濃度測定方法、および濃度測定システム
【課題】チップを用いて定量的な測定を可能とすることができる濃度測定方法等を提供する。
【解決手段】測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件においてプローブ分子とターゲット分子が結合反応を行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を求める。また、校正用チップについて求められた関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出する。
【解決手段】測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件においてプローブ分子とターゲット分子が結合反応を行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を求める。また、校正用チップについて求められた関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に固定されたプローブ分子を備えた測定用チップを用いてターゲット分子の溶液の濃度を測定する濃度測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
基材上にプローブ分子を固定したサイトを配列したＤＮＡチップを用いて、ターゲットＤＮＡを検出する方法が広く使用されている。ハイブリダイゼーションによりプローブ分子に結合するターゲットＤＮＡを蛍光物質によりラベル化することで、光学的な読取装置を用いてターゲットＤＮＡを検出することができる。
【０００３】
このようなＤＮＡチップでは、サイトごとに異なるプローブ分子を割り当てることで多種類のターゲットＤＮＡを１回の測定により同時に検出できる。各サイトの蛍光光量は各ターゲットＤＮＡがハイブリダイズして結合した量に応じて変化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２１２４７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＮＡチップを用いる場合、多数の遺伝子を同時に検出することが可能である。しかし、読取装置により計測される蛍光光量はターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが結合した量を相対的に示すものに過ぎず、ターゲットＤＮＡが含まれる溶液の絶対的な濃度を求めることはできない。したがって、ＤＮＡチップは複数の遺伝子の相対的な分布を求めるスクリーニングにしか使用されておらず、前記ターゲットＤＮＡ溶液の絶対的な濃度の計測、たとえば単位容積あたりの分子数［Ｍ／Ｌ］などには利用されていないのが現状である。
【０００６】
すなわち、ＤＮＡチップを用いた計測では、各サイトの明るさを画像により把握することで発現の様子を相対的に確認するのみであり、カメラの出力信号特性やプローブＤＮＡの飽和特性等に基づいて各サイトの濃度を定量的に数値化すること自体、一般的ではない。ましてや、その数値が絶対的な意義（例えば、ターゲット分子溶液の濃度）を持つように、チップの製造や計測方法がコントロールされることはない。
【０００７】
これに対し、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることにより、特定の遺伝子の発現やその変化等を定量的に測定することが可能である。しかし、増幅時のプライマ間の干渉等の問題があるため、複数の遺伝子を同時に測定することはできず、多数の遺伝子に対してリアルタイムＰＣＲを適用することは実質的に困難である。さらに、毎回の測定のたびに、酵素活性の相違を補正するための検量線の作成作業が必要で、作業負担が大きい。
【０００８】
本発明の目的は、チップを用いて定量的な測定を可能とすることができるターゲット分子の濃度測定方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の濃度測定方法は、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法において、前記測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を求めるステップと、前記測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するステップと、を備えることを特徴とする。
この濃度測定方法によれば、校正用チップによって求められた校正液のターゲット分子の濃度と校正用の計測光量との関係を用いて、測定用チップにより計測光量を求めるステップで求められた測定時の計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１０】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の濃度測定用チップは、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子にハイブリダイズしたターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、前記濃度測定用チップにおける校正情報として得られることを特徴とする。
この濃度測定用チップによれば、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、濃度測定用チップにおける校正情報として得られるので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１２】
前記濃度測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるとともに、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出してもよい。
【００１３】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の測定用チップの使用方法は、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する測定用チップの使用方法において、前記測定用チップを用い、特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、前記測定用チップと同一性能の校正用チップについて求められた校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するステップと、を備え、前記関係は、前記校正用チップを用いて前記特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより求められることを特徴とする。
この測定用チップの使用方法によれば、校正用チップによって求められた校正液の濃度と計測光量との関係を用いて、測定用チップによる計測光量を求めるステップで求められた測定時の計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１５】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の濃度測定方法によれば、校正用チップについて求められた校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の濃度測定用チップによれば、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、濃度測定用チップにおける校正情報として得られるので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１８】
本発明の測定用チップの使用方法によれば、校正用チップについて求められた校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１９】
前記測定用チップを用いて計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測してもよい。
【００２０】
前記プローブ分子とターゲット分子の結合は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸どうしのハイブリダイゼーションだけでなく、たんぱく質と抗体との抗原抗体反応を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＤＮＡチップを示す図であり、（ａ）はＤＮＡチップの構成を示す平面図、（ｂ）は製造された同一性能のＤＮＡチップ群を示す図。
