生体分子を含む測定用試料の調製方法
【課題】測定に充分な量の生体分子を含む測定用試料を生体組織から調製する方法を提供する。
【解決手段】生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程とを含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法。
【解決手段】生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程とを含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織から生体分子を含む測定用試料を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織中に含まれる生体分子、例えば膜タンパク質（例えばチロシンキナーゼなどの酵素）、核タンパク質（ヒストン、ＤＮＡトポイソメラーゼなど）、細胞質タンパク質（サイクリン依存性キナーゼなどの酵素）を測定することにより、その組織が由来する対象（例えばヒト）が罹患している疾患について調べることが知られている。
【０００３】
特開２００７−６１０８８号（特許文献１）は、乳癌患者から採取した細胞塊を、ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心分離により得られた上清を、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）含有測定用試料として用いている。一方、沈殿物にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液を加えて遠心分離を行い、得られた上清を上皮成長因子受容体であるＨＥＲ２含有試料として用いている。
【特許文献１】特開２００７−６１０８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１のような試料の調製方法では、特に遠心分離後の沈殿物から、所望の生体分子を測定に充分な量で含む試料を得ることができない場合があった。また、充分な量の目的分子を含む試料を得るために、生体から採取された組織を二つに分け、細胞質分子を含む試料と、核タンパク質及び／又は膜タンパク質を含む試料とを別々に調製することが考えられる。しかしながら、バイオプシーで採取された組織のように組織自体の量が少ない場合、組織を二つに分け別々に試料を調製することが困難であるという問題があった。
そこで、本発明は、測定に充分な量の生体分子を含む測定用試料を生体組織から調製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、
前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、
前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程と
を含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の測定用試料の調製方法により、生体由来の組織から、測定される物質を充分量含む第１測定用試料及び第２測定用試料を得ることができ、例えば患者の組織中の疾患に関連する物質を効率よく測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法により調製される第１及び第２測定用試料は、測定される物質として組織由来の生体分子を含む。該生体分子は、その存在及び／又は量が疾患に関連することが知られている分子であることが好ましい。
【０００８】
本明細書において、「測定」とは、目的物質の存在を検出すること及びその量を測定することの少なくともいずれか一方を含むことを意図する。
【０００９】
上記の第１測定用試料に含まれる生体分子は、細胞質に含まれる生体分子であることが好ましい。また、第１測定用試料は、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するための試料であることが好ましい。上記の酵素としては、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、Ａｋｔ、及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）などが挙げられ、ＣＤＫがより好ましい。ＣＤＫとしては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７などが挙げられる。中でも、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の少なくとも１つがより好ましい。
【００１０】
上記の第２測定用試料に含まれる生体分子は、細胞膜及び核の少なくともいずれか一方に含まれる生体分子が好ましい。細胞膜に含まれる生体分子としては、膜タンパク質、及び細胞外マトリックスなどが挙げられ、膜タンパク質がより好ましい。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン及びファイブロネクチンなどが挙げられる。膜タンパク質としては、細胞膜に結合している受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、膜型タンパク質分解酵素であるＭＴ１−ＭＭＰなどの酵素が挙げられる。ＲＴＫは、インシュリン受容体（ＩＲ）、インシュリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）などを含む。
上記のＨＥＲとしては、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２などが知られている。本発明において第２測定用試料にＨＥＲ２が含まれることがより好ましい。
【００１１】
上記の核に含まれる分子は、核タンパク質、ＤＮＡなどが挙げられ、核タンパク質がより好ましい。核タンパク質としては、ＤＮＡトポイソメラーゼ、テロメアーゼなどの酵素が挙げられ、なかでもＩＩ型トポイソメラーゼがより好ましい。
【００１２】
本発明の方法は、生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程を含む。この工程は、目的の生体分子の変性、分解などを防ぐために、2〜4℃のような低温で行うことが好ましい。これにより、第１測定用試料を、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するために好適に用いることができる。
上記の生体から採取された組織は、生体（例えばヒト患者）からバイオプシー、外科切除などにより採取されたリンパ節組織、器官、血液などを含む。より好ましくは、上記の組織は、癌細胞を含む。
【００１３】
上記の第１緩衝液は、得られる測定用試料中の測定される生体分子が変性するのを防ぐものであれば特に限定されない。第１緩衝液のpHは、生体分子を変性させたり、生体分子が酵素の場合は失活させたりすることなく、安定した状態で回収できる範囲であれば特に限定されず、好ましくは4.0〜9.0、より好ましくは4.5〜8.5、さらに好ましくは5.0〜8.0である。
【００１４】
