環境ストレス抵抗性植物作成用組換えベクター
【課題】
作付時に外部からの薬剤を必要とせず、特定遺伝子の過剰発現を行わずに、環境ストレス抵抗性植物を提供し、その再分化培地を提供すること。
【解決手段】ポリADPリボースポリメラーゼをアンチセンス方向で植物個体に挿入することにより、植物体内における遺伝子損傷の際のエネルギー恒常性を向上させ、さらに再分化の際にZeatinとIAAを含む培地で生育することにより、環境ストレス抵抗性植物を提供できる。
作付時に外部からの薬剤を必要とせず、特定遺伝子の過剰発現を行わずに、環境ストレス抵抗性植物を提供し、その再分化培地を提供すること。
【解決手段】ポリADPリボースポリメラーゼをアンチセンス方向で植物個体に挿入することにより、植物体内における遺伝子損傷の際のエネルギー恒常性を向上させ、さらに再分化の際にZeatinとIAAを含む培地で生育することにより、環境ストレス抵抗性植物を提供できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ストレス抵抗性植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、自力で移動することができないため、乾燥、塩、低温などの環境要因によって生育が大きく左右される。これらは農業生産と関わっており、環境ストレス抵抗性を付与した農作物の開発は、世界の農業生産効率を向上させる技術として期待されている。地球人口の増大等に鑑み、食料自給率の低下等の食糧問題の対策として、従来、植物の生育が不可能であった場所における上記のような植物生産の道は、この食糧問題を解決する方策となる。
【０００３】
植物に環境ストレス抵抗性を付与するために、酵母細胞壁の酵素分解物を含む薬剤組成物が知られている（特許文献１）。
【０００４】
また、乾燥、高塩濃度、低温等を含む各種の環境ストレス条件下に対して高い抵抗性を付与するために、ｓＨＳＰ１７．７遺伝子（熱ショックタンパク質）を利用して植物に環境ストレス抵抗性を付与する例が知られている（特許文献２）
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−０４５７０９号公報
【特許文献２】特開２００６−０３４２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載の技術は、植物作付時に薬剤を必要とするため、薬剤がない場合、植物そのものを環境ストレス負荷がかかる土地に作付することができない。
【０００７】
さらに、上記特許文献２に記載の技術は、細胞に熱ショックタンパク質遺伝子を導入していることから、複数の環境に対応できる場合があるものの、細胞産物の発現低下等の影響が懸念される。
これらの課題を解決するため、遺伝子損傷の際、エネルギー恒常性を高める目的でポリＡＤＰリボシル化を抑制することが行われている。具体的には、シロイヌナズナにおいてポリＡＤＰリボースポリメラーゼ［Poly (ADP-ribose) polymerase ; PARP］を種々の阻害剤を用いて抑制している研究がある。（非特許文献１）
【０００８】
【非特許文献１】MarcDe Blockら、Plant. J., No.41, p95-106
【０００９】
植物は、環境ストレスを受けた際に遺伝子損傷を修復するために過剰なＮＡＤを消費することが知られている。このＮＡＤ消費の原因となっているＰＡＲＰ遺伝子の発現を、阻害剤でなくＲＮＡｉ法により抑制する方法が考えられる。この方法であれば、環境ストレスに起因する内部エネルギーの浪費から細胞を保護することができるため、あらゆる環境ストレスに対して抵抗性を持つと考えられる。しかしながら、ある遺伝子を恒久的に抑制する方法については、植物では例が少なかった。また、トランスジェニック植物を効率よく再分化させるための培地は、知られていなかった。
【００１０】
本発明は、発明者らの研究の結果、特定遺伝子の過剰発現を行わずに、かつ、作付時に薬剤を必要としない環境ストレス抵抗性植物の製造法を提供するとともに、効率的にトランスジェニック植物を再分化できる培地を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子断片を含むＲＮＡｉ法によるトランスジェニック植物を作成ことにより、ＲＮＡｉの干渉効果で植物体内における遺伝子損傷の際のエネルギー恒常性を向上させ、引いては環境ストレス抵抗性を提供できることを見出した。
【００１２】
本発明は、
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
さらに、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する上記の植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有するＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、上記に記載のいずれかの組換えベクターにより形質転換することを特徴とする環境ストレス抵抗性植物の製造法に関する。
さらに、上記に記載のいずれかの組換えベクターにより形質転換された環境ストレス抵抗性植物に関する。
また、環境ストレスが、乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、病害ストレス、および浸透圧ストレスからなる群から選ばれる複数個からなる上記に記載の環境ストレス抵抗性植物に関する。
さらに、植物が、イネ科、ユリ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、およびヤナギ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物に関する。
また、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地に関する。
さらに、１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌのゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）および／または０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を含有する、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、特段の薬剤を使うことなく、更には、複合環境ストレス（乾燥・浸透圧・低温等）のもとにおいても生育する植物を生育できる環境ストレス抵抗性植物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための最良の形態につき、以下に示す図面も含め説明する。なお、本発明は異なる多くの態様での実施が可能である。
【００１５】
１．遺伝子のクローニング