【図２】ＤＮＡチップを使用する際の作業手順を示すフローチャート。
【図３】絶対値光量系を得るための校正方法の原理を説明するための図であり、（ａ）は校正時の状態を示す図、（ｂ）は測定時の状態を示す図、（ｃ）は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を例示する図。
【図４】チップを収容した化学反応用カートリッジの構成を示す平面図。
【図５】図４のＶ−Ｖ線における断面図。
【図６】標的分子検出用チップの構造を示す図であり、（a）は斜視図、（ｂ）は（a）のＢ−Ｂ線における断面図。
【図７】溶液移送時の操作を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明による濃度測定方法の一実施形態について説明する。
【００２３】
図１（ａ）はＤＮＡチップの構成を示す平面図、図１（ｂ）は製造された同一性能のＤＮＡチップ群を示す図である。
【００２４】
図１（ａ）に示すように、ＤＮＡチップ１０の表面には、ターゲットＤＮＡに相補的な配列を有するプローブＤＮＡが配置されたサイト１０ａ，１０ｂ，・・・が設けられている。サイト数はチップの用途に応じて任意の数を選択でき、例えば、２サイト〜３万サイト程度とすることができる。各サイトに異なるプローブを割り当てることで、複数種類のターゲットＤＮＡについて同時測定が可能となる。本実施形態では、同一性能を有するＤＮＡチップ１０，１０，・・・を複数個製作し（図１（ｂ））、この一部を校正用チップとして使用し、残りを測定用チップとして使用する。
【００２５】
このようなＤＮＡチップは、特願２００６−７８３５６（バイオチップ作成装置）に示すように、プローブＤＮＡ溶液をピンで基板上に接触させることでサイト（スポット）を形成することができる。このようなＤＮＡチップ作成装置を図８に示す。この方法では、ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡや蛋白チップ等も作成することが可能である。また一般には、ピン接触だけではなくインクジェットや光リソグラフ等を用いて各サイトを形成することも行われている。各サイトには、特定の遺伝子に対応したプローブＤＮＡ分子が所定量だけ固定化される。
【００２６】
次に、本案を考案するに至った重要な知見を示す。図９に、ターゲットＤＮＡ濃度とそれをハイブリダイゼーションした後のＤＮＡチップの光量の関係を示す。この実験にはオリゴＤＮＡを使用し、ハイブリダイゼーションは１ｈｒと２４ｈｒの２つの条件で行った。
横軸は、ターゲットＤＮＡの濃度［ｎＭ］であり、縦軸は後述する絶対光量値[ｎＷ／ｍ2]である。図でわかるように、ターゲットＤＮＡ濃度が０．００１［ｎＭ］までは光量は１[ｎＷ／ｍ2]以下であるが、この濃度を超えると直線的に濃度と光量が比例して上昇する。さらに濃度が上昇すると光量は飽和し、一定値となる。すなわち、溶液濃度の範囲を特定範囲に限定すれば、溶液濃度と光量値は比例関係が得られる。この特定範囲を校正し、その係数を求めることにより光量値から濃度を逆算することが可能となる。この係数を以降、プローブ係数と呼ぶこととする。なお、図でわかるように、この特定の比例領域において、ハイブリダイゼーションの時間を長くすることは、同一のターゲットＤＮＡ濃度でも、より明るい光量が得られることを示している。すなわち、同一のチップであっても、ハイブリダイゼーションの条件を変えた場合は、そのプローブ係数を変える必要がある。
【００２７】
また、このようなハイブリダイゼーションの再現性の結果を図１３に示す。従来のＤＮＡチップの例を図１３（ＤＮＡチップＡ）に示す。同じターゲットＤＮＡ濃度でも、ハイブリダイゼーション後の光量はばらつきが大きい。これを後述する絶対光量系を用いて品質管理を行い、工程改善を実施した。これによって、図１３（ＤＮＡチップＢ）のように、同一のターゲットＤＮＡ濃度に対して安定した光量が得られるようになった。
以上の２つの知見が本案の重要な基盤となっている。
【００２８】
次に、ＤＮＡチップ１０の具体的な使用方法について説明する。
【００２９】
図２は、ＤＮＡチップ１０を使用する際の作業手順を示すフローチャートである。ステップＳ０〜ステップＳ３は、チップを校正する手順を示している。
【００３０】
まず、実質的に同一の性能を有するＤＮＡチップ１０，１０，・・・（図２（ｂ））を作製する（ステップＳ０）。本明細書において、性能が同一であることは、後述する校正時の計測結果が測定時に有効に利用できる程度に性能が実質的に同一であることを意味する。
【００３１】
次に、ＤＮＡチップ１０，１０，・・・から選択された１枚の校正用チップに対し、個々のプローブＤＮＡごとに校正用のダミーのターゲットＤＮＡ溶液を用意する。このダミーのターゲット分子Ｔ１〜ＴＮのそれぞれを規定の濃度Ａ１〜ＡＮで用意し混合した校正液を用いて、ハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ１）。添え字１〜ｎはターゲットＤＮＡの種類に対応した番号である。ハイブリダイゼーションは温度、ラベル化法（先染め／後染め）などの各条件が規定された標準条件で行う。先染めとは、ハイブリダイゼーション前にターゲットＤＮＡにラベル化する方法であり、後染めとは、ハイブリダイゼーション後にラベル化する方法である。
【００３２】
次に、ＤＮＡチップ１０（校正用チップ）の光量計測を行い、各ターゲットＤＮＡに対応するサイトの光量Ｂ１〜ＢＮ[Ｗ／ｍ２]を測定する。また、励起光に起因するバックグラウンド値（Ｃ１〜ＣＮ）[Ｗ／ｍ２]を測定する（ステップＳ２）。
【００３３】
次に、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを算出する（ステップＳ３）。ｋｐｉ（ｉ＝１〜Ｎ）は、
ｋｐｉ＝（Ｂｉ−Ｃｉ）／Ａｉ [（Ｗ／ｍ２）／Ｍ]または[（Ｗ／ｍ２）／分子]など
（ただし、ｉ＝１〜Ｎ）
により定義される。プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮは、各ターゲットＤＮＡについての濃度と、対応するサイトの光量との比に相当する値として定義され、ターゲットＤＮＡの種類に応じて異なる値をとる。
以上の流れを図１０に示す。
【００３４】
図２のステップＳ１１〜ステップＳ１３は、測定用のＤＮＡチップ１０（測定用チップ）を用いて測定を行う手順を示している。
【００３５】
まず、測定用チップを用い、上記のハイブリダイゼーション条件（上記標準条件）において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ１１）。
【００３６】
次に、ＤＮＡチップ１０（測定用チップ）の光量計測を行い、各ターゲットＤＮＡに対応するサイトの光量ｙ１〜ｙＮ[Ｗ／ｍ２]を測定する（ステップＳ１２）。ここでは絶対値光量系での測定が必要となるが、絶対値光量系を測定する方法については後述する。
【００３７】
次に、サイトの光量ｙ１〜ｙＮから各ターゲットＤＮＡの濃度Ａ１〜ＡＮを算出する（ステップＳ１３）。ここでは、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いて測定対象溶液における各ターゲットＤＮＡの濃度Ａ１〜ＡＮを逆算する。濃度Ａｉ（ｉ＝１〜Ｎ）は、
Ａｉ＝（ｙｉ−Ｚｉ）／ｋｐｉ
（ただし、ｉ＝１〜Ｎ，）
により算出される。Ｚｉはバックグラウンド値である。
以上の流れを図１１に示す。
【００３８】
このように、本実施形態では、１枚のＤＮＡチップ１０を校正用チップとして用いて算出されたプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いて光量を濃度に変換することにより、多数のターゲットＤＮＡについて、その測定対象溶液中の濃度を１度の測定で定量的に求めることができる。測定ごとの検量線の作成作業も不要である。
【００３９】
次に、絶対値光量系を得るための方法について説明する。絶対値光量系は、光源や光学系などを安定させることで、画像の光量の読取値そのものが毎回同じ値になる精度の保証を行うとともに、その読取装置の校正法を国家トレーザブルにすることにより、読取値をＳＩ単位系に準拠した物理的な絶対値表記[Ｗ／ｍ２]など）を可能とした系である。
光量から濃度を逆算する場合は、必ず最初の校正を行った光学系と同等の特性を持つ光学系を使用する必要がある。通常のバイオ・化学系計測器は、光量の読取値に対する精度の保証がない。すなわち、複数台の装置の光量の読取値が異なるため、校正した光学系と同一の測定用の光学系が同一である保証はない。従って、常に校正した装置そのもので測定も同時期に行う必要がある。しかし、絶対光量系を使用することで、複数の測定器を用いても、互いに光量の精度保証が可能となり、また経年変化に対しても保証されるため、チップメーカが校正に用いた装置と、エンドユーザが測定に使用する装置が異なっても良い。また時間的に経過していても問題がない。
