生体物質採取方法
【課題】細胞内に含まれる生体成分のうち、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、タンパク質、あるいは、糖タンパク質を細胞を殺すこと無しに得る。
【解決手段】特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取する。
【解決手段】特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内に含まれる生体成分のうち、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、タンパク質、あるいは、糖タンパク質を細胞を殺すこと無しに得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体）をプローブとしてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。
【０００３】
さらに、これら分離したｍＲＮＡはベクターに組み込んだり、ＰＣＲで増幅したりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。いずれの場合でも、試料としては、細胞や組織を破砕して細胞内に存在するＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質を抽出するので、もとの細胞は死んでしまう。
【０００４】
ところが、多くの生命は外界の状況や細胞自身の分化、加齢により、同一遺伝子から異なるｍＲＮＡが産出されることが数多く報告されている。この現象はスプライシングバリアントとかオルターナティブスプライシングと呼ばれている。これは、プレマチュアーなｍＲＮＡがゲノムより転写された後、エピゲネティックな制御により状況に応じて異なるエキソンが使われて成熟ｍＲＮＡが作られるためである。あるいは免疫細胞系のＴ細胞やＢ細胞のように、免疫幹細胞からの分化の過程で、ゲノムそのものの配列が再構成されたり変異が導入されたりするためである。
【０００５】
さらに、細胞のガン化においては、遺伝子の配列において、タンパク質翻訳レベルでのアミノ酸変異やタンパク質が作られなくなってしまうような変異が起きたり、ＬＯＨのように１対の遺伝子のうち片方の遺伝子が消失してしまったりするケースが数多く存在する。
【０００６】
このような変異は、細胞にとって普遍的なことではないので、理想的には同一細胞から連続的にｍＲＡＮなりタンパク質を分離して分析できるようにする必要がある。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
おそらくｍＲＡＮの分析で最も多用されている技術はＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレー）とＰＣＲであろう。タンパク質の分析では臨床目的に用いられるのがイムノアッセイ、タンパク質そのものの研究にはＮＭＲやＸ線回折、質量分析器が用いられている。工学的には前記した遺伝子組換えが重要な技術である。いずれにせよ、細胞からｍＲＮＡやゲノムやタンパク質を分離採取する必要がある。
【０００９】
しかし、現状では、細胞を生かしたままその細胞質や核などに含まれる生体物質を分析するには、細胞を外界から隔離している細胞膜を破壊し、内容物を得る必要があった。一部の技術としては、界面活性剤であるＮＰ−４０を利用して細胞膜にランダムに穴を開け、細胞質に含まれる物質を細胞の外に溶出させてこれを得る方法が存在する。あるいは分泌性のタンパク質の場合は例外的にそのまま利用できる。
【００１０】
しかし、これらは、汎用的な技術として細胞を生かしたまま、その細胞から生体物質を得ることはできない。これが生化学の実験研究におけるもっとも基本的な問題点のひとつであった。
【００１１】
昨今の生物学では、個々の細胞が外界や隣接する細胞とどのように影響しあいながら機能しているかを調べる研究が盛んになりつつある。このような目的には、従来の細胞を破壊してそのＲＮＡなどを調べる方法は適切ではない。
【００１２】
また、再生医療に用いるエンブリオニックステムセルのような基本的に１細胞の取り扱いが必要な場合は、元の細胞を分析のために破壊することはできない。これらは分化誘導して利用するわけであるが、分裂初期の段階からの細胞状態の追跡とコントロールが必要となる。
【００１３】
さらに、従来技術のように細胞を破壊して、内容物を得る方法では次のような問題もある。細胞を破壊するとその時点で、ｍＲＮＡなどはＲＮａｓｅに晒され、急激に分解してしまう。実際、完全長のｍＲＮＡ（多くの場合、安定なｃＤＮＡに直ちに置き換える操作をする）を得るのはきわめて難しく、しかも実験者の技量に取得率が依存することはよく経験することである。腕のよい実験研究者で６０％程度、腕が悪いとほぼ０％というように完全長ｍＲＮＡを得ることは難しい。瞬時に細胞からｍＲＮＡを採取できる技術が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの問題点を解決するために、本発明では、生きた細胞から瞬時にｍＲＮＡやＤＮＡやタンパク質を採取する手段を提供することにある。細胞は使い切りではなく生かしたまま、必要に応じて複数回ｍＲＮＡやタンパク質の解析ができる方法を提案することを目的とする。このための生体物質の分離デバイスと、デバイスに使用するケミストリーと分離方法を提案する。
【００１５】
細胞を生かしたまま、その細胞の内容物を得るため、先端直径が細胞に比べ十分細い針を細胞に刺して針先端に内容物を付着させて採取する。
【００１６】
ｍＲＮＡを得るには、針先端にはｍＲＮＡを採取するオリゴＴをプローブとして固定したものを用いる。あるいはオリゴＴの３’末端側に２から４程度の異なる配列のオリゴを固定してｍＲＮＡをポリＡとのハイブリダイゼーション安定性を確保したプローブを用いる。このときに用いるプローブは通常のリン酸ジエステル結合で作られているポリヌクレオチドでは細胞内のエンド抜くレア−ゼで分解を受けやすいのと、ホールディングしやすいｍＲＮＡのプロービング配列部分がふさがれてしまうことを回避するために、ＰＮＡやそれに類してマイナス荷電をプローブに持たない人工ポリヌクレオチドを用いる。
【００１７】
特定のタンパク質を得るには、抗体を針先端に固定したものを用いて特定タンパク質を採取する。抗体のＦｃ部分は目的物質以外を非特異吸着する可能性があるので、これを除去したＦ（ａｂ’）２を用いる。
【００１８】
細胞に針を刺す場合は、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端部分（細胞に挿入される部分）の直径を細胞に対して１／５以下とする。さらに、生体試料チップ先端部３にコートされた酸化チタンＴｉＯ２の領域５を設ける。或いは、針の先端部分にアルギニンをコートしておき、細胞表面の細胞膜のりん脂質とのインタラクションを容易とし、スムーズに針が差し込まれるようにしている。アルギニンはアルギニンモノマーが少なくても狭い範囲に６分子程度存在するのが有効である。あるいはオリゴアルギニンを固定して用いてもよい。
【００１９】
