特異性の高いプローブと、それを用いた核酸アレイ、及びその製造方法
【課題】ハイブリダイゼーションの特異性を向上させる、効率的なブロッキング核酸を提供する。
【解決手段】塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
【解決手段】塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象となるターゲット核酸をより正確に検出するための核酸検出用プローブに関する。また、複数のターゲット核酸を同時により正確に検出するための核酸アレイ、及び核酸アレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出・同定する方法として、現在までにさまざまな手法が開発されている。そのための基本技術として、ハイブリダイゼーション法が広く用いられている。
【０００３】
ハイブリダイゼーションとは、核酸分子が相補的に複合体（２本鎖）を形成することである。これは、相補的な塩基間での水素結合の連続によるものである。
一般的に、２本鎖を構成する核酸の塩基長が長いほどハイブリダイゼーションの親和性が高く、短いほどハイブリダイゼーションの親和性が低くなる。また、ハイブリダイゼーションの親和性は、核酸を構成する塩基にも依存する。２本鎖を構成する核酸にＧ、Ｃが多い場合はハイブリダイゼーションの親和性が高くなり、Ａ、Ｔが多い場合はハイブリダイゼーションの親和性が低くなる。これは、塩基が形成する水素結合の数の違い（前者が３個、後者が２個）によるものである。
【０００４】
ハイブリダイゼーションを利用して特定の核酸を検出する方法としては、サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションがある。これは、検出対象となる核酸（ターゲット核酸）を担体上に固定化し、その相補鎖である核酸（プローブ核酸）をこれに接触させ、形成されたハイブリダイゼーションを検出することにより、ターゲット核酸を検出する方法である。これらの手法では、一度に検出できる核酸の種類は少数である。
【０００５】
一方、多種類の核酸を同時に検出する方法としては、核酸アレイ（ＤＮＡチップ）がある。近年では、多種類のプローブ核酸を高密度に配列した核酸アレイの開発が盛んに行われている。核酸アレイの基本的な検出原理は、上述の手法と同一である。核酸アレイを用いることで、遺伝子全体の動きを包括的に評価することが可能となってきている。
【０００６】
しかしながら、ハイブリダイゼーションにおいては、完全に相補的な配列のみが２本鎖を形成するとは限らず、類似した塩基配列であれば２本鎖を形成することがある。このため、ハイブリダイゼーション法による核酸の検出には、検出目的ではない核酸をも検出してしまう、いわゆる「クロスハイブリダイゼーション」（本明細書において「クロスハイブリ」ともいう）の問題が生じる場合があった。
クロスハイブリダイゼーションを極力除去し、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させるための方法は、これまでにも数多く考案されてきた。
【０００７】
例えば、ハイブリダイゼーションの条件を最適化することが挙げられる。条件としては、第一にハイブリダイゼーションの温度がある。核酸のハイブリダイゼーションは、水素結合によるものである。温度を上昇させると、ハイブリダイゼーションが起こりにくくなる。よって温度を上昇させることで、目的のハイブリダイゼーションは極力維持したまま、クロスハイブリダイゼーションのみを解離させることが可能である。
【０００８】
また、条件としては、第二にハイブリダイゼーション溶液の塩濃度がある。核酸は負の電荷を持つため、核酸同士は電気的に反発する。溶液の塩濃度を高くすると、核酸の負の電荷が相殺されることで、核酸同士の反発が弱まり、ハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。よって、溶液の塩濃度を調整することで、目的のハイブリダイゼーションは維持しつつ、クロスハイブリダイゼーションを極力防ぐような条件を設定することが可能である。
【０００９】
ハイブリダイゼーション溶液に何らかの添加剤を加えることで特異性を向上させることも可能である。界面活性剤やベタイン、デンハルト溶液、ホルムアミドなどを添加することで、分子内での立体構造をとりにくくすることができる。これにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となる。
【００１０】
また、プローブ核酸として比較的長い鎖長のｃＤＮＡを用いる場合は、ハイブリダイゼーション溶液にＣｏｔ−１やサケ精子ＤＮＡを添加することで、繰り返し配列に由来するようなクロスハイブリダイゼーションを防止することができる。これにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能である。
【００１１】
さらに、近年の膨大なゲノム情報の蓄積や、情報処理技術の発達により、クロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにプローブ核酸を設計するためのプログラムなどが開発されている。これらを使用することでハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となっている。
【００１２】
このような中で、「ブロッキング核酸」を用いて、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させる方法も開発されている。
ブロッキング核酸とは、プローブ核酸の部分的な相補鎖により構成される核酸である。ブロッキング核酸には、クロスハイブリダイゼーションの要因となる核酸（クロスハイブリ核酸）に比較してプローブ核酸との親和性が高く、本来の検出対象となるターゲット核酸に比較してプローブ核酸との親和性が低い核酸が用いられる。
【００１３】
このブロッキング核酸を、あらかじめプローブ核酸にハイブリダイズさせておく。すると、クロスハイブリ核酸がプローブ核酸にハイブリダイズすることを阻害できる。一方、ターゲット核酸はプローブ核酸にハイブリダイズする。この結果、ハイブリダイゼーションの特異性は向上する。
【００１４】
プローブ核酸による一塩基多型の検出に、ブロッキング核酸を使用する方法が知られている。プローブ核酸のうち、一塩基多型部分ではない不変の塩基配列部分に、ブロッキング核酸をハイブリダイズさせ、この部分をブロックしておく。他方、一塩基多型部分は露出させておく。すると、目的となる多型配列を有する核酸はプローブ核酸にハイブリダイズするが、異なる多型配列を有する核酸はプローブ核酸にはハイブリダイズしない。このようにして、ブロッキング核酸を用いて、一塩基の微細な違いを高感度に検出することが可能である（特許文献１）。
【００１５】
ブロッキング核酸は、上記の条件を満たすものであれば、塩基配列や配列長は自由に設計することができる。
【００１６】
しかし、ブロッキング核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの親和性が低い場合（例えば、ブロッキング核酸の配列長を短く設定した場合）は、ブロッキング核酸がクロスハイブリを十分に阻害することができず、高い特異性が得られない場合がある。その一方で、ブロッキング核酸とプローブ核酸との親和性が高い場合（例えば、ブロッキング核酸の配列長を長く設定した場合）は、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションもが阻害され、結果的に検出感度の大幅な低下を招く場合がある。つまり、ブロッキング核酸を使用した核酸の検出においては、感度と特異性を両立させることは困難である。
そのため、ブロッキング核酸を用いたハイブリダイゼーションの特異性向上方法は、多型解析などの、ターゲット核酸が多量に存在する場合に主に適用可能であった。通常のｍＲＮＡの発現解析では、ターゲット核酸の絶対量が少ない場合が多い。このような場合は、検出感度が低下することにより、ターゲット核酸が検出できなくなる懸念があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０１２５７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、プローブ核酸とターゲット核酸との間のハイブリダイゼーションを阻害することなく、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させる、効率的なブロッキング核酸が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決するためにブロッキング核酸の設計方法に着目し、鋭意検討を行った。その結果、ブロッキング核酸の一部がプローブ核酸の一部に、また、ブロッキング核酸の他の一部が別のプローブ核酸の一部にハイブリダイズするようにブロッキング核酸を設計すると、効率的にハイブリダイゼーションの特異性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
（２）前記（１）に記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている核酸アレイ。
（３）塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂのいずれか一方の核酸を担体にアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む、核酸アレイの製造方法であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸アレイの製造方法。
（４）前記（１）に記載の核酸組成物又は前記（２）に記載の核酸アレイとターゲット核酸とを接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、ターゲット核酸の検出方法。
【発明の効果】
【００２０】
従来のブロッキング核酸は、プローブ核酸に十分な特異性を確保しようとする場合は、ハイブリダイゼーションのシグナル強度を低下させる。また、シグナル強度を維持しようとする場合は、プローブ核酸に十分な特異性を確保することが困難である。そのため、これを発現解析に適用することは困難であった。
しかしながら、本発明を適用することにより、従来のブロッキング核酸で生じるようなハイブリダイゼーション効率の低減を防ぎ、効率的にハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となった。その結果、ブロッキング核酸を用いた特異性向上方法を、多型解析だけでなく、発現解析に使用することも可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のプローブ核酸及びブロッキング核酸の概要図である。
【図２】本発明のプローブ核酸及びブロッキング核酸の概要図である。
【図３】本発明の核酸アレイの一態様を示す図である。
【図４】本発明の核酸アレイを用いた検出方法の一態様を示す図である。
【図５】繊維配列体を製造する配列固定治具の図である。
【図６】核酸アレイのデザインを示す図である。数字は配列番号、Ｂはプローブ核酸を搭載しないスポットを示す図である。
【図７】実施例１におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図８】比較例１〜４におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図９】比較例５〜６におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１０】図７〜９のうち、プローブＸ及びプローブＹにおける結果をまとめた図である。
【図１１】実施例２におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１２】比較例７〜８におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１３】図１１及び１２のうち、プローブＡ及びプローブＢにおける結果をまとめた図である。
【図１４】実施例３におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１５】比較例９〜１１におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１６】図１４及び１５のうち、プローブＣ及びプローブＤにおける結果をまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
本発明の第一は、塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的な塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物である。核酸Ａは、塩基配列Ａ１の３’末端に塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、核酸Ｂは、Ａ２’の５’末端にＡ１’の３’末端が連結された形態となっている（図１）。
ここで、塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２とは、任意の核酸塩基配列である。
塩基配列Ａ１’とは、塩基配列Ａ１の相補配列からなる塩基配列である。
塩基配列Ａ２’とは、塩基配列Ａ２の相補配列からなる塩基配列である。
【００２３】
従って、核酸Ａと核酸Ｂとが一分子同士存在すると、核酸Ａの３’側であるＡ２に核酸Ｂの３’側である配列（Ａ２の相補配列であるＡ２’）がハイブリダイズした形態となることが可能である（図１上パネル）。あるいは、核酸Ａの５’側（Ａ１）に核酸Ｂの５’側（Ａ１の相補配列であるＡ１’）がハイブリダイズした形態となることが可能である。核酸Ａと核酸Ｂとを複数混合すると、核酸Ａと核酸Ｂとが互い違いにハイブリダイズするようになる（図１下パネル）。本発明においては、このような核酸Ａ及びＢを含む核酸組成物のうち、いずれか一方をプローブ核酸として使用し、他方をブロッキング核酸として使用する。
核酸は、ＲＮＡであってもＤＮＡであっても、ＰＮＡやＬＮＡなどのアナログであっても、それらが混在するものであっても、相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、二本鎖を形成できるものである限りはどのようなものであってもよい。
塩基配列は、完全にランダムなものであっても、何らかの遺伝子を検出するために、その遺伝子と全部又は一部が同一の配列であってもよく、その遺伝子と全部又は一部が相補配列であってもよい。塩基配列は、その配列が他の塩基配列と区別できるものである限り、どのような長さ及び構成であってもよい。ただし、連結した核酸Ａ及び核酸Ｂがプローブ核酸として機能するためには、連結した核酸Ａ及び核酸Ｂの配列長が１０塩基から１００塩基であることが好ましく、２０塩基から７０塩基であることがさらに好ましい。
塩基配列Ａ１とＡ２との関係（Ａ１’とＡ２’との関係）は、互いに塩基配列長が同程度であることが好ましい。具体的には、塩基配列Ａ１とＡ２との（Ａ１’とＡ２’との）配列長の差が５塩基以内であり、さらにその差が２塩基以内であることが望ましい。
また、塩基配列Ａ１とＡ２とは、それぞれの相補配列（Ａ１’とＡ２’）との２本鎖の形成のしやすさが同程度であることが望ましい。具体的には、塩基配列Ａ１及びＡ２を形成する塩基のうち、ＡとＴ（もしくはＵ）を１、ＧとＣを２として、それぞれの配列を構成する全塩基分の値を加算する。その際の塩基配列Ａ１とＡ２との値の差が、０から５であることが望ましく、０から３であることがより望ましい。
相補配列とは、ある配列と対をなす配列である。核酸は、ＡとＴ（もしくはＵ）、ＧとＣがそれぞれ水素結合することによって、２本鎖を形成し、対をなす。従って、例えば、ＡＴＧＣの相補配列は、ＧＣＡＴであり、ＴＡＣＧの相補配列はＣＧＴＡとなる。但し、相補配列は上記塩基対のみに限定されるものではなく、所定の長さを有する塩基配列において、その配列中の一部の塩基が上記塩基対を形成しなくても、配列とその対をなす配列とがハイブリダイズすることができる限り、「相補配列」に含まれるものとする。
【００２４】
