生体分子アッセイチップ
【課題】マイクロリアクター技術を用いた生体分子アッセイチップの作製方法、及び作製されたチップの提供を目的とする。
【解決手段】本発明は、（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を添加する工程、（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように該基板１と密着させ、微小リアクター内で生体分子２を合成する工程、（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップを、基板２と重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に結合させる工程を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法、及び該方法で作製されたチップを提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を添加する工程、（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように該基板１と密着させ、微小リアクター内で生体分子２を合成する工程、（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップを、基板２と重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に結合させる工程を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法、及び該方法で作製されたチップを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を配列状に固定化したチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を網羅的に解析する有力なツールとして、ＤＮＡチップやプロテインチップなどが現在利用されている。これらのチップは、ＤＮＡ、タンパク質を基板上にアレイ状に固定化し、目的に応じた反応系に供することで、目的の機能を発揮する可能性のある分子の同定を網羅的に行うことができる。
【０００３】
ＤＮＡチップに関しては、光リソグラフィー技術を用いてチップ上にＤＮＡを合成することで位置情報と配列情報を対応させるアフィメトリックス社の方法とすでに既知の配列をもったＤＮＡをチップ上に貼り付けるスタンフォード大方式が現在多く利用されている。大規模な配列を一度に調べるにはアフィメトリックス方式が有利で、ある限られた既知の配列のＤＮＡ集団を調べるにはスタンフォード方式が便利である。これらの方法は目的に応じて使い分けられている。
【０００４】
また、プロテインチップの作製に関しては、Ｐｈｙｌｏｓ社による、アフィメトリックス型のＤＮＡ基板にＩＶＶ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）のｍＲＮＡ領域をハイブリダイゼーションさせてチップ上にタンパク質を番地化して非共有結合的に固定化する試み（非特許文献１）があるもののその多くは、特定の限られたタンパク質集団をスポットしてチップ化するスタンフォード方式のプロテインチップである。このため未知の配列からなる遺伝子を元にした膨大なライブラリからプロテインチップを作製することは極めて困難な状況である。ちなみに、Ｐｈｙｌｏｓ社の方法はこの点でもっとも有望であるが、タンパク質の固定化にハイブリダイゼーションによる方法を用いていることから、様々なバッファー条件下で酵素アッセイをする目的に対しては、安定な固定化法とは言えず、未だ実用的な段階には至っていない。さらに、ハイブリダイゼーションさせる領域をタグとして導入するプロセスを加えることになるため実用性の上から必ずしも効率的とは言えない。
【０００５】
一方、発明者らは、ＩＶＶ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）法を利用した、有用タンパク質の同定、開発に関し、種々の技術を提供している（特許文献１）。ＩＶＶ法とは、ランダムな配列を有する多量のペプチド又は該ペプチドからなるペプチドライブラリーの中から、目的に応じたペプチド分子を選択する方法で、進化工学上、有力な手法として注目を浴びている。ＩＶＶ法は、核酸配列情報とこれに対応するタンパク質の活性又は機能を、１対１で対応づけることができる技術であるため、本法を網羅的解析に利用することができれば、所望の活性を有するタンパク質とこれをコードする核酸配列情報を同時に、かつ、大量に取得することも可能となる。しかしながら、現段階では、このような方法により網羅的な解析を可能にする技術等は報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｅｎｇら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２：４８−５７，２００２
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００６／０４１１９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、膨大な変異体を含むＤＮＡライブラリから、クローニングの過程を経ずに、各変異体タンパク質を個別にチップ上に固定化する方法について鋭意研究を行った結果、μＴＡＳ技術を用いることで、所望のＤＮＡをアレイ化したＤＮＡチップに対応するｍＲＮＡチップ、プロテインチップを一連の過程において作製することが可能であることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、マイクロリアクターチップを用いた生体分子アッセイチップを作製する方法、及び該方法によって作製されるチップの提供を目的とする。
さらに、本発明は、該チップ上に固定化された生体分子から、固定化された位置を変更することなく、他の生体分子を合成する方法、及び該方法によって作製されるチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）
に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法。
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程」である。
（２）本発明の第２の態様は、「上記（１）の工程（ａ）に記載の「複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１」を作製する工程が、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（ａ）生体分子１と生体分子を増幅するための反応試薬との混合液を、マイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子１が確率分布的に１分子以下になるように希釈して充填する工程、
（ｂ）生体分子１を増幅する反応を行う工程、
（ｃ）該マイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板１と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板１を重ね合わせ、増幅した生体分子１を基板上に固定する工程」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記生体分子１が核酸又は核酸誘導体であることを特徴とする上記（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記生体分子１を増幅する反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記核酸誘導体がリンカーＤＮＡを連結したものであることを特徴とする上記（３）又は（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記リンカーＤＮＡにピューロマイシンが結合していることを特徴とする上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記基板１上にアビジンを固定化し、前記核酸又は核酸誘導体にビオチン化することを特徴とする上記（３）乃至（６）のいずれかに記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記生体分子１がＤＮＡであり、生体分子２がＲＮＡであることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