表面に特定生体物質を捕捉した針を細胞から引き抜き、採取するわけであるが、ｍＲＮＡの場合は針をそのままＰＣＲ反応溶液に浸し、特定ｍＲＮＡの特定配列部分を増幅して得る。あるいは一端逆転写してｃＤＮＡを得てから特定遺伝子をＰＣＲ増幅してもよい。タンパク質の場合は増幅できないのでそのままの利用ということになり、実質的に細胞内特定物質量の測定がもっとも有効な利用形態となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞を破壊せずに、細胞中に含まれる生体物質を採取できる。従来は困難であった細胞を破壊せずにｍＲＮＡや核内タンパク質の定量解析が可能となる。細胞を殺さないので、解析した細胞そのものを培養して利用することが可能となる。これにより、再生医療の最大のボトルネックであるステムセルの素性を解析し、目的に合った細胞のみを分化誘導し、利用することが可能となる。分化誘導中においても分裂細胞を殺さずに細胞内生体物質を解析できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例１）
図１は実施例１の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。図２（Ａ）は、実施例１で使用する針の先端部の構成の一例を示す図であり、図２（Ｂ）は、針の全体構成を示す斜視図である。
【００２２】
図１において、１は細胞、２は細胞核、３は針の先端部、４は容器、５はＰＣＲのための反応液である。針３の先端部２２には、図２（Ａ）に示すように、プローブ２１が固定されている。針３は、図２（Ｂ）に示すように、支持部８を介して基部７により保持される。針３の先端部はきわめて小さいものである。この取り扱いを容易にするために、針３の先端部は、ホルダ８を有し、ホルダ８は操作基板７に結合される。ホルダ８は、例えば、１ｍｍφとし、操作基板７は４ｍｍ×５ｍｍとする。
【００２３】
実施例１では大腸がん細胞に針を刺して、中に存在する特定ｍＲＮＡを採取する方法に関し説明する。プローブ２１としては２６塩基長のポリＴの３’末端に５塩基長のランダム配列オリゴＤＮＡが結合さている。これは、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。プローブ２１は細胞内のｍＲＮＡと容易にインタラクションするようにＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）でできている。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。このため、ハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。また、細胞膜を通過するときにリン脂質との反発力を生じないのでスムーズに針を刺すことができる。さらに、ＴｉＯ２が固定された領域５を設け、生体試料チップ先端部３を細胞１に刺すときに、３３５ｎｍの紫外線を照射すると、コートされた酸化チタン５の有機物分解作用により容易に細胞１に刺さる。
【００２４】
針３の固相表面上にプローブ２１が高密度に固定されているケースで通常のＤＮＡプローブを用いると、マイナス荷電のバリアーを超えて標的ＤＮＡがプローブに接近する必要があり、反応速度論的にも熱力学的に見ても不利になる。また、標的ｍＲＮＡは必ず１本鎖になる必要があるが、実際は分子内で３次元的にホールディングしており、プローブ２１が結合するプロービングサイトが埋まっているケースがある。ＰＮＡのようにマイナス荷電を持たないプローブを用いることで、プローブ自体の電荷をなくすことができるので、ハイブリダイゼーションの速度と収率が向上する。
【００２５】
さらに、ＰＮＡの電荷を持たない特性は、静電的な反発力を生じないので、標的ＤＮＡが２本鎖であっても競争的に２本鎖にもぐりこみ競争的にハイブリダイゼーションすることができる。さらに、細胞膜もマイナスに荷電したリン脂質で覆われているため、針３の表面にマイナス荷電があると、針３と細胞１の間で反発力がはたらき、針３を刺しづらくなる。ＰＮＡでできたプローブ２１を固定した針３を用いることでスムーズに細胞に針を刺すことができる。
【００２６】
工程１）に示すように、細胞内生体物質の採取のターゲットである細胞１に先端部分が細胞に比べ１／５以下の直径の細い針３を刺す。プレマチュアーなｍＲＮＡ或いは核タンパク質を採取するには針を核２に刺す。細胞１に針３を刺した状態を３０秒間維持する。
【００２７】
工程２）では針３を細胞１から引き抜く。
【００２８】
工程３）では、直ちに、２×ＳＳＣで針３の先端部２２を洗浄する。
【００２９】
工程４）では、針３の先端部２２のプローブ２１に捕捉されているｍＲＮＡのうち特定ｍＲＮＡを増幅する。容器４には特定ｍＲＮＡに対応するプライマー組と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとポリメラーゼの基質であるｄＮＴＰとＭｇとｐＨ９のＴｒｉｓ系緩衝液からなる反応液５が２μｌ含まれている。反応液上面は、操作中の蒸発を防ぐため、２μｌのミネラルオイルが重層してある。
【００３０】
ここでは、図２に示すHomo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 1 （ＴＡＣＳＴＤ 1）に特異的な配列部分を増幅する。ＴＡＣＳＴＤ１は上皮細胞でガンになると多量に発現するといわれている全長１５２８ｂｐのｍＲＮＡである。ヒトＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡ配列に関しては、HUGO Gene Normenclature Committee、鉄LC new solute carrier superfamily proposed members (SLC) HGNC approved煤A禰GNC Gene Grouping/Family Nomenclature煤A[online]、HUGO、[平成16年8月1日検索]、、インターネット< URL: http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily.shtml>に記載されている。
【００３１】
配列番号１と配列番号２の配列の合成オリゴＤＮＡ（濃度：０．２ｐｍｏｌ／μｌ）を、それぞれ、プライマーとして、定法に従いＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲは９４℃変性５秒間、５５℃アニール１０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３５回繰り返す。反応液量は前記したとおり、２μｌで行う。ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。その結果、２３０ｂｐの位置に実質的にシングルの電気泳動分離バンドが得られる。データベースから予想されるＰＣＲ産物の塩基長は２３３ｂｐである。
ＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴ ＧＡＧＡＡＣＣＴＡＣ ＴＧ ：（配列番号１）
ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡ ＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡ ：（配列番号２）
次に、最初に針を刺した細胞に対して、１６時間後に、再度、工程１）から工程４）を繰り返し、ｍＲＮＡの採取とＰＣＲ増幅を行う。２回目の針刺しは、コンタミネーションを防ぐため、１回目の針刺しとは別の針３を用いる。
【００３２】