連結とは、上述の塩基配列Ａ１における３’末端の水酸基と塩基配列Ａ２における５’末端のリン酸基、あるいは、塩基配列Ａ１’における３’末端の水酸基と塩基配列Ａ２’における５’末端のリン酸基がフォスフォジエステル結合していることを示す。
３’末端とはヌクレオチドの３’末端のことであり、ここには水酸基がついている。また、５’末端とはヌクレオチドの５’末端のことであり、ここにはリン酸基がついている。あるヌクレオチドの３’末端の水酸基と、異なるヌクレオチドの５’末端のリン酸基がフォスフォジエステル結合することで、核酸は鎖状の分子構造をとることができる。５’末端と３’末端は鎖状の核酸の向きを示すものである。
核酸Ａとは、塩基配列Ａ１の３’末端に塩基配列Ａ２の５’末端が連結することによって形成される塩基配列からなる核酸である。
【００２５】
核酸Ｂとは、塩基配列Ａ２’の５’末端に塩基配列Ａ１’の３’末端が連結することによって形成される塩基配列からなる核酸である。
【００２６】
混合されているとは、混合されているもの同士が、接触している、または接触可能に近接している状態となっていることである。上述の核酸Ａと核酸Ｂが混合されることにより、核酸Ａと核酸Ｂとは、核酸Ａの３’側の領域（Ａ２）と核酸Ｂの３’側の領域（Ａ２’）、あるいは、核酸Ａの５’側の領域（Ａ１）と核酸Ｂの５’側の領域（Ａ１’）にてハイブリダイゼーションを形成する。このとき、核酸Ａと核酸Ｂが一分子同士であれば、ハイブリダイゼーションに供されていない部分は、１本鎖のままであると考えられる（図１上パネルのＡ１とＡ１’）。
しかしながら、核酸Ａ及び核酸Ｂが多量に存在する場合は、ハイブリダイゼーションが連続的に発生し、複数の核酸Ａと複数の核酸Ｂとによる二本鎖構造をとることが推測される（図１下パネル）。
ターゲット核酸とは、検出対象となる標的核酸のことである。
【００２７】
プローブ核酸とは、ハイブリダイゼーションによって、ターゲット核酸をとらえるための核酸である。すなわち、プローブ核酸とは、ターゲット核酸の相補鎖である。
クロスハイブリ核酸とは、ターゲット核酸以外で、プローブ核酸にハイブリダイズしてしまう核酸である（クロスハイブリダイズ核酸ともいう）。
ブロッキング核酸とは、プローブ核酸の部分的な相補鎖により構成される核酸である。ブロッキング核酸は、プローブ核酸にクロスハイブリ核酸がハイブリダイズすることを防止する。
【００２８】
ここで、核酸Ａをプローブ核酸として使用し、核酸Ｂをブロッキング核酸として使用する場合を考える。ターゲット核酸は、核酸Ａの相補鎖である。ターゲット核酸以外で、核酸Ａにハイブリダイズする核酸が、クロスハイブリ核酸である。
プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ２とブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ２’はハイブリダイズすることから、塩基配列Ａ２の一部の配列に相補的な配列を有するクロスハイブリ核酸は、ブロッキング核酸によってハイブリダイゼーションが阻害される。また、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ１は、上記とは別のブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ１’とハイブリダイズすることから、塩基配列Ａ１の一部の配列に相補的な配列を有するクロスハイブリ核酸も、ブロッキング核酸によってハイブリダイゼーションが阻害される。一方、プローブ核酸とブロッキング核酸がこのように連続的にハイブリダイズしている状態では、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは、ほとんど阻害されない。つまり、本手法によれば、クロスハイブリ核酸のプローブ核酸へのハイブリダイゼーションを抑制してノイズを低減しつつ、ターゲット核酸がプローブ核酸とハイブリダイズすることが可能であり、ターゲット核酸の検出感度（特異性）を高めることができる（図２）。
また、本発明の第二の態様は、前記記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている前記核酸アレイである。
【００２９】
すなわち、本発明の第二の態様は、前記核酸組成物が担体に配置され、かつ、その配置位置が規定された核酸アレイである。
また、本発明の第三の態様は、上記核酸アレイの製造方法であり、上記核酸Ａ及び核酸Ｂのいずれか一方の核酸をあらかじめ担体に対してアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む。
ここで、アドレス可能とは、相対的又は絶対的な位置が判別可能な状態であることを指す。具体的には、複数の核酸組成物が配置されている際に、担体上のどの位置にどの核酸組成物が配置されているのかが明らかとされている、あるいは、明らかにすることができる状態のことを指す。
【００３０】
例えば、プローブ核酸の一端を、アレイ上の所定位置に固定して規則的に整列することにより、どの位置にどのプローブ核酸が固定されているかを知ることができる。図３は、核酸Ａの一端が担体上に固定された状態を示す図である。
担体とは、プローブ核酸を固定化する物質であり、核酸組成物を配置する物質のことである。ガラスやシリコン、樹脂、ゲル、ビーズなどさまざまな物質を担体として使用することができる。
【００３１】
核酸アレイとは、プローブ核酸が、担体に複数アドレス可能に固定化されてなるものである。また、本発明でいう核酸アレイとは、担体に複数アドレス可能に固定化されたプローブ核酸に、さらにブロッキング核酸がハイブリダイズしているものである。
【００３２】
固定化とは、プローブ核酸が担体から離脱しないようにする処理のことである。例えば、プローブ核酸や担体自体に何らかの官能基を修飾し、化学的に結合させることにより、プローブ核酸を担体に固定化することが可能である。また、静電的な結合や、疎水的な結合によっても固定化が可能である。
本発明の核酸アレイは、核酸Ａおよび核酸Ｂのうち、何れか一方のみを担体に固定化し、他方を固定化されている核酸にハイブリダイズさせることにより、製造することが可能である。この場合、はじめに固定化した核酸がプローブ核酸となり、後からハイブリダイズさせた核酸がブロッキング核酸となる。
また、本発明の核酸アレイは、あらかじめ核酸Ａと核酸Ｂを混合しておき、その混合物を担体に配置することでも製造することが可能である。
さらに、本発明の第四の態様は、前記核酸アレイ又は核酸組成物にターゲット核酸を接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、核酸の検出方法である。
接触とは、核酸アレイ又は核酸組成物とターゲット核酸とを同一の反応系に存在させることを意味する。さらに具体的には、核酸アレイ上にターゲット核酸を添加すること、核酸組成物とターゲット核酸とを混合することなどが挙げられる。
核酸Ａをプローブ核酸として使用する態様の場合を考える（図２）。ブロッキング核酸によって、プローブ核酸とクロスハイブリ核酸とのハイブリダイゼーションは抑制されている。この状態でターゲット核酸を核酸組成物又は核酸アレイと接触させることにより、クロスハイブリ核酸のプローブ核酸へのハイブリダイゼーションを防止しつつ、ターゲット核酸をプローブ核酸とハイブリダイズさせることができる（図２）。
【００３３】
図４は、プローブ核酸が担体上にアドレス可能に固定化されたとき、すなわち核酸アレイにおけるターゲット核酸の検出の態様を示す図である。ブロッキング核酸によって、担体に固定化されたプローブ核酸Ａとクロスハイブリ核酸とのハイブリダイゼーションは抑制されている。この状態でターゲット核酸を核酸アレイと接触させることにより、プローブ核酸とターゲット核酸とはハイブリダイズする。ターゲット核酸が存在しなければ、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ２には、ブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ２’がハイブリダイズしている。また、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ１には、別のプローブ核酸Ａにハイブリダイズしているブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ１’がハイブリダイズしている（図３）。ターゲット核酸を存在させると、先にハイブリダイズしていた塩基配列Ａ１と塩基配列Ａ１’および塩基配列Ａ２と塩基配列Ａ２’のハイブリダイズが解かれる。この結果、クロスハイブリ核酸のハイブリダイゼーションを防止しつつ、ターゲット核酸がプローブ核酸とハイブリダイズすることができる（図４）。
【００３４】
ターゲット核酸の検出は、ターゲット核酸を蛍光ラベル、放射標識等により標識し、検出装置でシグナルを検出すればよい。プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリッド形成を、蛍光、化学発光、ラジオアイソトープなど、あらかじめターゲット核酸に標識された物質に由来するシグナルにより定量化又は定性化することにより、プローブ核酸に対応するターゲット核酸の存在を確認することができる。また、検出の方法は上記に限定されない。例えば、ブロッキング核酸の方を標識しておき、ターゲット核酸がハイブリすることによるブロッキング核酸の脱落をシグナルの低下で確認することも可能である。
上記、「標識」方法は、核酸のハイブリダイゼーションを検出することができる限り特に限定されるものではない。標識に使用される標識物質としては、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどの蛍光物質、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシターゼを使用した基質分解にともなう化学発光を利用するための酵素又はタンパク質、γ−３２Ｐやα−３２Ｐ等のラジオアイソトープなどが挙げられるが、蛍光物質を使用することが簡便である点で好ましい。
【００３５】
これらの標識物質を核酸分子に取り込ませる際には、標識方法が安定であり、プローブ核酸との特異的なハイブリダイゼーションを阻害しない限りにおいては、直接的、間接的または物理的、化学的結合に関わらずどのような方法であっても使用可能である。化学的な修飾を行う方法として、あらかじめ蛍光物質で標識された塩基を反応時に取り込ませる方法や、ビオチンやアミノアリル基によって修飾されたアナログ塩基を反応時に取り込ませ、それを介して標識物質を取り込ませる方法が挙げられる。また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなどを用いて標識物質を相補核酸分子にインターカレートさせる方法、ＵＬＹＳＩＳのように標識物質を相補核酸分子に対して白金を介して結合させる方法などを採用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１に示す配列番号１番および２番で示されるオリゴヌクレオチド（６０塩基長）を合成した。
【００３７】
合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された５’−Ｏ−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
【００３８】
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【００３９】
【表１】
【００４０】
プローブＸの１〜３０番目及び３１〜６０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＹについても同様である。
【００４１】
次に、図５に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図５中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００４２】
まず、直径０．３２ｍｍの孔（１１）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列、横各１９列で合計２２８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック１質量％添加）を１本ずつ、通過させた。
【００４３】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００４４】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００４５】
この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００４６】
次に、表２に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をアレイに固定するプローブ核酸毎にそれぞれ調製した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
次に、図６に示した配置になるように、中空繊維束の対応する中空繊維の中空部に上記で作製したゲル前駆体重合性溶液を充填するために、該重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封しされていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にプローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００４９】
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００５０】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（核酸アレイ）を３００枚得た。
【００５１】
核酸アレイは、図６に示すプローブ位置で作製した。なお、図６中の数字１及び２は、プローブ核酸の配列番号を示し（それぞれ配列番号１、配列番号２）、核酸アレイには、それぞれの配列番号に示す塩基配列を有するプローブ核酸が配置されている。Ｂは、プローブ核酸の入っていないスポットを示す。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【００５２】
まず、表３に示す配列番号３および配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【００５３】
配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の完全相補鎖（６０塩基）のうち、５末端側の３０塩基と、３末端側の３０塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の完全相補鎖（６０塩基）のうち、５末端側の３０塩基と、３末端側の３０塩基を入れ替えた構造から構成される。
【００５４】
【表３】
【００５５】
配列番号３については、配列番号１のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号４については、配列番号２のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ｘ−６０Ｔ及びＹ−６０Ｔにおいて、第１〜３０番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、３１〜６０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表４に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で６０℃、１６時間接触させた。
【００５６】
【表４】
【００５７】
接触後の核酸アレイは、０．１２Ｍ ＴＮＴバッファー（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１２Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．１２Ｍ ＴＮバッファー（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．１２Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