記ＲＮＡがｍＲＮＡであることを特徴とする上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記基板２にピューロマイシンを結合したリンカーＤＮＡが固定化されていることを特徴とする上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法により作製したチップ」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「上記（１１）に記載のチップ上に固定化された生体分子２から生体分子３を合成する１又は複数種類の反応溶液中に該チップを浸し、生体分子３が配列状に固定化されたチップを作製する方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液であり、生体分子３がタンパク質−核酸複合体であることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液及び逆転写酵素を含む溶液であり、生体分子３がタンパク質−ＤＮＡ複合体であることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「上記（１１）乃至（１４）いずれかに記載の方法により作製したチップ」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が対応した位置に固定化された各チップを作製することができるため、ＤＮＡ上の核酸配列情報と、タンパク質の機能とを１対１に対応づけてモニターすることを可能とする。
【００１０】
本発明の方法及びチップを用いることで、所望の機能改変が達成された分子（ＤＮＡ又はタンパク質）を、比較的短時間にて同定することができる。
【００１１】
本発明の方法及びチップを用いることで、ゲノム解析等で得られた遺伝子（特に酵素に関わる）機能を短期間にて同定することができる。
【００１２】
本発明の方法及びチップを用い、代謝経路を解析するために複数の遺伝子の組み合わせを作りアッセイすることで、迅速に基質から代謝産物へ至る経路を同定できる。
【００１３】
本発明の方法及びチップを用いる場合、同一の酵素を各ウェルに加え、基質と阻害剤候補を加えることによる基質の濃度変化からより優れた阻害剤候補を選択できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、微小リアクターを備えたマイクロリアクターチップと基板を重ね合わせる工程を繰り返すことで、配列状に固定化された生体分子の固定化位置を変更することなく、該生体分子から他の生体分子を合成し、最終的には、最初に固定化された生体分子とは異なる生体分子が固定化されたチップを作製する方法、及び作製されたチップを提供するものである。より具体的には、例えば、ＤＮＡを固定化したチップからタンパク質を固定化したチップを、ＤＮＡ−タンパク質のチップ上の対応位置を変更せずに、連続的な工程により作製する方法を提供する。
本方法によれば、ＤＮＡライブラリ等から選択された他種類のＤＮＡを同一種類毎に配列状に固定化したＤＮＡチップから、各ＤＮＡがコードするタンパク質を該ＤＮＡの固定化位置と同じ位置に固定化したプロテインチップを作製することができる。
さらに、該プロテインチップ上のタンパク質を、ｍＲＮＡとの複合体として固定すれば、プロテインチップ上で逆転写反応を行わせることで、該タンパク質をコードするＤＮＡを固定化したチップを作製することも可能である。ここで、ｍＲＮＡは、ＤＮＡチップとマイクロリアクターチップを重ね合わせ、各微小リアクター内で転写反応を実行することで、対応するｍＲＮＡを微小リアクター内に取得することができる。
ｍＲＮＡとタンパク質との複合体は、例えば、ピューロマイシンなどタンパク質と特異的に結合する化合物等を結合させたリンカーＤＮＡを介して、作製することができる。すなわち、ｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有するリンカーＤＮＡであって、ピューロマイシンが結合したものを用いれば、該リンカーとｍＲＮＡが相補的部分で結合するため、生じた複合体は、ｍＲＮＡは該リンカーＤＮＡを介してピューロマイシンを結合しているものとなる。なお、リンカーＤＮＡとピューロマイシンとの結合は公知の手法により実施することができる。
【００１５】
さらに、該チップ上のタンパク質の固定化位置に対応した微小リアクターを備えたマイクロリアクターを用いることで、チップ上の全てのタンパク質の活性等をチップの作製と連続して測定することが可能となる。例えば、該チップ上のタンパク質活性を測定するための反応溶液を各微小リアクター中に添加したマイクロリアクターチップを、該微小リアクターと固定化されたタンパク質の位置が一致し、かつ、各タンパク質が微小リアクター内の反応溶液と十分に接触するように重ね合わせて、活性測定反応を実行することで、チップ上の全てのタンパク質の活性を同時に解析することが可能となる。
【００１６】
本方法は、目的のタンパク質の優れた活性を有する変異体の選択等において有効な方法である。例えば、特定のタンパク質に体系的に変異を導入したＤＮＡライブラーを固定化したチップを最初のＤＮＡチップとした場合、これに対応するプロテインチップの作製、プロテインチップ上のタンパク質の活性及び活性評価までを一つの工程として行うことができる。評価結果から所望のタンパク質を同定すれば、これをコードするＤＮＡは、ｍＲＮＡを逆転写することで容易に取得できるため、該タンパク質の一次配列情報も簡便に取得することができる。得られた一次配列情報に基づいて、更なるタンパク質の検索を行うこともできる。
【００１７】
以下に本発明の主な実施形態について記載する。
本発明の一の実施形態は、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法であり、
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程、を含む方法である。
ここで、「生体分子１」は、他の生体分子にｉｎ ｖｉｔｒｏにて変換することができるものが好ましく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが利用可能である。「生体分子１」は、基板上に配列状に固定する必要があるが、例えば、生体分子１がＤＮＡの場合、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、チップ表面をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。この場合、アビジンを基板上に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させるのが好ましい。また、生体分子１がＲＮＡである場合には、例えば、アビジン−ビオチン結合により基板上に結合させ該ＲＮＡの一部と相補的なＤＮＡリンカーを介して固定化する方法の他、ＲＮＡにアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、チップ表面をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを挙げることができる。この場合も上記と同様に、アビジンを基板上に固定化し、ビオチンをリンカーＤＮＡに結合させる方法が好ましい。
【００１８】
「マイクロリアクターチップ」とは、ポリマー、ガラス、シリコンなどの基板上に微細な流路や凹を形成し、この流路又は凹中（微小リアクター）において、化学反応を行うことができる、超微小な反応装置のことである。マイクロリアクターチップの表面は生体分子の吸着を抑制するためにPEGなどにより表面修飾を施してあることが好ましい。
本実施形態においては、基板上に固定化された生体分子がマイクロリアクター内の反応試薬と反応可能な様に接触する必要がある。ここで、基板１、基板２の表面は必ずしも平坦である必要はなく、例えば、生体分子を固定する表面積を増やすために凹凸を加工してもよい。ただし、基板とマイクロリアクターチップを重ね合わせた際に、マイクロリアクターチップ上の全てのマイクロリアクター内の試薬等の漏れがなく封じられるように、マイクロリアクターチップが接触する部分の基板表面は平坦である必要がある。
また、該反応を最適な状態で行わせるために、マイクロリアクターの温度、微小リアクター内のｐＨ条件などを制御する他の装置などを組み合わせて、実施してもよい。ここで反応試薬とは、例えば、生体分子１がＤＮＡであって、生体分子２がＲＮＡである場合には、転写に必要な試薬のことであり、該試薬は市販のものを使用しても、独自に調製したものを使用してもよい。