２回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡに対して、今度は、同じヒトＴＡＣＳＴＤ１の別の配列部分を増幅するプライマーで増幅を行う。このプライマーは配列番号３と配列番号４のそれぞれから作成する。
ＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧ ＧＣＴＧＡＧＡＴＡＡ ＡＧＧ ：（配列番号３）
ＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴ ＡＴＴＴＴＧＡＧＴＡ ＣＡＧＧ ：（配列番号４）
このときのＰＣＲ条件は、９４℃変性５秒間、５２℃アニール１０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３５回繰り返す。
【００３３】
１回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡと同様に、ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。その結果、今度は、２１５ｂｐの電気泳動分離バンドが一本得られる。配列から計算される塩貴重は２１６ｂｐである。１回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた溶液の２３０ｂｐの位置にはバンドは確認されない。
【００３４】
この結果は、最初の針刺しから１６時間を経過しても細胞が死んでいないことを示す。すなわち、最初の針刺しで細胞１が死亡する場合は、細胞質でＲＮａｓｅによりｍＲＮＡが直ちに分解を始めるので、実質ｍＲＮＡを増幅することができないのに対して、２回目の針刺で採取されたｍＲＮＡがＰＣＲにより増幅できたので、最初の針刺しで細胞１が死亡していないことが確認できる。
【００３５】
（実施例２）
実施例２では、一回の針刺しでｍＲＮＡを生きた細胞から採取し、複数のｃＤＮＡを得る方法について述べる。ここでは実施例１と同様にＰＮＡで出来たプローブ２１が固定されている針３でｍＲＮＡを採取する。
【００３６】
図３は、実施例２で使用する針４３の具体例を示す図である。実施例１と同様にプローブ２１の他に先端部の領域９にＴｉＯ２が固定されるのに加え、さらに、アルギニン４８が固定されている。固定するアルギニンはアミノ酸１個でも良いし、オクタマーまでの長さでも良い。固定法はＰＮＡを固定する溶液に１／４０モル比で加えておいて針全体に満遍なく固定している。針４３の支持部の構成は示さないが、図２（Ｂ）と同様である。
【００３７】
プローブ２１およびアルギニンの固定法について述べる。まず、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの０．５％水溶液（酢酸を０．５％添加、シランカップリング剤が溶解しない場合は溶解するまで酢酸を加える）を３０分間室温（２５℃）で放置し、メトキシ基を加水分解し、活性なシラノール基を生成させる。表面に酸化膜を有するシリコン製の針３を活性化したシランカップリング溶液に浸し、１時間放置する。純水で５秒間リンスする。この時点でシランカップリング剤のシラノール基が部分的に酸化シリコンの表面のシラノール基と脱水縮合したものと、シランカップリング剤のシラノール基と酸化シリコン表面の酸素が水素結合で結合したものの準安定な混合物ができる。
【００３８】
次に、１０５〜１１０℃で空気中で３０分間加熱する。この操作で、水素結合しているシランカップリング剤のシラノール基とシリコン表面の酸素分子の間で脱水縮合が完結する。また、シリコン表面に存在するシランカップリング剤同士でも脱水縮合が進行する。最終的にシリコン表面にグリシドキシプロピル基が導入される。このうちグリシドキシ基をなす原子団の一部がアミノ基との反応性が高いエポキシ基である。ｐＨ１０の水溶液条件下で５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の上記アミノ基を有するＰＮＡと１．２５μＭのＬ−Ａｒｇ或いはアルギニンオリゴマー（（Ｌ−Ａｒｇ）ｎ（ｎ：２〜８）混合溶液を１時間５０℃で反応させる。この反応でアルギニンを部分的に固定したＰＮＡ固定針を得ることができる。
【００３９】
実施例２で調製した針を用いると細胞に針４３を刺すときに細胞１の保持がほとんど必要がない程度の力で針４３を刺すことができる。このため、組織細胞以外にも培養細胞のように固定されていない細胞でも比較的容易に針を刺すことができる。
【００４０】
図４は実施例２の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【００４１】
工程１）では、針４３を生きている細胞１に突き刺し、３０秒間この状態を維持する。
【００４２】
工程２）では、細胞１から針４３を引き抜く。
【００４３】
工程３）では、直ちに、ＲＮａｓｅインヒビター入りの溶液で洗浄する。この状態で針４３の表面にハイブリダイズしているのはポリＡ−ＲＮＡと考えることができる。
【００４４】
工程４）は、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る工程である。プローブ２１である相補的なポリＴは針４３の表面に固定されているので、この状態で逆転写酵素を働かせて相補鎖合成するとポリＴを基点に相補鎖が合成される。次にＲＮａｓｅＨを作用させＲＮＡ鎖を分解し、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る。
【００４５】
工程５）では、第１のＰＣＲ増幅を行う。実施例２では、実施例１に用いたヒトＴＡＣＳＴＤ１に対応する配列番号１と配列番号２の配列をそれぞれ持つ第１のプライマー組と、配列番号３と配列番号４の配列をそれぞれ持つ第２のプライマー組をそれぞれ容器４４−１と４４−２に用意する。
【００４６】
第１のＰＣＲ増幅は、配列番号１と配列番号２の配列をそれぞれ持つ第１のプライマー組を持つＰＣＲ溶液４５の入った容器４４−１に針４３を刺し、ＰＣＲを行う。反応条件は実施例１に従う。
【００４７】
工程６）では、針４３を容器４４−１から引き上げ、十分洗浄する。
【００４８】
工程７）では、第２のＰＣＲ増幅を行う。第２のＰＣＲ増幅は、配列番号３と配列番号４の配列をそれぞれ持つ第２のプライマー組を持つＰＣＲ溶液４６の入った容器４４−２に針４３を刺し、ＰＣＲを行う。反応条件は実施例１に従う。
【００４９】
第２のＰＣＲ終了後、それぞれのＰＣＲ増幅によって容器４４−１および４４−２に得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。容器４４−１で行った第１のＰＣＲ増幅溶液からは２３０ｂｐの単一電気泳動分離バンドが、容器４４−２で行った第２のＰＣＲ増幅溶液からは２１５ｂｐの単一バンドが検出される。
【００５０】
工程５から７までの処理４０は、工程４で得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡについて、適当に準備されたＰＣＲ溶液の入った容器に対して繰り返し実行することが出来る。
【００５１】
実施例２では、生きた細胞からｍＲＮＡを容易に採取でき、針先にハイブリダイズしたｍＲＮＡのｃＤＮＡを針上に固定した形で合成することができる。針の表面にはｍＲＮＡがライブラリーとして保存されることになるので、必要に応じて必要なときに、ＰＣＲを用いて目的遺伝子の目的配列部分を増幅して得ることができる。このようなｍＲＮＡライブラリーをｃＤＮＡの形で固定した針は長期保存が可能なため、細胞に針を刺した時点での転写産物をマスターライブラリーとして保存することができる。
