ｐｒｅｓｅｎｔ）。ある実施形態では、還元剤は、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）であり、約、少なくとも約あるいは多くても約０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲にある。
【０１０２】
本発明の液体医薬組成物は任意に、フリーラジカルスカベンジャーまたは酸化防止剤を含んでもよい。フリーラジカルスカベンジャーまたは酸化防止剤の例として、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ−α酢酸トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）、メラトニン、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、メラトニン、、亜ジチオン酸塩、ピロ亜硫酸塩、システイン、二亜硫酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオエチレングリコール、Ｌ−トレオアスコブ酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、レシチン、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニドール、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ヒドロキシコマリン、ブチル化ヒドロキシトルエン、セファルム、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、没食子酸ラウリル、プロピルヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシブチルロフェノン、ジメチルフェノール、、レシチン、エタノールアミン、メグルミンおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない（米国特許出願公開第２００５／０１０６２１４号を参照）。
【０１０３】
一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲にある。一実施形態では、たとえば、酸化防止剤の亜硫酸ナトリウムは、０％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲にある。（以下を参照：Ｓｗａｄｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４），１４１：３９７）。
【０１０４】
一実施形態では、酸化防止薬は、スピントラップ剤である。スピントラップ剤の例として、Ｎ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）（以下を参照：Ｋｏｔａｋｅ，Ｙ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ（１９９９）４８１）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）（Ｇａｒｉｂｏｌｄｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２９：６３３；Ｍｉｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ．（Ｔｏｋｙｏ）（２０００）４１：１０３；Ｍｏｔａ−Ｆｉｌｉｐｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｈｏｃｋ １２：２５５Ｒ：２２−４１；Ｓ：３９〜２６ ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）（以下を参照：Ｌａｐｃｈａｋら、Ｓｔｒｏｋｅ（２００１）３２：１４７−５３）；（二ナトリウム−［（ｔｅｒｔ−ブチルイミノ）メチル］ベンゼン−１，３−ジスルホナートＮ−オキシド（ＮＸＹ−０５９）（以下を参照：Ｌａｐｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ（２００３）９：２５３−６２）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、スピントラップ剤は、０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在するＴＥＭＰＯである。いくつかの実施形態では、スピントラップ剤はＴＥＭＰＯであり、１００ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在する。別の実施形態では、スピントラップ剤はＴＥＭＰＯであり、０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在する。
【０１０６】
本発明のカルコゲナイド組成物は任意に、防腐剤を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「防腐剤」という語は、微生物の増殖の防止に用いる化合物を意味するものである。そうした化合物の例として、以下に限定されるものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェエノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、チメロサール、メタクレゾール、ミリスチルγ−塩化ピコリニウム、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チオグリセロール、チメロサール、チモールおよびメチル、エチル、プロピルまたはブチルパラベンおよび当業者に公知のこれら以外ものが挙げられる。こうした防腐剤を、記載されているような許容可能な医療慣行に従って通常の濃度で液体カルゴゲナイド組成物に用いる。（以下を参照：Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００６）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，ＤＢ，Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。ある実施形態、防腐剤は、ベンジルアルコールであり、０％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、防腐剤はベンジルアルコールであり、０％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。一実施形態では、防腐剤は、０％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲のフェノールである。ある実施形態では、防腐剤は、（０．０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のメチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のエチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲のプロピルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．４％（ｗ／ｖ）の範囲のブチルパラベンである。ある実施形態では、防腐剤は、０％〜０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲の塩化ベンザルコニウムである。
【０１０７】
一実施形態では、賦形剤を組み合わせてポリスルフィドの形成を低減する。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減させる賦形剤の組み合わせは、０％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲の亜硫酸ナトリウムおよび０％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲のＥＤＴＡを含む。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減する賦形剤の組み合わせは、亜硫酸ナトリウムとＤＴＰＡ５である。一実施形態では、ポリスルフィドの形成を低減する賦形剤の組み合わせは、亜硫酸ナトリウム、ＤＴＰＡ５およびベンジルアルコールである。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、０．０１ｍｇ／ｍｌ以下の鉄、１０、５、２．７、２．５または１ＥＵ／ｍｌ以下のエンドトキシン、１０、５または１ｐｐｍ未満の硫化カルボニルおよび５、２．５または１ｐｐｍ未満の二硫化炭素を含む。
【０１０９】
これらの材料は食品添加剤および加工助剤として一般に受け入れられているうえ、そうした用途に関する米国食品医薬品局の「一般に安全と認められる」（すわたち「ＧＲＡＳ：ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ」）基準を達成している。このため、上述のいくつかは好ましいものである。
【０１１０】
本発明は、本発明の液体医薬組成物を含むキットをさらに含む。ある実施形態では、そうしたキットは、本発明の液体医薬組成物を保存する１つまたは複数の容器を含む。一実施形態では、不活性ガスまたは希ガス下で組成物を容器に保存する。この容器についてはシールし、不透過性かつ遮光性の容器（琥珀色バイアルなど）を含む（ａ ｓｅａｌｅｄ ａｎｄ ｈａｓ ａｎｄ ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ｅ．ｇ．，ａｎ ａｍｂｅｒ ｖｉａｌ））。
【０１１１】
Ｂ．液体医薬組成物の調製方法
本発明の方法の種々の実施形態によれば、生物学的物質に本発明の液体医薬組成物を、たとえば、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下、小胞体内、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）において与えるか、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄により与える。
【０１１２】
液体中に溶解したカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体を既知の望ましい濃度で含む組成物または非経口投与用の組成物を意図している。「非経口」とは、消化管を経由せずに物質を投与する任意の経路をいう。一般に、液体カルコゲナイド組成物については、たとえば、カルコゲナイドガス（Ｈ２Ｓなど）を組成物に接触（溶解または注入など）させ、ガス分子を適切なｐＨ改変剤からなる液体に溶解させることで製造すればよい。一実施形態では、カルコゲナイドガスは緩衝剤であり、薬学的に許容されるキャリアからなる液体に溶解させる。さらなる実施形態では、液体医薬組成物は、単一の賦形剤または賦形剤の組み合わせを加えて記載のように調製されるカルコゲナイドガス溶液からなる。
【０１１３】
組成物に溶解するガスの量については、以下に限定されるものではないが、たとえば、液体または溶液のガス溶解性、液体または溶液の化学組成、その温度、その圧力、そのｐＨ、組成物中の化学品のｐＫＡ、そのイオン強度、さらにはガスの濃度、ガスを溶液に接触させる程度（溶解または注入の速度または持続時間など）など、多くの可変要素によって異なることを当業者であれば認識するであろう。非経口投与用の液体または溶液中のカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度に関しては、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の安定性については、液体カルコゲナイド組成物の調製または製造後の様々な時間間隔でその濃度を測定することで判定することができ、出発濃度と比較してカルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の濃度が低下すると、カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の減少または化学変換が示唆される。
【０１１４】
あるいは、最も多く含まれるカルコゲナイド化合物（またはその塩または前駆体）の化学変化（酸化など）により引き起こされる化学物質の経時的な変化を管理された保存条件（温度、湿度、光曝露など）下で測定して液体カルコゲナイド医薬組成物の安定性を判定してもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、カルコゲナイドの塩の形を滅菌水または食塩水（０．９％塩化ナトリウム）に溶解し、薬学的に許容される非経口製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、大槽内、腹腔内および皮内など）剤形を得て液体カルコゲナイド組成物を生成する。別の実施形態では、液体医薬組成物を、経口、経鼻（吸入またはエアロゾル）、頬粘膜または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与剤形に製剤する。非経口用液体剤形をある種のｐＨに緩衝して、カルコゲナイド化合物の溶解性を高めたり、カルコゲナイド化合物のイオン化状態に影響を与えたりしてもよい。硫化水素またはセレン化水素の場合、以下に限定されるものではないが、ナトリウム、カルシウム、バリウム、リチウムまたはカリウムなど、当業者に公知の多くの塩の形のどれでも構わない。一実施形態では、硫化ナトリウムまたはセレン化ナトリウムを無菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５〜８．５の範囲に調整して被検体に投与可能な既知の濃度の溶液を得る。
【０１１６】
種々の実施形態では、液体または溶液をカルコゲナイド化合物と接触させる前に酸素を還元してある、液体または溶液中で液体カルコゲナイド組成物を調製する。一実施形態では、本発明の液体医薬組成物の調製方法は、医薬組成物の製造および保存の各局面で酸素含有量を限定することをさらに含む。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０μＭ〜５μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０μＭ〜３μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０．００１μＭ〜０．１μＭの範囲で測定される。一実施形態では、酸素は、医薬組成物中に０．１μＭ〜１μＭの範囲で測定される。
【０１１７】
ある種のカルコゲナイド化合物（硫化水素、セレン化水素など）は、酸素と化学反応する能力があり酸化および化学変化を起こすため、酸素の存在下で安定ではない。したがって、以下に限定されるものではないが、液体または溶液への陰圧の印加（真空脱気（ｖａｃｕｕｍ ｄｅｇａｓｉｎｇ））あるいは溶液または液体を試薬と接触させ酸素を結合または「キレート化」させて溶液から酸素を効率的に除去するなど、当該技術分野において公知の方法を用いて、酸素を液体または溶液から除去してもよい。
【０１１８】
一実施形態では、液体カルコゲナイド組成物を不透過性の容器に保存する。これは特に、溶液からすでに酸素を除去してあるときに、カルコゲナイドまたはその塩もしくは前駆体の酸化を抑制または防止するのに望ましい。さらに、不透過性の容器で保存すれば、液体または溶液のカルコゲナイドガスの酸化生成物を抑えて、溶解したカルコゲナイドの濃度を一定に保つこともできる。不透過性容器については当業者に知られており、ガス不透過性の構成材料を含む「点滴バッグ」または密封ガラスバイアルがあるが、これに限定されるものではない。気密性保存容器内での空気への曝露を防ぐため、閉める前に容器に窒素またはアルゴンなどの不活性ガスまたは希ガスを導入しておいてもよい。
【０１１９】
他の関連する実施形態では、液体医薬組成物を琥珀色バイアルなどの耐光性または遮光の容器またはバイアルに保存する。好ましくは組成物をガラスバイアルにパッケージングする。ガラスバイアルは、組成物の酸化分解を防止／遅延させるため、たとえば、窒素のような不活性雰囲気の若干強い圧力で満たし、さらに光の侵入を防止することで組成物の光化学的劣化を防止するようになっていることが好ましい。これは、琥珀色バイアルを用いることで最も効果的に実現することができる。多くの静脈注射液が酸素に感受性であるため、溶液を無酸素環境で保存できる容器系については、よく知られている。たとえば、充填およびシールプロセスの過程で酸素をパージするガラス容器を用いてもよい。別の実施形態では、酸素が入らないようにシールする上包装に封入できる可撓性のプラスチック容器が有用である。基本的に、酸素が液体医薬組成物と相互作用できないようにするのであればどのような容器を用いてもよい。（米国特許第６，４５８，７５８号を参照）一実施形態では、容器は、１種または複数種の酸素スカベンジャーを含む。たとえば、酸素をスカベンジする組成物については、生成物を支持または保持する手段の内面のコーティングまたは内層として塗布すれば、酸素の透過に対するバリアとなり得る（米国特許第５，４９２，７４２号を参照）。
【０１２０】
一実施形態では、本発明は、溶液中にカルコゲナイド塩を溶解することを含む、医薬組成物の調製方法を含む。一実施形態では、カルコゲナイド塩は、硫化ナトリウムである。別の実施形態では、カルコゲナイドおよび塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳ、ＢａＳであるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、この液体は水またはリン酸緩衝生理食塩水である。一実施形態では、この液体は水酸化カリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液である。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、ガス状のカルコゲナイド、たとえば、Ｈ２Ｓ（硫化水素）を液体に注入することを含む、医薬組成物の調製方法を含む。一実施形態では、この液体は、水酸化カリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液である。
