液状形態及び凍結乾燥形態の免疫ブロブリンＧ組成物用安定化配合物
本発明は、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に好適な、糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤を含む、免疫グロブリンＧ組成物の安定化配合物に関する。また、本発明は、前記安定化配合物を含む、液状形態又は凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状形態又は凍結乾燥形態のいずれかの免疫グロブリンＧ組成物（ＩｇＧ）の安定化及び保存のための薬学的に許容される安定化配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、自己免疫由来の多数の疾患が、現在のところ、ＩｇＧ濃縮物によって治療されており、これは、過去数年において、欧州及びアメリカ合衆国におけるＩｇＧの不足を生じている。
【０００３】
事実、例えば、通常、酸性ｐＨに処方され、静脈内投与によって適用可能な、ヒト血漿から製造されたＩｇＧ濃縮物の必要性が高まりつつある。ＩｇＧの必要性が高まると共に、治療において使用されることを目的とする、ならびに、液状又は凍結乾燥のいずれかの形態で保存される、静脈内投与が可能なＩｇＧ濃縮物（ＩｇＧＩＶ）の安定化が、必須の特徴となっている。
【０００４】
この点において、特に、アナフェラキシー反応のリスクと関連する、補体システムを活性化し得る凝集体（オリゴマー及びポリマー）の形成を回避するように、ＩｇＧＩＶが、安定化されなければならないことが知られている。さらに、ＩｇＧＩＶ中の二量体の存在は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける動脈圧の低下と相関関係がある（Bleeker W.K. et al, Blood, 95, 2000. p. 1856-1861）。また、さらなる物理化学的劣化、とりわけ、酸化及び加水分解等は、ＩｇＧの保存中に干渉する可能性がある。
【０００５】
治療的使用に好適な、変性されていないＩｇＧ組成物を得るためだけでなく、向上した保存安定性を備えたＩｇＧ組成物を得るため、ＩｇＧの凍結乾燥又は液状形態の安定化は、古くから、糖及びアミノ酸から選択される化合物の添加を必要とする。
【０００６】
タンパク質組成物、特にＩｇＧの凍結乾燥形態の特定の安定化剤の添加による安定化は、数々の研究において調べられた。M. Pikal, “Freez-Drying of Proteins, Part 2: Formulation Selection”, Biopharm, 3(9); pp. 26-30 (1990) 及びArakawa et al, Pharm. Res., 1991, 8(3), p. 285-291によって科学論文に掲載されたそれらは、凍結乾燥前のタンパク質組成物への賦形剤の添加は、凍結乾燥中の安定性及び／又は保存中の凍結乾燥産物の安定性を高めることを示している。しかしながら、これらの安定化剤のうちのいくつかは、およそ１００ｋＤａよりも大きいタンパク質の沈殿剤として知られている。従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３０００〜６０００の使用は、対応するタンパク質組成物を凍結乾燥に導く凍結相において致命的（redhibitory）である。Osterberg et al, (Pharm. Res., 1997, 14(7), p. 892-898) は、組換え第ＶＩＩＩ因子の凍結乾燥形態の安定化に対する、ヒスチジン、スクロース、非イオン界面活性剤及び塩化ナトリウムを含む混合物の有効性を示し、ＰＥＧの添加を通じて、何の安定化の向上も観察されなかったことを示した。さらに、Guo et al, (Biomacromol., 2002, 3(4), p. 846-849)は、ＰＥＧ存在下のセイヨウワサビペルオキシダーゼの凍結乾燥は、その天然の構造を保持することができないことを指摘した。従って、ＰＥＧの存在は、望ましくないようである。
【０００７】
凍結乾燥ＩｇＧＩＶ組成物は、例えば、安定化剤として、それぞれ２％のグルコース、５％のスクロース及び２％のＤ−マンニトールを含む、商標、PolygamTM（American Red Cross）、Gammar IVTM（Armour Pharmaceutical Company）及びVenoglobulinTM I(Alpha)のもと、商業的に入手可能である。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ９７／０４８０１は、特定の賦形剤を含む凍結乾燥モノクローナル抗体配合物（免疫グロブリンＧ及びＥ型）の安定化の効果を開示している。スクロース／グリシン及びスクロース／マンニトール等の他の組み合わせに比べ、有効性に欠けることから、これらの賦形剤からグリシン／マンニトールの組み合わせは選択されなかった。
【０００９】
しかしながら、ＩｇＧＩＶの凍結乾燥形態に好適な安定化剤は、液状ＩｇＧＩＶ組成物に対して効果がない可能性があることが知られている。
【００１０】
従って、商業的に入手可能な液状ＩｇＧＩＶ組成物は、対応する凍結乾燥形態で使用されるものとは異なる、特定の安定化剤を含む。例えば、安定化剤として、１０％マルトース、０．１６〜０．２４Ｍのグリシン及び５％Ｄ−ソルビトールを含む液状ＩｇＧＩＶ組成物は、それぞれ、商標、Gamimune NTM、Gamimune NTM 10%（Miles Inc.）及びVenoglobulinTM（Alpha）として知られている。
【００１１】
液状形態及び凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物を安定化するために使用される成分の異なる特性は、幾人かの著者らを、両方の形態のＩｇＧ組成物を保存することを可能にする同一の安定化剤又は安定化剤の混合物を調べることに駆り立てた。この点において、最近の研究は、同一の安定化剤の混合物、主に、アルブミン及びスクロースを含む、液状ＩｇＧＩＶ組成物Vigam-S及びVigam Liquid（National Blood Authority、イギリスの登録商標）及び凍結乾燥された後の液状ＩｇＧＩＶ組成物（Vigam-S）の安定化に向けられた（K. Chidwick et al, Vox Sanguinis, 77, 204-209, 1999）。しかしながら、溶液Vigam Liquidは、酸性ｐＨ（ｐＨ５）にて処方され、これは、ＩｇＧ及びアルブミンのリシンのアミノ残基と縮合する還元糖（フルクトース及びグルコース）（メイラード産物（溶液の褐変）になる不安定なシッフ塩基を与える）へのスクロースの加水分解のために欠点がある。ＩｇＧの保存の間に変化する（evolve）賦形剤の使用は、一旦反応が始まると、制御することができないため、充分ではないと理解されている。
【００１２】
さらに、マルトース又はスクロース等の前述のいくつかの安定剤は、腎不全及び／又は糖尿病を罹患する患者において、危険を伴わずに使用することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の欠点を克服するために、本出願人は、両方の考慮されるＩｇＧの保存形態の安定化及びこれらＩｇＧの治療的有効性を保存し、さらに向上させる目的を達成する、独特の薬学的に許容される安定化配合物を実施する。
【００１４】
その様な安定化配合物は、特に、出発材料のコントロールを容易にするという、ただ１つの処方を実行することの利点、ならびに生産工程図の簡略化と併せて、製造コストの削減をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
その目的のため、糖及びアミノ酸は、安定化剤として使用されるという観察結果に基づいて、本出願人は、これら安定化剤のうちのいくつかは、選択された糖及びアミノ酸の特性について種々の結果を有するが、熱及び攪拌によって引き起こされる変性に対する保護特性を有する、液状ＩｇＧ組成物を与えること、そしてさらに、例えば２つの成分の、混合物の安定化効果は、個々の成分が単独で用いられた際に得られる安定化効果からは推測できないことを、予備試験に基づいて示した。さらに、いくつかの試験された糖は、液状ＩｇＧ組成物の最適コンディショニング溶媒に対応する酸性ｐＨ値において、安定ではなかった。
【００１６】
他方、予備試験後に選択された安定化剤は、引き起こされた酸化に対する液状ＩｇＧ組成物の不安定性の最小化を可能にすることはできなかった。そこで、本出願人は、Tween （登録商標）80又はTriton（登録商標）X 100等の非イオン洗浄剤を添加し、満足な結果を得た。
【００１７】
従って、本発明は、免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤を含むこと特徴とする配合物に関する。
【００１８】
本発明の安定化配合物は、糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤の他に、少なくとも１種の他の添加剤を含むことができる。この添加剤は、界面活性剤、糖及びアミノ酸等の、本発明の技術分野において古典的に使用される安定化剤の異なるカテゴリーから選択される化合物であり得、例えば、ｐＨ、イオン強度等を調整するために該配合物に添加される賦形剤であってもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明の配合物は、前記糖アルコール、グリシン、非イオン洗浄剤からなる。そのような、本発明のこれらの３つの化合物のみを含む安定化配合物は、凍結乾燥及び非凍結乾燥ＩｇＧ組成物の共同の安定化を提供すること、ならびに、有効な最小数の安定化剤の存在によって、工業規模での製造期間及びコストを削減するという利点を有する。
