生物学的に活性な二量体型タンパク質の製造のための新規の方法
【課題】生物学的に活性な二量体型の TGF−β（β型トランスフォーミング増殖因子）様タンパク質の製造のためのフォルディングプロセスの提供。
【解決手段】二量体型生物活性β型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質又はその塩の製造のための方法であって、前記 TGF−β様タンパク質の変性単量体を、この単量化型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって二量化後に生物活性に結びつくようなコンホメーションにフォルディングせしめ、しかもこの単量体を可溶性形態に保っておくような温和な界面活性剤と、DMSO, DMSO2，DMF 、並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る方法。
【解決手段】二量体型生物活性β型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質又はその塩の製造のための方法であって、前記 TGF−β様タンパク質の変性単量体を、この単量化型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって二量化後に生物活性に結びつくようなコンホメーションにフォルディングせしめ、しかもこの単量体を可溶性形態に保っておくような温和な界面活性剤と、DMSO, DMSO2，DMF 、並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は生物学的に活性な二量体型 TGF−β（β型トランスフォーミング増殖因子）様タンパク質の調製のためのフォルディング方法に関する。
発明の背景
TGF−β様タンパク質、即ち、 TGF−β超科は胎芽の発育又は組織の再生の如き数多くの生物学的調節経路における中心的な役割を果たす。これらは非常に有能な生物学的因子であり、それらは多種多様の目的のために治療的にも利用されうる。 TGF−β超科の最も良く知られる構成員は TGF−βそれ自体である。
【０００２】
TGF−βは当初ヒト血小板、ヒト胎盤及びウシの腎臓から均質となるまで精製され、そして約25,000Daの分子量を有するホモ二量体型タンパク質と同定されている。最初は、未形質転換NRK 細胞の定着非依存性増殖を誘導するようにEGF 又は TGF−αと相乗的に作用できる能力により特徴付けられたが、最近になり、 TGF−βが多種多様な正常及び新生細胞の双方に対して莫大な調節作用を発揮することが示され、細胞活性の多機能調節因子としてのこのタンパク質の重要性が示唆されるようになった。細胞又は組織のタイプ、並びにその他の増殖因子の有無に依存して、 TGF−βは有系分裂、細胞増殖及び成長を刺激しうるか、又はこれらの過程を効率的に阻害しうるか、又はその他の作用、例えば脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成及び免疫細胞機能の調節、化学走性の刺激、又は分化の誘導もしくは阻害を発揮しうる。 TGF−βの多くの作用は細胞又は組織のストレス又は負傷に対する応答性及びその結果としての損傷の修復に関連する。炎症発生の後、 TGF−βは顆粒組織の形成に主要たる役割を果たし、フィブロネクチン、コラーゲン及び数種のプロテアーゼインヒビターの如き細胞外マトリックスの形成に関与する遺伝子の発現性を増大させ、そしてフィブロプラストによるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、従って接続組織の収縮における役割の可能性が示唆される。
【０００３】
TGF−β１， TGF−β２， TGF−β３， TGF−β４及び TGF−β５と命名された５種類の機能的且つ構造的に近縁する TGF−βが今までに述べられている。
【０００４】
TGF−βは全て 390〜412 個のアミノ酸前駆体として合成され、これはＣ末端側の 112個のアミノ酸より成る成熟形態となるようにタンパク質分解を受ける。その成熟生物活性形態においては、 TGF−βはそれぞれ 112個のアミノ酸の２本のポリペプチド鎖の酸性及び熱安定性ジスルフィド連結型ホモ二量体である。ヒトの TGF−β１（Derynck, R. ら（1985) Nature 316, 701-705)、ネズミの TGF−β１（Derynck, R. ら（1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379)及びサルの TGF−β１(Sharples, K. ら（1987) DNA 6, 239-244)の完全アミノ酸配列は著しい配列保存性を示し、１個のアミノ酸残基のみで相違する。ヒト TGF−β１、ヒト TGF−β２（de Martin, R. ら（1987) EMBO J. 6, 3673-3677；Marquardt, H. ら（1987)J. Biol. Chem. 262, 12127-12131)及びヒト TGF−β３（Ten Dijke, P. ら（1988) PNAS 85, 4715-4719) のアミノ酸配列の対比はこれら３種のタンパク質がその成熟形態において約70〜80％の配列同一性を示すことが実証されている。ヘテロ二量体型 TGF−β１，２がブタの血小板から単離されており、そして TGF−β２の１個のサブユニットにジスルフィド連結した TGF−β１の１個のサブユニットより成る(Cheifetz, S. ら (1987) Cell 48, 409-415) 。
【０００５】
最近、様々な治療方式において試験できるよう十分な量で得るために TGF−βを、天然起源（例えば血小板）からこれらの因子を単離するのではなく、組換技術を介して製造すること狙いとする試みがなされている。しかしながら、生物学的に活性な組換 TGF−βを得ることが非常に難しいことが実証された。配列表においてSEQ ID No.１〜６で示す表配列からわかる通り、 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の成熟形態を含む 112個のアミノ酸は９個のシステイン残基を含む。 TGF−β２に関して示されている通り、この９個のシステイン残基は４本の分子内及び１本の分子内ジスルフィド結合を形成している［Schlunegger, M. P. and Gruetter, M. G., Nature 358：430-434 (1992)］。 TGF−βの異種発現は、適正な一次構造は有するものの、適正な二次又は三次構造となるように適正にフォルディングせず、従って生物活性を欠いた生成物を招きうる。
【０００６】
天然 TGF−β分子の複雑さを考慮すると、関連の TGF−β遺伝子をより高等な生物より誘導された細胞の中で発現せしめることが好都合と一般に考えられる。組換 TGF−β２の発現は真核系において達成されうるが、得られる生物学的に活性な適正にフォルディングされた物質の収量は満足たるものからかけ離れている。
【０００７】
従って、微生物宿主において生物活性 TGF−βを製造する試みがなされている。しかしながら、例えば細菌においては、その細胞内条件は適正なフォルディング、ジスルフィド結合形成及びジスルフィド安定化二量体であって活性にとって明らかに本質的な事象を誘導するようなものではない。即ち、ヨーロッパ特許出願EP-A-0,268,561に記載の如き、ラムダプロモーターのコントロール下でのＥ．コリ(E. coli）における関連遺伝子の発現ではごくわずかな生物活性 TGF−βしか得られない。別の報告には、trp プロモーターのコントロール下でのＥ．コリにおける TGF−β cDNA の発現が記述され、SDS ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにおいて13,000Daの見かけ上の分子量を有する放射能ラベルされたタンパク質バンドが生み出されているが、しかし活性は全く測定されなかった(Urushizaki, Y. ら（1987）Tnmor Res. 22, 41-55) 。
【０００８】
組換タンパク質が細菌（例えばＥ．コリ）発現系において高レベルで産生されるとき、それらは往々にして封入体又はリフラクチル体（Ｒ体）と呼ばれる高度に不溶性の細胞内沈殿物の形態で認められ、これらは位相差顕微鏡のもとで細胞の囲い内で見える輝点として認識されうる。可溶性細菌タンパク質から容易に分離できうるこれらの封入体は、その天然の対応物の機能活性を発揮せず、それ故商品としての価値のないほとんど変性及び還元された形態の組換タンパク質を含む。従って、組換リフラクチル−タンパク質は、それをその変性形態に保つのに適当な条件下で可溶化し、次いで変性したほどけ形態から適正な機能的に活性な三次元構造へと転移させるためにフォルディングさせるべきであることが一般的に同意され、そのコンホメーションは比較的弱い原子価力、例えば水素結合、疎水性相互作用及び帯電相互作用により安定化されるものである。システイン含有タンパク質の場合、このプロセスはジスルフィド結合の形成も包括しうる。ジスルフィド結合の形成を化学的に促進せしめる場合、不適正な分子内結合の形成を、そして二量又は多量体型タンパク質の場合、分子間結合が阻止又は最小限化されるべきであり、その理由は所望されない不適正にフォルディングされた異性体は不均一な物質をもたらし得、それ故所望の構造を有するタンパク質の更なる精製を複雑にするか、又は低い活性を有するタンパク質をもたらしうるからである。
【０００９】
タンパク質のフォルディングは通常強力な変性条件下でのタンパク質の可溶化、その後のタンパク質のフォルディングを可能にするためのカオトロピズム濃度の低下を含んで成る多段式プロセスにおいて実施される。しかしながら、かかる手法は TGF−βのフォルディングにおいて失敗している。ヨーロッパ特許出願EP-A-0,433,225において、生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質の製造について成功を収めた方法が記載され、それにおいては界面活性剤がフォルディングバッファーの中に入ったまま TGF−β様タンパク質のフォルディングを可能にする温和な界面活性剤を使用している。
【００１０】
従来技術（Tam ら、J. Am. Chem. Soc. 113 ：6657-6662, 1991)よりわかる通り、ペプチドの中でのジスルフィド結合の選択的且つ効率的な形成を促進するためにジスルフィドスルホキシド（DMSO）が使用できうる。この方法は選択的であり、即ち副反応がなく、そして広いpH域が適用されうる。しかしながら、適正なジスルフィド結合の形成は約30個のアミノ酸までのペプチドにしか、示されていない。別の公開物（Bentleら、米国特許第4,731,440 号）において、ジメチルスルホン又はジメチルスルホンと尿との混合物が封入体からのソマトトロピンの可溶化のために使用されている。この可溶化タンパク質はこのタンパク質のジメチルスルホン含有溶液を温和な酸化剤と接触させることにより再生されうる。
【００１１】
驚くべきことに、 TGF−β様タンパク質のフォルディングのために温和な界面活性剤を利用する方法は、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルスルホン(DMSO2）又はジメチルホルムアミド(DMF）を添加することにより改良できうることがこの度発見された。
発明の目的
本発明の目的は生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質をその変性又はそうでなければ非天然形態から作り出すための改良方法を提供することにある。目的は、そのタンパク質の単量体を、（ａ）温和な界面活性剤、並びに（ｂ）DMSO, DMF もしくはDMSO2 、又はDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２もしくは３種の混合物を含んで成るフォルディングバッファーで処理したとき、大量の所望の二量体型生成物が予測し得なかった収量において生成されるという予測し得なかった発見により達成される。
発明の詳細な説明
本発明はβ型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質の二量体型生物活性タンパク質の製造のための改良方法に関し、この方法は TGF−β様タンパク質を（ａ） TGF−β超科のタンパク質のフォルディングを可能にする温和な界面活性剤と（ｂ）DMSO, DMF 及びDMSO2 並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る。
【００１２】
本発明に関する「 TGF−β−様タンパク質」は以下の TGF−β超科の構成員（これは「 TGF−β様タンパク質」なる語にも属する）の単量体のアミノ酸配列の少なくとも一つに対して75％以上の相同性を有する配列をその単量体において有するタンパク質を意味する：
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３； BSC−１サル腎細胞のコンディンショニング培地から単離された増殖インヒビター（即ち、ポリエルギン；Holley, R. W. ら（1980) PNAS 77, 5989-5992；Ristow, H. J. (1986) PNAS 83, 5531-5533)；ニワトリの胚芽軟質細胞由来の TGF−β４（Jackowlew, S. B.ら (1988) Molecular Endocrinology 2, 1186-1195) ；アフリカツメガエル由来の TGF−β５（Kondaiah, P.ら（1990) J. Biol. Chem. 265, 1089-1093)； TGF−β−関連インヒビン及びアクチビン（卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌を調節する性腺タンパク質）；Mullerian 阻害物質(MIS；これは雄の哺乳動物胎児におけるミュラー管の発育を阻害する）；骨形態発生タンパク質(BMP、軟骨及び骨の形成の誘導に関与するポリペプチド群；今日知られるこの群の構成員は BMP−２， BMP−３， BMP−４， BMP−５， BMP−６， BMP−７， BMP−８及び BMP−９である）；ショウジョウバエのデカペンタプレジック(decapentaplegic）遺伝子複合体由来の転写体(dpp、これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う）；Vg−１（アフリカツメガエル転写体の産物であり、卵母細胞の植物極に存在する）；並びに Vgr−１、即ちVg−１関連哺乳動物遺伝子（Mason, A. ら (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 957-964 ；Cate, R.ら (1986) Cell 45, 685-698；Wozney, J. M. ら (1988) Science 242, 1528-1534；Padgett, R. ら（1986) Nature 325, 81-84 ；Weeks, D. L. and Melton, D. A. (1987) Cell 51, 861-868；Lyons, K. ら（1989) PNAS 86, 4554-4558) 。
【００１３】
「 TGF−β−様タンパク質」の意味の中に含まれるのは種々の TGF−β様タンパク質のサブユニット、又はこの親分子の生物活性の一部又は全部を保持している上記のタンパク質のフラグメント又は突然変異体を含むヘテロ二量体である。
【００１４】
好適な意味において、本明細書における「 TGF−β−様タンパク質」なる語は TGF−β超科の任意のタンパク質を意味する。より好適な意味において、これは以下の TGF−β超科のタンパク質より成る群から選ばれるタンパク質を意味する：哺乳動物起源、例えばサル、ネズミ、ブタ、ウマ又はウシの TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３並びに 112個づつのアミノ酸の２種類のサブユニットより成るヘテロ二量体型 TGF−β、並びに TGF−βのフラグメント及び突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子； BSC−１サル腎細胞のコンディショニング培地から単離された増殖インヒビター（即ち、ポリエルギン）；ニワトリ胚芽軟質細胞由来の TGF−β４；アフリカツメガエル由来の TGF−β５； TGF−β関連インヒビン及びアクチビン（卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌を調節する性腺タンパク質）；Mullerian 阻害物質(MIS；これは雄の哺乳動物胎児のミュラー管の発育を阻害する）；骨形態発生タンパク質(BMP；軟骨及び骨の形成の誘導に関与するポリペプチドの群；今日知られるこの群の構成員は BMP−２， BMP−３， BMP−４， BMP−５， BMP−６， BMP−７， BMP−８及び BMP−９）；ショウジョウバエのデカペンタプレジック遺伝子複合体の転写体(dpp；これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う）；Vg−１（アフリカツメガエル転写体の産物；これは卵母細胞の植物極に存在する）；並びに Vgr−１、即ち、Vg−１関連哺乳動物遺伝子。「 TGF−β様タンパク質」の意味の中に更に含まれるのは種々の TGF−β様タンパク質のサブユニットを含むヘテロ二量体、又はその親分子の生物活性の一部又は全てを保持する上記のタンパク質のフラグメント又は突然変異体である。
【００１５】
より好ましい TGF−β様タンパク質は、 TGF−β１， TGF−β２， TGF−β３、ヘテロ二量体型 TGF−β、 TGF−βのフラグメント又は突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、BMP 、インヒビン及びアクチビンから選ばれる。より好ましいのは、 BMP−２， TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３、並びにそのヘテロ二量体並びにフラグメント及び突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、好ましくは以降に定義するハイブリド TGF−β１−３、ハイブリド TGF−β２−３もしくは TGF−β３−２又は TGF−β１−２であって、Ｎ−からＣ−末端の順序で、ヒト TGF−β１のＮ末端側の44個のアミノ酸及び TGF−β２のＣ末端側の68個のアミノ酸より成るものである。更により好ましいのは配列表の中でSEQ ID No.１，３，５，７，９又は11に示すアミノ酸配列を有するものである。最も好適な TGF−β様タンパク質は TGF−β３である。
【００１６】
BMP−２なる語は、同一の生物活性を有する BMP−２の変異体も含む。かかる変異体は例えば実施例において製造したもの、即ち、追加のＮ末端メチオニンを有するSEQ ID No.13の BMP−２及びＮ末端アミノ酸Gln を欠くSEQ ID No.13の BMP−２である。
【００１７】
本発明の目的のための TGF−βの生物活性は、
−線維芽細胞に対する TGF−βの細胞移動促進活性（Postlethwaithe, A. E. ら（1987) J. Exp. Med. 165, 251 ；Burk, R. (1973)PNAS 70, 369に従って改良）；
−ヒトＡ375 黒色腫細胞の増殖に対する TGF−βの阻害作用（Brown, T. J.ら（1987) J. Immunol. 139, 2977)；
−CCL-64細胞DNA 合成阻害アッセイ (Graycar, J. L.ら（1989) Molecular Endocrinology 3 ：1977-1986)又は
−以降の実施例に記載の連続ミンクの肺上皮細胞系Mv−１−Lu（ATCC／CCL64)の増殖の阻害；
のいづれかとして規定する。
【００１８】
任意の起源又は方法に由来する単量体型 TGF−β様タンパク質は本法に従って対応の二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質へとフォルディングされうる。例えば、 TGF−β様タンパク質の単量体は天然起源に由来するか、又は当業界公知の方法により組換DNA 技術を介してもしくは合成的に製造されうる。単量体が夾雑物に原因してin vitroフォルディングに適さない場合、可溶化及び変性化単量体をクロマトグラフィーにより、例えばSephacryl S-100 HRの如きでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製できうる。