第１緩衝液に含まれる緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、MOPS（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、HEPES（２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸）、Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、トリシン（Ｎ−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]グリシン）などが挙げられる。
【００１５】
上記の第１緩衝液は、界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としては、目的の生体分子を可溶化でき、かつ該生体分子を分解又は変性しないものが好ましい。電荷を有する界面活性剤は、生体分子が酵素である場合、酵素に結合して立体構造を変化させる可能性がある。そのため、第１測定用試料を、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するために用いる場合、上記の第１緩衝液に含まれる界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルエーテル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルなどを基本構造として有するものが挙げられる。具体的には、非イオン界面活性剤としては、ノニデットＰ−４０（NP−40、Shell International Petroleum Company Limitedの登録商標）、Triton−X（Union Carbide Chemicals and Plastics Inc.の登録商標）、Tween（ICI Americas Inc.の登録商標）、Brij（ICI Americas Inc.の登録商標）、Emulgen（花王の登録商標）などが挙げられる。第１緩衝液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜３％、さらに好ましくは０．１〜１％である。
【００１６】
上記の第１緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤などを含有してもよい。
【００１７】
プロテアーゼ阻害剤は、細胞に含まれるプロテアーゼによって目的の生体分子が分解されることを防ぐために用いることができる。プロテアーゼ阻害剤としては例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）などのメタロプロテアーゼ阻害剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、トリプシン阻害剤、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ阻害剤、ヨードアセトアミド、E−64などのシステインプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。これらのプロテアーゼ阻害剤は単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。
また、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）のような、あらかじめ複数のプロテアーゼ阻害剤が混合された市販品を用いることもできる。
【００１８】
脱リン酸化酵素阻害剤は、例えば生体分子がＣＤＫのようなリン酸化酵素である場合に、細胞内に含まれる脱リン酸化酵素により酵素活性が低下することを防ぐために用いることができる。脱リン酸化酵素阻害剤としては、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム（Na3VO4）、フッ化ナトリウム（NaF）、オカダ酸などが挙げられる。脱リン酸化阻害剤は、単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
【００１９】
上記の第１調製工程における第１緩衝液中での組織の粉砕は、従来公知の組織の粉砕方法により行うことができ、例えば、ペッスル、超音波破砕装置、フレンチプレスなどを用いることができる。生体分子が酵素の場合、酵素活性が失活しにくい点で、ペッスルを用いることが好ましい。
【００２０】
ペッスルは、当該技術において通常用いられるものであれば特に限定されず、組織及び第１緩衝液の量に応じて、適当な大きさのペッスルを選択して用いてよい。ペッスルは、手動で用いるもの又は機器に取り付けて用いるもののいずれであってもよいが、一定の圧力及び動作で組織を粉砕できる点で、機器に取り付けて用いるものがより好ましい。
ペッスルを機器に取り付けて用いる場合、例えば500μlの組織を含む第１緩衝液当たり、2.5〜7.5 kg/w程度の圧力で4℃にて2〜3分程度粉砕することが好ましい。
【００２１】
次いで、上記の粉砕により得られた第１組織粉砕液を、第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離する。上記の分離は、当該技術において通常用いられる方法により行うことができ、遠心分離がより好ましい。遠心分離は、例えば、４℃にて10000〜20000 rpmの速度で3〜10分程度行うことができる。
このようにして得られる第１可溶性画分は、第１測定用試料として用いることができる。
【００２２】
上記の第１不溶性画分は、凍結粉砕の処理に付す。上記の凍結粉砕とは、不溶性画分を凍結させたまま粉砕する処理を意味する。第１不溶性画分の凍結は、-40℃以下の極低温媒体、例えば液体窒素、液体ヘリウム、液体酸素を用いて行うことができる。凍結させた第１不溶性画分の粉砕は、該凍結させた第１不溶性画分を小片に破砕できる方法により行うことができる。該粉砕は、ミルなどの粉砕装置を用いることが好ましい。ミルは、第１不溶性画分の量に応じて適宜選択でき、例えばＳＫミル（株式会社トッケン）を用いることができる。
【００２３】
次に、上記のように凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る。
第２緩衝液は、上記の第１緩衝液と同様のpHを有してよく、上記の第１緩衝液について例示した緩衝剤を含むことができる。
【００２４】
第２緩衝液は、界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としては、目的の生体分子を可溶化でき、該生体分子を分解しないものであれば特に限定されない。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）などの両性界面活性剤、上記の第１緩衝液について記載したような非イオン界面活性剤のいずれを用いてもよい。
第２緩衝液中の界面活性剤の濃度は、第１緩衝液の界面活性剤の濃度よりも高いことが好ましく、具体的には、５％より高く１０％以下が好ましく、より好ましくは６〜８％である。
【００２５】
上記の第２緩衝液は、上記の第１緩衝液について記載したことと同様に、プロテアーゼ阻害剤を含んでよい。
【００２６】
上記の第２緩衝液を凍結粉砕物に加え、これを混合して得られる混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離する。該分離は、上記の第１調製工程について記載したことと同様に、遠心分離により行われることが好ましい。遠心分離は、例えば10000〜20000 rpmの速度で3〜10分程度行うことができる。
このようにして得られる第２可溶性画分を、第２測定用試料として用いることができる。
【００２７】