【０１２２】
種々の実施形態では、本発明のカルコゲナイドを含む液体医薬組成物の調製方法は、組成物のｐＨを調整するステップをさらにも含む。ある実施形態では、塩化水素、二酸化炭素、窒素または硫化水素の１種または複数種を加えてｐＨを調整する。別の実施形態では、窒素、二酸化炭素または硫化水素またはこれらの任意の組み合わせを組成物に溶解してｐＨを調整する。一実施形態では、窒素と二酸化炭素の組み合わせまたは窒素と硫化水素の組み合わせを組成物に溶解してｐＨを調整する。ある実施形態では、硫化水素を水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムに溶解して溶液のｐＨを調整する。一実施形態では、１当量の硫化水素溶液を１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解する。
【０１２３】
さらに、本明細書に記載の方法は、金属キレート剤、フリーラジカルスカベンジャーおよび／または還元剤の１種または複数種を加えることをさらにも含んでもよい。本発明の特定の方法では、液体カルコゲナイド組成物を保持する入れ物を含む、ｐＨ測定用、ガス添加用アクセスポートおよび外部雰囲気と接触せずに分注できるアクセスポート付きの密封容器内で液体カルコゲナイド組成物を製造する。一実施形態では、その入れ物は、摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコである。一実施形態では、入れ物に窒素ガスまたはアルゴンガスを流して酸素含有量を最小限に抑え０．００μＭ〜３μＭの範囲とする。ある実施形態、入れ物内の酸素含有量の測定値が０．０１μＭ〜０．０３μＭである。液体カルコゲナイド組成物の最終スルフィド濃度については、ＮａＯＨの初濃度から判定する。たとえば、安定性の向上（ＤＴＰＡ）または浸透圧モル濃度のバランス（ＮａＣｌ）を確保する任意の所望の添加剤と共に、ＮａＯＨ溶液を三つ口フラスコに加える。撹拌しながら５ｐｓｉで１５分間アルゴン溶解して、この溶液から酸素を除去する。この溶液に、溶液のｐＨが７．６〜７．８の範囲になるまで硫化水素ガス（Ｈ２Ｓ）を撹拌しながら溶解する。一実施形態では、許容されるｐＨ範囲は、７．５〜８．０である。酸素が溶液に入らないようアルゴンでヘッドスペースを最大限満たして、この溶液をアルゴン陽圧下でフラスコからバイアルまたはビンに分注する。分注バイアルまたはビンを、アルゴンが常時流されるグローブボックスに入れて酸素を最小限に抑え０．００μＭ〜０．５μＭの範囲とする。分注前に各ビンまたはバイアルにアルゴンを流しておく。バイアルおよびビンは安定性を高めるため褐色のガラス製で、これをテフロン（登録商標）ライナー付きシリコンまたはゴムで覆われたキャップで閉じ、クラウンキャップクリンパーを用いてプラスチックキャップでシールし、密閉する。一実施形態では、バイアルおよびビンはホウケイ酸ガラスからなる。一実施形態では、バイアルおよびビンは二酸化ケイ素からなる。
【０１２４】
Ｃ．液体医薬組成物の使用方法
本発明の液体医薬組成物を用いて、ガス状のカルコゲナイド（国際公開第２００５／０４１６５５号を参照）または液体カルコゲナイド組成物で処置されたことがある任意の疾患または障害など、種々の疾患および障害の処置または予防を行ってもよい。たとえば、動物モデルでは、硫化ナトリウムによる処置が、心筋梗塞、敗血症（以下を参照：Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ（２００３）：４７：１５５）、硬変における血管異常（以下を参照：Ｆｉｏｒｕｃｃｉ Ｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（２００５）４２：５３９）の有望な治療薬として、心臓保護剤として（以下を参照：（以下を参照；Ｇｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍ（２００４）３１３：３６２）、神経保護剤として（以下を参照：Ｑｕ Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ．（２００６）８８９）、心筋虚血再灌流障害において（以下を参照：Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ（２００６）１０１：５３）、血管石灰化の抑制のため（以下を参照：Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．（２００６）２７：２９９）、薬剤処置による胃障害の緩和のため（以下を参照：Ｆｉｏｒｕｃｃｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００５）１２９：１２１０）、好中球接着の抑制のため、白血球による炎症の調節のため（以下を参照：Ｚａｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．（２００６）２０：２１１８−２１２０）、勃起不全（以下を参照：Ｓｒｉｌａｔｈａ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００６）５３５：２８０）、過敏性腸症候群において（Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ Ｅ．ら、ＪＰＥＴ（２００６）３１９：４４７）、炎症後の過敏症における抗侵害受容作用のため用いられている。治療用途および関連情報のさらなる例を表Ｉにまとめてある。さらに、この組成物については、種々の生物物質においてステイシスまたはプレステイシスを誘導するために用いてもよく、虚血または低酸素に起因する傷害の処置または予防に用いてもよい。
【０１２５】
「生物物質」という語は、細胞、組織、器官および／または生命体およびこれらの任意の組み合わせなど、任意の生きた生物学的物質をいう。本発明の方法については、生命体の部分（細胞内、組織内および／または１つもしくは複数の器官内など）で実施してもよいし（その部分が生命体内にとどまっているか、生命体から除去されているかは問わない）、生命体全体で実施してもよいことを意図している。さらに、細胞および組織の文脈では、均一および不均一な細胞集団も本発明の実施形態の被検体であってもよいことを意図している。「インビボにおける生物物質」という語は、インビボの、すなわち、そのまま生命体内あるか、生命体に結合している生物物質をいう。さらに、「生物物質」という語は、「生物学的物質」という語と同義であることも理解されよう。ある実施形態では、１つまたは複数の細胞、組織または器官が生命体から分離されていることを意図している。「単離された」という語を用いて、そうした生物物質を説明することができる。本発明の方法は、インビボおよび／または単離された生物物質で実施してもよいことを意図している。
【０１２６】
本発明の方法により処置される細胞は、真核細胞でも原核細胞でもよい。ある実施形態では、細胞は真核細胞である。より詳細には、いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞として、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、フェレット、雌ウシ、ヒツジまたはウマ由来の細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明の細胞は、２倍体であってもよいが、場合によっては、１倍体（性細胞）であってもよい。さらに、細胞は、倍数体、異数体または無核であってもよい。細胞は、心臓、肺、腎臓、肝臓、骨髄、膵臓、皮膚、骨、静脈、動脈、角膜、血液、小腸、大腸、脳、脊髄、平滑筋、骨格筋、卵巣、精巣、子宮および臍帯など、特定の組織または器官由来であってもよい。ある実施形態では、細胞は、血小板、骨髄球、赤血球、リンパ球、脂肪細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、グリア細胞、ニューロン、分泌細胞、バリア機能細胞、収縮性細胞、吸収細胞、粘膜細胞、輪部細胞（角膜由来）、幹細胞（全能性、多能性または複能性）、未受精もしくは受精卵母細胞または精子などの細胞型の１つとして特徴付けられてもよい。
【０１２７】
通常の単純な意味に従い「組織」および「器官」という語を用いている。組織は細胞からなるが、「組織」という語は、一定の種類の構造材料を形成する類似細胞の集合体をいうことが理解されよう。さらに、器官は、組織の特定のタイプである。ある実施形態では、組織または器官を「単離する」が、これは組織または器官が生命体内にないことを意味する。
【０１２８】
「低酸素」および「低酸素の」という語は、酸素レベルが正常未満である環境をいう。通常の生理学的濃度の酸素が細胞、組織または器官に供給されないと、低酸素が引き起こされる。「正常酸素」とは、該当する個々の細胞型、細胞状態または組織の酸素が通常の生理学的濃度であることをいう。「無酸素」は、酸素がないことをいう。「低酸素状態」は、細胞、器官または生命体の低酸素に到る状態をいう。これらの状態は、細胞型および組織または器官内の細胞の個々の構造または位置ばかりでなく、細胞の代謝状態によって異なる。本発明では、低酸素状態は、酸素濃度が通常の大気条件であるか、あるいはそれ未満の２０．８、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０％未満の状態を含む。あるいは、これらの数字は、１気圧（１０１．３ｋＰａ）での気圧に対する割合を表してもよい。「無酸素」は、酸素がないことをいう。酸素濃度がゼロパーセントであれば、無酸素状態である。したがって、低酸素状態は無酸素状態を含むが、いくつかの実施形態で実現する低酸素状態は、０．５％以上である。本明細書で使用する場合、「正常酸素状態」は、約２０．８％あるいはそれ以上の酸素濃度とする。
【０１２９】
水は、標準温度と圧力（ＳＴＰ）で空気に触れると２８０μＭの溶解酸素を含む。ある実施形態では、本明細書に記載のおよび当業者に公知の方法を用いてカルコゲナイド液体医薬組成物を水中で製剤化し、水中の酸素レベルが低酸素状態に低下すると、すなわち、水中の酸素が２８０μＭ未満に低下になると、「製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）低酸素」が生じる。
【０１３０】
別の実施形態では、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）低酸素は、酸素濃度が通常の大気条件であるか、あるいはそれ未満の２０．８、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０％未満である状態を含む。あるいは、これらの数字は、１気圧（１０１．３ｋＰａ）での気圧に対する割合を表してもよい。
【０１３１】
低酸素または無酸素を達成する標準的な方法は十分確立しており、化学触媒の力を借りてチャンバーから酸素を除去する環境チャンバーを用いることを含む。そうしたチャンバーについては、たとえば、ＧＡＳＰＡＫ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ＋Ｃａｒｂｏｎ Ｄｉｏｘｉｄｅ ＥｎｖｅｌｏｐｅｓまたはＢＩＯ−ＢＡＧ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＣｈａｍｂｅｒｓとしてＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）から市販されている。あるいは、チャンバー内の空気を窒素など酸素以外のガスと交換して酸素を取り除いてもよい。酸素濃度については、たとえば、ＦＹＲＩＴＥ Ｏｘｙｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂａｃｈａｒａｃｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）を用いて判定することができる。
【０１３２】
一実施形態では、「有効量」という語は、測定可能な結果を達成できる量をいう。一実施形態では、「有効量」は、たとえば、第２相または第３相の比較臨床試験において医学的処置が必要なヒト被験者に投与した際に、事前に設定した臨床エンドポイント（死亡率など）に対して統計学的に有意な利益が得られる量である。有効量は、疾患または傷害に反応した生物物質の生存性を高める量であるか、生物物質のステイシスまたはプレステイシスを誘導する量である。
【０１３３】
当然のことながら、組織または器官においてステイシスまたはプレステイシスを誘導する際の有効量とは、組織または器官の細胞呼吸の全体量で判定した、組織または器官のステイシスまたはプレステイシスを誘導する量である。したがって、たとえば、特定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物への曝露後、心臓の酸素消費レベル（心臓細胞の全体に関する）が少なくとも約２倍（すなわち、５０％）低下する場合、その特定量は、心臓にステイシスを誘導する有効量であることが理解されよう。同様に、生命体にステイシスまたはプレステイシスを誘導する有効量も、ステイシスまたはプレステイシスに関するある特定のパラメーターの全体または総合レベルについて評価した量である。生命体の特定部分を標的にする場合を除き、生命体にステイシスまたはプレステイシスを誘導する際の有効量は、生命体全体のステイシスまたはプレステイシスを全体的に誘導する量であることも理解されよう。さらに、有効量は、ステイシスまたはプレステイシスを誘導するのに十分な量であってもよいし、たとえば、別の化合物、傷害または病状のような別の薬または刺激と組み合わせてステイシスまたはプレステイシスを誘導するのに十分な量であってもよいことも理解されよう。
【０１３４】
ある実施形態では、本発明の方法および組成物は、処置対象の生物学的物質にステイシスまたはプレステイシスを誘導する。本明細書で使用する場合、「ステイシス」とは、生物学的物質は生きているが、生物物質による二酸化炭素生成の速度または量が少なくとも５０％（すなわち、２倍）低下すること；生物物質による酸素消費の速度または量が少なくとも５０％低下すること；および運動または移動性が少なくとも１０％低下すること（精細胞または心臓もしくは四肢など運動する細胞または組織、あるいは全生命体にステイシスを誘導する際にのみ適用）（「細胞呼吸指標」と総称される）の１つまたは複数を特徴とする低代謝状態をいう。
【０１３５】
本発明のある実施形態では、生物物質による酸素消費速度は、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００倍またはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下することを意図している。あるいは、本発明の実施形態については、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上あるいはそこから導き出せる任意の範囲のように、生物物質による酸素消費速度の低下率という観点から検討してもよいことを意図している。
【０１３６】
酸素消費を測定するにはどのようなアッセイを用いてもよいが、典型的なアッセイでは、閉鎖環境を利用し、環境に導入した酸素と一定時間後に環境内残っている酸素の差の測定を行う。生物物質による二酸化炭素の生成を測定して酸素消費量を判定してもよいこともさらに意図している。したがって、二酸化炭素の生成が減少する場合は、酸素消費の減少に相当することになる。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「プレステイシス」とは、生物物質がステイシスに到るのに通過しなければならない低代謝状態をいう。プレステイシスは、生物学的物質内の代謝低下の規模がステイシスとして定義されるものより小さいことを特徴とする。有効な化合物を用いてステイシスを達成するには、生物物質は生物物質における酸素消費およびＣＯ２生成の低下が５０％未満に分類される低代謝状態を必ず通過しなければならない。代謝または細胞呼吸が５０％未満の程度に低下するそうした一連の現象を、「プレステイシス」の状態と呼ぶ。
【０１３８】
さらに、種々の実施形態では、プレステイシスは、正常な生理的状態と比較して代謝活性の１つまたは複数の指標の低下が１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以下であることを特徴とする。他の実施形態では、プレステイシスは、別の刺激に呼応してステイシスへの移行を強化または促進し得ること、あるいは、傷害に起因する損傷、疾患の発症もしくは進行または出血、特に不可逆的組織損傷、出血性ショックもしくは死亡に到る可能性がある出血からの生物物質の生存を向上させる、またはそれから生物物質を保護できることを特徴とする。本明細書に明示的に例示した本発明の方法は「ステイシス」の誘導に言及する場合があるが、そうした方法を、「プレステイシス」の誘導に容易に適合させることができることと、本発明がそうしたプレステイシスの誘導方法を意図していることとが理解されよう。さらに、ステイシスの誘導に用いた同じ方法および組成物を用いて、その組成物をステイシスの誘導に使用するよりもより少ない投与量および／またはより短い時間で生物物質に与えることで、プレステイシスを誘導してもよい。
【０１３９】
本発明の方法によれば、ステイシスまたはプレステイシスは一時的および／または可逆的であるのが一般的であり、これは、ある程度経った時点で生物物質がステイシスの特徴をもはや示さなくなることと、生物学的物質が死んだり分解したりするほどに処置が有毒でないことを意味する。
【０１４０】
本発明の方法の種々の実施形態によれば、ステイシスまたはプレステイシスを誘導するには、直接ステイシスそのものを誘導する一定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物で生物物質を処置するか、あるいは、それ自体はステイシスまたはプレステイシスを誘導しないものの、代わりに、以下に限定されるものではないが、傷害、疾患、低酸素症、過剰な出血または本明細書に記載するような１種または複数種の有効な化合物による処置などの別の刺激に呼応して、生物物質がステイシスを達成する能力を促進または強化する、またはそれを達成するのに要する時間を短縮する、一定量の本発明の液体カルコゲナイド組成物で生物物質を処置する。
【０１４１】