本発明の一態様としての遺伝子は、乾燥・浸透圧・低温等の環境ストレスにより活性化され、ＤＮＡ損傷を発見すると、ＮＡＤを基質としてＡＤＰリボースのポリマーを合成して、ヒストンを修飾する機能を有するものが挙げられ、例えば、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が挙げられ、配列表２に示したイネのＰＡＲＰが好ましい。
【００１６】
本発明の一態様としての遺伝子のクローニングは、例えば以下のようにして行う。
ｍＲＮＡの供給源としては、葉、茎、根、花など植物体の一部または植物体全体が挙げられる。また、種子を１／２ＭＳ培地、ＧＭ培地などの固体培地に播種し、無菌条件化で生育させた植物体も用いることができる。
【００１７】
ｍＲＮＡの抽出は、例えば１／２ＭＳ培地で生育させた植物体を、液体窒素で凍結する。その後、通常の方法に従えばよく、例えば、凍結した植物体を乳鉢などで磨砕後、得られた磨砕物から、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法、グリオキザール法、グアニジンチオシナネート-塩化セシウム法などにより、粗ＲＮＡ領域を抽出調整する。なお、ＲＮＡ抽出にあたり、市販のキットを用いても良い。
【００１８】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型として、逆転写ＰＣＲを行い、ＰＡＲＰを含有する領域のｃＤＮＡを増幅する。
【００１９】
ここで、得られた目的とするクローンのｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、自動塩基配列決定装置を用いて配列決定を行うが、通常の高知の方法であるマキサム-ギルバートの化学修飾法、またはジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知の手法によって配列決定を行っても良い。
【００２０】
なお、生物の遺伝子は、同じ機能を果たすものでも、各種間、または各個体毎に、その塩基配列はある程度相違することがある。
そのため、上記ＤＮＡ塩基配列と同一の配列を有する塩基配列と同一でなくとも、本発明に係るＤＮＡは、これが導入された宿主細胞にエネルギー恒常性という機能に関与していればよい。さらに、ＲＮＡ緩衝作用によりその機能を減弱および／または失活すればよい。よって、ＲＮＡｉ発現ベクター中に組み込むＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。また、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。さらに、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、好ましくは１００ｂｐから３ｋｂ、さらに好ましくは２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。
また、配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で、好ましくは１００ｂｐから３ｋｂ、さらに好ましくは２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有するＤＮＡであればよい。あるいは、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであっても良い。
配列表２に、イネのＰＡＲＰ遺伝子配列を示した。本発明の実施例に用いたトマトの該遺伝子は今だ単離されていない。しかし、トウモロコシ、アラビドプシス、ヒトの該遺伝子とは、それぞれ８６．７％、７０．６％、５６．３％と比較的高い相同性を有していることから、高度に保存されたい遺伝ｈ氏と考えられる。
【００２１】
２．組換えベクター及び形質転換植物の作製
本発明の一形態に係る組換えベクターは、上記遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここでベクターとしては、
例えば、λファージ等のファージＤＮＡや、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌用プラスミドＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌プラスミドＤＮＡ、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母用プラスミドＤＮＡ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩＧ、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ等のバイナリーベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡ、またはｐＭＯＮ２００、ｐＮＣＡＴ等の中間ベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２２】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ―ＲＢ）間に目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＬＢＡ４４０４等にトリファレンタルメルティング法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質転換に用いても良い。
【００２３】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを採用しても構わない。
【００２４】
さらに、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが望ましく、ベクターには上記遺伝子の上流、内部、または下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選抜マーカー遺伝子等を連結することが可能で、かつ望ましいと考える。
【００２５】
ここで、プロモーターとは、上記ＤＮＡを発現させることができるものであればどのようなものでもよく、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌やファージに由来するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等のほか、これらのプロモーターを人為的に改変して得られたｔａｃプロモーター等のプロモーターを用いることもできる。酵母を宿主とする場合には、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸプロモーター等が好ましい。また、植物細胞を宿主とする場合は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓプロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