本発明は、また、上記の第１緩衝液及び第２緩衝液を含む、本発明の測定用試料の調製方法において用いるためのキットも提供する。
第１緩衝液及び第２緩衝液は、液体であってもよいし、用時に水を添加して用いる、凍結乾燥などにより得られる固体であってもよい。好ましくは、上記のキットは、液体の第１緩衝液を含む容器と、液体の第２緩衝液を含む容器とを含むことが好ましい。
【００２８】
上記のキットは、第１測定用試料及び第２測定用試料中に含まれる生体分子の測定に用いるための試薬を含んでもよい。このような試薬は、測定される生体分子の種類により適宜選択できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
（測定用試料の調製）
乳がん患者3名（患者1〜3）から摘出した腫瘍細胞塊3検体（38〜54ｍｇ）から、次のようにして測定用試料1〜3を調製した。なお、これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３０】
（１）工程１
まず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約150mg/mlとなるように、第１緩衝液としての緩衝液A（0.1w／v％のノニデットP-40（カルビオケム社）、50mMのトリス塩酸（pH7.4）、5mMのEDTA、50mMのフッ化ナトリウム、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム及び100μl/mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む）と腫瘍細胞塊とをチューブに収容した。
ペッスルにより、加圧強度5kg/w、回転角度75度、左右2回の条件下で、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊を粉砕して第１組織粉砕液を得た。この第１組織粉砕液を、4℃にて15000rpmで5分間遠心分離し、第１可溶性画分としての上清（第１測定用試料）と、第１不溶性画分としての沈殿物とを得た。
【００３１】
（２）工程２
工程１で得られた沈殿物に、緩衝液B（1％のTriton-X100、0.1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1％のSDS、50mMのトリス塩酸（pH8.0）、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA及び0.2％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含む）を添加して15000rpm、5分間遠心分離を行い、上清（以下、工程２の上清という）と沈殿物とを得た。
【００３２】
（３）工程３
工程２で得られた沈殿をチューブに入れ、該チューブを液体窒素に約３０秒浸漬することにより凍結し、SKミル（株式会社トッケン）を用いて粉砕した。粉砕物に、第２緩衝液としてのSDSローディングバッファー（200mMのトリス塩酸（pH6.8）、40％のグリセロール、8％のSDS及び10％の2-メルカプトエタノールを含む）を粉砕物の重量の1/3量で加えて混合した。これを、100℃で5分間加熱して、15000rpmで2分間遠心分離して、上清を回収して、第２測定用試料を得た。
【００３３】
（測定用試料の分析）
上記の工程１〜３で得られた試料について、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩ（TopII）及び膜タンパク質であるＨＥＲ２の含有量を調べるために、TopIIに対する抗体、及びＨＥＲ２に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを次のようにして行った。
上記の工程１及び２で得られた第１測定用試料及び第２工程の上清に、1/3の容量のSDSローディングバッファーを加え、100℃で5分間加熱して、ウェスタンブロッティング用試料を調製した。
得られた２種類のウェスタンブロッティング用試料、及び第２測定用試料のそれぞれ10μlを用いてSDS-PAGEを行い、ゲルを室温で15分間、トランスファーバッファー（192mMのグリシン、25mMのトリス及び20％のメタノールを含む）に浸漬して平衡化した。
ゲル中のタンパク質を、Mini Trans-Blot cell transfer system（バイオラッド社）を用いて100V、4℃、一時間でImmobilon FL membrane（ミリポア社）に転写した。
メンブレンを、ブロッキング試薬A（4％のBSA、25mMのトリス塩酸（pH7.4）、150mMのNaCl及び0.02％のTween20を含む）中で37℃、1時間振とうすることによりブロッキングを行い、さらに洗浄液A（25mMのトリス塩酸（pH7.4）、150mMのNaCl及び0.02％のTween20を含む）で洗浄した。
洗浄後、メンブレンを、抗トポイソメラーゼII（TopoII）ウサギ抗体（一次抗体：カルビオケム社）溶液5μl含む5mlのブロッキング試薬A中で、室温で1時間振とう振とうした。
メンブレンを20mlの洗浄液Aで洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識化ブタ抗ウサギIgG （二次抗体：DAKO社）溶液5μlを含む5mlのブロッキング試薬A中で、室温にて90分間振とうして、メンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた。
メンブレンを20mlの洗浄液Aで洗浄した後、ECL-Plus (Amersham社)を、使用説明書に従って用いて処理した。処理したメンブレンからの発光を、イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）を用いて検出した。
【００３４】
（測定用試料のＨＥＲ２含有量の分析）
上記の工程１〜３で得られた試料について、膜タンパク質であるＨＥＲ２の含有量を、次のようにして調べた。
上記のトポイソメラーゼＩＩについての分析において、抗TopoII抗体溶液に代えてウサギ抗HER2抗体（アップステイト社）溶液を用い、HRP標識化ブタ抗ウサギIgG溶液の代わりにビオチン標識化ヤギ抗ウサギIgG（サンタクルズ社）溶液を用い、蛍光色素であるAlexa fluor 488 conjugated streptabidin（モレキュラープローブ社）溶液を用いた定法により反応させ、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって検出した。
【００３５】
（結果）
結果を、図１及び２に示す。図１及び２では、sup1：第１測定用試料、sup2：第２工程の上清、sup3：第２測定用試料の結果を、検体１〜３について示す。
これらの結果から、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩ及び膜タンパク質であるＨＥＲ２は、ともに、第２測定用試料中に最も多く含まれていることがわかる。一方、第１工程で得られた不溶性画分に通常の可溶化液を混合する工程２の操作では、核タンパク質も膜タンパク質もほとんど検出できなかった。よって、本発明の方法により、充分量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を調製できたことがわかる。
なお、上記の第１測定用試料を調製する工程１は、特開２００７−６１０８８号の実施例１に記載されるＣＤＫ測定用試料の調製法と同じであり、第１測定用試料中に含まれるＣＤＫが測定できることが、特開２００７−６１０８８号に記載されている。
