生物学的製剤治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者の選択方法
【課題】生物学的製剤による治療が有効なリウマチ患者を選択する方法を提供すること。
【解決手段】リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することができる。
【解決手段】リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的製剤治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者の選択方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチの治療は一般に、抗炎症剤とリウマチ治療薬（ＤＭＡＲＤ）を組み合わせることにより行われており、リウマチ治療薬として、種々の免疫調節剤、免疫抑制剤、生物学的製剤が既に臨床で使用されている。リウマチ治療薬の例としては、例えばＩＬ−１阻害剤、ＳＴＡＴ−３阻害剤、ＩＬ−６ワクチン、ＩＬ−６融合タンパク、ＩＬ−６阻害剤、ＴＮＦ−α阻害剤、ＩＬ−１５阻害剤、ＩＬ−１７阻害剤、抗ＣＤ２０抗体、２−ペニシルアミン誘導体、Ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｔ細胞副刺激モジュレーター、ＡＰ−１阻害剤、リポポリサッカライド結合タンパク（ＬＢＰｓ）、補体阻害剤、プロテイン（ｐ３８）キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ３阻害剤、リピッドＡアナログ、メラニンアナログ、抗ＩＬ−６受容体抗体（特許文献１）などが挙げられる。しかしながら、これらのリウマチ治療薬による治療効果は個々の患者によって異なり、治療に抵抗性の患者や効果が十分に得られない患者も存在する。
【０００３】
近年、関節リウマチ、膠原病等の自己免疫疾患等の治療戦略は、生物学的製剤による抗サイトカイン療法の登場により劇的に変化しているが、これらのリウマチ治療用生物学的製剤の使い分けについて明確な指針はない。さらに、生物学的製剤は、非常に高価な薬剤であり、医療経済的にも、生物学的製剤による治療が有効な関節リウマチ患者を選択し得る方法の確立が求められている。例えば、特許文献２には、関節リウマチ患者の治療予後予測方法が開示されている。また、特許文献３には、リウマチ治療剤の効果の予測方法が開示されている。しかし、いずれの方法も実用化には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９６／１１０２０号
【特許文献２】国際公開第２００８／０１６１３４号
【特許文献３】特開２００９−０９２５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生物学的製剤による治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする方法。
［２］リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量と比較することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］生物学的製剤が、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤である前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＩＬ−６阻害剤が抗ＩＬ−６受容体抗体であり、Ｔ細胞活性化阻害剤がＴ細胞副刺激モジュレーターである前記［３］に記載の方法。
［５］生物学的製剤が、トシリズマブまたはアバタセプトである前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］リウマチ膠原病性疾患が、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病である前記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］試料が末梢血単核球である前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］生物学的製剤による治療を開始した後に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生物学的製剤による治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）は被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と健康ボランティアのＦｏｘｐ３発現量を比較した図であり、（Ｂ）は被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＣＴＬＡ−４発現量と健康ボランティアのＣＴＬＡ−４発現量を比較した図である。
【図２】被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値の相関を示す図である。
【図３】被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値の相関を示す図である。
【図４】被験リウマチ膠原病性疾患患者１７例を、３種類の変数を用いて２つのクラスター（グループＡおよびグループＢ）に分けた結果を示した図であり、（Ａ）はトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量、（Ｂ）は罹病期間、（Ｃ）は年齢について示した図である。
【図５】グループＡおよびＢのトシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後におけるＭＭＰ−３値を比較し、ｔ−検定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供する。
【００１０】
リウマチ膠原病性疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、多発筋炎、全身性強皮症、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、ウエゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、混合性結合織病、リウマチ性多発筋痛症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、反応性関節炎、再発性多発軟骨炎、ＲＳ３ＰＥ症候群、成人スティル病、変形性関節症、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、ＡＡアミロイドーシス、強直性脊椎炎、後天性血友病などが挙げられる。好ましくは、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病であり、より好ましくは、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症またはＲＳ３ＰＥ症候群であり、特に好ましくは関節リウマチである。
【００１１】