【００１９】
フォルディングされる前に、この単量体型 TGF−β−様タンパク質は変性（即ち、ほどけ）可溶化形態において存在していなくてはならない。タンパク質を効率的に変性及び溶解できるのは当業界に公知のいわゆるカオトロピック剤であり、これは水性溶液で、且つ適当な濃度で、対応のタンパク質の立体形状をその表面の改変を通じて、即ち水和状態、溶媒環境又は溶媒−界面相互作用の変化を通じて変化させるものである。かかるカオトロピック剤又は変性剤の例には尿素、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム（約４〜約９Ｍの濃度域）、及び界面活性剤、例えばSDS(これは0.01〜２％程度の濃度で添加）が含まれる。また、 TGF−β様タンパク質を含む水性溶液の約２〜約４のpHに至る、例えば低分子量脂肪族有機酸、好ましくは２，３又は４個のＣ原子を有するかかる酸、より好ましくは酢酸による酸性化、並びに例えばpH10以上の塩基性条件、更には高温が、単量体の変性及び可溶化をもたらすであろう。
【００２０】
次いでこの単量体を、生物活性二量体の回復を可能にする「フォルディング条件」にかける。「フォルディング条件」とは、その条件下で分子内及び分子間ジスルフィド結合の形成が促進され、そしてその変性単量体が生物活性に係るコンホメーションを帯びるようにする条件をいう。このプロセスはこの単量体の一次構造（即ち、アミノ酸配列）の任意の変化には関与しないが、生物活性に結びつく二量体型生成物の三次元コンホメーションの形成には関連する。このプロセスはジスルフィド結合の形成、及び二量体型生物活性構造への単量体の会合を含む。
【００２１】
この目的のため、変性単量体を（ａ）以降に定義する温和な界面活性剤と、（ｂ）DMSO, DMF, DMSO2、並びにDMSO, DMSO2 及びDMFより成る群のうちの２又は３種の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで、中性又はアルカリ性のpH及び妥当な温度、例えば約０℃〜約40℃において処理する。好適なpHは約７〜約10、DMSOの場合は約pH９〜9.5 がより好ましく、DMF の場合は約pH8.5 が好ましく、そしてDMSO2 の場合は約pH9.5 が好ましい。
【００２２】
本発明に従うフォルディングのために利用されうる慣用のバッファー系はpH６〜10において十分な緩衝能を供するバッファーである。タンパク質のフォルディングに対して阻害作用を有さない全てのバッファーが本発明において適用可能である。例えば、適当なバッファーはトリス−、ビス−トリス、又はピペラジンバッファーである。これらのバッファーは更に、所望するなら塩、及び所望するなら塩基性アミノ酸を含みうる。
【００２３】
フォルディングバッファーにおいて利用できうる塩は、例えば３Ｍに至る濃度のNa+ ，Li+ ，Ｋ+ ，NH4 + ，Mg+ ，Ca2+もしくはMn2+と、Cl- ，Ｆ- ，Br- ，Ｊ- ，HCO3- ，SO42- 、リン酸、酢酸、シアン酸もしくはロダン酸との塩、又はその他のアルカリ金属−もしくはアルカリ土類金属−ハロゲンもしくは偽ハロゲン化合物である。１〜２Ｍの濃度のNaClが好ましい。
【００２４】
フォルディングバッファーの中に使用できる塩基性アミノ酸は例えば好ましくは 0.5Ｍの濃度のアルギニンである。
【００２５】
本発明の目的のためのDMSO, DMSO2 又はDMF の好適な濃度は約５％〜約40％、より好ましくは約10％〜約30％である。DMSOの更に好ましい濃度は約10％〜約30％、より好ましくは約20％である。DMFに関しては、更により好ましい濃度は約10％〜約30％、より好ましくは約10％である。DMSO2 に関しては、更により好ましい濃度は約10％である。DMSOとDMF との混合物、DMSOとDMSO2 との混合物、又はDMF とDMSO2 との混合物は、合わせた溶媒に関し、約５％〜約40％、好ましくは約10％〜約30％、より好ましくは約10％〜約20％の濃度において使用されうる。
【００２６】
本発明に係る TGF−β超科のタンパク質のフォルディングに適する温和な界面活性剤は単量体型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって、二量化後に生物活性に結びつくコンホメーションにフォルディングさせ、しかもこの単量体を可溶形態に保つ任意の界面活性剤である。
【００２７】
かかる界面活性剤は非イオン性、カチオン性、アニオン性又は双イオン性であってよい。好適な界面活性剤は非イオン界面活性剤ジジトニン、そしてより好ましくは双イオン性界面活性剤３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート(CHAPS）及び３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（CHAPSO）である。界面活性剤の混合物、例えばCHAPS とCHAPSOとの混合物を使用することも可能である。温和な界面活性剤はフォルディングバッファーの中に約１〜100mM の濃度、より好ましくは30〜60mMの濃度、更により好ましくは30mMの濃度で主として存在する。
【００２８】
本発明の好適な態様において、このフォルディングバッファーは更に還元物質を含む。タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合性を高める適当な還元物質は例えば還元型のグルタチオン、還元型のジチオスレイトール、還元型のβ−メルカプトエタノール、還元型のメルカプトメタノール、システイン及びシステアミンより成る群から選ばれる低分子量スルフヒドリル試薬である。適当な濃度は例えば約１〜100mM 、好ましくは約１〜約10mM、より好ましくは約2.5mM である。
【００２９】
フォルディングは妥当な温度、例えば約０〜約40℃、好ましくは約４℃で、妥当な時間、例えば約２〜約 720ｈかけて行う。フォルディングの時間は利用する温度に依存するため、温度を任意の所望のフォルディング時間のために最適化し得、そしてその逆も真なりである。
【００３０】
本発明に係る二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質の製造は一段手順で実施し得、それにおいては前記タンパク質の単量体をフォルディングバッファーに移し、そしてその反応混合物を例えば２時間から７日以上の期間、例えば０℃〜40℃の温度、好ましくは４℃において、フォルディング及び二量化を連続的に行いながらインキュベートする。フォルディング反応の際のタンパク質濃度はかなり重要であり、その理由は、高すぎてしまうと、単量体は著しく凝集してしまい、所望されないほど高次元のオリゴマーの形成が起きてしまうからである。タンパク質濃度が約２mg／ml未満であると、二量体型生成物の最終収率は高まり、0.01〜 0.5mg／mlの濃度域が好ましい。
【００３１】
TGF−β３のフォルディングに関する本発明に従うフォルディング実験の好適な例は以下の通りである：
0.1mg ／mlの TGF−β３；
100mM のトリス；
任意的に還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプトエタノールより成る群から選ばれる１〜50mMの物質（しかしながら、上述の通り、本法はシスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である）；
１ＭのNaCl；
0.5Ｍのアルギニン；
20〜30％のDMSO；
30mMのCHAPS 又はCHAPSO；
pH９〜9.5 ；
又は
0.1mg ／mlの TGF−β３；
100mM のトリス；
還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプトエタノールより成る群から選ばれる2.5mM の物質（しかしながら、上述の通り、本法はシスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である）；
１ＭのNaCl；
0.5Ｍのアルギニン；
10％のDMF ；
30mMのCHAPS 又はCHAPSO；
pH8.5 。
【００３２】
フォルディング後、生物活性二量体を精製し、不完全にフォルディングした TGF−β様タンパク質、並びに不純物、特にこのポリペプチドを微生物宿主細胞において製造するときに調製品の中に存在しうるパイロジェン又はその他の内毒素を除去する。二量体の分離はクロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー（例えばMono Sカラム上）、及び逆相HPLCにより行う。
【００３３】
本発明は更に、本発明の方法に従って製造した二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質に関する。これらの TGF−β様タンパク質は様々な治療方式に利用できる。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は本発明の例示であり、限定するものではない。
実施例１：Ｅ．コリの中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
実施例１Ａ：一般方法
細菌株：
−Ｅ．コリＫ12／LC 137：htpRam , lonR9 , lacam , malam , trpam , phoam, rspL, tsx::Tn10 , supCts (Goff, S. A. ら（1984)PNAS 81, 6647-6651) 。
プラスミド：
−pPLMu (Buell, G.ら（1985) Nucleic Acids Res. 13, 1923-1938) ：このプラスミドはファージMu ner遺伝子リボソーム結合部位をもつバクテリオファージλＰL プロモーターを担持する（Van Leerdam, E. ら（1982) Virology 123, 19-28)。
−pcl857：熱不安定性λCL857 レプレッサーをコードし、且つカナマイシンに対する耐性を授けるプラスミド（Remault, E. ら（1983) Gene 22, 103-113) 。
SDS−ゲル電気泳動：
SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE）及びタンパク質染色はBIORAD由来のMiniprotean IIセル及び厚さ１mmの18％のポリアクリルアミドゲルを利用して既に説明されている通り（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)に実施する。
熱誘導：
40μｇづつのアンピシリン及びカナマイシン (LB／amp ／kan)を含む20mlの培養チューブ中の７mlのLB−培地（Maniatisら (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）に単一のコロニーを接種し、そして振盪しながら一夜30℃でインキュベートする。この一夜培養物５mlを100ml のエーレンマイヤーフラスコ中の15mlのLB／amp ／kan に加える。このフラスコを42℃の浴槽シェーカーに移す。移す前に２mlのサンプルを取り（非誘導条件）、そして移してから１時間間隔で１mlづつのサンプルを取る（誘導条件）。細胞を遠心分離（５min ；10,000rpm ；エンペンドルフ遠心機で）によりペレット化し、そして上清液を捨てる。このペレットをSDS-PAGE用の100 μｌのサンプルバッファーに再懸濁し、そして95℃で10min 加熱する。５μｌのアリコートをSDS-PAGEに載せる。
コンピテント細胞の調製：
コンピテントＥ．コリ細胞はManiatisら (1982) , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkに記載の塩化カルシウム手順により調製する。プラスミドpcl857を担持する細胞を30℃で増殖させる。
実施例１Ｂ：発現ベクターpPLMu.hTGF−β１，pPLMu.hTGF−β２及びpPLMu.hTGF−β３の構築並びに TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３それぞれのコード配列（配列表に示す）を NcoＩで消化しておいたプラスミドPGem-5ZF（＋)(Promega)の中にクローニングし、仔牛小腸アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer）で脱リン酸化し、そしてクレノウポリメラーゼ（Gibco-BRL)で補完（フィル・イン）する。得られる構築体をpGKM 125(TGF−β１），pGKM 740(TGF−β２）及びpGKM 126(TGF−β３）と命名し、そしてコンピテントＥ．コリＹ1090細胞を形質転換するのに用いる。 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３をコードする適正なインサートを担持するクローンをそれぞれＥ．コリＹ1090／pGKM 125(TGF−β１），Ｅ．コリＹ1090／pGKM 740(TGF−β２）及びＥ．コリＹ1090／pGKM 126(TGF−β３）と命名する。
【００３５】
Ｅ．コリＹ1090／pGKM 125，Ｅ．コリＹ1090／pGKM 740及びＥ．コリＹ1090／pGKM 126細胞をLB培地の中で増殖させ、そしてプラスミドDNA をBirnboim, H. C. 及びDoly, H. (1979) Nucleic AcidsResearch 7, 1513の方法により調製する。５μｇのプラスミドDNAを50μｌ制限バッファーの中で、 NcoＩと SalＩ(pGKM 125), NcoＩとEcoRＶ(pGKM 740)又は NcoＩ単独(pGKM 126)のいづれかで、供給者（Boehringer）の推奨に従って完全に切断する。DNA を５μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム、100mM のMgCl2 , ５mMのEDTA及び 150μｌのエタノールの添加により沈殿させる。−70℃で15分インキュベートした後、DNA をSorvall 遠心機の中のSS34ローターにおいて13,000ｇで15分の遠心によりペレットにする。上清液を捨て、そしてペレットを0.25％のブロモフェノールブルー及び0.25％のキシレンシアノールを含む80μｌの 0.089Ｍのトリス：ポレート、 0.089Ｍの硼酸及び 0.002ＭのEDTA(TBEバッファー）の中に再懸濁する。20μｌのサンプルを４回、 0.5μｇ／mlのエチジウムブロミドを含むTBE バッファーの中で１％のアガロースゲルを通じて50ボルトにおいて、ブロモフェノールブルーマーカーが長さ10cm厚さ0.8cm のゲルの底に達するまで電気泳動させる。成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３それぞれをコードするDNA フラグメントを短波UV光で可視化し、レーザー刃で切り出し、そしてSchleicher & Schull Biotrap 装置の中で200mamp を1.5 時間適当にゲル断片から電気溶出させる。溶出したDNA フラグメントを沈殿させ（前記参照）、そして20μｌのTEに再懸濁する。
【００３６】
５μｌのプラスミドpPLMu を NcoＩと SalＩ， NcoＩとEcoRＶ、又は NcoＩ単独のいづれかでの消化により線状化し、そしてフラグメントDNA について前述した通りにゲル精製する。100ng の線状化且つ精製したpPLMu ベクターDNA 及び３倍モル当量の対応の精製フラグメントDNA を４℃で15時間、１単位のDNA リガーゼ（Boehringer）を含む20μｌのライゲーションバッファー（70mMのトリス／HCl, pH7.5, 10mMのMgCl2 , ５mMのDTT ，0.1mM のアデノシン−シリン酸）の中でインキュベートする。
【００３７】
10μｌのライゲーション混合物をプラスミドpcl857を担持する 200μｌの低温（４℃）コンピテントＥ．コリLC 137細胞に加える。30分後、細胞を42℃の湯浴の中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックにかける。２mlのLB培地を加え、そしてこの培養物を30℃で60分振盪する。 200μｌのアリコートをアンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上でプレート培養する。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析する。pPLMu 中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３をコードするDNA フラグメントのサブクローニングはプラスミドpPLMu.hTGF−β１，pPLMu.hTGF−β２及びpPLMu.hTGF−β３のそれぞれをもたらす。上記の構築体を含むクローンをそれぞれ、Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３と称する。
【００３８】
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３細胞を熱誘導し（実施例１Ａ参照）、そして発現したタンパク質をSDS-PAGEにより分析する。
【００３９】
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３は全て熱誘導して２時間後に約12,000Daの見かけ上の分子量で泳動する熱誘導タンパク質として認定される。
実施例１Ｃ：形質転換体の発酵
40mg／ｌのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中のＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３の一夜培養物を30℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の上記の抗生物質を含むLB培地750ml に加え、そして65℃の湯浴の中で約3.5 分振盪することにより42℃に加熱する。次いでフラスコを42℃のシェーカーに移し、そして３時間インキュベートする。これらのフラスコを氷冷水槽の中で12℃にまで冷やし、そしてGSA ローター(Sorvall）の中で8,000rpmでの10分遠心分離の後に集める。
実施例２：サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)の中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３のコード配列を酵母酸性ホスファターゼの誘導性プロモーター（PH05）のコントロール下でサッカロマイセス・セレビジエの中で発現させる。
【００４０】
発現ベクターは２段階で構築する：
Ａ．プラスミドpJDB 207／PH05−RIT 12の構築、
Ｂ．プラスミド pJDB 207R／PH05− TGF−β１， pJDB 207R／PH05− TGF−β２及び pJDB 207R／PH05− TGF−β３の構築。
【００４１】
ここでＡ）は酵母ベクター及びPH05転写ターミネーターを供し、そしてＢ）はPH05プロモーターのコントロール下にある成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３のそれぞれをコードするインサートをもつ発現カセットを供する。
実施例２Ａ：プラスミドpJDB 207／PH05−RIT 12の構築
プラスミドp31 RIT 12 (ヨーロッパ特許出願EP277,313)を制限エンドヌクレアーゼ SalＩにより線状化する。エチジウムブロミドの存在下での部分HindIII 消化は、276bp の SalＩ／BamHＩ pBR 322配列、534bp の酵母酸性ホスファターゼPH05プロモーター、酵母インベルターゼシグナル配列（19個のアミノ酸をコード）及びPH05転写ターミネーターを含んで成る１kbの SalＩ／HindIII フラグメントをもたらす。
【００４２】