エンハンサーとは、例えば目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域等が挙げられる。
【００２７】
ターミネーターとは、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば良く、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター等が挙げられる
【００２８】
選抜マーカーとは、組換え遺伝子を含む宿主をスクリーニングできれば良く、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐｒ遺伝子）、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII遺伝子）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ遺伝子）等が挙げられる。
【００２９】
３．形質転換植物の作成
本発明の形質転換植物は、上記２の組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を作成することができる。
【００３０】
形質転換の際の宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）Ｈｍｓ１７４株、Ｋ１２株、ＤＨ１株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ１ １１４株、２０７−２１株、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株、ＬＢＡ４４０４株、ＥＨＡ１０１株、ＥＨＡ１０５株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母類等であれば、本発明の一形態に係る形質転換細胞を取得することができる。
【００３１】
形質転換植物体を作製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、カルシウムイオン法、凍結融解法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合等がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドを持つアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）やカルスに感染させる方法を採用することができるが、これに限定されるわけではない。
【００３２】
目的遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲ後に増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色を行い、増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００３３】
または、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の上流域または下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
【００３４】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれであってもよい。単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物を挙げることができ、双子葉植物としては、例えば、アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等）、ウリ科（キュウリ、メロン、カボチャ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、ミツバ等）、キク科（レタス等）、アオイ科（ワタ、オクラ等）、アカザ科（シュガービート、ホウレンソウ等）、ヤナギ科（ポプラ等）に属する植物が挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、これらの中でも、トマト、イネ等が特に好ましく用いられる。
【００３５】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、葉、茎、種子、胚、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明において、形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官、植物組織、植物培養細胞のいずれをも意味するものとする。
【００３７】
形質転換の対象となる植物材料として植物組織を用いた場合、これらを炭素源、無機塩類、ビタミン、エネルギー源としての糖類を加えて、発芽させ、一定期間生育を行う。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムをそれぞれ組み合わせることができる。
【００３８】
形質転換体の再分化にあたり、植物ホルモンを使用することもできる。植物ホルモンは、サイトカイニン、オーキシン、ジベレリン、エチレン等に分けられるが、このうちサイトカイニン、オーキシンを組み合わせて使用することが望ましい。
【００３９】
サイトカイニンは、植物細胞の分裂を誘導するものであれば良く、Ｚｅａｔｉｎ（ゼアチン）、Ｋｉｎｅｔｉｎ（カイネチン）、Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ベンジルアデニン）、Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ（チジアズロン）等が挙げられるが、中でもＺｅａｔｉｎを使用することが望ましい。
【００４０】
Ｚｅａｔｉｎの使用量は、培地中のオーキシン濃度にも依存するが、１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌの範囲内であれば良く、１．０ｍｇ／Ｌ〜２．０ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
【００４１】
オーキシンとは、細胞伸長速度を制御することができれば良く、ＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、ＩＢＡ（インドール酪酸）、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、２,４−Ｄ（２,４−ジクロロフェノキシ酢酸）等が挙げられるが、ＩＡＡを使用することが好ましい。
【００４２】
ＩＡＡの使用量は、培地中のオーキシン濃度にも依存するが、０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌの範囲内であれば良く、０ｍｇ／Ｌ〜０．１ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。なお、本実施例に本発明は限定されるものではない。