【００４０】
図３は絶対値光量系を得るための校正方法の原理を説明するための図である。図３（ａ）において、１００はパワーメータ、２００は光学顕微鏡、３００はLEDなどの照明用基準光源である。
【００４１】
パワーメータ１００は、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたものであり、国家標準と互換性のあるものである。このパワーメータ１００により顕微鏡２００経由の照明用基準光源３００の光量を測定し、パワーメータ１００を基準にして照明用基準光源３００の光量を校正する。
【００４２】
次に、図３（ｂ）に示すように、その校正された照明用基準光源３００の全光量を顕微鏡２００を介して光量検出器（例えばカメラ）４００の受光素子（図示せず）で検出する。ここでパワーメータ１００の出力値[Ｗ]と、光量検出器４００の出力値の全画素の合計値を比較することにより、カメラ４００の受光素子の受光光量とカメラの出力信号の関係を校正することができる。すなわち、[（Ｗ／ｍ２）／階調]の値を校正することができる。
【００４３】
図３（ｃ）にこのような校正方法による校正結果の一例を示す。図３（ｃ）は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を例示する図である。例えば、光源３００が緑色の光である場合は、Y=2.61E-06X＋2.57E-05、光源３００が赤色の光である場合は、Y=1.81E-06X−5.26E-05などの関係となる。なお、式中のXは階調、Yは光量である。
【００４４】
このようにして校正されたカメラを読取装置（例えば、本願出願人が提案した特開２００１−３１１６９０号に記載の読取装置など）の受光器に用いると、測定した画像の階調値から直接蛍光光量を測定することができる。
【００４５】
このような読取装置の例を図１２に示す。この装置は励起部、サンプル部、受光部、信号処理部から構成されている。励起部からのレーザ光がサンプルに照射されて発生した蛍光を受光部を経由してＣＣＤカメラが受光し、その信号を信号処理部で処理する。校正時には装置の制御と共に校正値の記憶を行う。測定器として使用する場合は、あらかじめ入力されたチップのプローブ係数と測定された光量からターゲットＤＮＡの濃度の算出を行う。
【００４６】
他方、蛍光色素から発生する光量は以下の演算処理により求めることができる。
蛍光色素によって吸収される光のパワーΔＩは、次式で与えられる。
ΔＩ＝2.3×103×α×Io×ｎ／（Na×Ｓ） ［Ｗ］ …（１）
ただし、
α ： モル吸光係数 ８×104［M-1 cm-1］
Io ： 入射光量［W］
ｎ ： 分子数［個］
Na ： アボガドロ数 6×1023
Ｓ ： 面積［cm2］
である。
【００４７】
これに量子効率などを考慮することで蛍光色素から発生する蛍光光量を推定することができる。
【００４８】
したがって、上記校正方法によって校正されたカメラを用いて計測した蛍光光量と上記推定した蛍光光量の値を対応させることにより、チップ上の蛍光分子の数nを直接推定することもできる。
【００４９】
このように、本発明の濃度測定方法では、校正時（図２のステップＳ２）および測定時（図２のステップＳ１２）の両者において絶対値光量系での計測を行うことにより、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮの算出、およびプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いた濃度の逆算が可能となる。
【００５０】
上記実施形態では、１枚のチップを用いてすべてのターゲットＤＮＡについてプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを算出しているが、個々のターゲットＤＮＡごとに校正用の溶液を用意し、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。この場合には、個々のターゲットＤＮＡについて１枚ずつ校正用チップを使用する必要がある。
【００５１】
ハイブリダイゼーションでは、複数のターゲットＤＮＡ間での相互の干渉（クロス・コンタミネーション）が存在する。したがって、校正時におけるダミーのターゲット分子Ｔ１〜ＴＮの濃度Ａ１〜ＡＮを測定時の状態に近い濃度とすることにより、相互干渉による影響が補償され、測定精度を向上させることができる。
【００５２】
本発明において、チップの校正は、例えば、チップの製造者の側で行い、チップを用いた遺伝子測定をチップの購入者の側で行うことができる。この場合、校正の結果（校正情報）、すなわち、校正液のターゲット分子の濃度と計測光量との関係（上記実施形態におけるプローブ係数）をチップの購入者に与えることで、チップの購入者の側で定量的な測定が可能となる。
【００５３】
また、ターゲット分子を指定した特注チップを製造する場合に、その特注チップを校正し、校正情報を特注チップに付加して販売することもできる。
【００５４】
本発明において、校正時におけるハイブリダイゼーション条件と、測定時におけるハイブリダイゼーション条件とを極力一致させることにより、高精度の濃度測定が可能となる。このため、ハイブリダイゼーション温度、ターゲット分子のラベル化法、塩濃度、ハイブリダイゼーション時間、その他の条件を一致させることができるように、校正時のハイブリダイゼーション条件を詳細に明示することが望ましい。
【００５５】
また、校正時および測定時に、同一の読取装置を使用することにより、読取装置の相違に起因する誤差を抑制することができる。とくに絶対値光量系を用いることにより、メーカーや機種、器差、経年変化によらない国際標準に準拠した汎用性のある光量値を用いることができるようになる。
【００５６】
本発明において、校正用チップおよび測定用チップとして、チップ内部に形成される貫通孔の内部にプローブ分子を固定した貫通型チップを使用することができる。貫通型チップとして、種々のタイプのものを使用できる。例えば、多孔質フィルタにプローブを固相化したものや、繊維型チップ（例えば、三菱レイヨン株式会社の商品「ジェノパール」（登録商標））等を使用できる。
【００５７】
さらに、測定用チップを本願発明者の提案による化学反応用カートリッジ（特開２００６−３３７２３８）に収容することもできる。この化学反応用カートリッジは、外力に基づくカートリッジの変形によって内容物を移動させることで所望の化学処理が行われるように、内部にウェルや流路を設けた構成を備えるものである。カートリッジ内に測定用チップを収容し、カートリッジ内でハイブリダイゼーションを行わせることができる。
【００５８】
以下、図４〜図７を参照して、測定用チップを化学反応用カートリッジに収容した例を示す。後述する標的分子検出用チップ１０Ａが、本発明における測定用チップおよび校正用チップに対応する。
【００５９】
図４はこのような化学反応用カートリッジの構成を示す平面図、図５は図４のＶ−Ｖ線における断面図である。
【００６０】
図４および図５に示すように、化学反応用カートリッジは、基板１と、基板１に重ね合わされる弾性部材２とを備える。
【００６１】
弾性部材２の裏面（図５において下面）には、その表面（図５において上面）側に凹んだ所定形状の凹部が形成されている。この凹部は、カートリッジ基板１と弾性部材２との間に空間を生み出すことで、図４および図５に示すように、溶液を収容する室２１，２２，２３、標的分子検出用チップ１０Ａへ溶液等を供給するための供給部２４、および、流路２５，２６，２７，２８を構成する。図４に示すように、流路２５、室２１、流路２６、室２２、流路２７および供給部２４は順次連通されている。
【００６２】
上記凹部以外の領域では、カートリッジ基板１と弾性部材２とは互いに接着されている。このため、凹部に収容された溶液がカートリッジ内で密閉され、外部への漏れが防止される。
【００６３】
図４および図５に示すように、基板１には、標的分子検出用チップ１０Ａが収容される収容部１１と、標的分子検出用チップ１０Ａの裏側（図５において下側）に設けられ、標的分子検出用チップ１０Ａから排出される溶液を収容する排出部１２と、が形成されている。また、弾性部材２の裏面には、標的分子検出用チップ１０Ａを支持する支持部材４が固定されている。収容部１１に収容された標的分子検出用チップ１０Ａは、カートリッジ基板１および支持部材４に接着されて、カートリッジ内部に固定される。このような構造により、標的分子検出用チップ１０Ａの周囲からの、標的分子検出用チップ１０Ａの厚み方向の溶液の漏れを防ぎつつ、標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジ内部で固定している。また、図５に示すように、カートリッジ基板１の排出部１２は流路２８に連通されている。