【００１９】
本実施形態の工程（ａ）で使用する基板１は、以下の方法によっても作製することができる。まず、生体分子１がＤＮＡである場合には、複数種類のＤＮＡの混合物（ＤＮＡライブラリなど）をＤＮＡ増幅試薬と混合し、混合物を適当なバッファーなどで希釈して、微小リアクターに分注する。ここで、各微小リアクターに確率的にＤＮＡが１分子になるように希釈して分注を行う。ＤＮＡと増幅試薬と希釈との前後は特に限定するものではない。分注後、ＤＮＡが増幅するのに適するように、マイクロリアクターチップの条件を設定し、反応を行わせると、各微小リアクター毎に異なる種類のＤＮＡが増幅される。次に、増幅されたＤＮＡを含むマイクロリアクターチップを基板１と接触するように密着して、マイクロリアクター内のＤＮＡ分子を基板１上に固定する。ここで、ＤＮＡを増幅する場合、ＰＣＲ反応を利用することが好ましく、該反応のために必要な反応溶液な市販のものを使用することができる。また、マイクロリアクター内のＤＮＡを基板上に固定する場合、ＤＮＡにビオチンが取り込まれるように増幅反応を行わせ、基板をアビジンでコートしておけば、アビジン−ビオチン結合を介して、ＤＮＡは容易に基板上に固定化することができる。ＤＮＡにビオチンを取り込ませる方法としては、例えば、ビオチン標識したＰＣＲプライマーを用いる方法などを利用することができる。
また、生体分子１又は２が核酸である場合、該核酸にリンカーとなるＤＮＡを連結し、その末端にピューロマイシンを結合したものを用いてもよい。
【００２０】
本実施形態においては、マイクロリアクター内で合成された生体分子２を他の基板（基板２）上に固定化することで、生体分子２を配列状に固定化したチップを作製するものである。ここで生体分子２を基板上に固定化する方法としては、生体分子２がＲＮＡである場合、例えば、ＲＮＡの一部と相補的な配列を含むリンカーをあらかじめ基板上に固定化しておくことにより、マイクロリアクター内のＲＮＡが容易に基板上に固定化される。ここで用いるリンカーは、異なる微小リアクター内に存在する異なるＲＮＡ全てに共通の配列に対して、相補的な配列を含むものを用いるのが好ましい。「異なるＲＮＡ全てに共通の配列」とは、ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ（生体分子１）を増幅するときに使用したＰＣＲプライマーの配列などを利用することができる。さらに、リンカーの末端にはピューロマイシンを結合させてもよい。リンカーのDNAとピューロマイシンの間はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、等の親水性かつフレキシブルな構造をもつことが望ましい。また、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後にＴ４ＲＮＡリガーゼで容易に連結できるように一部ハイブリダイゼーションしない配列を１塩基以上持たせることが好ましい。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、上記実施態様において作製されるチップを種々の反応溶液に接触させることで、該チップ上の生体分子２から生体分子３を合成する方法及びかかる方法により作製されたチップである。生体分子２がｍＲＮＡである場合、無細胞翻訳系を含有する溶液とｍＲＮＡが固定化されたチップを接触させて、反応を行わせることより、ｍＲＮＡを鋳型としてタンパク質（生体分子３）が合成される。この場合、上記一の実施態様において、ピューロマイシンを結合させたリンカーを用いると、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して、リンカーと結合するため、生体分子３が固定化されたチップを作製することができる。ここで、無細胞翻訳系としては、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽由来の無細胞系などを使用することができ、市販のものを利用してもよい。ここで合成された生体分子３は、ｍＲＮＡ、リンカーＤＮＡ及びタンパク質との複合体であるが、さらに、逆転写酵素を含む反応液中でｍＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応を行わせることで、生体分子１に対応するＤＮＡ、リンカーＤＮＡ及びタンパク質との複合体にすることもできる。
【００２２】
上記他の実施形態で作製されたチップ上の生体分子３がタンパク質の活性等を測定することで、所望の活性を保持するタンパク質を、該チップ上において容易に同定することができる。さらに、同定されたタンパク質に対応するＤＮＡ（生体分子１）の配列決定を行うことで、所望の活性を有するタンパク質に対応するＤＮＡの配列情報を容易に取得することができる。ここで、タンパク質の活性を測定する場合、該チップのタンパク質（つまり生体分子３）が固定化されている位置に対応するようなマイクロリアクターチップを用意し、マイクロリアクターチップの微小リアクター内にタンパク質活性を測定するために必要な溶液を予め充填し、該チップと該マイクロリアクターチップを重ね合わせて反応させることで、チップ上のタンパク質の活性を測定することができる。
【００２３】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
ＤＮＡからタンパク質チップを作製する方法は次のとおりである（図１）。
ステップ１：ライブラリ（ｃＤＮＡ）構築
ステップ２：チップ上でのライブラリの１分子までの希釈及び１分子ＰＣＲ
ステップ３：チップ上へのＰＣＲ産物の固定化
ステップ４：チップ上での転写
ステップ５：転写物の他のチップへの移し換えとその表面上にあるリンカーＤＮＡとの連結反応
ステップ６：ステップ５のチップ上への無細胞翻訳系の添加と、ＲＮＡ−タンパク質の連結反応及び逆転写反応によるＤＮＡとタンパク質のチップへの固定化
【００２５】
１．ライブラリ構築
モデルタンパク質としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を選び、蛍光活性に重要な６５残基目のスレオニンにランダムな変異を加えたものをライブラリとする。このライブラリは、図２に示す方法で５’側にＴ７プロモーター、５’ＵＴＲ（ＴＭＶ ｏｍｅｇａ）を、また、３’側にスペーサーを有するＤＮＡコンストラクトを構築した。使用したプライマーはＦｉｒｓｔ ｓｔｅｐのＴ７プロモーター及び５’ＵＴＲ領域を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためにプライマー１とプライマー２を利用した。また、ＧＦＰを含む領域をＰＣＲするためにプライマー３とプライマー４を用いた。
（プライマー１）
５’−ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’
（配列番号１）
（プライマー２）
５’−ＣＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧ−３’
（配列番号２）
（プライマー３）
５’−ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ−３’ （配列番号３）
（プライマー４）
５’−ＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＮＮＮＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧ−３’ （配列番号４）
【００２６】
２．ＤＮＡの1分子への希釈及び1分子PCR
ＰＣＲで増幅したフラグメント（８５３ｂｐ）はキアゲンのＤＮＡ精製キットにより精製し、７．０４ｎＭの濃度に調製した。このｃＤＮＡをヌクレアーゼーフリーの精製水によって１μｌあたり４×１０８，４×１０７，４×１０６，４×１０５，４×１０４，４×１０３，４×１０２，４０，４，０．４分子になるように希釈した。これらをテンプレートとして、１×ＥｘＴａｑ ＰＣＲ バッファー（Ｔａｋａｒａ社）中、 最終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２μＭのｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−Ｃｙ３ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号５）；５’末端をＣｙ３で標識したもの）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （５’−ＢｉｏｔｉｎＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号６）；５’末端をビオチンで標識したもの）にて、０．５ ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ社）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃２分、（９４℃（３０秒）、６４℃（３０秒）、７２℃（６０秒））を５０サイクル行い、最後に７２℃（１０ｍｉｎ）で伸長反応を行った。得られた反応物は、２μｌ分取し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した（図３）。