【００２０】
本発明の範囲において、液状ＩｇＧ組成物は、ヒト血漿の分画によって直接得られる、ポリクローナルＩｇＧ濃縮物の水性溶液はもちろん、前者の凍結乾燥後、好適な水性媒体に再構成されたものである。再構成のための水性溶媒は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る注射用水であり、ＩｇＧと適合性がある。これらのＩｇＧ組成物は、さらに、特定のウイルスの不活性化／除去工程にかけられ得る。好ましくは、血漿分画法（plasma fraction methods）は、Cohn et al (J. Am. Chem. Soc. 68, 459, 1946)、Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424)、Steinbuch et al. (Rev. Franc. Et. Clin. and Biol., XIV, 1054, 1969)及び特許出願ＷＯ９４／９３３４に記載されている。
【００２１】
考慮された糖のうち、本出願人は、ＩｇＧ組成物のコンディショニングの酸性ｐＨにおける安定性基準（そのようにして、免疫グロブリンＧとのメイラード反応の開始を回避する）、薬学的適合性、及び、特に、液状又は凍結乾燥ＩｇＧ組成物のいずれかに対するそれらの安定化作用についての基準に基づいて、糖アルコールを選択した。実際、安定化剤としてのみ使用される所与の糖アルコールは、液状形態にのみ対応し得ることが指摘されていた。
【００２２】
糖アルコールのうち、本発明によって好ましく使用されるものは、マンニトール、ソルビトール又はこれらの異性体であり、より好ましくはマンニトールである。
【００２３】
本発明の安定化配合物中に存在する、グリシンは、ＩｇＧ組成物の安定化に好適であることが知られているが、それは液状形態においてのみである。
【００２４】
非イオン洗浄剤の添加は、該配合物の保護効果を、相乗効果によって驚くほど向上させた。好適な非イオン洗浄剤は、Tween（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタン−モノオレエート）、Tween（登録商標）20（ポリオキシエチレンソルビタン−モノラウレート）、Triton（登録商標）X 100（オクトキシノール１０）及びPluronic（登録商標）F68（ポリエチレンポリプロピレン グリコール）からなる群より有利に選択される。Tween（登録商標）80及びTriton（登録商標）X 100が好ましく使用された。
【００２５】
これらの化合物の濃度は、凍結乾燥及び非凍結乾燥ＩｇＧ組成物に対する望ましい安定化効果を得るように、当業者によって選択される。
【００２６】
好ましくは、マンニトール濃度は３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、洗浄剤濃度は２０〜５０ｐｐｍ、及びグリシン濃度は７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌである。
【００２７】
また、本発明は、本発明の安定化配合物を含む、液状形態及び／又は凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物であって、さらに、治療、特に静脈内投与に使用可能なＩｇＧ組成物に関する。これらの液状形態及び／又は凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物は、本発明の安定化配合物の存在により、４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に７％未満の量の二量体を含有する。室温にて６ヶ月間の液状形態のＩｇＧ組成物の保存は、欧州薬局方（European Pharmacopeia）に定められる基準（３％）より極めて低い量（すなわち、約０．３％未満）のポリマーを生じる。凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物は、室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存の後の耐量（tolerated amount）よりもおよそ１０倍低いポリマー割合を含む。
【００２８】
さらに、本発明は、ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態の免疫グロブリンＧ組成物、凍結乾燥形態のもの及び好適な水性溶媒における凍結乾燥形態の再構成後のものの安定化のための、本発明による安定化配合物の使用に関する。
【発明の効果】
【００２９】
その様な安定化配合物は、特に、出発材料のコントロールを容易にするという、ただ１つの処方を実行することの利点、ならびに生産工程図の簡略化と併せて、製造コストの削減をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下の実施例は、この範囲に限定することなく、異なる上記免疫グロブリンＧ組成物を注射した後の、経時的な、ラットにおける動脈圧変動の経過（curse）をグラフによって示す図１を参照し、本発明を説明する。
【実施例１】
【００３１】
実施例１ 安定化配合物の作製（elaboration）
国際特許出願ＷＯ０２／０９２６３２において本出願人によって開発された方法に従って得られた濃縮物を、ＩｇＧ組成物として使用した。およそ５０ｇ／ｌのＩｇＧを含むこの濃縮物を、ｐＨ値４．６〜４．８に調整し、そして熱不安定性の不純物を除去するために、５６℃にて２時間、熱処理にかける。
【００３２】
マンニトール、グリシン及びTween（登録商標）80又はTriton（登録商標）X 100を、単独又は混合（試験溶液）し、表１に指定される濃度で、このＩｇＧ濃縮物に添加する。
【００３３】
【表１】
【００３４】
さらに、試験溶液は、残渣（粒子、凝集体）の可能性のある存在を観察することによって、それらの変性の程度を測定するため、熱ストレス、攪拌ストレス及び酸化ストレスの異なる試験にかけられる。
【００３５】
熱ストレスは、P. Fernandes et al, Vox Sanguinis,1980, 39. p. 101-112の論文に従って行われる。要約すると、５ｍｌの試験溶液の試料を、１０ｍｌのひだを付けられた（crimped）ガラスバイアル中に入れ、その後、５７℃にて４時間、水浴中で加熱する。試験溶液に対する加熱の影響は、熱ストレスの後及び前の濁度の違いを計測することによって測定される。計測された濁度の値が低ければ低いほど、適用された熱ストレスについて、ＩｇＧ溶液が安定である。
【００３６】
攪拌ストレスの試験は、H. Levine et al, Journal of Parental Science & technology, 1991, vol. 45, n°3, p. 160-165による論文において記載されている通りに行われる。以下、５ｍｌの試験溶液の試料を、遮光された１０ｍｌのひだを付けられたガラス管中に入れ、その後、各管をミキサーIKA Vibrax VXR（Fisher Scientific,フランス製）上に横にして置き、そしてその後、室温にて１５０ｒｐｍで１８時間攪拌する。攪拌ストレスの結果は、ストレス適用の前後の試験溶液の視覚的な外観の比較によって測定される。その目的のため、以下の任意値の価値尺度を、定義する：
０．２５：１又は２の懸濁した粒子を含む透明溶液；
０．５０：少し懸濁した微粒子を含む透明溶液；
０．７５：０．５０のときよりも多い少しの懸濁した粒子を含む透明溶液；
２．０：さらに多くの懸濁した粒子を含む、わずかに改変した（modified）視覚的な外観；
５．０：多数の懸濁したフィラメント又は粒子；
１０．０：さらに大きな粒子及び凝集体、さらには凝固体。
【００３７】
酸化ストレスは、１０ｍｌのガラスバイアル中に入れられた５ｍｌの試験溶液の試料に対して行われる。液体の表面は、酸素−豊富雰囲気（Ｏ２＞２１％）の存在下に３〜４秒、入れられる。密閉及び攪拌の後、このバイアルを、１５分間、５℃まで冷却する。結果は、酸化ストレスの適用の前後の試験溶液の視覚的外観の比較によって、測定される。結果は、攪拌ストレス用に定義されたものと同じ価値尺度に従って、数的に表される。
【００３８】
異なる上記のストレスを適用された後に得られた、異なる計測結果は、表２に要約される。
【００３９】
【表２】
【００４０】
得られた結果は、最初に、ＩｇＧ濃縮物（溶液Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）溶液に、ただ１種の安定化剤の添加は、安定化剤を含まないコントロール溶液Ａに比べ、適用された３種のストレスのうち、２種のストレスに対して向上した保護を可能にすることを示す。それに加え、マンニトール及びグリシンが共同して存在すること（溶液Ｄ）は、望ましくなく、撹拌ストレスの結果は、マンニトール及びグリシンのみ（溶液Ｂ又はＣ）によって得られたものより、あるいは、コントロール溶液Ａに比べても、明らかに低い。この結果は、本発明による安定化配合物の作製のための成分の選択の重要性を実証し、これは、個々の成分単独の安定化効果からは、結果として推測され得ない。他方、試験溶液に対して実施された試験は、考慮された特定の安定化配合物Ｉ及びＪが、安定化剤を含まないコントロール溶液Ａに比べ、適用された３種のストレスによる変性に対して極めて満足な保護を提供することを示す。しかしながら、本発明によらない安定化配合物を含む試験溶液Ｇ及びＨも、この段階では、同様に満足な結果を与える。
