生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置
【課題】対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を提供する。
【解決手段】生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持ち、前記作用極に金属反射膜を備えた円錐形状の凹部を持つ生体物質測定チップと、前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えた発光測定装置。
【解決手段】生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持ち、前記作用極に金属反射膜を備えた円錐形状の凹部を持つ生体物質測定チップと、前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えた発光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光標識剤の発光量を測定する生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置に関するものである。
【０００２】
本発明は、生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置に関し、より詳細には、生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の検出感度を向上する技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、ＤＮＡやたんぱく質の量を発光標識剤の発光量により測定する。発光標識剤を標識したＤＮＡやたんぱく質を電極へ特異的に吸着させ、電極近傍にある発光標識剤を電気化学反応によって発光させる。この電気化学発光を光センサで受光し、光量を電気信号に変換して発光量データとして出力する。
【０００４】
図１５に従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を示す。チップ基板２００に光学的に透明なカバー２０４によって蓋をしてサンプル液や試薬を流すための流路２０３を形成している。流路２０３のチップ基板表面には電気化学反応を行う２種類の電極、作用極２０１と対極２０２を形成している。たんぱく質をサンドイッチ法により抗原抗体反応させる場合は次のような手順で行う。作用極２０１には目的タンパク質に特異的に結合する一次抗体をあらかじめ固定しておく。流路２０３にサンプル液を流すと、一次抗体と特異的なたんぱく質のみ作用極２０１上で結合する。
【０００５】
次に、目的タンパク質に特異的に結合し、発光標識剤を標識した二次抗体を流路２０３に流すと、作用極２０１上に目的たんぱく質がある場合にのみ二次抗体が結合する。流路２０３中の不要な二次抗体を緩衝液で洗い流し、作用極２０１と対極２０２との間に電圧を印加すると、作用極２０１上に二次抗体が結合している場合には作用極２０１上で発光し、二次抗体が結合していない場合には発光しない。作用極２０１上の発光２０５を対物レンズ２０６と集光レンズ２０７によって光電子増倍管２０８の受光面２０９に導き、フォトンカウント方式によって発光量を測定する。この発光量を元に目的タンパク質の量や有無を判定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平６−３４５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出チップ上の発光標識剤からの発光は放射状に照射されるので、対物レンズに入射する光はそのうちの一部のみで、それ以外の光は、利用される事なく捨てられている。そのため、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量が少ないため、検出感度を向上することができないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体物質測定チップは、生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持ち、前記作用極に凹部を有することを特徴としたものである。
【０００９】
また、本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、前記生体物質測定チップと、前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えたことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置によれば、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
図１に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップを上面から見た図を示す。チップ基板４はガラス製で厚みは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ角とし、チップ基板４上には作用極１、対極２、参照極３の３つの電極を形成している。これら３つの電極は３電極法にて電気化学発光を行うための電極である。チップ基板４の中央部に発光標識の発光部位となる作用極１を円形に形成し、作用極１を囲むように対極２を配置し、作用極１と対極２との隙間に参照極３を配置している。本実施例では、作用極１の円形部の直径は３ｍｍ、対極２までの隙間は１ｍｍ、対極２の円形部の外周の直径は７ｍｍ、隙間にある参照極３の線幅は０．２ｍｍとした。３つの電極はチップ基板４の端に向けて伸ばしてあり、これは電圧印加部と接続するための接点部である。
【００１３】
作用極１、対極２及び参照極３には、発光標識の発光を反射する材料として、金をスパッタして形成した。後述するように作用極１は円錐状に凹ませているので、作用極上の対向面からの光を反射させてチップ基板上に配置される受光ユニットへ入射させるために、電極材料は反射率が高い必要がある。電極の材料としては、例えば、金、白金、パラジウム、ロジウムのような貴金属が挙げられる。発光標識は電極表面近傍にあって、その発光はあらゆる方向に放射される。発光標識の発光のうちチップ裏面方向へ放射される光成分を近傍の電極の反射によって表面方向へ放射するようにでき、集光量を上げられるメリットもある。３つの電極が集まる中央部を囲むように液だめ用ゴム５を配置している。３つの電極のチップ基板４の端にある接点部が露出するように、液だめ用ゴム５の外形はチップ基板４よりも小さいほうが良い。本実施例では、液だめ用ゴム５の液滴部の直径は７．５ｍｍとした。
【００１４】
図２に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの図１中のＡ−Ａ’での断面図を示す。チップ基板４上の中央部に作用極１があり、作用極の中央部は凹の円錐形状となっている。円錐の頂点は、図１で示したチップ中央にある作用極１の円形部分の中心と一致している。チップ基板４の垂線に対する円錐の側面とのなす角、より正確には円錐の母線とのなす角を本実施例では５４度とした。従って、この円錐の頂角は１０８度となっている。この頂角の角度設定は後述する発光測定装置の光学ユニットの集散角に応じて決める必要があり、詳細は後述する。
【００１５】
作用極１の周りを取り囲むように対極２があり、その外側に液だめ用ゴム５を配置することで、電解液を液滴６のように全ての電極上に貯留することが出来る。液だめ用ゴム５は液滴６の液漏れを防ぐ必要があるため、チップ基板４への吸着性が高く、撥水性の高い素材としてシリコンゴムが良い。本実施例では、液滴６の電解液の液量は８０μｌとしたので、８０μｌの液滴が溢れないようにシリコンゴムの厚みは１ｍｍとした。