Ｆｏｘｐ３（forkhead box P3）は，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞に特異的な転写因子として知られている。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、活性化したＴ細胞で発現し、Ｔ細胞による免疫応答を収束に向かわせる細胞表面タンパク質として知られ、Ｆｏｘｐ３を発現した制御性Ｔ細胞の働きに必須であることが報告されている（Wing Kら、Science 2008）。したがって、試料としてはリンパ球を含む試料を好適に用いることができる。リンパ球を含む試料であれば特に限定されないが、血液由来の試料が好ましく、より好ましくは末梢血単核球（以下「ＰＢＭＣ」ともいう。）である。ＰＢＭＣは、公知の方法で取得することができる。例えば、市販の血球分離溶液を用いることにより全血から分離し、取得することができる。
【００１２】
発現量の測定は、試料中のタンパク質量を測定してもよく、ｍＲＮＡ量を測定してもよい。例えば、試料としてＰＢＭＣを用いる場合、ＰＢＭＣ中のＦｏｘｐ３タンパク質量またはＣＴＬＡ−４タンパク質量は、公知の方法でＰＢＭＣからタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ＰＢＭＣ中のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ量またはＣＴＬＡ−４ｍＲＮＡ量は、公知の方法でＰＢＭＣからＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法または定量ＲＴ−ＰＣＲ法であり、より好ましくは定量ＲＴ−ＰＣＲ法である。
【００１３】
Ｆｏｘｐ３およびＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列およびコードする遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。例えば、ヒトＦｏｘｐ３のtranscript variant 1 の塩基配列はACCESSION: NM_014009、その翻訳物（431aa）はACCESSION: NP_054728、ヒトＦｏｘｐ３のtranscript variant 2 の塩基配列はACCESSION: NM_001114377、その翻訳物（396aa）はACCESSION: NP_001107849 である。また、例えば、ヒトＣＴＬＡ−４のtranscript variant 1 の塩基配列はACCESSION: NM_005214 XM_001129541 XM_001129550 XM_001129561、その翻訳物（223aa）はACCESSION: NP_005205 XP_001129541 XP_001129550 XP_001129561、ヒトＣＴＬＡ−４のtranscript variant 2 の塩基配列はACCESSION: NM_001037631、その翻訳物（174aa）はACCESSION: NP_001032720 である。
【００１４】
生物学的製剤は、リウマチ膠原病性疾患の治療に有用と考えられる生物学的製剤であればよく、特に限定されない。例えば、現在リウマチ膠原病性疾患の治療薬として臨床使用されている生物学的製剤が挙げられる。具体的には、例えば、抗ＴＮＦ抗体、ＴＮＦ受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体、ＣＴＬＡ−４と免疫グロブリンの融合タンパク質などが挙げられる。本発明に好適な生物学的製剤としては、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤が挙げられる。
ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤は、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害するものであれば限定されないが、抗ＩＬ−６受容体抗体が好ましい。なかでもヒト化抗ＩＬ−６受容体抗体として臨床使用されているトシリズマブ（商品名：アクテムラ）が好ましい。
Ｔ細胞活性化阻害剤はＴ細胞の活性化を阻害するものであれば限定されないが、Ｔ細胞副刺激モジュレーターが好ましく、なかでもヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインより構成された可溶性融合タンパク質であるアバタセプト（商品名：オレンシア）が好ましい。
【００１５】
本発明者は、トシリズマブ治療を開始する前のリウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後の患者のＭＭＰ−３（マトリックスメタロプロティナーゼ−３）値が有意に相関することを見出した。具体的には、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が低く、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が低い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が高いことを見出した。すなわち、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い患者は、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いと推定できる。したがって、トシリズマブによる治療を開始する前にＦｏｘｐ３発現量を測定することにより、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することが可能となる。
【００１６】
リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量の高低は、例えば、蓄積された背景データに基づいて任意の基準値を設けて判定することができる。また、例えば、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量と比較して判定することができる。好ましくは、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量と比較して判定することである。健常者は、慢性疾患に罹患していない成人が好ましく性別は問わない。高齢でないこと（例えば２０代〜３０代）がより好ましい。健常者のＦｏｘｐ３の発現量は、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料と同様の方法で同一部位から採取した試料を用い、同一の測定方法を用いて測定することが好ましい。また、健常者のＦｏｘｐ３の発現量は、複数の健常者の平均値を用いることが好ましく、多数の健常者のＦｏｘｐ３の発現量を蓄積した背景データの平均値を用いることがより好ましい。
健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より高い場合に、リウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３の発現量が高いと判定することができる。好ましくは健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より１．５倍以上高い場合、より好ましくは健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より２倍以上高い場合にリウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３の発現量が高いと判定する。