この１kbのp31 RIT 12の SalＩ／HindIII フラグメントを、 SalＩ及びHindIII で切っておいた酵母−Ｅ．コリシャトルベクターpJD 207 (Beggs, J. D. ：Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, pp.383-389)にクローニングする。この１kbのインサートを含む得られるプラスミドをpJDB 207／PH05−RIT 12と命名する。
実施例２Ｂ：プラスミドpJDB 207R ／PH05− TGF−β３の構築
プラスミドpGKM 740(TGF−β３)(実施例１．Ｇ参照）を NcoＩで切る。その接着末端をクレノウDNA ポリメラーゼによる反応で補完する。EcoRＩリンカー（５′−CCGGAATTCCGG；Biolabs)を加え、そしてその混合物をライゲーションする。得られる環状プラスミドをpGKMA 668 (TGF−β３) と称し、そしてEcoRＩ及び SalＩにより切断する。0.4kb のEcoRＩ／ SalＩフラグメントをアガロースゲルから単離し、精製し、そして滅菌水の中に25μｇ／mlの濃度で再懸濁する。このフラグメントは TGF−β３の成熟コード配列を含み、成熟 TGF−β３のアミノ酸 AlaＩを規定するコドンGCT に対して枠内に(in frame to）ATG を有する。
【００４３】
PH05プロモーターを534bp のBamHＩ／EcoRＩフラグメント上のプラスミドp31 RIT 12（上記参照）から単離する。プラスミドpJD 207 ／PH05−RIT 12をBamHＩ及び XhoＩで切断する。大型の6.8kb のBamHＩ／ XhoＩフラグメントを単離する。PH05転写ターミネーターはフラグメント上に残ったままである。BamHＩ／EcoRＩPH05プロモーターフラグメント、 TGF−β３をコードするEcoRＩ／ SalＩフラグメント、及びBamHＩ／ XhoＩベクターフラグメントをライゲーションする。PH05プロモーターのコントロール下にある TGF−β３遺伝子がpJDB 207の中に反時計方向でクローニングされている一の適正なクローンを pJDB 207R／PH05− TGF−β３と命名する。
【００４４】
似たようにして、成熟 TGF−β１及び TGF−β２をＳ．セレビジエの中で発現させる。 TGF−β１及び TGF−β３のコード配列を含むプラスミドはそれぞれpGKM 125及びpGKM 126である（実施例１．Ｇ参照）。これらのプラスミドを NcoＩで消化し、EcoRＩリンカーを付加し、そしてライゲーションした後、得られる環状プラスミドをEcoRＩ及び SalＩで切断する。EcoRＩ／ SalＩフラグメントを上記の通りにしてpJDB 207R の中にクローニングする。得られるプラスミドを pJDB 207R／PH05− TGF−β１及び pJDB 207R／PH05− TGF−β３と呼ぶ。
実施例２Ｃ：Ｓ．セレビジエ株GRF 18の形質転換
サッカロマイセス・セレビジエ株GRF 18(MATα, his ３−11，his ３−15，leu ２−３，leu −112 ，can R , DSM 3665) を次のプラスミドにより
pJDB 207R／PH05−TGF−β１
pJDB 207R／PH05−TGF−β２
pJDB 207R／PH05−TGF−β３
Hinnen, A.ら（1978) PNAS 75, 1929 に記載の形質転換プロトコールを利用して形質転換させる。
【００４５】
形質転換した酵母細胞をロイシンを欠く酵母最小培地プレート上で選別する。個々の形質転換コロニーを単離し、そして以下の通りに呼ぶ：
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β１
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β２及び
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β３。
実施例２Ｄ：Ｓ．セレビジエ形質転換体の発酵及び細胞抽出物の調製
上記の酵母形質転換体はPH05プロモーターコントロール式発現カセットを含み、それ故 TGF−β１， TGF−β２又は TGF−β３の発現のためのプロモーターの抑制を必要とする。形質転換体をそれぞれ、アミノ酸は含まないが (NH4)2SO4の代わりに10ｇ／ｌのＬ−アスパラギン、１ｇ／ｌのＬ−ヒスチジン及び20ｇ／ｌのグルコースを含むDifco 酵母窒素ベースの処方に従って調製した酵母高Pi最小培地の中で２段予備培養（10ml及び50ml）で増殖させる。第２予備培養物の細胞を 0.9％のNaClで洗い、そして全ての細胞を、アミノ酸は含まないが0.03ｇ／ｌのKH2PO4，10ｇ／ｌのＬ−アスパラギン、１ｇ／ｌのヒスチジン及び20ｇ／ｌのグルコースを含むDifco 酵母窒素基礎培地の処方に従って調製した100ml の低Pi最小培地に接種するために用いる。この培養物を30℃にて180rpmで撹拌する。
【００４６】
10mlの培養物由来の細胞を５ｈ，24ｈ及び48ｈ目において3000rpm での遠心により集め、そして 0.9％のNaClの中で１回洗う。細胞ペレットを溶解バッファー［66mMのリン酸カリウムpH7.4 ，４mMのZwittergent (Calbiochem)］の中に再懸濁する。８ｇのガラスビーズ（直径 0.5〜0.75mm）を加え、そしてこの懸濁物をVortex Mix上で２分づつ４〜５回低温で強く振盪させる。その細胞抽出物をデカンテーションしてガラスビーズから除去する。抽出物中の細胞破片を3000rpm で４℃にて５分間の遠心により沈降させる。上清液及びペレットを分け、そして−20℃で保存する。
実施例３
実施例３Ａ：Ｅ．コリからの不溶性単量体型 TGF−β３の回収
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３を実施例１Ｃに記載の通りにして発酵させる。細胞破壊及び不溶性 TGF−β３の回収を４℃で実施する。約18ｇのウェット細胞を60mlの 0.1Ｍのトリス／HCl ，10mMのEDTA，１mMのPMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、pH8.3(破壊バッファー）に懸濁する。細胞をフレンチプレス（SLMInstruments, Inc.)にその製造者の仕様書に従って２回通し、そしてその容量を破壊バッファーで200ml にする。その懸濁物を15,000ｇで20分遠心する。得られるペレットを１ＭのNaClを含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の通りに10分遠心する。そのペレットを１％のトリトンＸ−100(Pierce）を含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして再び上記の通りに10分遠心する。洗浄したペレットを次に50mlの20mMのトリス／HCl ，１mMのEDTA，１mMのPMSF、１％のDTT に懸濁し、そしてテフロン（登録商標）製組織グラインダーでホモジナイズする。得られる懸濁物は不溶性形態の粗単量体型 TGF−β３を含む。
実施例３Ｂ：単量体型 TGF−β３の可溶化及び精製
実施例３Ａに従って得られる TGF−β３懸濁物10mlを10％の酢酸でpH2.5 にまで酸性化し、そしてエッペルドルフ遠心機で室温で10分遠心する。その上清液をSephacryl Ｓ−100 カラム（Pharmacia, 2.6×78cm）で、10％の酢酸中で 1.4ml／min の流速においてクロマトグラフィーにかける。（他方、このクロマトグラフィーはSephacryl Ｓ−100 HR (Pharmacia)で行ってよく、そしてカラムは１％の酢酸又は５mMのHCl で流す）。190min〜220minで溶出する単量体型変性 TGF−β３をプールする。この材料を生物活性二量体型 TGF−β３を得るためのフォルディングのために（実施例４）、又は更なる精製及び構造分析のために（実施例３Ｄ）使用する。
実施例３Ｃ：サッカロマイセス・セレビジエからの単量体型 TGF−β３の回収
上記の通りにして実施した500ml 発酵から得られる破壊細胞のペレットを20mlの４Ｍの尿素、 0.1Ｍのトリス、１％のDTT ，pH8.0に懸濁する。この混合物を室温に30分保ち、５分毎に断続的にボルテキシングにかける。不溶性材料を30,000ｇ、30分、40℃の遠心分離により除去し、そしてその上清液を酢酸でpH2.5 に調整し、そして５％の酢酸に対して４℃で一夜かけて徹底的に透析する。その溶液を上記の通りに遠心し、そして清浄な上清液をYM10膜 (Amicon）上での限外濾過により４mlの最終容量となるまで濃縮する。次いでこのサンプルをSephacryl Ｓ−100 HR(Pharmacia）で５％の酢酸において、実施例３Ｂに記載の通りにしてクロマトグラフィーにかけ、単量体型 TGF−β３が得られる。
実施例３Ｄ：RP−HPLCによる単量体型 TGF−β３の更なる精製
Sephacryl Ｓ−100 カラムからのプール画分のアリコート（実施例３Ｂ）をVydac 214 TP 5415 HPLC逆相カラム(4.6×150mm, The Separation Group, Hesperia, CA, USA）で精製する。このカラムを 0.1％のTFA の水溶液70％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液30％との混合物で平衡にし、そしてその生成物を 0.1％のTFA の水溶液55％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液45％との混合物で終了する１ml／min の流速で30分にわたる線状勾配により溶出させる。溶出は216nm での吸収でモニターし、そして個々のピークをUV吸収に従って手動で集める。変性した単量体型 TGF−β３は21.5min で溶出する。分離のために利用する個々の逆相カラムに依存して、同一の TGF−β３の調製品がそれぞれ16min 及び18min 前後で溶出する。
【００４７】
TGF−β３画分を上記と同じカラム及び溶媒系を利用するRP−HPLCにより分析する。 TGF−β３を 0.1％のTFA の水溶液 100％で開始し、このTFA の水溶液30％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液70％との混合物で終了する42min にわたる線状勾配により溶出させる。 TGF−β３は30.4min 後に単一ピークとして溶出する。使用する個々のカラムに依存して、29min 及び29.9min の滞留時間が得られる。
実施例３Ｅ：SDS-PAGEによる単量体型 TGF−β３の分析
Sephacryl Ｓ−100 カラム（実施例３Ｂ）又は逆相カラム（実施例３Ｄ）の個々のアリコートを真空乾燥し、そしてクマジーブルーＲ−250 で染色した15％のポリアクリルアミドスラブゲルでのSDS-PAGEにより分析する。見かけ上分子量約12,000Daの一本のバンドが得られ、これは還元型の天然のブタ TGF−β３と区別でなかった。
実施例３Ｆ：単量体型 TGF−β３のＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例３Ｂ由来の TGF−β３を真空エバポレーションにかけ、25μｌの 0.1Ｍの酢酸に溶かし、そして気相タンパク質シーケンサーモデル 470Ａ（Applied Biosystems）でのアミノ酸配列決定にかける。
【００４８】
Ｎ末端アミノ酸配列は配列表の中のSEQ ID No.に６示すものと同一である。
実施例４： TGF−β３のin vitroフォルディング
上記の通りにして得た TGF−β３を 0.1Ｍのトリス、30mMのCHAPS 、１ＭのNaCl、５mMの還元型グルタチオン及び20％（ｖ／ｖ）のDMSOのそれぞれより成るバッファーの中で４℃にてフォルディングする。バッファーのpHはNaOHでpH9.5 に調整する。 TGF−β３の最終濃度は 0.1mg／mlとする。４℃で７日後、その溶液を濃酢酸でpH3.5 に酸性化し、YM10膜 (Amicon）の付いたAmico 撹拌式セルの中での限外濾過により約10倍濃縮する。その濃縮溶液を 0.1Ｍの酢酸によりもとの容量に希釈し、そして再度濃縮する。この手順を２回繰り返す。次いでこの溶液を実施例５記載の通りにしてイオン交換クロマトグラフィーにかける。
実施例５：カチオン交換クロマトグラフィーによる二量体型生物活性 TGF−β３の単離
約10〜50mgの TGF−β３を含む実施例４において得られる溶液を HiLoad 26／10 S-Sepharose高性能カラム(Pharmacia）に載せる。このカラムをまず20mMの酢酸ナトリウム、30％のイソプロピルアルコール、pH4.0(バッファーＡ）により５分洗い、次いで 0.2ＭのNaClを含むバッファーＡで始まり、そして 0.5ＭのNaClを含むバッファーＡで終わる45分にわたる線状勾配により溶出させる。溶出は280nm でモニターし、そして手動式に分画する。画分を非還元SDS-PAGEにより二量体型 TGF−β３について、及びin vitroバイオアッセイにより生物活性について検定する。
実施例６：二量体型 TGF−β３の更なる精製及び特性決定
実施例６Ａ：HPLCによる精製
二量体型生物活性 TGF−β３を含む画分をプールし、 0.1Ｍの酢酸に対して透析するか又は同容量の 0.1％のTFA 水溶液で希釈し、そしてVydac 214 TP 510カラム（１cm×25cm，The Separations Group, USA）でのRP−HPLCにかける。そのカラムを75％の溶媒Ａ［ 0.1％のTFA 水溶液］及び25％の溶媒Ｂ［0.08％のTFA のアセトニトリル溶液］の混合物により 4.5ml／min の流速で平衡にする。サンプルの添加後、そのカラムを235nm でモニターした吸収が基底値に到達するまで平衡条件下で洗浄する。次いでカラムをこの平衡条件で始まり、そして45％の溶媒Ａと55％の溶媒Ｂの混合物で終わる線状勾配により30分以内で溶出させる。溶出液を手動式に分画し、そして非還元SDS-PAGE及びin vitroバイオアッセイにより分析する。
実施例６Ｂ：SDS-PAGEによる分析
実施例６の精製 TGF−β３のアリコートをそれぞれ真空乾燥し、そしてクマジーブルーＲ−250 で染色する15％のポリアクリルアミドスラブゲルでのSDS-PAGEにより分析する。還元させていないサンプルは約25kDa の見かけ上の分子量の一本のバンドを示し、一方還元サンプルは約12.5kDa においてバンドを示す。
実施例６Ｃ：分子量決定
実施例６Ａ由来の精製 TGF−β３を電子スプレー式イオン化質量分析器 (ESI-MS) により分析する。全質量は理論的に期待される値に非常に近いことがわかる。
実施例６Ｄ：アミノ酸分析
アミノ酸分析はKnecht, R. and Chang, J. -X., Analytical Chemistry 58 ：2375-2379 (1986)に記載の通りに実施する。その結果は理論通りであった。
実施例６Ｅ：Ｎ−末端アミノ酸配列の決定
10〜20μｇの実施例７Ａの TGF−β３を真空エバポレーションし、25μｌの10mMの酢酸に溶かし、そして気相シーケンサーモデル 477Ａ（Applied Biosystems）でのアミノ酸配列決定にかける。最初の10個の残基のアミノ酸配列は理論通りであった。
実施例６Ｆ：Asp-N プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
92mg (6.7mmole）の TGF−β３を還元し、４−ビニルピリジルエチル化し、真空遠心分離で乾かし、そして20mlの５mMのHCl に再溶解する。10mMのZwittergent ３−12界面活性剤（Calbiochem Corporation, La Jolla, CA）を含む200ml の 0.2Ｍのトリス−酢酸バッファーpH7.8 を加え、そしてタンパク質溶液と混合する。切断は２mg（50mlの水に溶解）のエンドプロテイナーゼAsp-N(シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi）突然変異体、Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG 由来）により37℃で実施する。13時間後、50mlの10％（ｖ／ｖ）のTFA を加え、そしてその混合物をVydac 218 TP 5415 カラム(4.6mm×150mm, The Separations Group）での、５〜45％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの 0.1％のTFA溶液／水溶液の 0.1ml／min の流速での40min での線状勾配によるRP−HPLCにより分離させる。単離したペプチドを電子スプレーイオン化質量分析器ESI-MSにより分析する。決定される分子量は予測したAsp-N フラグメントに関する計算値と良好に一致する。
【００４９】
同定されたフラグメントは残基１及び２を除き、完全アミノ酸配列をカバーする。これらのアミノ酸はタンパク質全体のＮ末端配列決定により、及びＶ８フラグメントの分析により同定する。
実施例６Ｇ：Ｖ８プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
実施例９に類似して、Asp-N プロテアーゼにより、４−ビニルピリジル化 TGF−β３をプロテアーゼＶ８により消化し、そしてそのフラグメントをRP−HPLCにより分離し、そしてESI-MSにより分析する。決定される分子量は理論値により一致し、 TGF−β３の同定を実証する。同定されたフラグメントは 112個のアミノ酸残基の全配列をカバーする。
実施例７：フォルディングした TGF−βについてのin vitro活性試験：ミンク肺上皮細胞（Mv−１−Lu）酸性ホスファターゼアッセイ
TGF−β又はハイブリドタンパク質をin vitroで、連続ミンク肺上皮細胞系Mv−１−Lu（ATCC／CCL64)の増殖を阻害する化合物の効能を測定する細胞バイオアッセイでスクリーニングする。Mv−１−Lu細胞系は TGF−βのバイオアッセイにおける高感度なリポーターであると実証されており、シグモイド型の濃度応答を示し、約10〜50pg／mlのリポートEC50を有す（Tuckerら、Science 1984；226 ：705-707 ；Absherら、J. Immunol Methods 1991 ；138 ：301-303；Danielpourら、J. Cell Physiol, 1989 ；138 ：79-86)。増殖が TGF−βにより強く阻害されるMv−１−Lu細胞はこのサイトカインの分析バイオアッセイの開発に最も適する細胞系であると現在考えられている（Kelleyら、Exp Lung Res 1992 ；18：877-887 ；Meager, J. Immunol Methods 1991 ；141 ：1-14) 。アッセイは96穴マイクロタイタープレートの中で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville MD, USA 由来の46継代目においてオリジナル的に得られる細胞を利用して実施する。細胞を TGF−β標準品又はサンプルの希釈系列を含む増殖培地（５％ｖ／ｖ胎児牛血清を有する最小必須培地）の中に低密度（ウェル当り5000細胞）で播種する。次にアッセイを37℃にて多湿５％CO2 インキュベーターの中で72時間インキュベートする。細胞増殖の阻害は高感度酵素的細胞染色法（これは各ウェルの中で産生される酸性ホスファターゼの量の比色換算値を供する）により決定され、染色の強さは各ウェルの中に存在する細胞の数に対応する。各ウェルの吸収O.D.を405nmで決定し、そしてアッセイデーターをプロットし、そして適当なPCソフトウェアプログラムにより分析する。このアッセイにおいて、１単位（Ｕ）の活性はMv−１−Lu細胞増殖の最大阻害の半分に必要な TGF−βの量として記述する。
実施例８：フォルディングした TGF−β３のin vivo 活性試験
実施例８Ａ：老齢マウスにおける部分的に厚みを帯びた創傷の治癒