【００５８】
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【００５９】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表５に記載の配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６０】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号５及び配列番号６で示される６０塩基のターゲットモデル検体を、２０塩基ずつ３等分した、表５に記載のオリゴＤＮＡ（配列番号７から１２）を使用した。
【００６１】
【表５】
【００６２】
ターゲットモデル検体（配列番号５及び６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号７から１２）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【００６３】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表６の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で６０℃、１６時間接触させることで実施した。
【００６４】
【表６】
【００６５】
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．１２ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【００６６】
データは、プローブＸ、プローブＹのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されている１０箇所のスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を平均して示した。
【００６７】
その結果を図７に示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２０５９０、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は５１４７であった。
【００６８】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は８４０８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２１０２であった。
比較例１
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００６９】
その結果を図８Ａに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５８１８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は９０７４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４であった。
【００７０】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１６８５３、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は３８７１であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４であった。
【００７１】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例１に比較して高かったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度がそれ以上の割合で高く、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例に比較して極めて低い値となった。これは、ブロッキング核酸を使用しない状態では、多くのクロスハイブリ核酸がプローブ核酸とハイブリダイゼーションを形成してしまい、高い特異性が得られないことを示している。
比較例２
ブロッキング核酸として、表５に記載の配列番号５及び配列番号６で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる６０塩基のものを使用した。それ以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００７２】
その結果を図８Ｂに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５８５、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は８９６であった。
【００７３】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１４８８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は３７２であった。
【００７４】
本比較例においては、使用したブロッキング核酸の長さがプローブ核酸と同一であるため、ハイブリダイゼーションの効率が、ターゲットモデル検体と変わらない。そのため、ブロッキング核酸が、ターゲットモデル検体とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション形成をも競合阻害してしまい、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度が極めて低くなる。クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度についてはほとんど検出されないが、ターゲットモデル検体のシグナル強度が大幅に低くなる分、実施例１と比較して、ターゲット／クロスハイブリ比が低くなった。
比較例３
ブロッキング核酸として、表７に記載の５０塩基長のもの（配列番号１３、１４）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの６塩基目から、５５塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００７５】
その結果を図８Ｃに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１０９３２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２７３３であった。
【００７６】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３４７４、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は８６９であった。
【００７７】
本比較例においては、使用したブロッキング核酸の長さがプローブ核酸よりも１０塩基短い（ブロッキング核酸とプローブ核酸の長さが均等ではない）ため、先の比較例２に比較してターゲットモデル検体とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション形成はしやすい。しかしながら、実施例１で使用したブロッキング核酸に比較して、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度は低く、そのため、ターゲット／クロスハイブリ比も低い値となった。
【００７８】
【表７】
【００７９】
比較例４
ブロッキング核酸として、表８に記載の４０塩基長のもの（配列番号１５、１６）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１１塩基目から、５０塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００８０】
その結果を図８Ｄに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２５２０２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は２６３であり、ターゲット／クロスハイブリ比は９６であった。
【００８１】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１２４１６、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は２６であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４７１であった。
【００８２】
用いたブロッキング核酸の鎖長は４０塩基であるが、本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
【００８３】
【表８】
【００８４】
比較例５
ブロッキング核酸として、表９に記載された３０塩基長のもの（配列番号１７、１８）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１６塩基目から、４５塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００８５】
その結果を図９Ａに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５０３７、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は３４５９であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１０であった。
【００８６】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１６６４１、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は９４６であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１８であった。
【００８７】
この結果は、比較例４と同様に、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度に比較して、クロスハイブリ検体由来のシグナルが多く検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
【００８８】
【表９】
【００８９】
比較例６
ブロッキング核酸として、表１０に記載の３０塩基長のもの（配列番号１９、２０、２１、２２）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１塩基目から、３０塩基目まで及び、３１塩基目から６０塩基目の配列で構成されている。使用したブロッキング核酸以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００９０】
その結果を図９Ｂに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２５７１２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は１７９であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１４４であった。
【００９１】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１１４３９、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２６０であった。
【００９２】
ここで用いたブロッキング核酸は、１本の６０塩基長のプローブ核酸に対して、２本の３０塩基長のブロッキング核酸を用い、プローブ核酸の全配列をブロッキングしている。プローブ核酸の全配列をブロッキングできるという点では、実施例１や、比較例２と同一であるが、実施例１に対してターゲット／クロスハイブリ比は低い値であった。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
実施例１、比較例２〜６のまとめ
図１０に、実施例と比較例を同一グラフ上にプロットした。図１０において、パネルＡはプローブＸ、パネルＢはプローブＹにおける結果をまとめた図である。その結果、実施例におけるターゲット／クロスハイブリ比が他の何れの比較例に比べても、きわめて高かった。以上により、本実施例におけるブロッキング核酸が、比較例にて使用したブロッキング核酸に比較してプローブ核酸の特異性を向上させることを証明した。
実施例２
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１１に示す配列番号２３番および２４番で示されるオリゴヌクレオチド（３０塩基長）を合成した。
【００９５】
実施例１と同様にして５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【００９６】
【表１１】
【００９７】
プローブＡの１〜１５番目及び１６〜３０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＢについても同様である。
【００９８】
そのほかは実施例１
と同様にして、核酸アレイを作製した。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【００９９】
まず、表１１に示す配列番号２７および配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【０１００】
配列番号２７で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の完全相補鎖（３０塩基）のうち、５末端側の１５塩基と、３末端側の１５塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２４の完全相補鎖（３０塩基）のうち、５末端側の１５塩基と、３末端側の１５塩基を入れ替えた構造から構成される。
【０１０１】
配列番号２７については、配列番号２３のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号２８については、配列番号２４のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ａ−３０及びＢ−３０において、第１〜１５番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、１６〜３０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表１２に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で６０℃、１６時間接触させた。
【０１０２】
【表１２】
【０１０３】
接触後の核酸アレイは、０．２４Ｍ ＴＮＴバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．２４Ｍ ＴＮバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．２４Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【０１０４】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表１１に記載の配列番号２５及び配列番号２６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１０５】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号２９及び配列番号３０で示される１５塩基のオリゴヌクレオチドを使用した。