【００６４】
標的分子検出用チップ１０Ａはハイブリダイゼーションにより標的分子を検出する、貫通型チップである。
【００６５】
図６は標的分子検出用チップ１０Ａの構造を示す図であり、図６（a）は斜視図、図６（ｂ）は図６（a）のＢ−Ｂ線における断面図である。図６（a）および図６（ｂ）に示すように、標的分子検出用チップ１０Ａでは、個々の標的分子に対応するプローブが固定された検出部位３１が２次元的に配置され、各検出部位３１が隔壁３２により区画されている。各検出部位３１は標的分子検出用チップ１０Ａの厚み方向（図６（ｂ）において上下方向）に貫通する溶液中の標的分子をハイブリダイゼーションにより検出する。
【００６６】
次に、上記カートリッジにおける溶液移送の動作を説明する。図７は溶液移送時の操作を示す図である。
【００６７】
カートリッジに形成された室２１には、予め検査対象となる溶液が注入される。溶液の注入は、流路２５を介して注射針を差し込むことで行われる。流路２５には弾性体からなる栓（不図示）が密閉状態で取り付けられており、溶液注入時には注射針を栓に突刺する。溶液注入後、注射針を引き抜くと栓の針孔が塞がり、密閉状態が確保される。
【００６８】
次に、図７および図４に示すように、一定間隔で設けられたローラ５１およびローラ５２により弾性部材２を基板１に向けて押し付け、ローラ５１およびローラ５２を右方向に移動させる。このような操作により、室２１に注入された溶液が、流路２６、室２６、流路２７を介して供給部２４に送り込まれる。さらに図７に示すように、溶液は、供給部２４から標的分子検出用チップ１０Ａの各検出部位３１を下向きに貫通し、排出部１２および流路２８を介して室２３に到達する。
【００６９】
次に、ローラ５１およびローラ５２を弾性部材２に押し付けたまま、図７において左右方向に、所定回数往復移動させる。このような操作により、溶液を室２２および室２６の間で往復移送し、標的分子検出用チップ１０Ａの検出部位３１を複数回通過させる。これにより、ハイブリダイゼーションのために必要とされる検出部位３１に対する溶液の接触の充分な機会を与える。また、標的分子以外の分子による誤ったハイブリダイゼーションを低減する。なお、ハイブリダイゼーションの条件として適切であれば、ローラ５１およびローラ５２の往復移動を省略することもできる。
【００７０】
図７に示すように、ハイブリダイゼーションを行う間、ヒータＨＴを用いて溶液の温度をハイブリダイゼーションに適した値に保持してもよい。
【００７１】
このようなハイブリダイゼーションのための操作を行った後、所定の読取装置等を用いて標的分子検出用チップ１０Ａにおいてハイブリダイゼーションした標的分子の検出を行う。標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジから取り出すことなく、カートリッジ内部で標的分子の検出を行うようにしてもよいし、標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジから取り外した後に標的分子の検出を行うようにしてもよい。
【００７２】
この場合、同じ化学処理用カートリッジに校正用チップ（標的分子検出用チップ１０Ａ）を収容し、校正時にカートリッジ内でハイブリダイゼーションを行わせることで、ハイブリダイゼーション条件を一致させることができる。化学処理用カートリッジにチップ（校正用チップおよび測定用チップ）を収容する場合、ハイブリダイゼーション条件を精度よく一致させ易く、濃度の測定精度を向上させることができる。また、化学処理用カートリッジにチップを収容する場合においても、校正時および測定時において同じ読取装置を用いて標的分子の検出を行ってもよい。
【００７３】
以上説明したように、本発明の濃度測定方法によれば、校正用チップについて求められた校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００７４】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、基材上に固定されたプローブ分子を備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法等に対し、広く適用することができる。本発明は、ＤＮＡチップへの適用に限定されない。本発明におけるチップのプローブ分子およびターゲット分子は、核酸だけでなく、たんぱく質、抗体等も含まれる。
【符号の説明】
【００７５】
１０ ＤＮＡチップ（校正用チップ、測定用チップ）
１０Ａ 標的分子検出用チップ（校正用チップ、測定用チップ）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に固定されたプローブ分子を備えた測定用チップを用いてターゲット分子の溶液の濃度を測定する濃度測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
基材上にプローブ分子を固定したサイトを配列したＤＮＡチップを用いて、ターゲットＤＮＡを検出する方法が広く使用されている。ハイブリダイゼーションによりプローブ分子に結合するターゲットＤＮＡを蛍光物質によりラベル化することで、光学的な読取装置を用いてターゲットＤＮＡを検出することができる。
【０００３】
このようなＤＮＡチップでは、サイトごとに異なるプローブ分子を割り当てることで多種類のターゲットＤＮＡを１回の測定により同時に検出できる。各サイトの蛍光光量は各ターゲットＤＮＡがハイブリダイズして結合した量に応じて変化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２１２４７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＮＡチップを用いる場合、多数の遺伝子を同時に検出することが可能である。しかし、読取装置により計測される蛍光光量はターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが結合した量を相対的に示すものに過ぎず、ターゲットＤＮＡが含まれる溶液の絶対的な濃度を求めることはできない。したがって、ＤＮＡチップは複数の遺伝子の相対的な分布を求めるスクリーニングにしか使用されておらず、前記ターゲットＤＮＡ溶液の絶対的な濃度の計測、たとえば単位容積あたりの分子数［Ｍ／Ｌ］などには利用されていないのが現状である。
【０００６】
すなわち、ＤＮＡチップを用いた計測では、各サイトの明るさを画像により把握することで発現の様子を相対的に確認するのみであり、カメラの出力信号特性やプローブＤＮＡの飽和特性等に基づいて各サイトの濃度を定量的に数値化すること自体、一般的ではない。ましてや、その数値が絶対的な意義（例えば、ターゲット分子溶液の濃度）を持つように、チップの製造や計測方法がコントロールされることはない。
【０００７】
これに対し、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることにより、特定の遺伝子の発現やその変化等を定量的に測定することが可能である。しかし、増幅時のプライマ間の干渉等の問題があるため、複数の遺伝子を同時に測定することはできず、多数の遺伝子に対してリアルタイムＰＣＲを適用することは実質的に困難である。さらに、毎回の測定のたびに、酵素活性の相違を補正するための検量線の作成作業が必要で、作業負担が大きい。
【０００８】
本発明の目的は、チップを用いて定量的な測定を可能とすることができるターゲット分子の濃度測定方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の濃度測定方法は、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法において、前記測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を求めるステップと、前記測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するステップと、を備えることを特徴とする。
この濃度測定方法によれば、校正用チップによって求められた校正液のターゲット分子の濃度と校正用の計測光量との関係を用いて、測定用チップにより計測光量を求めるステップで求められた測定時の計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１０】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の濃度測定用チップは、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子にハイブリダイズしたターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、前記濃度測定用チップにおける校正情報として得られることを特徴とする。