創傷治癒過程は年齢を追うごとに悪くなることが知られ（GroveG. L. (1982) Arch. Dermatol. Res. 272 ：381)、従って老人医療分野における主たる問題を占める。従って、部分的に厚みを帯びた創傷（II度火傷により生成）の治癒に及ぼすフォルディングした活性二量体型 TGF−β３のin vivo 生物効果を部分欠陥又は損われた創傷修復状況で、即ち老齢動物で、Schultz, G. S.ら（1987) Science 235 ：350 に記載のものと類似する以下のプロトコールを利用して調べる。
【００５０】
１個の中皮熱傷を麻酔したＣ57／BL６マウス（生後 450日以上）（その背中は予め毛剃りしてあり、そして市販クリーム型除毛剤で脱毛しておいた）の背胸部上に、80℃の湯浴に平衡化しておいたしんちゅうテンプレート（１×１cm，８ｇ）の10秒間の適用により施す。得られる水疱を外科的に除去し、そして火傷を５日間にわたり毎日様々な量（500ng, 100ng又は10ng）のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３を含む25μｌの無菌ビヒクルバッファー溶液（10mMのヒスチジン、140mM のNaCl，pH7.4 の溶液中の 0.8％ｗ／ｖのヒドロキシプロピルセルロースより成る）又はバッファーのみの適用により処置するか、又は未処置のままにしておく。局部塗布した材料は無菌、無内毒素がなく、且つ無パイロジェンであり、そしてマウスは全て実験中個別のカゴに入れておいた。各実験グループは５匹の動物より成る。
【００５１】
TGF−β３による処置の５日後、マウスを麻酔し、水疱（あるなら）を火傷から外科的に除去し、そして火傷を写真撮影する。上皮を再生した火傷の領域の外形を均一な厚みの透明オーバーヘッドプロジェクターフィルム上において抽き、そして治癒した各オリジナルの火傷領域の率を面積測定法により算定する。結果を、実験の際に未処置のままにしておいた同一の中皮火傷を負った若齢（生後56〜84日）のＣ57／BL６マウスにおける上皮再生過程とも比較する。
【００５２】
面積測定分析の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３の５日間にわたる毎日の局部塗布が、ビヒクルバッファーのみ又は未処置の創傷と比較したときに、用量依存式に老齢マウスでの部分的に厚みを帯びた創傷の上皮再生を刺激及び加速することを示した。若齢マウスは局部塗布する TGF−β３を全く抜きにして、その創傷を有効に再上皮形成するのに十分に見かけ上有能である。長期分析は、強められた上皮形成過程を、 TGF−β３処置創傷における６日目での再生表皮の角質増殖症を伴って示す。
実施例８Ｂ：成ラットにおける全体に厚みを帯びた創傷の治癒
フォルディングした活性二量体型 TGF−β３の生物効果も創傷修復の第２in vivo モデル、即ち、Mustoe, T. A. ら（1987) Science 237 ：1333に記載のものと類似の以下のプロトコールを利用する成ラットにおける全体に厚みを帯びた創傷（外科的切開により作成）の治癒に基づいて調べる。
【００５３】
１個の全体に厚みを帯びた長さ５cmの直線切開を 1.5cm×２で、背中を予め毛剃りしておき、且つ市販のクリームタイプ除毛剤で脱毛しておいたペントバルビトン麻酔した雄のWistarラット(300〜 350ｇ）の背中線の両側に施す。この実験グループにおいて、左側の切開（背側の最上部から見て）の縁に、様々な量（２mg，１mg，0.1mg 又は0.01mg）のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３を含む無菌ビヒクルバッファー（10mMのヒスチジン、140mM のNaCl，pH7.4 の溶液中の 0.8％ｗ／ｖのヒドロキシプロピルセルロースより成る）の一回の局部塗布(100μｌ）を施す。逆側の右側切開の縁には前記ビヒクルバッファー中の対応の等量の偽薬コントロール（牛血清アルブミン）を施し、そしてコントロール動物における切開の縁においては、左側の切開にはビヒクルバッファーのみを施し、そして右側切開においては外科切開後処置を施しておかない。局部塗布する材料は全て無菌、無内毒素及び無パイロジェンである。各創傷の縁を５−０ Ethilonの５針の均等に施した介在式水平マットレス縫合糸で接合させる。動物は全て個別にカゴに入れ、そして創傷は処置後21日以内の様々な期間にわたり治癒のために放置する。殺した後、背皮全体を各動物から剥ぎ、そして全ての皮下脂肪を外科用メスを用いて各皮膚の下側から慎重に除去する。２本の平行な外科メスより成るテンプレート（刃間の距離は８mm）を引張強さ測定のための皮膚片（各切開上の縫合の間）を切り出すために用いる。サンプルを長期分析のために各切開の一端から採取する。各切り出した皮膚サンプルにより寛容される最大負荷を万能引張強さ装置モデル144501（Zwick, Ulm, FRG)で測定する。測定は、油圧式クランプで固定しておいた、且つ10mm／分の速度で破断点に至るまで延伸した30mm×８mmの片で行い、最大負荷をチャートレコーダーで記録する。測定は各創傷由来の三重測定サンプルで行い、そして実験グループは４匹の動物より成る。感染症又は過剰な出血の徴候を示す創傷（全創傷の３％未満）については破断強さの測定を行わない。
【００５４】
引張強さ測定の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３の一回の局部塗布が、コントロールグループと比較したときに、２倍に至るまで破断強さを強め、そして成ラットの全体に厚みを帯びた切開創傷を21日間にわたり用量依存式で治癒を加速せしめることを実証する。長期分析は、コントロール創傷と比べたとき、21日間にわたり TGF−β３処置した創傷における単核細胞、線維芽細胞の流入、及びコラーゲン産生の著しい増大を示す。一過性の角質増殖症も処置後14日まで TGF−β３処置創傷においても明示される。
実施例９：可溶化単量体型ハイブリド TGF−βタンパク質及び可溶化単量体型 BMP−２の調製
実施例９．１：ハイブリド TGF−β
５mlのプラスミドpPLMu を NcoＩ及び SalＩでの消化により線状にし、そしてフラグメントDNA に関して上記した通りにゲル精製する。100ng の線状化、且つ精製したpPLMu ベクターDNA 、並びに配列表に示すハイブリド TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２のそれぞれをコードする３倍モル当量の対応の精製フラグメントDNA を４℃で15時間、１単位のDNA リガーゼ（Boehringer）を含む20mlのライゲーションバッファー（70mMのトリス−HCl ，pH7.5 ，10mMのMgCl2 ，５mlのDTT 、0.1mM のアデノシン三リン酸）の中でインキュベートする。
【００５５】
10mlのライゲーション混合物をプラスミドpcL857を担持する200ml の低温（４℃）コンピテントＥ．コリLC 137細胞）に加える。30分後、細胞を42℃の湯浴の中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックせしめる。２mlのLB培地を加え、そしてその培養物を30℃で60min 振盪する。 200μｌのアリコートをアンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上にプレートし、そして30℃で22ｈインキュベートする。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析する。pPLMu の中での TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２をコードするDNA フラグメントのサブクローニングはプラスミド pPLMu.TGF−β１（44／45）β３， pPLMu.TGF−β２（44／45）β３及び pPLMu.TGF−β３（44／45）β２のそれぞれをもたらす。上記の構築体を含むクローンをＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３とそれぞれ呼ぶ。
【００５６】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３を以下の通り（実施例３Ａも参照のこと）に熱誘導し、そして発現したタンパク質をSDS-PAGEにより分析する。 TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２は全て、熱誘導して２ｈ後に熱誘導化、タンパク質として出現し、約12,000Daの見かけ上の分子量をもって泳動した。
【００５７】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３の、40mg／ｌのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の一夜培養物を30℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の上記の抗生物質を含む750mlのLB培地に加え、そして65℃の湯浴の中で約3.5 分振盪することにより42℃に加熱する。次いでこのフラスコを42℃のシェーカーに移し、そして３ｈインキュベートする。このフラスコを氷冷水槽の中で12℃に冷却し、そして細胞をGSA ローター(Sorvall）の中での8000rpm での10分の遠心分離により集める。
【００５８】
単量体型可溶化 TGF−β１−３ハイブリドの製造のための下記の手順も TGF−β２−３及び TGF−β３−２の可溶化に適用する。
【００５９】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３細胞を上記の通りに発酵させ、そして封入体を下記の通りにして調製する。細胞破壊及び封入体の回収は４℃で行う。約18ｇのウェット細胞を60mlの 0.1Ｍのトリス／HCl ，10mMのEDTA，１mMのPMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、pH8.3(破壊バッファー）の中に懸濁する。この細胞をフレンチプレス(SLM Instruments, Inc.）にその製造者の仕様書に従って２回通し、そしてその容量を破壊バッファーで200ml にする。その懸濁物を15,000ｇで20分遠心する。得られるペレットを１ＭのNaClを含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の通りに10分遠心する。そのペレットを１％のトリトンＸ−100(Pierce）を含む、100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして再び上記の通りに10分遠心する。
【００６０】
0.3ｇの洗浄ペレットを10mlの20mMのトリス／HCl ，１mMのEDTA，１mMのPMSF， 0.1％のDTT ，pH8.0 に懸濁し、そして室温で１ｈ磁気撹拌する。そのサンプルを濃酢酸でpH2.5 にし、そしてテフロン（登録商標）製組織ホモジナイザーでホモジナイズし、そしてCentricon H-401 遠心機(Kontron Instruments）の中で固定角ローターＡ．８．24を用い、60min ，15℃，12,000rpm で遠心する。透明な上清液の酢酸をYM05フィルターの付いたAmicon 8010 撹拌式セルの中で10mMのHCl により、繰り返し濃縮及び10mMのHCl によるその溶液の希釈により変換する。
実施例９．２： BMP
Ｎ末端配列Ｑ−Ａ−Ｋ−Ｈ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｋ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｒ−Ｈを有するWozneyら、Science 242 ：1528-1534(1988)に記載の BMP−２（本来の名称＝ BMP−２Ａ）の成熟形成を含む封入体を慣用の方法に従い、Ｔ７ポリメラーゼ発現系を有するＥ．コリの中で調製する。発現のために用いる BMP−２ DNAを配列表の中のSEQ ID No.13で示す。組換 BMP−２はＮ末端に追加のメチオニンを有す。第２の手法において、 BMP−２の突然変異体、即ち（−Ｑ１)BMP−２を作った。これは第１アミノ酸が欠失し、且つメチオニンがＮ末端にないことを除き上記と同一のタンパク質である。
【００６１】
10mMの BMP−２又は（−Ｑ１)BMP−２封入体懸濁物を10％の酢酸でpH2.5 に酸性化し、そしてエッペンドルフ遠心機で室温で10min遠心する。この上清液をSephacryl Ｓ−100 カラム（Pharmacia, 2.6×78cm）で10％の酢酸中で 1.4ml／min の流速でクロマトグラフィーにかける。単量体型の変性 BMP−２を含む画分をプールする。プールした材料を以下のリフォルディング実験に利用する。
実施例10：種々の TGF−β及び TGF−β−ハイブリド及び BMP−２による一連のリフォルディング実験
本発明の多様性及び広範囲の適用性は以下の一連の実施例にまとめた結果により例示される。in vitroタンパク質リフォルディング実験に利用した特定の条件及び個々のタンパク質を列挙する。その他の実験条件は実施例４に記載の通りである。生物活性はin vitroタンパク質フォルディングを開始してから３及び７日後に決定した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
GSH ： 還元型グルタチオン
DMSO： ジメチルスルホキシド
DMSO2 ： ジメチルスルホン
BMP −２：追加のＮ末端メチオニンを有する BMP−２
（−Ｑ１)BMP−２：Ｎ末端グルタミンを欠く BMP−２
β３： TGF−β３
活性： ＋：Takuwa Y. ら（1991) Biochemical and Biophysical Research Communication Vol. 174, 96-101,「Bone Morphogenetic Protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultered osteoblastic cells, MC3T3-E1 」記載のin vitroバイオアッセイ又はクロマトグラフィー及び電気泳動のいづれかにより決定される、実施例７に記載のin vitroバイオアッセイにおいての TGF−βの中程の活性、又はフォルディングした BMP−２及び（−Ｑ１)BMP−２の形成。
微生物の寄託
以下の微生物はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig (FRG)に寄託してある：
微生物 寄託日 受託番号
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１ 1989年11月28日 DSM 5656
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２ 1989年11月28日 DSM 5657
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３ 1989年11月28日 DSM 5658
サッカロマイセス・セレビジエGRF18 1986年３月４日 DSM 3665
【発明の開示】
【０００１】
本発明は生物学的に活性な二量体型 TGF−β（β型トランスフォーミング増殖因子）様タンパク質の調製のためのフォルディング方法に関する。
発明の背景
TGF−β様タンパク質、即ち、 TGF−β超科は胎芽の発育又は組織の再生の如き数多くの生物学的調節経路における中心的な役割を果たす。これらは非常に有能な生物学的因子であり、それらは多種多様の目的のために治療的にも利用されうる。 TGF−β超科の最も良く知られる構成員は TGF−βそれ自体である。
【０００２】
TGF−βは当初ヒト血小板、ヒト胎盤及びウシの腎臓から均質となるまで精製され、そして約25,000Daの分子量を有するホモ二量体型タンパク質と同定されている。最初は、未形質転換NRK 細胞の定着非依存性増殖を誘導するようにEGF 又は TGF−αと相乗的に作用できる能力により特徴付けられたが、最近になり、 TGF−βが多種多様な正常及び新生細胞の双方に対して莫大な調節作用を発揮することが示され、細胞活性の多機能調節因子としてのこのタンパク質の重要性が示唆されるようになった。細胞又は組織のタイプ、並びにその他の増殖因子の有無に依存して、 TGF−βは有系分裂、細胞増殖及び成長を刺激しうるか、又はこれらの過程を効率的に阻害しうるか、又はその他の作用、例えば脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成及び免疫細胞機能の調節、化学走性の刺激、又は分化の誘導もしくは阻害を発揮しうる。 TGF−βの多くの作用は細胞又は組織のストレス又は負傷に対する応答性及びその結果としての損傷の修復に関連する。炎症発生の後、 TGF−βは顆粒組織の形成に主要たる役割を果たし、フィブロネクチン、コラーゲン及び数種のプロテアーゼインヒビターの如き細胞外マトリックスの形成に関与する遺伝子の発現性を増大させ、そしてフィブロプラストによるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、従って接続組織の収縮における役割の可能性が示唆される。
【０００３】
TGF−β１， TGF−β２， TGF−β３， TGF−β４及び TGF−β５と命名された５種類の機能的且つ構造的に近縁する TGF−βが今までに述べられている。
【０００４】
TGF−βは全て 390〜412 個のアミノ酸前駆体として合成され、これはＣ末端側の 112個のアミノ酸より成る成熟形態となるようにタンパク質分解を受ける。その成熟生物活性形態においては、 TGF−βはそれぞれ 112個のアミノ酸の２本のポリペプチド鎖の酸性及び熱安定性ジスルフィド連結型ホモ二量体である。ヒトの TGF−β１（Derynck, R. ら（1985) Nature 316, 701-705)、ネズミの TGF−β１（Derynck, R. ら（1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379)及びサルの TGF−β１(Sharples, K. ら（1987) DNA 6, 239-244)の完全アミノ酸配列は著しい配列保存性を示し、１個のアミノ酸残基のみで相違する。ヒト TGF−β１、ヒト TGF−β２（de Martin, R. ら（1987) EMBO J. 6, 3673-3677；Marquardt, H. ら（1987)J. Biol. Chem. 262, 12127-12131)及びヒト TGF−β３（Ten Dijke, P. ら（1988) PNAS 85, 4715-4719) のアミノ酸配列の対比はこれら３種のタンパク質がその成熟形態において約70〜80％の配列同一性を示すことが実証されている。ヘテロ二量体型 TGF−β１，２がブタの血小板から単離されており、そして TGF−β２の１個のサブユニットにジスルフィド連結した TGF−β１の１個のサブユニットより成る(Cheifetz, S. ら (1987) Cell 48, 409-415) 。
【０００５】
最近、様々な治療方式において試験できるよう十分な量で得るために TGF−βを、天然起源（例えば血小板）からこれらの因子を単離するのではなく、組換技術を介して製造すること狙いとする試みがなされている。しかしながら、生物学的に活性な組換 TGF−βを得ることが非常に難しいことが実証された。配列表においてSEQ ID No.１〜６で示す表配列からわかる通り、 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の成熟形態を含む 112個のアミノ酸は９個のシステイン残基を含む。 TGF−β２に関して示されている通り、この９個のシステイン残基は４本の分子内及び１本の分子内ジスルフィド結合を形成している［Schlunegger, M. P. and Gruetter, M. G., Nature 358：430-434 (1992)］。 TGF−βの異種発現は、適正な一次構造は有するものの、適正な二次又は三次構造となるように適正にフォルディングせず、従って生物活性を欠いた生成物を招きうる。
【０００６】
天然 TGF−β分子の複雑さを考慮すると、関連の TGF−β遺伝子をより高等な生物より誘導された細胞の中で発現せしめることが好都合と一般に考えられる。組換 TGF−β２の発現は真核系において達成されうるが、得られる生物学的に活性な適正にフォルディングされた物質の収量は満足たるものからかけ離れている。