【００５２】
（実施例３）
実施例３では、特定のタンパク質とアフィニティーを有する抗体を固定し多針で特定物質を採取する例について述べる。図５（Ａ）は、実施例３で採用しうる針先端部５３を示す図であり、図５（Ｂ）は、実施例３で採用しうる針の全体構成を示す斜視図である。
【００５３】
抗体としては、ヒトミトコンドリア膜を分離しウサギに感作させているポリクロナルな抗ヒトミトコンドリア抗体を用いる。この抗体は、ミトコンドリアの複数のタンパク質や糖鎖抗原に対して反応する。
【００５４】
抗ヒトミトコンドリア抗体を針先端部５３に固定した針の調製について述べる。まず、抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）２断片にＳＨ基を導入する。導入されるＳＨ基はＦ（ａｂ’）２１分子あたり３〜４分子である。次に、針先端部５３は次の方法でシランカップリング処理し、あらかじめ表面にアミノ基を導入する。０．５％Ｎ−（β−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン水溶液を室温で３０分間放置し、活性化シランカップリング溶液を得る。表面が酸化されたシリコンからなる針を浸漬して、１時間放置する。針先端部５３を純水でリンスした後、１０５〜１１０℃で空気中で乾燥させる。これで針先端部５３表面に共有結合で固定されたアミノ基を得ることができる。
【００５５】
次に、片方にスクシンイミドエステル残基もう片方にマレイイミド残基を有する２価性試薬であるＮ−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｅｍｉｄｅをｐＨ８の条件で３０分間室温で反応させる。緩衝液は０．１Ｍ防酸緩衝液ｐＨ８．５を使用する。リンス後ｐＨ６．５の条件でＳＨ基を導入したＦ（ａｂ’）２を１時間室温で反応させる。緩衝液は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を用いる。得られるＦ（ａｂ’）２固定針は５％トレハロースを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で保存する。図５（Ａ）ではＦ（ａｂ’）２５１が針先端部５３の表面のエリア５２に固定された様子を模式的に示す。
【００５６】
図５（Ｂ）に示すように、表面のエリア５２にＦ（ａｂ’）２５１が固定された針先端部５３は、支持部８で支持されて基部７に結合される。
【００５７】
基部７で保持して、Ｆ（ａｂ’）２が固定された針先端部５３を細胞質に刺し、針先端部５３を引き抜く。このとき１００倍対物レンズを用いて顕微鏡観察しながら針を引き抜くと、針の周りにミトコンドリアがまとわりついて針と一緒に動くことが見えるケースがある。針先端部５３を緩やかにリンスする。表面に残る物質は、３Ｍ塩酸グアニジンで溶出させ、含まれるタンパク質やｍＲＮＡを解析する材料として用いることができる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> A method of Preparation of Biomaterials
<130> NT04P0875
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctgagcgagt gagaacctac tg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agccacatca gctatgtcca 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtatgagaag gctgagataa agg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agctgcttat attttgagta cagg 24
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【図２】（Ａ）は、実施例１で使用する針の先端部の構成の一例を示す図であり、（Ｂ）は、針の全体構成を示す斜視図である。
【図３】実施例２で使用する針４３の具体例を示す図である。
【図４】実施例２の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【図５】（Ａ）は、実施例３で採用しうる針先端部５３を示す図であり、（Ｂ）は、実施例３で採用しうる針の全体構成を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…細胞、２…細胞核、３，４３，５３…針、４，４４−１，４４−２…容器、５，４５，４６…ＰＣＲのための反応液、２１，５１…プローブ、２２，５２…針３の先端部、７…基部、８…支持部、９…先端部の領域、４８…アルギニン。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内に含まれる生体成分のうち、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、タンパク質、あるいは、糖タンパク質を細胞を殺すこと無しに得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体）をプローブとしてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。
【０００３】
さらに、これら分離したｍＲＮＡはベクターに組み込んだり、ＰＣＲで増幅したりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。いずれの場合でも、試料としては、細胞や組織を破砕して細胞内に存在するＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質を抽出するので、もとの細胞は死んでしまう。
【０００４】
ところが、多くの生命は外界の状況や細胞自身の分化、加齢により、同一遺伝子から異なるｍＲＮＡが産出されることが数多く報告されている。この現象はスプライシングバリアントとかオルターナティブスプライシングと呼ばれている。これは、プレマチュアーなｍＲＮＡがゲノムより転写された後、エピゲネティックな制御により状況に応じて異なるエキソンが使われて成熟ｍＲＮＡが作られるためである。あるいは免疫細胞系のＴ細胞やＢ細胞のように、免疫幹細胞からの分化の過程で、ゲノムそのものの配列が再構成されたり変異が導入されたりするためである。
【０００５】
さらに、細胞のガン化においては、遺伝子の配列において、タンパク質翻訳レベルでのアミノ酸変異やタンパク質が作られなくなってしまうような変異が起きたり、ＬＯＨのように１対の遺伝子のうち片方の遺伝子が消失してしまったりするケースが数多く存在する。
【０００６】
このような変異は、細胞にとって普遍的なことではないので、理想的には同一細胞から連続的にｍＲＡＮなりタンパク質を分離して分析できるようにする必要がある。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