【００２７】
３．チップ上へのPCR産物の固定化
増幅された１分子ＰＣＲ産物はキアゲンの精製カラムで精製した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって濃度を測定した。これらのビオチン化ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液を等容量の２×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と混合し、３８４穴マイクロプレートに加えた。次に、１０μｌスケールの反応物をストレプトアビジン塗布スライドガラス（ＡｒｒａｙＩｔ社）にトランスファーし、１５分間インキュベーションした。その後、１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでガラス表面を洗浄した。増幅したＤＮＡはＣｙ３の蛍光を発するため、スライドガラスをフルオロイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ社）で確認した（図４）。
【００２８】
４．チップ上での転写
上記のスライド上のｃＤＮＡをさらにＴ７転写酵素及びその反応液（ＲｉｂｏＭＡＸ， Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０μｌを満たした３８４穴マイクロプレートに合わせ、３７℃で３時間反応させた。その後、ＤＮａｓｅによりＤＮＡテンプレートを分解し、各ウェルから反応液を採取し、ＲＮＡ ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した（図５）。
【００２９】
５．マイクロリアクター内での生体分子活性の測定
本発明により作製されたチップ上の生体分子の活性を測定するにあたり、モデルタンパク質の活性測定を行った。測定モデル系としてアルデヒド分解酵素（ＡＫＲ）を用い、微量酵素反応を上記手法にて作製したＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）により作製した直径、高さ６μｍ（０．１５ｐｌ）のマイクロリアクターを１万個有するマイクロリアクターアレイチップ上で測定した。酵素ＡＫＲ ２μＭ（１万個／リアクター）、基質Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ ２０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ ０．２ｍＭをリアクター内に封入し、アルデヒド分解酵素反応（アルデヒド＋ＮＡＤＰＨ→アルコール＋ＮＡＤＰ＋）を、水銀ランプのｉ線（３６５ｎｍ）を励起光として、波長４００ｎｍ以上のＮＡＤＰＨ自家蛍光強度を、高感度冷却ＣＣＤカメラ用いて検出しＮＡＤＰＨの蛍光強度の変化から、アルデヒド還元酵素の進行を測定した。測定結果（図６）から酵素活性は１−１０（ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄｉｚｅｄ／ｍｉｎ／ＡＫＲ）と算出された。このように個々のマイクロリアクター内の酵素の活性は光学計測により評価可能であることが明らかとなった。また、光学測定に限らず、酵素反応は電気化学的計測によっても可能であり、微小電極をマイクロリアクター内に集積化することで並列計測の実現も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
医薬品開発における医薬品候補分子アッセイのハイスループット化に有用である。また、診断薬、診断機器等の分野で用いられる診断チップとして利用可能である。さらに、バイオエタノール合成酵素等の代謝系解析に利用し、さらに進化工学的な手法で今後の環境・エネルギー分野に有用な機能分子の探査にも貢献することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のチップを作製する過程を示した模式図である。
【図２】ＧＦＰの変異体のライブラリを構築するためのステップを模式的に示した図である。
【図３】ＧＦＰのｃＤＮＡライブラリを希釈し、これを鋳型にＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図４】チップ上に固定化した１分子ＰＣＲ産物を、Ｃｙ３の蛍光を検出する方法により確認した結果を示す。Ｎｅｇ．：ＤＮＡ無しのネガティブコントロール
【図５】ＰＣＲ産物の固定化したチップをＴ７転写酵素及びその反応液を満たしたマイクロプレートと接触させ、転写反応を行わせた後、マイクロプレートの各ウェル中に存在するＲＮＡを電気泳動により確認した結果を示す。
【図６】マイクロリアクター内での酵素反応（アルデヒド分解酵素）の測定結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を配列状に固定化したチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を網羅的に解析する有力なツールとして、ＤＮＡチップやプロテインチップなどが現在利用されている。これらのチップは、ＤＮＡ、タンパク質を基板上にアレイ状に固定化し、目的に応じた反応系に供することで、目的の機能を発揮する可能性のある分子の同定を網羅的に行うことができる。
【０００３】
ＤＮＡチップに関しては、光リソグラフィー技術を用いてチップ上にＤＮＡを合成することで位置情報と配列情報を対応させるアフィメトリックス社の方法とすでに既知の配列をもったＤＮＡをチップ上に貼り付けるスタンフォード大方式が現在多く利用されている。大規模な配列を一度に調べるにはアフィメトリックス方式が有利で、ある限られた既知の配列のＤＮＡ集団を調べるにはスタンフォード方式が便利である。これらの方法は目的に応じて使い分けられている。
【０００４】
また、プロテインチップの作製に関しては、Ｐｈｙｌｏｓ社による、アフィメトリックス型のＤＮＡ基板にＩＶＶ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）のｍＲＮＡ領域をハイブリダイゼーションさせてチップ上にタンパク質を番地化して非共有結合的に固定化する試み（非特許文献１）があるもののその多くは、特定の限られたタンパク質集団をスポットしてチップ化するスタンフォード方式のプロテインチップである。このため未知の配列からなる遺伝子を元にした膨大なライブラリからプロテインチップを作製することは極めて困難な状況である。ちなみに、Ｐｈｙｌｏｓ社の方法はこの点でもっとも有望であるが、タンパク質の固定化にハイブリダイゼーションによる方法を用いていることから、様々なバッファー条件下で酵素アッセイをする目的に対しては、安定な固定化法とは言えず、未だ実用的な段階には至っていない。さらに、ハイブリダイゼーションさせる領域をタグとして導入するプロセスを加えることになるため実用性の上から必ずしも効率的とは言えない。
【０００５】
一方、発明者らは、ＩＶＶ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）法を利用した、有用タンパク質の同定、開発に関し、種々の技術を提供している（特許文献１）。ＩＶＶ法とは、ランダムな配列を有する多量のペプチド又は該ペプチドからなるペプチドライブラリーの中から、目的に応じたペプチド分子を選択する方法で、進化工学上、有力な手法として注目を浴びている。ＩＶＶ法は、核酸配列情報とこれに対応するタンパク質の活性又は機能を、１対１で対応づけることができる技術であるため、本法を網羅的解析に利用することができれば、所望の活性を有するタンパク質とこれをコードする核酸配列情報を同時に、かつ、大量に取得することも可能となる。しかしながら、現段階では、このような方法により網羅的な解析を可能にする技術等は報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｅｎｇら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２：４８−５７，２００２