【００４４】
（１) ＰＡＲＰ遺伝子のクローニング
イネ日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ. ｃｖ.ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）から全ＲＮＡを抽出し、これをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用し、オリゴｄＴプライマーとして逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマー５’-CTGAGATGCCCCTGGGTAAACTAA-３’と、アンチセンスプライマー５’-ACGGTTTTGCCTAAGCCCTTGGTC−３’を用いてＰＣＲを行い、ＰＡＲＰのｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃
３分、（９４℃ １分、５６℃ １分、７２℃ １分）×３５サイクル、７２℃ １０分、の後、２０℃で維持した。増幅後、電気泳動でバンドサイズを確認した。さらに、全自動塩基配列解析装置で塩基配列の解析を行い、目的の領域が正常に増幅されていることを確認した。
【００４５】
（２) 植物形質転換用プラスミドの構築
ＰＡＲＰのｃＤＮＡ断片をＸｂａＩとＳｐｅI〔以下、本領域をＰＡＲＰ１とする。（図１）〕、ＸｈｏＩとＳａｃＩ（以下、本領域をＰＡＲＰ２とする）それぞれの制限酵素で処理し、ｐＵＩＧ２２１ベクターに挿入して、アンチセンスＰＡＲＰベクターを構築した。（図２）
【００４６】
ＰＡＲＰ１とＰＡＲＰ２を含むアンチセンスＰＡＲＰベクターをアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株にトリファレンタルメイティング法により導入し、形質転換用アグロバクテリウムを得た。（図３）
【００４７】
（３) マイクロトマトの形質転換
形質転換には、播種後約３週間のマイクロトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ
ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ）を、子葉、本葉、胚軸に分け、使用した。形質転換後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む培地で選抜し、本葉と胚軸で、複数のＰＡＲＰ形質転換体を得ることに成功した。
【００４８】
（４）形質転換体の再分化
得られたＰＡＲＰ形質転換体の再分化にあたり、植物ホルモンＺｅａｔｉｎ（ゼアチン）および／またはＩＡＡ（インドール−３―酢酸）を含む培地（表１）に置床し、約一ヶ月間観察を行ったところ、Ｚｅａｔｉｎ １．０ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌまたは、Ｚｅａｔｉｎ ２．０ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌを含む培地で、良好な生育を観察した。（表１における試験区Ｂ−５が図４に、表１における試験区Ｂ−８が図５に対応）
【表１】
【発明の産業上の利用可能性】
【００４９】
環境ストレス抵抗性を持つ植物と、その初期再分化培地として、産業上の利用可能性を大きく有している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＰＡＲＰ領域の両端を、それぞれＸｂａ１、Ｓｐｅ１で制限酵素処理したものを示す図である。図中、左右両端のレーンはサイズマーカーで、左のレーンから右に、120分、90分、60分および30分制限酵素処理した電気泳動像となる、
【図２】ＰＡＲＰを２箇所挿入したＲＮＡｉ発現ベクターを示す図である。
【図３】トリファレンタルメイティング法により作製した形質転換用アグロバクテリウムバイナリベクターを示す図である。
【図４】形質転換を行ったマイクロトマトの胚軸の様子、カルス由来の不定芽（Zeatin1.0mg/L、IAA0.1mg/L）を示す図である。
【図５】図４と同様な、カルス由来の不定芽（Zeatin2.0mg/L、IAA0.1mg/L）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ストレス抵抗性植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、自力で移動することができないため、乾燥、塩、低温などの環境要因によって生育が大きく左右される。これらは農業生産と関わっており、環境ストレス抵抗性を付与した農作物の開発は、世界の農業生産効率を向上させる技術として期待されている。地球人口の増大等に鑑み、食料自給率の低下等の食糧問題の対策として、従来、植物の生育が不可能であった場所における上記のような植物生産の道は、この食糧問題を解決する方策となる。
【０００３】
植物に環境ストレス抵抗性を付与するために、酵母細胞壁の酵素分解物を含む薬剤組成物が知られている（特許文献１）。
【０００４】
また、乾燥、高塩濃度、低温等を含む各種の環境ストレス条件下に対して高い抵抗性を付与するために、ｓＨＳＰ１７．７遺伝子（熱ショックタンパク質）を利用して植物に環境ストレス抵抗性を付与する例が知られている（特許文献２）
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−０４５７０９号公報
【特許文献２】特開２００６−０３４２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載の技術は、植物作付時に薬剤を必要とするため、薬剤がない場合、植物そのものを環境ストレス負荷がかかる土地に作付することができない。
【０００７】
さらに、上記特許文献２に記載の技術は、細胞に熱ショックタンパク質遺伝子を導入していることから、複数の環境に対応できる場合があるものの、細胞産物の発現低下等の影響が懸念される。
これらの課題を解決するため、遺伝子損傷の際、エネルギー恒常性を高める目的でポリＡＤＰリボシル化を抑制することが行われている。具体的には、シロイヌナズナにおいてポリＡＤＰリボースポリメラーゼ［Poly (ADP-ribose) polymerase ; PARP］を種々の阻害剤を用いて抑制している研究がある。（非特許文献１）
【０００８】
【非特許文献１】MarcDe Blockら、Plant. J., No.41, p95-106
【０００９】
植物は、環境ストレスを受けた際に遺伝子損傷を修復するために過剰なＮＡＤを消費することが知られている。このＮＡＤ消費の原因となっているＰＡＲＰ遺伝子の発現を、阻害剤でなくＲＮＡｉ法により抑制する方法が考えられる。この方法であれば、環境ストレスに起因する内部エネルギーの浪費から細胞を保護することができるため、あらゆる環境ストレスに対して抵抗性を持つと考えられる。しかしながら、ある遺伝子を恒久的に抑制する方法については、植物では例が少なかった。また、トランスジェニック植物を効率よく再分化させるための培地は、知られていなかった。