ある実施形態では、本発明の液体医薬組成物を用いて虚血または低酸素状態にさらされた生物物質の傷害の処置または予防を行う。一実施形態では、こうした方法を用いて、傷害、外傷または救命医療の処置を受けたことがある、受けている、あるいはそうした処置の影響を受けやすい患者を処置する。傷害の原因は、外的侵襲（熱傷、創傷、切断、銃創または手術による外傷、腹部手術、前立腺手術など）、内的侵襲（敗血症性ショック、脳卒中または心停止、血行の急激な低下を引き起こす心発作など）または低温または放射線への曝露など非侵襲的ストレスによる血行の低下であってもよい。傷害は、細胞レベルでは細胞、組織および／または器官を低酸素にさらすことになり、それによりプログラムされた細胞死、すなわち「アポトーシス」の誘導につながることが多い。
【０１４２】
故に、本発明は、組織、器官、四肢、さらに生命体全体を傷害の有害な作用から保護する手段としてそれらを本発明の液体カルコゲナイド組成物と有効量で接触させることを意図している。診察をすぐに受けられない特定のシナリオでは、こうすることで、患者が適切な診察を受けられるまで患者のために「時間を稼ぐ」ことができる。さらに、本発明は、創傷治癒および組織再生の遅延をもたらす恐れがある生物学的プロセスを阻止／遅延することで、組織再生および創傷治癒を誘導する方法も意図している。この文脈では、四肢または生命体に相当な創傷があるシナリオにおいて生物物質を液体カルコゲナイド組成物と接触させ、治癒および再生を阻害する生物学的プロセスに対処することで創傷治癒および組織再生プロセスを支援する。本発明の方法を実行して創傷治癒だけでなく、心停止または脳卒中および出血性ショックなどの外傷を防止または処置してもよい。本発明は、開胸手術（ｔｈｏｒｏａｃｏｔｏｍｙ）、開腹手術および脾臓の処置または心臓手術、動脈瘤、手術、脳手術および同種のものなど救急の外科的手技による外傷の危険に対して重要な意味を持つ。
【０１４３】
ある実施形態では、本発明の方法を実行して心停止または脳卒中の生存性を向上させてもよく、それに起因する虚血傷害を防止してもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、心停止または脳卒中の患者またはその危険性がある患者の生存性を向上させる、またはそうした患者の虚血傷害を緩和する方法であって、心筋梗塞、心停止または脳卒中の前、その後あるいはその前後両方に液体カルコゲナイド組成物を有効量で患者に与えることを含む、方法を含む。
【０１４４】
本明細書で使用する場合、「疾患の処置」という語は、疾患、症候または障害を発症した患者の管理および看護をいう。処置の目的は、疾患、症候または障害の有害作用の減弱にある。処置は、有効な化合物を投与して疾患、症候または障害を除去または制御すると共に疾患、症候または障害に伴う症状または合併症を緩和することを含む。
【０１４５】
ある実施形態では、本発明の方法は、虚血もしくは低酸素傷害または疾患による侵襲の前に、たとえば、患者などの生物学的物質に前処置を行うことを含む。こうした方法については、虚血または低酸素を引き起こす可能性がある傷害または疾患が事前に予定または選択されているか、それが生じるであろうと事前に予測されているときに用いてもよい。例として、自然にあるいは手技の結果、失血が起こる可能性がある大手術、血液の酸素化が不十分になるか、血液の血管送達が減少する可能性がある心肺バイパス（冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ：ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ）術の場合と同様）、または臓器移植が必要な移植患者に輸送および移植するため提供臓器を摘出する前に行われる臓器提供者の処置においてが挙げられるが、これに限定されるものではない。例として、傷害または疾患の進行の危険性が内在する（血管形成術後の不安定狭心症、大外傷または失血後に出血している動脈瘤、出血性卒中においてなど）病態または医療診断検査により危険性が診断される可能性がある病態が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４６】
さらに、本発明のさらなる実施形態は、失血、あるいは適切な血液供給の欠如などによるこれ以外の細胞または組織への酸素補給の不足から、生存性を向上させることおよび不可逆的組織損傷を防止することに関する。これは、たとえば、実際の失血の結果であってもよいし、細胞または組織への血流の閉塞が引き起こす症候または疾患、生命体の局所または全体の血圧を低下させる症候または疾患、血液により運ばれる酸素量を減少させる症候または疾患、あるいは血液中の酸素運搬細胞の数を減少せる症候または疾患によるものでもよい。関連する可能性がある症候および疾患として、凝血および塞栓、嚢胞、増殖、腫瘍、貧血（鎌状赤血球貧血など）、血友病、これ以外の血液凝固に関連する疾患（フォンウィルブランドまたはＩＴＰ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａなど）およびアテローム性動脈硬化が挙げられるが、これに限定されるものではない。そうした症候および疾患は、傷害、疾患または症候が原因で本質的に生命体の細胞または組織に低酸素または無酸素状態をきたすものも含む。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、出血性ショックを起こしている生物学的物質の傷害または損傷を防止してその物質の生存性を向上させる方法であって、出血性ショックの危険性があるまたはその状態にある生物学的物質を、有効量の液体カルコゲナイド組成物とできる限り速やかに、理想的には傷害から１時間以内に接触させることを含む、方法を提供する。この方法を用いれば、患者を管理された環境（手術など）へ搬送することができ、傷害の当初の原因に対処し、その後患者を管理された方法で正常な機能に戻すことが可能になる。この適応症の場合、傷害後の１時間は「ゴールデンアワー」と呼ばれ、成功を収めるうえで決定的に重要である。
【０１４８】
様々な他の実施形態では、本発明の方法を、虚血または低酸素に伴う神経変性疾患の処置、低体温の処置、過剰増殖性障害の処置および免疫障害の処置に用いてもよい。他の様々な実施形態では、生物学的症候は、神経疾患、循環器疾患、代謝疾患、感染症、肺疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患および免疫関連疾患のいずれか１つまたはこれらの組み合わせである。
【０１４９】
ある実施形態では、本発明の方法を用いて、たとえば、単離された細胞、組織および器官など、低酸素または虚血状態にさられたエキソビボの生物物質の生存性を向上させる。そうしたエキソビボの生物学的物質の具体的な例として、血小板および他の血液製剤ならびに移植される組織および器官が挙げられる。
【０１５０】
一実施形態では、たとえば、低温保存および保存の過程で細胞株または実験用生命体を意図的に低酸素または虚血状態にさらす場合など、実験室または調査の状況で本発明の方法を用いて生物学的物質の生存性を向上させる。たとえば、細胞、組織または器官を、本発明の液体カルコゲナイド組成物の存在下で保存または輸送してもよい。本発明の方法を用いて提供組織および器官の生存性を高め、それにより提供組織を移植患者に移植してから血流を回復させるまでの時間を引き延ばしてもよい。こうした方法は、他の保存剤および酸素灌流の使用など現在の保存方法と併用してもよい。本発明は、血小板（特定の実施形態では、無酸素環境で保存された血小板を含む）の生存性を高める方法であって、保存過程で血小板を有効量の液体カルコゲナイド組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【０１５１】
さらに、本発明は、非生存の生物学的物質の保存と、非生物学的物質の保存またはその有効期間の延長のための方法および組成物も提供する。こうした方法は、非生存の生物物質または非生物学的物質を液体カルコゲナイド組成物と接触させることを含む。
【０１５２】
ある実施形態では、または生物学的物質に与える有効な化合物の量は、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍｇ、ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｍ２あるいはそこから導き出せる任意の範囲であってもよい。あるいは、その量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍＭまたはＭあるいはそこから導き出せる任意の範囲で表してもよい。
【０１５３】
本発明の種々の実施形態では、生物学的物質を本発明の液体医薬組成物に、約、少なくとも、少なくとも約または多くても約３０秒間、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、１、２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上およびその任意の範囲または任意の組み合わせで曝露する。
【０１５４】
さらに、投与が静脈内である場合、以下のパラメーターを適用してもよいことを意図している。約、少なくとも約あるいは多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００滴／分またはμ滴／分あるいはそこから導き出せる任意の範囲の流量。いくつかの実施形態では、溶液の量を、液体カルコゲナイド組成物の濃度に応じて体積で規定する。時間の量は、約、少なくとも約あるいは多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、１、２、３、４、５、６、７日間、１、２、３、４、５週間および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月あるいはそこから導き出せる任意の範囲であってもよい。
【０１５５】
全体としてまたは単一セッションで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｍｌもしくはリットルまたはその任意の範囲の量を投与してもよい。
【０１５６】
以下に限定されるものではないが、本明細書で言及した、および／または出願データシートに列挙した上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物についてはすべて、その全体を参考として本明細書に援用する。
【０１５７】
（実施例１）
液体医薬組成物Ｉ〜ＩＶの方法および製造
４つのカルコゲナイド液体医薬組成物を下記のように調製した。
【０１５８】
脱酸素水を用いて原液を調製した。脱酸素水については、空気を真空除去し、圧縮窒素（９９．９９％）で３０分間溶解して酸素を除去した。２．５ＭのＮａ２Ｓの飽和原液を、無酸素の脱イオン蒸留水ですすいだＮａ２Ｓ＊９Ｈ２Ｏ結晶（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ＃５４２５）から調製した。この原液をしっかりとシールし遮光して保存した。ＨＣｌの２２０ｍＭの原液については、濃酸（ＦＩＳＨＥＲ＃Ａ１４４−２１２）を希釈して調製し、圧縮窒素で溶解することで酸素を除去した。
【０１５９】
無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で液体医薬組成物を調製した。ｐＨメーター、バブラーおよびスターラー付きの反応器をグローブボックス内に置いた。グローブボックス内の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。本発明の液体医薬組成物の調製方法は、医薬組成物の製造および保存の各局面で酸素含有量を制限し、酸素が医薬組成物中で０μＭ〜５μＭの範囲で測定されるものである。
【０１６０】
液体医薬組成物を、各口に以下の特徴を持つ摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコ（Ｗｉｌｍａｄ Ｌａｂｓ）で調製した：
ａ）中央オリフィスとｏリングのあるプラスチックキャップが付いた汎用アダプター。このアダプターにｐＨプローブを装着しＯリングでシールした。
【０１６１】
ｂ）ホース継手と中央オリフィスおよびＯリングのあるプラスチックキャップとが付いた汎用アダプター。このアダプターに、ガラスフリットを用いてガス分散チューブを装着した。分散チューブを圧縮ガスボンベに連結し、このチューブを用い圧縮窒素で溶解して溶液から酸素を除去し、Ｈ２Ｓと窒素の混合物でｐＨを中和した。ホース継手にプラスチックチューブを装着し圧力を逃がした。これらの２つの連結を逆にして窒素陽圧下でフラスコの内容物を分注した。
【０１６２】
ｃ）第３の口を摺り合わせの栓でシールし、これを用いてＮａ２Ｓ溶液または水をフラスコに加えた。
【０１６３】
１．液体医薬組成物Ｉ−Ｎａ２Ｓ九水和物
液体医薬組成物Ｉを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素の脱イオン蒸留水を三つ口フラスコに加え、撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１６４】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて２００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１６５】
ｃ）２００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を、撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１６６】
ｄ）２２０ｍＭのＨＣｌを、圧縮窒素で溶解し撹拌しながら、最終ｐＨが７．８〜８．０になるまで加えた。
【０１６７】
ｅ）脱酸素脱イオン水を加えて最終濃度１００ｍＭのＮａ２Ｓを得た。
【０１６８】
２．液体医薬組成物ＩＩ−Ｎａ２Ｓ九水和物
液体医薬組成物ＩＩを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素脱イオン水を三つ口フラスコに加え、撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１６９】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１７０】
ｃ）１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１７１】
ｄ）この溶液を、ｐＨが７．８になるまで圧縮窒素とＣＯ２との５０／５０混合物（９９．９％）でバブリングした。
【０１７２】
３．液体医薬組成物ＩＩＩ−Ｈ２Ｓおよび窒素を含むＮａ２Ｓ
液体医薬組成物ＩＩＩを以下のステップで調製した：
ａ）無酸素脱イオン水を、三つ口フラスコに加え撹拌しながら窒素で３０分間溶解して酸素を除去した。
【０１７３】
ｂ）２．５ＭのＮａ２Ｓ原液を加えて１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を得た。
【０１７４】
ｃ）１００ｍＭのＮａ２Ｓ溶液を、撹拌しながら圧縮窒素で１５分間バブリングした。
【０１７５】
ｄ）この溶液を、ｐＨが８．２になるまで圧縮窒素とＨ２Ｓの５０／５０混合物でバブリングした。この結果、最終濃度が９０ｍＭのスルフィドを得た。
【０１７６】
４．液体医薬組成物ＩＶ−Ｈ２Ｓ
液体医薬組成物ＩＶの最終スルフィド濃度をＮａＯＨの初濃度により判定した。液体医薬組成物ＩＶを以下のステップで調製した：
ａ）５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲の溶液に溶かしたＮａＯＨを添加剤（ＤＴＰＡ、酸化防止剤）と一緒に三つ口フラスコに加えた（図１。）
ｂ）撹拌しながらアルゴンにて５ｐｓｉで１５分間バブリングして、この溶液から酸素を除去した。
【０１７７】
ｃ）この溶液にＨ２Ｓを、ｐＨが７．７（または７．６〜７．８の範囲）に低下するまで撹拌しながらバブリングした。
【０１７８】
ｄ）フラスコのヘッドスペースにアルゴンを流した。
【０１７９】
ｅ）褐色の分注ビンまたはバイアルを、アルゴンが常時流されるグローブボックス内に置き、各ビンまたはバイアルにアルゴンを流した。
【０１８０】
ｆ）製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）をアルゴン下で分注して無酸素環境を維持した。
【０１８１】
この溶液の安定性を、スルフィド濃度、ｐＨおよび吸光度スペクトル（ポリスルフィド形成）を測定してモニターした。追加のアッセイを行い、スルフィット、スルファート、チオスルファートおよび硫黄元素を含む酸化生成物をモニターした。
【０１８２】
窒素陽圧下の密封グローブボックス内で三つ口フラスコから液体医薬組成物を分注した。琥珀色バイアルまたは褐色ビンを不活性アルゴンまたは窒素雰囲気で若干強い圧力で満たし、液体医薬組成物の酸化分解を防止／遅延し、クラウンキャップクリンパー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｚ１１２９７６）を用いてテフロン（登録商標）／シリコンライナー付きプラスチックキャップまたは中央テフロン（登録商標）ライナー付きのシリコンセプタム付きプラスチックキャップでシールし、密閉した。
【０１８３】
（実施例２）
カルコゲナイド液体医薬組成物を無酸素環境で製造すると、スルフィドが安定し、スルフィドの酸素化生成物が減少する
スルフィドが酸素に触れると、図１および図２に示すような種々の酸化生成物が生成される。（以下を参照：Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９７２），ｐ．５２９−５３７；Ｋｏｔｒｏｎａｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２），ｐ．２４２０−２４２８；Ｂｅａｕｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９８４）；ｐ．２５−９７）
無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で製造したときの液体医薬組成物ＩＶの３つの製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）における安定性を検査した。この研究では、グローブボックス内および溶液中の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。液体医薬組成物を実施例１に記載されているように調製した。