【００１７】
本発明の方法は、
「生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有することを特徴とする方法。
（ａ）生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定する工程
（ｂ）（ａ）で得られたＦｏｘｐ３の発現量を健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３発現量と比較する工程
（ｃ）健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３発現量よりＦｏｘｐ３発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する工程」と表現することができる。
また、生物学的製剤による治療を開始する前にＦｏｘｐ３の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法は、生物学的製剤による治療を開始する前にＦｏｘｐ３の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療の予後を予測する方法と換言することができる。
【００１８】
現在の関節リウマチ治療の基本戦略は、早期に生物学的製剤を用いて介入し、骨関節変形を予防していくことである。これをＷｉｎｄｏｗｓ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙと呼んでいる。生物学的製剤が奏功すれば、将来的に様々なリウマチ薬を中止することが可能となり、緩解治癒も望める状況となっている。加えて、生物学的製剤は、離職率、休職率を改善させ、社会問題の解決にもつながることが明らかになっている。しかしながら、生物学的製剤は非常に高価な薬剤であり、医療経済状況を考慮すれば、関節リウマチ患者全例に導入することは困難である。また、ＴＮＦ阻害剤などは、各種の大規模試験によるエビデンスによれば、関節リウマチの治療判定基準であるＡＣＲ２０の改善率は約６０％と報告されている。トシリズマブでも７０〜８０％前後と報告されている。つまり、それだけ高価な薬剤でありながら、すべての患者に効果があるとは限らない状況である。
このような状況下において、本願発明は、疾患活動性が高い患者に、生物学的製剤を導入するべきかどうかを選択する際の参考として用いることができ、リウマチ膠原病性疾患患者のＱＯＬや医療経済状況を改善していくうえで非常に有用であると考えられる。
【００１９】
本発明者は、トシリズマブ治療開始から６か月後のリウマチ膠原病性疾患患者のＣＴＬＡ−４発現量とトシリズマブ治療開始６か月後の患者のＭＭＰ−３値が有意に相関することを見出した。具体的には、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が高い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が低く、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が低い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が高いことを見出した。すなわち、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が高い患者は、その時点において、それまでのトシリズマブによる治療が有効であり、その後も有効である蓋然性が高いと推定できる。したがって、トシリズマブによる治療開始後にＣＴＬＡ−４発現量を測定することにより、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することが可能となる。治療開始後は、好ましくは４か月以上経過後、より好ましくは５か月以上経過後、さらに好ましくは６か月以上経過後である。
【００２０】
ＣＴＬＡ−４発現量の高低の判定は、上記Ｆｏｘｐ３発現量の判定と同様に行うことができる。すなわち、健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より高い場合、好ましくは健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より１．５倍以上高い場合、より好ましくは健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より２倍以上高い場合に、リウマチ膠原病性疾患患者のＣＴＬＡ−４の発現量が高いと判定する。
【００２１】
本発明の方法は、
「生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、以下の（ｄ）〜（ｆ）の工程を有することを特徴とする方法。
（ｄ）生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定する工程
（ｅ）（ｄ）で得られたＣＴＬＡ−４の発現量を健常者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４発現量と比較する工程
（ｆ）健常者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４発現量よりＣＴＬＡ−４発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する工程」と表現することができる。
また、生物学的製剤による治療を開始した後にＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法は、生物学的製剤による治療を開始した後にＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、測定時におけるリウマチ膠原病性疾患の活動性を評価する方法と換言することができる。
【００２２】
リウマチ膠原病疾患において、疾患の活動性は、例えばＭＭＰ−３、ＣＲＰ、ＤＡＳ２８等を指標として評価されるリウマチの状態を意味する。ＭＭＰ−３は、関節破壊の程度を反映する。ＣＲＰは炎症の強さを反映する。ＤＡＳ２８は、関節リウマチ全体の活動性を示すもので、２８関節を対象に腫脹関節、疼痛関節を評価し、血沈、患者の自覚を示すＶＡＳを組み合わせて計算して示されるものである。
【００２３】
ＤＡＳ２８は、簡便で、関節リウマチの活動性をよく反映するが、評価者により評価が異なる場合があること、患者の自覚症状が患者によってばらつきを示すこと等によって、過大評価や過小評価され得るという問題がある。そこで、リウマチ膠原病性疾患治療、特に関節リウマチ治療においては、疾患活動性を簡便に、かつ再現性良く評価する検査法が望まれている。特に、生物学的製剤を導入した患者において必要性が高い。
このような状況下において、本願発明は、測定時におけるリウマチ膠原病性疾患の活動性評価の参考として用いることができ、リウマチ膠原病性疾患患者のＱＯＬや医療経済状況を改善していくうえで非常に有用であると考えられる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（１）被験患者およびサンプリング