おそらくｍＲＡＮの分析で最も多用されている技術はＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレー）とＰＣＲであろう。タンパク質の分析では臨床目的に用いられるのがイムノアッセイ、タンパク質そのものの研究にはＮＭＲやＸ線回折、質量分析器が用いられている。工学的には前記した遺伝子組換えが重要な技術である。いずれにせよ、細胞からｍＲＮＡやゲノムやタンパク質を分離採取する必要がある。
【０００９】
しかし、現状では、細胞を生かしたままその細胞質や核などに含まれる生体物質を分析するには、細胞を外界から隔離している細胞膜を破壊し、内容物を得る必要があった。一部の技術としては、界面活性剤であるＮＰ−４０を利用して細胞膜にランダムに穴を開け、細胞質に含まれる物質を細胞の外に溶出させてこれを得る方法が存在する。あるいは分泌性のタンパク質の場合は例外的にそのまま利用できる。
【００１０】
しかし、これらは、汎用的な技術として細胞を生かしたまま、その細胞から生体物質を得ることはできない。これが生化学の実験研究におけるもっとも基本的な問題点のひとつであった。
【００１１】
昨今の生物学では、個々の細胞が外界や隣接する細胞とどのように影響しあいながら機能しているかを調べる研究が盛んになりつつある。このような目的には、従来の細胞を破壊してそのＲＮＡなどを調べる方法は適切ではない。
【００１２】
また、再生医療に用いるエンブリオニックステムセルのような基本的に１細胞の取り扱いが必要な場合は、元の細胞を分析のために破壊することはできない。これらは分化誘導して利用するわけであるが、分裂初期の段階からの細胞状態の追跡とコントロールが必要となる。
【００１３】
さらに、従来技術のように細胞を破壊して、内容物を得る方法では次のような問題もある。細胞を破壊するとその時点で、ｍＲＮＡなどはＲＮａｓｅに晒され、急激に分解してしまう。実際、完全長のｍＲＮＡ（多くの場合、安定なｃＤＮＡに直ちに置き換える操作をする）を得るのはきわめて難しく、しかも実験者の技量に取得率が依存することはよく経験することである。腕のよい実験研究者で６０％程度、腕が悪いとほぼ０％というように完全長ｍＲＮＡを得ることは難しい。瞬時に細胞からｍＲＮＡを採取できる技術が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの問題点を解決するために、本発明では、生きた細胞から瞬時にｍＲＮＡやＤＮＡやタンパク質を採取する手段を提供することにある。細胞は使い切りではなく生かしたまま、必要に応じて複数回ｍＲＮＡやタンパク質の解析ができる方法を提案することを目的とする。このための生体物質の分離デバイスと、デバイスに使用するケミストリーと分離方法を提案する。
【００１５】
細胞を生かしたまま、その細胞の内容物を得るため、先端直径が細胞に比べ十分細い針を細胞に刺して針先端に内容物を付着させて採取する。
【００１６】
ｍＲＮＡを得るには、針先端にはｍＲＮＡを採取するオリゴＴをプローブとして固定したものを用いる。あるいはオリゴＴの３’末端側に２から４程度の異なる配列のオリゴを固定してｍＲＮＡをポリＡとのハイブリダイゼーション安定性を確保したプローブを用いる。このときに用いるプローブは通常のリン酸ジエステル結合で作られているポリヌクレオチドでは細胞内のエンド抜くレア−ゼで分解を受けやすいのと、ホールディングしやすいｍＲＮＡのプロービング配列部分がふさがれてしまうことを回避するために、ＰＮＡやそれに類してマイナス荷電をプローブに持たない人工ポリヌクレオチドを用いる。
【００１７】
特定のタンパク質を得るには、抗体を針先端に固定したものを用いて特定タンパク質を採取する。抗体のＦｃ部分は目的物質以外を非特異吸着する可能性があるので、これを除去したＦ（ａｂ’）２を用いる。
【００１８】
細胞に針を刺す場合は、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端部分（細胞に挿入される部分）の直径を細胞に対して１／５以下とする。さらに、生体試料チップ先端部３にコートされた酸化チタンＴｉＯ２の領域５を設ける。或いは、針の先端部分にアルギニンをコートしておき、細胞表面の細胞膜のりん脂質とのインタラクションを容易とし、スムーズに針が差し込まれるようにしている。アルギニンはアルギニンモノマーが少なくても狭い範囲に６分子程度存在するのが有効である。あるいはオリゴアルギニンを固定して用いてもよい。
【００１９】
表面に特定生体物質を捕捉した針を細胞から引き抜き、採取するわけであるが、ｍＲＮＡの場合は針をそのままＰＣＲ反応溶液に浸し、特定ｍＲＮＡの特定配列部分を増幅して得る。あるいは一端逆転写してｃＤＮＡを得てから特定遺伝子をＰＣＲ増幅してもよい。タンパク質の場合は増幅できないのでそのままの利用ということになり、実質的に細胞内特定物質量の測定がもっとも有効な利用形態となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞を破壊せずに、細胞中に含まれる生体物質を採取できる。従来は困難であった細胞を破壊せずにｍＲＮＡや核内タンパク質の定量解析が可能となる。細胞を殺さないので、解析した細胞そのものを培養して利用することが可能となる。これにより、再生医療の最大のボトルネックであるステムセルの素性を解析し、目的に合った細胞のみを分化誘導し、利用することが可能となる。分化誘導中においても分裂細胞を殺さずに細胞内生体物質を解析できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例１）
図１は実施例１の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。図２（Ａ）は、実施例１で使用する針の先端部の構成の一例を示す図であり、図２（Ｂ）は、針の全体構成を示す斜視図である。
【００２２】
図１において、１は細胞、２は細胞核、３は針の先端部、４は容器、５はＰＣＲのための反応液である。針３の先端部２２には、図２（Ａ）に示すように、プローブ２１が固定されている。針３は、図２（Ｂ）に示すように、支持部８を介して基部７により保持される。針３の先端部はきわめて小さいものである。この取り扱いを容易にするために、針３の先端部は、ホルダ８を有し、ホルダ８は操作基板７に結合される。ホルダ８は、例えば、１ｍｍφとし、操作基板７は４ｍｍ×５ｍｍとする。
【００２３】
実施例１では大腸がん細胞に針を刺して、中に存在する特定ｍＲＮＡを採取する方法に関し説明する。プローブ２１としては２６塩基長のポリＴの３’末端に５塩基長のランダム配列オリゴＤＮＡが結合さている。これは、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。プローブ２１は細胞内のｍＲＮＡと容易にインタラクションするようにＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）でできている。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。このため、ハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。また、細胞膜を通過するときにリン脂質との反発力を生じないのでスムーズに針を刺すことができる。さらに、ＴｉＯ２が固定された領域５を設け、生体試料チップ先端部３を細胞１に刺すときに、３３５ｎｍの紫外線を照射すると、コートされた酸化チタン５の有機物分解作用により容易に細胞１に刺さる。
【００２４】