ターゲットモデル検体（配列番号２５及び２６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号２９及び３０）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【０１０６】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表１３の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で６０℃、１６時間接触させることで実施した。洗浄はブロッキング核酸接触後と同様の方法にて実施した。
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．２４ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【０１０９】
データは、プローブＡ、プローブＢのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されているスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を示した。
【０１１０】
その結果を図１１に示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は166516、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2964であり、ターゲット／クロスハイブリ比は56であった。
【０１１１】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は89108、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2054であり、ターゲット／クロスハイブリ比は43であった。
比較例７
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１１２】
その結果を図１２Ａに示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は159204、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は10850であり、ターゲット／クロスハイブリ比は15であった。
【０１１３】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ
６４７）のシグナル強度は85560、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は8484であり、ターゲット／クロスハイブリ比は10であった。
【０１１４】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例２と同程度であったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度がそれ以上の割合で高く、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例に比較して極めて低い値となった。これは、ブロッキング核酸を使用しない状態では、多くのクロスハイブリ核酸がプローブ核酸とハイブリダイゼーションを形成してしまい、高い特異性が得られないことを示している。
比較例８
ブロッキング核酸として、表１１に記載の配列番号２９及び配列番号３０で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる１５塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１１５】
その結果を図１２Ｂに示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は166700、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は3476であり、ターゲット／クロスハイブリ比は48であった。
【０１１６】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は94244、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2900であり、ターゲット／クロスハイブリ比は32であった。
【０１１７】
用いたブロッキング核酸の鎖長は１５塩基であった。本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが実施例２に比較して高く検出された。
実施例２、比較例７、比較例８のまとめ
図１３に、実施例２、比較例７、比較例８の結果をまとめた。図１３において、パネルＡはプローブＡ、パネルＢはプローブＢにおける結果をまとめた図である。３０塩基長のプローブＡ、プローブＢを用いた場合においても、実施例に記載の方法は比較例に記載の方法に比較して特異性の高いデータが得られることが明らかとなった。
実施例３
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１４に示す配列番号３１番および３２番で示されるオリゴヌクレオチド（２０塩基長）を合成した。
【０１１８】
実施例１と同様にして５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【０１１９】
【表１４】
【０１２０】
プローブＣの１〜１０番目及び１１〜２０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＤについても同様である。
【０１２１】
そのほかは実施例１と同様にして、核酸アレイを作製した。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【０１２２】
まず、表１４に示す配列番号３３および配列番号３４で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【０１２３】
配列番号３３で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３１の完全相補鎖（２０塩基）のうち、５末端側の１０塩基と、３末端側の１０塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号３４で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３２の完全相補鎖（２０塩基）のうち、５末端側の１０塩基と、３末端側の１０塩基を入れ替えた構造から構成される。
配列番号３３については、配列番号３１のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号３４については、配列番号３２のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ｃ−２０Ｔ及びＤ−２０Ｔにおいて、第１〜１０番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、１１〜２０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表１２に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で５０℃、１６時間接触させた。
接触後の核酸アレイは、０．２４Ｍ ＴＮＴバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．２４Ｍ ＴＮバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．２４Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
【０１２４】
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【０１２５】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表１４に記載の配列番号３５及び配列番号３６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１２６】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号３７及び配列番号３８で示される１０塩基のオリゴヌクレオチドを使用した。
ターゲットモデル検体（配列番号３５及び３６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号３７及び３８）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【０１２７】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表１３の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で５０℃、１６時間接触させることで実施した。洗浄はブロッキング核酸接触後と同様の方法にて実施した。
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．２４ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【０１２８】
データは、プローブＣ、プローブＤのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されているスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を示した。
【０１２９】
その結果を図１４に示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は23456、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は558であり、ターゲット／クロスハイブリ比は42であった。
【０１３０】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1728、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は156であり、ターゲット／クロスハイブリ比は11であった。
【０１３１】
比較例９
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３２】
その結果を図１５Ａに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は21712、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は6751であり、ターゲット／クロスハイブリ比は3であった。
【０１３３】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1432、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は1045であり、ターゲット／クロスハイブリ比は1であった。
【０１３４】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例３と同程度であったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度は実施例３に比較して高いため、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例３に比較して極めて低い値となった。
比較例１０
ブロッキング核酸として、表１４に記載の配列番号３７及び配列番号３８で示される、プローブ核酸の相補配列からなる１０塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３５】
その結果を図１５Ｂに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は19480、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は521であり、ターゲット／クロスハイブリ比は37であった。
【０１３６】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1380、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は213であり、ターゲット／クロスハイブリ比は6であった。
【０１３７】
用いたブロッキング核酸の鎖長は１０塩基であるが、本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
比較例１１
ブロッキング核酸として、表１４に記載の配列番号３５及び配列番号３６で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる２０塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３８】
その結果を図１５Ｃに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は3656、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は386であり、ターゲット／クロスハイブリ比は9であった。
【０１３９】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は752、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は122であり、ターゲット／クロスハイブリ比は6であった。
【０１４０】
用いたブロッキング核酸の鎖長は２０塩基であるが、本条件においては、ターゲットモデル検体の鎖長と同一であるため、ターゲットモデル検体のハイブリダイゼーションの効率が著しく低下し、シグナル強度が大幅に低下する。その結果、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
実施例３、比較例９、比較例１０、比較例１１のまとめ
図１６に、実施例３、比較例９、比較例１０、比較例１１の結果をまとめた。図１６において、パネルＡはプローブＣ、パネルＢはプローブＤにおける結果をまとめた図である。２０塩基長のプローブＣ、プローブＤを用いた場合においても、実施例に記載の方法は比較例に記載の方法に比較して特異性の高いデータが得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の低減を防ぎ、多型解析だけでなく、発現解析に使用することも可能な核酸組成物及び核酸アレイが提供される。
【符号の説明】
【０１４２】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１〜38：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象となるターゲット核酸をより正確に検出するための核酸検出用プローブに関する。また、複数のターゲット核酸を同時により正確に検出するための核酸アレイ、及び核酸アレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出・同定する方法として、現在までにさまざまな手法が開発されている。そのための基本技術として、ハイブリダイゼーション法が広く用いられている。
【０００３】
ハイブリダイゼーションとは、核酸分子が相補的に複合体（２本鎖）を形成することである。これは、相補的な塩基間での水素結合の連続によるものである。
一般的に、２本鎖を構成する核酸の塩基長が長いほどハイブリダイゼーションの親和性が高く、短いほどハイブリダイゼーションの親和性が低くなる。また、ハイブリダイゼーションの親和性は、核酸を構成する塩基にも依存する。２本鎖を構成する核酸にＧ、Ｃが多い場合はハイブリダイゼーションの親和性が高くなり、Ａ、Ｔが多い場合はハイブリダイゼーションの親和性が低くなる。これは、塩基が形成する水素結合の数の違い（前者が３個、後者が２個）によるものである。
【０００４】