【００３６】
比較例１
乳がん患者9名（患者1〜9）から摘出した腫瘍細胞塊9検体（16〜98ｍｇ）から、上記の工程１のようにして試料1〜9を調製した。これらを、実施例１と同様にして、TopoIIについてのウェスタンブロットにより、TopoIIの含有量を調べた。これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩを発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３７】
（結果）
結果を、図３に示す。図３の結果から、実施例１の工程１で得られた試料と同様に、工程１により得られる第１測定用試料中には、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩはほとんど含有されていないことがわかる。
【００３８】
比較例２
乳がん患者2名（患者1〜3）から摘出した腫瘍細胞塊2検体（26-48ｍｇ）から、次のようにして測定用試料1〜3を調製した。これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３９】
（試料の調製）
実施例の工程１及び２と同様にして、第１測定用試料及び工程２の上清を得た。
次いで、工程２で得られた沈殿物を、ペッスルにより、加圧強度5kg/w、回転角度75度、左右2回の条件下で、粉砕した。粉砕物に1/3量のSDSローディングバッファーを粉砕物の重量の1/3量で加え、100℃で5分間加熱して、ペッスルで２回処理した試料を得た。
【００４０】
（試料の分析）
上記の第１測定用試料、工程２の上清及びペッスルで２回処理した試料を、実施例１に記載したようにして、TopoII及びHER2の含有量をウェスタンブロッティングにより調べた。
【００４１】
（結果）
結果を図４に示す。図４では、sup1：第１測定用試料、sup2：第２工程の上清、sup3：ペッスルで２回処理した試料の結果を、検体１〜３について示す。
図４の結果から、組織をペッスルで粉砕する第１調製工程で得られた第１不溶性画分を再びペッスルで粉砕しても、試料中にはトポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２がほとんど含有されていないことがわかる。
【００４２】
これらの結果から、本発明の方法により測定用試料を調製することにより、充分な量の細胞質に含まれる分子を含む第１測定用試料と、充分な量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を得ることができたことがわかる。特に、ペッスルにより破砕された組織の不溶性画分を、凍結粉砕することで、充分な量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を、効率よく得ることができることが明らかになった。
【００４３】
例えば、癌細胞を含む組織のように不均質な組織に含まれる細胞質分子と核タンパク質及び／又は膜タンパク質とを測定しようとする場合に、従来の試料の調製方法では、充分な量の目的分子を含む試料が得られないという問題があった。あるいは、充分な量の目的分子を含む試料を得るために、細胞質分子を含む試料と、核タンパク質及び／又は膜タンパク質を含む試料とを別々に調製することが考えられるが、各試料の調製に用いられる組織が異なり、試料を調製するための組織に含まれる癌細胞の数や種類が完全には同じにならないという問題があった。
しかし、本発明の方法により、同じ組織から第１測定用試料及び第２測定用試料を調製でき、同じ組織に含まれる細胞質分子と核タンパク質及び／又は膜タンパク質とを測定できるので、このような問題を回避でき、より信頼性の高い測定結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１のトポイソメラーゼＩＩを検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図２】実施例１のＨＥＲ２を検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図３】比較例１のトポイソメラーゼＩＩを検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図４】比較例２のトポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織から生体分子を含む測定用試料を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織中に含まれる生体分子、例えば膜タンパク質（例えばチロシンキナーゼなどの酵素）、核タンパク質（ヒストン、ＤＮＡトポイソメラーゼなど）、細胞質タンパク質（サイクリン依存性キナーゼなどの酵素）を測定することにより、その組織が由来する対象（例えばヒト）が罹患している疾患について調べることが知られている。
【０００３】
特開２００７−６１０８８号（特許文献１）は、乳癌患者から採取した細胞塊を、ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心分離により得られた上清を、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）含有測定用試料として用いている。一方、沈殿物にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液を加えて遠心分離を行い、得られた上清を上皮成長因子受容体であるＨＥＲ２含有試料として用いている。
【特許文献１】特開２００７−６１０８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１のような試料の調製方法では、特に遠心分離後の沈殿物から、所望の生体分子を測定に充分な量で含む試料を得ることができない場合があった。また、充分な量の目的分子を含む試料を得るために、生体から採取された組織を二つに分け、細胞質分子を含む試料と、核タンパク質及び／又は膜タンパク質を含む試料とを別々に調製することが考えられる。しかしながら、バイオプシーで採取された組織のように組織自体の量が少ない場合、組織を二つに分け別々に試料を調製することが困難であるという問題があった。
そこで、本発明は、測定に充分な量の生体分子を含む測定用試料を生体組織から調製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、
前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、
前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程と
を含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の測定用試料の調製方法により、生体由来の組織から、測定される物質を充分量含む第１測定用試料及び第２測定用試料を得ることができ、例えば患者の組織中の疾患に関連する物質を効率よく測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法により調製される第１及び第２測定用試料は、測定される物質として組織由来の生体分子を含む。該生体分子は、その存在及び／又は量が疾患に関連することが知られている分子であることが好ましい。
【０００８】
本明細書において、「測定」とは、目的物質の存在を検出すること及びその量を測定することの少なくともいずれか一方を含むことを意図する。
