生物を同定する方法
本開示は、生物を同定する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）核酸サンプルを生物から得る工程；（ｂ）上記核酸を画像化する工程；（ｃ）上記核酸の制限マップを得る工程；および、（ｄ）上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、上記生物を同定する工程、を包含する。詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属レベルおよび種レベルでのみならず、亜種レベル（株、亜株、および／もしくは単離物レベル）でも、同定かつ分類され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国特許商標庁に、２００８年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０２９，８１６号および２００８年５月１４日に出願された米国本出願第１２／１２０，５８６号（これらは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、生物（例えば、微生物）を同定する方法に関連する。この方法は、生物の核酸を画像化することを含み得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ゲノムの物理的マッピング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限マップを作り出す）は、種々の生物の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限マップは、光学的マッピングによって生成され得る。光学的マッピングは、蛍光顕微鏡を使用して、個々の標識されたＤＮＡ分子上の制限エンドヌクレアーゼ切断事象を可視化することによって、整然とした制限マップを生成し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明は、生物（例えば、微生物）を同定する方法を提供する。上記方法は、核酸の制限マップを生物から得る工程、および上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、それによって生物を同定する工程を包含する。詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属レベルおよび種レベルでのみならず、亜種レベル（株、亜株、および／もしくは単離物レベル）でも、同定かつ分類され得る。上記特色のある方法は、生物を同定するための迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。上記方法は、臨床状況（例えば、ヒトもしくは獣医学の状況）において；または環境的状況もしくは産業的状況（例えば、臨床微生物学もしくは工業的微生物学、食品安全性試験、地下水試験、大気試験、汚染試験など）において使用され得る。本質的には、本発明は、微生物の検出および／もしくは同定が必要であるかもしくは所望される任意の状況において有用である。
【０００５】
本発明はまた、とりわけ、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程、および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程によって、被験体における上記疾患もしくは障害を診断する方法を特徴とする。
【０００６】
一局面において、本発明は、生物を同定する方法を提供する。上記方法は、核酸サンプルの制限消化産物を得る工程、上記制限フラグメントを画像化する工程、および、上記画像化データをデータベースと比較する工程を包含する。本発明の制限マップは、例えば、核酸を表面に結合させる工程、上記核酸を上記表面上で延ばす工程、および、１種以上の制限エンドヌクレアーゼにさらす工程によって得られ（ｏｒｄｅｒ）得る。一般に、本発明の好ましい方法は、生物から核酸サンプルを得る工程；上記核酸を画像化する工程；上記核酸の制限マップを得る工程；および、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、これによって上記生物を同定する工程を包含する。
【０００７】
上記検出される物質は、微生物、細菌、原生生物、ウイルス、真菌、もしくは疾患原因生物（微生物（例えば、原生動物および多細胞寄生生物）を含む）であり得る。上記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはサンプルから得られたＲＮＡのｃＤＮＡコピーであり得る。上記核酸サンプルとしては、任意の組織もしくは体液サンプル、環境サンプル（例えば、水、空気、塵埃（ｄｉｒｔ）、岩など）、およびそれらから得られる全てのサンプルが挙げられる。
【０００８】
本発明の方法は、画像化する前に、核酸を１種以上の酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ）で消化する工程をさらに包含し得る。好ましい制限酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＭｌｕＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＰａｃＩ
ＡｆｌＩＩ ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＭｌｕＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＢａｍＨＩ
ＢｇｌＩＩ ＥｃｏＲＩ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
ＢｇｌＩＩ Ｂｓｕ３６Ｉ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＸｂａＩ
ＡｐａＬＩ ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ
ＡｐａＬＩ ＢａｍＨＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＸｂａＩ
ＢｇｌＩＩ ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＰａｃＩ
ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＢａｍＨＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＰａｃＩ ＸｂａＩ
ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
Ｂｓｕ３６Ｉ ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｈｅＩ
ＢａｍＨＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
ＢａｍＨＩ Ｂｓｕ３６Ｉ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＰｖｕＩＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＮｈｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｈｅＩ ＰａｃＩ 。
【０００９】
画像化は、理想的には、上記核酸を標識する工程を包含する。標識法は、当該分野で公知であり、任意の公知の標識を含み得る。しかし、好ましい標識は、光学的に検出可能な標識（例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒａｎ １５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット（ｂｕｔｙｒａｔｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標） Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミンＢ スルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ ７００；ＩＲＤ ８００；Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ナフタロシアニン、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯおよびＪＯＪＯ）である。
【００１０】
本発明において使用するためのデータベースは、制限マップ類似性クラスターを含み得る。上記データベースは、上記生物のクレードの少なくとも１つのメンバーからの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを伴う制限マップを含み得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、被験体における疾患もしくは障害を診断する方法を特色とし、上記方法は、検出されるべき生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；（ｂ）上記生物由来の核酸を画像化する工程；（ｃ）上記核酸の制限マップを得る工程；（ｄ）上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、上記生物を同定する工程、および（ｅ）上記生物の正体と、上記疾患もしくは障害とを相関させる工程を包含する。
【００１２】
方法は、被験体における疾患もしくは障害を処置する工程をさらに包含し得、この方法は、上で記載したように、被験体における疾患もしくは障害を診断する工程、および、上記疾患もしくは障害を改善させるために、上記被験体に処置を提供する工程を包含し得る。処置は、薬剤を上記被験体に投与する工程を包含し得る。
【００１３】
一実施形態において、単一のＤＮＡ分子から得られた制限マップは、公知の生物からの制限マップのデータベースに対して、上記データベースに存在する制限フラグメントパターンに最もマッチするものを同定するために、比較される。このプロセスは、十分なマッチが、所定の信頼レベルで生物を同定するために得られるまで、反復して行われ得る。本発明の方法によれば、サンプルから核酸が調製され、本明細書で記載されるように画像化される。制限マップが調製され、その制限パターンが、公知の生物についての制限パターンのデータベースと相関させられる。好ましい実施形態において、生物は、生物の混合物を含むサンプルから同定される。非常に好ましい実施形態において、本発明の方法は、１つより多い生物を含むと疑われるサンプルに存在する種々の生物の比率を決定するために使用される。さらに、本発明の方法の使用は、連続してもしくは同時に、同じサンプルから複数の微生物の検出を可能にする。
【００１４】
使用時に、本発明は、環境サンプル中の汚染物質を構成する微生物を同定するために適用され得る。例えば、本発明の方法は、空気、水、土壌、衣服、旅行携帯品（ｌｕｇｇａｇｅ）、唾液、尿、血液、痰、食品、飲料などのサンプル中の潜在的な生物学的ハザードを同定するために有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、未知の供給源から得られたサンプル中の生物を検出および同定するために使用される。本質的には、本発明の方法は、任意の環境的状況もしくは産業的状況における生物学的ハザードを検出するために使用され得る。
【００１５】
本発明のさらなる局面および特徴は、以下のその詳細な説明を見れば、明らかである。
【００１６】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップを示す模式図である。