針３の固相表面上にプローブ２１が高密度に固定されているケースで通常のＤＮＡプローブを用いると、マイナス荷電のバリアーを超えて標的ＤＮＡがプローブに接近する必要があり、反応速度論的にも熱力学的に見ても不利になる。また、標的ｍＲＮＡは必ず１本鎖になる必要があるが、実際は分子内で３次元的にホールディングしており、プローブ２１が結合するプロービングサイトが埋まっているケースがある。ＰＮＡのようにマイナス荷電を持たないプローブを用いることで、プローブ自体の電荷をなくすことができるので、ハイブリダイゼーションの速度と収率が向上する。
【００２５】
さらに、ＰＮＡの電荷を持たない特性は、静電的な反発力を生じないので、標的ＤＮＡが２本鎖であっても競争的に２本鎖にもぐりこみ競争的にハイブリダイゼーションすることができる。さらに、細胞膜もマイナスに荷電したリン脂質で覆われているため、針３の表面にマイナス荷電があると、針３と細胞１の間で反発力がはたらき、針３を刺しづらくなる。ＰＮＡでできたプローブ２１を固定した針３を用いることでスムーズに細胞に針を刺すことができる。
【００２６】
工程１）に示すように、細胞内生体物質の採取のターゲットである細胞１に先端部分が細胞に比べ１／５以下の直径の細い針３を刺す。プレマチュアーなｍＲＮＡ或いは核タンパク質を採取するには針を核２に刺す。細胞１に針３を刺した状態を３０秒間維持する。
【００２７】
工程２）では針３を細胞１から引き抜く。
【００２８】
工程３）では、直ちに、２×ＳＳＣで針３の先端部２２を洗浄する。
【００２９】
工程４）では、針３の先端部２２のプローブ２１に捕捉されているｍＲＮＡのうち特定ｍＲＮＡを増幅する。容器４には特定ｍＲＮＡに対応するプライマー組と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとポリメラーゼの基質であるｄＮＴＰとＭｇとｐＨ９のＴｒｉｓ系緩衝液からなる反応液５が２μｌ含まれている。反応液上面は、操作中の蒸発を防ぐため、２μｌのミネラルオイルが重層してある。
【００３０】
ここでは、図２に示すHomo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 1 （ＴＡＣＳＴＤ 1）に特異的な配列部分を増幅する。ＴＡＣＳＴＤ１は上皮細胞でガンになると多量に発現するといわれている全長１５２８ｂｐのｍＲＮＡである。ヒトＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡ配列に関しては、HUGO Gene Normenclature Committee、鉄LC new solute carrier superfamily proposed members (SLC) HGNC approved煤A禰GNC Gene Grouping/Family Nomenclature煤A[online]、HUGO、[平成16年8月1日検索]、、インターネット< URL: http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily.shtml>に記載されている。
【００３１】
配列番号１と配列番号２の配列の合成オリゴＤＮＡ（濃度：０．２ｐｍｏｌ／μｌ）を、それぞれ、プライマーとして、定法に従いＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲは９４℃変性５秒間、５５℃アニール１０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３５回繰り返す。反応液量は前記したとおり、２μｌで行う。ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。その結果、２３０ｂｐの位置に実質的にシングルの電気泳動分離バンドが得られる。データベースから予想されるＰＣＲ産物の塩基長は２３３ｂｐである。
ＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴ ＧＡＧＡＡＣＣＴＡＣ ＴＧ ：（配列番号１）
ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡ ＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡ ：（配列番号２）
次に、最初に針を刺した細胞に対して、１６時間後に、再度、工程１）から工程４）を繰り返し、ｍＲＮＡの採取とＰＣＲ増幅を行う。２回目の針刺しは、コンタミネーションを防ぐため、１回目の針刺しとは別の針３を用いる。
【００３２】
２回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡに対して、今度は、同じヒトＴＡＣＳＴＤ１の別の配列部分を増幅するプライマーで増幅を行う。このプライマーは配列番号３と配列番号４のそれぞれから作成する。
ＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧ ＧＣＴＧＡＧＡＴＡＡ ＡＧＧ ：（配列番号３）
ＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴ ＡＴＴＴＴＧＡＧＴＡ ＣＡＧＧ ：（配列番号４）
このときのＰＣＲ条件は、９４℃変性５秒間、５２℃アニール１０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３５回繰り返す。
【００３３】
１回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡと同様に、ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。その結果、今度は、２１５ｂｐの電気泳動分離バンドが一本得られる。配列から計算される塩貴重は２１６ｂｐである。１回目の針刺しによって得られたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた溶液の２３０ｂｐの位置にはバンドは確認されない。
【００３４】
この結果は、最初の針刺しから１６時間を経過しても細胞が死んでいないことを示す。すなわち、最初の針刺しで細胞１が死亡する場合は、細胞質でＲＮａｓｅによりｍＲＮＡが直ちに分解を始めるので、実質ｍＲＮＡを増幅することができないのに対して、２回目の針刺で採取されたｍＲＮＡがＰＣＲにより増幅できたので、最初の針刺しで細胞１が死亡していないことが確認できる。
【００３５】
（実施例２）
実施例２では、一回の針刺しでｍＲＮＡを生きた細胞から採取し、複数のｃＤＮＡを得る方法について述べる。ここでは実施例１と同様にＰＮＡで出来たプローブ２１が固定されている針３でｍＲＮＡを採取する。
【００３６】
図３は、実施例２で使用する針４３の具体例を示す図である。実施例１と同様にプローブ２１の他に先端部の領域９にＴｉＯ２が固定されるのに加え、さらに、アルギニン４８が固定されている。固定するアルギニンはアミノ酸１個でも良いし、オクタマーまでの長さでも良い。固定法はＰＮＡを固定する溶液に１／４０モル比で加えておいて針全体に満遍なく固定している。針４３の支持部の構成は示さないが、図２（Ｂ）と同様である。
【００３７】