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００６／０４１１９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、膨大な変異体を含むＤＮＡライブラリから、クローニングの過程を経ずに、各変異体タンパク質を個別にチップ上に固定化する方法について鋭意研究を行った結果、μＴＡＳ技術を用いることで、所望のＤＮＡをアレイ化したＤＮＡチップに対応するｍＲＮＡチップ、プロテインチップを一連の過程において作製することが可能であることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、マイクロリアクターチップを用いた生体分子アッセイチップを作製する方法、及び該方法によって作製されるチップの提供を目的とする。
さらに、本発明は、該チップ上に固定化された生体分子から、固定化された位置を変更することなく、他の生体分子を合成する方法、及び該方法によって作製されるチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）
に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法。
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程」である。
（２）本発明の第２の態様は、「上記（１）の工程（ａ）に記載の「複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１」を作製する工程が、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（ａ）生体分子１と生体分子を増幅するための反応試薬との混合液を、マイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子１が確率分布的に１分子以下になるように希釈して充填する工程、
（ｂ）生体分子１を増幅する反応を行う工程、
（ｃ）該マイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板１と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板１を重ね合わせ、増幅した生体分子１を基板上に固定する工程」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記生体分子１が核酸又は核酸誘導体であることを特徴とする上記（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記生体分子１を増幅する反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記核酸誘導体がリンカーＤＮＡを連結したものであることを特徴とする上記（３）又は（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記リンカーＤＮＡにピューロマイシンが結合していることを特徴とする上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記基板１上にアビジンを固定化し、前記核酸又は核酸誘導体にビオチン化することを特徴とする上記（３）乃至（６）のいずれかに記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記生体分子１がＤＮＡであり、生体分子２がＲＮＡであることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記ＲＮＡがｍＲＮＡであることを特徴とする上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記基板２にピューロマイシンを結合したリンカーＤＮＡが固定化されていることを特徴とする上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法により作製したチップ」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「上記（１１）に記載のチップ上に固定化された生体分子２から生体分子３を合成する１又は複数種類の反応溶液中に該チップを浸し、生体分子３が配列状に固定化されたチップを作製する方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液であり、生体分子３がタンパク質−核酸複合体であることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液及び逆転写酵素を含む溶液であり、生体分子３がタンパク質−ＤＮＡ複合体であることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「上記（１１）乃至（１４）いずれかに記載の方法により作製したチップ」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が対応した位置に固定化された各チップを作製することができるため、ＤＮＡ上の核酸配列情報と、タンパク質の機能とを１対１に対応づけてモニターすることを可能とする。
【００１０】
本発明の方法及びチップを用いることで、所望の機能改変が達成された分子（ＤＮＡ又はタンパク質）を、比較的短時間にて同定することができる。
【００１１】
本発明の方法及びチップを用いることで、ゲノム解析等で得られた遺伝子（特に酵素に関わる）機能を短期間にて同定することができる。
【００１２】
本発明の方法及びチップを用い、代謝経路を解析するために複数の遺伝子の組み合わせを作りアッセイすることで、迅速に基質から代謝産物へ至る経路を同定できる。
【００１３】
本発明の方法及びチップを用いる場合、同一の酵素を各ウェルに加え、基質と阻害剤候補を加えることによる基質の濃度変化からより優れた阻害剤候補を選択できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、微小リアクターを備えたマイクロリアクターチップと基板を重ね合わせる工程を繰り返すことで、配列状に固定化された生体分子の固定化位置を変更することなく、該生体分子から他の生体分子を合成し、最終的には、最初に固定化された生体分子とは異なる生体分子が固定化されたチップを作製する方法、及び作製されたチップを提供するものである。より具体的には、例えば、ＤＮＡを固定化したチップからタンパク質を固定化したチップを、ＤＮＡ−タンパク質のチップ上の対応位置を変更せずに、連続的な工程により作製する方法を提供する。
本方法によれば、ＤＮＡライブラリ等から選択された他種類のＤＮＡを同一種類毎に配列状に固定化したＤＮＡチップから、各ＤＮＡがコードするタンパク質を該ＤＮＡの固定化位置と同じ位置に固定化したプロテインチップを作製することができる。
さらに、該プロテインチップ上のタンパク質を、ｍＲＮＡとの複合体として固定すれば、プロテインチップ上で逆転写反応を行わせることで、該タンパク質をコードするＤＮＡを固定化したチップを作製することも可能である。ここで、ｍＲＮＡは、ＤＮＡチップとマイクロリアクターチップを重ね合わせ、各微小リアクター内で転写反応を実行することで、対応するｍＲＮＡを微小リアクター内に取得することができる。
ｍＲＮＡとタンパク質との複合体は、例えば、ピューロマイシンなどタンパク質と特異的に結合する化合物等を結合させたリンカーＤＮＡを介して、作製することができる。すなわち、ｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有するリンカーＤＮＡであって、ピューロマイシンが結合したものを用いれば、該リンカーとｍＲＮＡが相補的部分で結合するため、生じた複合体は、ｍＲＮＡは該リンカーＤＮＡを介してピューロマイシンを結合しているものとなる。なお、リンカーＤＮＡとピューロマイシンとの結合は公知の手法により実施することができる。
【００１５】
さらに、該チップ上のタンパク質の固定化位置に対応した微小リアクターを備えたマイクロリアクターを用いることで、チップ上の全てのタンパク質の活性等をチップの作製と連続して測定することが可能となる。例えば、該チップ上のタンパク質活性を測定するための反応溶液を各微小リアクター中に添加したマイクロリアクターチップを、該微小リアクターと固定化されたタンパク質の位置が一致し、かつ、各タンパク質が微小リアクター内の反応溶液と十分に接触するように重ね合わせて、活性測定反応を実行することで、チップ上の全てのタンパク質の活性を同時に解析することが可能となる。
【００１６】