【図２】図２は、３群にクラスター化されたＥ．ｃｏｌｉの６つの単離物：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、およびＫ１２（Ｋ１２および７１８を含む）の制限マップを示す模式図である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップの中の共通するモチーフを示す模式図である。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、Ｅ．ｃｏｌｉに共通する領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、特定の株（すなわち、Ｏ１５７、ＣＦＴ、もしくはＫ１２）に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図６】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、各単離物に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉを同定すると考えられるレベルを示す、ツリー図である。
【図８】図８は、サンプルの制限マップ（中央のマップ）およびデータベースからの関連する制限マップを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本開示は、生物（例えば、微生物）を同定する方法を特徴とする。上記方法は、生物から核酸（例えば、ＤＮＡ）の制限マップを得る工程、および、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、これによって上記生物を同定する工程を包含する。種々の群および亜群に共通するモチーフを含む詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属および種のレベルでのみならず、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物レベルでも同定および分類され得る。例えば、細菌は、属レベル（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、種レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種）、株レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７、ＣＦＴ、およびＫ１２株）、ならびに単離物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７：Ｈ７単離物）（以下の実験３Ｂにおいて記載されるように）において同定および分類され得る。上記特色のある方法は、生物を同定するための迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。これら方法は、種々の臨床状況において（例えば、被験体（例えば、ヒトもしくは動物被験体）における生物の同定のために）使用され得る。
【００１９】
本開示はまた、とりわけ、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程、および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程によって、被験体における上記疾患もしくは障害を診断する方法を特徴とする。これらの方法は、臨床状況、例えば、ヒトおよび獣医学の状況において使用され得る。
【００２０】
本発明の方法はまた、食品もしくは環境的状況において、生物を同定および／もしくは検出するために有用である。例えば、本発明の方法は、飲料水、空気、土壌、および他の環境供給源中の環境的脅威を評価するために使用され得る。本発明の方法はまた、食品中の生物を同定するために、ならびに時間でもしくは地理的に分離される複数のサンプル、および同じもしくは類似のバッチに由来するサンプルにおける食中毒の共通する供給源を決定するために有用である。
【００２１】
（制限マッピング）
本明細書で特色のある方法は、データベースの生成および同定されるべき生物の処理の両方の間の制限マッピングを利用する。使用され得る制限マッピングの１つのタイプは、光学的マッピングである。光学的マッピングは、単一のＤＮＡ分子から整然とした制限マップを生成するための単一分子技術である（Ｓａｍａｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。この方法の間に、個々の蛍光標識されたＤＮＡ分子は、カバースリップと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れ（第１世代の方法において）において延ばされる（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）か、もしくはポリリジン処理ガラス表面上で固定される（第２世代の方法において）。同書。上記添加されたエンドヌクレアーゼは、特定の点において上記ＤＮＡを切断し、そのフラグメントが画像化される。同書。制限マップは、上記消化から生じるフラグメントの数に基づいて、構築され得る。同書。一般に、最終的なマップは、類似の分子から得られるフラグメントサイズの平均である。同書。従って、本発明の一実施形態において、同定されるべき生物の制限マップは、上記生物を含むサンプルから生成される多くのマップの平均である。
【００２２】
光学的マッピングおよび関連する方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、同第５，５９９，６６４号、同第６，１５０，０８９号、同第６，１４７，１９８号、同第５，７２０，９２８号、同第６，１７４，６７１号、同第６，２９４，１３６号、同第６，３４０，５６７号、同第６，４４８，０１２号、同第６，５０９，１５８号、同第６，６１０，２５６号、および同第６，７１３，２６３号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載されている。光学的マップは、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２（本明細書に参考として援用される）に記載されるように、構築される。簡潔には、試験生物由来の個々の染色体フラグメントが、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電的相互作用によって、誘導体化ガラス上に固定され、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、インターカレーター色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、そして画像分析のために自動化蛍光顕微鏡に配置される。上記染色体フラグメントは固定化されるので、上記制限エンドヌクレアーゼでの消化によって生成された上記制限フラグメントは、上記ガラスに結合したままであり、上記インターカレーター色素での染色後に、蛍光顕微鏡法によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限フラグメントのサイズは、画像分析ソフトウェアを使用して測定され、異なる分子における同一の制限フラグメントパターンは、染色体全体を網羅する、整然とした制限マップを組み立てるために使用される。
【００２３】
（制限マップデータベース）
本明細書で記載される方法とともに使用されるデータベースは、前出で議論される光学的マッピング技術によって生成され得る。上記データベースは、多数の単離物（例えば、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１，０００個、約１，５００個、約２，０００個、約３，０００個、約５，０００個、約１０，０００個もしくはこれ以上の単離物）についての情報を含み得る。さらに、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関して注釈付きの情報（類似性クラスター）を含む。多数の単離物および特定のモチーフに関する情報は、生物の正確かつ迅速な同定を可能にする。
【００２４】
上記データベースの制限マップは、種々の単離物に由来する核酸を特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素で消化（切断）することによって、生成され得る。いくつかのマップは、１種のエンドヌクレアーゼでの消化の結果であり得る。いくつかのマップは、エンドヌクレアーゼの組み合わせ（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種もしくはこれ以上のエンドヌクレアーゼ）での消化の結果であり得る。上記データベースおよび／もしくは上記同定されるべき生物についての制限マップを生成するために使用され得る例示的エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられる：ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ。使用され得る他のエンドヌクレアーゼの非網羅的な例としては、以下が挙げられる：ＡｌｕＩ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、およびＳｍａＩ。さらに他の制限エンドヌクレアーゼは、当該分野で公知である。
【００２５】
異なる株間でのマップアラインメントは、フラグメントサイジングエラー、誤った切断および切断の欠失（ｍｉｓｓｉｎｇ ｃｕｔ）、ならびに欠失した小さなフラグメント（ｍｉｓｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を組み込むスコアリングモデルに従って、２つの制限マップの光学的アラインメントを見いだすダイナミックプログラミングアルゴリズムで生成される（Ｍｙｅｒｓら，Ｂｕｌｌ Ｍａｔｈ Ｂｉｏｌ ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら，Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｒｏｂａｂ ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、上記スコアは、より長い、より良好なアラインメントがより高いスコアを有するように、上記２つのマップの間の差異によってペナルティーを科されるアラインメントの長さの対数に比例する。
【００２６】
類似性クラスターを生成するために、各マップは、あらゆる他のマップに対して整列される。これらアラインメントから、対様式のアラインメント分析は、両方のゲノム中のマッチしていない領域の全長を、両方のゲノムの全体のサイズで除算することによって、上記対のメンバーの間で「パーセント非類似性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を決定するために行われる。これら非類似性測定値は、統計学的パッケージ「Ｒ」において実行されるように、凝集性クラスター化法（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）「Ａｇｎｅｓ」への入力として使用される。簡潔には、このクラスター化法は、それ自体のクラスターにおいて各エントリーを最初に配置し、次いで、２つの最も近いクラスターを反復して連結することによって機能する。ここで上記２つのクラスター間の距離は、一方のクラスター中の点と、他方のクラスター中の点との間の最小の非類似性である。
【００２７】
（同定されるべき生物）