【実施例２】
【００４１】
実施例１による攪拌ストレスにかけられた試験溶液Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ中に存在するポリマー、特に二量体の量を定量的に測定するため、これらは、欧州薬局方（欧州薬局方、第４版、“静脈内投与用正常ヒト免疫グロブリン”章、方法２．２．２９）の方法に記載されている手段に従って、サイズ除外クロマトグラフィーにかけられる。
【００４２】
表３は、二量体及びポリマーの得られたパーセンテージを表す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
ポリマーの最も低いパーセンテージは、試験溶液Ｉ及びＪによって得られる。これらの結果は、考慮された安定化剤Ｉ及びＪの特定の配合物は、実施例１において記載される、適用された攪拌ストレスによる変性に対して、極めて満足な保護を提供することを裏付ける。
【００４５】
配合物Ｉ及びＪの選択の後、薬学的に許容される非イオン洗浄剤（すなわち、Tween（登録商標）80）の含有量のために、試験溶液Ｊのみが、以下の実施例のために選択された。
【実施例３】
【００４６】
液状形態の溶液Ｊ（以下、“液状ＩｇＧ”と呼ぶ）は、現在の温度条件（４℃）下での保存期間による、安定性試験にかけられる。同様の試験を、以下、“凍結乾燥ＩｇＧ”と記載される、凍結乾燥溶液Ｊ（４５±３時間の凍結乾燥期間）に対して行う。これらの安定性試験は、必要に応じて注射用水で再構成された液状溶液Ｊを用いて行われる。それらは、以下に定義される２４ヶ月の期間の４つのパラメーターの変動（evolution）に対するフォローアップ（follow-up）からなり、このうち３つは、欧州薬局方（欧州薬局方、第４版、“静脈内投与用正常ヒト免疫グロブリン”章：
（ａ）サイズ除外クロマトグラフィー（方法２．２．２９）によって測定される二量体量の変動、
（ｂ）抗−補体活性の変動（方法２．６．１７）、及び
（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスに対する特異抗体、抗ＨＢｓの力価の変動（方法２．７．１））
に含まれる方法を参照して測定される。
【００４７】
第４のパラメーター（ｄ）は、当業者に公知の、特異的抗−ＩｇＧ３（DADE-Behring：キット抗−ＩｇＧ３）の存在下における、比濁分析用量（nephelometric dosage）によるＩｇＧ３の量の変動を明示する。
【００４８】
計測は、液状溶液Ｊの調製（ｔ０）に続いて、それぞれ１２ヶ月及び２４ヶ月の保存期間の後に行われる。
【００４９】
各試験に対して得られた計測結果は、以下の表に示され、データは、３つの試験の平均値である。
【００５０】
【表４】
【００５１】
保存期間中の二量体量の増加は、試験の正確性の限界（limits of exactitude）の内に含まれ、組成物の定量的変性を観察することができるほど充分に有意ではない。
【００５２】
【表５】
【００５３】
抗補体活性におけるわずかな減少が、液状ＩｇＧ組成物に対して観察される一方、凍結乾燥ＩｇＧでは、何も変動していない。この減少は、臨床的な有意性を有するものではなく、この活性の増加は、もっぱら、利用の観点から好ましくないであろう。
【００５４】
【表６】
【００５５】
極めてわずかな減少が、液状ＩｇＧ組成物において生じているように見えるが、特に、凍結乾燥ＩｇＧに対しては、有意な変化は見られない。
【００５６】
【表７】
【００５７】
観察された変化は、ＩｇＧ３量の値の不確定性限界（uncertainty margine）内に含まれる。従って、それらは、有意ではない。
【００５８】
４つの上記のパラメーターは、本発明の配合物が、特に、液状又は凍結乾燥形態のいずれのＩｇＧ組成物の、４℃の温度にて２４ヶ月の保存期間での、これらの組成物の注目すべき変動なしに、安定化に対しても好適であることを示し、逆の場合、製品の変性を意味し、従って、臨床的使用は可能ではないであろう。
【実施例４】
【００５９】
実施例１に示される組成物は、ＩｇＧ組成物として使用される。マンニトール、グリシン及びTween（登録商標）80は、それぞれ３２ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ及び５０ｐｐｍの濃度で、このＩｇＧ濃縮物に添加される。このようにして得られた液状形態の溶液Ｋ（以下、“液状ＩｇＧ”と記載する）は、４℃、室温及び４０℃での保存期間による安定性試験にかけられる。同じ試験を、凍結乾燥溶液Ｋ（４５±３時間の凍結乾燥期間）（以下、“凍結乾燥ＩｇＧ”と記載する）に対して行う。これらの安定性試験は、必要に応じて、注射用の調製物用の水で再構成された、液状溶液Ｋを用いて行われる。試験は、実施例３に示される、欧州薬局方に記載される方法２．２．２９を参照してサイズ除外クロマトグラフィーによって測定されるポリマー含有量の変動の１２ヶ月の期間のフォローアップ（follow-up）からなる。最大耐量閾値（maximal tolerated threshold）は、欧州薬局方の基準によって定義され、３％である。
【００６０】
計測は、液状溶液Ｋの調製（ｔ０）に続き、それぞれ、３、６及び１２ヶ月の保存期間の後に行われる。
【００６１】
上記３種の保存温度にて各試験に対して得られた計測結果は、以下表８、９及び１０にそれぞれ示され、得られた値は、３つの試験の平均値である。
【００６２】
【表８】
【００６３】
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
液状ＩｇＧの保存期間は、４０℃にて３ヶ月である。４℃及び室温での６ヶ月保存期間の終わりに、観察されたポリマーの含有量は、欧州薬局方に定められる基準をはるかに下回っている。凍結乾燥ＩｇＧに対しては、４℃及び室温での１２ヶ月の保存期間は、耐量の１０倍低いポリマー含有量を生じる。同じ含有量が、４０℃にて６ヶ月の保存期間の後に観察される。
【実施例５】
【００６６】
この実施例は、二量体含有量７％未満を有する本発明の溶液が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて注射した後、降圧効果（hypotensor effect）を引き起こさないことを確認することを意図する。Bleeker W.K.ら (Blood, 95, 2000, p. 1856-1861) は、注射されるＩｇＧ試料における免疫グロブリンＧ二量体の含有量が多いほど、ｉｎ ｖｉｖｏにおける降圧効果が高いことを報告している。自己免疫疾患の治療は、ＩｇＧの大量注射を必要とし、従って、ＩｇＧにおける二量体の含有量が制御されなければ、低血圧に苦しむ患者にとって、危険因子となり得る。
【００６７】
本実施例において示される、これらの研究は、２つの液状形態のＩｇＧ溶液、それぞれ、１１．５０％の二量体量を含む古典的なＩｇＧ溶液（溶液Ｔ−ＩｇＧ：５０ｇ／ｌ；スクロース：１００ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：３ｇ／ｌ、ｐＨ：６．５）、及び６．３％の二量体量を含む前述の実施例由来の溶液Ｋの、麻酔して調製されたラットにおける、血液動態効果を評価及び比較することを目的とした。
手法
１８０〜２００ｇの成体、雄、Ｓｐｒａｎｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ（IFFA-Credo：フランス）ラットを、６０ｍｇ／ｋｇの割合でペントバルビタール（Sanofi-France）を腹腔内注射によって麻酔する。麻酔されたラットを、３７℃に自動温度調節されたマットレス上に仰向けに寝かせる。古典的な圧センサー及び動脈圧を継続的に計測することを可能にするレコーダーと接続されたカテーテルを、頸動脈に導入する。気管カニューレは、呼吸路を自由にすることを可能にする。ＩｇＧ（溶液Ｋ及びＴ）の静脈内投与は、２．６６ｍｌ／１２０分の速度で、動物の頸静脈内に導入されたカテーテルを通して行われる。
【００６８】
動脈圧（ｍｍＨｇ）変動は、各６匹のラットの３グループについて、経時的に計測される：
−生理学的血清を受ける１つのコントロール群、
−０．６５ ｇ／ｋｇの割合にて溶液Ｔを受ける１つの処置群、及び
−０．６５ ｇ／ｋｇの割合にて溶液Ｋを受ける１つの処置群。
【００６９】
実験は、２０分の予備的な安定化フェーズ（preliminary stabilisation phase）で始まる。動脈圧の継続的記録は、ｔ０−１０分に始まる（ｔ０＝注射）。
【００７０】
これらの研究結果は、図１のチャートで読まれ、各点は、６つの実験の標準偏差を伴う、平均値である。統計学的解析は、当業者によって公知の分散分析の後、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定によって行われる。
【００７１】
これらの結果は、動脈圧データは、ＩｇＧ注射前、安定であり、３群のラットにおいて同程度であることを示す。動脈圧の減少は、ｔ０＋１０分にて見られ、最小値は、およそｔ０＋１５分に注射前の最初の値の５０％未満の値（およそ１００ｍｍＨｇからおよそ５０ｍｍＨｇに下がる）に達し、その後、注射を始めた後５０分から６０分に、動脈圧に達し、徐々に元に戻る。
【実施例６】
【００７２】
本実施例は、液状形態の溶液Ｊが、タンパク質及び異なる賦形剤を含む溶液と比較して、血液粘度の減少に寄与するかどうかを確認することを意図する。その目的のため、室温及びＴ＝３７℃にて、当業者に公知の方法に従って、赤血球の２つの重力沈降試験を行った。
手法
