測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法
【課題】表面プラズモン共鳴を適用し、発光ダイオードとＣＣＤカメラを主な要素とする簡易な装置により、一重項酸素を媒介とした化学増幅型蛍光イムノアセイを実現することができる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法を提供する。
【解決手段】本発明の測定用基板１０は、光源と光検出素子による反射または透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられ、透明基板１１と、透明基板１１の一方の面１１ａに設けられた金薄膜１２と、金薄膜１２上に配置された感応剤１３と、金薄膜１２および感応剤１３を被覆する保護膜１４と、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５と、を備えたことを特徴とする。
【解決手段】本発明の測定用基板１０は、光源と光検出素子による反射または透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられ、透明基板１１と、透明基板１１の一方の面１１ａに設けられた金薄膜１２と、金薄膜１２上に配置された感応剤１３と、金薄膜１２および感応剤１３を被覆する保護膜１４と、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５と、を備えたことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイと言われる生化学的測定方法に用いられる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイとは、免疫反応を利用して、微量物質の検出・定量を行う免疫学的測定方法、抗原抗体反応を利用した測定方法などの生化学的測定方法である。
近年、生化学的測定方法の１つとして、蛍光色素を含む微粒子をレーザーダイオードから発振された光により励起することによって生じる一重項酸素による発光現象を利用したアセイが実用化されている。このアセイは、現在でも一般的に用いられるエンザイムイノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）と比較すると、抗原と、これを挟み込む２種の抗体とを１つのステップで混合するだけで、これらの抗原および抗体を検出できることから、測定時間と手間を大幅に軽減することができるという利点がある。さらに、このアセイは、１次抗体−抗原−２次抗体が結合して近接していないと発光しないため、エンザイムイノアッセイや従来の蛍光イムノアッセイに比べてバックグラウンドが低く抑えられるので、高感度化にも有利な手法である。また、このアセイでは、蛍光色素を励起する一重項酸素が生体中分子やスーパーオキシドと反応して濃度が減少することから、蛍光色素をシリカで保護した微粒子により、測定時の夾雑物の影響が抑えられることも報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】中島 憲一郎、「化学発光を利用する分析法」、分析化学、Ｖｏｌ．４９（２０００）、Ｎｏ．３、ｐｐ．１３５−１５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のような利点を有する活性酸素種（一重項酸素）を用いた化学増幅は、診療や介護の現場で行う臨床検査（ＰＯＣＴ、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）やオンサイトでの生化学的測定にも適していると期待される。しかしながら、従来は、レーザーダイオードを用いているため、測定装置の小型化や低コスト化を達成することが難しい上に、測定装置の設置場所にも制限があった。そこで、レーザーダイードの代りに、これと比べると安価で小型の測定装置に組み込みが可能な発光ダイオードを用いて、一重項酸素を発生させることも可能であるが、それによって発生する一重項酸素の量は、生化学分析に十分な反応量ではなかった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、表面プラズモン共鳴を適用し、発光ダイオードとＣＣＤカメラを主な要素とする簡易な測定装置により、一重項酸素を媒介とした化学増幅型蛍光イムノアセイを実現することができる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置された感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。
【０００７】
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモンによる増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置された感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。
【０００８】
前記保護膜はシリカ薄膜であることが好ましい。
【０００９】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記透明基板側に反射させて、前記蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記保護膜側に透過させて、前記蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定用基板によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオード（ＬＥＤ）とＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。また、感応剤が保護膜で被覆されているので、本発明の測定用基板を用いた測定中に感応剤が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
【００１２】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図２】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図３】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図４】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図５】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図６】本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。
【図７】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【図８】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図９】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１０】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１１】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１２】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。
【図１３】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１４】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【図１５】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第二の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の実施の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１５】
「測定用基板」
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射または透過光学系で構成される測定装置において、一重項酸素による蛍光発光現象である表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用基板である。
なお、ここでいう生化学的結合形成および生化学的結合量とは、１次抗体に結合させた抗原と２次抗体との結合の形成、および、その結合量のことである。
【００１６】
（１）第一の実施形態
図１は、本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。
この実施形態の測定用基板１０は、透明基板１１と、透明基板１１の一方の面１１ａに設けられた金薄膜１２と、金薄膜１２上（金薄膜１２の透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）１２ａ）に配置された感応剤１３と、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面（感応剤１３の金薄膜１２と接している面以外の面）１３ａを被覆する保護膜１４と、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５とから概略構成されている。
【００１７】
透明基板１１は、特に限定されないが、発光ダイオード（ＬＥＤ）から入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
また、透明基板１１の厚さは、特に限定されないが、金薄膜１２の表面にエバネッセント波を生じさせるのに十分な光が、発光ダイオードから金薄膜１２に入射される程度、かつ、取り扱いがし易く、割れ難い厚さであることが好ましく、０．５ｍｍ〜２ｍｍであることがより好ましい。
【００１８】
金薄膜１２は、スパッタリング装置や蒸着装置などによって形成された連続した薄膜である。
金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤１３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤１３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。
【００１９】
また、金薄膜１２の膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起される大きさであることが好ましく、２０ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましい。
【００２０】
感応剤１３としては、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ）などの一重項酸素を発生させる色素が用いられる。
透明基板１１の一方の面１１ａに配置される感応剤１３の量は、表面プラズモン共鳴によって、生化学的結合形成および生化学的結合量を検出するために十分な励起光が得られる量であり、金薄膜１２の一方の面１２ａにおいて、１００ｍｍ２あたり０．６μｇ〜３０μｇであることが好ましい。
【００２１】
保護膜１４は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光の透過率に優れるとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができるものが好ましく、シリカ薄膜であることがより好ましい。
【００２２】