トシリズマブ治療を開始していないリウマチ膠原病性疾患患者１７例（関節リウマチ：１５例、リウマチ性多発筋痛症：１例、ＲＳ３ＰＥ：１例）を被験患者とした。被験患者から、トシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後の３回採血し、定法によりＰＢＭＣからｃＤＮＡを調製した。また、健康ボランティア２１名から同様にＰＢＭＣ由来のｃＤＮＡを得た。
【００２６】
（２）測定因子
ＩＬ−１β、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲＣ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−６、β−ａｃｔｉｎ、β２Ｍおよび１８Ｓ−ＲＮＡの２４種類の因子について、リウマチ膠原病性疾患患者と健康ボランティアとの発現量の差を測定した。測定には、上記２４種類の測定が可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ（applied biosystems）を使用した。
ストックしたサンプル７２検体分を９枚のアレイを用いて測定し、ΔΔＣｔ法を用いて同時解析した。発現補正としてβ−ａｃｔｉｎを選択し、ある健康ボランティアの発現量を仮の１として健康ボランティアの平均を算出した。得られた健康ボランティアの平均発現量を真の１としてリウマチ膠原病性疾患患者の発現量を算出した。
【００２７】
（３）被験患者と健康ボランティアとの測定因子発現量の比較
トシリズマブ治療開始前の被験患者における上記測定因子の発現量を健康ボランティアの発現量と対比した。
その結果、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、Ｆｏｘｐ３およびＣＴＬＡ−４において、被験患者と健康ボランティアとの間に有意差が認められた。なお、有意差検定には不等分散の場合のｔ検定（アスピン・ウェルチ）を用いた。
【００２８】
（４）測定因子と臨床パラメータとの多変量解析
被験患者から得られた臨床パラメータ（ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質、ＭＭＰ-３：マトリックスメタロプロティナーゼ３、ＤＡＳ−２８ＣＲＰ：関節リウマチの疾患活動性の評価、等）との相関性を、ＪＭＰ８．０ソフトウェア（SAS Institute）を用いて解析した。
【００２９】
その結果、図２に示すように、被験患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値に有意な相関（相関係数：−０．５６３７、ｐ＝０．０１８４）が認められた。この結果から、トシリズマブ治療開始前におけるＦｏｘｐ３発現量が低いリウマチ膠原病性疾患患者より、Ｆｏｘｐ３発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者のほうが、トシリズマブ治療が有効である可能性が高いことが明らかとなった。つまり、リウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３発現量を測定することにより、トシリズマブ治療が有効である可能性が高い患者を選択できることが示された。
【００３０】
また、図３に示すように、被験患者のトシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値に有意な相関（相関係数：−０．５７３５、ｐ＝０．０１６１）が認められた。この結果から、トシリズマブ治療開始後においてＣＴＬＡ−４発現量の高い患者はリウマチの活動性が低く、逆にＣＴＬＡ−４発現量の低い患者はリウマチの活動性が高いことが明らかとなった。つまり、トシリズマブ治療中の患者のＣＴＬＡ−４発現量を測定することにより、その時点におけるトシリズマブ治療効果の高い患者を選択することができる。
【００３１】
（５）クラスター分析
被験患者１７例について、ＪＭＰ８．０ソフトウェアを用い、変数として年齢、罹病期間およびトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量の３変数を選択することにより、グループＡ（９例）およびグループＢ（８例）の２つのクラスターに分かれた。
図４（Ａ）〜（Ｃ）に、各変数についての各グループの分布を示した。（Ａ）はトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量、（Ｂ）は罹病期間、（Ｃ）は年齢である。グループＡは、Ｆｏｘｐ３発現量が低く、罹病期間が短く、年齢が高い傾向を示した。グループＢは、Ｆｏｘｐ３発現量が高く、罹病期間および年齢は広範囲にばらつきがある傾向をし示した。
【００３２】
各グループのトシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後におけるＭＭＰ−３値に注目し、各時期の両グループのＭＭＰ−３値についてｔ−検定を行った。結果を図５に示した。トシリズマブ治療開始３か月後および６か月後のＭＭＰ−３値は、グループＡとＢとの間に有意差が認められた。この結果は、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い傾向のグループＢのほうが、トシリズマブ治療により３か月後および６か月後のＭＭＰ−３値が低くなることを示すものであり、トシリズマブ治療開始前においてＦｏｘｐ３発現量の高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択すれば、トシリズマブ治療が有効である可能性が高いことが裏付けられた。
【００３３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的製剤治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者の選択方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチの治療は一般に、抗炎症剤とリウマチ治療薬（ＤＭＡＲＤ）を組み合わせることにより行われており、リウマチ治療薬として、種々の免疫調節剤、免疫抑制剤、生物学的製剤が既に臨床で使用されている。リウマチ治療薬の例としては、例えばＩＬ−１阻害剤、ＳＴＡＴ−３阻害剤、ＩＬ−６ワクチン、ＩＬ−６融合タンパク、ＩＬ−６阻害剤、ＴＮＦ−α阻害剤、ＩＬ−１５阻害剤、ＩＬ−１７阻害剤、抗ＣＤ２０抗体、２−ペニシルアミン誘導体、Ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｔ細胞副刺激モジュレーター、ＡＰ−１阻害剤、リポポリサッカライド結合タンパク（ＬＢＰｓ）、補体阻害剤、プロテイン（ｐ３８）キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ３阻害剤、リピッドＡアナログ、メラニンアナログ、抗ＩＬ−６受容体抗体（特許文献１）などが挙げられる。しかしながら、これらのリウマチ治療薬による治療効果は個々の患者によって異なり、治療に抵抗性の患者や効果が十分に得られない患者も存在する。
【０００３】