種々の生物（例えば、ウイルス）および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物、および真菌）は、本明細書で特色のある方法で同定され得る。一実施形態において、上記生物の遺伝情報は、ＤＮＡの形態において保存される。上記遺伝情報はまた、ＲＮＡとして保存され得る。
【００２８】
同定されるべき生物を含むサンプルは、ヒトサンプル（例えば、組織サンプル（例えば、上皮組織（例えば、皮膚）、結合組織（例えば、血液および骨）、筋肉組織、および神経組織、または分泌サンプル（例えば、唾液、尿、涙液、および糞便サンプル））であり得る。上記サンプルはまた、非ヒトサンプル（例えば、馬、ラクダ、ラマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、イタチ、齧歯類、鳥、は虫類、および昆虫サンプル）であり得る。上記サンプルはまた、植物、水源、食品、空気、土壌、植物、または他の環境供給源もしくは産業的供給源に由来し得る。
【００２９】
（生物の同定）
本明細書で記載される方法（すなわち、生物を同定する方法、被験体における疾患もしくは障害を診断する方法、生物の抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および被験体に投与するための治療上有効な抗生物質を決定する方法、および被験体を処置する方法）は、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させる工程を包含する。上記方法は、未知のサンプル（もしくは上記サンプルの平均制限マップ）からの生の単一分子マップの各々を、上記データベース中の実態の各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００３０】
上記方法の一実施形態において、上記同定されるべき生物の全ゲノムは、上記データベースに対して比較され得る。別の実施形態において、上記ゲノムに由来する共有エレメントを抽出するためのいくつかの方法が、上記マッチングアルゴリズムのための参照点としてなお働き得る上記生物のゲノムの領域の減少したセットを生成するために作り出され得る。
【００３１】
上記でおよび以下の実施例において議論されるように、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関する注釈付きの情報（類似性クラスター）を含み得る。このような詳細な情報は、亜種レベルで生物の同定を可能にし、続いて、上記生物を有する被験体のより正確な診断および／もしくは処置を可能にする。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の方法は、生物、株、もしくは状態を示す遺伝的モチーフを同定するために使用される。例えば、本発明の方法は、単離物において、抗生物質耐性を付与する少なくとも１つのモチーフを同定するために使用される。このことは、さらなるクラスター分析なしで、処置の適切な選択を可能にする。
【００３３】
（適用）
本明細書に記載される方法は、種々の状況において、例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体において、食品において、環境供給源（例えば、食品、水、空気）において、および産業的状況において、生物を同定するために使用され得る。上記特色のある方法はまた、被験体（例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体）における疾患もしくは障害を診断する方法、および、上記診断に基づいて上記被験体を処置する方法を包含する。上記方法は：上記被験体由来の生物を含むサンプルを得る工程；上記生物由来の核酸を画像化する工程；上記核酸の制限マップを得る工程；上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程；および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程を包含する。
【００３４】
上で議論されたように、種々の生物が、本明細書で議論される方法によって同定され得、したがって、種々の疾患および障害が、上記方法によって診断され得る。上記生物は、上記疾患もしくは障害の、例えば、原因、誘因、および／もしくは徴候であり得る。一実施形態において、１種より多い生物が、本明細書に記載される方法によって同定され得、そして存在する生物の組み合わせは、診断を導き得る。専門家は、生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させ得る。例として、以下に、数種の疾患およびそれらを引き起こすことが公知である細菌を非網羅的に列挙する；破傷風−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ；結核−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；髄膜炎−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；ボツリスム−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；細菌性赤痢（ｄｙｓｅｎｔｒｙ）−Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；ライム病−Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；胃腸炎−Ｅ．ｃｏｌｉおよび／もしくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．；食中毒−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、および／もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。これらおよび他の疾患もしくは障害は、本明細書に記載される方法によって診断され得る。
【００３５】
いったん疾患もしくは障害が診断されると、被験体を処置することに関する決定が、例えば、医療提供者および獣医師によってなされ得る。上記被験体を処置することは、（その同定された生物が一因となっている、もしくはその同定された生物が原因である）疾患もしくは障害を改善させるため、薬剤もしくは薬剤の組み合わせを投与する工程を含み得る。上記疾患もしくは上記障害の改善は、その疾患もしくはその障害の症状の低減を含み得る。上記被験体に投与される薬剤は、精神もしくは身体のプロセスに影響する任意の化学的物質（例えば、抗体および／もしくは小分子）を含み得る。上記薬剤は、組成物（例えば、薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物）の形態で投与され得る。上記組成物は、例えば、静脈内投与、経口投与、局所的投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、および経肛門投与に適切な形態であり得る。適切な薬学的キャリアとしては、例えば、滅菌生理食塩水、生理学的緩衝溶液などが挙げられる。上記薬学的組成物は、活性成分の放出を制御するために、もしくは患者の器官系において、それら薬学的組成物を長く存在させるために、さらに処方され得る。この目的のために適切な多数の薬剤送達システムが公知であり、例えば、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミクロスフェアなどが挙げられる。上記被験体の処置はまた、化学療法および放射線治療を含み得る。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明の方法の例示的実施形態を提供し、限定として扱われるべきではない。
【００３７】
（実施例１．光学的マッピングを使用する微生物の同定）
微生物同定（ＩＤ）は、一般に、２つの相を有する。第１において、多くの生物に由来するＤＮＡを、マッピングし、互いに対して比較する。これら比較から、重要な表現型および分類法が、マップ特徴と関係づけられる。第２の相において、単一分子制限マップを、最良のマッチを見いだすために、上記データベースに対して比較する。
【００３８】
（データベース構築および注釈）
生物の多様性を表すに十分なマップを、上記マップが種々の生物を識別することが可能であることに基づいて、生成する。上記データベースにおける上記生物の多様性が大きいほど、未知の生物を同定する能力は、より正確になる。理想的には、データベースは、医療的もしくは産業的状況において有用であるように十分な種々の微生物について、種および亜種のレベルで公知の生物の配列マップを含む。しかし、任意の所定のデータベースにマッピングされる生物の正確な数は、上記データベースが投入されるべき望ましい使用に基づいて、上記ユーザーの都合のよいときに決定される。
【００３９】
十分な数の微生物がマッピングされた後、マップ類似性クラスターを生成する。第１に、マップのツリーを生成する。上記ツリー構築の後、種々の表現型および分類データをオーバーレイし、上記集団の残りから個々のクレードを特有に区別するマップの領域を、同定する。この目的は、目的の表現型／分類と相関する特定のクレードを見いだすことである。これは、上記クラスター化法に対する改善を介して一部引き起こされる。
【００４０】
いったん上記クラスターおよびツリーが注釈をつけられたら、上記注釈は、個々のマップに戻って適用される。さらに、必要であれば、上記データベースを、区別の重要な領域のみを含むようにトリミングし、これは、時間効率（ｔｉｍｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増大させ得る。
【００４１】
（未知のものの予想（ｃａｌｌｉｎｇ）（同定））
未知のものを試験する一実施形態は、上記未知のサンプルに由来する生の単一分子マップの各々を、上記データベース中のエントリーの各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００４２】
近縁の生物の間の識別を、上記生物から得られたデータと、上記データベース中のデータと比較することによって、最大のヒットもしくは最良のマッチ可能性を単純に選び出すことによって行い得る。より正確な比較を、何がその特定のゲノムの識別的特徴であるのか 対 何が、同じ種のいくつかの単離物の中で共有される共通するモチーフであるのかについて、各ゲノムに対する詳細な注釈を有することによって行い得る。従って、マッチスコアが統合される場合、分類のレベル（単一ゲノムよりむしろ）に、一定の可能性が認められる（ｒｅｃｅｉｖｅ ａ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）。従って、何か明確な特徴であるのか、および何が共有されるのかに関して、上記ゲノムの広範囲の注釈が必要とされる。
【００４３】
上記方法の一実施形態において、全ゲノムを、全ての分子に対して比較する。種内のマップの多くの重なり合いが一般に存在するので、別の実施形態が使用され得る。第２の実施形態において、上記ゲノムから共有されるエレメントを抽出するためのいくつかの方法を、上記マッチングアルゴリズムについての参照点としてもなお働き得る領域の減少したセットを生成するために、作り出す。上記第２の実施形態は、システム性能を増大させるために、参照データベースを合理化すること（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｉｎｇ）を可能にする。
【００４４】
（実施例２．微生物同定のための複数酵素の使用）
一実施形態において、上記酵素の各々からの単一分子制限マップを、実施例１に記載されるデータベースに対して独立して比較し、有望な同定を、各酵素から独立して予想する（ｃａｌｌ）。次いで、その最後のマッチ可能性を、独立した実験として組み合わせる。この実施形態は、いくつかの組み込まれた余剰分を提供し、従って、上記プロセスの正確性を提供する。
【００４５】
（緒言）