プローブ２１およびアルギニンの固定法について述べる。まず、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの０．５％水溶液（酢酸を０．５％添加、シランカップリング剤が溶解しない場合は溶解するまで酢酸を加える）を３０分間室温（２５℃）で放置し、メトキシ基を加水分解し、活性なシラノール基を生成させる。表面に酸化膜を有するシリコン製の針３を活性化したシランカップリング溶液に浸し、１時間放置する。純水で５秒間リンスする。この時点でシランカップリング剤のシラノール基が部分的に酸化シリコンの表面のシラノール基と脱水縮合したものと、シランカップリング剤のシラノール基と酸化シリコン表面の酸素が水素結合で結合したものの準安定な混合物ができる。
【００３８】
次に、１０５〜１１０℃で空気中で３０分間加熱する。この操作で、水素結合しているシランカップリング剤のシラノール基とシリコン表面の酸素分子の間で脱水縮合が完結する。また、シリコン表面に存在するシランカップリング剤同士でも脱水縮合が進行する。最終的にシリコン表面にグリシドキシプロピル基が導入される。このうちグリシドキシ基をなす原子団の一部がアミノ基との反応性が高いエポキシ基である。ｐＨ１０の水溶液条件下で５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の上記アミノ基を有するＰＮＡと１．２５μＭのＬ−Ａｒｇ或いはアルギニンオリゴマー（（Ｌ−Ａｒｇ）ｎ（ｎ：２〜８）混合溶液を１時間５０℃で反応させる。この反応でアルギニンを部分的に固定したＰＮＡ固定針を得ることができる。
【００３９】
実施例２で調製した針を用いると細胞に針４３を刺すときに細胞１の保持がほとんど必要がない程度の力で針４３を刺すことができる。このため、組織細胞以外にも培養細胞のように固定されていない細胞でも比較的容易に針を刺すことができる。
【００４０】
図４は実施例２の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【００４１】
工程１）では、針４３を生きている細胞１に突き刺し、３０秒間この状態を維持する。
【００４２】
工程２）では、細胞１から針４３を引き抜く。
【００４３】
工程３）では、直ちに、ＲＮａｓｅインヒビター入りの溶液で洗浄する。この状態で針４３の表面にハイブリダイズしているのはポリＡ−ＲＮＡと考えることができる。
【００４４】
工程４）は、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る工程である。プローブ２１である相補的なポリＴは針４３の表面に固定されているので、この状態で逆転写酵素を働かせて相補鎖合成するとポリＴを基点に相補鎖が合成される。次にＲＮａｓｅＨを作用させＲＮＡ鎖を分解し、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る。
【００４５】
工程５）では、第１のＰＣＲ増幅を行う。実施例２では、実施例１に用いたヒトＴＡＣＳＴＤ１に対応する配列番号１と配列番号２の配列をそれぞれ持つ第１のプライマー組と、配列番号３と配列番号４の配列をそれぞれ持つ第２のプライマー組をそれぞれ容器４４−１と４４−２に用意する。
【００４６】
第１のＰＣＲ増幅は、配列番号１と配列番号２の配列をそれぞれ持つ第１のプライマー組を持つＰＣＲ溶液４５の入った容器４４−１に針４３を刺し、ＰＣＲを行う。反応条件は実施例１に従う。
【００４７】
工程６）では、針４３を容器４４−１から引き上げ、十分洗浄する。
【００４８】
工程７）では、第２のＰＣＲ増幅を行う。第２のＰＣＲ増幅は、配列番号３と配列番号４の配列をそれぞれ持つ第２のプライマー組を持つＰＣＲ溶液４６の入った容器４４−２に針４３を刺し、ＰＣＲを行う。反応条件は実施例１に従う。
【００４９】
第２のＰＣＲ終了後、それぞれのＰＣＲ増幅によって容器４４−１および４４−２に得られた溶液を（株）日立製作所製のi-チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。容器４４−１で行った第１のＰＣＲ増幅溶液からは２３０ｂｐの単一電気泳動分離バンドが、容器４４−２で行った第２のＰＣＲ増幅溶液からは２１５ｂｐの単一バンドが検出される。
【００５０】
工程５から７までの処理４０は、工程４で得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡについて、適当に準備されたＰＣＲ溶液の入った容器に対して繰り返し実行することが出来る。
【００５１】
実施例２では、生きた細胞からｍＲＮＡを容易に採取でき、針先にハイブリダイズしたｍＲＮＡのｃＤＮＡを針上に固定した形で合成することができる。針の表面にはｍＲＮＡがライブラリーとして保存されることになるので、必要に応じて必要なときに、ＰＣＲを用いて目的遺伝子の目的配列部分を増幅して得ることができる。このようなｍＲＮＡライブラリーをｃＤＮＡの形で固定した針は長期保存が可能なため、細胞に針を刺した時点での転写産物をマスターライブラリーとして保存することができる。
【００５２】
（実施例３）
実施例３では、特定のタンパク質とアフィニティーを有する抗体を固定し多針で特定物質を採取する例について述べる。図５（Ａ）は、実施例３で採用しうる針先端部５３を示す図であり、図５（Ｂ）は、実施例３で採用しうる針の全体構成を示す斜視図である。
【００５３】
抗体としては、ヒトミトコンドリア膜を分離しウサギに感作させているポリクロナルな抗ヒトミトコンドリア抗体を用いる。この抗体は、ミトコンドリアの複数のタンパク質や糖鎖抗原に対して反応する。
【００５４】
抗ヒトミトコンドリア抗体を針先端部５３に固定した針の調製について述べる。まず、抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）２断片にＳＨ基を導入する。導入されるＳＨ基はＦ（ａｂ’）２１分子あたり３〜４分子である。次に、針先端部５３は次の方法でシランカップリング処理し、あらかじめ表面にアミノ基を導入する。０．５％Ｎ−（β−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン水溶液を室温で３０分間放置し、活性化シランカップリング溶液を得る。表面が酸化されたシリコンからなる針を浸漬して、１時間放置する。針先端部５３を純水でリンスした後、１０５〜１１０℃で空気中で乾燥させる。これで針先端部５３表面に共有結合で固定されたアミノ基を得ることができる。
【００５５】
次に、片方にスクシンイミドエステル残基もう片方にマレイイミド残基を有する２価性試薬であるＮ−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｅｍｉｄｅをｐＨ８の条件で３０分間室温で反応させる。緩衝液は０．１Ｍ防酸緩衝液ｐＨ８．５を使用する。リンス後ｐＨ６．５の条件でＳＨ基を導入したＦ（ａｂ’）２を１時間室温で反応させる。緩衝液は０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を用いる。得られるＦ（ａｂ’）２固定針は５％トレハロースを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で保存する。図５（Ａ）ではＦ（ａｂ’）２５１が針先端部５３の表面のエリア５２に固定された様子を模式的に示す。
【００５６】
図５（Ｂ）に示すように、表面のエリア５２にＦ（ａｂ’）２５１が固定された針先端部５３は、支持部８で支持されて基部７に結合される。
【００５７】