クエン酸三ナトリウム０．２Ｍ（１／９，ｖ／ｖ）の抗凝固溶液の存在下で、群０＋のヒト赤血球を、ｐＨ７．４の通常濃度のＰＢＳの生理食塩水溶液で３回洗浄する。様々な賦形剤中のタンパク質の水溶液を調製し、溶液Ｊを、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ及びｐＨ７に調整する。タンパク質及び賦形剤、ならびにそれらの各濃度は、表１１に示される。各タンパク質溶液の４．５ｍｌの試料を取り、１０ｍｌの目盛りのついたガラス管に入れる。その後、０．５ｍｌの洗浄された赤血球を、各溶液に添加する。得られた混合物を、密閉した管を３〜４回上下に回転する事によって均質化する。均質化の終わりに、管を、カウンターディスプレー上に置き、沈降速度を表す、透明なメニスカス（meniscus）までの赤血球細胞のタンジェント（tangent）の明瞭なデカンテーションライン（decantation line）が出現するために要する時間を計測する。室温での実験結果は、表１１に示される。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
得られた結果は、考慮された赤血球は、本発明の溶液ＪのＩｇＧの存在下で、試験された混合物の粘度の減少に対応する、高い沈降速度を有し、従って、より良い血液流動性を得ることを可能にすることを示す。
【００７５】
さらなる試験が、目盛りつきの１０ｍｌのガラス管中に入れられた上記混合物（４．５ｍｌのタンパク質溶液及び０．５ｍｌの洗浄された赤血球）を用いて行われ、この管を３〜４回上下に回転することによって均質化した。この作業が完了するとすぐに、この管を、３７℃の温度にて４５°の角度で１時間以内に、それらの内容物が沈降する方法で、置き、試験された混合物の上清量を計測する。Ｔ＝３７℃の試験結果を、表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
表１２における結果の解析は、以下に示される：
−血漿混合物の上清容量は、試験された混合物中で最も高く、従って、対応する最も低い粘度を示す；
−アルブミン混合物及び本発明の溶液Ｊは、同様の沈降速度（同容量の上清）を示す；
−従来技術のＩｇＧ混合物（すなわち、スクロース及びＮａＣｌを含む）は、最も少ない上清容量を導き、本発明の混合物Ｊ中においてよりも、赤血球の沈降が遅いことを意味し、さらに、上記の他の試験混合物と同様、上清は分離した溶血によって、バラ色に着色されていることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】異なる上記免疫グロブリンＧ組成物を注射した後の、経時的な、ラットにおける動脈圧変動の経過（curse）をグラフによって示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状形態又は凍結乾燥形態のいずれかの免疫グロブリンＧ組成物（ＩｇＧ）の安定化及び保存のための薬学的に許容される安定化配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、自己免疫由来の多数の疾患が、現在のところ、ＩｇＧ濃縮物によって治療されており、これは、過去数年において、欧州及びアメリカ合衆国におけるＩｇＧの不足を生じている。
【０００３】
事実、例えば、通常、酸性ｐＨに処方され、静脈内投与によって適用可能な、ヒト血漿から製造されたＩｇＧ濃縮物の必要性が高まりつつある。ＩｇＧの必要性が高まると共に、治療において使用されることを目的とする、ならびに、液状又は凍結乾燥のいずれかの形態で保存される、静脈内投与が可能なＩｇＧ濃縮物（ＩｇＧＩＶ）の安定化が、必須の特徴となっている。
【０００４】
この点において、特に、アナフェラキシー反応のリスクと関連する、補体システムを活性化し得る凝集体（オリゴマー及びポリマー）の形成を回避するように、ＩｇＧＩＶが、安定化されなければならないことが知られている。さらに、ＩｇＧＩＶ中の二量体の存在は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける動脈圧の低下と相関関係がある（Bleeker W.K. et al, Blood, 95, 2000. p. 1856-1861）。また、さらなる物理化学的劣化、とりわけ、酸化及び加水分解等は、ＩｇＧの保存中に干渉する可能性がある。
【０００５】
治療的使用に好適な、変性されていないＩｇＧ組成物を得るためだけでなく、向上した保存安定性を備えたＩｇＧ組成物を得るため、ＩｇＧの凍結乾燥又は液状形態の安定化は、古くから、糖及びアミノ酸から選択される化合物の添加を必要とする。
【０００６】
タンパク質組成物、特にＩｇＧの凍結乾燥形態の特定の安定化剤の添加による安定化は、数々の研究において調べられた。M. Pikal, “Freez-Drying of Proteins, Part 2: Formulation Selection”, Biopharm, 3(9); pp. 26-30 (1990) 及びArakawa et al, Pharm. Res., 1991, 8(3), p. 285-291によって科学論文に掲載されたそれらは、凍結乾燥前のタンパク質組成物への賦形剤の添加は、凍結乾燥中の安定性及び／又は保存中の凍結乾燥産物の安定性を高めることを示している。しかしながら、これらの安定化剤のうちのいくつかは、およそ１００ｋＤａよりも大きいタンパク質の沈殿剤として知られている。従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３０００〜６０００の使用は、対応するタンパク質組成物を凍結乾燥に導く凍結相において致命的（redhibitory）である。Osterberg et al, (Pharm. Res., 1997, 14(7), p. 892-898) は、組換え第ＶＩＩＩ因子の凍結乾燥形態の安定化に対する、ヒスチジン、スクロース、非イオン界面活性剤及び塩化ナトリウムを含む混合物の有効性を示し、ＰＥＧの添加を通じて、何の安定化の向上も観察されなかったことを示した。さらに、Guo et al, (Biomacromol., 2002, 3(4), p. 846-849)は、ＰＥＧ存在下のセイヨウワサビペルオキシダーゼの凍結乾燥は、その天然の構造を保持することができないことを指摘した。従って、ＰＥＧの存在は、望ましくないようである。
【０００７】
凍結乾燥ＩｇＧＩＶ組成物は、例えば、安定化剤として、それぞれ２％のグルコース、５％のスクロース及び２％のＤ−マンニトールを含む、商標、PolygamTM（American Red Cross）、Gammar IVTM（Armour Pharmaceutical Company）及びVenoglobulinTM I(Alpha)のもと、商業的に入手可能である。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ９７／０４８０１は、特定の賦形剤を含む凍結乾燥モノクローナル抗体配合物（免疫グロブリンＧ及びＥ型）の安定化の効果を開示している。スクロース／グリシン及びスクロース／マンニトール等の他の組み合わせに比べ、有効性に欠けることから、これらの賦形剤からグリシン／マンニトールの組み合わせは選択されなかった。
【０００９】
しかしながら、ＩｇＧＩＶの凍結乾燥形態に好適な安定化剤は、液状ＩｇＧＩＶ組成物に対して効果がない可能性があることが知られている。
【００１０】
従って、商業的に入手可能な液状ＩｇＧＩＶ組成物は、対応する凍結乾燥形態で使用されるものとは異なる、特定の安定化剤を含む。例えば、安定化剤として、１０％マルトース、０．１６〜０．２４Ｍのグリシン及び５％Ｄ−ソルビトールを含む液状ＩｇＧＩＶ組成物は、それぞれ、商標、Gamimune NTM、Gamimune NTM 10%（Miles Inc.）及びVenoglobulinTM（Alpha）として知られている。
【００１１】
液状形態及び凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物を安定化するために使用される成分の異なる特性は、幾人かの著者らを、両方の形態のＩｇＧ組成物を保存することを可能にする同一の安定化剤又は安定化剤の混合物を調べることに駆り立てた。この点において、最近の研究は、同一の安定化剤の混合物、主に、アルブミン及びスクロースを含む、液状ＩｇＧＩＶ組成物Vigam-S及びVigam Liquid（National Blood Authority、イギリスの登録商標）及び凍結乾燥された後の液状ＩｇＧＩＶ組成物（Vigam-S）の安定化に向けられた（K. Chidwick et al, Vox Sanguinis, 77, 204-209, 1999）。しかしながら、溶液Vigam Liquidは、酸性ｐＨ（ｐＨ５）にて処方され、これは、ＩｇＧ及びアルブミンのリシンのアミノ残基と縮合する還元糖（フルクトース及びグルコース）（メイラード産物（溶液の褐変）になる不安定なシッフ塩基を与える）へのスクロースの加水分解のために欠点がある。ＩｇＧの保存の間に変化する（evolve）賦形剤の使用は、一旦反応が始まると、制御することができないため、充分ではないと理解されている。
【００１２】
さらに、マルトース又はスクロース等の前述のいくつかの安定剤は、腎不全及び／又は糖尿病を罹患する患者において、危険を伴わずに使用することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の欠点を克服するために、本出願人は、両方の考慮されるＩｇＧの保存形態の安定化及びこれらＩｇＧの治療的有効性を保存し、さらに向上させる目的を達成する、独特の薬学的に許容される安定化配合物を実施する。
【００１４】