【０１８４】
（１）９７ｍＭ、ｐＨ７．６２、２７３ｍＯｓｍ；（２）９８ｍＭ、ｐＨ７．７１、２９１ｍＯｓｍおよび（３）９８ｍＭ、ｐＨ７．７５、２７６ｍＯｓｍなど、液体医薬組成物ＩＶの３つの調製物を調製した。そこの組成物を検査し、無酸素環境で調製するとスルフィドの安定性が向上し、測定可能な酸化生成物が減少するかどうか判定した。液体医薬組成物を、窒素ガスを流してボックス内の酸素含有量を最低限（０．０２μＭ）に抑えた密封グローブボックス内の反応装置で製造した。非経口液体医薬組成物のスルフィドのレベルおよび酸化生成物（ポリスルフィド、スルフィット、チオスルファート、スルファートおよび未知のピーク）を１２９日間にわたって解析した。
【０１８５】
スルフィドをイオン選択電気化学（ＩＳＥ：Ｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で測定した。イオン選択電気化学（ＩＳＥ）は、イオン種を測定する手法である。その電極は、イオンが膜の表面に結合する、イオン種特異的な膜を含んでいた。膜に結合したイオンの量から、溶液中のイオン濃度によって異なる電位差を確認した。スルフィドのレベルは、測定期間にわたり対照に対して１００％の状態が続いた（図３）。
【０１８６】
スルフィット、チオスルファートおよびスルファートについては、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ：Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に解析した。イオン種の解析のためイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）を用いて、二相系におけるサンプル成分のマイグレーションの違いを測定した。固定相との相互作用が弱かったサンプル成分は、カラムで費やす時間が短くなる。イオンが注入から検出までカラムで費やす時間は保持時間と呼ばれ、成分確認の尺度となるのに対し、ピークの高さまたは面積は、成分濃度の尺度となる。このアッセイでのスルファートの検出上限は＜０．０８％であり、潜在的なスルファート値の範囲は、０％〜＜０．０８％と考えられた。ポリスルフィドについては、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘにて３７０ｎＭで測定し、蒸留水Ｈ２Ｏと比較した（以下を参照：Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｗｉｌｅｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７７，ｐ．１１１４−１１２０；Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｍ．Ｒ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７９，ｐ．１４０６−１４１４；Ｔｏｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｏｌｏｇｙ．１９９７，ｐ．９３−１０３；Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７２，ｐ．５２９−５３７；Ｋｏｔｒｏｎａｒｏｕ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９２，ｐ．２４２０−２４２８）。検出された酸化生成物の量を図５Ａに示す。
【０１８７】
（実施例３）
ＤＴＰＡの存在下または非存在下でのポリスルフィド形成で測定される液体医薬組成物ＩＶの安定性
合成キレート剤でスルフィドの液体医薬組成物の安定性を高められるかどうかを調べた。２つの液体医薬組成物（液体医薬組成物ＩＶ）を、無酸素環境を創出するため窒素ガスで満たした簡便なグローブボックス中のドラフト内で調製した。液体カルコゲナイド組成物を、ｐＨ測定用、ガス添加用アクセスポートと外部雰囲気と接触させずに分注することができるポートとがある、液体カルコゲナイド組成物を保持する摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコ（入れ物）を含む密封容器内で製造した。入れ物に窒素ガスまたはアルゴンガスを流し、酸素含有量を最小限に抑えた。これらの医薬組成物の最終スルフィド濃度をＮａＯＨの初濃度により判定した。
【０１８８】
ＮａＯＨ溶液を、添加剤を一切使用せずに、あるいは安定性を高めるためＤＴＰＡを用いて三つ口フラスコに入れた。どちらの製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）にもＮａＣｌを含ませ浸透圧モル濃度のバランスを取り、撹拌しながらアルゴンにて５ｐｓｉで１５分間溶解して溶液から酸素を除去した。グローブボックス内の酸素レベルを、感度レベルが０．０３μＭの酸素メーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）でモニターした。検査対象の液体医薬組成物、９７ｍＭのスルフィドＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）を、合成キレート剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（１ｍＭ）を使用してあるいは使用せずに作製した。スルフィドおよびポリスルフィドのレベルを、０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）を用いてピーク吸光度３７０ｎｍで測定値した。図４に示すように、１ｍＭのＤＴＰＡが存在した場合、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）におけるスルフィドの安定性が１２９日目に向上した。
【０１８９】
酸化生成物のスルフィット（ｕＭ）、スルファート（ｕＭ）、チオスルファート（ｕＭ）および３７分で測定された未知の生成物（Ｕ）を１２９日目に測定した。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、１ｍＭのＤＴＰＡが存在した場合、酸化生成物のレベルが１２９日目に低下した。１２９日間の終了時に測定されるポリスルフィド形成は、全スルフィド濃度に対して０．０３％未満である。
【０１９０】
（実施例４）
スルフィドの液体医薬組成物におけるｐＨは安定している
硫化水素は、弱い二塩基酸であり、溶液中で３つの形（Ｈ２Ｓ、ＨＳ−およびＳ２−）で存在している。溶液中の硫黄種の割合は、ｐＨによって異なる。ｐＨ７では、ＨＳ−が主要な種である。ｐＨ７未満ではＨ２Ｓが支配的な種となる（以下を参照：Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＤＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９７７，ｐ．１１１４−１１２０）。
【０１９１】
液体医薬組成物ＩＶにおけるスルフィドの製剤安定性を検査するため、１２９日間の特定の時点でｐＨを測定した。１００ｍＭのスルフィドＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）の液体医薬組成物を、窒素ガスを流してボックス内の酸素含有量を最低限（測定値０．０２μＭ未満）に抑えた密封グローブボックス内の反応装置で製造した。ｐＨメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてｐＨを、０、８、２２、３０、３７、５１、７２、１００および１２９日目に測定した。ｐＨは、平均値が７．６８±０．０４（平均と標準偏差）と１２９日間にわたって安定していた（図６）。
【０１９２】
商業的に許容可能な様々な温度および期間で保存した後、濃度、ｐＨおよび重量オスモル濃度など、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ：Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の許容基準に適合した硫化ナトリウムの液体医薬組成物を調製した。
【０１９３】
（実施例５）
液体医薬組成物ＩＶの投与後のラット尿におけるスルフィドおよび酸化生成物の検出
齧歯動物を用いて尿中のスルフィド酸化生成物の代謝プロファイルを測定した。ラットの尿における酸化生成物のチオスルファートおよびスルファートのレベルを測定し、その後、液体医薬組成物ＩＶ（９８ｍＭのスルフィド、ｐＨ７．６５、２９３ｍ／Ｏｓｍｏｌ）を静脈内ボーラス投与した。
【０１９４】
１０〜１１週の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０グラム）（Ｔａｃｏｎｉｃ），Ｐｒｕｎｅｄａｌｅ，カリフォルニア州）を麻酔（１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）し、２つの頸静脈カテーテル（ＪＶＣ：ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ ｃａｔｈｅｔｅｒ）および尿道カニューレを埋植した。実験の期間中、麻酔を維持した。液体医薬組成物ＩＶ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のボーラス投与量を、頸静脈カテーテルを介して注射した。実験の期間中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、インフュージョンポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて３ｍＬ／時間の速度で注入した。注射前（時＝０）および投与後６０分まで１５分間隔で尿サンプルを採取し、解析のため４℃で保存した。
【０１９５】
尿中のチオスルファートおよびスルファートのレベルを、イオンクロマトグラフィー（Ｍｅｔｒｏｓｅｐ Ａ ｓｕｐｐ５カラムを備えたＭｅｔｒｏｈｍ ＡＧ８６１ ＩＣ）により解析した。尿サンプルをＩＣ溶離液（３．２ｍＭの炭酸ナトリウム／１．０ｍＭの炭酸水素ナトリウム）で１：２０に希釈した。６０分後に排泄されたチオスルファートのレベルは、３００μＭに上昇した（図７Ａ）。排泄されたスルファートのレベルは、６０分間にわたり平均２２±３ｍＭであった（図７Ｂ）。これらのデータから、スルフィド酸化生成物のチオスルファートおよびスルファートが尿中に排泄され、イオンクロマトグラフィーで検出可能であることが示される。
【０１９６】
（実施例６）
液体医薬組成物ＩＶの投与後のラット血中におけるスルフィドおよびチオスルファートの検出
液体医薬組成物ＩＶの静脈内ボーラス投与後に誘導体化法およびＧＣ−ＭＳ解析を用いて、ラット血中のスルフィドおよびチオスルファートのレベルを測定した。
【０１９７】
頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）および頸動脈カニューレ（ＣＡＣ：ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｃａｎｎｕｌａ）を挿入した１０〜１１週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット３匹（３２６〜３５０）グラム（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｐｒｕｎｅｄａｌｅ，ＣＡ）を用いた。この動物を、実験手順を開始する前の５〜６日間、温度と湿度が制御された環境で回復および馴化させた。食物および水を自由に与えた。
【０１９８】
各ラットからベースライン血液サンプル（約０．３ｍｌ）を、頸動脈カニューレを介して２３ｇのルアースタブアダプターを装着したヘパリンコーティング１ｍｌシリンジに採取した。サンプリング後、対応する量の食塩水を、続いて１００μｌのヘパリン溶液（ヘパリン加デキストロース５０ＩＵ／ｍｌ）を、頸動脈カニューレを介して動物にゆっくりと注射した。ボーラス投与量（１ｍｇ／ｋｇ 静脈内）の液体医薬組成物ＩＶ（９８ｍＭのスルフィド、ｐＨ７．６５、２９３ｍＯｓｍ）を、頸静脈カテーテルを介して注射した。頸動脈カテーテルによる投与後、２３ｇのルアースタブアダプターを装着したヘパリンコーティング１ｍＬシリンジを用いて血液（約０．３ｍＬ）をすぐに採取した。記載の通り血液サンプルをすぐに処理した。サンプリング後、対応する量の食塩水を、頸動脈カテーテルを介して動物にゆっくりと注射した。血液サンプリングを注射後１０分、３０分、６０分、２時間および４時間後に繰り返した。
【０１９９】
０．２ｍｌのラット血液をシリンジで採取し、５％ＮａＣｌ、２００ｍＭのアスコルビン酸（新たに調製）、２０ｍＭのペンタフルオロベンジルブロミド（ＰＦＢＢｒ：ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌｂｒｏｍｉｄｅ）のアセトン溶液を含む９ｍｌの琥珀色バイアルにすぐに加えた。調製物をスクリューキャップ（ＰＴＦＥ被覆セプタム付き）で閉じ、１分間ボルテックスした。この混合物を１５分インキュベートさせ、次いで各バイアルに、無酸素の四ホウ酸ナトリウム飽和水に溶かした５ｍＭのテトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド溶液、酢酸エチルに溶かした２５ｍＭのヨウ素溶液、酢酸エチルに溶かした５０ｍＭのペンタフルオロベンジルブロミド溶液に加えた。この調製物を３０秒間ボルテックスし、次いで５分間インキュベートした。次に１００ｍｇのリン酸二水素カリウムを加え、この溶液を３０秒ボルテックスした。次にこの溶液を１時間インキュベートし、反応を終了させ、その後、２５００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清（有機相）を除去し、ＧＣ／ＭＳによる解析のため完全に乾燥させた。（Ｋａｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）３３：２１７；Ｋａｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９１）１５：１４８）．
これらの結果から、ＰＦＢ−Ｂｒ誘導体化法を用いて、ボーラス投与量の液体医薬組成物ＩＶを静脈内注射したラットの血中でスルフィドおよびチオスルファートを同時に検出することができることが示される（図８Ａおよび図８Ｂ）。２４０分間の研究期間にわたりスルフィドのレベルを血液から収集し、最高血中濃度には１０分で到達した（図８Ｂ）。
【０２００】
（実施例７）
液体医薬組成物は低酸素状態での生存を向上させる
ガス状Ｈ２Ｓによる処置は、低酸素状態での動物の生存能力を向上させることが明らかになっている。しかしながら、直ちに生命を脅かす傷害が遠隔地で生じた場合など、一定の環境下では、カルコゲナイド液体医薬組成物で患者を処置できれば非常に都合がよい。実施例Ｉに記載されているように液体スルフィド組成物を調製し、低酸素環境での動物の生存能力を向上できるどうかを検査した。
【０２０１】
実験の一セットでは、頸静脈にカテーテル（ＪＶＣ）を埋め込んだ雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５〜６週齢）（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて、この動物に１ｍＬまたは５ｍＬのルアーロックシリンジＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）で液体スルフィド液体医薬組成物を注入して３種類の液体医薬組成物を検査した。Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＤＳ）社製のＩＰＴＴ−３００トランスポンダーを用いて体温をモニターした。実験の少なくとも２４時間前にトランスポンダーを動物の背部に皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。トランスポンダーを介してＢＭＤＳ社製のＤＡＳ−６００８データ収集モジュールでマウスの体温を記録し、データをコンピュータースプレッドシートに入力し、時間に対してプロットした。
【０２０２】
インフュージョンポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により留置カテーテルを介して液体医薬組成物を各マウスに投与した。皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまでマウスに注入した。体温が３３℃まで低下する前にマウスが苦痛の徴候を示した場合、注入を１０分間停止し、前の速度よりも遅い速度で再開した。動物の体温が３３℃以下に低下したら、注入を停止し、マウスを低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に移した。
【０２０３】
第１の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＪＶＣ０７）にｐＨ７．７５の液体Ｎａ２Ｓ溶液（液体医薬組成物Ｉ）を注入した。この例の液体医薬組成物Ｉの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を脱酸素脱イオンＨ２Ｏで濃度４３ｍＭに希釈し、ｐＨのモニタリングと、ほとんど空気接触のないガス添加とが可能な摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコで３０分間撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解することにより、この溶液から酸素を除去して行った。溶液のｐＨをＮ２で溶解し撹拌しながら、２２０ｍＭのＨＣｌを用いて７．７５に調整した。最終溶液（液体医薬組成物Ｉ）をアルゴン下で琥珀色バイアルに分注してヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。液体医薬組成物Ｉの調製に使用したＮａ２Ｓの飽和原液それ自体は、脱酸素脱イオンＨ２Ｏ１ミリリットル当たり約１．０ｇの洗浄Ｎａ２Ｓ結晶を溶解して調製し、この原液を遮光し、密栓して保存しておいた。
【０２０４】