【００１０】
本発明は、発明者らの研究の結果、特定遺伝子の過剰発現を行わずに、かつ、作付時に薬剤を必要としない環境ストレス抵抗性植物の製造法を提供するとともに、効率的にトランスジェニック植物を再分化できる培地を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子断片を含むＲＮＡｉ法によるトランスジェニック植物を作成ことにより、ＲＮＡｉの干渉効果で植物体内における遺伝子損傷の際のエネルギー恒常性を向上させ、引いては環境ストレス抵抗性を提供できることを見出した。
【００１２】
本発明は、
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
さらに、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する上記の植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有するＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクターに関する。
また、上記に記載のいずれかの組換えベクターにより形質転換することを特徴とする環境ストレス抵抗性植物の製造法に関する。
さらに、上記に記載のいずれかの組換えベクターにより形質転換された環境ストレス抵抗性植物に関する。
また、環境ストレスが、乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、病害ストレス、および浸透圧ストレスからなる群から選ばれる複数個からなる上記に記載の環境ストレス抵抗性植物に関する。
さらに、植物が、イネ科、ユリ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、およびヤナギ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物に関する。
また、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地に関する。
さらに、１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌのゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）および／または０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を含有する、上記に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、特段の薬剤を使うことなく、更には、複合環境ストレス（乾燥・浸透圧・低温等）のもとにおいても生育する植物を生育できる環境ストレス抵抗性植物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための最良の形態につき、以下に示す図面も含め説明する。なお、本発明は異なる多くの態様での実施が可能である。
【００１５】
１．遺伝子のクローニング
本発明の一態様としての遺伝子は、乾燥・浸透圧・低温等の環境ストレスにより活性化され、ＤＮＡ損傷を発見すると、ＮＡＤを基質としてＡＤＰリボースのポリマーを合成して、ヒストンを修飾する機能を有するものが挙げられ、例えば、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が挙げられ、配列表２に示したイネのＰＡＲＰが好ましい。
【００１６】
本発明の一態様としての遺伝子のクローニングは、例えば以下のようにして行う。
ｍＲＮＡの供給源としては、葉、茎、根、花など植物体の一部または植物体全体が挙げられる。また、種子を１／２ＭＳ培地、ＧＭ培地などの固体培地に播種し、無菌条件化で生育させた植物体も用いることができる。
【００１７】
ｍＲＮＡの抽出は、例えば１／２ＭＳ培地で生育させた植物体を、液体窒素で凍結する。その後、通常の方法に従えばよく、例えば、凍結した植物体を乳鉢などで磨砕後、得られた磨砕物から、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法、グリオキザール法、グアニジンチオシナネート-塩化セシウム法などにより、粗ＲＮＡ領域を抽出調整する。なお、ＲＮＡ抽出にあたり、市販のキットを用いても良い。
【００１８】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型として、逆転写ＰＣＲを行い、ＰＡＲＰを含有する領域のｃＤＮＡを増幅する。
【００１９】
ここで、得られた目的とするクローンのｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、自動塩基配列決定装置を用いて配列決定を行うが、通常の高知の方法であるマキサム-ギルバートの化学修飾法、またはジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知の手法によって配列決定を行っても良い。
【００２０】
なお、生物の遺伝子は、同じ機能を果たすものでも、各種間、または各個体毎に、その塩基配列はある程度相違することがある。
そのため、上記ＤＮＡ塩基配列と同一の配列を有する塩基配列と同一でなくとも、本発明に係るＤＮＡは、これが導入された宿主細胞にエネルギー恒常性という機能に関与していればよい。さらに、ＲＮＡ緩衝作用によりその機能を減弱および／または失活すればよい。よって、ＲＮＡｉ発現ベクター中に組み込むＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。また、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。さらに、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、好ましくは１００ｂｐから３ｋｂ、さらに好ましくは２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子の発現低下機能を有するものであればよい。
また、配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で、好ましくは１００ｂｐから３ｋｂ、さらに好ましくは２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有するＤＮＡであればよい。あるいは、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであっても良い。