その様な安定化配合物は、特に、出発材料のコントロールを容易にするという、ただ１つの処方を実行することの利点、ならびに生産工程図の簡略化と併せて、製造コストの削減をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
その目的のため、糖及びアミノ酸は、安定化剤として使用されるという観察結果に基づいて、本出願人は、これら安定化剤のうちのいくつかは、選択された糖及びアミノ酸の特性について種々の結果を有するが、熱及び攪拌によって引き起こされる変性に対する保護特性を有する、液状ＩｇＧ組成物を与えること、そしてさらに、例えば２つの成分の、混合物の安定化効果は、個々の成分が単独で用いられた際に得られる安定化効果からは推測できないことを、予備試験に基づいて示した。さらに、いくつかの試験された糖は、液状ＩｇＧ組成物の最適コンディショニング溶媒に対応する酸性ｐＨ値において、安定ではなかった。
【００１６】
他方、予備試験後に選択された安定化剤は、引き起こされた酸化に対する液状ＩｇＧ組成物の不安定性の最小化を可能にすることはできなかった。そこで、本出願人は、Tween （登録商標）80又はTriton（登録商標）X 100等の非イオン洗浄剤を添加し、満足な結果を得た。
【００１７】
従って、本発明は、免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤を含むこと特徴とする配合物に関する。
【００１８】
本発明の安定化配合物は、糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤の他に、少なくとも１種の他の添加剤を含むことができる。この添加剤は、界面活性剤、糖及びアミノ酸等の、本発明の技術分野において古典的に使用される安定化剤の異なるカテゴリーから選択される化合物であり得、例えば、ｐＨ、イオン強度等を調整するために該配合物に添加される賦形剤であってもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明の配合物は、前記糖アルコール、グリシン、非イオン洗浄剤からなる。そのような、本発明のこれらの３つの化合物のみを含む安定化配合物は、凍結乾燥及び非凍結乾燥ＩｇＧ組成物の共同の安定化を提供すること、ならびに、有効な最小数の安定化剤の存在によって、工業規模での製造期間及びコストを削減するという利点を有する。
【００２０】
本発明の範囲において、液状ＩｇＧ組成物は、ヒト血漿の分画によって直接得られる、ポリクローナルＩｇＧ濃縮物の水性溶液はもちろん、前者の凍結乾燥後、好適な水性媒体に再構成されたものである。再構成のための水性溶媒は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る注射用水であり、ＩｇＧと適合性がある。これらのＩｇＧ組成物は、さらに、特定のウイルスの不活性化／除去工程にかけられ得る。好ましくは、血漿分画法（plasma fraction methods）は、Cohn et al (J. Am. Chem. Soc. 68, 459, 1946)、Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424)、Steinbuch et al. (Rev. Franc. Et. Clin. and Biol., XIV, 1054, 1969)及び特許出願ＷＯ９４／９３３４に記載されている。
【００２１】
考慮された糖のうち、本出願人は、ＩｇＧ組成物のコンディショニングの酸性ｐＨにおける安定性基準（そのようにして、免疫グロブリンＧとのメイラード反応の開始を回避する）、薬学的適合性、及び、特に、液状又は凍結乾燥ＩｇＧ組成物のいずれかに対するそれらの安定化作用についての基準に基づいて、糖アルコールを選択した。実際、安定化剤としてのみ使用される所与の糖アルコールは、液状形態にのみ対応し得ることが指摘されていた。
【００２２】
糖アルコールのうち、本発明によって好ましく使用されるものは、マンニトール、ソルビトール又はこれらの異性体であり、より好ましくはマンニトールである。
【００２３】
本発明の安定化配合物中に存在する、グリシンは、ＩｇＧ組成物の安定化に好適であることが知られているが、それは液状形態においてのみである。
【００２４】
非イオン洗浄剤の添加は、該配合物の保護効果を、相乗効果によって驚くほど向上させた。好適な非イオン洗浄剤は、Tween（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタン−モノオレエート）、Tween（登録商標）20（ポリオキシエチレンソルビタン−モノラウレート）、Triton（登録商標）X 100（オクトキシノール１０）及びPluronic（登録商標）F68（ポリエチレンポリプロピレン グリコール）からなる群より有利に選択される。Tween（登録商標）80及びTriton（登録商標）X 100が好ましく使用された。
【００２５】
これらの化合物の濃度は、凍結乾燥及び非凍結乾燥ＩｇＧ組成物に対する望ましい安定化効果を得るように、当業者によって選択される。
【００２６】
好ましくは、マンニトール濃度は３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、洗浄剤濃度は２０〜５０ｐｐｍ、及びグリシン濃度は７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌである。
【００２７】
また、本発明は、本発明の安定化配合物を含む、液状形態及び／又は凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物であって、さらに、治療、特に静脈内投与に使用可能なＩｇＧ組成物に関する。これらの液状形態及び／又は凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物は、本発明の安定化配合物の存在により、４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に７％未満の量の二量体を含有する。室温にて６ヶ月間の液状形態のＩｇＧ組成物の保存は、欧州薬局方（European Pharmacopeia）に定められる基準（３％）より極めて低い量（すなわち、約０．３％未満）のポリマーを生じる。凍結乾燥形態のＩｇＧ組成物は、室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存の後の耐量（tolerated amount）よりもおよそ１０倍低いポリマー割合を含む。
【００２８】
さらに、本発明は、ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態の免疫グロブリンＧ組成物、凍結乾燥形態のもの及び好適な水性溶媒における凍結乾燥形態の再構成後のものの安定化のための、本発明による安定化配合物の使用に関する。
【発明の効果】
【００２９】
その様な安定化配合物は、特に、出発材料のコントロールを容易にするという、ただ１つの処方を実行することの利点、ならびに生産工程図の簡略化と併せて、製造コストの削減をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下の実施例は、この範囲に限定することなく、異なる上記免疫グロブリンＧ組成物を注射した後の、経時的な、ラットにおける動脈圧変動の経過（curse）をグラフによって示す図１を参照し、本発明を説明する。
【実施例１】
【００３１】
実施例１ 安定化配合物の作製（elaboration）
国際特許出願ＷＯ０２／０９２６３２において本出願人によって開発された方法に従って得られた濃縮物を、ＩｇＧ組成物として使用した。およそ５０ｇ／ｌのＩｇＧを含むこの濃縮物を、ｐＨ値４．６〜４．８に調整し、そして熱不安定性の不純物を除去するために、５６℃にて２時間、熱処理にかける。
【００３２】
マンニトール、グリシン及びTween（登録商標）80又はTriton（登録商標）X 100を、単独又は混合（試験溶液）し、表１に指定される濃度で、このＩｇＧ濃縮物に添加する。
【００３３】
【表１】
【００３４】
さらに、試験溶液は、残渣（粒子、凝集体）の可能性のある存在を観察することによって、それらの変性の程度を測定するため、熱ストレス、攪拌ストレス及び酸化ストレスの異なる試験にかけられる。
【００３５】
熱ストレスは、P. Fernandes et al, Vox Sanguinis,1980, 39. p. 101-112の論文に従って行われる。要約すると、５ｍｌの試験溶液の試料を、１０ｍｌのひだを付けられた（crimped）ガラスバイアル中に入れ、その後、５７℃にて４時間、水浴中で加熱する。試験溶液に対する加熱の影響は、熱ストレスの後及び前の濁度の違いを計測することによって測定される。計測された濁度の値が低ければ低いほど、適用された熱ストレスについて、ＩｇＧ溶液が安定である。
【００３６】
攪拌ストレスの試験は、H. Levine et al, Journal of Parental Science & technology, 1991, vol. 45, n°3, p. 160-165による論文において記載されている通りに行われる。以下、５ｍｌの試験溶液の試料を、遮光された１０ｍｌのひだを付けられたガラス管中に入れ、その後、各管をミキサーIKA Vibrax VXR（Fisher Scientific,フランス製）上に横にして置き、そしてその後、室温にて１５０ｒｐｍで１８時間攪拌する。攪拌ストレスの結果は、ストレス適用の前後の試験溶液の視覚的な外観の比較によって測定される。その目的のため、以下の任意値の価値尺度を、定義する：
０．２５：１又は２の懸濁した粒子を含む透明溶液；
０．５０：少し懸濁した微粒子を含む透明溶液；