【０００９】
上記の第１測定用試料に含まれる生体分子は、細胞質に含まれる生体分子であることが好ましい。また、第１測定用試料は、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するための試料であることが好ましい。上記の酵素としては、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、Ａｋｔ、及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）などが挙げられ、ＣＤＫがより好ましい。ＣＤＫとしては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７などが挙げられる。中でも、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の少なくとも１つがより好ましい。
【００１０】
上記の第２測定用試料に含まれる生体分子は、細胞膜及び核の少なくともいずれか一方に含まれる生体分子が好ましい。細胞膜に含まれる生体分子としては、膜タンパク質、及び細胞外マトリックスなどが挙げられ、膜タンパク質がより好ましい。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン及びファイブロネクチンなどが挙げられる。膜タンパク質としては、細胞膜に結合している受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、膜型タンパク質分解酵素であるＭＴ１−ＭＭＰなどの酵素が挙げられる。ＲＴＫは、インシュリン受容体（ＩＲ）、インシュリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）などを含む。
上記のＨＥＲとしては、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２などが知られている。本発明において第２測定用試料にＨＥＲ２が含まれることがより好ましい。
【００１１】
上記の核に含まれる分子は、核タンパク質、ＤＮＡなどが挙げられ、核タンパク質がより好ましい。核タンパク質としては、ＤＮＡトポイソメラーゼ、テロメアーゼなどの酵素が挙げられ、なかでもＩＩ型トポイソメラーゼがより好ましい。
【００１２】
本発明の方法は、生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程を含む。この工程は、目的の生体分子の変性、分解などを防ぐために、2〜4℃のような低温で行うことが好ましい。これにより、第１測定用試料を、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するために好適に用いることができる。
上記の生体から採取された組織は、生体（例えばヒト患者）からバイオプシー、外科切除などにより採取されたリンパ節組織、器官、血液などを含む。より好ましくは、上記の組織は、癌細胞を含む。
【００１３】
上記の第１緩衝液は、得られる測定用試料中の測定される生体分子が変性するのを防ぐものであれば特に限定されない。第１緩衝液のpHは、生体分子を変性させたり、生体分子が酵素の場合は失活させたりすることなく、安定した状態で回収できる範囲であれば特に限定されず、好ましくは4.0〜9.0、より好ましくは4.5〜8.5、さらに好ましくは5.0〜8.0である。
【００１４】
第１緩衝液に含まれる緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、MOPS（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、HEPES（２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸）、Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、トリシン（Ｎ−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]グリシン）などが挙げられる。
【００１５】
上記の第１緩衝液は、界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としては、目的の生体分子を可溶化でき、かつ該生体分子を分解又は変性しないものが好ましい。電荷を有する界面活性剤は、生体分子が酵素である場合、酵素に結合して立体構造を変化させる可能性がある。そのため、第１測定用試料を、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するために用いる場合、上記の第１緩衝液に含まれる界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルエーテル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルなどを基本構造として有するものが挙げられる。具体的には、非イオン界面活性剤としては、ノニデットＰ−４０（NP−40、Shell International Petroleum Company Limitedの登録商標）、Triton−X（Union Carbide Chemicals and Plastics Inc.の登録商標）、Tween（ICI Americas Inc.の登録商標）、Brij（ICI Americas Inc.の登録商標）、Emulgen（花王の登録商標）などが挙げられる。第１緩衝液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜３％、さらに好ましくは０．１〜１％である。
【００１６】
上記の第１緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤などを含有してもよい。
【００１７】
プロテアーゼ阻害剤は、細胞に含まれるプロテアーゼによって目的の生体分子が分解されることを防ぐために用いることができる。プロテアーゼ阻害剤としては例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）などのメタロプロテアーゼ阻害剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、トリプシン阻害剤、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ阻害剤、ヨードアセトアミド、E−64などのシステインプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。これらのプロテアーゼ阻害剤は単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。
また、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）のような、あらかじめ複数のプロテアーゼ阻害剤が混合された市販品を用いることもできる。
【００１８】
脱リン酸化酵素阻害剤は、例えば生体分子がＣＤＫのようなリン酸化酵素である場合に、細胞内に含まれる脱リン酸化酵素により酵素活性が低下することを防ぐために用いることができる。脱リン酸化酵素阻害剤としては、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム（Na3VO4）、フッ化ナトリウム（NaF）、オカダ酸などが挙げられる。脱リン酸化阻害剤は、単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