配列表２に、イネのＰＡＲＰ遺伝子配列を示した。本発明の実施例に用いたトマトの該遺伝子は今だ単離されていない。しかし、トウモロコシ、アラビドプシス、ヒトの該遺伝子とは、それぞれ８６．７％、７０．６％、５６．３％と比較的高い相同性を有していることから、高度に保存されたい遺伝ｈ氏と考えられる。
【００２１】
２．組換えベクター及び形質転換植物の作製
本発明の一形態に係る組換えベクターは、上記遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここでベクターとしては、
例えば、λファージ等のファージＤＮＡや、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌用プラスミドＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌プラスミドＤＮＡ、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母用プラスミドＤＮＡ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩＧ、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ等のバイナリーベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡ、またはｐＭＯＮ２００、ｐＮＣＡＴ等の中間ベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２２】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ―ＲＢ）間に目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＬＢＡ４４０４等にトリファレンタルメルティング法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質転換に用いても良い。
【００２３】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを採用しても構わない。
【００２４】
さらに、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが望ましく、ベクターには上記遺伝子の上流、内部、または下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選抜マーカー遺伝子等を連結することが可能で、かつ望ましいと考える。
【００２５】
ここで、プロモーターとは、上記ＤＮＡを発現させることができるものであればどのようなものでもよく、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌やファージに由来するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等のほか、これらのプロモーターを人為的に改変して得られたｔａｃプロモーター等のプロモーターを用いることもできる。酵母を宿主とする場合には、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸプロモーター等が好ましい。また、植物細胞を宿主とする場合は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓプロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
エンハンサーとは、例えば目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域等が挙げられる。
【００２７】
ターミネーターとは、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば良く、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター等が挙げられる
【００２８】
選抜マーカーとは、組換え遺伝子を含む宿主をスクリーニングできれば良く、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐｒ遺伝子）、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII遺伝子）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ遺伝子）等が挙げられる。
【００２９】
３．形質転換植物の作成
本発明の形質転換植物は、上記２の組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を作成することができる。
【００３０】
形質転換の際の宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）Ｈｍｓ１７４株、Ｋ１２株、ＤＨ１株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ１ １１４株、２０７−２１株、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株、ＬＢＡ４４０４株、ＥＨＡ１０１株、ＥＨＡ１０５株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母類等であれば、本発明の一形態に係る形質転換細胞を取得することができる。
【００３１】
形質転換植物体を作製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、カルシウムイオン法、凍結融解法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合等がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドを持つアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）やカルスに感染させる方法を採用することができるが、これに限定されるわけではない。
【００３２】
目的遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲ後に増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色を行い、増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００３３】
または、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の上流域または下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