【００１６】
図３に、本発明の実施の形態１における生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の全体構成図を示す。図３において、生体物質検出チップ７の中央部には発光標識を標識した生体物質を滴下している。その生体物質検出チップ７を生体物質検出チップ固定台４１上へ固定し、生体物質検出チップ７の中央部からの発光を受光ユニット４０にて検出する。受光ユニット４０は対物レンズ１１と集光レンズ１２とからなるレンズユニットと、受光センサとして光電子増倍管ユニット１３とで構成している。受光ユニット４０では生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットで光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。生体物質検出チップ７はチップ位置合わせ用突起４８で位置規制し、受光ユニット光軸１５上に生体物質検出チップ７の発光中心が位置するように固定する。
【００１７】
生体物質検出チップ７の作用極１は中央が凹形状の金属反射膜である。このため、生体物質検出チップ７の発光は受光ユニット４０へ入射すると共に、凹形状の対向する面で反射されてから受光ユニット４０へ入射する。従って、受光ユニット４０へは、直接光と凹形状の対向する面での反射光とが合計されて入射するので検出光量が２倍になり、その結果、検出感度が２倍になる。このメカニズムの詳細は後述する。
【００１８】
生体物質検出チップ７で発光させるための電圧の印加は次のように行う。図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ電圧印加のプロファイルを設定する。この電圧印加プロファイルは、例えば、０ボルトよりスタートし、１秒後に１．３Ｖまで上昇し、その後２秒間１．３Ｖを保持した後０ボルトになるというステップになる。電圧印加部４２でこの電圧印加プロファイルに基づいた電圧を生成し、生体物質検出チップ固定台４１に配置した電極を介して生体物質検出チップ７へと接続される。この接続方法はどのような方法でも構わないが、生体物質検出チップ７を脱着可能とするため、生体物質検出チップ７への電気的接続は、ばね電極で生体物質検出チップ７を押さえる構成とするのが良い。
【００１９】
受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理は次のように行う。光電子増倍管ユニット１３はフォトンカウント方式であり、受光した光量に応じてパルス信号を出力する。このパルス信号を一定時間単位でカウンタ４３にてカウントし、カウント値メモリ４４へと順次格納する。タイミング生成部４５で一定時間単位でのカウントとカウント値の格納を制御するためのタイミング信号を生成する。タイミング生成部４５のタイミング信号生成のスタート／ストップはコントローラ４６よりコントロールする。コントローラ４６はカウント値メモリ４４よりカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへ転送する。ここでは、一定時間単位を１０ｍｓとし、１０ｍｓ単位でカウントして１０ｍｓ間に発生したパルス数をカウント値データとした。光電子増倍管ユニット１３の出力パルスの最小の周期であるパルス幅分解能は７０ｎｓのものを用いており、このとき１０ｍｓ間の最大パルス数は１４２，８５７個のため、カウンタ４３には１８ビットのものを採用した。発光量の測定時間を３秒間としたのでカウント値メモリ４４のメモリの個数は３０１個としている。
【００２０】
発光量測定の動作は、生体物質検出チップ７への電圧印加と受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理とを同期して行う。まず、図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ測定スタートのコマンドを発行する。測定スタートのコマンドにより、コントローラ４６より電圧印加部４２へ電圧プロファイルを出力し、生体物質検出チップ７へ電圧プロファイルに基づいた電圧を印加する。同時にタイミング生成部４５をスタートさせ、受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理を開始する。所定の測定時間が経過すると、電圧印加部４２への電圧プロファイルが出力を停止して生体物質検出チップ７への電圧印加を停止する。同時にタイミング生成部４５をストップして検出光量の信号処理を停止する。その後、検出光量データとしてカウント値メモリ４４のカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへと転送して測定完了する。
【００２１】
図４に、本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図を示す。電圧印加プロファイル記憶部３０よりＤ／Ａコンバータ３１へ電圧データを順次送って電圧印加プロファイルに基づいた電圧を発生する。オペアンプ３２により参照極接点３４の電圧がＤ／Ａコンバータ３１の出力電圧と等しくなるように対極接点３３に電圧を印加する。作用極接点３５はＧＮＤへ接地している。作用極接点３５は作用極へ、参照極接点３４は参照極へ、対極接点３３は対極へと接続している。先に述べた電圧印加プロファイルの１．３Ｖとは参照極に対する作用極の電位で定義される。ここでは、作用極はＧＮＤに接地され電位がゼロなので、参照極の電位が−１．３Ｖになるように対極の電位がマイナス方向で設定されることになる。つまり、Ｄ／Ａコンバータの出力電圧は電圧印加プロファイルと符号が逆であり、ここでは−１．３Ｖとなっている。
【００２２】
図５に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光させる原理を示す。生体物質検出チップ７はチップ基板４上の中央部に作用極１があり、その周辺に対極２がある。さらに外側に液だめ用ゴム５を配置し、電解液を液滴６のように溜めている。作用極１上に発光標識を標識した生体物質を滴下しており、作用極１と対極間に電圧を印加すると発光標識が作用極１上で発光する。
【００２３】
生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１で集光し、さらに集光レンズ１２で光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。対物レンズ１１、集光レンズ１２、光電子増倍管ユニット１３の光軸である受光ユニット光軸１５は作用極１の円錐の頂点を通るように配置する。本実施例では、集光レンズ１２には対物レンズ１１と同じものを用い、受光ユニット４０の全長を短くするため対物レンズ１１と集光レンズ１２との間隔は１ｍｍとした。対物レンズ１１の前側焦点位置が作用極１の中心となるように対物レンズ１１を配置し、集光レンズ１２の後側焦点位置が受光面１４となるように光電子増倍管ユニット１３を配置した。
【００２４】
これにより、作用極１の像が受光面１４に結像するようにしている。また本実施例では、対物レンズ１１の焦点距離は４０ｍｍ、有効径は３０ｍｍ、有効な集散角Ｕは２２度とした。対物レンズ１１の焦点距離は作用極１の半径に対して１０倍以上とするのが良い。この焦点距離や曲率半径が小さいと収差の影響が大きくなり、光軸より離れた光線である作用極１の外周寄りの発光成分が受光面１４へ到達しなくなるためである。大きくしすぎるのは光学的には問題ないが、装置サイズが大きくなる等、実用的ではない。
【００２５】
図５において、生体物質検出チップ７からの右側の側面で発光した光線のうち、直接対物レンズ１１へ入射する光線１０を実線で示す。一方、作用極１の対向する面で反射してから対物レンズ１１へ入射する光線１６を点線で示す。平坦な作用極では、対物レンズ１１へ入射する光は光線１０のような直接光だけなので、作用極を凹形状にすることによって対向する電極面で反射する光線を対物レンズへと導くことができ、従来捨てられていた光を有効に利用できるようになる。