一般に、光学的マッピングを、平均フラグメントサイズの特定の範囲内で使用し得、任意の所定の酵素については、異なるゲノムにわたって、平均フラグメントサイズにおけるかなりの変動が存在する。これら理由から、光学的マッピングは、代表的には、臨床的に関連する微生物の同定のために単一酵素を選択するには最適でない。代わりに、目的のあらゆる生物について、マッピングに適したデータベース中に少なくとも１つの酵素が存在する可能性を最適化するために、小さなセットの酵素を選択する。
【００４６】
（選択基準）
酵素選択の第１の工程は、目的の細菌の同定であった。これら細菌を２つの群に分類した：（ａ）最も共通する臨床的に興味深い生物、および（ｂ）人の健康に関与する他の細菌。選択されたセットの酵素は、上記共通する臨床的に興味深い細菌の各々を、近縁のゲノムの詳細な比較に適した平均フラグメントサイズ（約６〜１３ｋｂ）の範囲内で切断する少なくとも１種の酵素を有さなければならない。さらに、残りの生物については、各フラグメントは、光学的マッピングのための機能的範囲（約４〜２０ｋｂ）内になければならない。これらの制限を、数学的モデリング、管理された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）実験、および顧客指示を伴う実験を通じて決定した。最後に、光学的マッピングに既に使用された酵素を選択した。
【００４７】
（示唆されるセット）
上記基準に基づいて、予備セットは、酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｂａＩからなり、これら酵素を、光学的マッピングのために使用した。公知の酵素とともに、重要な生物を網羅する２８個のさらなるセットが存在するので、このセットが適切でない事象においては、代わりのものが利用される（データ示さず）。
【００４８】
（最終工程）
実験２における分析は、配列決定されたゲノムに焦点が当てられているので、完全なデータベース生成の前に、このセットの酵素を他の臨床的に重要なゲノムに対して試験する。これは、原理研究の証明の第１相の一部である。
【００４９】
（実施例３．Ｅ．ｃｏｌｉの同定）
Ａ．微生物同定法の一実施形態において、約５００〜約１，０００個の単離物の間の核酸を、光学的にマッピングする。次いで、特有のモチーフを、属、種、株、亜株、および単離物にわたって同定する。サンプルを同定するために、上記サンプルの単一核酸分子を、上記モチーフに対して整列させ、ｐ値を各モチーフマッチについて割り当てる。上記ｐ値を組み合わせて、モチーフの尤度を見いだす。最も特異的なモチーフに同定を与える。
【００５０】
Ｂ．以下の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉを単離物レベルへ下げて同定する方法を例示する。６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物の制限マップを、これら単離物の核酸をＢａｍＨＩ制限酵素で消化することによって得た。図１は、これら６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：５３６、Ｏ１５７：Ｈ７（完全ゲノム）、ＣＦＴ０７３（完全ゲノム）、１３８１、Ｋ１２（完全ゲノム）、および７１８の制限マップを示す。図２に示されるように、上記単離物を３つの亜群（株）にクラスター化した：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、Ｋ１２（Ｋ１２および７１８を含む）。
【００５１】
これら制限マップは、これら６つの単離物の関係に関して複数レベルの情報を提供した（例えば、上記３つ亜群の全てに共通するモチーフ（図３を参照のこと）およびＥ．ｃｏｌｉに特異的な領域（図４中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示した）。上記マップはまた、各株に特有の領域（図５中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）および各単離物に対して特異的な領域（図６中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示すことができた。
【００５２】
この情報および類似の情報を、データベース中で保存し得、目的の細菌を同定するために使用し得る。例えば、同定されるべき生物の制限マップを、上記生物の上記核酸をＢａｍＨＩで消化することによって、獲得し得る。この制限マップを、上記データベース中のマップと比較し得る。上記同定されるべき生物のマップが、Ｅ．ｃｏｌｉに対して、亜群のうちの１つに対して、上記株のうちの１つに対して、および／もしくは特定の単離物に対して、特異的なモチーフを含む場合、上記生物の正体は、上記特定のモチーフを相関させることによって、得られ得る。図６は、類似性ツリーの種々の長さを横断する可能性を図示するために、模式図を示す。
【００５３】
Ｃ．以下の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌としてサンプルを同定することを例示する。サンプル（サンプル２８）を、ＢａｍＨＩで消化し、その制限マップを得た（図８、真ん中の制限マップを参照のこと）。このサンプルを、種々のＥ．ｃｏｌｉ単離物を含むデータベースに対して整列させた。上記サンプルは、４つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：ＮＣ ００２６９５、ＡＣ ００００９１、ＮＣ ０００９１３、およびＮＣ ００２６５５に類似であることが分かった。従って、上記サンプルを、上記ＡＣ ００００９１単離物に最も近縁であるＥ．ｃｏｌｉ細菌として同定した。
【００５４】
本開示の実施形態は、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書で記載されるもの以外の方法において行われ得る。従って、上記実施形態は、例示であって、限定ではないと解釈されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国特許商標庁に、２００８年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０２９，８１６号および２００８年５月１４日に出願された米国本出願第１２／１２０，５８６号（これらは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、生物（例えば、微生物）を同定する方法に関連する。この方法は、生物の核酸を画像化することを含み得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ゲノムの物理的マッピング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限マップを作り出す）は、種々の生物の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限マップは、光学的マッピングによって生成され得る。光学的マッピングは、蛍光顕微鏡を使用して、個々の標識されたＤＮＡ分子上の制限エンドヌクレアーゼ切断事象を可視化することによって、整然とした制限マップを生成し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明は、生物（例えば、微生物）を同定する方法を提供する。上記方法は、核酸の制限マップを生物から得る工程、および上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、それによって生物を同定する工程を包含する。詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属レベルおよび種レベルでのみならず、亜種レベル（株、亜株、および／もしくは単離物レベル）でも、同定かつ分類され得る。上記特色のある方法は、生物を同定するための迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。上記方法は、臨床状況（例えば、ヒトもしくは獣医学の状況）において；または環境的状況もしくは産業的状況（例えば、臨床微生物学もしくは工業的微生物学、食品安全性試験、地下水試験、大気試験、汚染試験など）において使用され得る。本質的には、本発明は、微生物の検出および／もしくは同定が必要であるかもしくは所望される任意の状況において有用である。
【０００５】
本発明はまた、とりわけ、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程、および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程によって、被験体における上記疾患もしくは障害を診断する方法を特徴とする。
【０００６】
一局面において、本発明は、生物を同定する方法を提供する。上記方法は、核酸サンプルの制限消化産物を得る工程、上記制限フラグメントを画像化する工程、および、上記画像化データをデータベースと比較する工程を包含する。本発明の制限マップは、例えば、核酸を表面に結合させる工程、上記核酸を上記表面上で延ばす工程、および、１種以上の制限エンドヌクレアーゼにさらす工程によって得られ（ｏｒｄｅｒ）得る。一般に、本発明の好ましい方法は、生物から核酸サンプルを得る工程；上記核酸を画像化する工程；上記核酸の制限マップを得る工程；および、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、これによって上記生物を同定する工程を包含する。
【０００７】
上記検出される物質は、微生物、細菌、原生生物、ウイルス、真菌、もしくは疾患原因生物（微生物（例えば、原生動物および多細胞寄生生物）を含む）であり得る。上記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはサンプルから得られたＲＮＡのｃＤＮＡコピーであり得る。上記核酸サンプルとしては、任意の組織もしくは体液サンプル、環境サンプル（例えば、水、空気、塵埃（ｄｉｒｔ）、岩など）、およびそれらから得られる全てのサンプルが挙げられる。
【０００８】
本発明の方法は、画像化する前に、核酸を１種以上の酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ）で消化する工程をさらに包含し得る。好ましい制限酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＭｌｕＩ
ＡｆｌＩＩ ＢｇｌＩＩ ＰａｃＩ
ＡｆｌＩＩ ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＭｌｕＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ
ＡｆｌＩＩ ＡｐａＬＩ ＢａｍＨＩ
ＢｇｌＩＩ ＥｃｏＲＩ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
ＢｇｌＩＩ Ｂｓｕ３６Ｉ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＸｂａＩ
ＡｐａＬＩ ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ
ＡｐａＬＩ ＢａｍＨＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＸｂａＩ
ＢｇｌＩＩ ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＰａｃＩ
ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＢａｍＨＩ ＮｃｏＩ ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＰａｃＩ ＸｂａＩ
ＭｌｕＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
Ｂｓｕ３６Ｉ ＭｌｕＩ ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ ＢｇｌＩＩ ＮｈｅＩ
ＢａｍＨＩ ＮｄｅＩ ＰａｃＩ
ＢａｍＨＩ Ｂｓｕ３６Ｉ ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＰｖｕＩＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｃｏＩ ＮｈｅＩ
ＢｇｌＩＩ ＮｈｅＩ ＰａｃＩ 。
【０００９】
画像化は、理想的には、上記核酸を標識する工程を包含する。標識法は、当該分野で公知であり、任意の公知の標識を含み得る。しかし、好ましい標識は、光学的に検出可能な標識（例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒａｎ １５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット（ｂｕｔｙｒａｔｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標） Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミンＢ スルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ ７００；ＩＲＤ ８００；Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ナフタロシアニン、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯおよびＪＯＪＯ）である。
【００１０】
本発明において使用するためのデータベースは、制限マップ類似性クラスターを含み得る。上記データベースは、上記生物のクレードの少なくとも１つのメンバーからの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを伴う制限マップを含み得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、被験体における疾患もしくは障害を診断する方法を特色とし、上記方法は、検出されるべき生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；（ｂ）上記生物由来の核酸を画像化する工程；（ｃ）上記核酸の制限マップを得る工程；（ｄ）上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、上記生物を同定する工程、および（ｅ）上記生物の正体と、上記疾患もしくは障害とを相関させる工程を包含する。
【００１２】
方法は、被験体における疾患もしくは障害を処置する工程をさらに包含し得、この方法は、上で記載したように、被験体における疾患もしくは障害を診断する工程、および、上記疾患もしくは障害を改善させるために、上記被験体に処置を提供する工程を包含し得る。処置は、薬剤を上記被験体に投与する工程を包含し得る。
【００１３】
一実施形態において、単一のＤＮＡ分子から得られた制限マップは、公知の生物からの制限マップのデータベースに対して、上記データベースに存在する制限フラグメントパターンに最もマッチするものを同定するために、比較される。このプロセスは、十分なマッチが、所定の信頼レベルで生物を同定するために得られるまで、反復して行われ得る。本発明の方法によれば、サンプルから核酸が調製され、本明細書で記載されるように画像化される。制限マップが調製され、その制限パターンが、公知の生物についての制限パターンのデータベースと相関させられる。好ましい実施形態において、生物は、生物の混合物を含むサンプルから同定される。非常に好ましい実施形態において、本発明の方法は、１つより多い生物を含むと疑われるサンプルに存在する種々の生物の比率を決定するために使用される。さらに、本発明の方法の使用は、連続してもしくは同時に、同じサンプルから複数の微生物の検出を可能にする。
【００１４】
使用時に、本発明は、環境サンプル中の汚染物質を構成する微生物を同定するために適用され得る。例えば、本発明の方法は、空気、水、土壌、衣服、旅行携帯品（ｌｕｇｇａｇｅ）、唾液、尿、血液、痰、食品、飲料などのサンプル中の潜在的な生物学的ハザードを同定するために有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、未知の供給源から得られたサンプル中の生物を検出および同定するために使用される。本質的には、本発明の方法は、任意の環境的状況もしくは産業的状況における生物学的ハザードを検出するために使用され得る。
【００１５】
本発明のさらなる局面および特徴は、以下のその詳細な説明を見れば、明らかである。
【００１６】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップを示す模式図である。
【図２】図２は、３群にクラスター化されたＥ．ｃｏｌｉの６つの単離物：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、およびＫ１２（Ｋ１２および７１８を含む）の制限マップを示す模式図である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップの中の共通するモチーフを示す模式図である。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、Ｅ．ｃｏｌｉに共通する領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、特定の株（すなわち、Ｏ１５７、ＣＦＴ、もしくはＫ１２）に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図６】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、各単離物に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉを同定すると考えられるレベルを示す、ツリー図である。
【図８】図８は、サンプルの制限マップ（中央のマップ）およびデータベースからの関連する制限マップを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本開示は、生物（例えば、微生物）を同定する方法を特徴とする。上記方法は、生物から核酸（例えば、ＤＮＡ）の制限マップを得る工程、および、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させ、これによって上記生物を同定する工程を包含する。種々の群および亜群に共通するモチーフを含む詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属および種のレベルでのみならず、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物レベルでも同定および分類され得る。例えば、細菌は、属レベル（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、種レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種）、株レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７、ＣＦＴ、およびＫ１２株）、ならびに単離物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７：Ｈ７単離物）（以下の実験３Ｂにおいて記載されるように）において同定および分類され得る。上記特色のある方法は、生物を同定するための迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。これら方法は、種々の臨床状況において（例えば、被験体（例えば、ヒトもしくは動物被験体）における生物の同定のために）使用され得る。
【００１９】
本開示はまた、とりわけ、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程、および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程によって、被験体における上記疾患もしくは障害を診断する方法を特徴とする。これらの方法は、臨床状況、例えば、ヒトおよび獣医学の状況において使用され得る。
【００２０】
本発明の方法はまた、食品もしくは環境的状況において、生物を同定および／もしくは検出するために有用である。例えば、本発明の方法は、飲料水、空気、土壌、および他の環境供給源中の環境的脅威を評価するために使用され得る。本発明の方法はまた、食品中の生物を同定するために、ならびに時間でもしくは地理的に分離される複数のサンプル、および同じもしくは類似のバッチに由来するサンプルにおける食中毒の共通する供給源を決定するために有用である。
【００２１】
（制限マッピング）
本明細書で特色のある方法は、データベースの生成および同定されるべき生物の処理の両方の間の制限マッピングを利用する。使用され得る制限マッピングの１つのタイプは、光学的マッピングである。光学的マッピングは、単一のＤＮＡ分子から整然とした制限マップを生成するための単一分子技術である（Ｓａｍａｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。この方法の間に、個々の蛍光標識されたＤＮＡ分子は、カバースリップと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れ（第１世代の方法において）において延ばされる（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）か、もしくはポリリジン処理ガラス表面上で固定される（第２世代の方法において）。同書。上記添加されたエンドヌクレアーゼは、特定の点において上記ＤＮＡを切断し、そのフラグメントが画像化される。同書。制限マップは、上記消化から生じるフラグメントの数に基づいて、構築され得る。同書。一般に、最終的なマップは、類似の分子から得られるフラグメントサイズの平均である。同書。従って、本発明の一実施形態において、同定されるべき生物の制限マップは、上記生物を含むサンプルから生成される多くのマップの平均である。
【００２２】
光学的マッピングおよび関連する方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、同第５，５９９，６６４号、同第６，１５０，０８９号、同第６，１４７，１９８号、同第５，７２０，９２８号、同第６，１７４，６７１号、同第６，２９４，１３６号、同第６，３４０，５６７号、同第６，４４８，０１２号、同第６，５０９，１５８号、同第６，６１０，２５６号、および同第６，７１３，２６３号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載されている。光学的マップは、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２（本明細書に参考として援用される）に記載されるように、構築される。簡潔には、試験生物由来の個々の染色体フラグメントが、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電的相互作用によって、誘導体化ガラス上に固定され、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、インターカレーター色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、そして画像分析のために自動化蛍光顕微鏡に配置される。上記染色体フラグメントは固定化されるので、上記制限エンドヌクレアーゼでの消化によって生成された上記制限フラグメントは、上記ガラスに結合したままであり、上記インターカレーター色素での染色後に、蛍光顕微鏡法によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限フラグメントのサイズは、画像分析ソフトウェアを使用して測定され、異なる分子における同一の制限フラグメントパターンは、染色体全体を網羅する、整然とした制限マップを組み立てるために使用される。