マウスに０．８ｍＭ／ｋｇのＨ２Ｓ液体医薬組成物Ｉを、皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまで注入速度６．４μＬ／分で６０分間にわたって有効用量にて注入した（図９）。次いで注入を停止し、１分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。１時間後、マウスを低酸素チャンバーから取り出し、ケージに収容し、モニターした。マウスは、処置後に苦痛の徴候をまったく示さなかった。これに対し、対照ビヒクルで処置したマウスは、死亡した（図１０）。
【０２０５】
第２の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＣＡＴ０８）に、ｐＨ８．２のＮａ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＩ）を注入した。液体医薬組成物ＩＩの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を脱酸素脱イオンＨ２Ｏで濃度４１ｍＭに希釈し、摺り合わせ備品（ｇｒｏｕｎｄ ｆｉｔｔｉｎｇｓ）付きの三つ口フラスコで３０分間撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解することにより、この溶液から酸素を除去して行った。ＮａＣｌを加えて、この溶液の最終浸透圧モル濃度を３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌに調整した。Ｎ２およびＣＯ２の５０／５０混合物で溶解してｐＨを調整した。最終溶液（液体医薬組成物ＩＩ）をできるだけ空気に触れないように琥珀色バイアルまたはビンに分注し、ヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。
【０２０６】
マウスに最初の注入速度８μＬ／分で６２分間注入を行った。３０分の注入後、苦痛の徴候が観察されたため注入を４μＬ／分に減らした。４μＬ／分で１２分間注入後、体温が３３℃に下がるまで注入速度を６μＬ／分に上げた。注入を停止し、５分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。マウスは、低酸素雰囲気で６０分間生存した。
【０２０７】
第３の実験では、マウス（ＩＤ：ＭＪＶＣ０３）にＮａ２Ｓ（Ｈ２Ｓおよび窒素で緩衝処理）の液体Ｐ医薬組成物ＩＩＩ（ｐＨ８．３５）を注入した。この例では、液体医薬組成物ＩＩＩの調製については、Ｎａ２Ｓの飽和原液を６５ｍＭに希釈し、摺り合わせ備品付きの三つ口フラスコで３０分撹拌しながら１００％Ｎ２で溶解してこの希釈溶液から酸素を除去し、Ｎ２およびＨ２Ｓの５０／５０混合物で溶解することでｐＨを調整して行った。最終溶液（液体医薬組成物ＩＩＩ）をできるだけ空気に触れないように琥珀色バイアルまたはビンに分注し、ヘッドスペースをできるだけ残さないようにし、テフロン（登録商標）／シリコンライナーまたはセプタムを用いてキャップでシールした。
【０２０８】
マウスにＮａ２Ｓ（Ｈ２Ｓおよび窒素で緩衝処理）液体医薬組成物ＩＩＩを注入速度４．３μＬ／分で６０分間にわたり注入した。体温が３３℃まで低下したとき注入を停止し、１分以内にこの動物を低酸素雰囲気（４．０％Ｏ２）に置いた。マウスは、４．０％低酸素で５３分生存した。
【０２０９】
マウスを液体Ｈ２Ｓで処置したときに得られた結果と対照的に、ビヒクルを注入（１０μＬ／分）した対照（未処置）雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（平均体重２２グラム）は、４．０％Ｏ２でわずか平均７分しか生存せず、体温の低下は平均でわずか０．０６±０．３８℃にとどまった。
【０２１０】
別の実験では、実験化合物の処置をまったく受けたことがないカニューレ挿入雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＲＪＶＣ４０）（３１０グラム、Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて、ｐＨ７．９の液体医薬組成物（５０ｍＭのＨ２Ｓ）（液体医薬組成物ＩＶ）の保護作用を検査した。この動物に血管内留置カテーテルを外科的に埋植し、任意の手順の前にストレスおよび疾患の徴候について調べた。手順の前に動物の体重を測定し、体重をケージカードに記載した。Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＤＳ）社製のＩＰＴＴ−３００トランスポンダーを用いて体温をモニターした。実験の少なくとも２４時間前にトランスポンダーを動物の背部に皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。トランスポンダーを介してＢＭＤＳ社製のＤＡＳ−６００８データ収集モジュールでマウスの体温を記録し、データをコンピュータースプレッドシートに入力し、時間に対してプロットした。
【０２１１】
苦痛の徴候および皮下に埋植したＩＰＴＴ−３００トランスポンダーで測定した体温の低下をモニターしながら、ラットに、インフュージョンポンプ（Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により留置カテーテルを介してｐＨ７．９の５０ｍＭのＨ２Ｓ（液体医薬組成物ＩＶ）を２８３分間にわたり注入した。開始の注入速度は６．５μＬ／分で、皮膚に埋植した温度チップが３３℃の体温を記録するまで１５分ごとに６．５μＬ／分ずつ上昇させた。動物が苦痛の徴候を示した際、注入を１０分間停止し、前の速度よりも遅い１３．０μＬ／分速度で再開した。体温が３３℃まで低下したとき注入を停止し、８分以内にこの動物を低酸素雰囲気（３．５％Ｏ２）に置いた。動物は３２分間生存した。低酸素チャンバー内で測定した体温は２．５℃低下した。
【０２１２】
４匹（未処置）の雄性ＳＤラット（平均体重３４２グラム；ハーラン（Ｈａｒｌａｎ））の対照群は、３．５％Ｏ２で平均１５±４分生存し、体温は平均１．６±０．２℃低下した。
【０２１３】
これらの実験から、硫化水素の液体医薬組成物には、低酸素状態で動物の生存能力を向上させる保護作用があることが確認される。さらに、この結果からは、Ｈ２Ｓの液体医薬組成物の投与は、たとえば、傷害または疾患により誘発される低酸素または虚血状態にある患者、あるいはその危険性がある患者にとって有益であり、生物学的物質を低酸素傷害または虚血傷害から保護し、これを防ぐ手段となることも確認される。
【０２１４】
（実施例８）
スルフィドの液体医薬組成物は、マウスの肝虚血再灌流障害モデルにおいて肝傷害からの細胞保護効果をもたらす
マウスの肝虚血再灌流（Ｉ／Ｒ：ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に細胞保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、肝虚血後および５時間の再灌流期間の直前に液体医薬組成物ＩＶ（スルフィド、９５ｍＭ、ｐＨ７．９２）を腹腔内ボーラス投与すると、血清中で測定される肝トランスアミナーゼのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が減少し、病理組織スコアが改善することが証明される。一方、ビヒクルで処置しても、肝Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２１５】
これらの研究で用いたマウスは、８〜１０週のＣ５７−ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）であった。食物および水を自由に与えた。実験手順を開始する前に温度および湿度が管理された環境で被検動物を馴化させた。
【０２１６】
マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔し、外科的手技の過程で加温を維持し、肝虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を誘導した。具体的には、正中切開し、肝臓を露出させ、ヘパリンを注射し、血液凝固を防止した。肝動脈と門脈をともに微小動脈瘤鉗子でクランプし、肝臓の左側葉および中葉を虚血状態にした。肝臓を腹膜腔内の元の位置に維持して４５分間虚血を行い、０．９％生理食塩水に浸したガーゼで湿性を保った。対照マウスにはシャム手術を行ったが、微小動脈瘤鉗子で肝血流量を減少させなかった。４５分後、微小動脈瘤鉗子を除去した。５時間の肝再灌流後に分光光度法および市販されている試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて血清中の肝トランスアミナーゼのレベル（ＡＳＴまたはＡＬＴ）を検査した。
【０２１７】
マウスの肝虚血再灌流障害被検動物を無作為に４群に割り付けた。群１はビヒクル処置；群２は０．３ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；群３は１．０ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置および群４は３．０ｍｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置であった。図１１に示すように、ＡＳＴのレベルは、検査対象の最高濃度（３．０ｍｇ／ｋｇ）で統計学的に有意な低下が認められた。３つの処置群（０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）でビヒクルと比較してＡＬＴのレベルが低下した。
【０２１８】
（実施例９）
スルフィドの液体医薬組成物は、マウスの心筋虚血再灌流モデルにおいて心保護効果をもたらす
マウスの心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、虚血後および２４時間の再灌流期間の５分前に液体医薬組成物ＩＶ（９５ｍＭ、ｐＨ７．６５）を左心室腔にボーラス投与すると、危険領域に占める割合で心筋虚血が減少し、心筋梗塞サイズが縮小したことが明らかにされる。関連研究では、研究開始の２４時間前に液体医薬組成物ＩＶをプレコンディショニングボーラス投与量で投与すると、心筋梗塞サイズ（危険領域に占める割合）（心筋梗塞）が有意に縮小した（図１６）。一方、ビヒクルで処置しても、心筋Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２１９】
これらの研究で用いたマウスは、８〜１０週のＣ５７−ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）であった。食物および水を自由に与えた。実験手順を開始する前に温度および湿度が管理された環境で被検動物を馴化させた。
【０２２０】
マウスをケタミンおよびペントバルビタールナトリウムで麻酔し、外科的手技の過程で加温を維持し、心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を誘導した。マウスを手術台に腹側で置き、経口挿管し、モデル６８３齧歯動物用人工呼吸器に接続した（一回換気量は２．２ｍＬ、呼吸数は毎分１２２回、人工呼吸器サイドポート経由で１００％酸素を補給。）（Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。胸部を開き、近位左主冠動脈を露出させ、結紮した。心筋および冠動脈閉塞を３０分間維持し、続いて縫合糸を除去し、２４時間再灌流した。
【０２２１】
虚血後の再灌流から２４時間後、マウスを麻酔し、挿管し、齧歯動物用人工呼吸器に接続した。エバンスブルー色素を、総頸動脈に通したカテーテルに注入した。胸骨正中切開を行い、左主冠動脈を前と同じ場所で再結紮した。エバンスブルー色素で可視化して虚血ゾーンを非虚血ゾーンと区別し、心臓を速やかに切除し、短軸に沿って連続的に切断して１ｍｍの５枚の切片とし、これを１．０％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃にて５分間インキュベートし、危険ゾーン内の生存心筋と非生存心筋を区別した。５枚の心筋スライス（１ｍｍ）をそれぞれ秤量し、サンプル内容を知らされていない観察者がコンピューター支援面積測定を用いて梗塞領域、危険領域（ＡＡＲ）および非虚血性左心室を評価した。左心室の危険領域（ＡＡＲ）および梗塞サイズの判定のすべての手順（以下を参照：Ｊｏｎｅｓ，ＳＰ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００４））．２８６：Ｈ２７６−Ｈ２８２）。
【０２２２】
データを、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアバージョン５．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて事後的なボンフェローニ分析により２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）で解析した。データを平均値±平均値の標準誤差として報告する。ｐ値が０．０５未満の場合に有意と見なした。
【０２２３】
マウスの心筋虚血再灌流モデル被検群の動物１０〜１３匹を以下の４つの処置群に無作為に割り付けた。群１：ビヒクル処置；群２：５０μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；群３：１００μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置；および群４：５００μｇ／ｋｇの液体医薬組成物ＩＶによる処置。この研究では、虚血の３０分および２４時間の再灌流期間の前に液体医薬組成物ＩＶ（９７ｍＭ、ｐＨ７．６５）を左心室腔にボーラス投与すると、５０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ用量投与処置群において危険領域に占める割合で心筋梗塞サイズが縮小した（図１２）。試験対象の最高濃度（５００μｇ／ｋｇ）で処置した動物４匹が生存した。ビヒクルでは心筋Ｉ／Ｒ傷害の保護効果はまったく得られなかった。
【０２２４】
第２の実験では、動物を手術および虚血の２４時間前に、ボーラス投与量の液体医薬組成物ＩＶで前処置（プレコンディショニング投与）した。液体（ｌｑｕｉｄ）医薬組成物で前処置（１００μｇ／ｋｇ）すると、梗塞サイズの有意な縮小が測定され、心筋壊死に対する保護作用が得られた（図１６）。
【０２２５】
（実施例１０）
大型哺乳動物において軽度の低体温を誘導するための、液体医薬組成物ＩＶの方法および使用
液体医薬組成物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶが齧歯動物の中核体温を抑制することはすでに証明されている（実施例７）。心停止においては、心臓手術時の患者の広範囲な虚血の神経保護剤として、さらに再灌流障害の軽減を目的として軽度の低体温誘導が用いられている（以下を参照：Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００３），１０８：１１８−１２１０）。この研究では、軽度の低体温モデルを用いて液体医薬組成物ＩＶが大型動物の体温を低下させるという仮説を確認した。液体医薬組成物ＩＶを雌性ブタの２つのコホートに６０分にわたり投与し、体温の変化率を経時的に測定した。
【０２２６】
雌性ブタ（２０〜２５ｋｇ）を収容し、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に記載されているように適切な管理を施した。温度を６１〜８１°Ｆおよび相対湿度を３０〜７０％に維持するように環境管理内容を設定した。明暗各１２時間周期として、部屋の換気回数を最低でも１０回／時間とした。
【０２２７】
ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２．０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを筋肉内（ＩＭ：ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ）投与して動物を麻酔した。次いで、すぐに各動物に挿管し、イソフルラン吸入剤（０．５〜２．５％）を用いて麻酔状態を維持した。吸入麻酔については、従量式レスピレーターまたは再呼吸装置により送達した。静脈内カテーテルを、乳酸加リンゲル液（１０ｍｌ／ｋｇ／時間）および任意の必要な救命救急薬（投与の薬剤、用量、経路および部位を手術ファイルに記述した）の投与のため頸静脈に留置した。イソフルラン濃度、酸素の割合、ＳａＯ２％、脈拍、呼吸数および毛細血管再充満時間を１５分ごとに手作業で記録した。血圧およびＥＫＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ）を、研究を通じてモニターした。中核体温については、中核体温を得るため動物の食道に挿入した食道温度プローブを用いてモニターした。
【０２２８】
動物５〜６匹の２つのコホートを記載のように麻酔した。ＥＫＧ、動脈圧および中核（腹部）温度を測定した。動物を３０分間のベースライン期間中麻酔状態に維持した。３０分間のベースライン期間後、被検ブタにリンゲル液と、別の静脈ラインを通じてビヒクルまたはリンゲル液と、別の静脈ラインを通じて液体医薬組成物ＩＶとを６０分間注入（２．５ｍｇ／ｋｇ／時間）した。動物を６０分間の注入期間中観察した。中核温度を１秒間隔で測定した。６０分間の注入の後、麻酔から回復前の４０分間動物を観察した。
【０２２９】
肝臓直下の腹部に配置した温度プローブから中核温度を記録した。ＰｏｗｅｒＬａｂデータ収集器具およびソフトウェアを用いてデータを直接コンピューターに取り込んだ。氷冷乳酸リンゲル液を１時間注入する過程で記録したデータポイントを、回帰分析のためＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにエクスポートした。
【０２３０】
全体の温度変化および変化速度（回帰直線勾配）について群平均を計算し、スチューデントのｔ検定で比較検討した。
【０２３１】
これらの実験から、ブタ（２０〜２５ｋｇ）では、液体医薬組成物ＩＶが低体温誘導処置により誘導される低体温の程度を高めることが確認される。液体医薬組成物ＩＶを投与すると、ビヒクルと比較して中核体温に統計学的に有意な変化が生じる（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。データによって、大型動物に低体温を誘導するうえで液体医薬組成物ＩＶが有効であることが明らかにされる。
【０２３２】
（実施例１１）