【００２６】
図６に、本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の円錐側面の最も外側から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。
【００２７】
図７に、本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の円錐側面の最も外側から対向する作用極へ向かい、作用極で反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、図６の光線に加えて、図７に示すような電極での反射を経由する光線を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００２８】
図８と図９を用いて、対物レンズ１１の集散角Ｕと作用極１の円錐形状の頂角との関係を説明する。ＰＯＱは、作用極１の断面を示し、Ｏはその凹部の中心を示す。その頂角の半角をＶとする。
【００２９】
まず、図８を用いて作用極１の最外周の点Ｐで発光し、Ｐに対向する作用極上の点Ｑで反射して対物レンズの最も外側を通る光線ｅの角度Ｗを求める。点Ｑでの法線ｎを引くと、三角形ＯＱＲの内角の和は１８０度であるから、法線ｎに対する光線ＰＱの入射角はＶとなる。反射の法則により光線ｅの出射角も同じくＶとなる。点Ｑで光軸ｌに平行な直線ｍを引くと、対物レンズへ向かう角度はＷである。光線ＰＱと光線ｅとのなす角は２Ｖ、光線ＰＱと直線ｍとのなす角は９０度であることより、Ｗ＝２Ｖ−９０度と計算される。逆算すると、Ｖ＝（Ｗ＋９０度）／２と表現できる。ここで、光線ｅが対物レンズに入射するためには、Ｗは、対物レンズの集散角以下でなければならない。そのためには、Ｖ≦（Ｕ＋９０度）／２となる必要がある。
【００３０】
次に、図９を用いて作用極１の最外周の点Ｐで発光し、作用極の凹部の中心点Ｏ近傍で反射して対物レンズの最も外側を通る光線ｆの角度Ｙを求める。補助線として点Ｏでの作用極１の法線ｓとＯＱを延長した直線ｕを引く。光線ＰＯの入射角と光線ｆの出射角をＸとすると、角ＱＯＰは２Ｖ、または９０度＋Ｘと計算できるので、２Ｖ＝９０度＋Ｘである。光軸ｌと光線ＰＯとのなす角に着目すると、Ｖ＝２Ｘ＋Ｙである。これら２つの関係より、Ｙ＝１８０度−３Ｖとなる。逆算すると、Ｖ＝（１８０度−Ｙ）／３と表現できる。ここで、光線ｆが対物レンズに入射するためには、Ｙは対物レンズの集散角に等しいか小さい必要がある。そのためには、Ｖ≧（１８０度−Ｕ）／３である必要がある。本実施例では、図２で先述したように頂角は１０８度に設定したので、Ｕ＝２２度、Ｗ＝１８度、Ｙ＝１８度、Ｖ＝５４度となる。
【００３１】
以上説明した本発明の生体物質測定チップとその発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例について説明する。まず、生化学的試料からＤＮＡサンプルを抽出する。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他ＤＮＡを有する生化学的試料から超音波、振とうなどの物理手段、ＤＮＡ抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。抽出された長鎖の２本鎖ＤＮＡは制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断する。切断された２本鎖ＤＮＡは熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡに分離される。これらの工程によりＤＮＡサンプルを得る。
【００３２】
次に、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位を持つＤＮＡプローブを磁性微粒子の表面に固定する。磁性微粒子は、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁性微粒子の粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３３】
さらに、標識剤を準備する。本発明で使用される標識剤は、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位であるＤＮＡプローブと、発光標識に結合しているものである。ＤＮＡと特異的に結合可能な部位としては、前述の磁性微粒子に固定化したＤＮＡプローブと同様、検出すべきＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡである。
【００３４】
発光標識としては、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が挙げられる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体などがある。
【００３５】
前述のようにして得られたＤＮＡサンプル、ＤＮＡプローブが固定された磁性微粒子および標識剤を、反応容器で混合し、ハイブリダイズさせる。ＤＮＡサンプル中に検出すべきＤＮＡ配列が存在していると、標識剤がＤＮＡサンプルを介して磁性微粒子に結合した複合体を形成する。
【００３６】
ハイブリダイズさせた後、結合しなかった非目的サンプルや未反応物質はＢ／Ｆ分離により除去する。Ｂ／Ｆ分離は、反応容器の一部に磁石を配置し、磁力により磁性微粒子を固定後、溶液を除去することで行う。このＢ／Ｆ分離によって、磁性微粒子に結合した検出すべきＤＮＡ配列および標識剤を選択的に得ることができる。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離後、複合体から発光標識を分離する。この発光標識の分離は、少なくとも電気化学発光物質を磁性微粒子から分離できればよく、ＤＮＡプローブは切断、分解された状態であってもよい。また、標識剤のＤＮＡプローブやＤＮＡサンプル、磁性微粒子に固定化されたＤＮＡプローブとともに磁性微粒子から分離されてもよい。このような発光標識を分離する方法としては、アルカリ変性、熱変性、物理破壊、酵素分解などが挙げられる。
【００３８】
このようにして発光標識の分離を行った後、複合体から分離した発光標識を含む溶液を、生体物質検出チップ７の作用極１に滴下した後、乾燥により作用極上に固定する。
【００３９】
次に、電解液を生体物質検出チップ７上に滴下する。ここで、電解液は、支持電解質および還元剤を含む溶液であり、公知のものが使用可能である。支持電解質としては、溶液にイオン導電性を与える物質、例えば、リン酸ナトリウムや塩化ナトリウムのような塩を挙げられる。また、還元剤としては、電気化学的に酸化した電気化学発光物質を還元し、励起状態にする物質、例えば、トリエチルアミンやトリプロピルアミン、シュウ酸などが挙げられる。
【００４０】
生体物質検出チップ７に対して電位を印加し、電気化学発光させる。そして、光電子増倍管１３により電位印加中の電気化学発光の発光量を検出し、測定値はコントローラ４６により図示しないホストＰＣへ転送する。
【００４１】