【００２３】
（制限マップデータベース）
本明細書で記載される方法とともに使用されるデータベースは、前出で議論される光学的マッピング技術によって生成され得る。上記データベースは、多数の単離物（例えば、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１，０００個、約１，５００個、約２，０００個、約３，０００個、約５，０００個、約１０，０００個もしくはこれ以上の単離物）についての情報を含み得る。さらに、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関して注釈付きの情報（類似性クラスター）を含む。多数の単離物および特定のモチーフに関する情報は、生物の正確かつ迅速な同定を可能にする。
【００２４】
上記データベースの制限マップは、種々の単離物に由来する核酸を特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素で消化（切断）することによって、生成され得る。いくつかのマップは、１種のエンドヌクレアーゼでの消化の結果であり得る。いくつかのマップは、エンドヌクレアーゼの組み合わせ（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種もしくはこれ以上のエンドヌクレアーゼ）での消化の結果であり得る。上記データベースおよび／もしくは上記同定されるべき生物についての制限マップを生成するために使用され得る例示的エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられる：ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ。使用され得る他のエンドヌクレアーゼの非網羅的な例としては、以下が挙げられる：ＡｌｕＩ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、およびＳｍａＩ。さらに他の制限エンドヌクレアーゼは、当該分野で公知である。
【００２５】
異なる株間でのマップアラインメントは、フラグメントサイジングエラー、誤った切断および切断の欠失（ｍｉｓｓｉｎｇ ｃｕｔ）、ならびに欠失した小さなフラグメント（ｍｉｓｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を組み込むスコアリングモデルに従って、２つの制限マップの光学的アラインメントを見いだすダイナミックプログラミングアルゴリズムで生成される（Ｍｙｅｒｓら，Ｂｕｌｌ Ｍａｔｈ Ｂｉｏｌ ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら，Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｒｏｂａｂ ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、上記スコアは、より長い、より良好なアラインメントがより高いスコアを有するように、上記２つのマップの間の差異によってペナルティーを科されるアラインメントの長さの対数に比例する。
【００２６】
類似性クラスターを生成するために、各マップは、あらゆる他のマップに対して整列される。これらアラインメントから、対様式のアラインメント分析は、両方のゲノム中のマッチしていない領域の全長を、両方のゲノムの全体のサイズで除算することによって、上記対のメンバーの間で「パーセント非類似性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を決定するために行われる。これら非類似性測定値は、統計学的パッケージ「Ｒ」において実行されるように、凝集性クラスター化法（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）「Ａｇｎｅｓ」への入力として使用される。簡潔には、このクラスター化法は、それ自体のクラスターにおいて各エントリーを最初に配置し、次いで、２つの最も近いクラスターを反復して連結することによって機能する。ここで上記２つのクラスター間の距離は、一方のクラスター中の点と、他方のクラスター中の点との間の最小の非類似性である。
【００２７】
（同定されるべき生物）
種々の生物（例えば、ウイルス）および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物、および真菌）は、本明細書で特色のある方法で同定され得る。一実施形態において、上記生物の遺伝情報は、ＤＮＡの形態において保存される。上記遺伝情報はまた、ＲＮＡとして保存され得る。
【００２８】
同定されるべき生物を含むサンプルは、ヒトサンプル（例えば、組織サンプル（例えば、上皮組織（例えば、皮膚）、結合組織（例えば、血液および骨）、筋肉組織、および神経組織、または分泌サンプル（例えば、唾液、尿、涙液、および糞便サンプル））であり得る。上記サンプルはまた、非ヒトサンプル（例えば、馬、ラクダ、ラマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、イタチ、齧歯類、鳥、は虫類、および昆虫サンプル）であり得る。上記サンプルはまた、植物、水源、食品、空気、土壌、植物、または他の環境供給源もしくは産業的供給源に由来し得る。
【００２９】
（生物の同定）
本明細書で記載される方法（すなわち、生物を同定する方法、被験体における疾患もしくは障害を診断する方法、生物の抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および被験体に投与するための治療上有効な抗生物質を決定する方法、および被験体を処置する方法）は、生物の核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させる工程を包含する。上記方法は、未知のサンプル（もしくは上記サンプルの平均制限マップ）からの生の単一分子マップの各々を、上記データベース中の実態の各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００３０】
上記方法の一実施形態において、上記同定されるべき生物の全ゲノムは、上記データベースに対して比較され得る。別の実施形態において、上記ゲノムに由来する共有エレメントを抽出するためのいくつかの方法が、上記マッチングアルゴリズムのための参照点としてなお働き得る上記生物のゲノムの領域の減少したセットを生成するために作り出され得る。
【００３１】
上記でおよび以下の実施例において議論されるように、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関する注釈付きの情報（類似性クラスター）を含み得る。このような詳細な情報は、亜種レベルで生物の同定を可能にし、続いて、上記生物を有する被験体のより正確な診断および／もしくは処置を可能にする。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の方法は、生物、株、もしくは状態を示す遺伝的モチーフを同定するために使用される。例えば、本発明の方法は、単離物において、抗生物質耐性を付与する少なくとも１つのモチーフを同定するために使用される。このことは、さらなるクラスター分析なしで、処置の適切な選択を可能にする。
【００３３】
（適用）
本明細書に記載される方法は、種々の状況において、例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体において、食品において、環境供給源（例えば、食品、水、空気）において、および産業的状況において、生物を同定するために使用され得る。上記特色のある方法はまた、被験体（例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体）における疾患もしくは障害を診断する方法、および、上記診断に基づいて上記被験体を処置する方法を包含する。上記方法は：上記被験体由来の生物を含むサンプルを得る工程；上記生物由来の核酸を画像化する工程；上記核酸の制限マップを得る工程；上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって上記生物を同定する工程；および、上記生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させる工程を包含する。
【００３４】
上で議論されたように、種々の生物が、本明細書で議論される方法によって同定され得、したがって、種々の疾患および障害が、上記方法によって診断され得る。上記生物は、上記疾患もしくは障害の、例えば、原因、誘因、および／もしくは徴候であり得る。一実施形態において、１種より多い生物が、本明細書に記載される方法によって同定され得、そして存在する生物の組み合わせは、診断を導き得る。専門家は、生物の正体と、疾患もしくは障害とを相関させ得る。例として、以下に、数種の疾患およびそれらを引き起こすことが公知である細菌を非網羅的に列挙する；破傷風−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ；結核−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；髄膜炎−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；ボツリスム−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；細菌性赤痢（ｄｙｓｅｎｔｒｙ）−Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；ライム病−Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；胃腸炎−Ｅ．ｃｏｌｉおよび／もしくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．；食中毒−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、および／もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。これらおよび他の疾患もしくは障害は、本明細書に記載される方法によって診断され得る。
【００３５】