ハイブリダイゼーションを利用して特定の核酸を検出する方法としては、サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションがある。これは、検出対象となる核酸（ターゲット核酸）を担体上に固定化し、その相補鎖である核酸（プローブ核酸）をこれに接触させ、形成されたハイブリダイゼーションを検出することにより、ターゲット核酸を検出する方法である。これらの手法では、一度に検出できる核酸の種類は少数である。
【０００５】
一方、多種類の核酸を同時に検出する方法としては、核酸アレイ（ＤＮＡチップ）がある。近年では、多種類のプローブ核酸を高密度に配列した核酸アレイの開発が盛んに行われている。核酸アレイの基本的な検出原理は、上述の手法と同一である。核酸アレイを用いることで、遺伝子全体の動きを包括的に評価することが可能となってきている。
【０００６】
しかしながら、ハイブリダイゼーションにおいては、完全に相補的な配列のみが２本鎖を形成するとは限らず、類似した塩基配列であれば２本鎖を形成することがある。このため、ハイブリダイゼーション法による核酸の検出には、検出目的ではない核酸をも検出してしまう、いわゆる「クロスハイブリダイゼーション」（本明細書において「クロスハイブリ」ともいう）の問題が生じる場合があった。
クロスハイブリダイゼーションを極力除去し、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させるための方法は、これまでにも数多く考案されてきた。
【０００７】
例えば、ハイブリダイゼーションの条件を最適化することが挙げられる。条件としては、第一にハイブリダイゼーションの温度がある。核酸のハイブリダイゼーションは、水素結合によるものである。温度を上昇させると、ハイブリダイゼーションが起こりにくくなる。よって温度を上昇させることで、目的のハイブリダイゼーションは極力維持したまま、クロスハイブリダイゼーションのみを解離させることが可能である。
【０００８】
また、条件としては、第二にハイブリダイゼーション溶液の塩濃度がある。核酸は負の電荷を持つため、核酸同士は電気的に反発する。溶液の塩濃度を高くすると、核酸の負の電荷が相殺されることで、核酸同士の反発が弱まり、ハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。よって、溶液の塩濃度を調整することで、目的のハイブリダイゼーションは維持しつつ、クロスハイブリダイゼーションを極力防ぐような条件を設定することが可能である。
【０００９】
ハイブリダイゼーション溶液に何らかの添加剤を加えることで特異性を向上させることも可能である。界面活性剤やベタイン、デンハルト溶液、ホルムアミドなどを添加することで、分子内での立体構造をとりにくくすることができる。これにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となる。
【００１０】
また、プローブ核酸として比較的長い鎖長のｃＤＮＡを用いる場合は、ハイブリダイゼーション溶液にＣｏｔ−１やサケ精子ＤＮＡを添加することで、繰り返し配列に由来するようなクロスハイブリダイゼーションを防止することができる。これにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能である。
【００１１】
さらに、近年の膨大なゲノム情報の蓄積や、情報処理技術の発達により、クロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにプローブ核酸を設計するためのプログラムなどが開発されている。これらを使用することでハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となっている。
【００１２】
このような中で、「ブロッキング核酸」を用いて、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させる方法も開発されている。
ブロッキング核酸とは、プローブ核酸の部分的な相補鎖により構成される核酸である。ブロッキング核酸には、クロスハイブリダイゼーションの要因となる核酸（クロスハイブリ核酸）に比較してプローブ核酸との親和性が高く、本来の検出対象となるターゲット核酸に比較してプローブ核酸との親和性が低い核酸が用いられる。
【００１３】
このブロッキング核酸を、あらかじめプローブ核酸にハイブリダイズさせておく。すると、クロスハイブリ核酸がプローブ核酸にハイブリダイズすることを阻害できる。一方、ターゲット核酸はプローブ核酸にハイブリダイズする。この結果、ハイブリダイゼーションの特異性は向上する。
【００１４】
プローブ核酸による一塩基多型の検出に、ブロッキング核酸を使用する方法が知られている。プローブ核酸のうち、一塩基多型部分ではない不変の塩基配列部分に、ブロッキング核酸をハイブリダイズさせ、この部分をブロックしておく。他方、一塩基多型部分は露出させておく。すると、目的となる多型配列を有する核酸はプローブ核酸にハイブリダイズするが、異なる多型配列を有する核酸はプローブ核酸にはハイブリダイズしない。このようにして、ブロッキング核酸を用いて、一塩基の微細な違いを高感度に検出することが可能である（特許文献１）。
【００１５】
ブロッキング核酸は、上記の条件を満たすものであれば、塩基配列や配列長は自由に設計することができる。
【００１６】
しかし、ブロッキング核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの親和性が低い場合（例えば、ブロッキング核酸の配列長を短く設定した場合）は、ブロッキング核酸がクロスハイブリを十分に阻害することができず、高い特異性が得られない場合がある。その一方で、ブロッキング核酸とプローブ核酸との親和性が高い場合（例えば、ブロッキング核酸の配列長を長く設定した場合）は、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションもが阻害され、結果的に検出感度の大幅な低下を招く場合がある。つまり、ブロッキング核酸を使用した核酸の検出においては、感度と特異性を両立させることは困難である。
そのため、ブロッキング核酸を用いたハイブリダイゼーションの特異性向上方法は、多型解析などの、ターゲット核酸が多量に存在する場合に主に適用可能であった。通常のｍＲＮＡの発現解析では、ターゲット核酸の絶対量が少ない場合が多い。このような場合は、検出感度が低下することにより、ターゲット核酸が検出できなくなる懸念があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０１２５７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、プローブ核酸とターゲット核酸との間のハイブリダイゼーションを阻害することなく、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させる、効率的なブロッキング核酸が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決するためにブロッキング核酸の設計方法に着目し、鋭意検討を行った。その結果、ブロッキング核酸の一部がプローブ核酸の一部に、また、ブロッキング核酸の他の一部が別のプローブ核酸の一部にハイブリダイズするようにブロッキング核酸を設計すると、効率的にハイブリダイゼーションの特異性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
（２）前記（１）に記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている核酸アレイ。
（３）塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂのいずれか一方の核酸を担体にアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む、核酸アレイの製造方法であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸アレイの製造方法。
（４）前記（１）に記載の核酸組成物又は前記（２）に記載の核酸アレイとターゲット核酸とを接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、ターゲット核酸の検出方法。
【発明の効果】
【００２０】
従来のブロッキング核酸は、プローブ核酸に十分な特異性を確保しようとする場合は、ハイブリダイゼーションのシグナル強度を低下させる。また、シグナル強度を維持しようとする場合は、プローブ核酸に十分な特異性を確保することが困難である。そのため、これを発現解析に適用することは困難であった。
しかしながら、本発明を適用することにより、従来のブロッキング核酸で生じるようなハイブリダイゼーション効率の低減を防ぎ、効率的にハイブリダイゼーションの特異性を向上させることが可能となった。その結果、ブロッキング核酸を用いた特異性向上方法を、多型解析だけでなく、発現解析に使用することも可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のプローブ核酸及びブロッキング核酸の概要図である。
【図２】本発明のプローブ核酸及びブロッキング核酸の概要図である。
【図３】本発明の核酸アレイの一態様を示す図である。
【図４】本発明の核酸アレイを用いた検出方法の一態様を示す図である。
【図５】繊維配列体を製造する配列固定治具の図である。
【図６】核酸アレイのデザインを示す図である。数字は配列番号、Ｂはプローブ核酸を搭載しないスポットを示す図である。
【図７】実施例１におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図８】比較例１〜４におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図９】比較例５〜６におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１０】図７〜９のうち、プローブＸ及びプローブＹにおける結果をまとめた図である。
【図１１】実施例２におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１２】比較例７〜８におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１３】図１１及び１２のうち、プローブＡ及びプローブＢにおける結果をまとめた図である。
【図１４】実施例３におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１５】比較例９〜１１におけるモデル検体のシグナル強度と、その比率を示す図である。
【図１６】図１４及び１５のうち、プローブＣ及びプローブＤにおける結果をまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
本発明の第一は、塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的な塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物である。核酸Ａは、塩基配列Ａ１の３’末端に塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、核酸Ｂは、Ａ２’の５’末端にＡ１’の３’末端が連結された形態となっている（図１）。
ここで、塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２とは、任意の核酸塩基配列である。
塩基配列Ａ１’とは、塩基配列Ａ１の相補配列からなる塩基配列である。
塩基配列Ａ２’とは、塩基配列Ａ２の相補配列からなる塩基配列である。
【００２３】
従って、核酸Ａと核酸Ｂとが一分子同士存在すると、核酸Ａの３’側であるＡ２に核酸Ｂの３’側である配列（Ａ２の相補配列であるＡ２’）がハイブリダイズした形態となることが可能である（図１上パネル）。あるいは、核酸Ａの５’側（Ａ１）に核酸Ｂの５’側（Ａ１の相補配列であるＡ１’）がハイブリダイズした形態となることが可能である。核酸Ａと核酸Ｂとを複数混合すると、核酸Ａと核酸Ｂとが互い違いにハイブリダイズするようになる（図１下パネル）。本発明においては、このような核酸Ａ及びＢを含む核酸組成物のうち、いずれか一方をプローブ核酸として使用し、他方をブロッキング核酸として使用する。
核酸は、ＲＮＡであってもＤＮＡであっても、ＰＮＡやＬＮＡなどのアナログであっても、それらが混在するものであっても、相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、二本鎖を形成できるものである限りはどのようなものであってもよい。
塩基配列は、完全にランダムなものであっても、何らかの遺伝子を検出するために、その遺伝子と全部又は一部が同一の配列であってもよく、その遺伝子と全部又は一部が相補配列であってもよい。塩基配列は、その配列が他の塩基配列と区別できるものである限り、どのような長さ及び構成であってもよい。ただし、連結した核酸Ａ及び核酸Ｂがプローブ核酸として機能するためには、連結した核酸Ａ及び核酸Ｂの配列長が１０塩基から１００塩基であることが好ましく、２０塩基から７０塩基であることがさらに好ましい。
塩基配列Ａ１とＡ２との関係（Ａ１’とＡ２’との関係）は、互いに塩基配列長が同程度であることが好ましい。具体的には、塩基配列Ａ１とＡ２との（Ａ１’とＡ２’との）配列長の差が５塩基以内であり、さらにその差が２塩基以内であることが望ましい。
また、塩基配列Ａ１とＡ２とは、それぞれの相補配列（Ａ１’とＡ２’）との２本鎖の形成のしやすさが同程度であることが望ましい。具体的には、塩基配列Ａ１及びＡ２を形成する塩基のうち、ＡとＴ（もしくはＵ）を１、ＧとＣを２として、それぞれの配列を構成する全塩基分の値を加算する。その際の塩基配列Ａ１とＡ２との値の差が、０から５であることが望ましく、０から３であることがより望ましい。
相補配列とは、ある配列と対をなす配列である。核酸は、ＡとＴ（もしくはＵ）、ＧとＣがそれぞれ水素結合することによって、２本鎖を形成し、対をなす。従って、例えば、ＡＴＧＣの相補配列は、ＧＣＡＴであり、ＴＡＣＧの相補配列はＣＧＴＡとなる。但し、相補配列は上記塩基対のみに限定されるものではなく、所定の長さを有する塩基配列において、その配列中の一部の塩基が上記塩基対を形成しなくても、配列とその対をなす配列とがハイブリダイズすることができる限り、「相補配列」に含まれるものとする。
【００２４】
連結とは、上述の塩基配列Ａ１における３’末端の水酸基と塩基配列Ａ２における５’末端のリン酸基、あるいは、塩基配列Ａ１’における３’末端の水酸基と塩基配列Ａ２’における５’末端のリン酸基がフォスフォジエステル結合していることを示す。
３’末端とはヌクレオチドの３’末端のことであり、ここには水酸基がついている。また、５’末端とはヌクレオチドの５’末端のことであり、ここにはリン酸基がついている。あるヌクレオチドの３’末端の水酸基と、異なるヌクレオチドの５’末端のリン酸基がフォスフォジエステル結合することで、核酸は鎖状の分子構造をとることができる。５’末端と３’末端は鎖状の核酸の向きを示すものである。
核酸Ａとは、塩基配列Ａ１の３’末端に塩基配列Ａ２の５’末端が連結することによって形成される塩基配列からなる核酸である。
【００２５】
核酸Ｂとは、塩基配列Ａ２’の５’末端に塩基配列Ａ１’の３’末端が連結することによって形成される塩基配列からなる核酸である。
【００２６】
混合されているとは、混合されているもの同士が、接触している、または接触可能に近接している状態となっていることである。上述の核酸Ａと核酸Ｂが混合されることにより、核酸Ａと核酸Ｂとは、核酸Ａの３’側の領域（Ａ２）と核酸Ｂの３’側の領域（Ａ２’）、あるいは、核酸Ａの５’側の領域（Ａ１）と核酸Ｂの５’側の領域（Ａ１’）にてハイブリダイゼーションを形成する。このとき、核酸Ａと核酸Ｂが一分子同士であれば、ハイブリダイゼーションに供されていない部分は、１本鎖のままであると考えられる（図１上パネルのＡ１とＡ１’）。
しかしながら、核酸Ａ及び核酸Ｂが多量に存在する場合は、ハイブリダイゼーションが連続的に発生し、複数の核酸Ａと複数の核酸Ｂとによる二本鎖構造をとることが推測される（図１下パネル）。
ターゲット核酸とは、検出対象となる標的核酸のことである。
【００２７】