図１０に本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形の具体的な一例を示す。上側のグラフは印加する電圧波形で横軸が時間、縦軸が電圧値である。下側のグラフは発光波形で、横軸が時間、縦軸が発光量を示す光電子増倍管の単位時間当たりのカウント値である。本実施の形態において印加電圧は、電圧波形１００に示すように、ｔ１を1秒とし、１秒で１．３Ｖまで掃印し、２秒間１．３Ｖを保持した。また、発光量の検出の単位時間は１０ｍｓとし、１０ｍｓ毎の光電子増倍管からのパルスをカウント値としてプロットした。発光波形１０１は従来技術による発光波形であり、発光波形１０２は本実施の形態による発光波形である。この従来技術による発光検出は、平坦な作用極で構成した生体物質検出チップを用いた。図１０において、本実施の形態による発光波形１０２の場合は、従来技術による発光波形１０１と比較し、約２倍高い値を得られている。この差は、図７で説明した作用極による反射による効果であり、本発明が高感度な検出に有効である結果を示すものである。
【００４２】
これまで、凹部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１０８度とするのが良く、円錐の場合と同様にして対向する電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００４３】
（実施の形態２）
実施の形態１では、作用極の凹部が一つのみの場合であったが、複数の凹部でも同様に実現可能である。また、凹部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が複数の凹部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凹部を持つ作用極の構成例を図１１から図１４で説明する。それぞれの図において図の左半分は作用極１の正面図で、右半分はＡ−Ａ’での断面図である。図１１に、作用極１が複数の円錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が円錐形状の凹部である。図１２に、作用極１が複数の三角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が三角錐形状の凹部である。図１３に、作用極１が複数の四角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が四角錐形状の凹部である。図１４に、作用極１が複数の六角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が六角錐形状の凹部である。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態１と同じである。また、本発明の実施の形態２の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図１０に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００４４】
以上のように、実施の形態１および実施の形態２で示したように作用極１を凹形状にすることにより、受光ユニット４０に直接入射しない発光成分を対向する作用極で反射させて受光ユニット４０に入射させ、検出感度を向上することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかる生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる効果を有し、光を集光し、光量を増加させる用途として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの上面図
【図２】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの断面図
【図３】本発明の実施の形態１における生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の全体構成図
【図４】本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図
【図５】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光させる原理を示す図
【図６】本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図７】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線の追跡図
【図８】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線角度の説明図
【図９】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線角度の説明図
【図１０】本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形を示す図
【図１１】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の円錐で構成した図
【図１２】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の三角錐で構成した図
【図１３】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の四角錐で構成した図
【図１４】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の六角錐で構成した図
【図１５】従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の集光の構成を示す図
【符号の説明】
【００４７】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
４ チップ基板
５ 液だめ用ゴム
６ 液滴
７ 生体物質検出チップ
１１ 対物レンズ
１２ 集光レンズ
１３ 光電子増倍管ユニット
１４ 受光面
１５ 受光ユニット光軸
４０ 受光ユニット
４１ 生体物質検出チップ固定台
４２ 電圧印加部
４３ カウンタ
４４ カウント値メモリ
４５ タイミング生成部
４６ コントローラ
４８ チップ位置合わせ用突起
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光標識剤の発光量を測定する生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置に関するものである。
【０００２】
本発明は、生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置に関し、より詳細には、生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の検出感度を向上する技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、ＤＮＡやたんぱく質の量を発光標識剤の発光量により測定する。発光標識剤を標識したＤＮＡやたんぱく質を電極へ特異的に吸着させ、電極近傍にある発光標識剤を電気化学反応によって発光させる。この電気化学発光を光センサで受光し、光量を電気信号に変換して発光量データとして出力する。
【０００４】
図１５に従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を示す。チップ基板２００に光学的に透明なカバー２０４によって蓋をしてサンプル液や試薬を流すための流路２０３を形成している。流路２０３のチップ基板表面には電気化学反応を行う２種類の電極、作用極２０１と対極２０２を形成している。たんぱく質をサンドイッチ法により抗原抗体反応させる場合は次のような手順で行う。作用極２０１には目的タンパク質に特異的に結合する一次抗体をあらかじめ固定しておく。流路２０３にサンプル液を流すと、一次抗体と特異的なたんぱく質のみ作用極２０１上で結合する。
【０００５】