０．７５：０．５０のときよりも多い少しの懸濁した粒子を含む透明溶液；
２．０：さらに多くの懸濁した粒子を含む、わずかに改変した（modified）視覚的な外観；
５．０：多数の懸濁したフィラメント又は粒子；
１０．０：さらに大きな粒子及び凝集体、さらには凝固体。
【００３７】
酸化ストレスは、１０ｍｌのガラスバイアル中に入れられた５ｍｌの試験溶液の試料に対して行われる。液体の表面は、酸素−豊富雰囲気（Ｏ２＞２１％）の存在下に３〜４秒、入れられる。密閉及び攪拌の後、このバイアルを、１５分間、５℃まで冷却する。結果は、酸化ストレスの適用の前後の試験溶液の視覚的外観の比較によって、測定される。結果は、攪拌ストレス用に定義されたものと同じ価値尺度に従って、数的に表される。
【００３８】
異なる上記のストレスを適用された後に得られた、異なる計測結果は、表２に要約される。
【００３９】
【表２】
【００４０】
得られた結果は、最初に、ＩｇＧ濃縮物（溶液Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）溶液に、ただ１種の安定化剤の添加は、安定化剤を含まないコントロール溶液Ａに比べ、適用された３種のストレスのうち、２種のストレスに対して向上した保護を可能にすることを示す。それに加え、マンニトール及びグリシンが共同して存在すること（溶液Ｄ）は、望ましくなく、撹拌ストレスの結果は、マンニトール及びグリシンのみ（溶液Ｂ又はＣ）によって得られたものより、あるいは、コントロール溶液Ａに比べても、明らかに低い。この結果は、本発明による安定化配合物の作製のための成分の選択の重要性を実証し、これは、個々の成分単独の安定化効果からは、結果として推測され得ない。他方、試験溶液に対して実施された試験は、考慮された特定の安定化配合物Ｉ及びＪが、安定化剤を含まないコントロール溶液Ａに比べ、適用された３種のストレスによる変性に対して極めて満足な保護を提供することを示す。しかしながら、本発明によらない安定化配合物を含む試験溶液Ｇ及びＨも、この段階では、同様に満足な結果を与える。
【実施例２】
【００４１】
実施例１による攪拌ストレスにかけられた試験溶液Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ中に存在するポリマー、特に二量体の量を定量的に測定するため、これらは、欧州薬局方（欧州薬局方、第４版、“静脈内投与用正常ヒト免疫グロブリン”章、方法２．２．２９）の方法に記載されている手段に従って、サイズ除外クロマトグラフィーにかけられる。
【００４２】
表３は、二量体及びポリマーの得られたパーセンテージを表す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
ポリマーの最も低いパーセンテージは、試験溶液Ｉ及びＪによって得られる。これらの結果は、考慮された安定化剤Ｉ及びＪの特定の配合物は、実施例１において記載される、適用された攪拌ストレスによる変性に対して、極めて満足な保護を提供することを裏付ける。
【００４５】
配合物Ｉ及びＪの選択の後、薬学的に許容される非イオン洗浄剤（すなわち、Tween（登録商標）80）の含有量のために、試験溶液Ｊのみが、以下の実施例のために選択された。
【実施例３】
【００４６】
液状形態の溶液Ｊ（以下、“液状ＩｇＧ”と呼ぶ）は、現在の温度条件（４℃）下での保存期間による、安定性試験にかけられる。同様の試験を、以下、“凍結乾燥ＩｇＧ”と記載される、凍結乾燥溶液Ｊ（４５±３時間の凍結乾燥期間）に対して行う。これらの安定性試験は、必要に応じて注射用水で再構成された液状溶液Ｊを用いて行われる。それらは、以下に定義される２４ヶ月の期間の４つのパラメーターの変動（evolution）に対するフォローアップ（follow-up）からなり、このうち３つは、欧州薬局方（欧州薬局方、第４版、“静脈内投与用正常ヒト免疫グロブリン”章：
（ａ）サイズ除外クロマトグラフィー（方法２．２．２９）によって測定される二量体量の変動、
（ｂ）抗−補体活性の変動（方法２．６．１７）、及び
（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスに対する特異抗体、抗ＨＢｓの力価の変動（方法２．７．１））
に含まれる方法を参照して測定される。
【００４７】
第４のパラメーター（ｄ）は、当業者に公知の、特異的抗−ＩｇＧ３（DADE-Behring：キット抗−ＩｇＧ３）の存在下における、比濁分析用量（nephelometric dosage）によるＩｇＧ３の量の変動を明示する。
【００４８】
計測は、液状溶液Ｊの調製（ｔ０）に続いて、それぞれ１２ヶ月及び２４ヶ月の保存期間の後に行われる。
【００４９】
各試験に対して得られた計測結果は、以下の表に示され、データは、３つの試験の平均値である。
【００５０】
【表４】
【００５１】
保存期間中の二量体量の増加は、試験の正確性の限界（limits of exactitude）の内に含まれ、組成物の定量的変性を観察することができるほど充分に有意ではない。
【００５２】
【表５】
【００５３】
抗補体活性におけるわずかな減少が、液状ＩｇＧ組成物に対して観察される一方、凍結乾燥ＩｇＧでは、何も変動していない。この減少は、臨床的な有意性を有するものではなく、この活性の増加は、もっぱら、利用の観点から好ましくないであろう。
【００５４】
【表６】
【００５５】
極めてわずかな減少が、液状ＩｇＧ組成物において生じているように見えるが、特に、凍結乾燥ＩｇＧに対しては、有意な変化は見られない。
【００５６】
【表７】
【００５７】
観察された変化は、ＩｇＧ３量の値の不確定性限界（uncertainty margine）内に含まれる。従って、それらは、有意ではない。
【００５８】
４つの上記のパラメーターは、本発明の配合物が、特に、液状又は凍結乾燥形態のいずれのＩｇＧ組成物の、４℃の温度にて２４ヶ月の保存期間での、これらの組成物の注目すべき変動なしに、安定化に対しても好適であることを示し、逆の場合、製品の変性を意味し、従って、臨床的使用は可能ではないであろう。
【実施例４】
【００５９】
実施例１に示される組成物は、ＩｇＧ組成物として使用される。マンニトール、グリシン及びTween（登録商標）80は、それぞれ３２ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ及び５０ｐｐｍの濃度で、このＩｇＧ濃縮物に添加される。このようにして得られた液状形態の溶液Ｋ（以下、“液状ＩｇＧ”と記載する）は、４℃、室温及び４０℃での保存期間による安定性試験にかけられる。同じ試験を、凍結乾燥溶液Ｋ（４５±３時間の凍結乾燥期間）（以下、“凍結乾燥ＩｇＧ”と記載する）に対して行う。これらの安定性試験は、必要に応じて、注射用の調製物用の水で再構成された、液状溶液Ｋを用いて行われる。試験は、実施例３に示される、欧州薬局方に記載される方法２．２．２９を参照してサイズ除外クロマトグラフィーによって測定されるポリマー含有量の変動の１２ヶ月の期間のフォローアップ（follow-up）からなる。最大耐量閾値（maximal tolerated threshold）は、欧州薬局方の基準によって定義され、３％である。
【００６０】
計測は、液状溶液Ｋの調製（ｔ０）に続き、それぞれ、３、６及び１２ヶ月の保存期間の後に行われる。
【００６１】
上記３種の保存温度にて各試験に対して得られた計測結果は、以下表８、９及び１０にそれぞれ示され、得られた値は、３つの試験の平均値である。
【００６２】
【表８】
【００６３】
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
液状ＩｇＧの保存期間は、４０℃にて３ヶ月である。４℃及び室温での６ヶ月保存期間の終わりに、観察されたポリマーの含有量は、欧州薬局方に定められる基準をはるかに下回っている。凍結乾燥ＩｇＧに対しては、４℃及び室温での１２ヶ月の保存期間は、耐量の１０倍低いポリマー含有量を生じる。同じ含有量が、４０℃にて６ヶ月の保存期間の後に観察される。
【実施例５】
【００６６】
この実施例は、二量体含有量７％未満を有する本発明の溶液が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて注射した後、降圧効果（hypotensor effect）を引き起こさないことを確認することを意図する。Bleeker W.K.ら (Blood, 95, 2000, p. 1856-1861) は、注射されるＩｇＧ試料における免疫グロブリンＧ二量体の含有量が多いほど、ｉｎ ｖｉｖｏにおける降圧効果が高いことを報告している。自己免疫疾患の治療は、ＩｇＧの大量注射を必要とし、従って、ＩｇＧにおける二量体の含有量が制御されなければ、低血圧に苦しむ患者にとって、危険因子となり得る。
【００６７】
本実施例において示される、これらの研究は、２つの液状形態のＩｇＧ溶液、それぞれ、１１．５０％の二量体量を含む古典的なＩｇＧ溶液（溶液Ｔ−ＩｇＧ：５０ｇ／ｌ；スクロース：１００ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：３ｇ／ｌ、ｐＨ：６．５）、及び６．３％の二量体量を含む前述の実施例由来の溶液Ｋの、麻酔して調製されたラットにおける、血液動態効果を評価及び比較することを目的とした。
手法
１８０〜２００ｇの成体、雄、Ｓｐｒａｎｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ（IFFA-Credo：フランス）ラットを、６０ｍｇ／ｋｇの割合でペントバルビタール（Sanofi-France）を腹腔内注射によって麻酔する。麻酔されたラットを、３７℃に自動温度調節されたマットレス上に仰向けに寝かせる。古典的な圧センサー及び動脈圧を継続的に計測することを可能にするレコーダーと接続されたカテーテルを、頸動脈に導入する。気管カニューレは、呼吸路を自由にすることを可能にする。ＩｇＧ（溶液Ｋ及びＴ）の静脈内投与は、２．６６ｍｌ／１２０分の速度で、動物の頸静脈内に導入されたカテーテルを通して行われる。