近年、関節リウマチ、膠原病等の自己免疫疾患等の治療戦略は、生物学的製剤による抗サイトカイン療法の登場により劇的に変化しているが、これらのリウマチ治療用生物学的製剤の使い分けについて明確な指針はない。さらに、生物学的製剤は、非常に高価な薬剤であり、医療経済的にも、生物学的製剤による治療が有効な関節リウマチ患者を選択し得る方法の確立が求められている。例えば、特許文献２には、関節リウマチ患者の治療予後予測方法が開示されている。また、特許文献３には、リウマチ治療剤の効果の予測方法が開示されている。しかし、いずれの方法も実用化には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９６／１１０２０号
【特許文献２】国際公開第２００８／０１６１３４号
【特許文献３】特開２００９−０９２５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生物学的製剤による治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする方法。
［２］リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量と比較することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］生物学的製剤が、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤である前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＩＬ−６阻害剤が抗ＩＬ−６受容体抗体であり、Ｔ細胞活性化阻害剤がＴ細胞副刺激モジュレーターである前記［３］に記載の方法。
［５］生物学的製剤が、トシリズマブまたはアバタセプトである前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］リウマチ膠原病性疾患が、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病である前記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］試料が末梢血単核球である前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］生物学的製剤による治療を開始した後に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生物学的製剤による治療が有効なリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）は被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と健康ボランティアのＦｏｘｐ３発現量を比較した図であり、（Ｂ）は被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＣＴＬＡ−４発現量と健康ボランティアのＣＴＬＡ−４発現量を比較した図である。
【図２】被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値の相関を示す図である。
【図３】被験リウマチ膠原病性疾患患者のトシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値の相関を示す図である。
【図４】被験リウマチ膠原病性疾患患者１７例を、３種類の変数を用いて２つのクラスター（グループＡおよびグループＢ）に分けた結果を示した図であり、（Ａ）はトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量、（Ｂ）は罹病期間、（Ｃ）は年齢について示した図である。
【図５】グループＡおよびＢのトシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後におけるＭＭＰ−３値を比較し、ｔ−検定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法を提供する。
【００１０】
リウマチ膠原病性疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、多発筋炎、全身性強皮症、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、ウエゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、混合性結合織病、リウマチ性多発筋痛症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、反応性関節炎、再発性多発軟骨炎、ＲＳ３ＰＥ症候群、成人スティル病、変形性関節症、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、ＡＡアミロイドーシス、強直性脊椎炎、後天性血友病などが挙げられる。好ましくは、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病であり、より好ましくは、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症またはＲＳ３ＰＥ症候群であり、特に好ましくは関節リウマチである。
【００１１】
Ｆｏｘｐ３（forkhead box P3）は，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞に特異的な転写因子として知られている。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、活性化したＴ細胞で発現し、Ｔ細胞による免疫応答を収束に向かわせる細胞表面タンパク質として知られ、Ｆｏｘｐ３を発現した制御性Ｔ細胞の働きに必須であることが報告されている（Wing Kら、Science 2008）。したがって、試料としてはリンパ球を含む試料を好適に用いることができる。リンパ球を含む試料であれば特に限定されないが、血液由来の試料が好ましく、より好ましくは末梢血単核球（以下「ＰＢＭＣ」ともいう。）である。ＰＢＭＣは、公知の方法で取得することができる。例えば、市販の血球分離溶液を用いることにより全血から分離し、取得することができる。
【００１２】
発現量の測定は、試料中のタンパク質量を測定してもよく、ｍＲＮＡ量を測定してもよい。例えば、試料としてＰＢＭＣを用いる場合、ＰＢＭＣ中のＦｏｘｐ３タンパク質量またはＣＴＬＡ−４タンパク質量は、公知の方法でＰＢＭＣからタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ＰＢＭＣ中のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ量またはＣＴＬＡ−４ｍＲＮＡ量は、公知の方法でＰＢＭＣからＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法または定量ＲＴ−ＰＣＲ法であり、より好ましくは定量ＲＴ−ＰＣＲ法である。
【００１３】