次に、目的タンパク質に特異的に結合し、発光標識剤を標識した二次抗体を流路２０３に流すと、作用極２０１上に目的たんぱく質がある場合にのみ二次抗体が結合する。流路２０３中の不要な二次抗体を緩衝液で洗い流し、作用極２０１と対極２０２との間に電圧を印加すると、作用極２０１上に二次抗体が結合している場合には作用極２０１上で発光し、二次抗体が結合していない場合には発光しない。作用極２０１上の発光２０５を対物レンズ２０６と集光レンズ２０７によって光電子増倍管２０８の受光面２０９に導き、フォトンカウント方式によって発光量を測定する。この発光量を元に目的タンパク質の量や有無を判定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平６−３４５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出チップ上の発光標識剤からの発光は放射状に照射されるので、対物レンズに入射する光はそのうちの一部のみで、それ以外の光は、利用される事なく捨てられている。そのため、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量が少ないため、検出感度を向上することができないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体物質測定チップは、生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持ち、前記作用極に凹部を有することを特徴としたものである。
【０００９】
また、本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、前記生体物質測定チップと、前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えたことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置によれば、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
図１に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップを上面から見た図を示す。チップ基板４はガラス製で厚みは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ角とし、チップ基板４上には作用極１、対極２、参照極３の３つの電極を形成している。これら３つの電極は３電極法にて電気化学発光を行うための電極である。チップ基板４の中央部に発光標識の発光部位となる作用極１を円形に形成し、作用極１を囲むように対極２を配置し、作用極１と対極２との隙間に参照極３を配置している。本実施例では、作用極１の円形部の直径は３ｍｍ、対極２までの隙間は１ｍｍ、対極２の円形部の外周の直径は７ｍｍ、隙間にある参照極３の線幅は０．２ｍｍとした。３つの電極はチップ基板４の端に向けて伸ばしてあり、これは電圧印加部と接続するための接点部である。
【００１３】
作用極１、対極２及び参照極３には、発光標識の発光を反射する材料として、金をスパッタして形成した。後述するように作用極１は円錐状に凹ませているので、作用極上の対向面からの光を反射させてチップ基板上に配置される受光ユニットへ入射させるために、電極材料は反射率が高い必要がある。電極の材料としては、例えば、金、白金、パラジウム、ロジウムのような貴金属が挙げられる。発光標識は電極表面近傍にあって、その発光はあらゆる方向に放射される。発光標識の発光のうちチップ裏面方向へ放射される光成分を近傍の電極の反射によって表面方向へ放射するようにでき、集光量を上げられるメリットもある。３つの電極が集まる中央部を囲むように液だめ用ゴム５を配置している。３つの電極のチップ基板４の端にある接点部が露出するように、液だめ用ゴム５の外形はチップ基板４よりも小さいほうが良い。本実施例では、液だめ用ゴム５の液滴部の直径は７．５ｍｍとした。
【００１４】
図２に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの図１中のＡ−Ａ’での断面図を示す。チップ基板４上の中央部に作用極１があり、作用極の中央部は凹の円錐形状となっている。円錐の頂点は、図１で示したチップ中央にある作用極１の円形部分の中心と一致している。チップ基板４の垂線に対する円錐の側面とのなす角、より正確には円錐の母線とのなす角を本実施例では５４度とした。従って、この円錐の頂角は１０８度となっている。この頂角の角度設定は後述する発光測定装置の光学ユニットの集散角に応じて決める必要があり、詳細は後述する。
【００１５】
作用極１の周りを取り囲むように対極２があり、その外側に液だめ用ゴム５を配置することで、電解液を液滴６のように全ての電極上に貯留することが出来る。液だめ用ゴム５は液滴６の液漏れを防ぐ必要があるため、チップ基板４への吸着性が高く、撥水性の高い素材としてシリコンゴムが良い。本実施例では、液滴６の電解液の液量は８０μｌとしたので、８０μｌの液滴が溢れないようにシリコンゴムの厚みは１ｍｍとした。
【００１６】
図３に、本発明の実施の形態１における生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の全体構成図を示す。図３において、生体物質検出チップ７の中央部には発光標識を標識した生体物質を滴下している。その生体物質検出チップ７を生体物質検出チップ固定台４１上へ固定し、生体物質検出チップ７の中央部からの発光を受光ユニット４０にて検出する。受光ユニット４０は対物レンズ１１と集光レンズ１２とからなるレンズユニットと、受光センサとして光電子増倍管ユニット１３とで構成している。受光ユニット４０では生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットで光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。生体物質検出チップ７はチップ位置合わせ用突起４８で位置規制し、受光ユニット光軸１５上に生体物質検出チップ７の発光中心が位置するように固定する。
【００１７】
生体物質検出チップ７の作用極１は中央が凹形状の金属反射膜である。このため、生体物質検出チップ７の発光は受光ユニット４０へ入射すると共に、凹形状の対向する面で反射されてから受光ユニット４０へ入射する。従って、受光ユニット４０へは、直接光と凹形状の対向する面での反射光とが合計されて入射するので検出光量が２倍になり、その結果、検出感度が２倍になる。このメカニズムの詳細は後述する。
【００１８】
生体物質検出チップ７で発光させるための電圧の印加は次のように行う。図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ電圧印加のプロファイルを設定する。この電圧印加プロファイルは、例えば、０ボルトよりスタートし、１秒後に１．３Ｖまで上昇し、その後２秒間１．３Ｖを保持した後０ボルトになるというステップになる。電圧印加部４２でこの電圧印加プロファイルに基づいた電圧を生成し、生体物質検出チップ固定台４１に配置した電極を介して生体物質検出チップ７へと接続される。この接続方法はどのような方法でも構わないが、生体物質検出チップ７を脱着可能とするため、生体物質検出チップ７への電気的接続は、ばね電極で生体物質検出チップ７を押さえる構成とするのが良い。
【００１９】