また、保護膜１４の膜厚は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光を減衰することがないとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができる大きさであり、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００２３】
１次抗体１５としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原に応じて、１次抗体１５は適宜選択される。
また、１次抗体１５は、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａにおいて、感応剤１３上に固定化されている。すなわち、保護膜１４を介して、感応剤１３の表面１３ａ上に、１次抗体１５が固定化されている。
【００２４】
保護膜１４の表面１４ａに固定化される１次抗体１５の量は、測定対象の抗原を結合させるために十分な量であり、例えば、保護膜１４の表面１４ａにおいて、１００ｍｍ２あたり１ｎｇ〜１００ｎｇであることが好ましい。
【００２５】
次に、図２〜５を参照して、この測定用基板１０の製造方法を説明する。
まず、図２に示すように、スパッタリング装置や蒸着装置などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚の金薄膜１２を形成する。
次いで、スポッター装置などを用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、ローズベンガル、メチレンブルーなどの色素を含む溶液を微量の液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、図３に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａに、所定量の感応剤１３を配置する。
【００２６】
次いで、図４に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、所定の膜厚の保護膜１４を形成する。
保護膜１４を形成する方法としては、例えば、（１）スパッタリングにより金薄膜１２を形成する方法、（２）スポッター装置により、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに、テトラエトキシシランのエタノール溶液を液滴として滴下し、その後、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに塩酸を含むエタノール溶液を３０分以上接触させ、さらに、温度８０℃以上で４〜２０時間加熱して、保護膜１４を形成する方法などが用いられる。
【００２７】
次いで、図５に示すように、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得る。
シランカップリング剤としては、例えば、３アミノプロピルエトキシシランなどが用いられる。
【００２８】
この測定用基板１０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤１３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤１３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
【００２９】
（２）第二の実施形態
図６は、本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。
図６において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
この実施形態の測定用基板２０が、上述の第一の実施形態の測定用基板１０と異なる点は、透明基板１１の一方の面１１ａに、ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２が設けられ、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの上（ドット状の金薄膜２２Ａの透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）２２ａ）に、感応剤２３が配置されている点である。すなわち、感応剤２３も、ドット状に配置されている。
【００３０】
ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２は、電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などによって、一定の間隔を置いて、不連続かつ規則的に形成された多数のドット状（点状）の金薄膜２２Ａの集合体からなる薄膜である。
集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤２３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤２３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。
【００３１】
また、集合体２２の膜厚、すなわち、ドット状の金薄膜２２Ａの膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに表面プラズモン波が誘起される程度であることが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａ同士の間隔は、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起されて電場強度を増大させることができる大きさが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。
【００３２】
感応剤２３としては、上述の感応剤１３と同様のものが用いられる。
【００３３】
次に、この測定用基板２０の製造方法を説明する。
電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚のドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成し、さらに、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに、感応剤２３を配置する以外は、上述の第一の実施形態と同様にして、測定用基板２０を製造する。
【００３４】
この測定用基板２０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤２３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤２３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２を設けたことにより、発光ダイオードにより透明基板１１側から集合体２２に光を入射することによって、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起して電場強度を増大させることができるので、透過光学系による測定方法が可能となる。
【００３５】
「生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法」
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法では、まず、上述の測定用基板を用いて、測定用チップを形成する。
【００３６】
（１）第一の実施形態
図７〜１３を参照して、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を説明する。
図７は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
図７において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図７において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図８〜１３において、説明を簡略化するために、図７に示した測定用チップ３０の構成要素の一部の図示を省略する。
【００３７】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製する（ステップＡ１）。
【００３８】
測定用チップ３０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に設けられた溶液保持部材３１とから概略構成されている。
また、溶液保持部材３１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａが設けられている。
【００３９】
溶液保持部材３１は、ポリジメチルシロキサンシートからなり、その厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることがより好ましい。
また、溶液保持部材３１の空間３１ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、０．０５ｍｍ〜０．０７ｍｍであることがより好ましい。
【００４０】
なお、この実施形態では、溶液保持部材３１の空間３１ａの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、ポリジメチルシロキサンシートに設けられる貫通孔の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。
【００４１】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して（図８参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ１）。
これにより、測定用チップ３０の１次抗体１５と、溶液αに抗原が含まれる場合、その抗原４１とを反応させて、図９に示すように、１次抗体１５に抗原４１を結合させる。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、溶液αを除去する。
【００４２】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ１）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させ、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを除去し、さらに、空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。
バッファ溶液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）水溶液などが用いられる。
【００４３】
蛍光試薬４２としては、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴によって発生した一重項酸素により蛍光を発するものが用いられ、例えば、ユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）、Ｅｕ ｔｒｉｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｃｒｙｐｔａｔｅ、テルビウム錯体などのランタノイド錯体が挙げられる。
【００４４】
２次抗体４３としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原４１を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原４１に応じて、２次抗体４３は適宜選択される。
なお、本発明では、蛍光試薬４２と２次抗体４３の結合体の代りに、市販の抗体固定化用の蛍光ビーズを用いることもできる。