液体医薬組成物ＩＶはブタの心筋梗塞モデルにおいて局所虚血を減少させる
ブタの心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害モデルを用いてスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、虚血後（１２０分の再灌流期間の５分前に開始）に液体医薬組成物ＩＶ（１００ｍＭ、ｐＨ７．８０、２９２ｍＯｓｍ）のボーラス投与、続いて６０分の注入を左心室腔に行うと、危険領域に占める割合で心筋虚血が減少し、心筋梗塞サイズが縮小したことが明らかにされる。一方、ビヒクルで処置しても心筋Ｉ／Ｒ傷害モデルの保護効果はまったく得られなかった。
【０２３３】
動物を個別に収容した。食物および水を自由に与えた。実験はすべて、実験動物の管理と使用を規制する米国国立衛生研究所の指針に準じた。
【０２３４】
雌雄両性のブタ（３５〜４５ｋｇ）を塩酸ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で鎮静させ、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射で麻酔した。イソフルランからなる全身麻酔を、実験を通じて維持した。従量式ベンチレーターを用いて気管内挿管により換気（酸素４０％；一回換気量１０００ｍＬ；換気回数１２回／分；終末呼気陽圧３ｃｍ Ｈ２Ｏ；吸気時間と呼気時間の比１／２）を与えた。静脈アクセスおよびＩＶ注射のため右大腿静脈をカニューレ処置し、動脈血のサンプリングおよび動脈内圧のモニタリングのため右総または浅大腿動脈をカニューレ処置した。ヘパリンナトリウムおよび１％リドカインを開胸の前に投与した。ヘパリンを実験の終了時まで３０分ごとに投与した。胸骨正中切開により心嚢を露出させ、開放して心膜クレイドルを形成した。カテーテル付きマノメーターを心尖部から左心室（ＬＶ）に導入し、ＬＶ圧を記録した。血管を適切に露出させてから、左前下行枝またはその大きな対角枝の遠位１／３のあたりに血管ループを通した。血管ループを締めて冠動脈を閉塞させ、次いで、モスキート鉗子でクランプし安定させた。心筋表面の局所チアノーゼにより心筋虚血を視覚的に確認した。
【０２３５】
ブタを無作為に群分けし、４５分の局所虚血（閉塞）、続いて１２０分の再灌流を施した。動脈圧（収縮期圧、拡張期圧、平均血圧）、心拍数、局所的な短縮率（ＬＶ ｄＰ／ｄｔ）および心筋組織血流を、Ａｃｑｕｉｒｅ Ｐｌｕｓプロセッサーボードおよび左心室圧解析ソフトウェアおよびＧｏｕｌｄ ＥＣＧ／Ｂｉｏｔａｃｈを用いて実験を通じて連続的に取得した（ＰＯ−ＮＥ−ＭＡＨデジタルデータ収集システム，（Ｇｏｕｌｄ，Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｅｗ，ＯＨ）。液体医薬組成物ＩＶまたはビヒクルを、冠動脈鉗子を除去し始める５分前から投与し（ボーラス（１００ｍｃｇ／ｋｇ）および１ｍｇ／ｋｇ／時間注入）、再灌流期間中に６０分間注入を継続した。
【０２３６】
局所心筋機能を、虚血領域から約１０ｍｍ離れた心内膜下層に埋植した超音波プローブ（２．０ｍｍ）を用いてソノミクロメトリー（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，カナダ）で評価した。プローブについては、２対を心臓の短軸と平行に設置し、ポリプロピレンステッチ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＧ）で心外膜に取り付けた。実験の終了までプローブをそのままにしておいた。拡張末期ポイントおよび収縮末期ポイントを正確に識別するため、後処理ソフトウェア（ＳｏｎｏＶｉｅｗ，Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，カナダ）を用いてデジタルデータを点検した。正常洞調律の少なくとも３回の心周期において測定を行い、次いで平均した。呼吸の影響を排除するためデータ収集中はベンチレーターを停止させた。拡張末期セグメント長（ＥＤＬ：ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）を正のＬＶ ｄＰ／ｄｔの開始時に、収縮末期セグメント長（ＥＳＬ：ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）を負のｄＰ／ｄｔのピーク時に測定した。局所収縮性を局所心筋短縮率（ＳＳ：ｓｅｇｍｅｎｔ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）で評価した。壁運動異常を、拡張期終了後の心筋の隆起と定義される収縮期隆起（ＳＢ：ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｂｕｌｇｉｎｇ）として評価した。収縮期駆出後の短縮は、収縮後短縮（ＰＳＳ：ｐｏｓｔｓｙｓｔｏｌｉｃ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）である。ＳＳ率の経時的変化を４〜５つの特有の水平距離および／または垂直距離の平均値±平均値の標準誤差から算出し、ベースラインに対する比で表し、個々の動物間のばらつきを最小限に抑えた。ＳＳの経時的変化を平衡値に対する比で表し、個々の動物間のばらつきを最小限に抑えた。
【０２３７】
血液ガスおよびヘマトクリットを、１０〜１５分ごとにコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）２３８ｐＨ／血液ガスアナライザーおよびコーニング２７０ＣＯ−オキシメーターを用いてモニターした。血液ガスおよび酸塩基パラメーターをＰＯ２＞１００ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３±０．３；および温度３７℃に維持した。
【０２３８】
実験の終了後に関連する動脈を結紮してからモナストリルブルー色素を大動脈に注射して、虚血危険領域を明確にした。梗塞サイズを、トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）により判定し、危険領域に対する比で表した。危険領域および梗塞ゾーンの面積をコンピューター化された面積測定（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）で測定した。
【０２３９】
左心室の危険領域（虚血ゾーン）および非虚血領域（対照ゾーン）からの心筋組織サンプル（およそ０．５ｇ）は、心外膜、心筋および心内膜組織で構成され、各実験の終了時に採取して２つのサンプルに分けておいた。虚血ゾーンサンプルと非虚血ゾーンサンプルの確認については、モナストリルブルー色素を注射して行った。サンプルを急速凍結するか、必要に応じて包埋した。
【０２４０】
血液サンプルを採取し、遠心し、および／または氷上で保存した。ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて統計解析を行った。すべての変数の平均値±平均値の標準誤差を示す。統計学的有意性を、群を「被験者間」要因とし、時間を「対象内」要因として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）で判定した。ボンフェローニ補正を用いて個々の時点での平均効果について群間の事後比較を行い、検査の多重性を調整した。梗塞サイズにおける群間の統計的な差をＡＮＯＶＡで評価した。線形回帰分析を行い、各群における局所心筋短縮率、梗塞サイズおよび局所虚血時間の関係を判定した。群間の回帰直線の差を一般線形モデルを用いて比較検討した。さらに、顕著な非線形（たとえば、二次）効果についても一般線形モデルを用いて検査した。ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意と見なした。
【０２４１】
この研究では、４５分間の虚血および１２０分間の再灌流期間の５分前に液体医薬組成物ＩＶを左心室腔にボーラス投与し、続いて６０分間注入を行うことで、危険領域に占める割合で心筋梗塞サイズが縮小した（図１４）。心筋Ｉ／Ｒ傷害においてビヒクルの保護効果は、まったく得られなかった。
【０２４２】
（実施例１２）
液体医薬組成物ＩＶは、イヌにおける心肺バイパス後の心機能を保護する
現在まで、一般的な心臓手術の大部分は、心筋保護下の心停止により体外循環を用いて行われている。心機能不全が臨床的に明らかでない場合でも、圧−容積関係を用いたヒト研究に記載されているように心筋収縮力の低下が起こる可能性がある。さらに、術後合併症として冠血管内皮および末梢血管機能の傷害が見られる場合もある。さらに、体外循環は、放出されるフリーラジカルとの全身性の炎症反応を引き起こし、二次的な臓器傷害につながることも知られている。
【０２４３】
培養筋細胞、灌流心臓において、および心筋梗塞の齧歯動物モデルにおいて硫化水素が心保護作用を発揮し得るという証拠が得られつつある（たとえば、Ｐａｎ，ＴＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４０：１１９−３０（２００６）；Ｂｉａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１６：６７０−８（２００６）；Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０１：５３−６０（２００６）；ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：２６１−８（２００７）を参照）。スルフィドによる保護作用の機序として、細胞エネルギーの保存、炎症経路のダウンレギュレーション、酸化防止作用による細胞保護が挙げられる。本研究では、心肺バイパスのイヌモデルを用いてＨ２Ｓの液体医薬組成物の有望な心保護効果を検査し、この化合物が、臨床的に適切なバイパス手術モデルの心血管系機能に作用するかどうかを判定した。さらに、血管機能および心筋のエネルギー状態に対する硫化水素の作用も判定した。
【０２４４】
心停止（虚血；Ｓｚａｂｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２５：８２５−３２（２００４））の確立したモデルを用いてイヌの２つのコホートで心肺バイパス中にスルフィドの液体医薬組成物に心保護効果があるかどうかを検査した。この研究では、各動物に９０分間心肺バイパス（ＣＢＰ：ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ）（３０分間ＣＢＰの後、６０分間の心停止）を行い、動脈流を回復させて６０分間再灌流を行った。心停止および再灌流の過程で液体医薬組成物ＩＶを注入すると、前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）で測定した心機能が保護された。一方、ビヒクルで処置しても、心停止（虚血）モデルの心保護効果はまったく得られなかった。
【０２４５】
イヌを２群に無作為に割り付け、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈおよび国立衛生研究所の指針に従って人道的なケアを行った。イヌにプロピオニルプロマジンを前投薬し、ペントバルビタールで麻酔し、臭化パンクロニウムで維持し、気管内に挿管した。換気については、室内空気とＯ２の混合物、換気回数１２〜１５回／分とし、毎分の一回換気量１５ｍｌ／ｋｇで開始した。動脈血炭酸ガス分圧のレベルを３５〜４０ｍｍＨｇに維持した。大腿動脈および大腿静脈をカニューレ処置し、大動脈圧（ＡｏＰ：ａｏｒｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を記録し、生化学解析のため血液サンプルを採取した。基本的に静脈内補液をリンゲル液で行った（１ｍｌ／分／ｋｇ）。補液は、カリウム、炭酸水素および過剰塩基の値に応じて塩化カリウムおよび炭酸水素ナトリウムの投与を含む（８．４％）。カテコールアミンも、他のホルモン物質または昇圧物質も投与しなかった。
【０２４６】
液体医薬組成物ＩＶ（１００ｍＭ、ｐＨ７．７１、２９２ｍＯｓｍ）あるいはビヒクルを含む被験物質を６０分間の心停止および６０分間の再灌流期間中に注入した（１ｍｇ／ｋｇ／時間注入）。
【０２４７】
左前側方開胸後、大血管を切除した。左鎖骨下動脈を動脈灌流のためカニューレ処置し、抗凝固を維持するためヘパリンを投与した。静脈カニューレを右心房に留置した。体外回路（バイパス）については、熱交換器、静脈血貯血槽、ローラーポンプおよび膜型人工肺で構成され、ヘパリンおよび炭酸水素ナトリウムと共に乳酸リンゲル液溶液で刺激した。心肺バイパス（ＣＰＢ）の開始後、動物の体温を２８℃まで冷やした。大動脈を遮断し、心臓を２５ｍｌ／ｋｇのＨＴＫ溶液（ｍｍｏｌ単位：１５ＮａＣｌ、９ＫＣＩ、４ＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、１８ヒスチジンヒドロクロリド一水和物、１８０ヒスチジン、２トリプトファン、３０マンニトール、０．０１５ＣａＣｌ２、１カリウム−水素−２−オキソペンタンジオアト、Ｈ２Ｏ）で停止させた。
【０２４８】
心停止／灌流の間、ポンプ流量を調整して灌流圧を３５〜４０ｍｍＨｇ超に維持した。復温をクランプから４０分後に開始し、心停止から６０分後に大動脈のクランプを外し、バイパス回路で心臓に血液を再灌流させた。必要に応じて、４０ＪのＤＣ（ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ）除細動で心室細動を抑えた。
【０２４９】
研究後、換気を１００％酸素で再開した。動脈遮断の解除から２０分後にすべての動物を、強心薬療法を用いずにＣＰＢから離脱させた。ＣＢＰ前および再灌流の６０分後に機能の測定を行い、記録した。さらに、実験終了時に高エネルギーリン酸の分析のため心筋プローブも回収した。
【０２５０】
左右心室の収縮期圧（ＬＶＥＳＰ：ｌｅｆｔ ｅｎｄ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）および拡張期圧（ＬＶＥＤＰ：Ｌｅｆｔ ｅｎｄ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）ならびに容積をそれぞれ、肺動脈を通る圧力−コンダクタンス複合カテーテルで測定した。一回拍出量（ＳＶ：ｓｔｒｏｋｅ ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。１ｍｌの高張食塩水を肺動脈または上大静脈に急速注射して並列コンダクタンスを推計した。大静脈を閉塞させて一連の圧−容積ループを得た。左右心室の収縮末期圧−容積関係および前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）の傾きおよび切片を、心筋収縮力の負荷非依存性指標として算出した。
【０２５１】
左前下行動脈の冠血流を、血管周囲の超音波流量プローブで測定した。アセチルコリン（ＡＣＨ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、１０−７Ｍ）を冠動脈内単回ボーラス投与した後、冠血管内皮依存性血管拡張を評価し、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ：ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ、１０−４Ｍ）を冠動脈内単回ボーラス投与した後、内皮非依存性血管拡張を評価した。血管反応をベースラインの冠血管抵抗に対する変化率で表した。
【０２５２】
心収縮機能を再灌流後の圧−容積ループ解析で測定した。ビヒクルあるいは液体医薬組成物ＩＶによる注入をＣＢＰから３０分後に開始し、実験の終了まで継続した（１ｍｇ／ｋｇ／時間の用量で合計２時間静脈内注入）。すべての動物に６０分間の心停止（虚血）および合計９０分間の心肺バイパスを施した。虚血に対応してビヒクルで処置した群では前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）が減少した。心停止および再灌流中の液体医薬組成物ＩＶの注入では、ベースラインと比較した前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）の変化で測定した心保護が確認された（図１５）。
【０２５３】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の含量を、酵素反応速度アッセイにより標準的な測光で評価した。さらに、単離した冠状動脈環で内皮依存性と非依存性の弛緩も調べた。インビボ実験の終了後、心臓を切除し、冠動脈を単離して、冷たい（＋４℃）Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（１１８ｍＭのＮａＣｌ、４，７ｍＭのＫＣｌ、１，２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１，２のｍＭｍｇＳＯ４、１，７７ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１，４ｍＭのグルコース；ｐＨ＝７，４）に浸した。冠動脈を、外膜周囲の脂肪および周囲の結合組織から調製および洗浄し、手術用顕微鏡を用いて横に切断し幅４ｍｍの環にした。単離した大動脈環を、３７℃のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液２５ｍｌを含み、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を通気させた別の器官槽（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のステンレス製フックに掛けた。調製中は、内皮を損傷しないように特に注意を払った。等尺性収縮を、アイソメトリックフォーストランスデューサー（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて記録し、ＩＯＸソフトウェアシステム（ＥＭＫＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｒｉｓ，フランス）を用いてデジタル化し、保存し、表示した。この環を２ｇの静止張力下に置き、６０分平衡処理した。Ｕ４６６１９（５×１０−７Ｍ）を用いて安定なプラトーに達するまで環を前接触させ、内皮依存性拡張物質アセチルコリン（ＡＣｈ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、１０−９〜１０−４Ｍ）および内皮非依存性拡張物質ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ：ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ、１０−１０〜１０−５Ｍ）を累積濃度で加えて弛緩反応を調べた。弛緩を、Ｕ４６６１９により誘導された収縮に対する比で表わす。