受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理は次のように行う。光電子増倍管ユニット１３はフォトンカウント方式であり、受光した光量に応じてパルス信号を出力する。このパルス信号を一定時間単位でカウンタ４３にてカウントし、カウント値メモリ４４へと順次格納する。タイミング生成部４５で一定時間単位でのカウントとカウント値の格納を制御するためのタイミング信号を生成する。タイミング生成部４５のタイミング信号生成のスタート／ストップはコントローラ４６よりコントロールする。コントローラ４６はカウント値メモリ４４よりカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへ転送する。ここでは、一定時間単位を１０ｍｓとし、１０ｍｓ単位でカウントして１０ｍｓ間に発生したパルス数をカウント値データとした。光電子増倍管ユニット１３の出力パルスの最小の周期であるパルス幅分解能は７０ｎｓのものを用いており、このとき１０ｍｓ間の最大パルス数は１４２，８５７個のため、カウンタ４３には１８ビットのものを採用した。発光量の測定時間を３秒間としたのでカウント値メモリ４４のメモリの個数は３０１個としている。
【００２０】
発光量測定の動作は、生体物質検出チップ７への電圧印加と受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理とを同期して行う。まず、図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ測定スタートのコマンドを発行する。測定スタートのコマンドにより、コントローラ４６より電圧印加部４２へ電圧プロファイルを出力し、生体物質検出チップ７へ電圧プロファイルに基づいた電圧を印加する。同時にタイミング生成部４５をスタートさせ、受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理を開始する。所定の測定時間が経過すると、電圧印加部４２への電圧プロファイルが出力を停止して生体物質検出チップ７への電圧印加を停止する。同時にタイミング生成部４５をストップして検出光量の信号処理を停止する。その後、検出光量データとしてカウント値メモリ４４のカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへと転送して測定完了する。
【００２１】
図４に、本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図を示す。電圧印加プロファイル記憶部３０よりＤ／Ａコンバータ３１へ電圧データを順次送って電圧印加プロファイルに基づいた電圧を発生する。オペアンプ３２により参照極接点３４の電圧がＤ／Ａコンバータ３１の出力電圧と等しくなるように対極接点３３に電圧を印加する。作用極接点３５はＧＮＤへ接地している。作用極接点３５は作用極へ、参照極接点３４は参照極へ、対極接点３３は対極へと接続している。先に述べた電圧印加プロファイルの１．３Ｖとは参照極に対する作用極の電位で定義される。ここでは、作用極はＧＮＤに接地され電位がゼロなので、参照極の電位が−１．３Ｖになるように対極の電位がマイナス方向で設定されることになる。つまり、Ｄ／Ａコンバータの出力電圧は電圧印加プロファイルと符号が逆であり、ここでは−１．３Ｖとなっている。
【００２２】
図５に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光させる原理を示す。生体物質検出チップ７はチップ基板４上の中央部に作用極１があり、その周辺に対極２がある。さらに外側に液だめ用ゴム５を配置し、電解液を液滴６のように溜めている。作用極１上に発光標識を標識した生体物質を滴下しており、作用極１と対極間に電圧を印加すると発光標識が作用極１上で発光する。
【００２３】
生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１で集光し、さらに集光レンズ１２で光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。対物レンズ１１、集光レンズ１２、光電子増倍管ユニット１３の光軸である受光ユニット光軸１５は作用極１の円錐の頂点を通るように配置する。本実施例では、集光レンズ１２には対物レンズ１１と同じものを用い、受光ユニット４０の全長を短くするため対物レンズ１１と集光レンズ１２との間隔は１ｍｍとした。対物レンズ１１の前側焦点位置が作用極１の中心となるように対物レンズ１１を配置し、集光レンズ１２の後側焦点位置が受光面１４となるように光電子増倍管ユニット１３を配置した。
【００２４】
これにより、作用極１の像が受光面１４に結像するようにしている。また本実施例では、対物レンズ１１の焦点距離は４０ｍｍ、有効径は３０ｍｍ、有効な集散角Ｕは２２度とした。対物レンズ１１の焦点距離は作用極１の半径に対して１０倍以上とするのが良い。この焦点距離や曲率半径が小さいと収差の影響が大きくなり、光軸より離れた光線である作用極１の外周寄りの発光成分が受光面１４へ到達しなくなるためである。大きくしすぎるのは光学的には問題ないが、装置サイズが大きくなる等、実用的ではない。
【００２５】
図５において、生体物質検出チップ７からの右側の側面で発光した光線のうち、直接対物レンズ１１へ入射する光線１０を実線で示す。一方、作用極１の対向する面で反射してから対物レンズ１１へ入射する光線１６を点線で示す。平坦な作用極では、対物レンズ１１へ入射する光は光線１０のような直接光だけなので、作用極を凹形状にすることによって対向する電極面で反射する光線を対物レンズへと導くことができ、従来捨てられていた光を有効に利用できるようになる。
【００２６】
図６に、本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の円錐側面の最も外側から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。
【００２７】
図７に、本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の円錐側面の最も外側から対向する作用極へ向かい、作用極で反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、図６の光線に加えて、図７に示すような電極での反射を経由する光線を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００２８】
図８と図９を用いて、対物レンズ１１の集散角Ｕと作用極１の円錐形状の頂角との関係を説明する。ＰＯＱは、作用極１の断面を示し、Ｏはその凹部の中心を示す。その頂角の半角をＶとする。
【００２９】
まず、図８を用いて作用極１の最外周の点Ｐで発光し、Ｐに対向する作用極上の点Ｑで反射して対物レンズの最も外側を通る光線ｅの角度Ｗを求める。点Ｑでの法線ｎを引くと、三角形ＯＱＲの内角の和は１８０度であるから、法線ｎに対する光線ＰＱの入射角はＶとなる。反射の法則により光線ｅの出射角も同じくＶとなる。点Ｑで光軸ｌに平行な直線ｍを引くと、対物レンズへ向かう角度はＷである。光線ＰＱと光線ｅとのなす角は２Ｖ、光線ＰＱと直線ｍとのなす角は９０度であることより、Ｗ＝２Ｖ−９０度と計算される。逆算すると、Ｖ＝（Ｗ＋９０度）／２と表現できる。ここで、光線ｅが対物レンズに入射するためには、Ｗは、対物レンズの集散角以下でなければならない。そのためには、Ｖ≦（Ｕ＋９０度）／２となる必要がある。
【００３０】
次に、図９を用いて作用極１の最外周の点Ｐで発光し、作用極の凹部の中心点Ｏ近傍で反射して対物レンズの最も外側を通る光線ｆの角度Ｙを求める。補助線として点Ｏでの作用極１の法線ｓとＯＱを延長した直線ｕを引く。光線ＰＯの入射角と光線ｆの出射角をＸとすると、角ＱＯＰは２Ｖ、または９０度＋Ｘと計算できるので、２Ｖ＝９０度＋Ｘである。光軸ｌと光線ＰＯとのなす角に着目すると、Ｖ＝２Ｘ＋Ｙである。これら２つの関係より、Ｙ＝１８０度−３Ｖとなる。逆算すると、Ｖ＝（１８０度−Ｙ）／３と表現できる。ここで、光線ｆが対物レンズに入射するためには、Ｙは対物レンズの集散角に等しいか小さい必要がある。そのためには、Ｖ≧（１８０度−Ｕ）／３である必要がある。本実施例では、図２で先述したように頂角は１０８度に設定したので、Ｕ＝２２度、Ｗ＝１８度、Ｙ＝１８度、Ｖ＝５４度となる。