この濃度測定用チップによれば、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、濃度測定用チップにおける校正情報として得られるので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１２】
前記濃度測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるとともに、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出してもよい。
【００１３】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の測定用チップの使用方法は、基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する測定用チップの使用方法において、前記測定用チップを用い、特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、前記測定用チップと同一性能の校正用チップについて求められた校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するステップと、を備え、前記関係は、前記校正用チップを用いて前記特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより求められることを特徴とする。
この測定用チップの使用方法によれば、校正用チップによって求められた校正液の濃度と計測光量との関係を用いて、測定用チップによる計測光量を求めるステップで求められた測定時の計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１５】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の濃度測定方法によれば、校正用チップについて求められた校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の濃度測定用チップによれば、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、濃度測定用チップにおける校正情報として得られるので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１８】
本発明の測定用チップの使用方法によれば、校正用チップについて求められた校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００１９】
前記測定用チップを用いて計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測してもよい。
【００２０】
前記プローブ分子とターゲット分子の結合は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸どうしのハイブリダイゼーションだけでなく、たんぱく質と抗体との抗原抗体反応を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＤＮＡチップを示す図であり、（ａ）はＤＮＡチップの構成を示す平面図、（ｂ）は製造された同一性能のＤＮＡチップ群を示す図。
【図２】ＤＮＡチップを使用する際の作業手順を示すフローチャート。
【図３】絶対値光量系を得るための校正方法の原理を説明するための図であり、（ａ）は校正時の状態を示す図、（ｂ）は測定時の状態を示す図、（ｃ）は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を例示する図。
【図４】チップを収容した化学反応用カートリッジの構成を示す平面図。
【図５】図４のＶ−Ｖ線における断面図。
【図６】標的分子検出用チップの構造を示す図であり、（a）は斜視図、（ｂ）は（a）のＢ−Ｂ線における断面図。
【図７】溶液移送時の操作を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明による濃度測定方法の一実施形態について説明する。
【００２３】
図１（ａ）はＤＮＡチップの構成を示す平面図、図１（ｂ）は製造された同一性能のＤＮＡチップ群を示す図である。
【００２４】
図１（ａ）に示すように、ＤＮＡチップ１０の表面には、ターゲットＤＮＡに相補的な配列を有するプローブＤＮＡが配置されたサイト１０ａ，１０ｂ，・・・が設けられている。サイト数はチップの用途に応じて任意の数を選択でき、例えば、２サイト〜３万サイト程度とすることができる。各サイトに異なるプローブを割り当てることで、複数種類のターゲットＤＮＡについて同時測定が可能となる。本実施形態では、同一性能を有するＤＮＡチップ１０，１０，・・・を複数個製作し（図１（ｂ））、この一部を校正用チップとして使用し、残りを測定用チップとして使用する。
【００２５】
このようなＤＮＡチップは、特願２００６−７８３５６（バイオチップ作成装置）に示すように、プローブＤＮＡ溶液をピンで基板上に接触させることでサイト（スポット）を形成することができる。このようなＤＮＡチップ作成装置を図８に示す。この方法では、ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡや蛋白チップ等も作成することが可能である。また一般には、ピン接触だけではなくインクジェットや光リソグラフ等を用いて各サイトを形成することも行われている。各サイトには、特定の遺伝子に対応したプローブＤＮＡ分子が所定量だけ固定化される。
【００２６】
次に、本案を考案するに至った重要な知見を示す。図９に、ターゲットＤＮＡ濃度とそれをハイブリダイゼーションした後のＤＮＡチップの光量の関係を示す。この実験にはオリゴＤＮＡを使用し、ハイブリダイゼーションは１ｈｒと２４ｈｒの２つの条件で行った。
横軸は、ターゲットＤＮＡの濃度［ｎＭ］であり、縦軸は後述する絶対光量値[ｎＷ／ｍ2]である。図でわかるように、ターゲットＤＮＡ濃度が０．００１［ｎＭ］までは光量は１[ｎＷ／ｍ2]以下であるが、この濃度を超えると直線的に濃度と光量が比例して上昇する。さらに濃度が上昇すると光量は飽和し、一定値となる。すなわち、溶液濃度の範囲を特定範囲に限定すれば、溶液濃度と光量値は比例関係が得られる。この特定範囲を校正し、その係数を求めることにより光量値から濃度を逆算することが可能となる。この係数を以降、プローブ係数と呼ぶこととする。なお、図でわかるように、この特定の比例領域において、ハイブリダイゼーションの時間を長くすることは、同一のターゲットＤＮＡ濃度でも、より明るい光量が得られることを示している。すなわち、同一のチップであっても、ハイブリダイゼーションの条件を変えた場合は、そのプローブ係数を変える必要がある。
【００２７】
また、このようなハイブリダイゼーションの再現性の結果を図１３に示す。従来のＤＮＡチップの例を図１３（ＤＮＡチップＡ）に示す。同じターゲットＤＮＡ濃度でも、ハイブリダイゼーション後の光量はばらつきが大きい。これを後述する絶対光量系を用いて品質管理を行い、工程改善を実施した。これによって、図１３（ＤＮＡチップＢ）のように、同一のターゲットＤＮＡ濃度に対して安定した光量が得られるようになった。
以上の２つの知見が本案の重要な基盤となっている。
【００２８】
次に、ＤＮＡチップ１０の具体的な使用方法について説明する。
【００２９】
図２は、ＤＮＡチップ１０を使用する際の作業手順を示すフローチャートである。ステップＳ０〜ステップＳ３は、チップを校正する手順を示している。
【００３０】
まず、実質的に同一の性能を有するＤＮＡチップ１０，１０，・・・（図２（ｂ））を作製する（ステップＳ０）。本明細書において、性能が同一であることは、後述する校正時の計測結果が測定時に有効に利用できる程度に性能が実質的に同一であることを意味する。
【００３１】
次に、ＤＮＡチップ１０，１０，・・・から選択された１枚の校正用チップに対し、個々のプローブＤＮＡごとに校正用のダミーのターゲットＤＮＡ溶液を用意する。このダミーのターゲット分子Ｔ１〜ＴＮのそれぞれを規定の濃度Ａ１〜ＡＮで用意し混合した校正液を用いて、ハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ１）。添え字１〜ｎはターゲットＤＮＡの種類に対応した番号である。ハイブリダイゼーションは温度、ラベル化法（先染め／後染め）などの各条件が規定された標準条件で行う。先染めとは、ハイブリダイゼーション前にターゲットＤＮＡにラベル化する方法であり、後染めとは、ハイブリダイゼーション後にラベル化する方法である。