Ｆｏｘｐ３およびＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列およびコードする遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。例えば、ヒトＦｏｘｐ３のtranscript variant 1 の塩基配列はACCESSION: NM_014009、その翻訳物（431aa）はACCESSION: NP_054728、ヒトＦｏｘｐ３のtranscript variant 2 の塩基配列はACCESSION: NM_001114377、その翻訳物（396aa）はACCESSION: NP_001107849 である。また、例えば、ヒトＣＴＬＡ−４のtranscript variant 1 の塩基配列はACCESSION: NM_005214 XM_001129541 XM_001129550 XM_001129561、その翻訳物（223aa）はACCESSION: NP_005205 XP_001129541 XP_001129550 XP_001129561、ヒトＣＴＬＡ−４のtranscript variant 2 の塩基配列はACCESSION: NM_001037631、その翻訳物（174aa）はACCESSION: NP_001032720 である。
【００１４】
生物学的製剤は、リウマチ膠原病性疾患の治療に有用と考えられる生物学的製剤であればよく、特に限定されない。例えば、現在リウマチ膠原病性疾患の治療薬として臨床使用されている生物学的製剤が挙げられる。具体的には、例えば、抗ＴＮＦ抗体、ＴＮＦ受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体、ＣＴＬＡ−４と免疫グロブリンの融合タンパク質などが挙げられる。本発明に好適な生物学的製剤としては、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤が挙げられる。
ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤は、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害するものであれば限定されないが、抗ＩＬ−６受容体抗体が好ましい。なかでもヒト化抗ＩＬ−６受容体抗体として臨床使用されているトシリズマブ（商品名：アクテムラ）が好ましい。
Ｔ細胞活性化阻害剤はＴ細胞の活性化を阻害するものであれば限定されないが、Ｔ細胞副刺激モジュレーターが好ましく、なかでもヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインより構成された可溶性融合タンパク質であるアバタセプト（商品名：オレンシア）が好ましい。
【００１５】
本発明者は、トシリズマブ治療を開始する前のリウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後の患者のＭＭＰ−３（マトリックスメタロプロティナーゼ−３）値が有意に相関することを見出した。具体的には、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が低く、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が低い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が高いことを見出した。すなわち、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い患者は、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いと推定できる。したがって、トシリズマブによる治療を開始する前にＦｏｘｐ３発現量を測定することにより、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することが可能となる。
【００１６】
リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量の高低は、例えば、蓄積された背景データに基づいて任意の基準値を設けて判定することができる。また、例えば、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量と比較して判定することができる。好ましくは、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量と比較して判定することである。健常者は、慢性疾患に罹患していない成人が好ましく性別は問わない。高齢でないこと（例えば２０代〜３０代）がより好ましい。健常者のＦｏｘｐ３の発現量は、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料と同様の方法で同一部位から採取した試料を用い、同一の測定方法を用いて測定することが好ましい。また、健常者のＦｏｘｐ３の発現量は、複数の健常者の平均値を用いることが好ましく、多数の健常者のＦｏｘｐ３の発現量を蓄積した背景データの平均値を用いることがより好ましい。
健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より高い場合に、リウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３の発現量が高いと判定することができる。好ましくは健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より１．５倍以上高い場合、より好ましくは健常者のＦｏｘｐ３の発現量（平均値）より２倍以上高い場合にリウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３の発現量が高いと判定する。
【００１７】
本発明の方法は、
「生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有することを特徴とする方法。
（ａ）生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定する工程
（ｂ）（ａ）で得られたＦｏｘｐ３の発現量を健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３発現量と比較する工程
（ｃ）健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３発現量よりＦｏｘｐ３発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する工程」と表現することができる。
また、生物学的製剤による治療を開始する前にＦｏｘｐ３の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法は、生物学的製剤による治療を開始する前にＦｏｘｐ３の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療の予後を予測する方法と換言することができる。
【００１８】
現在の関節リウマチ治療の基本戦略は、早期に生物学的製剤を用いて介入し、骨関節変形を予防していくことである。これをＷｉｎｄｏｗｓ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙと呼んでいる。生物学的製剤が奏功すれば、将来的に様々なリウマチ薬を中止することが可能となり、緩解治癒も望める状況となっている。加えて、生物学的製剤は、離職率、休職率を改善させ、社会問題の解決にもつながることが明らかになっている。しかしながら、生物学的製剤は非常に高価な薬剤であり、医療経済状況を考慮すれば、関節リウマチ患者全例に導入することは困難である。また、ＴＮＦ阻害剤などは、各種の大規模試験によるエビデンスによれば、関節リウマチの治療判定基準であるＡＣＲ２０の改善率は約６０％と報告されている。トシリズマブでも７０〜８０％前後と報告されている。つまり、それだけ高価な薬剤でありながら、すべての患者に効果があるとは限らない状況である。