【００４５】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１２に示すように、測定用チップ３０を測定装置５０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側から金薄膜１２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、透明基板１１側に反射させて、その蛍光を測定する（ステップＤ１）。
【００４６】
この測定装置５０は、測定用チップ３０を載置する面（載置面）５１ａを有するコニカルプリズム５１と、測定用チップ３０に光を入射する発光ダイオード５２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ５３と、２次元ＣＣＤカメラ５３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）５４とから概略構成されている。
【００４７】
コニカルプリズム５１としては、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
発光ダイオード５２としては、特に限定されないが、水の吸収が少ない波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが好ましい。
【００４８】
２次元ＣＣＤカメラ５３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ５４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。
【００４９】
この測定装置５０を用いた測定方法では、図１２に示すように、コニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射する。
発光ダイオード５２から金薄膜１２に入射する光は、１ＭＨｚ〜５ＭＨｚの周期で間欠的（パルス状）な光である。
【００５０】
すると、金薄膜１２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤１３が励起して、その励起光と、溶液保持部材３１の空間３１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。
【００５１】
そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ３０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。
【００５２】
なお、発光ダイオード５２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード５２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。
なお、「擬似的プラトー部分」とは、最初に現れるプラトー部分であり、この部分の時間が長くなると、発散する。
【００５３】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【００５４】
（２）第二の実施形態
図１４は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
図１４において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図６に示した測定用基板２０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。
【００５５】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液αを空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液αを排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を形成する（ステップＡ２）。
【００５６】
測定用チップ６０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に順に設けられたシート状の第一部材６１およびシート状の第二部材６２とから概略構成されている。
また、第一部材６１は両面テープなどからなり、第一部材６１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられている。
さらに、第二部材６２はポリジメチルシロキサンシートなどからなり、第二部材６２には、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられている。
【００５７】
第一部材６１の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、０．５ｍｍ〜３ｍｍであることがより好ましい。
また、第一部材６１の空間６１ａの大きさ（面積）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、５ｍｍ２〜１０ｍｍ２であることがより好ましい。
【００５８】
第二部材６２の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させることができる程度であればよく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。
また、第二部材６２の流入部６２ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の流入部６２ａには、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させるためのポンプが接続（図示略）されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。
さらに、第二部材６２の排出部６２ｂの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の排出部６２ｂには、第一部材６１の空間６１ａ内から排出された廃液を回収する回収容器（図示略）が接続されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。
【００５９】
また、第二部材６２の流入部６２ａにポンプを接続し、第二部材６２の排出部６２ｂに回収容器を接続することにより、第一部材６１の空間６１ａ内では、図中の矢印（破線）方向に、測定対象の溶液αが流入する。
【００６０】
なお、この実施形態では、第一部材６１の空間６１ａの断面形状を長方形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第一部材に設けられる空間の断面形状は、正方形、円形、楕円形などであってもよい。
また、この実施形態では、第二部材６２の流入部６２ａ、第二部材６２の排出部６２ｂの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第二部材に設けられる流入部または排出部の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。
【００６１】
次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ２）。
これにより、測定用チップ６０の１次抗体１５と、溶液αに含まれる抗原４１とを反応させて、１次抗体１５に抗原４１を結合させる（図９参照）。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、溶液αを排出する。
【００６２】
次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ２）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させて、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを排出し、さらに、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を流入し、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。
【００６３】
次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１５に示すように、測定用チップ６０を測定装置７０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、保護膜１４側に透過させて、その蛍光を測定する（ステップＤ２）。
【００６４】
この測定装置７０は、測定用チップ６０を支持する支持部（図示略）と、測定用チップ６０に光を入射する発光ダイオード７２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ７３と、２次元ＣＣＤカメラ７３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）７４とから概略構成されている。
【００６５】
発光ダイオード７２としては、特に限定されないが、波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが用いられる。
【００６６】
２次元ＣＣＤカメラ７３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ７４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。
【００６７】
この測定装置７０を用いた測定方法では、図１５に示すように、支持部により測定用チップ６０を支持し、発光ダイオード７２から発光した光を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射する。
【００６８】
すると、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤２３が励起して、その励起光と、第一部材６１の空間６１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。
【００６９】
そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ６０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。
【００７０】
なお、発光ダイオード７２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード７２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。
【００７１】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
「実施例１」
（１）測定用基板の作製
図１に示す測定用基板１０を作製した。
まず、スパッタリングにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、膜厚約５０ｍｍの金薄膜１２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として多数滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、金薄膜１２の一方の面１２ａに、薄膜状に感応剤（ローズベンガル）１３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得た。
【００７４】
（２）測定用チップの作製
図７に示す測定用チップ３０を作製した。
測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製した。