プローブ核酸とは、ハイブリダイゼーションによって、ターゲット核酸をとらえるための核酸である。すなわち、プローブ核酸とは、ターゲット核酸の相補鎖である。
クロスハイブリ核酸とは、ターゲット核酸以外で、プローブ核酸にハイブリダイズしてしまう核酸である（クロスハイブリダイズ核酸ともいう）。
ブロッキング核酸とは、プローブ核酸の部分的な相補鎖により構成される核酸である。ブロッキング核酸は、プローブ核酸にクロスハイブリ核酸がハイブリダイズすることを防止する。
【００２８】
ここで、核酸Ａをプローブ核酸として使用し、核酸Ｂをブロッキング核酸として使用する場合を考える。ターゲット核酸は、核酸Ａの相補鎖である。ターゲット核酸以外で、核酸Ａにハイブリダイズする核酸が、クロスハイブリ核酸である。
プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ２とブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ２’はハイブリダイズすることから、塩基配列Ａ２の一部の配列に相補的な配列を有するクロスハイブリ核酸は、ブロッキング核酸によってハイブリダイゼーションが阻害される。また、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ１は、上記とは別のブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ１’とハイブリダイズすることから、塩基配列Ａ１の一部の配列に相補的な配列を有するクロスハイブリ核酸も、ブロッキング核酸によってハイブリダイゼーションが阻害される。一方、プローブ核酸とブロッキング核酸がこのように連続的にハイブリダイズしている状態では、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは、ほとんど阻害されない。つまり、本手法によれば、クロスハイブリ核酸のプローブ核酸へのハイブリダイゼーションを抑制してノイズを低減しつつ、ターゲット核酸がプローブ核酸とハイブリダイズすることが可能であり、ターゲット核酸の検出感度（特異性）を高めることができる（図２）。
また、本発明の第二の態様は、前記記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている前記核酸アレイである。
【００２９】
すなわち、本発明の第二の態様は、前記核酸組成物が担体に配置され、かつ、その配置位置が規定された核酸アレイである。
また、本発明の第三の態様は、上記核酸アレイの製造方法であり、上記核酸Ａ及び核酸Ｂのいずれか一方の核酸をあらかじめ担体に対してアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む。
ここで、アドレス可能とは、相対的又は絶対的な位置が判別可能な状態であることを指す。具体的には、複数の核酸組成物が配置されている際に、担体上のどの位置にどの核酸組成物が配置されているのかが明らかとされている、あるいは、明らかにすることができる状態のことを指す。
【００３０】
例えば、プローブ核酸の一端を、アレイ上の所定位置に固定して規則的に整列することにより、どの位置にどのプローブ核酸が固定されているかを知ることができる。図３は、核酸Ａの一端が担体上に固定された状態を示す図である。
担体とは、プローブ核酸を固定化する物質であり、核酸組成物を配置する物質のことである。ガラスやシリコン、樹脂、ゲル、ビーズなどさまざまな物質を担体として使用することができる。
【００３１】
核酸アレイとは、プローブ核酸が、担体に複数アドレス可能に固定化されてなるものである。また、本発明でいう核酸アレイとは、担体に複数アドレス可能に固定化されたプローブ核酸に、さらにブロッキング核酸がハイブリダイズしているものである。
【００３２】
固定化とは、プローブ核酸が担体から離脱しないようにする処理のことである。例えば、プローブ核酸や担体自体に何らかの官能基を修飾し、化学的に結合させることにより、プローブ核酸を担体に固定化することが可能である。また、静電的な結合や、疎水的な結合によっても固定化が可能である。
本発明の核酸アレイは、核酸Ａおよび核酸Ｂのうち、何れか一方のみを担体に固定化し、他方を固定化されている核酸にハイブリダイズさせることにより、製造することが可能である。この場合、はじめに固定化した核酸がプローブ核酸となり、後からハイブリダイズさせた核酸がブロッキング核酸となる。
また、本発明の核酸アレイは、あらかじめ核酸Ａと核酸Ｂを混合しておき、その混合物を担体に配置することでも製造することが可能である。
さらに、本発明の第四の態様は、前記核酸アレイ又は核酸組成物にターゲット核酸を接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、核酸の検出方法である。
接触とは、核酸アレイ又は核酸組成物とターゲット核酸とを同一の反応系に存在させることを意味する。さらに具体的には、核酸アレイ上にターゲット核酸を添加すること、核酸組成物とターゲット核酸とを混合することなどが挙げられる。
核酸Ａをプローブ核酸として使用する態様の場合を考える（図２）。ブロッキング核酸によって、プローブ核酸とクロスハイブリ核酸とのハイブリダイゼーションは抑制されている。この状態でターゲット核酸を核酸組成物又は核酸アレイと接触させることにより、クロスハイブリ核酸のプローブ核酸へのハイブリダイゼーションを防止しつつ、ターゲット核酸をプローブ核酸とハイブリダイズさせることができる（図２）。
【００３３】
図４は、プローブ核酸が担体上にアドレス可能に固定化されたとき、すなわち核酸アレイにおけるターゲット核酸の検出の態様を示す図である。ブロッキング核酸によって、担体に固定化されたプローブ核酸Ａとクロスハイブリ核酸とのハイブリダイゼーションは抑制されている。この状態でターゲット核酸を核酸アレイと接触させることにより、プローブ核酸とターゲット核酸とはハイブリダイズする。ターゲット核酸が存在しなければ、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ２には、ブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ２’がハイブリダイズしている。また、プローブ核酸Ａの塩基配列Ａ１には、別のプローブ核酸Ａにハイブリダイズしているブロッキング核酸Ｂの塩基配列Ａ１’がハイブリダイズしている（図３）。ターゲット核酸を存在させると、先にハイブリダイズしていた塩基配列Ａ１と塩基配列Ａ１’および塩基配列Ａ２と塩基配列Ａ２’のハイブリダイズが解かれる。この結果、クロスハイブリ核酸のハイブリダイゼーションを防止しつつ、ターゲット核酸がプローブ核酸とハイブリダイズすることができる（図４）。
【００３４】
ターゲット核酸の検出は、ターゲット核酸を蛍光ラベル、放射標識等により標識し、検出装置でシグナルを検出すればよい。プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリッド形成を、蛍光、化学発光、ラジオアイソトープなど、あらかじめターゲット核酸に標識された物質に由来するシグナルにより定量化又は定性化することにより、プローブ核酸に対応するターゲット核酸の存在を確認することができる。また、検出の方法は上記に限定されない。例えば、ブロッキング核酸の方を標識しておき、ターゲット核酸がハイブリすることによるブロッキング核酸の脱落をシグナルの低下で確認することも可能である。
上記、「標識」方法は、核酸のハイブリダイゼーションを検出することができる限り特に限定されるものではない。標識に使用される標識物質としては、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどの蛍光物質、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシターゼを使用した基質分解にともなう化学発光を利用するための酵素又はタンパク質、γ−３２Ｐやα−３２Ｐ等のラジオアイソトープなどが挙げられるが、蛍光物質を使用することが簡便である点で好ましい。
【００３５】
これらの標識物質を核酸分子に取り込ませる際には、標識方法が安定であり、プローブ核酸との特異的なハイブリダイゼーションを阻害しない限りにおいては、直接的、間接的または物理的、化学的結合に関わらずどのような方法であっても使用可能である。化学的な修飾を行う方法として、あらかじめ蛍光物質で標識された塩基を反応時に取り込ませる方法や、ビオチンやアミノアリル基によって修飾されたアナログ塩基を反応時に取り込ませ、それを介して標識物質を取り込ませる方法が挙げられる。また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなどを用いて標識物質を相補核酸分子にインターカレートさせる方法、ＵＬＹＳＩＳのように標識物質を相補核酸分子に対して白金を介して結合させる方法などを採用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１に示す配列番号１番および２番で示されるオリゴヌクレオチド（６０塩基長）を合成した。
【００３７】
合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された５’−Ｏ−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
【００３８】
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【００３９】
【表１】
【００４０】
プローブＸの１〜３０番目及び３１〜６０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＹについても同様である。
【００４１】
次に、図５に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図５中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００４２】
まず、直径０．３２ｍｍの孔（１１）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列、横各１９列で合計２２８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック１質量％添加）を１本ずつ、通過させた。
【００４３】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００４４】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００４５】
この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００４６】
次に、表２に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をアレイに固定するプローブ核酸毎にそれぞれ調製した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
次に、図６に示した配置になるように、中空繊維束の対応する中空繊維の中空部に上記で作製したゲル前駆体重合性溶液を充填するために、該重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封しされていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にプローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００４９】
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００５０】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（核酸アレイ）を３００枚得た。
【００５１】
核酸アレイは、図６に示すプローブ位置で作製した。なお、図６中の数字１及び２は、プローブ核酸の配列番号を示し（それぞれ配列番号１、配列番号２）、核酸アレイには、それぞれの配列番号に示す塩基配列を有するプローブ核酸が配置されている。Ｂは、プローブ核酸の入っていないスポットを示す。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【００５２】
まず、表３に示す配列番号３および配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【００５３】
配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の完全相補鎖（６０塩基）のうち、５末端側の３０塩基と、３末端側の３０塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の完全相補鎖（６０塩基）のうち、５末端側の３０塩基と、３末端側の３０塩基を入れ替えた構造から構成される。
【００５４】
【表３】
【００５５】
配列番号３については、配列番号１のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号４については、配列番号２のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ｘ−６０Ｔ及びＹ−６０Ｔにおいて、第１〜３０番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、３１〜６０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表４に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で６０℃、１６時間接触させた。
【００５６】
【表４】
【００５７】
接触後の核酸アレイは、０．１２Ｍ ＴＮＴバッファー（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１２Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．１２Ｍ ＴＮバッファー（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．１２Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
【００５８】
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【００５９】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表５に記載の配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６０】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号５及び配列番号６で示される６０塩基のターゲットモデル検体を、２０塩基ずつ３等分した、表５に記載のオリゴＤＮＡ（配列番号７から１２）を使用した。
【００６１】
【表５】
【００６２】
ターゲットモデル検体（配列番号５及び６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号７から１２）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【００６３】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表６の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で６０℃、１６時間接触させることで実施した。
【００６４】
【表６】
【００６５】
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．１２ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【００６６】
データは、プローブＸ、プローブＹのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されている１０箇所のスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を平均して示した。