基部７で保持して、Ｆ（ａｂ’）２が固定された針先端部５３を細胞質に刺し、針先端部５３を引き抜く。このとき１００倍対物レンズを用いて顕微鏡観察しながら針を引き抜くと、針の周りにミトコンドリアがまとわりついて針と一緒に動くことが見えるケースがある。針先端部５３を緩やかにリンスする。表面に残る物質は、３Ｍ塩酸グアニジンで溶出させ、含まれるタンパク質やｍＲＮＡを解析する材料として用いることができる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> A method of Preparation of Biomaterials
<130> NT04P0875
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctgagcgagt gagaacctac tg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agccacatca gctatgtcca 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtatgagaag gctgagataa agg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agctgcttat attttgagta cagg 24
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【図２】（Ａ）は、実施例１で使用する針の先端部の構成の一例を示す図であり、（Ｂ）は、針の全体構成を示す斜視図である。
【図３】実施例２で使用する針４３の具体例を示す図である。
【図４】実施例２の細胞内生体物質であるｍＲＮＡの採取法の流れを示す概略図である。
【図５】（Ａ）は、実施例３で採用しうる針先端部５３を示す図であり、（Ｂ）は、実施例３で採用しうる針の全体構成を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…細胞、２…細胞核、３，４３，５３…針、４，４４−１，４４−２…容器、５，４５，４６…ＰＣＲのための反応液、２１，５１…プローブ、２２，５２…針３の先端部、７…基部、８…支持部、９…先端部の領域、４８…アルギニン。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項２】
特定の生体物質に親和性のある物質と（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）とを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、前記親和性のある物質を針先端部に捕捉し、前記細胞が生きたまま細胞に含まれる特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項３】
特定の生体物質に親和性のある物質とＴｉＯ２とを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、前記親和性のある物質を針先端部に捕捉し、前記細胞が生きたまま細胞に含まれる特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項４】
前記特定の生体物質がｍＲＮＡである請求項１または２記載の生体物質採取方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡのポリＡ部分に親和性のあるポリＴ配列の誘導体を有するプローブを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を細胞より抜き、前記針先端部に捕捉されたｍＲＮＡを採取し、前記採取されたｍＲＮＡをＰＣＲで増幅して特定遺伝子のｃＤＮＡを得ることを特徴とする生体物質採取方法。
【請求項６】
前記特定の生体物質がタンパク質である請求項１または２記載の生体物質採取方法。
【請求項７】
特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取した後、さらに所定時間後に、特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を前記細胞に刺し、所定時間後に前記針を細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取することを特徴とする生体物質採取方法。
【請求項１】
特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項２】
特定の生体物質に親和性のある物質と（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）とを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、前記親和性のある物質を針先端部に捕捉し、前記細胞が生きたまま細胞に含まれる特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項３】
特定の生体物質に親和性のある物質とＴｉＯ２とを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、前記親和性のある物質を針先端部に捕捉し、前記細胞が生きたまま細胞に含まれる特定の生体物質を採取する生体物質採取方法。
【請求項４】
前記特定の生体物質がｍＲＮＡである請求項１または２記載の生体物質採取方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡのポリＡ部分に親和性のあるポリＴ配列の誘導体を有するプローブを先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を細胞より抜き、前記針先端部に捕捉されたｍＲＮＡを採取し、前記採取されたｍＲＮＡをＰＣＲで増幅して特定遺伝子のｃＤＮＡを得ることを特徴とする生体物質採取方法。
【請求項６】
前記特定の生体物質がタンパク質である請求項１または２記載の生体物質採取方法。
【請求項７】
特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を生きた細胞に刺し、所定時間後に前記針を生きた細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取した後、さらに所定時間後に、特定の生体物質に親和性のある物質を先端部に固定した針を前記細胞に刺し、所定時間後に前記針を細胞より抜き、前記先端部から前記特定の生体物質を採取することを特徴とする生体物質採取方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−６１０２７（Ｐ２００６−６１０２７Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４４５７５（Ｐ２００４−２４４５７５）
【出願日】平成１６年８月２５日（２００４．８．２５）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２５日（２００４．８．２５）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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