【００６８】
動脈圧（ｍｍＨｇ）変動は、各６匹のラットの３グループについて、経時的に計測される：
−生理学的血清を受ける１つのコントロール群、
−０．６５ ｇ／ｋｇの割合にて溶液Ｔを受ける１つの処置群、及び
−０．６５ ｇ／ｋｇの割合にて溶液Ｋを受ける１つの処置群。
【００６９】
実験は、２０分の予備的な安定化フェーズ（preliminary stabilisation phase）で始まる。動脈圧の継続的記録は、ｔ０−１０分に始まる（ｔ０＝注射）。
【００７０】
これらの研究結果は、図１のチャートで読まれ、各点は、６つの実験の標準偏差を伴う、平均値である。統計学的解析は、当業者によって公知の分散分析の後、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定によって行われる。
【００７１】
これらの結果は、動脈圧データは、ＩｇＧ注射前、安定であり、３群のラットにおいて同程度であることを示す。動脈圧の減少は、ｔ０＋１０分にて見られ、最小値は、およそｔ０＋１５分に注射前の最初の値の５０％未満の値（およそ１００ｍｍＨｇからおよそ５０ｍｍＨｇに下がる）に達し、その後、注射を始めた後５０分から６０分に、動脈圧に達し、徐々に元に戻る。
【実施例６】
【００７２】
本実施例は、液状形態の溶液Ｊが、タンパク質及び異なる賦形剤を含む溶液と比較して、血液粘度の減少に寄与するかどうかを確認することを意図する。その目的のため、室温及びＴ＝３７℃にて、当業者に公知の方法に従って、赤血球の２つの重力沈降試験を行った。
手法
クエン酸三ナトリウム０．２Ｍ（１／９，ｖ／ｖ）の抗凝固溶液の存在下で、群０＋のヒト赤血球を、ｐＨ７．４の通常濃度のＰＢＳの生理食塩水溶液で３回洗浄する。様々な賦形剤中のタンパク質の水溶液を調製し、溶液Ｊを、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ及びｐＨ７に調整する。タンパク質及び賦形剤、ならびにそれらの各濃度は、表１１に示される。各タンパク質溶液の４．５ｍｌの試料を取り、１０ｍｌの目盛りのついたガラス管に入れる。その後、０．５ｍｌの洗浄された赤血球を、各溶液に添加する。得られた混合物を、密閉した管を３〜４回上下に回転する事によって均質化する。均質化の終わりに、管を、カウンターディスプレー上に置き、沈降速度を表す、透明なメニスカス（meniscus）までの赤血球細胞のタンジェント（tangent）の明瞭なデカンテーションライン（decantation line）が出現するために要する時間を計測する。室温での実験結果は、表１１に示される。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
得られた結果は、考慮された赤血球は、本発明の溶液ＪのＩｇＧの存在下で、試験された混合物の粘度の減少に対応する、高い沈降速度を有し、従って、より良い血液流動性を得ることを可能にすることを示す。
【００７５】
さらなる試験が、目盛りつきの１０ｍｌのガラス管中に入れられた上記混合物（４．５ｍｌのタンパク質溶液及び０．５ｍｌの洗浄された赤血球）を用いて行われ、この管を３〜４回上下に回転することによって均質化した。この作業が完了するとすぐに、この管を、３７℃の温度にて４５°の角度で１時間以内に、それらの内容物が沈降する方法で、置き、試験された混合物の上清量を計測する。Ｔ＝３７℃の試験結果を、表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
表１２における結果の解析は、以下に示される：
−血漿混合物の上清容量は、試験された混合物中で最も高く、従って、対応する最も低い粘度を示す；
−アルブミン混合物及び本発明の溶液Ｊは、同様の沈降速度（同容量の上清）を示す；
−従来技術のＩｇＧ混合物（すなわち、スクロース及びＮａＣｌを含む）は、最も少ない上清容量を導き、本発明の混合物Ｊ中においてよりも、赤血球の沈降が遅いことを意味し、さらに、上記の他の試験混合物と同様、上清は分離した溶血によって、バラ色に着色されていることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】異なる上記免疫グロブリンＧ組成物を注射した後の、経時的な、ラットにおける動脈圧変動の経過（curse）をグラフによって示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、該配合物が、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように、糖アルコール、グリシン、及び非イオン洗浄剤を含むことを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤からなる、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
該糖アルコールがマンニトールであることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項４】
マンニトールの濃度が、３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の配合物。
【請求項５】
グリシンの濃度が、７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項６】
非イオン洗浄剤の濃度が、２０〜５０ｐｐｍであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定化配合物を含む、液状形態の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定化配合物を含む、凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項９】
室温にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項７に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１０】
室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存期間後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項８に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１１】
４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に、７％未満の二量体の量を含むことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか1項に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１２】
ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１３】
凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１４】
凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物を好適な水性媒体中において再構成した後に得られた、液状形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、該配合物が、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように、糖アルコール、７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度のグリシン、及び２０〜５０ｐｐｍの濃度の非イオン洗浄剤を含むことを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤からなる、請求項１に記載の安定化配合物。
【請求項３】
該糖アルコールがマンニトールであることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４】
マンニトールの濃度が、３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の配合物。
【請求項５】
安定化剤として、請求項２〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物を含む、液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項６】
ポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物及び請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の凍結乾燥によって得られる、凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項７】
室温にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項５に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項８】