溶液保持部材３１としては、ポリジメチルシロキサンからなるシートを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａを設けた反応ウェルを用いた。
【００７５】
（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ポジティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ポジティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた蛍光試薬のユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）と結合したコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、このバッファ溶液を接触させ、室温にて２０分間、反応させた。この間、測定用チップ３０をしんとう機に搭載して回転数３０ｒｐｍで揺らした。
【００７６】
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなるコニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００７７】
「実施例２」
（１）測定用基板の作製
図６に示す測定用基板２０を作製した。
まず、電子線リソグラフィーにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、幅２０ｎｍ×２０ｎｍ、膜厚約２０ｍｍのドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、ドット状に感応剤（ローズベンガル）２３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａおよび感応剤２３の表面２３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板２０を得た。
【００７８】
（２）測定用チップの作製
図１４に示す測定用チップ６０を作製した。
測定用基板２０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液を空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液を排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を作製した。
溶液保持部材６３としては、第一部材６１と第二部材６２を積層した、フローセルを用いた。
第一部材６１としては、両面テープを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられたものを用いた。
第二部材６２としては、ポリジメチルシロキサンシートを型抜きして、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられたものを用いた。
【００７９】
（３）反応測定
実施例１と同様にして、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、反応させた後、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、第一部材６１の空間６１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ６０を、図１５に示す測定装置７０に設置した。
そして、発光ダイオード７２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射した。
すると、測定用チップ６０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ７３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００８０】
「比較例」
（１） 測定用基板の作製
実施例１と同様にして、図１に示す測定用基板１０を作製した。
（２）測定用チップの作製
実施例１と同様にして、図７に示す測定用チップ３０を作製した。
（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、バッファ溶液のみ（ネガティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ネガティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ネガティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、実施例１と同様にして、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、実施例１と同様にして、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から蛍光が発光する様子を目視にて確認することができなかった。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００８１】
以上の結果から、実施例１および２において求められた蛍光量と、比較例において求められた蛍光量とを比較したところ、実施例１および２の蛍光量は、比較例の蛍光量の３倍以上であることが分かった。これより、実施例１および２によれば、発光ダイオードを用いた測定装置にて、プラズモン増強蛍光イムノアセイが実現できることを確認できた。
【００８２】
なお、実施例１で用いたウェル型測定用チップ３０は、一般的な９６穴ウェルと同じサイズのウェルとして設計していることから、ジグに設置することによって、上記の測定装置５０に限らず、市販の生化学用蛍光測定装置に適用することもできる。
【符号の説明】
【００８３】
１０・・・測定用基板、１１・・・透明基板、１２・・・金薄膜、１３・・・感応剤、１４・・・保護膜、１５・・・１次抗体、２０・・・測定用基板、２２・・・集合体、２２Ａ・・・ドット状の金薄膜、２３・・・感応剤、３０・・・測定用チップ、３１・・・溶液保持部材、４１・・・抗原、４２・・・蛍光試薬、４３・・・２次抗体、５０・・・測定装置、５１・・・コニカルプリズム、５２・・・発光ダイオード、５３・・・２次元ＣＣＤカメラ、５４・・・フィルタ、６０・・・測定用チップ、６１・・・第一部材、６２・・・第二部材、６３・・・溶液保持部材、７０・・・測定装置、７２・・・発光ダイオード、７３・・・２次元ＣＣＤカメラ、７４・・・フィルタ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイと言われる生化学的測定方法に用いられる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイとは、免疫反応を利用して、微量物質の検出・定量を行う免疫学的測定方法、抗原抗体反応を利用した測定方法などの生化学的測定方法である。
近年、生化学的測定方法の１つとして、蛍光色素を含む微粒子をレーザーダイオードから発振された光により励起することによって生じる一重項酸素による発光現象を利用したアセイが実用化されている。このアセイは、現在でも一般的に用いられるエンザイムイノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）と比較すると、抗原と、これを挟み込む２種の抗体とを１つのステップで混合するだけで、これらの抗原および抗体を検出できることから、測定時間と手間を大幅に軽減することができるという利点がある。さらに、このアセイは、１次抗体−抗原−２次抗体が結合して近接していないと発光しないため、エンザイムイノアッセイや従来の蛍光イムノアッセイに比べてバックグラウンドが低く抑えられるので、高感度化にも有利な手法である。また、このアセイでは、蛍光色素を励起する一重項酸素が生体中分子やスーパーオキシドと反応して濃度が減少することから、蛍光色素をシリカで保護した微粒子により、測定時の夾雑物の影響が抑えられることも報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】中島 憲一郎、「化学発光を利用する分析法」、分析化学、Ｖｏｌ．４９（２０００）、Ｎｏ．３、ｐｐ．１３５−１５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のような利点を有する活性酸素種（一重項酸素）を用いた化学増幅は、診療や介護の現場で行う臨床検査（ＰＯＣＴ、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）やオンサイトでの生化学的測定にも適していると期待される。しかしながら、従来は、レーザーダイオードを用いているため、測定装置の小型化や低コスト化を達成することが難しい上に、測定装置の設置場所にも制限があった。そこで、レーザーダイードの代りに、これと比べると安価で小型の測定装置に組み込みが可能な発光ダイオードを用いて、一重項酸素を発生させることも可能であるが、それによって発生する一重項酸素の量は、生化学分析に十分な反応量ではなかった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、表面プラズモン共鳴を適用し、発光ダイオードとＣＣＤカメラを主な要素とする簡易な測定装置により、一重項酸素を媒介とした化学増幅型蛍光イムノアセイを実現することができる測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置された感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。
【０００７】
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモンによる増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置された感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする。
【０００８】
前記保護膜はシリカ薄膜であることが好ましい。
【０００９】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記透明基板側に反射させて、前記蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、本発明の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記保護膜側に透過させて、前記蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定用基板によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオード（ＬＥＤ）とＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。また、感応剤が保護膜で被覆されているので、本発明の測定用基板を用いた測定中に感応剤が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
【００１２】
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図２】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図３】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図４】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図５】本発明の測定用基板の第一の実施形態の製造方法を示す概略断面図である。