【００３１】
以上説明した本発明の生体物質測定チップとその発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例について説明する。まず、生化学的試料からＤＮＡサンプルを抽出する。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他ＤＮＡを有する生化学的試料から超音波、振とうなどの物理手段、ＤＮＡ抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。抽出された長鎖の２本鎖ＤＮＡは制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断する。切断された２本鎖ＤＮＡは熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡに分離される。これらの工程によりＤＮＡサンプルを得る。
【００３２】
次に、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位を持つＤＮＡプローブを磁性微粒子の表面に固定する。磁性微粒子は、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁性微粒子の粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３３】
さらに、標識剤を準備する。本発明で使用される標識剤は、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位であるＤＮＡプローブと、発光標識に結合しているものである。ＤＮＡと特異的に結合可能な部位としては、前述の磁性微粒子に固定化したＤＮＡプローブと同様、検出すべきＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡである。
【００３４】
発光標識としては、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が挙げられる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体などがある。
【００３５】
前述のようにして得られたＤＮＡサンプル、ＤＮＡプローブが固定された磁性微粒子および標識剤を、反応容器で混合し、ハイブリダイズさせる。ＤＮＡサンプル中に検出すべきＤＮＡ配列が存在していると、標識剤がＤＮＡサンプルを介して磁性微粒子に結合した複合体を形成する。
【００３６】
ハイブリダイズさせた後、結合しなかった非目的サンプルや未反応物質はＢ／Ｆ分離により除去する。Ｂ／Ｆ分離は、反応容器の一部に磁石を配置し、磁力により磁性微粒子を固定後、溶液を除去することで行う。このＢ／Ｆ分離によって、磁性微粒子に結合した検出すべきＤＮＡ配列および標識剤を選択的に得ることができる。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離後、複合体から発光標識を分離する。この発光標識の分離は、少なくとも電気化学発光物質を磁性微粒子から分離できればよく、ＤＮＡプローブは切断、分解された状態であってもよい。また、標識剤のＤＮＡプローブやＤＮＡサンプル、磁性微粒子に固定化されたＤＮＡプローブとともに磁性微粒子から分離されてもよい。このような発光標識を分離する方法としては、アルカリ変性、熱変性、物理破壊、酵素分解などが挙げられる。
【００３８】
このようにして発光標識の分離を行った後、複合体から分離した発光標識を含む溶液を、生体物質検出チップ７の作用極１に滴下した後、乾燥により作用極上に固定する。
【００３９】
次に、電解液を生体物質検出チップ７上に滴下する。ここで、電解液は、支持電解質および還元剤を含む溶液であり、公知のものが使用可能である。支持電解質としては、溶液にイオン導電性を与える物質、例えば、リン酸ナトリウムや塩化ナトリウムのような塩を挙げられる。また、還元剤としては、電気化学的に酸化した電気化学発光物質を還元し、励起状態にする物質、例えば、トリエチルアミンやトリプロピルアミン、シュウ酸などが挙げられる。
【００４０】
生体物質検出チップ７に対して電位を印加し、電気化学発光させる。そして、光電子増倍管１３により電位印加中の電気化学発光の発光量を検出し、測定値はコントローラ４６により図示しないホストＰＣへ転送する。
【００４１】
図１０に本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形の具体的な一例を示す。上側のグラフは印加する電圧波形で横軸が時間、縦軸が電圧値である。下側のグラフは発光波形で、横軸が時間、縦軸が発光量を示す光電子増倍管の単位時間当たりのカウント値である。本実施の形態において印加電圧は、電圧波形１００に示すように、ｔ１を1秒とし、１秒で１．３Ｖまで掃印し、２秒間１．３Ｖを保持した。また、発光量の検出の単位時間は１０ｍｓとし、１０ｍｓ毎の光電子増倍管からのパルスをカウント値としてプロットした。発光波形１０１は従来技術による発光波形であり、発光波形１０２は本実施の形態による発光波形である。この従来技術による発光検出は、平坦な作用極で構成した生体物質検出チップを用いた。図１０において、本実施の形態による発光波形１０２の場合は、従来技術による発光波形１０１と比較し、約２倍高い値を得られている。この差は、図７で説明した作用極による反射による効果であり、本発明が高感度な検出に有効である結果を示すものである。
【００４２】
これまで、凹部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１０８度とするのが良く、円錐の場合と同様にして対向する電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００４３】
（実施の形態２）
実施の形態１では、作用極の凹部が一つのみの場合であったが、複数の凹部でも同様に実現可能である。また、凹部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が複数の凹部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凹部を持つ作用極の構成例を図１１から図１４で説明する。それぞれの図において図の左半分は作用極１の正面図で、右半分はＡ−Ａ’での断面図である。図１１に、作用極１が複数の円錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が円錐形状の凹部である。図１２に、作用極１が複数の三角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が三角錐形状の凹部である。図１３に、作用極１が複数の四角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が四角錐形状の凹部である。図１４に、作用極１が複数の六角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が六角錐形状の凹部である。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態１と同じである。また、本発明の実施の形態２の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図１０に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００４４】