【００１９】
上記の第１調製工程における第１緩衝液中での組織の粉砕は、従来公知の組織の粉砕方法により行うことができ、例えば、ペッスル、超音波破砕装置、フレンチプレスなどを用いることができる。生体分子が酵素の場合、酵素活性が失活しにくい点で、ペッスルを用いることが好ましい。
【００２０】
ペッスルは、当該技術において通常用いられるものであれば特に限定されず、組織及び第１緩衝液の量に応じて、適当な大きさのペッスルを選択して用いてよい。ペッスルは、手動で用いるもの又は機器に取り付けて用いるもののいずれであってもよいが、一定の圧力及び動作で組織を粉砕できる点で、機器に取り付けて用いるものがより好ましい。
ペッスルを機器に取り付けて用いる場合、例えば500μlの組織を含む第１緩衝液当たり、2.5〜7.5 kg/w程度の圧力で4℃にて2〜3分程度粉砕することが好ましい。
【００２１】
次いで、上記の粉砕により得られた第１組織粉砕液を、第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離する。上記の分離は、当該技術において通常用いられる方法により行うことができ、遠心分離がより好ましい。遠心分離は、例えば、４℃にて10000〜20000 rpmの速度で3〜10分程度行うことができる。
このようにして得られる第１可溶性画分は、第１測定用試料として用いることができる。
【００２２】
上記の第１不溶性画分は、凍結粉砕の処理に付す。上記の凍結粉砕とは、不溶性画分を凍結させたまま粉砕する処理を意味する。第１不溶性画分の凍結は、-40℃以下の極低温媒体、例えば液体窒素、液体ヘリウム、液体酸素を用いて行うことができる。凍結させた第１不溶性画分の粉砕は、該凍結させた第１不溶性画分を小片に破砕できる方法により行うことができる。該粉砕は、ミルなどの粉砕装置を用いることが好ましい。ミルは、第１不溶性画分の量に応じて適宜選択でき、例えばＳＫミル（株式会社トッケン）を用いることができる。
【００２３】
次に、上記のように凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る。
第２緩衝液は、上記の第１緩衝液と同様のpHを有してよく、上記の第１緩衝液について例示した緩衝剤を含むことができる。
【００２４】
第２緩衝液は、界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としては、目的の生体分子を可溶化でき、該生体分子を分解しないものであれば特に限定されない。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）などの両性界面活性剤、上記の第１緩衝液について記載したような非イオン界面活性剤のいずれを用いてもよい。
第２緩衝液中の界面活性剤の濃度は、第１緩衝液の界面活性剤の濃度よりも高いことが好ましく、具体的には、５％より高く１０％以下が好ましく、より好ましくは６〜８％である。
【００２５】
上記の第２緩衝液は、上記の第１緩衝液について記載したことと同様に、プロテアーゼ阻害剤を含んでよい。
【００２６】
上記の第２緩衝液を凍結粉砕物に加え、これを混合して得られる混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離する。該分離は、上記の第１調製工程について記載したことと同様に、遠心分離により行われることが好ましい。遠心分離は、例えば10000〜20000 rpmの速度で3〜10分程度行うことができる。
このようにして得られる第２可溶性画分を、第２測定用試料として用いることができる。
【００２７】
本発明は、また、上記の第１緩衝液及び第２緩衝液を含む、本発明の測定用試料の調製方法において用いるためのキットも提供する。
第１緩衝液及び第２緩衝液は、液体であってもよいし、用時に水を添加して用いる、凍結乾燥などにより得られる固体であってもよい。好ましくは、上記のキットは、液体の第１緩衝液を含む容器と、液体の第２緩衝液を含む容器とを含むことが好ましい。
【００２８】
上記のキットは、第１測定用試料及び第２測定用試料中に含まれる生体分子の測定に用いるための試薬を含んでもよい。このような試薬は、測定される生体分子の種類により適宜選択できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
（測定用試料の調製）
乳がん患者3名（患者1〜3）から摘出した腫瘍細胞塊3検体（38〜54ｍｇ）から、次のようにして測定用試料1〜3を調製した。なお、これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３０】
（１）工程１
まず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約150mg/mlとなるように、第１緩衝液としての緩衝液A（0.1w／v％のノニデットP-40（カルビオケム社）、50mMのトリス塩酸（pH7.4）、5mMのEDTA、50mMのフッ化ナトリウム、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム及び100μl/mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む）と腫瘍細胞塊とをチューブに収容した。
ペッスルにより、加圧強度5kg/w、回転角度75度、左右2回の条件下で、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊を粉砕して第１組織粉砕液を得た。この第１組織粉砕液を、4℃にて15000rpmで5分間遠心分離し、第１可溶性画分としての上清（第１測定用試料）と、第１不溶性画分としての沈殿物とを得た。
【００３１】
（２）工程２
工程１で得られた沈殿物に、緩衝液B（1％のTriton-X100、0.1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1％のSDS、50mMのトリス塩酸（pH8.0）、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA及び0.2％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含む）を添加して15000rpm、5分間遠心分離を行い、上清（以下、工程２の上清という）と沈殿物とを得た。
【００３２】
（３）工程３
工程２で得られた沈殿をチューブに入れ、該チューブを液体窒素に約３０秒浸漬することにより凍結し、SKミル（株式会社トッケン）を用いて粉砕した。粉砕物に、第２緩衝液としてのSDSローディングバッファー（200mMのトリス塩酸（pH6.8）、40％のグリセロール、8％のSDS及び10％の2-メルカプトエタノールを含む）を粉砕物の重量の1/3量で加えて混合した。これを、100℃で5分間加熱して、15000rpmで2分間遠心分離して、上清を回収して、第２測定用試料を得た。
【００３３】
（測定用試料の分析）
上記の工程１〜３で得られた試料について、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩ（TopII）及び膜タンパク質であるＨＥＲ２の含有量を調べるために、TopIIに対する抗体、及びＨＥＲ２に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを次のようにして行った。