室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項６に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項９】
４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に、７％未満の二量体の量を含む組成物であることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか1項に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１０】
ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物用の安定化剤としての、請求項２〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１１】
凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１２】
凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物を好適な水性媒体中において再構成した後に得られた、液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１】
免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、該配合物が、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように、糖アルコール、グリシン、及び非イオン洗浄剤を含むことを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤からなる、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
該糖アルコールがマンニトールであることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項４】
マンニトールの濃度が、３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の配合物。
【請求項５】
グリシンの濃度が、７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項６】
非イオン洗浄剤の濃度が、２０〜５０ｐｐｍであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定化配合物を含む、液状形態の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定化配合物を含む、凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項９】
室温にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項７に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１０】
室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存期間後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項８に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１１】
４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に、７％未満の二量体の量を含むことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか1項に記載の免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１２】
ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１３】
凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１４】
凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物を好適な水性媒体中において再構成した後に得られた、液状形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜６のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物用安定化配合物であって、該配合物が、液状形態及び凍結乾燥形態の免疫グロブリンＧ組成物の安定化に適するように、糖アルコール、７ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度のグリシン、及び２０〜５０ｐｐｍの濃度の非イオン洗浄剤を含むことを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記糖アルコール、グリシン及び非イオン洗浄剤からなる、請求項１に記載の安定化配合物。
【請求項３】
該糖アルコールがマンニトールであることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４】
マンニトールの濃度が、３０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の配合物。
【請求項５】
安定化剤として、請求項２〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物を含む、液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項６】
ポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物及び請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の凍結乾燥によって得られる、凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項７】
室温にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項５に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項８】
室温にて１２ヶ月又は４０℃にて６ヶ月の保存期間の後に、０．３％未満のポリマー量を含有することを特徴とする、請求項６に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項９】
４℃にて２４ヶ月の保存期間の後に、７％未満の二量体の量を含む組成物であることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか1項に記載のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物。
【請求項１０】
ヒト血漿の分画によって直接得られた液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物用の安定化剤としての、請求項２〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１１】
凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【請求項１２】
凍結乾燥形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物を好適な水性媒体中において再構成した後に得られた、液状形態のポリクローナル免疫グロブリンＧ組成物の安定化のための、請求項１〜４のいずれか1項に記載の安定化配合物の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５２２７８０（Ｐ２００６−５２２７８０Ａ）
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５７８６（Ｐ２００６−５０５７８６）
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０００８７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１６５６
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０５３７５３００）ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジ．グループメント ディンテレット パブリック (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０００８７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１６５６
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０５３７５３００）ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジ．グループメント ディンテレット パブリック (2)
【Ｆターム（参考）】
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