【０００７】
従って、微生物宿主において生物活性 TGF−βを製造する試みがなされている。しかしながら、例えば細菌においては、その細胞内条件は適正なフォルディング、ジスルフィド結合形成及びジスルフィド安定化二量体であって活性にとって明らかに本質的な事象を誘導するようなものではない。即ち、ヨーロッパ特許出願EP-A-0,268,561に記載の如き、ラムダプロモーターのコントロール下でのＥ．コリ(E. coli）における関連遺伝子の発現ではごくわずかな生物活性 TGF−βしか得られない。別の報告には、trp プロモーターのコントロール下でのＥ．コリにおける TGF−β cDNA の発現が記述され、SDS ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにおいて13,000Daの見かけ上の分子量を有する放射能ラベルされたタンパク質バンドが生み出されているが、しかし活性は全く測定されなかった(Urushizaki, Y. ら（1987）Tnmor Res. 22, 41-55) 。
【０００８】
組換タンパク質が細菌（例えばＥ．コリ）発現系において高レベルで産生されるとき、それらは往々にして封入体又はリフラクチル体（Ｒ体）と呼ばれる高度に不溶性の細胞内沈殿物の形態で認められ、これらは位相差顕微鏡のもとで細胞の囲い内で見える輝点として認識されうる。可溶性細菌タンパク質から容易に分離できうるこれらの封入体は、その天然の対応物の機能活性を発揮せず、それ故商品としての価値のないほとんど変性及び還元された形態の組換タンパク質を含む。従って、組換リフラクチル−タンパク質は、それをその変性形態に保つのに適当な条件下で可溶化し、次いで変性したほどけ形態から適正な機能的に活性な三次元構造へと転移させるためにフォルディングさせるべきであることが一般的に同意され、そのコンホメーションは比較的弱い原子価力、例えば水素結合、疎水性相互作用及び帯電相互作用により安定化されるものである。システイン含有タンパク質の場合、このプロセスはジスルフィド結合の形成も包括しうる。ジスルフィド結合の形成を化学的に促進せしめる場合、不適正な分子内結合の形成を、そして二量又は多量体型タンパク質の場合、分子間結合が阻止又は最小限化されるべきであり、その理由は所望されない不適正にフォルディングされた異性体は不均一な物質をもたらし得、それ故所望の構造を有するタンパク質の更なる精製を複雑にするか、又は低い活性を有するタンパク質をもたらしうるからである。
【０００９】
タンパク質のフォルディングは通常強力な変性条件下でのタンパク質の可溶化、その後のタンパク質のフォルディングを可能にするためのカオトロピズム濃度の低下を含んで成る多段式プロセスにおいて実施される。しかしながら、かかる手法は TGF−βのフォルディングにおいて失敗している。ヨーロッパ特許出願EP-A-0,433,225において、生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質の製造について成功を収めた方法が記載され、それにおいては界面活性剤がフォルディングバッファーの中に入ったまま TGF−β様タンパク質のフォルディングを可能にする温和な界面活性剤を使用している。
【００１０】
従来技術（Tam ら、J. Am. Chem. Soc. 113 ：6657-6662, 1991)よりわかる通り、ペプチドの中でのジスルフィド結合の選択的且つ効率的な形成を促進するためにジスルフィドスルホキシド（DMSO）が使用できうる。この方法は選択的であり、即ち副反応がなく、そして広いpH域が適用されうる。しかしながら、適正なジスルフィド結合の形成は約30個のアミノ酸までのペプチドにしか、示されていない。別の公開物（Bentleら、米国特許第4,731,440 号）において、ジメチルスルホン又はジメチルスルホンと尿との混合物が封入体からのソマトトロピンの可溶化のために使用されている。この可溶化タンパク質はこのタンパク質のジメチルスルホン含有溶液を温和な酸化剤と接触させることにより再生されうる。
【００１１】
驚くべきことに、 TGF−β様タンパク質のフォルディングのために温和な界面活性剤を利用する方法は、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルスルホン(DMSO2）又はジメチルホルムアミド(DMF）を添加することにより改良できうることがこの度発見された。
発明の目的
本発明の目的は生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質をその変性又はそうでなければ非天然形態から作り出すための改良方法を提供することにある。目的は、そのタンパク質の単量体を、（ａ）温和な界面活性剤、並びに（ｂ）DMSO, DMF もしくはDMSO2 、又はDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２もしくは３種の混合物を含んで成るフォルディングバッファーで処理したとき、大量の所望の二量体型生成物が予測し得なかった収量において生成されるという予測し得なかった発見により達成される。
発明の詳細な説明
本発明はβ型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質の二量体型生物活性タンパク質の製造のための改良方法に関し、この方法は TGF−β様タンパク質を（ａ） TGF−β超科のタンパク質のフォルディングを可能にする温和な界面活性剤と（ｂ）DMSO, DMF 及びDMSO2 並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る。
【００１２】
本発明に関する「 TGF−β−様タンパク質」は以下の TGF−β超科の構成員（これは「 TGF−β様タンパク質」なる語にも属する）の単量体のアミノ酸配列の少なくとも一つに対して75％以上の相同性を有する配列をその単量体において有するタンパク質を意味する：
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３； BSC−１サル腎細胞のコンディンショニング培地から単離された増殖インヒビター（即ち、ポリエルギン；Holley, R. W. ら（1980) PNAS 77, 5989-5992；Ristow, H. J. (1986) PNAS 83, 5531-5533)；ニワトリの胚芽軟質細胞由来の TGF−β４（Jackowlew, S. B.ら (1988) Molecular Endocrinology 2, 1186-1195) ；アフリカツメガエル由来の TGF−β５（Kondaiah, P.ら（1990) J. Biol. Chem. 265, 1089-1093)； TGF−β−関連インヒビン及びアクチビン（卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌を調節する性腺タンパク質）；Mullerian 阻害物質(MIS；これは雄の哺乳動物胎児におけるミュラー管の発育を阻害する）；骨形態発生タンパク質(BMP、軟骨及び骨の形成の誘導に関与するポリペプチド群；今日知られるこの群の構成員は BMP−２， BMP−３， BMP−４， BMP−５， BMP−６， BMP−７， BMP−８及び BMP−９である）；ショウジョウバエのデカペンタプレジック(decapentaplegic）遺伝子複合体由来の転写体(dpp、これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う）；Vg−１（アフリカツメガエル転写体の産物であり、卵母細胞の植物極に存在する）；並びに Vgr−１、即ちVg−１関連哺乳動物遺伝子（Mason, A. ら (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 957-964 ；Cate, R.ら (1986) Cell 45, 685-698；Wozney, J. M. ら (1988) Science 242, 1528-1534；Padgett, R. ら（1986) Nature 325, 81-84 ；Weeks, D. L. and Melton, D. A. (1987) Cell 51, 861-868；Lyons, K. ら（1989) PNAS 86, 4554-4558) 。
【００１３】
「 TGF−β−様タンパク質」の意味の中に含まれるのは種々の TGF−β様タンパク質のサブユニット、又はこの親分子の生物活性の一部又は全部を保持している上記のタンパク質のフラグメント又は突然変異体を含むヘテロ二量体である。
【００１４】
好適な意味において、本明細書における「 TGF−β−様タンパク質」なる語は TGF−β超科の任意のタンパク質を意味する。より好適な意味において、これは以下の TGF−β超科のタンパク質より成る群から選ばれるタンパク質を意味する：哺乳動物起源、例えばサル、ネズミ、ブタ、ウマ又はウシの TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３並びに 112個づつのアミノ酸の２種類のサブユニットより成るヘテロ二量体型 TGF−β、並びに TGF−βのフラグメント及び突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子； BSC−１サル腎細胞のコンディショニング培地から単離された増殖インヒビター（即ち、ポリエルギン）；ニワトリ胚芽軟質細胞由来の TGF−β４；アフリカツメガエル由来の TGF−β５； TGF−β関連インヒビン及びアクチビン（卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌を調節する性腺タンパク質）；Mullerian 阻害物質(MIS；これは雄の哺乳動物胎児のミュラー管の発育を阻害する）；骨形態発生タンパク質(BMP；軟骨及び骨の形成の誘導に関与するポリペプチドの群；今日知られるこの群の構成員は BMP−２， BMP−３， BMP−４， BMP−５， BMP−６， BMP−７， BMP−８及び BMP−９）；ショウジョウバエのデカペンタプレジック遺伝子複合体の転写体(dpp；これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う）；Vg−１（アフリカツメガエル転写体の産物；これは卵母細胞の植物極に存在する）；並びに Vgr−１、即ち、Vg−１関連哺乳動物遺伝子。「 TGF−β様タンパク質」の意味の中に更に含まれるのは種々の TGF−β様タンパク質のサブユニットを含むヘテロ二量体、又はその親分子の生物活性の一部又は全てを保持する上記のタンパク質のフラグメント又は突然変異体である。
【００１５】
より好ましい TGF−β様タンパク質は、 TGF−β１， TGF−β２， TGF−β３、ヘテロ二量体型 TGF−β、 TGF−βのフラグメント又は突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、BMP 、インヒビン及びアクチビンから選ばれる。より好ましいのは、 BMP−２， TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３、並びにそのヘテロ二量体並びにフラグメント及び突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、好ましくは以降に定義するハイブリド TGF−β１−３、ハイブリド TGF−β２−３もしくは TGF−β３−２又は TGF−β１−２であって、Ｎ−からＣ−末端の順序で、ヒト TGF−β１のＮ末端側の44個のアミノ酸及び TGF−β２のＣ末端側の68個のアミノ酸より成るものである。更により好ましいのは配列表の中でSEQ ID No.１，３，５，７，９又は11に示すアミノ酸配列を有するものである。最も好適な TGF−β様タンパク質は TGF−β３である。
【００１６】
BMP−２なる語は、同一の生物活性を有する BMP−２の変異体も含む。かかる変異体は例えば実施例において製造したもの、即ち、追加のＮ末端メチオニンを有するSEQ ID No.13の BMP−２及びＮ末端アミノ酸Gln を欠くSEQ ID No.13の BMP−２である。
【００１７】
本発明の目的のための TGF−βの生物活性は、
−線維芽細胞に対する TGF−βの細胞移動促進活性（Postlethwaithe, A. E. ら（1987) J. Exp. Med. 165, 251 ；Burk, R. (1973)PNAS 70, 369に従って改良）；
−ヒトＡ375 黒色腫細胞の増殖に対する TGF−βの阻害作用（Brown, T. J.ら（1987) J. Immunol. 139, 2977)；
−CCL-64細胞DNA 合成阻害アッセイ (Graycar, J. L.ら（1989) Molecular Endocrinology 3 ：1977-1986)又は
−以降の実施例に記載の連続ミンクの肺上皮細胞系Mv−１−Lu（ATCC／CCL64)の増殖の阻害；
のいづれかとして規定する。
【００１８】
任意の起源又は方法に由来する単量体型 TGF−β様タンパク質は本法に従って対応の二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質へとフォルディングされうる。例えば、 TGF−β様タンパク質の単量体は天然起源に由来するか、又は当業界公知の方法により組換DNA 技術を介してもしくは合成的に製造されうる。単量体が夾雑物に原因してin vitroフォルディングに適さない場合、可溶化及び変性化単量体をクロマトグラフィーにより、例えばSephacryl S-100 HRの如きでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製できうる。
【００１９】
フォルディングされる前に、この単量体型 TGF−β−様タンパク質は変性（即ち、ほどけ）可溶化形態において存在していなくてはならない。タンパク質を効率的に変性及び溶解できるのは当業界に公知のいわゆるカオトロピック剤であり、これは水性溶液で、且つ適当な濃度で、対応のタンパク質の立体形状をその表面の改変を通じて、即ち水和状態、溶媒環境又は溶媒−界面相互作用の変化を通じて変化させるものである。かかるカオトロピック剤又は変性剤の例には尿素、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム（約４〜約９Ｍの濃度域）、及び界面活性剤、例えばSDS(これは0.01〜２％程度の濃度で添加）が含まれる。また、 TGF−β様タンパク質を含む水性溶液の約２〜約４のpHに至る、例えば低分子量脂肪族有機酸、好ましくは２，３又は４個のＣ原子を有するかかる酸、より好ましくは酢酸による酸性化、並びに例えばpH10以上の塩基性条件、更には高温が、単量体の変性及び可溶化をもたらすであろう。
【００２０】
次いでこの単量体を、生物活性二量体の回復を可能にする「フォルディング条件」にかける。「フォルディング条件」とは、その条件下で分子内及び分子間ジスルフィド結合の形成が促進され、そしてその変性単量体が生物活性に係るコンホメーションを帯びるようにする条件をいう。このプロセスはこの単量体の一次構造（即ち、アミノ酸配列）の任意の変化には関与しないが、生物活性に結びつく二量体型生成物の三次元コンホメーションの形成には関連する。このプロセスはジスルフィド結合の形成、及び二量体型生物活性構造への単量体の会合を含む。
【００２１】
この目的のため、変性単量体を（ａ）以降に定義する温和な界面活性剤と、（ｂ）DMSO, DMF, DMSO2、並びにDMSO, DMSO2 及びDMFより成る群のうちの２又は３種の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで、中性又はアルカリ性のpH及び妥当な温度、例えば約０℃〜約40℃において処理する。好適なpHは約７〜約10、DMSOの場合は約pH９〜9.5 がより好ましく、DMF の場合は約pH8.5 が好ましく、そしてDMSO2 の場合は約pH9.5 が好ましい。
【００２２】
本発明に従うフォルディングのために利用されうる慣用のバッファー系はpH６〜10において十分な緩衝能を供するバッファーである。タンパク質のフォルディングに対して阻害作用を有さない全てのバッファーが本発明において適用可能である。例えば、適当なバッファーはトリス−、ビス−トリス、又はピペラジンバッファーである。これらのバッファーは更に、所望するなら塩、及び所望するなら塩基性アミノ酸を含みうる。
【００２３】
フォルディングバッファーにおいて利用できうる塩は、例えば３Ｍに至る濃度のNa+ ，Li+ ，Ｋ+ ，NH4 + ，Mg+ ，Ca2+もしくはMn2+と、Cl- ，Ｆ- ，Br- ，Ｊ- ，HCO3- ，SO42- 、リン酸、酢酸、シアン酸もしくはロダン酸との塩、又はその他のアルカリ金属−もしくはアルカリ土類金属−ハロゲンもしくは偽ハロゲン化合物である。１〜２Ｍの濃度のNaClが好ましい。
【００２４】
フォルディングバッファーの中に使用できる塩基性アミノ酸は例えば好ましくは 0.5Ｍの濃度のアルギニンである。
【００２５】
本発明の目的のためのDMSO, DMSO2 又はDMF の好適な濃度は約５％〜約40％、より好ましくは約10％〜約30％である。DMSOの更に好ましい濃度は約10％〜約30％、より好ましくは約20％である。DMFに関しては、更により好ましい濃度は約10％〜約30％、より好ましくは約10％である。DMSO2 に関しては、更により好ましい濃度は約10％である。DMSOとDMF との混合物、DMSOとDMSO2 との混合物、又はDMF とDMSO2 との混合物は、合わせた溶媒に関し、約５％〜約40％、好ましくは約10％〜約30％、より好ましくは約10％〜約20％の濃度において使用されうる。
【００２６】
本発明に係る TGF−β超科のタンパク質のフォルディングに適する温和な界面活性剤は単量体型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって、二量化後に生物活性に結びつくコンホメーションにフォルディングさせ、しかもこの単量体を可溶形態に保つ任意の界面活性剤である。
【００２７】
かかる界面活性剤は非イオン性、カチオン性、アニオン性又は双イオン性であってよい。好適な界面活性剤は非イオン界面活性剤ジジトニン、そしてより好ましくは双イオン性界面活性剤３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート(CHAPS）及び３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（CHAPSO）である。界面活性剤の混合物、例えばCHAPS とCHAPSOとの混合物を使用することも可能である。温和な界面活性剤はフォルディングバッファーの中に約１〜100mM の濃度、より好ましくは30〜60mMの濃度、更により好ましくは30mMの濃度で主として存在する。
【００２８】
本発明の好適な態様において、このフォルディングバッファーは更に還元物質を含む。タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合性を高める適当な還元物質は例えば還元型のグルタチオン、還元型のジチオスレイトール、還元型のβ−メルカプトエタノール、還元型のメルカプトメタノール、システイン及びシステアミンより成る群から選ばれる低分子量スルフヒドリル試薬である。適当な濃度は例えば約１〜100mM 、好ましくは約１〜約10mM、より好ましくは約2.5mM である。
【００２９】
フォルディングは妥当な温度、例えば約０〜約40℃、好ましくは約４℃で、妥当な時間、例えば約２〜約 720ｈかけて行う。フォルディングの時間は利用する温度に依存するため、温度を任意の所望のフォルディング時間のために最適化し得、そしてその逆も真なりである。
【００３０】
本発明に係る二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質の製造は一段手順で実施し得、それにおいては前記タンパク質の単量体をフォルディングバッファーに移し、そしてその反応混合物を例えば２時間から７日以上の期間、例えば０℃〜40℃の温度、好ましくは４℃において、フォルディング及び二量化を連続的に行いながらインキュベートする。フォルディング反応の際のタンパク質濃度はかなり重要であり、その理由は、高すぎてしまうと、単量体は著しく凝集してしまい、所望されないほど高次元のオリゴマーの形成が起きてしまうからである。タンパク質濃度が約２mg／ml未満であると、二量体型生成物の最終収率は高まり、0.01〜 0.5mg／mlの濃度域が好ましい。