【００３２】
次に、ＤＮＡチップ１０（校正用チップ）の光量計測を行い、各ターゲットＤＮＡに対応するサイトの光量Ｂ１〜ＢＮ[Ｗ／ｍ２]を測定する。また、励起光に起因するバックグラウンド値（Ｃ１〜ＣＮ）[Ｗ／ｍ２]を測定する（ステップＳ２）。
【００３３】
次に、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを算出する（ステップＳ３）。ｋｐｉ（ｉ＝１〜Ｎ）は、
ｋｐｉ＝（Ｂｉ−Ｃｉ）／Ａｉ [（Ｗ／ｍ２）／Ｍ]または[（Ｗ／ｍ２）／分子]など
（ただし、ｉ＝１〜Ｎ）
により定義される。プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮは、各ターゲットＤＮＡについての濃度と、対応するサイトの光量との比に相当する値として定義され、ターゲットＤＮＡの種類に応じて異なる値をとる。
以上の流れを図１０に示す。
【００３４】
図２のステップＳ１１〜ステップＳ１３は、測定用のＤＮＡチップ１０（測定用チップ）を用いて測定を行う手順を示している。
【００３５】
まず、測定用チップを用い、上記のハイブリダイゼーション条件（上記標準条件）において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ１１）。
【００３６】
次に、ＤＮＡチップ１０（測定用チップ）の光量計測を行い、各ターゲットＤＮＡに対応するサイトの光量ｙ１〜ｙＮ[Ｗ／ｍ２]を測定する（ステップＳ１２）。ここでは絶対値光量系での測定が必要となるが、絶対値光量系を測定する方法については後述する。
【００３７】
次に、サイトの光量ｙ１〜ｙＮから各ターゲットＤＮＡの濃度Ａ１〜ＡＮを算出する（ステップＳ１３）。ここでは、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いて測定対象溶液における各ターゲットＤＮＡの濃度Ａ１〜ＡＮを逆算する。濃度Ａｉ（ｉ＝１〜Ｎ）は、
Ａｉ＝（ｙｉ−Ｚｉ）／ｋｐｉ
（ただし、ｉ＝１〜Ｎ，）
により算出される。Ｚｉはバックグラウンド値である。
以上の流れを図１１に示す。
【００３８】
このように、本実施形態では、１枚のＤＮＡチップ１０を校正用チップとして用いて算出されたプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いて光量を濃度に変換することにより、多数のターゲットＤＮＡについて、その測定対象溶液中の濃度を１度の測定で定量的に求めることができる。測定ごとの検量線の作成作業も不要である。
【００３９】
次に、絶対値光量系を得るための方法について説明する。絶対値光量系は、光源や光学系などを安定させることで、画像の光量の読取値そのものが毎回同じ値になる精度の保証を行うとともに、その読取装置の校正法を国家トレーザブルにすることにより、読取値をＳＩ単位系に準拠した物理的な絶対値表記[Ｗ／ｍ２]など）を可能とした系である。
光量から濃度を逆算する場合は、必ず最初の校正を行った光学系と同等の特性を持つ光学系を使用する必要がある。通常のバイオ・化学系計測器は、光量の読取値に対する精度の保証がない。すなわち、複数台の装置の光量の読取値が異なるため、校正した光学系と同一の測定用の光学系が同一である保証はない。従って、常に校正した装置そのもので測定も同時期に行う必要がある。しかし、絶対光量系を使用することで、複数の測定器を用いても、互いに光量の精度保証が可能となり、また経年変化に対しても保証されるため、チップメーカが校正に用いた装置と、エンドユーザが測定に使用する装置が異なっても良い。また時間的に経過していても問題がない。
【００４０】
図３は絶対値光量系を得るための校正方法の原理を説明するための図である。図３（ａ）において、１００はパワーメータ、２００は光学顕微鏡、３００はLEDなどの照明用基準光源である。
【００４１】
パワーメータ１００は、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたものであり、国家標準と互換性のあるものである。このパワーメータ１００により顕微鏡２００経由の照明用基準光源３００の光量を測定し、パワーメータ１００を基準にして照明用基準光源３００の光量を校正する。
【００４２】
次に、図３（ｂ）に示すように、その校正された照明用基準光源３００の全光量を顕微鏡２００を介して光量検出器（例えばカメラ）４００の受光素子（図示せず）で検出する。ここでパワーメータ１００の出力値[Ｗ]と、光量検出器４００の出力値の全画素の合計値を比較することにより、カメラ４００の受光素子の受光光量とカメラの出力信号の関係を校正することができる。すなわち、[（Ｗ／ｍ２）／階調]の値を校正することができる。
【００４３】
図３（ｃ）にこのような校正方法による校正結果の一例を示す。図３（ｃ）は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を例示する図である。例えば、光源３００が緑色の光である場合は、Y=2.61E-06X＋2.57E-05、光源３００が赤色の光である場合は、Y=1.81E-06X−5.26E-05などの関係となる。なお、式中のXは階調、Yは光量である。
【００４４】
このようにして校正されたカメラを読取装置（例えば、本願出願人が提案した特開２００１−３１１６９０号に記載の読取装置など）の受光器に用いると、測定した画像の階調値から直接蛍光光量を測定することができる。
【００４５】
このような読取装置の例を図１２に示す。この装置は励起部、サンプル部、受光部、信号処理部から構成されている。励起部からのレーザ光がサンプルに照射されて発生した蛍光を受光部を経由してＣＣＤカメラが受光し、その信号を信号処理部で処理する。校正時には装置の制御と共に校正値の記憶を行う。測定器として使用する場合は、あらかじめ入力されたチップのプローブ係数と測定された光量からターゲットＤＮＡの濃度の算出を行う。
【００４６】
他方、蛍光色素から発生する光量は以下の演算処理により求めることができる。
蛍光色素によって吸収される光のパワーΔＩは、次式で与えられる。
ΔＩ＝2.3×103×α×Io×ｎ／（Na×Ｓ） ［Ｗ］ …（１）
ただし、
α ： モル吸光係数 ８×104［M-1 cm-1］
Io ： 入射光量［W］
ｎ ： 分子数［個］
Na ： アボガドロ数 6×1023
Ｓ ： 面積［cm2］
である。
【００４７】
これに量子効率などを考慮することで蛍光色素から発生する蛍光光量を推定することができる。
【００４８】
したがって、上記校正方法によって校正されたカメラを用いて計測した蛍光光量と上記推定した蛍光光量の値を対応させることにより、チップ上の蛍光分子の数nを直接推定することもできる。
【００４９】
このように、本発明の濃度測定方法では、校正時（図２のステップＳ２）および測定時（図２のステップＳ１２）の両者において絶対値光量系での計測を行うことにより、プローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮの算出、およびプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを用いた濃度の逆算が可能となる。
【００５０】
上記実施形態では、１枚のチップを用いてすべてのターゲットＤＮＡについてプローブ係数ｋｐ１〜ｋｐＮを算出しているが、個々のターゲットＤＮＡごとに校正用の溶液を用意し、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。この場合には、個々のターゲットＤＮＡについて１枚ずつ校正用チップを使用する必要がある。
【００５１】
ハイブリダイゼーションでは、複数のターゲットＤＮＡ間での相互の干渉（クロス・コンタミネーション）が存在する。したがって、校正時におけるダミーのターゲット分子Ｔ１〜ＴＮの濃度Ａ１〜ＡＮを測定時の状態に近い濃度とすることにより、相互干渉による影響が補償され、測定精度を向上させることができる。
【００５２】
本発明において、チップの校正は、例えば、チップの製造者の側で行い、チップを用いた遺伝子測定をチップの購入者の側で行うことができる。この場合、校正の結果（校正情報）、すなわち、校正液のターゲット分子の濃度と計測光量との関係（上記実施形態におけるプローブ係数）をチップの購入者に与えることで、チップの購入者の側で定量的な測定が可能となる。
【００５３】
また、ターゲット分子を指定した特注チップを製造する場合に、その特注チップを校正し、校正情報を特注チップに付加して販売することもできる。