このような状況下において、本願発明は、疾患活動性が高い患者に、生物学的製剤を導入するべきかどうかを選択する際の参考として用いることができ、リウマチ膠原病性疾患患者のＱＯＬや医療経済状況を改善していくうえで非常に有用であると考えられる。
【００１９】
本発明者は、トシリズマブ治療開始から６か月後のリウマチ膠原病性疾患患者のＣＴＬＡ−４発現量とトシリズマブ治療開始６か月後の患者のＭＭＰ−３値が有意に相関することを見出した。具体的には、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が高い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が低く、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が低い患者は治療開始６か月後ＭＭＰ−３値が高いことを見出した。すなわち、トシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量が高い患者は、その時点において、それまでのトシリズマブによる治療が有効であり、その後も有効である蓋然性が高いと推定できる。したがって、トシリズマブによる治療開始後にＣＴＬＡ−４発現量を測定することにより、トシリズマブによる治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択することが可能となる。治療開始後は、好ましくは４か月以上経過後、より好ましくは５か月以上経過後、さらに好ましくは６か月以上経過後である。
【００２０】
ＣＴＬＡ−４発現量の高低の判定は、上記Ｆｏｘｐ３発現量の判定と同様に行うことができる。すなわち、健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より高い場合、好ましくは健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より１．５倍以上高い場合、より好ましくは健常者のＣＴＬＡ−４の発現量（平均値）より２倍以上高い場合に、リウマチ膠原病性疾患患者のＣＴＬＡ−４の発現量が高いと判定する。
【００２１】
本発明の方法は、
「生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、以下の（ｄ）〜（ｆ）の工程を有することを特徴とする方法。
（ｄ）生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定する工程
（ｅ）（ｄ）で得られたＣＴＬＡ−４の発現量を健常者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４発現量と比較する工程
（ｆ）健常者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４発現量よりＣＴＬＡ−４発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する工程」と表現することができる。
また、生物学的製剤による治療を開始した後にＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法は、生物学的製剤による治療を開始した後にＣＴＬＡ−４の発現量を測定することにより、測定時におけるリウマチ膠原病性疾患の活動性を評価する方法と換言することができる。
【００２２】
リウマチ膠原病疾患において、疾患の活動性は、例えばＭＭＰ−３、ＣＲＰ、ＤＡＳ２８等を指標として評価されるリウマチの状態を意味する。ＭＭＰ−３は、関節破壊の程度を反映する。ＣＲＰは炎症の強さを反映する。ＤＡＳ２８は、関節リウマチ全体の活動性を示すもので、２８関節を対象に腫脹関節、疼痛関節を評価し、血沈、患者の自覚を示すＶＡＳを組み合わせて計算して示されるものである。
【００２３】
ＤＡＳ２８は、簡便で、関節リウマチの活動性をよく反映するが、評価者により評価が異なる場合があること、患者の自覚症状が患者によってばらつきを示すこと等によって、過大評価や過小評価され得るという問題がある。そこで、リウマチ膠原病性疾患治療、特に関節リウマチ治療においては、疾患活動性を簡便に、かつ再現性良く評価する検査法が望まれている。特に、生物学的製剤を導入した患者において必要性が高い。
このような状況下において、本願発明は、測定時におけるリウマチ膠原病性疾患の活動性評価の参考として用いることができ、リウマチ膠原病性疾患患者のＱＯＬや医療経済状況を改善していくうえで非常に有用であると考えられる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（１）被験患者およびサンプリング
トシリズマブ治療を開始していないリウマチ膠原病性疾患患者１７例（関節リウマチ：１５例、リウマチ性多発筋痛症：１例、ＲＳ３ＰＥ：１例）を被験患者とした。被験患者から、トシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後の３回採血し、定法によりＰＢＭＣからｃＤＮＡを調製した。また、健康ボランティア２１名から同様にＰＢＭＣ由来のｃＤＮＡを得た。
【００２６】
（２）測定因子
ＩＬ−１β、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲＣ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−６、β−ａｃｔｉｎ、β２Ｍおよび１８Ｓ−ＲＮＡの２４種類の因子について、リウマチ膠原病性疾患患者と健康ボランティアとの発現量の差を測定した。測定には、上記２４種類の測定が可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ（applied biosystems）を使用した。
ストックしたサンプル７２検体分を９枚のアレイを用いて測定し、ΔΔＣｔ法を用いて同時解析した。発現補正としてβ−ａｃｔｉｎを選択し、ある健康ボランティアの発現量を仮の１として健康ボランティアの平均を算出した。得られた健康ボランティアの平均発現量を真の１としてリウマチ膠原病性疾患患者の発現量を算出した。
【００２７】
（３）被験患者と健康ボランティアとの測定因子発現量の比較
トシリズマブ治療開始前の被験患者における上記測定因子の発現量を健康ボランティアの発現量と対比した。
その結果、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、Ｆｏｘｐ３およびＣＴＬＡ−４において、被験患者と健康ボランティアとの間に有意差が認められた。なお、有意差検定には不等分散の場合のｔ検定（アスピン・ウェルチ）を用いた。
【００２８】
（４）測定因子と臨床パラメータとの多変量解析
被験患者から得られた臨床パラメータ（ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質、ＭＭＰ-３：マトリックスメタロプロティナーゼ３、ＤＡＳ−２８ＣＲＰ：関節リウマチの疾患活動性の評価、等）との相関性を、ＪＭＰ８．０ソフトウェア（SAS Institute）を用いて解析した。
【００２９】