【００３１】
TGF−β３のフォルディングに関する本発明に従うフォルディング実験の好適な例は以下の通りである：
0.1mg ／mlの TGF−β３；
100mM のトリス；
任意的に還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプトエタノールより成る群から選ばれる１〜50mMの物質（しかしながら、上述の通り、本法はシスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である）；
１ＭのNaCl；
0.5Ｍのアルギニン；
20〜30％のDMSO；
30mMのCHAPS 又はCHAPSO；
pH９〜9.5 ；
又は
0.1mg ／mlの TGF−β３；
100mM のトリス；
還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプトエタノールより成る群から選ばれる2.5mM の物質（しかしながら、上述の通り、本法はシスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である）；
１ＭのNaCl；
0.5Ｍのアルギニン；
10％のDMF ；
30mMのCHAPS 又はCHAPSO；
pH8.5 。
【００３２】
フォルディング後、生物活性二量体を精製し、不完全にフォルディングした TGF−β様タンパク質、並びに不純物、特にこのポリペプチドを微生物宿主細胞において製造するときに調製品の中に存在しうるパイロジェン又はその他の内毒素を除去する。二量体の分離はクロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー（例えばMono Sカラム上）、及び逆相HPLCにより行う。
【００３３】
本発明は更に、本発明の方法に従って製造した二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質に関する。これらの TGF−β様タンパク質は様々な治療方式に利用できる。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は本発明の例示であり、限定するものではない。
実施例１：Ｅ．コリの中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
実施例１Ａ：一般方法
細菌株：
−Ｅ．コリＫ12／LC 137：htpRam , lonR9 , lacam , malam , trpam , phoam, rspL, tsx::Tn10 , supCts (Goff, S. A. ら（1984)PNAS 81, 6647-6651) 。
プラスミド：
−pPLMu (Buell, G.ら（1985) Nucleic Acids Res. 13, 1923-1938) ：このプラスミドはファージMu ner遺伝子リボソーム結合部位をもつバクテリオファージλＰL プロモーターを担持する（Van Leerdam, E. ら（1982) Virology 123, 19-28)。
−pcl857：熱不安定性λCL857 レプレッサーをコードし、且つカナマイシンに対する耐性を授けるプラスミド（Remault, E. ら（1983) Gene 22, 103-113) 。
SDS−ゲル電気泳動：
SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE）及びタンパク質染色はBIORAD由来のMiniprotean IIセル及び厚さ１mmの18％のポリアクリルアミドゲルを利用して既に説明されている通り（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)に実施する。
熱誘導：
40μｇづつのアンピシリン及びカナマイシン (LB／amp ／kan)を含む20mlの培養チューブ中の７mlのLB−培地（Maniatisら (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）に単一のコロニーを接種し、そして振盪しながら一夜30℃でインキュベートする。この一夜培養物５mlを100ml のエーレンマイヤーフラスコ中の15mlのLB／amp ／kan に加える。このフラスコを42℃の浴槽シェーカーに移す。移す前に２mlのサンプルを取り（非誘導条件）、そして移してから１時間間隔で１mlづつのサンプルを取る（誘導条件）。細胞を遠心分離（５min ；10,000rpm ；エンペンドルフ遠心機で）によりペレット化し、そして上清液を捨てる。このペレットをSDS-PAGE用の100 μｌのサンプルバッファーに再懸濁し、そして95℃で10min 加熱する。５μｌのアリコートをSDS-PAGEに載せる。
コンピテント細胞の調製：
コンピテントＥ．コリ細胞はManiatisら (1982) , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkに記載の塩化カルシウム手順により調製する。プラスミドpcl857を担持する細胞を30℃で増殖させる。
実施例１Ｂ：発現ベクターpPLMu.hTGF−β１，pPLMu.hTGF−β２及びpPLMu.hTGF−β３の構築並びに TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３それぞれのコード配列（配列表に示す）を NcoＩで消化しておいたプラスミドPGem-5ZF（＋)(Promega)の中にクローニングし、仔牛小腸アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer）で脱リン酸化し、そしてクレノウポリメラーゼ（Gibco-BRL)で補完（フィル・イン）する。得られる構築体をpGKM 125(TGF−β１），pGKM 740(TGF−β２）及びpGKM 126(TGF−β３）と命名し、そしてコンピテントＥ．コリＹ1090細胞を形質転換するのに用いる。 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３をコードする適正なインサートを担持するクローンをそれぞれＥ．コリＹ1090／pGKM 125(TGF−β１），Ｅ．コリＹ1090／pGKM 740(TGF−β２）及びＥ．コリＹ1090／pGKM 126(TGF−β３）と命名する。
【００３５】
Ｅ．コリＹ1090／pGKM 125，Ｅ．コリＹ1090／pGKM 740及びＥ．コリＹ1090／pGKM 126細胞をLB培地の中で増殖させ、そしてプラスミドDNA をBirnboim, H. C. 及びDoly, H. (1979) Nucleic AcidsResearch 7, 1513の方法により調製する。５μｇのプラスミドDNAを50μｌ制限バッファーの中で、 NcoＩと SalＩ(pGKM 125), NcoＩとEcoRＶ(pGKM 740)又は NcoＩ単独(pGKM 126)のいづれかで、供給者（Boehringer）の推奨に従って完全に切断する。DNA を５μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム、100mM のMgCl2 , ５mMのEDTA及び 150μｌのエタノールの添加により沈殿させる。−70℃で15分インキュベートした後、DNA をSorvall 遠心機の中のSS34ローターにおいて13,000ｇで15分の遠心によりペレットにする。上清液を捨て、そしてペレットを0.25％のブロモフェノールブルー及び0.25％のキシレンシアノールを含む80μｌの 0.089Ｍのトリス：ポレート、 0.089Ｍの硼酸及び 0.002ＭのEDTA(TBEバッファー）の中に再懸濁する。20μｌのサンプルを４回、 0.5μｇ／mlのエチジウムブロミドを含むTBE バッファーの中で１％のアガロースゲルを通じて50ボルトにおいて、ブロモフェノールブルーマーカーが長さ10cm厚さ0.8cm のゲルの底に達するまで電気泳動させる。成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３それぞれをコードするDNA フラグメントを短波UV光で可視化し、レーザー刃で切り出し、そしてSchleicher & Schull Biotrap 装置の中で200mamp を1.5 時間適当にゲル断片から電気溶出させる。溶出したDNA フラグメントを沈殿させ（前記参照）、そして20μｌのTEに再懸濁する。
【００３６】
５μｌのプラスミドpPLMu を NcoＩと SalＩ， NcoＩとEcoRＶ、又は NcoＩ単独のいづれかでの消化により線状化し、そしてフラグメントDNA について前述した通りにゲル精製する。100ng の線状化且つ精製したpPLMu ベクターDNA 及び３倍モル当量の対応の精製フラグメントDNA を４℃で15時間、１単位のDNA リガーゼ（Boehringer）を含む20μｌのライゲーションバッファー（70mMのトリス／HCl, pH7.5, 10mMのMgCl2 , ５mMのDTT ，0.1mM のアデノシン−シリン酸）の中でインキュベートする。
【００３７】
10μｌのライゲーション混合物をプラスミドpcl857を担持する 200μｌの低温（４℃）コンピテントＥ．コリLC 137細胞に加える。30分後、細胞を42℃の湯浴の中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックにかける。２mlのLB培地を加え、そしてこの培養物を30℃で60分振盪する。 200μｌのアリコートをアンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上でプレート培養する。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析する。pPLMu 中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３をコードするDNA フラグメントのサブクローニングはプラスミドpPLMu.hTGF−β１，pPLMu.hTGF−β２及びpPLMu.hTGF−β３のそれぞれをもたらす。上記の構築体を含むクローンをそれぞれ、Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３と称する。
【００３８】
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３細胞を熱誘導し（実施例１Ａ参照）、そして発現したタンパク質をSDS-PAGEにより分析する。
【００３９】
TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３は全て熱誘導して２時間後に約12,000Daの見かけ上の分子量で泳動する熱誘導タンパク質として認定される。
実施例１Ｃ：形質転換体の発酵
40mg／ｌのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中のＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２及びＥ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３の一夜培養物を30℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の上記の抗生物質を含むLB培地750ml に加え、そして65℃の湯浴の中で約3.5 分振盪することにより42℃に加熱する。次いでフラスコを42℃のシェーカーに移し、そして３時間インキュベートする。これらのフラスコを氷冷水槽の中で12℃にまで冷やし、そしてGSA ローター(Sorvall）の中で8,000rpmでの10分遠心分離の後に集める。
実施例２：サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)の中での TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３の発現
成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３のコード配列を酵母酸性ホスファターゼの誘導性プロモーター（PH05）のコントロール下でサッカロマイセス・セレビジエの中で発現させる。
【００４０】
発現ベクターは２段階で構築する：
Ａ．プラスミドpJDB 207／PH05−RIT 12の構築、
Ｂ．プラスミド pJDB 207R／PH05− TGF−β１， pJDB 207R／PH05− TGF−β２及び pJDB 207R／PH05− TGF−β３の構築。
【００４１】
ここでＡ）は酵母ベクター及びPH05転写ターミネーターを供し、そしてＢ）はPH05プロモーターのコントロール下にある成熟 TGF−β１， TGF−β２及び TGF−β３のそれぞれをコードするインサートをもつ発現カセットを供する。
実施例２Ａ：プラスミドpJDB 207／PH05−RIT 12の構築
プラスミドp31 RIT 12 (ヨーロッパ特許出願EP277,313)を制限エンドヌクレアーゼ SalＩにより線状化する。エチジウムブロミドの存在下での部分HindIII 消化は、276bp の SalＩ／BamHＩ pBR 322配列、534bp の酵母酸性ホスファターゼPH05プロモーター、酵母インベルターゼシグナル配列（19個のアミノ酸をコード）及びPH05転写ターミネーターを含んで成る１kbの SalＩ／HindIII フラグメントをもたらす。
【００４２】
この１kbのp31 RIT 12の SalＩ／HindIII フラグメントを、 SalＩ及びHindIII で切っておいた酵母−Ｅ．コリシャトルベクターpJD 207 (Beggs, J. D. ：Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, pp.383-389)にクローニングする。この１kbのインサートを含む得られるプラスミドをpJDB 207／PH05−RIT 12と命名する。
実施例２Ｂ：プラスミドpJDB 207R ／PH05− TGF−β３の構築
プラスミドpGKM 740(TGF−β３)(実施例１．Ｇ参照）を NcoＩで切る。その接着末端をクレノウDNA ポリメラーゼによる反応で補完する。EcoRＩリンカー（５′−CCGGAATTCCGG；Biolabs)を加え、そしてその混合物をライゲーションする。得られる環状プラスミドをpGKMA 668 (TGF−β３) と称し、そしてEcoRＩ及び SalＩにより切断する。0.4kb のEcoRＩ／ SalＩフラグメントをアガロースゲルから単離し、精製し、そして滅菌水の中に25μｇ／mlの濃度で再懸濁する。このフラグメントは TGF−β３の成熟コード配列を含み、成熟 TGF−β３のアミノ酸 AlaＩを規定するコドンGCT に対して枠内に(in frame to）ATG を有する。
【００４３】
PH05プロモーターを534bp のBamHＩ／EcoRＩフラグメント上のプラスミドp31 RIT 12（上記参照）から単離する。プラスミドpJD 207 ／PH05−RIT 12をBamHＩ及び XhoＩで切断する。大型の6.8kb のBamHＩ／ XhoＩフラグメントを単離する。PH05転写ターミネーターはフラグメント上に残ったままである。BamHＩ／EcoRＩPH05プロモーターフラグメント、 TGF−β３をコードするEcoRＩ／ SalＩフラグメント、及びBamHＩ／ XhoＩベクターフラグメントをライゲーションする。PH05プロモーターのコントロール下にある TGF−β３遺伝子がpJDB 207の中に反時計方向でクローニングされている一の適正なクローンを pJDB 207R／PH05− TGF−β３と命名する。
【００４４】
似たようにして、成熟 TGF−β１及び TGF−β２をＳ．セレビジエの中で発現させる。 TGF−β１及び TGF−β３のコード配列を含むプラスミドはそれぞれpGKM 125及びpGKM 126である（実施例１．Ｇ参照）。これらのプラスミドを NcoＩで消化し、EcoRＩリンカーを付加し、そしてライゲーションした後、得られる環状プラスミドをEcoRＩ及び SalＩで切断する。EcoRＩ／ SalＩフラグメントを上記の通りにしてpJDB 207R の中にクローニングする。得られるプラスミドを pJDB 207R／PH05− TGF−β１及び pJDB 207R／PH05− TGF−β３と呼ぶ。
実施例２Ｃ：Ｓ．セレビジエ株GRF 18の形質転換
サッカロマイセス・セレビジエ株GRF 18(MATα, his ３−11，his ３−15，leu ２−３，leu −112 ，can R , DSM 3665) を次のプラスミドにより
pJDB 207R／PH05−TGF−β１
pJDB 207R／PH05−TGF−β２
pJDB 207R／PH05−TGF−β３
Hinnen, A.ら（1978) PNAS 75, 1929 に記載の形質転換プロトコールを利用して形質転換させる。
【００４５】
形質転換した酵母細胞をロイシンを欠く酵母最小培地プレート上で選別する。個々の形質転換コロニーを単離し、そして以下の通りに呼ぶ：
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β１
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β２及び
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18／ pJDB 207R／PH05− TGF−β３。
実施例２Ｄ：Ｓ．セレビジエ形質転換体の発酵及び細胞抽出物の調製
上記の酵母形質転換体はPH05プロモーターコントロール式発現カセットを含み、それ故 TGF−β１， TGF−β２又は TGF−β３の発現のためのプロモーターの抑制を必要とする。形質転換体をそれぞれ、アミノ酸は含まないが (NH4)2SO4の代わりに10ｇ／ｌのＬ−アスパラギン、１ｇ／ｌのＬ−ヒスチジン及び20ｇ／ｌのグルコースを含むDifco 酵母窒素ベースの処方に従って調製した酵母高Pi最小培地の中で２段予備培養（10ml及び50ml）で増殖させる。第２予備培養物の細胞を 0.9％のNaClで洗い、そして全ての細胞を、アミノ酸は含まないが0.03ｇ／ｌのKH2PO4，10ｇ／ｌのＬ−アスパラギン、１ｇ／ｌのヒスチジン及び20ｇ／ｌのグルコースを含むDifco 酵母窒素基礎培地の処方に従って調製した100ml の低Pi最小培地に接種するために用いる。この培養物を30℃にて180rpmで撹拌する。
【００４６】
10mlの培養物由来の細胞を５ｈ，24ｈ及び48ｈ目において3000rpm での遠心により集め、そして 0.9％のNaClの中で１回洗う。細胞ペレットを溶解バッファー［66mMのリン酸カリウムpH7.4 ，４mMのZwittergent (Calbiochem)］の中に再懸濁する。８ｇのガラスビーズ（直径 0.5〜0.75mm）を加え、そしてこの懸濁物をVortex Mix上で２分づつ４〜５回低温で強く振盪させる。その細胞抽出物をデカンテーションしてガラスビーズから除去する。抽出物中の細胞破片を3000rpm で４℃にて５分間の遠心により沈降させる。上清液及びペレットを分け、そして−20℃で保存する。
実施例３
実施例３Ａ：Ｅ．コリからの不溶性単量体型 TGF−β３の回収
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３を実施例１Ｃに記載の通りにして発酵させる。細胞破壊及び不溶性 TGF−β３の回収を４℃で実施する。約18ｇのウェット細胞を60mlの 0.1Ｍのトリス／HCl ，10mMのEDTA，１mMのPMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、pH8.3(破壊バッファー）に懸濁する。細胞をフレンチプレス（SLMInstruments, Inc.)にその製造者の仕様書に従って２回通し、そしてその容量を破壊バッファーで200ml にする。その懸濁物を15,000ｇで20分遠心する。得られるペレットを１ＭのNaClを含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の通りに10分遠心する。そのペレットを１％のトリトンＸ−100(Pierce）を含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして再び上記の通りに10分遠心する。洗浄したペレットを次に50mlの20mMのトリス／HCl ，１mMのEDTA，１mMのPMSF、１％のDTT に懸濁し、そしてテフロン（登録商標）製組織グラインダーでホモジナイズする。得られる懸濁物は不溶性形態の粗単量体型 TGF−β３を含む。