【００６７】
その結果を図７に示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２０５９０、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は５１４７であった。
【００６８】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は８４０８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２１０２であった。
比較例１
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００６９】
その結果を図８Ａに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５８１８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は９０７４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４であった。
【００７０】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１６８５３、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は３８７１であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４であった。
【００７１】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例１に比較して高かったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度がそれ以上の割合で高く、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例に比較して極めて低い値となった。これは、ブロッキング核酸を使用しない状態では、多くのクロスハイブリ核酸がプローブ核酸とハイブリダイゼーションを形成してしまい、高い特異性が得られないことを示している。
比較例２
ブロッキング核酸として、表５に記載の配列番号５及び配列番号６で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる６０塩基のものを使用した。それ以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００７２】
その結果を図８Ｂに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５８５、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は８９６であった。
【００７３】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１４８８、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は３７２であった。
【００７４】
本比較例においては、使用したブロッキング核酸の長さがプローブ核酸と同一であるため、ハイブリダイゼーションの効率が、ターゲットモデル検体と変わらない。そのため、ブロッキング核酸が、ターゲットモデル検体とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション形成をも競合阻害してしまい、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度が極めて低くなる。クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度についてはほとんど検出されないが、ターゲットモデル検体のシグナル強度が大幅に低くなる分、実施例１と比較して、ターゲット／クロスハイブリ比が低くなった。
比較例３
ブロッキング核酸として、表７に記載の５０塩基長のもの（配列番号１３、１４）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの６塩基目から、５５塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００７５】
その結果を図８Ｃに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１０９３２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２７３３であった。
【００７６】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３４７４、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は８６９であった。
【００７７】
本比較例においては、使用したブロッキング核酸の長さがプローブ核酸よりも１０塩基短い（ブロッキング核酸とプローブ核酸の長さが均等ではない）ため、先の比較例２に比較してターゲットモデル検体とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション形成はしやすい。しかしながら、実施例１で使用したブロッキング核酸に比較して、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度は低く、そのため、ターゲット／クロスハイブリ比も低い値となった。
【００７８】
【表７】
【００７９】
比較例４
ブロッキング核酸として、表８に記載の４０塩基長のもの（配列番号１５、１６）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１１塩基目から、５０塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００８０】
その結果を図８Ｄに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２５２０２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は２６３であり、ターゲット／クロスハイブリ比は９６であった。
【００８１】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１２４１６、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は２６であり、ターゲット／クロスハイブリ比は４７１であった。
【００８２】
用いたブロッキング核酸の鎖長は４０塩基であるが、本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
【００８３】
【表８】
【００８４】
比較例５
ブロッキング核酸として、表９に記載された３０塩基長のもの（配列番号１７、１８）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１６塩基目から、４５塩基目までの配列で構成されている。ブロッキング核酸以外は、実施例１と同様の手順にて実施した。
【００８５】
その結果を図９Ａに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は３５０３７、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は３４５９であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１０であった。
【００８６】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１６６４１、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は９４６であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１８であった。
【００８７】
この結果は、比較例４と同様に、ターゲットモデル検体由来のシグナル強度に比較して、クロスハイブリ検体由来のシグナルが多く検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
【００８８】
【表９】
【００８９】
比較例６
ブロッキング核酸として、表１０に記載の３０塩基長のもの（配列番号１９、２０、２１、２２）を使用した。これらの配列は、配列番号５、配列番号６それぞれの１塩基目から、３０塩基目まで及び、３１塩基目から６０塩基目の配列で構成されている。使用したブロッキング核酸以外は実施例１と同様の手順にて実施した。
【００９０】
その結果を図９Ｂに示す。プローブＸについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は２５７１２、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は１７９であり、ターゲット／クロスハイブリ比は１４４であった。
【００９１】
プローブＹについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は１１４３９、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は４４であり、ターゲット／クロスハイブリ比は２６０であった。
【００９２】
ここで用いたブロッキング核酸は、１本の６０塩基長のプローブ核酸に対して、２本の３０塩基長のブロッキング核酸を用い、プローブ核酸の全配列をブロッキングしている。プローブ核酸の全配列をブロッキングできるという点では、実施例１や、比較例２と同一であるが、実施例１に対してターゲット／クロスハイブリ比は低い値であった。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
実施例１、比較例２〜６のまとめ
図１０に、実施例と比較例を同一グラフ上にプロットした。図１０において、パネルＡはプローブＸ、パネルＢはプローブＹにおける結果をまとめた図である。その結果、実施例におけるターゲット／クロスハイブリ比が他の何れの比較例に比べても、きわめて高かった。以上により、本実施例におけるブロッキング核酸が、比較例にて使用したブロッキング核酸に比較してプローブ核酸の特異性を向上させることを証明した。
実施例２
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１１に示す配列番号２３番および２４番で示されるオリゴヌクレオチド（３０塩基長）を合成した。
【００９５】
実施例１と同様にして５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【００９６】
【表１１】
【００９７】
プローブＡの１〜１５番目及び１６〜３０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＢについても同様である。
【００９８】
そのほかは実施例１
と同様にして、核酸アレイを作製した。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【００９９】
まず、表１１に示す配列番号２７および配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【０１００】
配列番号２７で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の完全相補鎖（３０塩基）のうち、５末端側の１５塩基と、３末端側の１５塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２４の完全相補鎖（３０塩基）のうち、５末端側の１５塩基と、３末端側の１５塩基を入れ替えた構造から構成される。
【０１０１】
配列番号２７については、配列番号２３のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号２８については、配列番号２４のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ａ−３０及びＢ−３０において、第１〜１５番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、１６〜３０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表１２に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で６０℃、１６時間接触させた。
【０１０２】
【表１２】
【０１０３】
接触後の核酸アレイは、０．２４Ｍ ＴＮＴバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．２４Ｍ ＴＮバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．２４Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【０１０４】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表１１に記載の配列番号２５及び配列番号２６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１０５】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号２９及び配列番号３０で示される１５塩基のオリゴヌクレオチドを使用した。
ターゲットモデル検体（配列番号２５及び２６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号２９及び３０）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【０１０６】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表１３の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で６０℃、１６時間接触させることで実施した。洗浄はブロッキング核酸接触後と同様の方法にて実施した。
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．２４ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【０１０９】
データは、プローブＡ、プローブＢのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されているスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を示した。
【０１１０】
その結果を図１１に示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は166516、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2964であり、ターゲット／クロスハイブリ比は56であった。
【０１１１】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は89108、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2054であり、ターゲット／クロスハイブリ比は43であった。
比較例７
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１１２】
その結果を図１２Ａに示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は159204、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は10850であり、ターゲット／クロスハイブリ比は15であった。