本方法は、目的のタンパク質の優れた活性を有する変異体の選択等において有効な方法である。例えば、特定のタンパク質に体系的に変異を導入したＤＮＡライブラーを固定化したチップを最初のＤＮＡチップとした場合、これに対応するプロテインチップの作製、プロテインチップ上のタンパク質の活性及び活性評価までを一つの工程として行うことができる。評価結果から所望のタンパク質を同定すれば、これをコードするＤＮＡは、ｍＲＮＡを逆転写することで容易に取得できるため、該タンパク質の一次配列情報も簡便に取得することができる。得られた一次配列情報に基づいて、更なるタンパク質の検索を行うこともできる。
【００１７】
以下に本発明の主な実施形態について記載する。
本発明の一の実施形態は、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法であり、
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程、を含む方法である。
ここで、「生体分子１」は、他の生体分子にｉｎ ｖｉｔｒｏにて変換することができるものが好ましく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが利用可能である。「生体分子１」は、基板上に配列状に固定する必要があるが、例えば、生体分子１がＤＮＡの場合、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、チップ表面をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。この場合、アビジンを基板上に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させるのが好ましい。また、生体分子１がＲＮＡである場合には、例えば、アビジン−ビオチン結合により基板上に結合させ該ＲＮＡの一部と相補的なＤＮＡリンカーを介して固定化する方法の他、ＲＮＡにアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、チップ表面をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを挙げることができる。この場合も上記と同様に、アビジンを基板上に固定化し、ビオチンをリンカーＤＮＡに結合させる方法が好ましい。
【００１８】
「マイクロリアクターチップ」とは、ポリマー、ガラス、シリコンなどの基板上に微細な流路や凹を形成し、この流路又は凹中（微小リアクター）において、化学反応を行うことができる、超微小な反応装置のことである。マイクロリアクターチップの表面は生体分子の吸着を抑制するためにPEGなどにより表面修飾を施してあることが好ましい。
本実施形態においては、基板上に固定化された生体分子がマイクロリアクター内の反応試薬と反応可能な様に接触する必要がある。ここで、基板１、基板２の表面は必ずしも平坦である必要はなく、例えば、生体分子を固定する表面積を増やすために凹凸を加工してもよい。ただし、基板とマイクロリアクターチップを重ね合わせた際に、マイクロリアクターチップ上の全てのマイクロリアクター内の試薬等の漏れがなく封じられるように、マイクロリアクターチップが接触する部分の基板表面は平坦である必要がある。
また、該反応を最適な状態で行わせるために、マイクロリアクターの温度、微小リアクター内のｐＨ条件などを制御する他の装置などを組み合わせて、実施してもよい。ここで反応試薬とは、例えば、生体分子１がＤＮＡであって、生体分子２がＲＮＡである場合には、転写に必要な試薬のことであり、該試薬は市販のものを使用しても、独自に調製したものを使用してもよい。
【００１９】
本実施形態の工程（ａ）で使用する基板１は、以下の方法によっても作製することができる。まず、生体分子１がＤＮＡである場合には、複数種類のＤＮＡの混合物（ＤＮＡライブラリなど）をＤＮＡ増幅試薬と混合し、混合物を適当なバッファーなどで希釈して、微小リアクターに分注する。ここで、各微小リアクターに確率的にＤＮＡが１分子になるように希釈して分注を行う。ＤＮＡと増幅試薬と希釈との前後は特に限定するものではない。分注後、ＤＮＡが増幅するのに適するように、マイクロリアクターチップの条件を設定し、反応を行わせると、各微小リアクター毎に異なる種類のＤＮＡが増幅される。次に、増幅されたＤＮＡを含むマイクロリアクターチップを基板１と接触するように密着して、マイクロリアクター内のＤＮＡ分子を基板１上に固定する。ここで、ＤＮＡを増幅する場合、ＰＣＲ反応を利用することが好ましく、該反応のために必要な反応溶液な市販のものを使用することができる。また、マイクロリアクター内のＤＮＡを基板上に固定する場合、ＤＮＡにビオチンが取り込まれるように増幅反応を行わせ、基板をアビジンでコートしておけば、アビジン−ビオチン結合を介して、ＤＮＡは容易に基板上に固定化することができる。ＤＮＡにビオチンを取り込ませる方法としては、例えば、ビオチン標識したＰＣＲプライマーを用いる方法などを利用することができる。
また、生体分子１又は２が核酸である場合、該核酸にリンカーとなるＤＮＡを連結し、その末端にピューロマイシンを結合したものを用いてもよい。
【００２０】
本実施形態においては、マイクロリアクター内で合成された生体分子２を他の基板（基板２）上に固定化することで、生体分子２を配列状に固定化したチップを作製するものである。ここで生体分子２を基板上に固定化する方法としては、生体分子２がＲＮＡである場合、例えば、ＲＮＡの一部と相補的な配列を含むリンカーをあらかじめ基板上に固定化しておくことにより、マイクロリアクター内のＲＮＡが容易に基板上に固定化される。ここで用いるリンカーは、異なる微小リアクター内に存在する異なるＲＮＡ全てに共通の配列に対して、相補的な配列を含むものを用いるのが好ましい。「異なるＲＮＡ全てに共通の配列」とは、ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ（生体分子１）を増幅するときに使用したＰＣＲプライマーの配列などを利用することができる。さらに、リンカーの末端にはピューロマイシンを結合させてもよい。リンカーのDNAとピューロマイシンの間はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、等の親水性かつフレキシブルな構造をもつことが望ましい。また、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後にＴ４ＲＮＡリガーゼで容易に連結できるように一部ハイブリダイゼーションしない配列を１塩基以上持たせることが好ましい。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、上記実施態様において作製されるチップを種々の反応溶液に接触させることで、該チップ上の生体分子２から生体分子３を合成する方法及びかかる方法により作製されたチップである。生体分子２がｍＲＮＡである場合、無細胞翻訳系を含有する溶液とｍＲＮＡが固定化されたチップを接触させて、反応を行わせることより、ｍＲＮＡを鋳型としてタンパク質（生体分子３）が合成される。この場合、上記一の実施態様において、ピューロマイシンを結合させたリンカーを用いると、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して、リンカーと結合するため、生体分子３が固定化されたチップを作製することができる。ここで、無細胞翻訳系としては、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽由来の無細胞系などを使用することができ、市販のものを利用してもよい。ここで合成された生体分子３は、ｍＲＮＡ、リンカーＤＮＡ及びタンパク質との複合体であるが、さらに、逆転写酵素を含む反応液中でｍＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応を行わせることで、生体分子１に対応するＤＮＡ、リンカーＤＮＡ及びタンパク質との複合体にすることもできる。
【００２２】
上記他の実施形態で作製されたチップ上の生体分子３がタンパク質の活性等を測定することで、所望の活性を保持するタンパク質を、該チップ上において容易に同定することができる。さらに、同定されたタンパク質に対応するＤＮＡ（生体分子１）の配列決定を行うことで、所望の活性を有するタンパク質に対応するＤＮＡの配列情報を容易に取得することができる。ここで、タンパク質の活性を測定する場合、該チップのタンパク質（つまり生体分子３）が固定化されている位置に対応するようなマイクロリアクターチップを用意し、マイクロリアクターチップの微小リアクター内にタンパク質活性を測定するために必要な溶液を予め充填し、該チップと該マイクロリアクターチップを重ね合わせて反応させることで、チップ上のタンパク質の活性を測定することができる。