いったん疾患もしくは障害が診断されると、被験体を処置することに関する決定が、例えば、医療提供者および獣医師によってなされ得る。上記被験体を処置することは、（その同定された生物が一因となっている、もしくはその同定された生物が原因である）疾患もしくは障害を改善させるため、薬剤もしくは薬剤の組み合わせを投与する工程を含み得る。上記疾患もしくは上記障害の改善は、その疾患もしくはその障害の症状の低減を含み得る。上記被験体に投与される薬剤は、精神もしくは身体のプロセスに影響する任意の化学的物質（例えば、抗体および／もしくは小分子）を含み得る。上記薬剤は、組成物（例えば、薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物）の形態で投与され得る。上記組成物は、例えば、静脈内投与、経口投与、局所的投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、および経肛門投与に適切な形態であり得る。適切な薬学的キャリアとしては、例えば、滅菌生理食塩水、生理学的緩衝溶液などが挙げられる。上記薬学的組成物は、活性成分の放出を制御するために、もしくは患者の器官系において、それら薬学的組成物を長く存在させるために、さらに処方され得る。この目的のために適切な多数の薬剤送達システムが公知であり、例えば、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミクロスフェアなどが挙げられる。上記被験体の処置はまた、化学療法および放射線治療を含み得る。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明の方法の例示的実施形態を提供し、限定として扱われるべきではない。
【００３７】
（実施例１．光学的マッピングを使用する微生物の同定）
微生物同定（ＩＤ）は、一般に、２つの相を有する。第１において、多くの生物に由来するＤＮＡを、マッピングし、互いに対して比較する。これら比較から、重要な表現型および分類法が、マップ特徴と関係づけられる。第２の相において、単一分子制限マップを、最良のマッチを見いだすために、上記データベースに対して比較する。
【００３８】
（データベース構築および注釈）
生物の多様性を表すに十分なマップを、上記マップが種々の生物を識別することが可能であることに基づいて、生成する。上記データベースにおける上記生物の多様性が大きいほど、未知の生物を同定する能力は、より正確になる。理想的には、データベースは、医療的もしくは産業的状況において有用であるように十分な種々の微生物について、種および亜種のレベルで公知の生物の配列マップを含む。しかし、任意の所定のデータベースにマッピングされる生物の正確な数は、上記データベースが投入されるべき望ましい使用に基づいて、上記ユーザーの都合のよいときに決定される。
【００３９】
十分な数の微生物がマッピングされた後、マップ類似性クラスターを生成する。第１に、マップのツリーを生成する。上記ツリー構築の後、種々の表現型および分類データをオーバーレイし、上記集団の残りから個々のクレードを特有に区別するマップの領域を、同定する。この目的は、目的の表現型／分類と相関する特定のクレードを見いだすことである。これは、上記クラスター化法に対する改善を介して一部引き起こされる。
【００４０】
いったん上記クラスターおよびツリーが注釈をつけられたら、上記注釈は、個々のマップに戻って適用される。さらに、必要であれば、上記データベースを、区別の重要な領域のみを含むようにトリミングし、これは、時間効率（ｔｉｍｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増大させ得る。
【００４１】
（未知のものの予想（ｃａｌｌｉｎｇ）（同定））
未知のものを試験する一実施形態は、上記未知のサンプルに由来する生の単一分子マップの各々を、上記データベース中のエントリーの各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００４２】
近縁の生物の間の識別を、上記生物から得られたデータと、上記データベース中のデータと比較することによって、最大のヒットもしくは最良のマッチ可能性を単純に選び出すことによって行い得る。より正確な比較を、何がその特定のゲノムの識別的特徴であるのか 対 何が、同じ種のいくつかの単離物の中で共有される共通するモチーフであるのかについて、各ゲノムに対する詳細な注釈を有することによって行い得る。従って、マッチスコアが統合される場合、分類のレベル（単一ゲノムよりむしろ）に、一定の可能性が認められる（ｒｅｃｅｉｖｅ ａ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）。従って、何か明確な特徴であるのか、および何が共有されるのかに関して、上記ゲノムの広範囲の注釈が必要とされる。
【００４３】
上記方法の一実施形態において、全ゲノムを、全ての分子に対して比較する。種内のマップの多くの重なり合いが一般に存在するので、別の実施形態が使用され得る。第２の実施形態において、上記ゲノムから共有されるエレメントを抽出するためのいくつかの方法を、上記マッチングアルゴリズムについての参照点としてもなお働き得る領域の減少したセットを生成するために、作り出す。上記第２の実施形態は、システム性能を増大させるために、参照データベースを合理化すること（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｉｎｇ）を可能にする。
【００４４】
（実施例２．微生物同定のための複数酵素の使用）
一実施形態において、上記酵素の各々からの単一分子制限マップを、実施例１に記載されるデータベースに対して独立して比較し、有望な同定を、各酵素から独立して予想する（ｃａｌｌ）。次いで、その最後のマッチ可能性を、独立した実験として組み合わせる。この実施形態は、いくつかの組み込まれた余剰分を提供し、従って、上記プロセスの正確性を提供する。
【００４５】
（緒言）
一般に、光学的マッピングを、平均フラグメントサイズの特定の範囲内で使用し得、任意の所定の酵素については、異なるゲノムにわたって、平均フラグメントサイズにおけるかなりの変動が存在する。これら理由から、光学的マッピングは、代表的には、臨床的に関連する微生物の同定のために単一酵素を選択するには最適でない。代わりに、目的のあらゆる生物について、マッピングに適したデータベース中に少なくとも１つの酵素が存在する可能性を最適化するために、小さなセットの酵素を選択する。
【００４６】
（選択基準）
酵素選択の第１の工程は、目的の細菌の同定であった。これら細菌を２つの群に分類した：（ａ）最も共通する臨床的に興味深い生物、および（ｂ）人の健康に関与する他の細菌。選択されたセットの酵素は、上記共通する臨床的に興味深い細菌の各々を、近縁のゲノムの詳細な比較に適した平均フラグメントサイズ（約６〜１３ｋｂ）の範囲内で切断する少なくとも１種の酵素を有さなければならない。さらに、残りの生物については、各フラグメントは、光学的マッピングのための機能的範囲（約４〜２０ｋｂ）内になければならない。これらの制限を、数学的モデリング、管理された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）実験、および顧客指示を伴う実験を通じて決定した。最後に、光学的マッピングに既に使用された酵素を選択した。
【００４７】
（示唆されるセット）
上記基準に基づいて、予備セットは、酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｂａＩからなり、これら酵素を、光学的マッピングのために使用した。公知の酵素とともに、重要な生物を網羅する２８個のさらなるセットが存在するので、このセットが適切でない事象においては、代わりのものが利用される（データ示さず）。
【００４８】
（最終工程）
実験２における分析は、配列決定されたゲノムに焦点が当てられているので、完全なデータベース生成の前に、このセットの酵素を他の臨床的に重要なゲノムに対して試験する。これは、原理研究の証明の第１相の一部である。
【００４９】
（実施例３．Ｅ．ｃｏｌｉの同定）
Ａ．微生物同定法の一実施形態において、約５００〜約１，０００個の単離物の間の核酸を、光学的にマッピングする。次いで、特有のモチーフを、属、種、株、亜株、および単離物にわたって同定する。サンプルを同定するために、上記サンプルの単一核酸分子を、上記モチーフに対して整列させ、ｐ値を各モチーフマッチについて割り当てる。上記ｐ値を組み合わせて、モチーフの尤度を見いだす。最も特異的なモチーフに同定を与える。
【００５０】
Ｂ．以下の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉを単離物レベルへ下げて同定する方法を例示する。６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物の制限マップを、これら単離物の核酸をＢａｍＨＩ制限酵素で消化することによって得た。図１は、これら６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：５３６、Ｏ１５７：Ｈ７（完全ゲノム）、ＣＦＴ０７３（完全ゲノム）、１３８１、Ｋ１２（完全ゲノム）、および７１８の制限マップを示す。図２に示されるように、上記単離物を３つの亜群（株）にクラスター化した：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、Ｋ１２（Ｋ１２および７１８を含む）。
【００５１】
これら制限マップは、これら６つの単離物の関係に関して複数レベルの情報を提供した（例えば、上記３つ亜群の全てに共通するモチーフ（図３を参照のこと）およびＥ．ｃｏｌｉに特異的な領域（図４中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示した）。上記マップはまた、各株に特有の領域（図５中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）および各単離物に対して特異的な領域（図６中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示すことができた。
【００５２】
この情報および類似の情報を、データベース中で保存し得、目的の細菌を同定するために使用し得る。例えば、同定されるべき生物の制限マップを、上記生物の上記核酸をＢａｍＨＩで消化することによって、獲得し得る。この制限マップを、上記データベース中のマップと比較し得る。上記同定されるべき生物のマップが、Ｅ．ｃｏｌｉに対して、亜群のうちの１つに対して、上記株のうちの１つに対して、および／もしくは特定の単離物に対して、特異的なモチーフを含む場合、上記生物の正体は、上記特定のモチーフを相関させることによって、得られ得る。図６は、類似性ツリーの種々の長さを横断する可能性を図示するために、模式図を示す。
【００５３】
Ｃ．以下の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌としてサンプルを同定することを例示する。サンプル（サンプル２８）を、ＢａｍＨＩで消化し、その制限マップを得た（図８、真ん中の制限マップを参照のこと）。このサンプルを、種々のＥ．ｃｏｌｉ単離物を含むデータベースに対して整列させた。上記サンプルは、４つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：ＮＣ ００２６９５、ＡＣ ００００９１、ＮＣ ０００９１３、およびＮＣ ００２６５５に類似であることが分かった。従って、上記サンプルを、上記ＡＣ ００００９１単離物に最も近縁であるＥ．ｃｏｌｉ細菌として同定した。
【００５４】
本開示の実施形態は、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書で記載されるもの以外の方法において行われ得る。従って、上記実施形態は、例示であって、限定ではないと解釈されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）核酸サンプルを生物から得る工程；
（ｂ）該核酸を画像化する工程；
（ｃ）該核酸の制限マップを得る工程；および