【０１１３】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ
６４７）のシグナル強度は85560、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は8484であり、ターゲット／クロスハイブリ比は10であった。
【０１１４】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例２と同程度であったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度がそれ以上の割合で高く、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例に比較して極めて低い値となった。これは、ブロッキング核酸を使用しない状態では、多くのクロスハイブリ核酸がプローブ核酸とハイブリダイゼーションを形成してしまい、高い特異性が得られないことを示している。
比較例８
ブロッキング核酸として、表１１に記載の配列番号２９及び配列番号３０で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる１５塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１１５】
その結果を図１２Ｂに示す。プローブＡについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は166700、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は3476であり、ターゲット／クロスハイブリ比は48であった。
【０１１６】
プローブＢについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は94244、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は2900であり、ターゲット／クロスハイブリ比は32であった。
【０１１７】
用いたブロッキング核酸の鎖長は１５塩基であった。本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが実施例２に比較して高く検出された。
実施例２、比較例７、比較例８のまとめ
図１３に、実施例２、比較例７、比較例８の結果をまとめた。図１３において、パネルＡはプローブＡ、パネルＢはプローブＢにおける結果をまとめた図である。３０塩基長のプローブＡ、プローブＢを用いた場合においても、実施例に記載の方法は比較例に記載の方法に比較して特異性の高いデータが得られることが明らかとなった。
実施例３
核酸アレイの作製
核酸アレイを作製するために、表１４に示す配列番号３１番および３２番で示されるオリゴヌクレオチド（２０塩基長）を合成した。
【０１１８】
実施例１と同様にして５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これをプローブ核酸とした。
【０１１９】
【表１４】
【０１２０】
プローブＣの１〜１０番目及び１１〜２０番目の塩基は、それぞれ、図１において塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２に相当する。プローブＤについても同様である。
【０１２１】
そのほかは実施例１と同様にして、核酸アレイを作製した。
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの作製
次に、ブロッキング核酸であるオリゴヌクレオチドを設計し、上記で作製した核酸アレイに混合して、ブロッキング核酸混合済み核酸アレイを作製することとした。
【０１２２】
まず、表１４に示す配列番号３３および配列番号３４で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、これらをブロッキング核酸とした。
【０１２３】
配列番号３３で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３１の完全相補鎖（２０塩基）のうち、５末端側の１０塩基と、３末端側の１０塩基を入れ替えた構造から構成される。また、配列番号３４で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３２の完全相補鎖（２０塩基）のうち、５末端側の１０塩基と、３末端側の１０塩基を入れ替えた構造から構成される。
配列番号３３については、配列番号３１のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となり、配列番号３４については、配列番号３２のプローブ核酸に対するブロッキング核酸となる。すなわち、Ｃ−２０Ｔ及びＤ−２０Ｔにおいて、第１〜１０番目の塩基は、図１の核酸Ａをプローブ核酸、核酸Ｂをブロッキング核酸とした場合の塩基配列Ａ１’に相当し、１１〜２０番目の塩基は塩基配列Ａ２’に相当する。作製したブロッキング核酸を、核酸アレイに既に固定化されているプローブ核酸と混合するために、表１２に記載の溶液を作製し、核酸アレイと共に密封した状態で５０℃、１６時間接触させた。
接触後の核酸アレイは、０．２４Ｍ ＴＮＴバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 水溶液）、０．２４Ｍ ＴＮバッファー（０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２４Ｍ ＮａＣｌ水溶液）でそれぞれ洗浄し、その後、０．２４Ｍ ＴＮバッファーに浸漬した状態で、４℃、遮光で保管した。
【０１２４】
以上により、ブロッキング核酸が所定のプローブ核酸に対して混合されてなる「ブロッキング核酸混合済みプローブ核酸」が搭載された「ブロッキング核酸混合済み核酸アレイ」が完成した。
モデル検体の作製とハイブリダイゼーション
ブロッキング核酸混合済み核酸アレイの特異性評価に使用するモデル検体を作製した。
【０１２５】
プローブ核酸の検出対象（ターゲットモデル検体）としては、２種類のプローブ核酸に対して完全相補配列である、表１４に記載の配列番号３５及び配列番号３６のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１２６】
また、プローブ核酸の非検出対象（クロスハイブリモデル検体）としては、配列番号３７及び配列番号３８で示される１０塩基のオリゴヌクレオチドを使用した。
ターゲットモデル検体（配列番号３５及び３６）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（インビトロジェン社製）を使用して標識を行い、クロスハイブリモデル検体（配列番号３７及び３８）については、ＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）を使用して標識した。すなわち、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体を異なる標識物質にて標識し、ターゲットモデル検体とクロスハイブリモデル検体の混合物を核酸アレイにハイブリダイゼーションした場合においても、同一のプローブ核酸位置においてそれぞれを同時に独立に検出できるようにした。
【０１２７】
標識を行ったそれぞれのターゲットモデル検体及びクロスハイブリモデル検体について、表１３の組成となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したブロッキング核酸混合済み核酸アレイに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは核酸アレイとハイブリダイゼーション溶液を密封した状態で５０℃、１６時間接触させることで実施した。洗浄はブロッキング核酸接触後と同様の方法にて実施した。
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、核酸アレイを０．２４ＭのＴＮバッファー中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【０１２８】
データは、プローブＣ、プローブＤのシグナル共に、核酸アレイ上に搭載されているスポットで検出された、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７に由来する蛍光シグナルおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６に由来する蛍光シグナルの値を示した。
【０１２９】
その結果を図１４に示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は23456、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は558であり、ターゲット／クロスハイブリ比は42であった。
【０１３０】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1728、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は156であり、ターゲット／クロスハイブリ比は11であった。
【０１３１】
比較例９
ブロッキング核酸を混合しない核酸アレイを用い、それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３２】
その結果を図１５Ａに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は21712、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は6751であり、ターゲット／クロスハイブリ比は3であった。
【０１３３】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1432、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は1045であり、ターゲット／クロスハイブリ比は1であった。
【０１３４】
ターゲットモデル検体のシグナル強度は、実施例３と同程度であったが、クロスハイブリモデル検体由来のシグナル強度は実施例３に比較して高いため、ターゲット／クロスハイブリ比としては、実施例３に比較して極めて低い値となった。
比較例１０
ブロッキング核酸として、表１４に記載の配列番号３７及び配列番号３８で示される、プローブ核酸の相補配列からなる１０塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３５】
その結果を図１５Ｂに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は19480、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は521であり、ターゲット／クロスハイブリ比は37であった。
【０１３６】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は1380、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は213であり、ターゲット／クロスハイブリ比は6であった。
【０１３７】
用いたブロッキング核酸の鎖長は１０塩基であるが、本条件においては、クロスハイブリ検体由来のシグナルが検出されるため、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
比較例１１
ブロッキング核酸として、表１４に記載の配列番号３５及び配列番号３６で示される、プローブ核酸の完全相補配列からなる２０塩基のものを使用した。それ以外は実施例２と同様の手順にて実施した。
【０１３８】
その結果を図１５Ｃに示す。プローブＣについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は3656、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は386であり、ターゲット／クロスハイブリ比は9であった。
【０１３９】
プローブＤについては、ターゲットモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）のシグナル強度は752、クロスハイブリモデル検体由来の蛍光（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５４６）のシグナル強度は122であり、ターゲット／クロスハイブリ比は6であった。
【０１４０】
用いたブロッキング核酸の鎖長は２０塩基であるが、本条件においては、ターゲットモデル検体の鎖長と同一であるため、ターゲットモデル検体のハイブリダイゼーションの効率が著しく低下し、シグナル強度が大幅に低下する。その結果、ターゲット／クロスハイブリ比の値が低下する。
実施例３、比較例９、比較例１０、比較例１１のまとめ
図１６に、実施例３、比較例９、比較例１０、比較例１１の結果をまとめた。図１６において、パネルＡはプローブＣ、パネルＢはプローブＤにおける結果をまとめた図である。２０塩基長のプローブＣ、プローブＤを用いた場合においても、実施例に記載の方法は比較例に記載の方法に比較して特異性の高いデータが得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の低減を防ぎ、多型解析だけでなく、発現解析に使用することも可能な核酸組成物及び核酸アレイが提供される。
【符号の説明】
【０１４２】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１〜38：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている核酸アレイ。
【請求項３】
塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂのいずれか一方の核酸を担体にアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む、核酸アレイの製造方法であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸アレイの製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸組成物又は請求項２に記載の核酸アレイとターゲット核酸とを接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、ターゲット核酸の検出方法。
【請求項１】
塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂが混合された核酸組成物であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸組成物がアドレス可能に担体に配置された核酸アレイであって、核酸Ａ及びＢの何れか一方が担体上に固定化されている核酸アレイ。
【請求項３】
塩基配列Ａ１とＡ２とが連結してなる核酸Ａ、及び前記塩基配列Ａ１及びＡ２にそれぞれ相補的である塩基配列Ａ１’とＡ２’とが連結してなる核酸Ｂのいずれか一方の核酸を担体にアドレス可能に固定化させた後、他方の核酸を混合させる工程を含む、核酸アレイの製造方法であって、前記塩基配列Ａ１の３’末端に前記塩基配列Ａ２の５’末端が連結し、前記塩基配列Ａ２’の５’末端に前記塩基配列Ａ１’の３’末端が連結されている、核酸アレイの製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸組成物又は請求項２に記載の核酸アレイとターゲット核酸とを接触させ、ターゲット核酸のシグナルを検出する工程を含む、ターゲット核酸の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−２８４１５９（Ｐ２０１０−２８４１５９Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０５３９（Ｐ２０１０−１１０５３９）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]