【図６】本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。
【図７】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【図８】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図９】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１０】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１１】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１２】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。
【図１３】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を示す概略断面図である。
【図１４】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【図１５】本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第二の実施形態に用いられる測定装置を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の測定用基板、並びに、これを用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の実施の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１５】
「測定用基板」
本発明の測定用基板は、光源と光検出素子による反射または透過光学系で構成される測定装置において、一重項酸素による蛍光発光現象である表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用基板である。
なお、ここでいう生化学的結合形成および生化学的結合量とは、１次抗体に結合させた抗原と２次抗体との結合の形成、および、その結合量のことである。
【００１６】
（１）第一の実施形態
図１は、本発明の測定用基板の第一の実施形態を示す概略断面図である。
この実施形態の測定用基板１０は、透明基板１１と、透明基板１１の一方の面１１ａに設けられた金薄膜１２と、金薄膜１２上（金薄膜１２の透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）１２ａ）に配置された感応剤１３と、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面（感応剤１３の金薄膜１２と接している面以外の面）１３ａを被覆する保護膜１４と、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５とから概略構成されている。
【００１７】
透明基板１１は、特に限定されないが、発光ダイオード（ＬＥＤ）から入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
また、透明基板１１の厚さは、特に限定されないが、金薄膜１２の表面にエバネッセント波を生じさせるのに十分な光が、発光ダイオードから金薄膜１２に入射される程度、かつ、取り扱いがし易く、割れ難い厚さであることが好ましく、０．５ｍｍ〜２ｍｍであることがより好ましい。
【００１８】
金薄膜１２は、スパッタリング装置や蒸着装置などによって形成された連続した薄膜である。
金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤１３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤１３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、金薄膜１２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。
【００１９】
また、金薄膜１２の膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起される大きさであることが好ましく、２０ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましい。
【００２０】
感応剤１３としては、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ）などの一重項酸素を発生させる色素が用いられる。
透明基板１１の一方の面１１ａに配置される感応剤１３の量は、表面プラズモン共鳴によって、生化学的結合形成および生化学的結合量を検出するために十分な励起光が得られる量であり、金薄膜１２の一方の面１２ａにおいて、１００ｍｍ２あたり０．６μｇ〜３０μｇであることが好ましい。
【００２１】
保護膜１４は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光の透過率に優れるとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができるものが好ましく、シリカ薄膜であることがより好ましい。
【００２２】
また、保護膜１４の膜厚は、特に限定されないが、感応剤１３において発生した励起光を減衰することがないとともに、表面プラズモン共鳴を実施するバッファ溶液中に測定用基板１０を浸漬しても、そのバッファ溶液中に感応剤１３が溶出することを防止することができる大きさであり、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００２３】
１次抗体１５としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原に応じて、１次抗体１５は適宜選択される。
また、１次抗体１５は、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａにおいて、感応剤１３上に固定化されている。すなわち、保護膜１４を介して、感応剤１３の表面１３ａ上に、１次抗体１５が固定化されている。
【００２４】
保護膜１４の表面１４ａに固定化される１次抗体１５の量は、測定対象の抗原を結合させるために十分な量であり、例えば、保護膜１４の表面１４ａにおいて、１００ｍｍ２あたり１ｎｇ〜１００ｎｇであることが好ましい。
【００２５】
次に、図２〜５を参照して、この測定用基板１０の製造方法を説明する。
まず、図２に示すように、スパッタリング装置や蒸着装置などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚の金薄膜１２を形成する。
次いで、スポッター装置などを用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、ローズベンガル、メチレンブルーなどの色素を含む溶液を微量の液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、図３に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａに、所定量の感応剤１３を配置する。
【００２６】
次いで、図４に示すように、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、所定の膜厚の保護膜１４を形成する。
保護膜１４を形成する方法としては、例えば、（１）スパッタリングにより金薄膜１２を形成する方法、（２）スポッター装置により、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに、テトラエトキシシランのエタノール溶液を液滴として滴下し、その後、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａに塩酸を含むエタノール溶液を３０分以上接触させ、さらに、温度８０℃以上で４〜２０時間加熱して、保護膜１４を形成する方法などが用いられる。
【００２７】
次いで、図５に示すように、物理吸着あるいはシランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得る。
シランカップリング剤としては、例えば、３アミノプロピルエトキシシランなどが用いられる。
【００２８】
この測定用基板１０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤１３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤１３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
【００２９】
（２）第二の実施形態
図６は、本発明の測定用基板の第二の実施形態を示す概略断面図である。
図６において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
この実施形態の測定用基板２０が、上述の第一の実施形態の測定用基板１０と異なる点は、透明基板１１の一方の面１１ａに、ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２が設けられ、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの上（ドット状の金薄膜２２Ａの透明基板１１と接している面とは反対側の面（以下、「一方の面」と言う。）２２ａ）に、感応剤２３が配置されている点である。すなわち、感応剤２３も、ドット状に配置されている。
【００３０】
ドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２は、電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などによって、一定の間隔を置いて、不連続かつ規則的に形成された多数のドット状（点状）の金薄膜２２Ａの集合体からなる薄膜である。
集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａに、感応剤２３を配置するために必要な大きさ（面積）に設けられるが、所定量の感応剤２３が設けられる大きさであれば、その大きさは特に限定されない。すなわち、集合体２２は、透明基板１１の一方の面１１ａの一部に設けられていても、全面に設けられていてもよい。
【００３１】
また、集合体２２の膜厚、すなわち、ドット状の金薄膜２２Ａの膜厚は、特に限定されないが、透明基板１１を介して、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに表面プラズモン波が誘起される程度であることが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａ同士の間隔は、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光により、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起されて電場強度を増大させることができる大きさが好ましく、５ｎｍ〜４０ｎｍであることがより好ましい。
【００３２】
感応剤２３としては、上述の感応剤１３と同様のものが用いられる。
【００３３】
次に、この測定用基板２０の製造方法を説明する。
電子線リソグラフィー、ナノインプリント法などにより、透明基板１１の一方の面１１ａに、所定の大きさ、所定の膜厚のドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成し、さらに、集合体２２（ドット状の金薄膜２２Ａ）の表面２２ａに、感応剤２３を配置する以外は、上述の第一の実施形態と同様にして、測定用基板２０を製造する。
【００３４】