【０２５４】
心拍数（ＨＲ：ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ）、ＭＡＰ（ｍｅａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＣＯ（ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）
およびＣＢＦを表２に示す。処置群ではベースラインの心拍数がやや上昇したが、その他の点では差は認められなかった。ＭＡＰは、ＣＰＢ後に３群すべてで低下傾向を示したが、２つの処置群で有意であった（ｐ＜０．０５）。ＣＯは群間および経時的に大きな差を示さなかった。ＣＢＦは、ベースライン時に３群すべてで類似していた。ＣＰＢ後に対照群で大きく減少したのに対し、２つの処置群では変化がなかった。血行動態変数には群間および経時的に差がなかった。
【０２５５】
左心室機能に関するベースライン値に群間差はなかった。対照群ではＣＰＢ後、左心室ｄＰ／ｄｔとＰＲＳＷがともに有意に低下したが、Ｈ２Ｓにより一部回復した（図１５および図１７）。
【０２５６】
ＣＰＢ前のインビボでの内皮機能に差はなかった。ＣＰＢ後のアセチルコリンに対する反応は、対照群で有意に低下したが、Ｈ２Ｓにより一部消出した（図１９。）。ＳＮＰに対する反応については群間および経時的に差がなかった。
【０２５７】
アセチルコリン（ＡＣｈ）に前接触させた動脈環の内皮依存性の血管弛緩は、対照環（ＣＰＢを使用しない動物、過去の対照）と比較して有意に阻害され、Ｈ２Ｓ処置群では完全に防止された（図１９）。ＳＮＰ後の内皮依存性の血管弛緩には群間差はなかった。
【０２５８】
実験終了時に取得した心筋ＡＴＰの測定値は、硫化水素の存在下で対照ビヒクルと比較して有意に上昇した。一方、ＡＤＰおよびＡＭＰのレベルには変化がなかった（表３）。
【０２５９】
これらのデータから、大型動物モデルを用いた心肺バイパスでは、Ｈ２Ｓの液体製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で処置すると、心筋保護下の心停止後の虚血後心筋機能および内皮機能が改善することが明らかにされる。こうした有益な効果は、Ｈ２Ｓの酸化防止効果、抗炎症効果、血行動態効果および細胞保護効果あるいはこれらの組み合わせに起因する可能性がある。
【０２６０】
（実施例１３）
硫化水素は、大動脈閉塞による虚血再灌流障害に起因するＤＮＡの損傷を緩和する
胸部大動脈閉塞による虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の臨床的に適切なブタモデルを用いてＨ２ＳドナーであるＮａＨＳ注入の細胞保護効果を調べた。
【０２６１】
ＮａＨＳ（ｎ＝６；２ｍｇ／ｋｇ×時間、大動脈閉塞の２時間前に開始し、８時間の再灌流まで継続）あるいはビヒクル（ｎ＝６）のどちらかに無作為に割り付けた後、麻酔下で換気し装置を埋め込んだブタに、鎖骨下動脈すぐ下流および大動脈分岐上流に留置した膨張可能なバルーンを用いて３０分の大動脈閉塞を行った。大動脈閉塞中、平均動脈圧（ＭＡＰ）を、エスモロール、ニトログリセリンおよびＡＴＰの静脈内投与で閉塞前のレベルの８０〜１２０％に維持した。再灌流の初期にノルアドレナリンの持続静脈内投与を調節して、ＭＡＰがベースラインレベルの８０％を超えるように維持した。全血サンプルのＤＮＡの損傷を単細胞ゲル電気泳動（アルカリコメットアッセイ）で評価した。表４に示すデータは、中央値（範囲）であり、群内の差をフリードマンの順位によるＡＮＯＶＡで検査し、群間の差を対応のない順位和検定で検査した。
【０２６２】
ＮａＨＳ注入の結果、心拍数および心拍出量が有意に減少した。一方、血圧および一回拍出量は影響を受けなかった。ＮａＨＳにより、血行動態の目標値を達成するのに必要なノルアドレナリンの必要量が減少し、グルコース代謝回転が低下し、Ｉ／ＲによるＤＮＡの損傷が十分に抑制された（コメットアッセイのテールモーメント、＃ｐ＜０．０５対注入前、§ｐ＜０．０５対ビヒクル）。
【０２６３】
これらのデータから、Ｈ２ＳドナーであるＮａＨＳを注入すると、大動脈閉塞によるＩ／Ｒ傷害において有益であったことが明らかにされ、液体スルフィド製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）による処置で虚血傷害が防止されることが確認される。有益な効果は、本化合物の代謝調節効果と細胞保護効果の組み合わせに起因する可能性がある。
【０２６４】
【表１−１】
【０２６５】
【表１−２】
【０２６６】
【表１−３】
【０２６７】
【表２】
【０２６８】
【表３】
【０２６９】
【表４】
本明細書では説明のため本発明の特定の実施形態について記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変形が可能であることが上記から理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容されるキャリア中に安定な液体医薬カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む組成物であって、該カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物または塩の濃度、ｐＨおよび酸化生成物が該液体医薬組成物の保存後に許容基準の範囲内にとどまる、組成物。
【請求項２】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、濃度が９５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドはｗ／ｖで約８０％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドは、ｗ／ｖで約９０％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドはｗ／ｖで約９５％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記液体は水酸化ナトリウムである、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物の酸素含有量は５μＭ以下である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリスルフィド、スルフィット、スルファートおよびチオスルファートからなる群より選択される１種または複数種の酸化生成物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸化生成物は（０％〜１．０％）の範囲のスルファート、（０％〜１．０％）の範囲のスルフィット、（０％〜１％）の範囲のポリスルフィドまたは（０％〜１．０％）の範囲のチオスルファートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記保存期間は（２３°〜２７°）の範囲で約３ヶ月である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記保存期間は（２３°〜２７°）の範囲で約６ヶ月である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物はほぼ等張である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は不透過性の容器に保存される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物はキレート剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはデフェロキサミンからなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲の前記ＤＴＰＡの量の、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲の前記デフェロキサミンの量の、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物はｐＨ改変剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ｐＨ改変剤は二酸化炭素、水酸化ナトリウム、塩酸または硫化水素からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は還元剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはグルタチオンからなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の量は０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の還元剤。
【請求項２７】
前記グルタチオンの量は０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の還元剤。
【請求項２８】
前記組成物はフリーラジカルスカベンジャーをさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フリーラジカルスカベンジャーは（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）（Ｔｒｏｌｏｘ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記フリーラジカルスカベンジャーはスピントラップ剤である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記フリーラジカルスカベンジャーはＮ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）からなる群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記スピントラップ剤は（０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）の範囲にある、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物は防腐剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項３４】
前記防腐剤はベンジルアルコール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンまたは塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記防腐剤はベンジルアルコール（０％〜２．０％）（ｗ／ｖ）、フェノール（０％〜０．５％）（ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、エチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、プロピルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、ブチルパラベン（０％〜０．４％）（ｗ／ｖ）、塩化ベンザルコニウム、（０％〜０．０２％）（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ３ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３７】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ５ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は０％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３８】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ５ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は７．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は１％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３９】
動物への投与に好適なスルフィドの組成物の調製方法であって、
ａ．１当量の硫化水素ガスを１当量の液体に溶解し、それによりスルフィド組成物を製造するステップ；および
ｂ．ステップ（ａ）で得られた組成物のｐＨを６．５〜８．５の範囲に調整するステップを含み、それにより該組成物により、動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物が生成される、方法。
【請求項４０】
前記液体は水酸化ナトリウムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｐＨは１種または複数種の塩化水素、二酸化炭素、水酸化ナトリウムおよび硫化水素を加えて調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐＨは窒素、二酸化炭素および／または硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｐＨは窒素と二酸化炭素との組み合わせまたは窒素と硫化水素との組み合わせをステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｐＨは硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）で得られた組成物の浸透圧モル濃度を２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）で得られた組成物を不活性雰囲気または希ガス下で遮光バイアルに分注するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）で得られた組成物に賦形剤を加えるステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記賦形剤は、キレート剤、ｐＨ改変剤、還元剤、フリーラジカルスカベンジャーおよび防腐剤からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
約６ヶ月間の酸素含有量が５μＭ以下である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物を含む１つまたは複数の容器を含むキットであって、該組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である、キット。
【請求項５１】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記組成物は等張性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５４】
前記容器は遮光性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５５】
前記容器は琥珀色バイアルである、請求項５０に記載のキット。
【請求項５６】
前記容器はガス不透過性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５７】
前記組成物は不活性雰囲気または希ガス下で前記容器に保存される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５８】
前記不活性ガスまたは希ガスは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒｎ）からなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５９】
虚血または低酸素状態にさらされた生物学的物質のヒト疾患または傷害を処置する方法であって、該生物学的物質を有効量のカルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項６０】
前記接触させることは、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下、小胞体内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー、経口、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）での接触、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄による接触を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記虚血または低酸素状態は、前記物質への傷害、該物質に悪影響を及ぼす疾患の発症もしくは進行または該物質の大量出血に起因する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記物質は、前記傷害の前、前記疾患の発症または進行の前または該物質の大量出血の前に前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記物質は、前記傷害の後、前記疾患の発症または進行の後または該物質の大量出血の後に前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記傷害は外部の物理的原因に起因する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記傷害は手術である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記物質は、前記傷害、前記疾患の発症もしくは進行または該物質の大量出血に起因する損傷または死から該物質を保護する量および時間で前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記物質は細胞、組織、器官、生命体および動物からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記物質は動物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記動物は哺乳動物である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物はヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記生物学的物質は血小板を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