その結果、図２に示すように、被験患者のトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値に有意な相関（相関係数：−０．５６３７、ｐ＝０．０１８４）が認められた。この結果から、トシリズマブ治療開始前におけるＦｏｘｐ３発現量が低いリウマチ膠原病性疾患患者より、Ｆｏｘｐ３発現量が高いリウマチ膠原病性疾患患者のほうが、トシリズマブ治療が有効である可能性が高いことが明らかとなった。つまり、リウマチ膠原病性疾患患者のＦｏｘｐ３発現量を測定することにより、トシリズマブ治療が有効である可能性が高い患者を選択できることが示された。
【００３０】
また、図３に示すように、被験患者のトシリズマブ治療開始６か月後のＣＴＬＡ−４発現量と、トシリズマブ治療開始６か月後のＭＭＰ−３値に有意な相関（相関係数：−０．５７３５、ｐ＝０．０１６１）が認められた。この結果から、トシリズマブ治療開始後においてＣＴＬＡ−４発現量の高い患者はリウマチの活動性が低く、逆にＣＴＬＡ−４発現量の低い患者はリウマチの活動性が高いことが明らかとなった。つまり、トシリズマブ治療中の患者のＣＴＬＡ−４発現量を測定することにより、その時点におけるトシリズマブ治療効果の高い患者を選択することができる。
【００３１】
（５）クラスター分析
被験患者１７例について、ＪＭＰ８．０ソフトウェアを用い、変数として年齢、罹病期間およびトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量の３変数を選択することにより、グループＡ（９例）およびグループＢ（８例）の２つのクラスターに分かれた。
図４（Ａ）〜（Ｃ）に、各変数についての各グループの分布を示した。（Ａ）はトシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量、（Ｂ）は罹病期間、（Ｃ）は年齢である。グループＡは、Ｆｏｘｐ３発現量が低く、罹病期間が短く、年齢が高い傾向を示した。グループＢは、Ｆｏｘｐ３発現量が高く、罹病期間および年齢は広範囲にばらつきがある傾向をし示した。
【００３２】
各グループのトシリズマブ治療開始前、トシリズマブ治療開始３か月後、トシリズマブ治療開始６か月後におけるＭＭＰ−３値に注目し、各時期の両グループのＭＭＰ−３値についてｔ−検定を行った。結果を図５に示した。トシリズマブ治療開始３か月後および６か月後のＭＭＰ−３値は、グループＡとＢとの間に有意差が認められた。この結果は、トシリズマブ治療開始前のＦｏｘｐ３発現量が高い傾向のグループＢのほうが、トシリズマブ治療により３か月後および６か月後のＭＭＰ−３値が低くなることを示すものであり、トシリズマブ治療開始前においてＦｏｘｐ３発現量の高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択すれば、トシリズマブ治療が有効である可能性が高いことが裏付けられた。
【００３３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量と比較することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的製剤が、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−６阻害剤が抗ＩＬ−６受容体抗体であり、Ｔ細胞活性化阻害剤がＴ細胞副刺激モジュレーターである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的製剤が、トシリズマブまたはアバタセプトである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リウマチ膠原病性疾患が、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が末梢血単核球である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生物学的製剤による治療を開始した後に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
生物学的製剤による治療が有効である蓋然性が高いリウマチ膠原病性疾患患者を選択する方法であって、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量を、健常者由来の試料におけるＦｏｘｐ３またはＣＴＬＡ−４の発現量と比較することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的製剤が、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤またはＴ細胞活性化阻害剤である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−６阻害剤が抗ＩＬ−６受容体抗体であり、Ｔ細胞活性化阻害剤がＴ細胞副刺激モジュレーターである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的製剤が、トシリズマブまたはアバタセプトである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リウマチ膠原病性疾患が、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、ＲＳ３ＰＥ症候群、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、成人スティル病、再発性多発性軟骨炎、全身性強皮症、多発性筋炎、反応性関節炎、ベーチェット病、ＡＡアミロイドーシス、大動脈炎症候群（高安病）、強直性脊椎炎、または後天性血友病である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が末梢血単核球である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
生物学的製剤による治療を開始する前に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＦｏｘｐ３の発現量を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生物学的製剤による治療を開始した後に、リウマチ膠原病性疾患患者由来の試料におけるＣＴＬＡ−４の発現量を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−４４６５７（Ｐ２０１３−４４６５７Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８３０５９（Ｐ２０１１−１８３０５９）
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 一般社団法人日本リウマチ学会 第５５回日本リウマチ学会総会・学術集会・第２０回国際リウマチシンポジウム プログラム・抄録集 平成２３年６月２０日
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 一般社団法人日本リウマチ学会 第５５回日本リウマチ学会総会・学術集会・第２０回国際リウマチシンポジウム プログラム・抄録集 平成２３年６月２０日
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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