この測定用基板２０によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
また、感応剤２３が保護膜１４で被覆されているので、この測定用基板１０を用いた測定中に感応剤２３が消失して、測定感度が低下するという不具合を防止できる。
さらに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２を設けたことにより、発光ダイオードにより透明基板１１側から集合体２２に光を入射することによって、集合体２２の表面に局在する局在プラズモンが誘起して電場強度を増大させることができるので、透過光学系による測定方法が可能となる。
【００３５】
「生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法」
本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法では、まず、上述の測定用基板を用いて、測定用チップを形成する。
【００３６】
（１）第一の実施形態
図７〜１３を参照して、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態を説明する。
図７は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法の第一の実施形態に用いられる測定用チップを示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
図７において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図７において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図８〜１３において、説明を簡略化するために、図７に示した測定用チップ３０の構成要素の一部の図示を省略する。
【００３７】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製する（ステップＡ１）。
【００３８】
測定用チップ３０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に設けられた溶液保持部材３１とから概略構成されている。
また、溶液保持部材３１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａが設けられている。
【００３９】
溶液保持部材３１は、ポリジメチルシロキサンシートからなり、その厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることがより好ましい。
また、溶液保持部材３１の空間３１ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の抗原を含む溶液の必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、０．０５ｍｍ〜０．０７ｍｍであることがより好ましい。
【００４０】
なお、この実施形態では、溶液保持部材３１の空間３１ａの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、ポリジメチルシロキサンシートに設けられる貫通孔の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。
【００４１】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して（図８参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ１）。
これにより、測定用チップ３０の１次抗体１５と、溶液αに抗原が含まれる場合、その抗原４１とを反応させて、図９に示すように、１次抗体１５に抗原４１を結合させる。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、溶液αを除去する。
【００４２】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ１）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させ、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを除去し、さらに、空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。
バッファ溶液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）水溶液などが用いられる。
【００４３】
蛍光試薬４２としては、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴によって発生した一重項酸素により蛍光を発するものが用いられ、例えば、ユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）、Ｅｕ ｔｒｉｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｃｒｙｐｔａｔｅ、テルビウム錯体などのランタノイド錯体が挙げられる。
【００４４】
２次抗体４３としては、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法により検出される抗原４１を認識することができる抗体が用いられる。すなわち、測定対象の抗原４１に応じて、２次抗体４３は適宜選択される。
なお、本発明では、蛍光試薬４２と２次抗体４３の結合体の代りに、市販の抗体固定化用の蛍光ビーズを用いることもできる。
【００４５】
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１２に示すように、測定用チップ３０を測定装置５０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側から金薄膜１２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、透明基板１１側に反射させて、その蛍光を測定する（ステップＤ１）。
【００４６】
この測定装置５０は、測定用チップ３０を載置する面（載置面）５１ａを有するコニカルプリズム５１と、測定用チップ３０に光を入射する発光ダイオード５２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ５３と、２次元ＣＣＤカメラ５３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）５４とから概略構成されている。
【００４７】
コニカルプリズム５１としては、特に限定されないが、発光ダイオードから入射された光の透過率に優れ、熱膨張係数が小さく、低膨張の材質からなるものが好ましく、例えば、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）などの光学ガラスなどが用いられる。
発光ダイオード５２としては、特に限定されないが、水の吸収が少ない波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが好ましい。
【００４８】
２次元ＣＣＤカメラ５３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ５４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。
【００４９】
この測定装置５０を用いた測定方法では、図１２に示すように、コニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射する。
発光ダイオード５２から金薄膜１２に入射する光は、１ＭＨｚ〜５ＭＨｚの周期で間欠的（パルス状）な光である。
【００５０】
すると、金薄膜１２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、金薄膜１２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤１３が励起して、その励起光と、溶液保持部材３１の空間３１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。
【００５１】
そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ３０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。
【００５２】
なお、発光ダイオード５２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ５３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード５２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。
なお、「擬似的プラトー部分」とは、最初に現れるプラトー部分であり、この部分の時間が長くなると、発散する。
【００５３】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【００５４】
（２）第二の実施形態
図１４は、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法に用いられる測定用チップの第二の実施形態を示す概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
図１４において、図１に示した測定用基板１０と同じ構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図６に示した測定用基板２０の構成要素の一部の図示を省略する。また、図１４において、説明を簡略化するために、図１に示した測定用基板１０の構成要素の一部の図示を省略する。
【００５５】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法は、まず、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面（透明基板１１の一方の面１１ａ）上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液αを空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液αを排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を形成する（ステップＡ２）。
【００５６】
測定用チップ６０は、測定用基板１０と、その透明基板１１の一方の面１１ａ上に順に設けられたシート状の第一部材６１およびシート状の第二部材６２とから概略構成されている。
また、第一部材６１は両面テープなどからなり、第一部材６１には、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられている。
さらに、第二部材６２はポリジメチルシロキサンシートなどからなり、第二部材６２には、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられている。
【００５７】
第一部材６１の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであることが好ましく、０．５ｍｍ〜３ｍｍであることがより好ましい。
また、第一部材６１の空間６１ａの大きさ（面積）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、測定対象の溶液αの必要量を収容（保持）できる大きさであり、かつ、保護膜１４の表面１４ａに固定化された１次抗体１５を収容できる大きさであることが好ましく、５ｍｍ２〜１０ｍｍ２であることがより好ましい。