前記生物学的物質は移植される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
前記生物学的物質は再灌流障害の危険がある、請求項５９に記載の方法。
【請求項７６】
前記生物学的物質は出血性ショックの危険がある、請求項５９に記載の方法。
【請求項１】
薬学的に許容されるキャリア中に安定な液体医薬カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物またはその塩もしくは前駆体を含む組成物であって、該カルコゲナイドもしくはカルコゲナイド化合物または塩の濃度、ｐＨおよび酸化生成物が該液体医薬組成物の保存後に許容基準の範囲内にとどまる、組成物。
【請求項２】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩は、Ｈ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅ、ＰｏＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、濃度が９５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドはｗ／ｖで約８０％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドは、ｗ／ｖで約９０％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記カルコゲナイド化合物またはカルコゲナイド塩はスルフィドであり、該スルフィドはｗ／ｖで約９５％〜約１００％の範囲の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記液体は水酸化ナトリウムである、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物の酸素含有量は５μＭ以下である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリスルフィド、スルフィット、スルファートおよびチオスルファートからなる群より選択される１種または複数種の酸化生成物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸化生成物は（０％〜１．０％）の範囲のスルファート、（０％〜１．０％）の範囲のスルフィット、（０％〜１％）の範囲のポリスルフィドまたは（０％〜１．０％）の範囲のチオスルファートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記保存期間は（２３°〜２７°）の範囲で約３ヶ月である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記保存期間は（２３°〜２７°）の範囲で約６ヶ月である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物はほぼ等張である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は不透過性の容器に保存される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物はキレート剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはデフェロキサミンからなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲の前記ＤＴＰＡの量の、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲の前記デフェロキサミンの量の、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物はｐＨ改変剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ｐＨ改変剤は二酸化炭素、水酸化ナトリウム、塩酸または硫化水素からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は還元剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはグルタチオンからなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の量は０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の還元剤。
【請求項２７】
前記グルタチオンの量は０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の還元剤。
【請求項２８】
前記組成物はフリーラジカルスカベンジャーをさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フリーラジカルスカベンジャーは（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）（Ｔｒｏｌｏｘ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記フリーラジカルスカベンジャーはスピントラップ剤である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記フリーラジカルスカベンジャーはＮ−ｔ−ブチル−フェニルニトロン（ＰＢＮ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）からなる群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記スピントラップ剤は（０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）の範囲にある、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物は防腐剤をさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項３４】
前記防腐剤はベンジルアルコール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンまたは塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記防腐剤はベンジルアルコール（０％〜２．０％）（ｗ／ｖ）、フェノール（０％〜０．５％）（ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、エチルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、プロピルパラベン（０％〜０．２５％）（ｗ／ｖ）、ブチルパラベン（０％〜０．４％）（ｗ／ｖ）、塩化ベンザルコニウム、（０％〜０．０２％）（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ３ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は０％〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３７】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ５ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は０％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３８】
１当量の硫化水素ガスが１当量の水酸化ナトリウム溶液に溶解され、かつ５ヶ月間の保存後に前記組成物のｐＨの範囲は７．５〜８．５であり、該組成物の浸透圧モル濃度の範囲は２５０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、該組成物の酸素含有量は５μＭ以下であり、該組成物は１％〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある（ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ）酸化生成物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３９】
動物への投与に好適なスルフィドの組成物の調製方法であって、
ａ．１当量の硫化水素ガスを１当量の液体に溶解し、それによりスルフィド組成物を製造するステップ；および
ｂ．ステップ（ａ）で得られた組成物のｐＨを６．５〜８．５の範囲に調整するステップを含み、それにより該組成物により、動物への投与に好適なスルフィドの液体組成物が生成される、方法。
【請求項４０】
前記液体は水酸化ナトリウムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｐＨは１種または複数種の塩化水素、二酸化炭素、水酸化ナトリウムおよび硫化水素を加えて調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐＨは窒素、二酸化炭素および／または硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｐＨは窒素と二酸化炭素との組み合わせまたは窒素と硫化水素との組み合わせをステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｐＨは硫化水素をステップ（ａ）で得られた組成物に溶解して調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）で得られた組成物の浸透圧モル濃度を２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲の浸透圧モル濃度に調整するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）で得られた組成物を不活性雰囲気または希ガス下で遮光バイアルに分注するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）で得られた組成物に賦形剤を加えるステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記賦形剤は、キレート剤、ｐＨ改変剤、還元剤、フリーラジカルスカベンジャーおよび防腐剤からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
約６ヶ月間の酸素含有量が５μＭ以下である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物を含む１つまたは複数の容器を含むキットであって、該組成物のｐＨの範囲は６．５〜８．５である、キット。
【請求項５１】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記組成物は等張性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５４】
前記容器は遮光性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５５】
前記容器は琥珀色バイアルである、請求項５０に記載のキット。
【請求項５６】
前記容器はガス不透過性である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５７】
前記組成物は不活性雰囲気または希ガス下で前記容器に保存される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５８】
前記不活性ガスまたは希ガスは、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒｎ）からなる群より選択される、請求項５０に記載のキット。
【請求項５９】
虚血または低酸素状態にさらされた生物学的物質のヒト疾患または傷害を処置する方法であって、該生物学的物質を有効量のカルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項６０】
前記接触させることは、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、眼内、皮下、結膜下、小胞体内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜、心膜内、臍帯内、イントラオクララリー、経口、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）での接触、注射、注入、持続注入、吸収、吸着、浸漬、局所灌流、カテーテルまたは洗浄による接触を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨＳ、Ｋ２Ｓ、ＫＨＳ、Ｒｂ２Ｓ、ＣＳ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、（ＮＨ４）ＨＳ、ＢｅＳ、ＭｇＳ、ＣａＳ、ＳｒＳおよびＢａＳからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記カルコゲナイドまたはカルコゲナイド塩はＨ２Ｓｅ、Ｎａ２Ｓｅ、ＮａＨＳｅ、Ｋ２Ｓｅ、ＫＨＳｅ、Ｒｂ２Ｓｅ、ＣＳ２Ｓｅ、（ＮＨ４）２Ｓｅ、（ＮＨ４）ＨＳｅ、ＢｅＳｅ、ＭｇＳｅ、ＣａＳｅ、ＳｒＳｅおよびＢａＳｅからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記虚血または低酸素状態は、前記物質への傷害、該物質に悪影響を及ぼす疾患の発症もしくは進行または該物質の大量出血に起因する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記物質は、前記傷害の前、前記疾患の発症または進行の前または該物質の大量出血の前に前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記物質は、前記傷害の後、前記疾患の発症または進行の後または該物質の大量出血の後に前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記傷害は外部の物理的原因に起因する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記傷害は手術である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記物質は、前記傷害、前記疾患の発症もしくは進行または該物質の大量出血に起因する損傷または死から該物質を保護する量および時間で前記組成物と接触する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記物質は細胞、組織、器官、生命体および動物からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記物質は動物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記動物は哺乳動物である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物はヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記生物学的物質は血小板を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
前記生物学的物質は移植される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
前記生物学的物質は再灌流障害の危険がある、請求項５９に記載の方法。
【請求項７６】
前記生物学的物質は出血性ショックの危険がある、請求項５９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５０５８７９（Ｐ２０１０−５０５８７９Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１６３０（Ｐ２００９−５３１６３０）
【出願日】平成１９年１０月５日（２００７．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０６１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３０８１
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０９０９５７０９）イカリア， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月５日（２００７．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０６１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３０８１
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０９０９５７０９）イカリア， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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