【００３４】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれであってもよい。単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物を挙げることができ、双子葉植物としては、例えば、アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等）、ウリ科（キュウリ、メロン、カボチャ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、ミツバ等）、キク科（レタス等）、アオイ科（ワタ、オクラ等）、アカザ科（シュガービート、ホウレンソウ等）、ヤナギ科（ポプラ等）に属する植物が挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、これらの中でも、トマト、イネ等が特に好ましく用いられる。
【００３５】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、葉、茎、種子、胚、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明において、形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官、植物組織、植物培養細胞のいずれをも意味するものとする。
【００３７】
形質転換の対象となる植物材料として植物組織を用いた場合、これらを炭素源、無機塩類、ビタミン、エネルギー源としての糖類を加えて、発芽させ、一定期間生育を行う。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムをそれぞれ組み合わせることができる。
【００３８】
形質転換体の再分化にあたり、植物ホルモンを使用することもできる。植物ホルモンは、サイトカイニン、オーキシン、ジベレリン、エチレン等に分けられるが、このうちサイトカイニン、オーキシンを組み合わせて使用することが望ましい。
【００３９】
サイトカイニンは、植物細胞の分裂を誘導するものであれば良く、Ｚｅａｔｉｎ（ゼアチン）、Ｋｉｎｅｔｉｎ（カイネチン）、Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ベンジルアデニン）、Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ（チジアズロン）等が挙げられるが、中でもＺｅａｔｉｎを使用することが望ましい。
【００４０】
Ｚｅａｔｉｎの使用量は、培地中のオーキシン濃度にも依存するが、１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌの範囲内であれば良く、１．０ｍｇ／Ｌ〜２．０ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
【００４１】
オーキシンとは、細胞伸長速度を制御することができれば良く、ＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、ＩＢＡ（インドール酪酸）、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、２,４−Ｄ（２,４−ジクロロフェノキシ酢酸）等が挙げられるが、ＩＡＡを使用することが好ましい。
【００４２】
ＩＡＡの使用量は、培地中のオーキシン濃度にも依存するが、０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌの範囲内であれば良く、０ｍｇ／Ｌ〜０．１ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。なお、本実施例に本発明は限定されるものではない。
【００４４】
（１) ＰＡＲＰ遺伝子のクローニング
イネ日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ. ｃｖ.ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）から全ＲＮＡを抽出し、これをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用し、オリゴｄＴプライマーとして逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマー５’-CTGAGATGCCCCTGGGTAAACTAA-３’と、アンチセンスプライマー５’-ACGGTTTTGCCTAAGCCCTTGGTC−３’を用いてＰＣＲを行い、ＰＡＲＰのｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃
３分、（９４℃ １分、５６℃ １分、７２℃ １分）×３５サイクル、７２℃ １０分、の後、２０℃で維持した。増幅後、電気泳動でバンドサイズを確認した。さらに、全自動塩基配列解析装置で塩基配列の解析を行い、目的の領域が正常に増幅されていることを確認した。
【００４５】
（２) 植物形質転換用プラスミドの構築
ＰＡＲＰのｃＤＮＡ断片をＸｂａＩとＳｐｅI〔以下、本領域をＰＡＲＰ１とする。（図１）〕、ＸｈｏＩとＳａｃＩ（以下、本領域をＰＡＲＰ２とする）それぞれの制限酵素で処理し、ｐＵＩＧ２２１ベクターに挿入して、アンチセンスＰＡＲＰベクターを構築した。（図２）
【００４６】
ＰＡＲＰ１とＰＡＲＰ２を含むアンチセンスＰＡＲＰベクターをアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株にトリファレンタルメイティング法により導入し、形質転換用アグロバクテリウムを得た。（図３）
【００４７】
（３) マイクロトマトの形質転換
形質転換には、播種後約３週間のマイクロトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ
ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ）を、子葉、本葉、胚軸に分け、使用した。形質転換後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む培地で選抜し、本葉と胚軸で、複数のＰＡＲＰ形質転換体を得ることに成功した。
【００４８】
（４）形質転換体の再分化
得られたＰＡＲＰ形質転換体の再分化にあたり、植物ホルモンＺｅａｔｉｎ（ゼアチン）および／またはＩＡＡ（インドール−３―酢酸）を含む培地（表１）に置床し、約一ヶ月間観察を行ったところ、Ｚｅａｔｉｎ １．０ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌまたは、Ｚｅａｔｉｎ ２．０ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌを含む培地で、良好な生育を観察した。（表１における試験区Ｂ−５が図４に、表１における試験区Ｂ−８が図５に対応）
【表１】
【発明の産業上の利用可能性】
【００４９】