上記の工程１及び２で得られた第１測定用試料及び第２工程の上清に、1/3の容量のSDSローディングバッファーを加え、100℃で5分間加熱して、ウェスタンブロッティング用試料を調製した。
得られた２種類のウェスタンブロッティング用試料、及び第２測定用試料のそれぞれ10μlを用いてSDS-PAGEを行い、ゲルを室温で15分間、トランスファーバッファー（192mMのグリシン、25mMのトリス及び20％のメタノールを含む）に浸漬して平衡化した。
ゲル中のタンパク質を、Mini Trans-Blot cell transfer system（バイオラッド社）を用いて100V、4℃、一時間でImmobilon FL membrane（ミリポア社）に転写した。
メンブレンを、ブロッキング試薬A（4％のBSA、25mMのトリス塩酸（pH7.4）、150mMのNaCl及び0.02％のTween20を含む）中で37℃、1時間振とうすることによりブロッキングを行い、さらに洗浄液A（25mMのトリス塩酸（pH7.4）、150mMのNaCl及び0.02％のTween20を含む）で洗浄した。
洗浄後、メンブレンを、抗トポイソメラーゼII（TopoII）ウサギ抗体（一次抗体：カルビオケム社）溶液5μl含む5mlのブロッキング試薬A中で、室温で1時間振とう振とうした。
メンブレンを20mlの洗浄液Aで洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識化ブタ抗ウサギIgG （二次抗体：DAKO社）溶液5μlを含む5mlのブロッキング試薬A中で、室温にて90分間振とうして、メンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた。
メンブレンを20mlの洗浄液Aで洗浄した後、ECL-Plus (Amersham社)を、使用説明書に従って用いて処理した。処理したメンブレンからの発光を、イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）を用いて検出した。
【００３４】
（測定用試料のＨＥＲ２含有量の分析）
上記の工程１〜３で得られた試料について、膜タンパク質であるＨＥＲ２の含有量を、次のようにして調べた。
上記のトポイソメラーゼＩＩについての分析において、抗TopoII抗体溶液に代えてウサギ抗HER2抗体（アップステイト社）溶液を用い、HRP標識化ブタ抗ウサギIgG溶液の代わりにビオチン標識化ヤギ抗ウサギIgG（サンタクルズ社）溶液を用い、蛍光色素であるAlexa fluor 488 conjugated streptabidin（モレキュラープローブ社）溶液を用いた定法により反応させ、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって検出した。
【００３５】
（結果）
結果を、図１及び２に示す。図１及び２では、sup1：第１測定用試料、sup2：第２工程の上清、sup3：第２測定用試料の結果を、検体１〜３について示す。
これらの結果から、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩ及び膜タンパク質であるＨＥＲ２は、ともに、第２測定用試料中に最も多く含まれていることがわかる。一方、第１工程で得られた不溶性画分に通常の可溶化液を混合する工程２の操作では、核タンパク質も膜タンパク質もほとんど検出できなかった。よって、本発明の方法により、充分量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を調製できたことがわかる。
なお、上記の第１測定用試料を調製する工程１は、特開２００７−６１０８８号の実施例１に記載されるＣＤＫ測定用試料の調製法と同じであり、第１測定用試料中に含まれるＣＤＫが測定できることが、特開２００７−６１０８８号に記載されている。
【００３６】
比較例１
乳がん患者9名（患者1〜9）から摘出した腫瘍細胞塊9検体（16〜98ｍｇ）から、上記の工程１のようにして試料1〜9を調製した。これらを、実施例１と同様にして、TopoIIについてのウェスタンブロットにより、TopoIIの含有量を調べた。これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩを発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３７】
（結果）
結果を、図３に示す。図３の結果から、実施例１の工程１で得られた試料と同様に、工程１により得られる第１測定用試料中には、核タンパク質であるトポイソメラーゼＩＩはほとんど含有されていないことがわかる。
【００３８】
比較例２
乳がん患者2名（患者1〜3）から摘出した腫瘍細胞塊2検体（26-48ｍｇ）から、次のようにして測定用試料1〜3を調製した。これらの患者は、トポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を発現している患者であることが、臨床病理情報により確認されている。
【００３９】
（試料の調製）
実施例の工程１及び２と同様にして、第１測定用試料及び工程２の上清を得た。
次いで、工程２で得られた沈殿物を、ペッスルにより、加圧強度5kg/w、回転角度75度、左右2回の条件下で、粉砕した。粉砕物に1/3量のSDSローディングバッファーを粉砕物の重量の1/3量で加え、100℃で5分間加熱して、ペッスルで２回処理した試料を得た。
【００４０】
（試料の分析）
上記の第１測定用試料、工程２の上清及びペッスルで２回処理した試料を、実施例１に記載したようにして、TopoII及びHER2の含有量をウェスタンブロッティングにより調べた。
【００４１】
（結果）
結果を図４に示す。図４では、sup1：第１測定用試料、sup2：第２工程の上清、sup3：ペッスルで２回処理した試料の結果を、検体１〜３について示す。
図４の結果から、組織をペッスルで粉砕する第１調製工程で得られた第１不溶性画分を再びペッスルで粉砕しても、試料中にはトポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２がほとんど含有されていないことがわかる。
【００４２】
これらの結果から、本発明の方法により測定用試料を調製することにより、充分な量の細胞質に含まれる分子を含む第１測定用試料と、充分な量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を得ることができたことがわかる。特に、ペッスルにより破砕された組織の不溶性画分を、凍結粉砕することで、充分な量の核タンパク質及び膜タンパク質を含む第２測定用試料を、効率よく得ることができることが明らかになった。
【００４３】
例えば、癌細胞を含む組織のように不均質な組織に含まれる細胞質分子と核タンパク質及び／又は膜タンパク質とを測定しようとする場合に、従来の試料の調製方法では、充分な量の目的分子を含む試料が得られないという問題があった。あるいは、充分な量の目的分子を含む試料を得るために、細胞質分子を含む試料と、核タンパク質及び／又は膜タンパク質を含む試料とを別々に調製することが考えられるが、各試料の調製に用いられる組織が異なり、試料を調製するための組織に含まれる癌細胞の数や種類が完全には同じにならないという問題があった。