実施例３Ｂ：単量体型 TGF−β３の可溶化及び精製
実施例３Ａに従って得られる TGF−β３懸濁物10mlを10％の酢酸でpH2.5 にまで酸性化し、そしてエッペルドルフ遠心機で室温で10分遠心する。その上清液をSephacryl Ｓ−100 カラム（Pharmacia, 2.6×78cm）で、10％の酢酸中で 1.4ml／min の流速においてクロマトグラフィーにかける。（他方、このクロマトグラフィーはSephacryl Ｓ−100 HR (Pharmacia)で行ってよく、そしてカラムは１％の酢酸又は５mMのHCl で流す）。190min〜220minで溶出する単量体型変性 TGF−β３をプールする。この材料を生物活性二量体型 TGF−β３を得るためのフォルディングのために（実施例４）、又は更なる精製及び構造分析のために（実施例３Ｄ）使用する。
実施例３Ｃ：サッカロマイセス・セレビジエからの単量体型 TGF−β３の回収
上記の通りにして実施した500ml 発酵から得られる破壊細胞のペレットを20mlの４Ｍの尿素、 0.1Ｍのトリス、１％のDTT ，pH8.0に懸濁する。この混合物を室温に30分保ち、５分毎に断続的にボルテキシングにかける。不溶性材料を30,000ｇ、30分、40℃の遠心分離により除去し、そしてその上清液を酢酸でpH2.5 に調整し、そして５％の酢酸に対して４℃で一夜かけて徹底的に透析する。その溶液を上記の通りに遠心し、そして清浄な上清液をYM10膜 (Amicon）上での限外濾過により４mlの最終容量となるまで濃縮する。次いでこのサンプルをSephacryl Ｓ−100 HR(Pharmacia）で５％の酢酸において、実施例３Ｂに記載の通りにしてクロマトグラフィーにかけ、単量体型 TGF−β３が得られる。
実施例３Ｄ：RP−HPLCによる単量体型 TGF−β３の更なる精製
Sephacryl Ｓ−100 カラムからのプール画分のアリコート（実施例３Ｂ）をVydac 214 TP 5415 HPLC逆相カラム(4.6×150mm, The Separation Group, Hesperia, CA, USA）で精製する。このカラムを 0.1％のTFA の水溶液70％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液30％との混合物で平衡にし、そしてその生成物を 0.1％のTFA の水溶液55％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液45％との混合物で終了する１ml／min の流速で30分にわたる線状勾配により溶出させる。溶出は216nm での吸収でモニターし、そして個々のピークをUV吸収に従って手動で集める。変性した単量体型 TGF−β３は21.5min で溶出する。分離のために利用する個々の逆相カラムに依存して、同一の TGF−β３の調製品がそれぞれ16min 及び18min 前後で溶出する。
【００４７】
TGF−β３画分を上記と同じカラム及び溶媒系を利用するRP−HPLCにより分析する。 TGF−β３を 0.1％のTFA の水溶液 100％で開始し、このTFA の水溶液30％と0.08％のTFA のアセトニトリル溶液70％との混合物で終了する42min にわたる線状勾配により溶出させる。 TGF−β３は30.4min 後に単一ピークとして溶出する。使用する個々のカラムに依存して、29min 及び29.9min の滞留時間が得られる。
実施例３Ｅ：SDS-PAGEによる単量体型 TGF−β３の分析
Sephacryl Ｓ−100 カラム（実施例３Ｂ）又は逆相カラム（実施例３Ｄ）の個々のアリコートを真空乾燥し、そしてクマジーブルーＲ−250 で染色した15％のポリアクリルアミドスラブゲルでのSDS-PAGEにより分析する。見かけ上分子量約12,000Daの一本のバンドが得られ、これは還元型の天然のブタ TGF−β３と区別でなかった。
実施例３Ｆ：単量体型 TGF−β３のＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例３Ｂ由来の TGF−β３を真空エバポレーションにかけ、25μｌの 0.1Ｍの酢酸に溶かし、そして気相タンパク質シーケンサーモデル 470Ａ（Applied Biosystems）でのアミノ酸配列決定にかける。
【００４８】
Ｎ末端アミノ酸配列は配列表の中のSEQ ID No.に６示すものと同一である。
実施例４： TGF−β３のin vitroフォルディング
上記の通りにして得た TGF−β３を 0.1Ｍのトリス、30mMのCHAPS 、１ＭのNaCl、５mMの還元型グルタチオン及び20％（ｖ／ｖ）のDMSOのそれぞれより成るバッファーの中で４℃にてフォルディングする。バッファーのpHはNaOHでpH9.5 に調整する。 TGF−β３の最終濃度は 0.1mg／mlとする。４℃で７日後、その溶液を濃酢酸でpH3.5 に酸性化し、YM10膜 (Amicon）の付いたAmico 撹拌式セルの中での限外濾過により約10倍濃縮する。その濃縮溶液を 0.1Ｍの酢酸によりもとの容量に希釈し、そして再度濃縮する。この手順を２回繰り返す。次いでこの溶液を実施例５記載の通りにしてイオン交換クロマトグラフィーにかける。
実施例５：カチオン交換クロマトグラフィーによる二量体型生物活性 TGF−β３の単離
約10〜50mgの TGF−β３を含む実施例４において得られる溶液を HiLoad 26／10 S-Sepharose高性能カラム(Pharmacia）に載せる。このカラムをまず20mMの酢酸ナトリウム、30％のイソプロピルアルコール、pH4.0(バッファーＡ）により５分洗い、次いで 0.2ＭのNaClを含むバッファーＡで始まり、そして 0.5ＭのNaClを含むバッファーＡで終わる45分にわたる線状勾配により溶出させる。溶出は280nm でモニターし、そして手動式に分画する。画分を非還元SDS-PAGEにより二量体型 TGF−β３について、及びin vitroバイオアッセイにより生物活性について検定する。
実施例６：二量体型 TGF−β３の更なる精製及び特性決定
実施例６Ａ：HPLCによる精製
二量体型生物活性 TGF−β３を含む画分をプールし、 0.1Ｍの酢酸に対して透析するか又は同容量の 0.1％のTFA 水溶液で希釈し、そしてVydac 214 TP 510カラム（１cm×25cm，The Separations Group, USA）でのRP−HPLCにかける。そのカラムを75％の溶媒Ａ［ 0.1％のTFA 水溶液］及び25％の溶媒Ｂ［0.08％のTFA のアセトニトリル溶液］の混合物により 4.5ml／min の流速で平衡にする。サンプルの添加後、そのカラムを235nm でモニターした吸収が基底値に到達するまで平衡条件下で洗浄する。次いでカラムをこの平衡条件で始まり、そして45％の溶媒Ａと55％の溶媒Ｂの混合物で終わる線状勾配により30分以内で溶出させる。溶出液を手動式に分画し、そして非還元SDS-PAGE及びin vitroバイオアッセイにより分析する。
実施例６Ｂ：SDS-PAGEによる分析
実施例６の精製 TGF−β３のアリコートをそれぞれ真空乾燥し、そしてクマジーブルーＲ−250 で染色する15％のポリアクリルアミドスラブゲルでのSDS-PAGEにより分析する。還元させていないサンプルは約25kDa の見かけ上の分子量の一本のバンドを示し、一方還元サンプルは約12.5kDa においてバンドを示す。
実施例６Ｃ：分子量決定
実施例６Ａ由来の精製 TGF−β３を電子スプレー式イオン化質量分析器 (ESI-MS) により分析する。全質量は理論的に期待される値に非常に近いことがわかる。
実施例６Ｄ：アミノ酸分析
アミノ酸分析はKnecht, R. and Chang, J. -X., Analytical Chemistry 58 ：2375-2379 (1986)に記載の通りに実施する。その結果は理論通りであった。
実施例６Ｅ：Ｎ−末端アミノ酸配列の決定
10〜20μｇの実施例７Ａの TGF−β３を真空エバポレーションし、25μｌの10mMの酢酸に溶かし、そして気相シーケンサーモデル 477Ａ（Applied Biosystems）でのアミノ酸配列決定にかける。最初の10個の残基のアミノ酸配列は理論通りであった。
実施例６Ｆ：Asp-N プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
92mg (6.7mmole）の TGF−β３を還元し、４−ビニルピリジルエチル化し、真空遠心分離で乾かし、そして20mlの５mMのHCl に再溶解する。10mMのZwittergent ３−12界面活性剤（Calbiochem Corporation, La Jolla, CA）を含む200ml の 0.2Ｍのトリス−酢酸バッファーpH7.8 を加え、そしてタンパク質溶液と混合する。切断は２mg（50mlの水に溶解）のエンドプロテイナーゼAsp-N(シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi）突然変異体、Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG 由来）により37℃で実施する。13時間後、50mlの10％（ｖ／ｖ）のTFA を加え、そしてその混合物をVydac 218 TP 5415 カラム(4.6mm×150mm, The Separations Group）での、５〜45％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの 0.1％のTFA溶液／水溶液の 0.1ml／min の流速での40min での線状勾配によるRP−HPLCにより分離させる。単離したペプチドを電子スプレーイオン化質量分析器ESI-MSにより分析する。決定される分子量は予測したAsp-N フラグメントに関する計算値と良好に一致する。
【００４９】
同定されたフラグメントは残基１及び２を除き、完全アミノ酸配列をカバーする。これらのアミノ酸はタンパク質全体のＮ末端配列決定により、及びＶ８フラグメントの分析により同定する。
実施例６Ｇ：Ｖ８プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
実施例９に類似して、Asp-N プロテアーゼにより、４−ビニルピリジル化 TGF−β３をプロテアーゼＶ８により消化し、そしてそのフラグメントをRP−HPLCにより分離し、そしてESI-MSにより分析する。決定される分子量は理論値により一致し、 TGF−β３の同定を実証する。同定されたフラグメントは 112個のアミノ酸残基の全配列をカバーする。
実施例７：フォルディングした TGF−βについてのin vitro活性試験：ミンク肺上皮細胞（Mv−１−Lu）酸性ホスファターゼアッセイ
TGF−β又はハイブリドタンパク質をin vitroで、連続ミンク肺上皮細胞系Mv−１−Lu（ATCC／CCL64)の増殖を阻害する化合物の効能を測定する細胞バイオアッセイでスクリーニングする。Mv−１−Lu細胞系は TGF−βのバイオアッセイにおける高感度なリポーターであると実証されており、シグモイド型の濃度応答を示し、約10〜50pg／mlのリポートEC50を有す（Tuckerら、Science 1984；226 ：705-707 ；Absherら、J. Immunol Methods 1991 ；138 ：301-303；Danielpourら、J. Cell Physiol, 1989 ；138 ：79-86)。増殖が TGF−βにより強く阻害されるMv−１−Lu細胞はこのサイトカインの分析バイオアッセイの開発に最も適する細胞系であると現在考えられている（Kelleyら、Exp Lung Res 1992 ；18：877-887 ；Meager, J. Immunol Methods 1991 ；141 ：1-14) 。アッセイは96穴マイクロタイタープレートの中で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville MD, USA 由来の46継代目においてオリジナル的に得られる細胞を利用して実施する。細胞を TGF−β標準品又はサンプルの希釈系列を含む増殖培地（５％ｖ／ｖ胎児牛血清を有する最小必須培地）の中に低密度（ウェル当り5000細胞）で播種する。次にアッセイを37℃にて多湿５％CO2 インキュベーターの中で72時間インキュベートする。細胞増殖の阻害は高感度酵素的細胞染色法（これは各ウェルの中で産生される酸性ホスファターゼの量の比色換算値を供する）により決定され、染色の強さは各ウェルの中に存在する細胞の数に対応する。各ウェルの吸収O.D.を405nmで決定し、そしてアッセイデーターをプロットし、そして適当なPCソフトウェアプログラムにより分析する。このアッセイにおいて、１単位（Ｕ）の活性はMv−１−Lu細胞増殖の最大阻害の半分に必要な TGF−βの量として記述する。
実施例８：フォルディングした TGF−β３のin vivo 活性試験
実施例８Ａ：老齢マウスにおける部分的に厚みを帯びた創傷の治癒
創傷治癒過程は年齢を追うごとに悪くなることが知られ（GroveG. L. (1982) Arch. Dermatol. Res. 272 ：381)、従って老人医療分野における主たる問題を占める。従って、部分的に厚みを帯びた創傷（II度火傷により生成）の治癒に及ぼすフォルディングした活性二量体型 TGF−β３のin vivo 生物効果を部分欠陥又は損われた創傷修復状況で、即ち老齢動物で、Schultz, G. S.ら（1987) Science 235 ：350 に記載のものと類似する以下のプロトコールを利用して調べる。
【００５０】
１個の中皮熱傷を麻酔したＣ57／BL６マウス（生後 450日以上）（その背中は予め毛剃りしてあり、そして市販クリーム型除毛剤で脱毛しておいた）の背胸部上に、80℃の湯浴に平衡化しておいたしんちゅうテンプレート（１×１cm，８ｇ）の10秒間の適用により施す。得られる水疱を外科的に除去し、そして火傷を５日間にわたり毎日様々な量（500ng, 100ng又は10ng）のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３を含む25μｌの無菌ビヒクルバッファー溶液（10mMのヒスチジン、140mM のNaCl，pH7.4 の溶液中の 0.8％ｗ／ｖのヒドロキシプロピルセルロースより成る）又はバッファーのみの適用により処置するか、又は未処置のままにしておく。局部塗布した材料は無菌、無内毒素がなく、且つ無パイロジェンであり、そしてマウスは全て実験中個別のカゴに入れておいた。各実験グループは５匹の動物より成る。
【００５１】
TGF−β３による処置の５日後、マウスを麻酔し、水疱（あるなら）を火傷から外科的に除去し、そして火傷を写真撮影する。上皮を再生した火傷の領域の外形を均一な厚みの透明オーバーヘッドプロジェクターフィルム上において抽き、そして治癒した各オリジナルの火傷領域の率を面積測定法により算定する。結果を、実験の際に未処置のままにしておいた同一の中皮火傷を負った若齢（生後56〜84日）のＣ57／BL６マウスにおける上皮再生過程とも比較する。
【００５２】
面積測定分析の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３の５日間にわたる毎日の局部塗布が、ビヒクルバッファーのみ又は未処置の創傷と比較したときに、用量依存式に老齢マウスでの部分的に厚みを帯びた創傷の上皮再生を刺激及び加速することを示した。若齢マウスは局部塗布する TGF−β３を全く抜きにして、その創傷を有効に再上皮形成するのに十分に見かけ上有能である。長期分析は、強められた上皮形成過程を、 TGF−β３処置創傷における６日目での再生表皮の角質増殖症を伴って示す。
実施例８Ｂ：成ラットにおける全体に厚みを帯びた創傷の治癒
フォルディングした活性二量体型 TGF−β３の生物効果も創傷修復の第２in vivo モデル、即ち、Mustoe, T. A. ら（1987) Science 237 ：1333に記載のものと類似の以下のプロトコールを利用する成ラットにおける全体に厚みを帯びた創傷（外科的切開により作成）の治癒に基づいて調べる。
【００５３】
１個の全体に厚みを帯びた長さ５cmの直線切開を 1.5cm×２で、背中を予め毛剃りしておき、且つ市販のクリームタイプ除毛剤で脱毛しておいたペントバルビトン麻酔した雄のWistarラット(300〜 350ｇ）の背中線の両側に施す。この実験グループにおいて、左側の切開（背側の最上部から見て）の縁に、様々な量（２mg，１mg，0.1mg 又は0.01mg）のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３を含む無菌ビヒクルバッファー（10mMのヒスチジン、140mM のNaCl，pH7.4 の溶液中の 0.8％ｗ／ｖのヒドロキシプロピルセルロースより成る）の一回の局部塗布(100μｌ）を施す。逆側の右側切開の縁には前記ビヒクルバッファー中の対応の等量の偽薬コントロール（牛血清アルブミン）を施し、そしてコントロール動物における切開の縁においては、左側の切開にはビヒクルバッファーのみを施し、そして右側切開においては外科切開後処置を施しておかない。局部塗布する材料は全て無菌、無内毒素及び無パイロジェンである。各創傷の縁を５−０ Ethilonの５針の均等に施した介在式水平マットレス縫合糸で接合させる。動物は全て個別にカゴに入れ、そして創傷は処置後21日以内の様々な期間にわたり治癒のために放置する。殺した後、背皮全体を各動物から剥ぎ、そして全ての皮下脂肪を外科用メスを用いて各皮膚の下側から慎重に除去する。２本の平行な外科メスより成るテンプレート（刃間の距離は８mm）を引張強さ測定のための皮膚片（各切開上の縫合の間）を切り出すために用いる。サンプルを長期分析のために各切開の一端から採取する。各切り出した皮膚サンプルにより寛容される最大負荷を万能引張強さ装置モデル144501（Zwick, Ulm, FRG)で測定する。測定は、油圧式クランプで固定しておいた、且つ10mm／分の速度で破断点に至るまで延伸した30mm×８mmの片で行い、最大負荷をチャートレコーダーで記録する。測定は各創傷由来の三重測定サンプルで行い、そして実験グループは４匹の動物より成る。感染症又は過剰な出血の徴候を示す創傷（全創傷の３％未満）については破断強さの測定を行わない。
【００５４】
引張強さ測定の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活性二量体型 TGF−β３の一回の局部塗布が、コントロールグループと比較したときに、２倍に至るまで破断強さを強め、そして成ラットの全体に厚みを帯びた切開創傷を21日間にわたり用量依存式で治癒を加速せしめることを実証する。長期分析は、コントロール創傷と比べたとき、21日間にわたり TGF−β３処置した創傷における単核細胞、線維芽細胞の流入、及びコラーゲン産生の著しい増大を示す。一過性の角質増殖症も処置後14日まで TGF−β３処置創傷においても明示される。
実施例９：可溶化単量体型ハイブリド TGF−βタンパク質及び可溶化単量体型 BMP−２の調製
実施例９．１：ハイブリド TGF−β
５mlのプラスミドpPLMu を NcoＩ及び SalＩでの消化により線状にし、そしてフラグメントDNA に関して上記した通りにゲル精製する。100ng の線状化、且つ精製したpPLMu ベクターDNA 、並びに配列表に示すハイブリド TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２のそれぞれをコードする３倍モル当量の対応の精製フラグメントDNA を４℃で15時間、１単位のDNA リガーゼ（Boehringer）を含む20mlのライゲーションバッファー（70mMのトリス−HCl ，pH7.5 ，10mMのMgCl2 ，５mlのDTT 、0.1mM のアデノシン三リン酸）の中でインキュベートする。
【００５５】