環境ストレス抵抗性を持つ植物と、その初期再分化培地として、産業上の利用可能性を大きく有している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＰＡＲＰ領域の両端を、それぞれＸｂａ１、Ｓｐｅ１で制限酵素処理したものを示す図である。図中、左右両端のレーンはサイズマーカーで、左のレーンから右に、120分、90分、60分および30分制限酵素処理した電気泳動像となる、
【図２】ＰＡＲＰを２箇所挿入したＲＮＡｉ発現ベクターを示す図である。
【図３】トリファレンタルメイティング法により作製した形質転換用アグロバクテリウムバイナリベクターを示す図である。
【図４】形質転換を行ったマイクロトマトの胚軸の様子、カルス由来の不定芽（Zeatin1.0mg/L、IAA0.1mg/L）を示す図である。
【図５】図４と同様な、カルス由来の不定芽（Zeatin2.0mg/L、IAA0.1mg/L）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項２】
配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する請求項２記載の植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項４】
配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有するＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換することを特徴とする環境ストレス抵抗性植物の製造法。
【請求項６】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換された環境ストレス抵抗性植物。
【請求項７】
環境ストレスが、乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、病害ストレス、および浸透圧ストレスからなる群から選ばれる複数個からなる請求項６に記載の環境ストレス抵抗性植物。
【請求項８】
植物が、イネ科、ユリ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、およびヤナギ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、請求項６または請求項７に記載の環境ストレス抵抗性植物。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか１項に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地。
【請求項１０】
１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌのゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）および／または０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を含有する、請求項６から８のいずれか１項に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地。
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項２】
配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡを含み、細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡが、２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有する請求項２記載の植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項４】
配列番号１で表されるＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の一部で２００ｂｐから１ｋｂのＤＮＡ鎖長を有するＤＮＡの塩基配列の１個または複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列のＤＮＡを含み、かつ細胞への導入により形質転換をもたらすことにより、植物細胞のＰＡＲＰ遺伝子（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ遺伝子）の発現低下機能を有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換することを特徴とする環境ストレス抵抗性植物の製造法。
【請求項６】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換された環境ストレス抵抗性植物。
【請求項７】
環境ストレスが、乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、病害ストレス、および浸透圧ストレスからなる群から選ばれる複数個からなる請求項６に記載の環境ストレス抵抗性植物。
【請求項８】
植物が、イネ科、ユリ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、およびヤナギ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、請求項６または請求項７に記載の環境ストレス抵抗性植物。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか１項に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地。
【請求項１０】
１．０ｍｇ／Ｌ〜３．０ｍｇ／Ｌのゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）および／または０ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を含有する、請求項６から８のいずれか１項に記載の環境ストレス抵抗性植物を再分化させる培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１７８６５３（Ｐ２０１０−１７８６５３Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３９８８（Ｐ２００９−２３９８８）
【出願日】平成２１年２月４日（２００９．２．４）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月４日（２００９．２．４）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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