以上のように、実施の形態１および実施の形態２で示したように作用極１を凹形状にすることにより、受光ユニット４０に直接入射しない発光成分を対向する作用極で反射させて受光ユニット４０に入射させ、検出感度を向上することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかる生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置は、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる効果を有し、光を集光し、光量を増加させる用途として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの上面図
【図２】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの断面図
【図３】本発明の実施の形態１における生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の全体構成図
【図４】本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図
【図５】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光させる原理を示す図
【図６】本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図７】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線の追跡図
【図８】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線角度の説明図
【図９】本発明の実施の形態１における電極での反射を経由する光線角度の説明図
【図１０】本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形を示す図
【図１１】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の円錐で構成した図
【図１２】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の三角錐で構成した図
【図１３】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の四角錐で構成した図
【図１４】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の六角錐で構成した図
【図１５】従来の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の集光の構成を示す図
【符号の説明】
【００４７】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
４ チップ基板
５ 液だめ用ゴム
６ 液滴
７ 生体物質検出チップ
１１ 対物レンズ
１２ 集光レンズ
１３ 光電子増倍管ユニット
１４ 受光面
１５ 受光ユニット光軸
４０ 受光ユニット
４１ 生体物質検出チップ固定台
４２ 電圧印加部
４３ カウンタ
４４ カウント値メモリ
４５ タイミング生成部
４６ コントローラ
４８ チップ位置合わせ用突起
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持つ生体物質測定チップにおいて、
前記作用極に凹部を有する生体物質測定チップ。
【請求項２】
前記作用極の凹部に金属反射膜を形成した請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項３】
前記金属反射膜に金または白金またはパラジウムまたはロジウムを用いて形成した請求項２に記載の生体物質測定チップ。
【請求項４】
前記作用極の凹部を円錐形状とした請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項５】
前記作用極の凹部を多角錐形状とした請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項６】
前記円錐形状の頂点が前記作用極の中心と一致するように形成した請求項４および請求項５に記載の生体物質測定チップ。
【請求項７】
生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持つ生体物質測定チップにおいて、
前記作用極に複数の凹部を有する生体物質測定チップ。
【請求項８】
前記凹部を全て同一の円錐形状とした請求項７に記載の生体物質測定チップ。
【請求項９】
前記凹部を全て同一の多角錐形状とした請求項７に記載の生体物質測定チップ。
【請求項１０】
請求項１から請求項９に記載の生体物質測定チップと、
前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、
前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えた発光測定装置。
【請求項１１】
前記レンズユニットは対物レンズと集光レンズとで構成し、前記電極の発光面と前記受光センサの受光面とが結像関係となるように前記発光面と前記受光面と前記対物レンズと前記集光レンズとを配置した請求項１０に記載の発光測定装置。
【請求項１２】
前記対物レンズの焦点距離を前記生体物質測定チップの電極のサイズに対して１０倍以上とした請求項１０に記載の発光測定装置。
【請求項１】
生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持つ生体物質測定チップにおいて、
前記作用極に凹部を有する生体物質測定チップ。
【請求項２】
前記作用極の凹部に金属反射膜を形成した請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項３】
前記金属反射膜に金または白金またはパラジウムまたはロジウムを用いて形成した請求項２に記載の生体物質測定チップ。
【請求項４】
前記作用極の凹部を円錐形状とした請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項５】
前記作用極の凹部を多角錐形状とした請求項１に記載の生体物質測定チップ。
【請求項６】
前記円錐形状の頂点が前記作用極の中心と一致するように形成した請求項４および請求項５に記載の生体物質測定チップ。
【請求項７】
生体サンプルを測定するための作用極と対極とを持つ生体物質測定チップにおいて、
前記作用極に複数の凹部を有する生体物質測定チップ。
【請求項８】
前記凹部を全て同一の円錐形状とした請求項７に記載の生体物質測定チップ。
【請求項９】
前記凹部を全て同一の多角錐形状とした請求項７に記載の生体物質測定チップ。
【請求項１０】
請求項１から請求項９に記載の生体物質測定チップと、
前記作用極の中心を光軸が通るように配置されたレンズユニットと、
前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えた発光測定装置。
【請求項１１】
前記レンズユニットは対物レンズと集光レンズとで構成し、前記電極の発光面と前記受光センサの受光面とが結像関係となるように前記発光面と前記受光面と前記対物レンズと前記集光レンズとを配置した請求項１０に記載の発光測定装置。
【請求項１２】
前記対物レンズの焦点距離を前記生体物質測定チップの電極のサイズに対して１０倍以上とした請求項１０に記載の発光測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−１９８４１６（Ｐ２００９−１９８４１６Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４２４７８（Ｐ２００８−４２４７８）
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]