10mlのライゲーション混合物をプラスミドpcL857を担持する200ml の低温（４℃）コンピテントＥ．コリLC 137細胞）に加える。30分後、細胞を42℃の湯浴の中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックせしめる。２mlのLB培地を加え、そしてその培養物を30℃で60min 振盪する。 200μｌのアリコートをアンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上にプレートし、そして30℃で22ｈインキュベートする。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析する。pPLMu の中での TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２をコードするDNA フラグメントのサブクローニングはプラスミド pPLMu.TGF−β１（44／45）β３， pPLMu.TGF−β２（44／45）β３及び pPLMu.TGF−β３（44／45）β２のそれぞれをもたらす。上記の構築体を含むクローンをＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３とそれぞれ呼ぶ。
【００５６】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３を以下の通り（実施例３Ａも参照のこと）に熱誘導し、そして発現したタンパク質をSDS-PAGEにより分析する。 TGF−β１−３， TGF−β２−３及び TGF−β３−２は全て、熱誘導して２ｈ後に熱誘導化、タンパク質として出現し、約12,000Daの見かけ上の分子量をもって泳動した。
【００５７】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３，Ｅ．コリLC 137／pPLMu.TGF −β２（44／45）β３及びＥ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β３（44／45）β３の、40mg／ｌのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の一夜培養物を30℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を２ｌのエーレンマイヤーフラスコ中の上記の抗生物質を含む750mlのLB培地に加え、そして65℃の湯浴の中で約3.5 分振盪することにより42℃に加熱する。次いでこのフラスコを42℃のシェーカーに移し、そして３ｈインキュベートする。このフラスコを氷冷水槽の中で12℃に冷却し、そして細胞をGSA ローター(Sorvall）の中での8000rpm での10分の遠心分離により集める。
【００５８】
単量体型可溶化 TGF−β１−３ハイブリドの製造のための下記の手順も TGF−β２−３及び TGF−β３−２の可溶化に適用する。
【００５９】
Ｅ．コリLC 137／ pPLMu.TGF−β１（44／45）β３細胞を上記の通りに発酵させ、そして封入体を下記の通りにして調製する。細胞破壊及び封入体の回収は４℃で行う。約18ｇのウェット細胞を60mlの 0.1Ｍのトリス／HCl ，10mMのEDTA，１mMのPMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、pH8.3(破壊バッファー）の中に懸濁する。この細胞をフレンチプレス(SLM Instruments, Inc.）にその製造者の仕様書に従って２回通し、そしてその容量を破壊バッファーで200ml にする。その懸濁物を15,000ｇで20分遠心する。得られるペレットを１ＭのNaClを含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の通りに10分遠心する。そのペレットを１％のトリトンＸ−100(Pierce）を含む、100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして再び上記の通りに10分遠心する。
【００６０】
0.3ｇの洗浄ペレットを10mlの20mMのトリス／HCl ，１mMのEDTA，１mMのPMSF， 0.1％のDTT ，pH8.0 に懸濁し、そして室温で１ｈ磁気撹拌する。そのサンプルを濃酢酸でpH2.5 にし、そしてテフロン（登録商標）製組織ホモジナイザーでホモジナイズし、そしてCentricon H-401 遠心機(Kontron Instruments）の中で固定角ローターＡ．８．24を用い、60min ，15℃，12,000rpm で遠心する。透明な上清液の酢酸をYM05フィルターの付いたAmicon 8010 撹拌式セルの中で10mMのHCl により、繰り返し濃縮及び10mMのHCl によるその溶液の希釈により変換する。
実施例９．２： BMP
Ｎ末端配列Ｑ−Ａ−Ｋ−Ｈ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｋ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｒ−Ｈを有するWozneyら、Science 242 ：1528-1534(1988)に記載の BMP−２（本来の名称＝ BMP−２Ａ）の成熟形成を含む封入体を慣用の方法に従い、Ｔ７ポリメラーゼ発現系を有するＥ．コリの中で調製する。発現のために用いる BMP−２ DNAを配列表の中のSEQ ID No.13で示す。組換 BMP−２はＮ末端に追加のメチオニンを有す。第２の手法において、 BMP−２の突然変異体、即ち（−Ｑ１)BMP−２を作った。これは第１アミノ酸が欠失し、且つメチオニンがＮ末端にないことを除き上記と同一のタンパク質である。
【００６１】
10mMの BMP−２又は（−Ｑ１)BMP−２封入体懸濁物を10％の酢酸でpH2.5 に酸性化し、そしてエッペンドルフ遠心機で室温で10min遠心する。この上清液をSephacryl Ｓ−100 カラム（Pharmacia, 2.6×78cm）で10％の酢酸中で 1.4ml／min の流速でクロマトグラフィーにかける。単量体型の変性 BMP−２を含む画分をプールする。プールした材料を以下のリフォルディング実験に利用する。
実施例10：種々の TGF−β及び TGF−β−ハイブリド及び BMP−２による一連のリフォルディング実験
本発明の多様性及び広範囲の適用性は以下の一連の実施例にまとめた結果により例示される。in vitroタンパク質リフォルディング実験に利用した特定の条件及び個々のタンパク質を列挙する。その他の実験条件は実施例４に記載の通りである。生物活性はin vitroタンパク質フォルディングを開始してから３及び７日後に決定した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
GSH ： 還元型グルタチオン
DMSO： ジメチルスルホキシド
DMSO2 ： ジメチルスルホン
BMP −２：追加のＮ末端メチオニンを有する BMP−２
（−Ｑ１)BMP−２：Ｎ末端グルタミンを欠く BMP−２
β３： TGF−β３
活性： ＋：Takuwa Y. ら（1991) Biochemical and Biophysical Research Communication Vol. 174, 96-101,「Bone Morphogenetic Protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultered osteoblastic cells, MC3T3-E1 」記載のin vitroバイオアッセイ又はクロマトグラフィー及び電気泳動のいづれかにより決定される、実施例７に記載のin vitroバイオアッセイにおいての TGF−βの中程の活性、又はフォルディングした BMP−２及び（−Ｑ１)BMP−２の形成。
微生物の寄託
以下の微生物はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig (FRG)に寄託してある：
微生物 寄託日 受託番号
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β１ 1989年11月28日 DSM 5656
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β２ 1989年11月28日 DSM 5657
Ｅ．コリLC 137／pPLMu.hTGF−β３ 1989年11月28日 DSM 5658
サッカロマイセス・セレビジエGRF18 1986年３月４日 DSM 3665
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二量体型生物活性β型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質又はその塩の製造のための方法であって、前記 TGF−β様タンパク質の変性単量体を、この単量化型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって二量化後に生物活性に結びつくようなコンホメーションにフォルディングせしめ、しかもこの単量体を可溶性形態に保っておくような温和な界面活性剤と、DMSO, DMSO2, DMF 、並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記バッファーが還元物質を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記温和な界面活性剤がジジトニン、CHAPS, CHAPSO 、並びにジジトニン、CHAPS 及びCHAPSOより成る群の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記温和な界面活性剤がCHAPS, CHAPSO 及び任意のそれらの混合物より成る群から選ばれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記温和な界面活性剤が約１〜100mM の濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記温和な界面活性剤が約30〜60mMの濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記温和な界面活性剤が約30mMの濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒がDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒を約５％〜約40％の濃度において使用する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒を約10％〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
DMSOを約10％〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
DMSOを約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
DMF を約10〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
DMF を約10％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
DMSO2 を約10％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
DMSOとDMF との混合物を合わせた双方の溶媒について10〜30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
前記 TGF−β様タンパク質が、 TGF−β２， TGF−β３、ハイブリド TGF−β１−２、ハイブリド TGF−β１−３、ハイブリド TGF−β２−３、ハイブリド TGF−β３−２及び BMP−２より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１８】
前記 TGF−β様タンパク質が TGF−β３である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記バッファーが約６〜約10のpHを有する、請求項１又は２のいづれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記バッファーが約０℃〜約40℃の温度を有する、請求項１又は２のいづれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記還元物質が還元型スルフヒドリル化合物である、請求項２記載の方法。
【請求項２２】
前記還元型スルフヒドリル化合物が還元型のグルタチオン、還元型のβ−メルカプトエタノール、還元型のメルカプトメタノール、システイン、システアミン及び還元型のジチオスレイトールより成る群から選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項２３】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約１〜約100mM の濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【請求項２４】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約１〜約10mMの濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【請求項２５】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約2.5mM の濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【請求項１】
二量体型生物活性β型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β）様タンパク質又はその塩の製造のための方法であって、前記 TGF−β様タンパク質の変性単量体を、この単量化型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって二量化後に生物活性に結びつくようなコンホメーションにフォルディングせしめ、しかもこの単量体を可溶性形態に保っておくような温和な界面活性剤と、DMSO, DMSO2, DMF 、並びにDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群のうちの２又は３種の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記バッファーが還元物質を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記温和な界面活性剤がジジトニン、CHAPS, CHAPSO 、並びにジジトニン、CHAPS 及びCHAPSOより成る群の構成員の任意の混合物より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記温和な界面活性剤がCHAPS, CHAPSO 及び任意のそれらの混合物より成る群から選ばれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記温和な界面活性剤が約１〜100mM の濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記温和な界面活性剤が約30〜60mMの濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記温和な界面活性剤が約30mMの濃度において前記フォルディングバッファーの中に存在している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒がDMSO, DMSO2 及びDMF より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒を約５％〜約40％の濃度において使用する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒を約10％〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
DMSOを約10％〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
DMSOを約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
DMF を約10〜約30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
DMF を約10％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
DMSO2 を約10％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
DMSOとDMF との混合物を合わせた双方の溶媒について10〜30％の濃度において使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
前記 TGF−β様タンパク質が、 TGF−β２， TGF−β３、ハイブリド TGF−β１−２、ハイブリド TGF−β１−３、ハイブリド TGF−β２−３、ハイブリド TGF−β３−２及び BMP−２より成る群から選ばれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１８】
前記 TGF−β様タンパク質が TGF−β３である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記バッファーが約６〜約10のpHを有する、請求項１又は２のいづれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記バッファーが約０℃〜約40℃の温度を有する、請求項１又は２のいづれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記還元物質が還元型スルフヒドリル化合物である、請求項２記載の方法。
【請求項２２】
前記還元型スルフヒドリル化合物が還元型のグルタチオン、還元型のβ−メルカプトエタノール、還元型のメルカプトメタノール、システイン、システアミン及び還元型のジチオスレイトールより成る群から選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項２３】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約１〜約100mM の濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【請求項２４】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約１〜約10mMの濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【請求項２５】
前記還元型スルフヒドリル化合物を約2.5mM の濃度において使用する、請求項２記載の方法。
【公開番号】特開２００７−３１４５３（Ｐ２００７−３１４５３Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０４２９５（Ｐ２００６−３０４２９５）
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【分割の表示】特願平８−５０５４００の分割
【原出願日】平成７年７月１２日（１９９５．７．１２）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【分割の表示】特願平８−５０５４００の分割
【原出願日】平成７年７月１２日（１９９５．７．１２）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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