【００５８】
第二部材６２の厚さは、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させることができる程度であればよく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。
また、第二部材６２の流入部６２ａの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の流入部６２ａには、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液αを流入させるためのポンプが接続（図示略）されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。
さらに、第二部材６２の排出部６２ｂの大きさ（直径）は、特に限定されないが、本発明の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法において、第二部材６２の排出部６２ｂには、第一部材６１の空間６１ａ内から排出された廃液を回収する回収容器（図示略）が接続されるため、その接続に適した大きさであることが好ましく、０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであることがより好ましい。
【００５９】
また、第二部材６２の流入部６２ａにポンプを接続し、第二部材６２の排出部６２ｂに回収容器を接続することにより、第一部材６１の空間６１ａ内では、図中の矢印（破線）方向に、測定対象の溶液αが流入する。
【００６０】
なお、この実施形態では、第一部材６１の空間６１ａの断面形状を長方形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第一部材に設けられる空間の断面形状は、正方形、円形、楕円形などであってもよい。
また、この実施形態では、第二部材６２の流入部６２ａ、第二部材６２の排出部６２ｂの断面形状を円形としたが、本発明はこれに限定されない。本発明にあっては、第二部材に設けられる流入部または排出部の断面形状は、正方形、長方形、楕円形などであってもよい。
【００６１】
次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、測定対象の溶液α（抗原を含む場合も含まない場合もある）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液αを接触させる（ステップＢ２）。
これにより、測定用チップ６０の１次抗体１５と、溶液αに含まれる抗原４１とを反応させて、１次抗体１５に抗原４１を結合させる（図９参照）。
１次抗体１５と抗原４１との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、溶液αを排出する。
【００６２】
次いで、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内に、予め調製しておいた、蛍光試薬４２と結合した２次抗体４３を含む溶液βを流入して（図１０参照）、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、溶液βを接触させる（ステップＣ２）。
これにより、１次抗体１５に結合した抗原４１と、２次抗体４３とを反応させて、図１１に示すように、１次抗体１５に結合した抗原４１に２次抗体４３を結合させて、２次抗体４３における１次抗体１５に結合している側とは反対側の端に蛍光試薬４２を配置させる。
１次抗体１５に結合した抗原４１と２次抗体４３との反応が完了した後、第二部材６２の排出部６２ｂを介して、第一部材６１の空間６１ａ内から、２次抗体４３を含む溶液βを排出し、さらに、第二部材６２の流入部６２ａを介して、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を流入し、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄する。
【００６３】
次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、図１５に示すように、測定用チップ６０を測定装置７０に設置して、１次抗体１５に結合させた抗原４１と２次抗体４３との結合の形成、および、その結合量を検出する。
すなわち、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に光を入射して、その入射光によって蛍光試薬４２から励起された蛍光を、保護膜１４側に透過させて、その蛍光を測定する（ステップＤ２）。
【００６４】
この測定装置７０は、測定用チップ６０を支持する支持部（図示略）と、測定用チップ６０に光を入射する発光ダイオード７２と、蛍光試薬４２が発光した蛍光を観察、測定するための２次元ＣＣＤカメラ７３と、２次元ＣＣＤカメラ７３によって測定する光の波長を選択するためのフィルタ（波長選択フィルタ）７４とから概略構成されている。
【００６５】
発光ダイオード７２としては、特に限定されないが、波長６４０ｎｍ〜７６０ｎｍの光を発光するものが用いられる。
【００６６】
２次元ＣＣＤカメラ７３としては、画素数６４０×４８０以上で、フレームレートが２００ｆｐｓ以上の性能を有し、データの転送に必要なＧｉｇａ Ｅｔｈｅｒｎｅｔインターフェースを備えたもので、例えば、Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ社製のＧＥ６８０（商品名）などが用いられる。
フィルタ７４としては、蛍光試薬４２から発光される蛍光を選択的に透過するものが用いられ、波長５００〜６００ｎｍの範囲でのバンドパスフィルターであればよく、例えば、５９５ｎｍ中心の２５ｎｍ幅バンドパスフィルターであればよい。
【００６７】
この測定装置７０を用いた測定方法では、図１５に示すように、支持部により測定用チップ６０を支持し、発光ダイオード７２から発光した光を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射する。
【００６８】
すると、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面にエバネッセント波が生じるとともに、ドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２の表面に表面プラズモン波が誘起され、感応剤２３が励起して、その励起光と、第一部材６１の空間６１ａ内のバッファ溶液中に含まれている酸素分子とが反応して、一重項酸素が生成する。
【００６９】
そして、生成した一重項酸素が、蛍光試薬４２と反応する（図１３参照）。ここで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって、蛍光試薬４２から発光された蛍光が観測された場合、測定対象の溶液αには、抗原４１が含まれていたことになる。すなわち、この蛍光が発光する現象は、測定用チップ６０の１次抗体１５に結合している抗原４１に、蛍光試薬４２と結合している２次抗体４３が結合することによって生じる現象であるから、蛍光が観測されれば、溶液αには、抗原４１が含まれていたことを確認することができる。
また、溶液αにおける抗原４１の濃度が高ければ、２次抗体４３に結合した蛍光試薬４２の数、すなわち、２次抗体４３と蛍光試薬４２との結合数も多くなるため、蛍光量と抗原濃度との間には相関（比例関係）がある。
【００７０】
なお、発光ダイオード７２から金薄膜１２にパルス状の光を入射した際、初期に観測される蛍光の光信号は、目的とする蛍光試薬以外の夾雑物から発せられた短時間の蛍光信号も含まれている可能性が高い。そこで、２次元ＣＣＤカメラ７３によって撮影された画像のデータ処理により、蛍光が観測された初期のデータについては採用せず、発光ダイオード７２から発光された光による蛍光試薬４２の励起後、一定時間経過してから開始する擬似的プラトー部分での蛍光量を求め、抗原濃度に換算する。
【００７１】
この実施形態の生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法によれば、可搬・小型化に適した発光ダイオードとＣＣＤカメラを組み合わせた簡易な測定装置により、一重項酸素を用いた蛍光発光イムノアセイを測定できるようになり、将来的にオンサイト測定、ＰＯＣＴへの応用が可能になる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
「実施例１」
（１）測定用基板の作製
図１に示す測定用基板１０を作製した。
まず、スパッタリングにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、膜厚約５０ｍｍの金薄膜１２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、金薄膜１２の一方の面１２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として多数滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、金薄膜１２の一方の面１２ａに、薄膜状に感応剤（ローズベンガル）１３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、金薄膜１２の一方の面１２ａおよび感応剤１３の表面１３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板１０を得た。
【００７４】
（２）測定用チップの作製
図７に示す測定用チップ３０を作製した。
測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間３１ａを有する溶液保持部材３１を設け、測定用チップ３０を作製した。
溶液保持部材３１としては、ポリジメチルシロキサンからなるシートを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられている部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の空間３１ａを設けた反応ウェルを用いた。
【００７５】
（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ポジティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ポジティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、予め調製しておいた蛍光試薬のユーロピウム錯体（Ｓｏｄｉｕｍ［４’−（４’−Ａｍｉｎｏ−４−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−２，２’：−６，２“−ｔｅｒｐｙｄｉｎｅ−６，６”−ｄｉｙｌｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｏ）］ｅｕｒｏｐａｔｅ（ＩＩＩ）］）と結合したコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、このバッファ溶液を接触させ、室温にて２０分間、反応させた。この間、測定用チップ３０をしんとう機に搭載して回転数３０ｒｐｍで揺らした。
【００７６】
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなるコニカルプリズム５１の載置面５１ａに、測定用チップ３０を設置し、コニカルプリズム５１介して、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００７７】
「実施例２」
（１）測定用基板の作製
図６に示す測定用基板２０を作製した。