しかし、本発明の方法により、同じ組織から第１測定用試料及び第２測定用試料を調製でき、同じ組織に含まれる細胞質分子と核タンパク質及び／又は膜タンパク質とを測定できるので、このような問題を回避でき、より信頼性の高い測定結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１のトポイソメラーゼＩＩを検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図２】実施例１のＨＥＲ２を検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図３】比較例１のトポイソメラーゼＩＩを検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【図４】比較例２のトポイソメラーゼＩＩ及びＨＥＲ２を検出するためのウェスタンブロットの結果を示すメンブレンの写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、
前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、
前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程と
を含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法。
【請求項２】
第１緩衝液及び第２緩衝液が界面活性剤を含有し、第１緩衝液の界面活性剤の濃度が、第２緩衝液の界面活性剤の濃度よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１測定用試料が、細胞質に含まれる生体分子を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１測定用試料が、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するための試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酵素が、サイクリン依存性キナーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の少なくとも１つである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２調製工程で得られる第２測定用試料が、細胞膜及び核の少なくともいずれか一方に含まれる生体分子を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞膜に含まれる生体分子が、膜タンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
膜タンパク質が、上皮成長因子受容体である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上皮成長因子受容体が、ＨＥＲ２である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核に含まれる生体分子が、核タンパク質である請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核タンパク質が、ＤＮＡトポイソメラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡトポイソメラーゼが、ＩＩ型トポイソメラーゼである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
粉砕が、ペッスルを用いて行われる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生体から採取された組織が、癌患者から採取された癌細胞を含む組織である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１緩衝液と第２緩衝液とを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキット。
【請求項１】
生体から採取された組織に第１緩衝液を加え、第１緩衝液中で組織を粉砕し、得られた第１組織粉砕液を第１可溶性画分と第１不溶性画分とに分離し、第１可溶性画分を回収して第１測定用試料を得る第１調製工程と、
前記第１不溶性画分を凍結粉砕する工程と、
前記凍結粉砕して得られた凍結粉砕物に第２緩衝液を加えて混合し、得られた混合物を第２可溶性画分と第２不溶性画分とに分離し、第２可溶性画分を回収して第２測定用試料を得る第２調製工程と
を含む、生体分子を含む測定用試料の調製方法。
【請求項２】
第１緩衝液及び第２緩衝液が界面活性剤を含有し、第１緩衝液の界面活性剤の濃度が、第２緩衝液の界面活性剤の濃度よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１測定用試料が、細胞質に含まれる生体分子を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１測定用試料が、細胞質に含まれる酵素の活性を測定するための試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酵素が、サイクリン依存性キナーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の少なくとも１つである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２調製工程で得られる第２測定用試料が、細胞膜及び核の少なくともいずれか一方に含まれる生体分子を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞膜に含まれる生体分子が、膜タンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
膜タンパク質が、上皮成長因子受容体である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上皮成長因子受容体が、ＨＥＲ２である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核に含まれる生体分子が、核タンパク質である請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核タンパク質が、ＤＮＡトポイソメラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡトポイソメラーゼが、ＩＩ型トポイソメラーゼである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
粉砕が、ペッスルを用いて行われる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生体から採取された組織が、癌患者から採取された癌細胞を含む組織である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１緩衝液と第２緩衝液とを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２３２７７５（Ｐ２００９−２３２７７５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８４１５４（Ｐ２００８−８４１５４）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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