【００２３】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
ＤＮＡからタンパク質チップを作製する方法は次のとおりである（図１）。
ステップ１：ライブラリ（ｃＤＮＡ）構築
ステップ２：チップ上でのライブラリの１分子までの希釈及び１分子ＰＣＲ
ステップ３：チップ上へのＰＣＲ産物の固定化
ステップ４：チップ上での転写
ステップ５：転写物の他のチップへの移し換えとその表面上にあるリンカーＤＮＡとの連結反応
ステップ６：ステップ５のチップ上への無細胞翻訳系の添加と、ＲＮＡ−タンパク質の連結反応及び逆転写反応によるＤＮＡとタンパク質のチップへの固定化
【００２５】
１．ライブラリ構築
モデルタンパク質としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を選び、蛍光活性に重要な６５残基目のスレオニンにランダムな変異を加えたものをライブラリとする。このライブラリは、図２に示す方法で５’側にＴ７プロモーター、５’ＵＴＲ（ＴＭＶ ｏｍｅｇａ）を、また、３’側にスペーサーを有するＤＮＡコンストラクトを構築した。使用したプライマーはＦｉｒｓｔ ｓｔｅｐのＴ７プロモーター及び５’ＵＴＲ領域を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためにプライマー１とプライマー２を利用した。また、ＧＦＰを含む領域をＰＣＲするためにプライマー３とプライマー４を用いた。
（プライマー１）
５’−ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’
（配列番号１）
（プライマー２）
５’−ＣＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧ−３’
（配列番号２）
（プライマー３）
５’−ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ−３’ （配列番号３）
（プライマー４）
５’−ＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＮＮＮＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧ−３’ （配列番号４）
【００２６】
２．ＤＮＡの1分子への希釈及び1分子PCR
ＰＣＲで増幅したフラグメント（８５３ｂｐ）はキアゲンのＤＮＡ精製キットにより精製し、７．０４ｎＭの濃度に調製した。このｃＤＮＡをヌクレアーゼーフリーの精製水によって１μｌあたり４×１０８，４×１０７，４×１０６，４×１０５，４×１０４，４×１０３，４×１０２，４０，４，０．４分子になるように希釈した。これらをテンプレートとして、１×ＥｘＴａｑ ＰＣＲ バッファー（Ｔａｋａｒａ社）中、 最終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２μＭのｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−Ｃｙ３ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号５）；５’末端をＣｙ３で標識したもの）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （５’−ＢｉｏｔｉｎＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号６）；５’末端をビオチンで標識したもの）にて、０．５ ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ社）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃２分、（９４℃（３０秒）、６４℃（３０秒）、７２℃（６０秒））を５０サイクル行い、最後に７２℃（１０ｍｉｎ）で伸長反応を行った。得られた反応物は、２μｌ分取し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した（図３）。
【００２７】
３．チップ上へのPCR産物の固定化
増幅された１分子ＰＣＲ産物はキアゲンの精製カラムで精製した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって濃度を測定した。これらのビオチン化ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液を等容量の２×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と混合し、３８４穴マイクロプレートに加えた。次に、１０μｌスケールの反応物をストレプトアビジン塗布スライドガラス（ＡｒｒａｙＩｔ社）にトランスファーし、１５分間インキュベーションした。その後、１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでガラス表面を洗浄した。増幅したＤＮＡはＣｙ３の蛍光を発するため、スライドガラスをフルオロイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ社）で確認した（図４）。
【００２８】
４．チップ上での転写
上記のスライド上のｃＤＮＡをさらにＴ７転写酵素及びその反応液（ＲｉｂｏＭＡＸ， Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０μｌを満たした３８４穴マイクロプレートに合わせ、３７℃で３時間反応させた。その後、ＤＮａｓｅによりＤＮＡテンプレートを分解し、各ウェルから反応液を採取し、ＲＮＡ ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した（図５）。
【００２９】
５．マイクロリアクター内での生体分子活性の測定
本発明により作製されたチップ上の生体分子の活性を測定するにあたり、モデルタンパク質の活性測定を行った。測定モデル系としてアルデヒド分解酵素（ＡＫＲ）を用い、微量酵素反応を上記手法にて作製したＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）により作製した直径、高さ６μｍ（０．１５ｐｌ）のマイクロリアクターを１万個有するマイクロリアクターアレイチップ上で測定した。酵素ＡＫＲ ２μＭ（１万個／リアクター）、基質Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ ２０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ ０．２ｍＭをリアクター内に封入し、アルデヒド分解酵素反応（アルデヒド＋ＮＡＤＰＨ→アルコール＋ＮＡＤＰ＋）を、水銀ランプのｉ線（３６５ｎｍ）を励起光として、波長４００ｎｍ以上のＮＡＤＰＨ自家蛍光強度を、高感度冷却ＣＣＤカメラ用いて検出しＮＡＤＰＨの蛍光強度の変化から、アルデヒド還元酵素の進行を測定した。測定結果（図６）から酵素活性は１−１０（ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄｉｚｅｄ／ｍｉｎ／ＡＫＲ）と算出された。このように個々のマイクロリアクター内の酵素の活性は光学計測により評価可能であることが明らかとなった。また、光学測定に限らず、酵素反応は電気化学的計測によっても可能であり、微小電極をマイクロリアクター内に集積化することで並列計測の実現も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
医薬品開発における医薬品候補分子アッセイのハイスループット化に有用である。また、診断薬、診断機器等の分野で用いられる診断チップとして利用可能である。さらに、バイオエタノール合成酵素等の代謝系解析に利用し、さらに進化工学的な手法で今後の環境・エネルギー分野に有用な機能分子の探査にも貢献することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のチップを作製する過程を示した模式図である。
【図２】ＧＦＰの変異体のライブラリを構築するためのステップを模式的に示した図である。
【図３】ＧＦＰのｃＤＮＡライブラリを希釈し、これを鋳型にＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図４】チップ上に固定化した１分子ＰＣＲ産物を、Ｃｙ３の蛍光を検出する方法により確認した結果を示す。Ｎｅｇ．：ＤＮＡ無しのネガティブコントロール