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物は微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物は細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物はウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物は真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸サンプルは、前記生物の全てのゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸サンプルは、前記生物のトランスクリプトームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は、リボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記画像化工程の前に、１種以上の酵素で前記核酸を消化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記画像化工程は、前記核酸を標識する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１種のメンバーからの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
被験体における疾患もしくは障害を診断する方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体由来の生物を含むサンプルを得る工程；
（ｂ）該生物由来の核酸を画像化する工程；
（ｃ）該核酸の制限マップを得る工程；
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程；および
（ｅ）該生物の正体と、該疾患もしくは障害とを相関させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記生物は微生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物は細菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物はウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物は真菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸サンプルは、前記生物の全てのゲノムＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸サンプルは、前記生物のトランスクリプトームを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸は、リボ核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記画像化工程の前に、１種以上の酵素で前記核酸を消化する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記画像化工程は、前記核酸を標識する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１種のメンバーからの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
被験体における疾患もしくは障害を処置する方法であって、該方法は、請求項１９に記載の方法によって該被験体における該疾患もしくは障害を診断する工程、および、該疾患もしくは障害を改善させるために、該被験体に処置を提供する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記処置工程を提供することは、薬剤を前記被験体に投与する工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
該生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；
該サンプル中の核酸の制限マップを調製する工程；
該核酸を画像化する工程；
該制限マップと、既知生物の制限マップを含むデータベースとを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
該生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；
該サンプルから得られた核酸の、１つ以上の制限消化産物の光学的マップを調製する工程；
該光学的マップと、既知の生物の制限消化産物のマップとを比較する工程；および
該比較工程の結果に基づいて、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記サンプルは、食品、血液、痰、唾液、空気、水、土壌、植物物質、および未知の物質より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）核酸サンプルを生物から得る工程；
（ｂ）該核酸の制限マップを得る工程；
（ｃ）該核酸を画像化する工程；および
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１】
生物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）核酸サンプルを生物から得る工程；
（ｂ）該核酸を画像化する工程；
（ｃ）該核酸の制限マップを得る工程；および
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物は微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物は細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物はウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物は真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸サンプルは、前記生物の全てのゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸サンプルは、前記生物のトランスクリプトームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は、リボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記画像化工程の前に、１種以上の酵素で前記核酸を消化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記画像化工程は、前記核酸を標識する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１種のメンバーからの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
被験体における疾患もしくは障害を診断する方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体由来の生物を含むサンプルを得る工程；
（ｂ）該生物由来の核酸を画像化する工程；
（ｃ）該核酸の制限マップを得る工程；
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程；および
（ｅ）該生物の正体と、該疾患もしくは障害とを相関させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記生物は微生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物は細菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物はウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物は真菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸サンプルは、前記生物の全てのゲノムＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸サンプルは、前記生物のトランスクリプトームを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸は、リボ核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記画像化工程の前に、１種以上の酵素で前記核酸を消化する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記画像化工程は、前記核酸を標識する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１種のメンバーからの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
被験体における疾患もしくは障害を処置する方法であって、該方法は、請求項１９に記載の方法によって該被験体における該疾患もしくは障害を診断する工程、および、該疾患もしくは障害を改善させるために、該被験体に処置を提供する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記処置工程を提供することは、薬剤を前記被験体に投与する工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
該生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；
該サンプル中の核酸の制限マップを調製する工程；
該核酸を画像化する工程；
該制限マップと、既知生物の制限マップを含むデータベースとを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
該生物を含むと疑われるサンプルを得る工程；
該サンプルから得られた核酸の、１つ以上の制限消化産物の光学的マップを調製する工程；
該光学的マップと、既知の生物の制限消化産物のマップとを比較する工程；および
該比較工程の結果に基づいて、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記サンプルは、食品、血液、痰、唾液、空気、水、土壌、植物物質、および未知の物質より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
生物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）核酸サンプルを生物から得る工程；
（ｂ）該核酸の制限マップを得る工程；
（ｃ）該核酸を画像化する工程；および
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させることによって、該生物を同定する工程、
を包含する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５１４８０４（Ｐ２０１１−５１４８０４Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６９６４（Ｐ２０１０−５４６９６４）
【出願日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７１４０
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２２３８２９）オプジェン， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３７１４０
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２２３８２９）オプジェン， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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