【００５４】
本発明において、校正時におけるハイブリダイゼーション条件と、測定時におけるハイブリダイゼーション条件とを極力一致させることにより、高精度の濃度測定が可能となる。このため、ハイブリダイゼーション温度、ターゲット分子のラベル化法、塩濃度、ハイブリダイゼーション時間、その他の条件を一致させることができるように、校正時のハイブリダイゼーション条件を詳細に明示することが望ましい。
【００５５】
また、校正時および測定時に、同一の読取装置を使用することにより、読取装置の相違に起因する誤差を抑制することができる。とくに絶対値光量系を用いることにより、メーカーや機種、器差、経年変化によらない国際標準に準拠した汎用性のある光量値を用いることができるようになる。
【００５６】
本発明において、校正用チップおよび測定用チップとして、チップ内部に形成される貫通孔の内部にプローブ分子を固定した貫通型チップを使用することができる。貫通型チップとして、種々のタイプのものを使用できる。例えば、多孔質フィルタにプローブを固相化したものや、繊維型チップ（例えば、三菱レイヨン株式会社の商品「ジェノパール」（登録商標））等を使用できる。
【００５７】
さらに、測定用チップを本願発明者の提案による化学反応用カートリッジ（特開２００６−３３７２３８）に収容することもできる。この化学反応用カートリッジは、外力に基づくカートリッジの変形によって内容物を移動させることで所望の化学処理が行われるように、内部にウェルや流路を設けた構成を備えるものである。カートリッジ内に測定用チップを収容し、カートリッジ内でハイブリダイゼーションを行わせることができる。
【００５８】
以下、図４〜図７を参照して、測定用チップを化学反応用カートリッジに収容した例を示す。後述する標的分子検出用チップ１０Ａが、本発明における測定用チップおよび校正用チップに対応する。
【００５９】
図４はこのような化学反応用カートリッジの構成を示す平面図、図５は図４のＶ−Ｖ線における断面図である。
【００６０】
図４および図５に示すように、化学反応用カートリッジは、基板１と、基板１に重ね合わされる弾性部材２とを備える。
【００６１】
弾性部材２の裏面（図５において下面）には、その表面（図５において上面）側に凹んだ所定形状の凹部が形成されている。この凹部は、カートリッジ基板１と弾性部材２との間に空間を生み出すことで、図４および図５に示すように、溶液を収容する室２１，２２，２３、標的分子検出用チップ１０Ａへ溶液等を供給するための供給部２４、および、流路２５，２６，２７，２８を構成する。図４に示すように、流路２５、室２１、流路２６、室２２、流路２７および供給部２４は順次連通されている。
【００６２】
上記凹部以外の領域では、カートリッジ基板１と弾性部材２とは互いに接着されている。このため、凹部に収容された溶液がカートリッジ内で密閉され、外部への漏れが防止される。
【００６３】
図４および図５に示すように、基板１には、標的分子検出用チップ１０Ａが収容される収容部１１と、標的分子検出用チップ１０Ａの裏側（図５において下側）に設けられ、標的分子検出用チップ１０Ａから排出される溶液を収容する排出部１２と、が形成されている。また、弾性部材２の裏面には、標的分子検出用チップ１０Ａを支持する支持部材４が固定されている。収容部１１に収容された標的分子検出用チップ１０Ａは、カートリッジ基板１および支持部材４に接着されて、カートリッジ内部に固定される。このような構造により、標的分子検出用チップ１０Ａの周囲からの、標的分子検出用チップ１０Ａの厚み方向の溶液の漏れを防ぎつつ、標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジ内部で固定している。また、図５に示すように、カートリッジ基板１の排出部１２は流路２８に連通されている。
【００６４】
標的分子検出用チップ１０Ａはハイブリダイゼーションにより標的分子を検出する、貫通型チップである。
【００６５】
図６は標的分子検出用チップ１０Ａの構造を示す図であり、図６（a）は斜視図、図６（ｂ）は図６（a）のＢ−Ｂ線における断面図である。図６（a）および図６（ｂ）に示すように、標的分子検出用チップ１０Ａでは、個々の標的分子に対応するプローブが固定された検出部位３１が２次元的に配置され、各検出部位３１が隔壁３２により区画されている。各検出部位３１は標的分子検出用チップ１０Ａの厚み方向（図６（ｂ）において上下方向）に貫通する溶液中の標的分子をハイブリダイゼーションにより検出する。
【００６６】
次に、上記カートリッジにおける溶液移送の動作を説明する。図７は溶液移送時の操作を示す図である。
【００６７】
カートリッジに形成された室２１には、予め検査対象となる溶液が注入される。溶液の注入は、流路２５を介して注射針を差し込むことで行われる。流路２５には弾性体からなる栓（不図示）が密閉状態で取り付けられており、溶液注入時には注射針を栓に突刺する。溶液注入後、注射針を引き抜くと栓の針孔が塞がり、密閉状態が確保される。
【００６８】
次に、図７および図４に示すように、一定間隔で設けられたローラ５１およびローラ５２により弾性部材２を基板１に向けて押し付け、ローラ５１およびローラ５２を右方向に移動させる。このような操作により、室２１に注入された溶液が、流路２６、室２６、流路２７を介して供給部２４に送り込まれる。さらに図７に示すように、溶液は、供給部２４から標的分子検出用チップ１０Ａの各検出部位３１を下向きに貫通し、排出部１２および流路２８を介して室２３に到達する。
【００６９】
次に、ローラ５１およびローラ５２を弾性部材２に押し付けたまま、図７において左右方向に、所定回数往復移動させる。このような操作により、溶液を室２２および室２６の間で往復移送し、標的分子検出用チップ１０Ａの検出部位３１を複数回通過させる。これにより、ハイブリダイゼーションのために必要とされる検出部位３１に対する溶液の接触の充分な機会を与える。また、標的分子以外の分子による誤ったハイブリダイゼーションを低減する。なお、ハイブリダイゼーションの条件として適切であれば、ローラ５１およびローラ５２の往復移動を省略することもできる。
【００７０】
図７に示すように、ハイブリダイゼーションを行う間、ヒータＨＴを用いて溶液の温度をハイブリダイゼーションに適した値に保持してもよい。
【００７１】
このようなハイブリダイゼーションのための操作を行った後、所定の読取装置等を用いて標的分子検出用チップ１０Ａにおいてハイブリダイゼーションした標的分子の検出を行う。標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジから取り出すことなく、カートリッジ内部で標的分子の検出を行うようにしてもよいし、標的分子検出用チップ１０Ａをカートリッジから取り外した後に標的分子の検出を行うようにしてもよい。
【００７２】
この場合、同じ化学処理用カートリッジに校正用チップ（標的分子検出用チップ１０Ａ）を収容し、校正時にカートリッジ内でハイブリダイゼーションを行わせることで、ハイブリダイゼーション条件を一致させることができる。化学処理用カートリッジにチップ（校正用チップおよび測定用チップ）を収容する場合、ハイブリダイゼーション条件を精度よく一致させ易く、濃度の測定精度を向上させることができる。また、化学処理用カートリッジにチップを収容する場合においても、校正時および測定時において同じ読取装置を用いて標的分子の検出を行ってもよい。
【００７３】
以上説明したように、本発明の濃度測定方法によれば、校正用チップについて求められた校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係を用いて、計測光量を求めるステップで求められた計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
【００７４】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、基材上に固定されたプローブ分子を備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法等に対し、広く適用することができる。本発明は、ＤＮＡチップへの適用に限定されない。本発明におけるチップのプローブ分子およびターゲット分子は、核酸だけでなく、たんぱく質、抗体等も含まれる。
【符号の説明】
【００７５】
１０ ＤＮＡチップ（校正用チップ、測定用チップ）
１０Ａ 標的分子検出用チップ（校正用チップ、測定用チップ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法において、
前記測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との関係を求めるステップと、