まず、電子線リソグラフィーにより、ＢＫ７（硼珪酸ガラス）からなり、縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ×厚さ１ｍｍの透明基板１１の一方の面１１ａに、幅２０ｎｍ×２０ｎｍ、膜厚約２０ｍｍのドット状の金薄膜２２Ａの集合体２２を形成した。
次いで、スポッター装置を用いて、それぞれのドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、感応剤のローズベンガルを含む溶液を１点あたり４ｎＬの液滴として滴下し、その後、液滴の溶媒を乾燥するなどして除去し、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａに、ドット状に感応剤（ローズベンガル）２３を配置した。
次いで、スパッタリングにより、ドット状の金薄膜２２Ａの一方の面２２ａおよび感応剤２３の表面２３ａを覆うように、膜厚約１００ｎｍのシリカ薄膜からなる保護膜１４を形成した。
次いで、シランカップリング剤を介した化学結合により、保護膜１４の表面１４ａに、唾液中に存在するストレスマーカーとして知られるコルチゾールを抗原とし、そのコルチゾールの１次抗体１５を固定化し、測定用基板２０を得た。
【００７８】
（２）測定用チップの作製
図１４に示す測定用チップ６０を作製した。
測定用基板２０の１次抗体１５が設けられた面上に、少なくとも１次抗体１５を収容するとともに溶液を保持する空間６１ａを有するシート状の第一部材６１と、溶液を空間６１ａ内に流入する流入部６２ａおよび空間６１ａから溶液を排出する排出部６２ｂを有するシート状の第二部材６２とから構成される溶液保持部材６３を設け、測定用チップ６０を作製した。
溶液保持部材６３としては、第一部材６１と第二部材６２を積層した、フローセルを用いた。
第一部材６１としては、両面テープを型抜きして、測定用基板１０における少なくとも１次抗体１５が設けられた部分に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面長方形の空間６１ａが設けられたものを用いた。
第二部材６２としては、ポリジメチルシロキサンシートを型抜きして、第一部材６１の空間６１ａの一端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の流入部６２ａが設けられ、かつ、第一部材６１の空間６１ａの他端に対向する位置に、その厚さ方向に貫通する断面円形の排出部６２ｂが設けられたものを用いた。
【００７９】
（３）反応測定
実施例１と同様にして、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、１μｇ／ｍＬのコルチゾールを含むバッファ溶液（ポジティブ・サンプル溶液）を流入して、反応させた後、測定用チップ６０の第一部材６１の空間６１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、第一部材６１の空間６１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、第一部材６１の空間６１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、第一部材６１の空間６１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ６０を、図１５に示す測定装置７０に設置した。
そして、発光ダイオード７２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側からドット状の金薄膜２２Ａからなる集合体２２に入射した。
すると、測定用チップ６０から緑色の蛍光が発光する様子を目視にて確認することができた。
また、２次元ＣＣＤカメラ７３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００８０】
「比較例」
（１） 測定用基板の作製
実施例１と同様にして、図１に示す測定用基板１０を作製した。
（２）測定用チップの作製
実施例１と同様にして、図７に示す測定用チップ３０を作製した。
（３）反応測定
測定用チップ３０の溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、バッファ溶液のみ（ネガティブ・サンプル溶液）を流入して、測定用基板１０の１次抗体１５が設けられた面に、ネガティブ・サンプル溶液を接触させ、室温にて１０分間、反応させた。バッファ溶液としては、トリス緩衝液を用いた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ネガティブ・サンプル溶液を除去した。
次いで、実施例１と同様にして、溶液保持部材３１の空間３１ａ内に、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を流入して、反応させた。
反応が完了した後、溶液保持部材３１の空間３１ａ内から、ユーロピウム錯体とコルチゾールの２次抗体を含むバッファ溶液を除去し、さらに、溶液保持部材３１の空間３１ａ内をバッファ溶液で洗浄した。
次いで、溶液保持部材３１の空間３１ａ内にバッファ溶液を入れた状態で、測定用チップ３０を、図１２に示す測定装置５０に設置した。
そして、実施例１と同様にして、発光ダイオード５２から発光した光（波長６８０ｎｍ）を、透明基板１１側から金薄膜１２に入射した。
すると、測定用チップ３０から蛍光が発光する様子を目視にて確認することができなかった。
また、２次元ＣＣＤカメラ５３で蛍光画像を記録して、その画像データを処理することによって、蛍光発光開始から５００μｓ後、３００μｓの間の蛍光量を求めた。
【００８１】
以上の結果から、実施例１および２において求められた蛍光量と、比較例において求められた蛍光量とを比較したところ、実施例１および２の蛍光量は、比較例の蛍光量の３倍以上であることが分かった。これより、実施例１および２によれば、発光ダイオードを用いた測定装置にて、プラズモン増強蛍光イムノアセイが実現できることを確認できた。
【００８２】
なお、実施例１で用いたウェル型測定用チップ３０は、一般的な９６穴ウェルと同じサイズのウェルとして設計していることから、ジグに設置することによって、上記の測定装置５０に限らず、市販の生化学用蛍光測定装置に適用することもできる。
【符号の説明】
【００８３】
１０・・・測定用基板、１１・・・透明基板、１２・・・金薄膜、１３・・・感応剤、１４・・・保護膜、１５・・・１次抗体、２０・・・測定用基板、２２・・・集合体、２２Ａ・・・ドット状の金薄膜、２３・・・感応剤、３０・・・測定用チップ、３１・・・溶液保持部材、４１・・・抗原、４２・・・蛍光試薬、４３・・・２次抗体、５０・・・測定装置、５１・・・コニカルプリズム、５２・・・発光ダイオード、５３・・・２次元ＣＣＤカメラ、５４・・・フィルタ、６０・・・測定用チップ、６１・・・第一部材、６２・・・第二部材、６３・・・溶液保持部材、７０・・・測定装置、７２・・・発光ダイオード、７３・・・２次元ＣＣＤカメラ、７４・・・フィルタ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置された感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。
【請求項２】
光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置された感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。
【請求項３】
前記保護膜はシリカ薄膜であることを特徴とする請求項１または２に記載の測定用基板。
【請求項４】
請求項１または３に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記透明基板側に反射させて、前記蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。
【請求項５】
請求項２または３に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記保護膜側に透過させて、前記蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。
【請求項１】
光源と光検出素子による反射光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられた金薄膜と、該金薄膜上に配置された感応剤と、前記金薄膜および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。
【請求項２】
光源と光検出素子による透過光学系で構成される測定装置において、表面プラズモン共鳴による増強を利用した生化学的結合形成および生化学的結合量を検出する測定方法に用いられる測定用基板であって、
透明基板と、該透明基板の一方の面に設けられたドット状の金薄膜の集合体と、該集合体上に配置された感応剤と、前記集合体および前記感応剤を被覆する保護膜と、該保護膜の表面に固定化された１次抗体と、を備えたことを特徴とする測定用基板。
【請求項３】
前記保護膜はシリカ薄膜であることを特徴とする請求項１または２に記載の測定用基板。
【請求項４】
請求項１または３に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間を有する溶液保持部材を設けるステップＡ１と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ１と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ１と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記透明基板側に反射させて、前記蛍光を測定するステップＤ１と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。
【請求項５】
請求項２または３に記載の測定用基板を用いた生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法であって、
前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、少なくとも前記１次抗体を収容するとともに測定対象である溶液αを保持する空間、並びに、前記溶液αを前記空間内に流入する流入部および前記空間から前記溶液αを排出する排出部を有する溶液保持部材を設けるステップＡ２と、前記空間に前記溶液αを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液αを接触させるステップＢ２と、前記空間に蛍光試薬と結合した２次抗体を含む溶液βを流入して、前記測定用基板の１次抗体が設けられた面に、前記溶液βを接触させるステップＣ２と、前記透明基板側から前記金薄膜に光を入射して、該入射光によって前記蛍光試薬から励起された蛍光を、前記保護膜側に透過させて、前記蛍光を測定するステップＤ２と、を有することを特徴とする生化学的結合形成および生化学的結合量の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−２０９１０８（Ｐ２０１１−２０９１０８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７６９８４（Ｐ２０１０−７６９８４）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＥＴＨＥＲＮＥＴ
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＥＴＨＥＲＮＥＴ
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
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