【図５】ＰＣＲ産物の固定化したチップをＴ７転写酵素及びその反応液を満たしたマイクロプレートと接触させ、転写反応を行わせた後、マイクロプレートの各ウェル中に存在するＲＮＡを電気泳動により確認した結果を示す。
【図６】マイクロリアクター内での酵素反応（アルデヒド分解酵素）の測定結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法。
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程
【請求項２】
請求項１の工程（ａ）に記載の「複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１」を作製する工程が、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（ａ）生体分子１と生体分子を増幅するための反応試薬との混合液を、マイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子１が確率分布的に１分子以下になるように希釈して充填する工程、
（ｂ）生体分子１を増幅する反応を行う工程、
（ｃ）該マイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板１と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板１を重ね合わせ、増幅した生体分子１を基板上に固定する工程
【請求項３】
前記生体分子１が核酸又は核酸誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子１を増幅する反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸誘導体がリンカーＤＮＡを連結したものであることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカーＤＮＡにピューロマイシンが結合していることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基板１上にアビジンを固定化し、前記核酸又は核酸誘導体にビオチン化することを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子１がＤＮＡであり、生体分子２がＲＮＡであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基板２にピューロマイシンを結合したリンカーＤＮＡが固定化されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法により作製したチップ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のチップ上に固定化された生体分子２から生体分子３を合成する１又は複数種類の反応溶液中に該チップを浸し、生体分子３が配列状に固定化されたチップを作製する方法。
【請求項１３】
前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液であり、生体分子３がタンパク質−核酸複合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液及び逆転写酵素を含む溶液であり、生体分子３がタンパク質−ＤＮＡ複合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４いずれかに記載の方法により作製したチップ。
【請求項１】
下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、生体分子が配列状に固定化されたチップの作製方法。
（ａ）複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製した基板１上に固定化された生体分子１の配列位置と重なる位置に微小リアクターを具備するマイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子２を合成するための反応試薬を充填する工程、
（ｃ）生体分子２を合成するための反応試薬が生体分子１と接触するように、マイクロリアクターチップと基板１を密着させ、微小リアクター内で生体分子２の合成反応を行い生体分子２を合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）を終了したマイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板２と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板２を重ね合わせ、生体分子２を該基板２上に固定する工程
【請求項２】
請求項１の工程（ａ）に記載の「複数の同一種類の生体分子１を配列状に固定化した基板１」を作製する工程が、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（ａ）生体分子１と生体分子を増幅するための反応試薬との混合液を、マイクロリアクターチップの微小リアクター内に、生体分子１が確率分布的に１分子以下になるように希釈して充填する工程、
（ｂ）生体分子１を増幅する反応を行う工程、
（ｃ）該マイクロリアクターチップの微小リアクター内の反応溶液が、基板１と接触するように、該マイクロリアクターチップと基板１を重ね合わせ、増幅した生体分子１を基板上に固定する工程
【請求項３】
前記生体分子１が核酸又は核酸誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子１を増幅する反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸誘導体がリンカーＤＮＡを連結したものであることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカーＤＮＡにピューロマイシンが結合していることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基板１上にアビジンを固定化し、前記核酸又は核酸誘導体にビオチン化することを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子１がＤＮＡであり、生体分子２がＲＮＡであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基板２にピューロマイシンを結合したリンカーＤＮＡが固定化されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法により作製したチップ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のチップ上に固定化された生体分子２から生体分子３を合成する１又は複数種類の反応溶液中に該チップを浸し、生体分子３が配列状に固定化されたチップを作製する方法。
【請求項１３】
前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液であり、生体分子３がタンパク質−核酸複合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子２がｍＲＮＡであり、前記反応溶液が無細胞翻訳系を含有する溶液及び逆転写酵素を含む溶液であり、生体分子３がタンパク質−ＤＮＡ複合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４いずれかに記載の方法により作製したチップ。
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１１６２１８（Ｐ２００８−１１６２１８Ａ）
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２９７２６７（Ｐ２００６−２９７２６７）
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【出願人】（５０６３６７４３４）ジェナシス株式会社 (6)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【出願人】（５０６３６７４３４）ジェナシス株式会社 (6)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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