前記測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、
前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の前記校正液と同一範囲の濃度を算出するステップと、
を備えることを特徴とする濃度測定方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の濃度測定方法。
【請求項３】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子にハイブリダイズしたターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、
前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との関係が、前記濃度測定用チップにおける前記校正液と同一範囲の濃度と光量の校正情報として得られることを特徴とする濃度測定用チップ。
【請求項４】
前記濃度測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるとともに、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出することを特徴とする請求項３に記載の濃度測定用チップ。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項３または４に記載の濃度測定用チップ。
【請求項６】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度をターゲット分子に結合した蛍光ラベルにより測定する測定用チップの使用方法において、
前記測定用チップを用い、特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件において測定対象溶液に対してプローブ分子とターゲット分子が結合反応する時の計測光量を求めるステップと、
前記測定用チップと同一性能の校正用チップについて求められた特定の範囲の校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液における前記校正液と同一範囲の濃度のターゲット分子の濃度を算出するステップと、
を備え、
前記関係は、前記校正用チップを用いて前記特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件においてプローブ分子とターゲット分子が結合反応を行うことにより求められることを特徴とする測定用チップの使用方法。
【請求項７】
前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件は、前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項８】
前記測定用チップを用いて計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とする請求項６または７に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項９】
前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応は、核酸どうしのハイブリダイゼーション、またはたんぱく質と抗体との抗原抗体反応であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項１０】
前記請求項１または２に記載の測定方法において、計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とするプローブ係数校正システムおよびプローブ濃度測定システム。
【請求項１】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法において、
前記測定用チップと同一性能の校正用チップを用いて特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との関係を求めるステップと、
前記測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、
前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の前記校正液と同一範囲の濃度を算出するステップと、
を備えることを特徴とする濃度測定方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の濃度測定方法。
【請求項３】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子にハイブリダイズしたターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、
前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との関係が、前記濃度測定用チップにおける前記校正液と同一範囲の濃度と光量の校正情報として得られることを特徴とする濃度測定用チップ。
【請求項４】
前記濃度測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるとともに、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出することを特徴とする請求項３に記載の濃度測定用チップ。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項３または４に記載の濃度測定用チップ。
【請求項６】
基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度をターゲット分子に結合した蛍光ラベルにより測定する測定用チップの使用方法において、
前記測定用チップを用い、特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件において測定対象溶液に対してプローブ分子とターゲット分子が結合反応する時の計測光量を求めるステップと、
前記測定用チップと同一性能の校正用チップについて求められた特定の範囲の校正液の濃度と、計測光量との関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液における前記校正液と同一範囲の濃度のターゲット分子の濃度を算出するステップと、
を備え、
前記関係は、前記校正用チップを用いて前記特定のプローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件においてプローブ分子とターゲット分子が結合反応を行うことにより求められることを特徴とする測定用チップの使用方法。
【請求項７】
前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件は、前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項８】
前記測定用チップを用いて計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とする請求項６または７に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項９】
前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応は、核酸どうしのハイブリダイゼーション、またはたんぱく質と抗体との抗原抗体反応であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の測定用チップの使用方法。
【請求項１０】
前記請求項１または２に記載の測定方法において、計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とするプローブ係数校正システムおよびプローブ濃度測定システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１３−２４８１８（Ｐ２０１３−２４８１８Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６２５１８（Ｐ２０１１−１６２５１８）
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
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