生理活性物質の固定化方法
【課題】 蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、官能基を導入することなく、生理活性物質を固定化する方法を提供すること。
【解決手段】生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法であって、好ましくは、基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している生理活性物質の固定化方法。
【解決手段】生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法であって、好ましくは、基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している生理活性物質の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子において蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。
【０００６】
固定化する方法としては２通りの方法が実施されている。その一つは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、基材表面が蛋白質を吸着しやすいために、蛋白質を固定化した後に抗原や２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオアッセイ用基材が求められている。
【０００７】
もう一つが官能基を用いて蛋白質を表面に結合する方法である。蛋白質が吸着しにくいマトリクス形成成分に蛋白質と反応する官能基を導入し、これを介して蛋白質を固定化するが（たとえば、特許文献２）、蛋白質を固定化する工程と、固定化後に官能基を不活性化する工程とが必要なため、次の工程に入るまでの時間がかかる問題があった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特表２００４−５３１３９０号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、官能基を導入することなく、生理活性物質を固定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の通りである。
（１）生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
（２）前記基体表面に、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有している（１）記載の生理活性物質の固定化方法。
（３）前記基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している（２）記載の生理活性物質の固定化方法。
（４）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである（３）記載の生理活性物質の固定化方法。
【化１】
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（５）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである（４）記載の生理活性物質の固定化方法。
（６）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である（５）記載の生理活性物質の固定化方法。
（７）架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である（３）〜（６）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（８）架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである（３）〜（６）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【化２】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
（９）前記高濃度リン酸塩緩衝液の濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（１）〜（８）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１０）前記生理活性物質が核酸、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、又は糖タンパクである（１）〜（９）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１１）前記基体がプラスチックである（１）〜（１０）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１２）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである（１１）記載の生理活性物質の固定化方法。
（１３）前記基体がガラスである（１）〜（１０）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１４）前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である（１）〜（１３）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、官能基を導入することなく、生理活性物質を固定化することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法である。
基体表面には、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有していることが好ましい。アルキレングリコール残基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つ。
【００１３】
アルキレングリコール残基を含有する化合物としては、各種の化合物が挙げられるが、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物であることが好ましい。この高分子化合物は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つポリマーで、アルキレングリコール残基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。
【００１４】
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００１５】
【化３】
【００１６】
式中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Xの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００１７】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール （メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００１８】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。
【００１９】
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、(メタ)アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。
【００２０】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、なかでもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。
【００２１】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した一般式［２］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
【００２２】
【化４】
【００２３】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【００２４】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００２５】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の望ましい組成比は１〜２０mol％であり、好ましくは２〜１５mol％、最も好ましくは２〜１０mol％である。
【００２６】
本発明に使用する高分子化合物は、アルキレングリコール残基および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー以外に他の基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含んでもよい。例えば、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合させてもよく、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）としてはｎ―ブチルメタクリレートもしくはｎ−ドデシルメタクリレートもしくはｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。
【００２７】
本発明に使用する高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）および架橋可能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
【００２８】
溶媒としては、それぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基体に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基体を変性させないため好ましい。
【００２９】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３０】
本発明に使用する高分子化合物の化学構造は、少なくともアルキレングリコール残基及び架橋可能な官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３１】
本発明に使用する高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３２】
本発明に使用する高分子化合物は、基体表面を該高分子化合物で被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つことから、基体表面を被覆した後に、架橋させることが可能である。これにより、基体上の高分子に不溶性を付与することができ、基体洗浄による信号低下を低減することができる。
【００３３】
基体表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．００１〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子の主鎖同士を架橋させる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基の場合の高分子化合物の被覆については、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該合成高分子中にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。
【００３４】
含水量が少ないとシラノール基の生成が不十分で、架橋結合が弱くなる。一方、含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が含有されていれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。
【００３５】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。
【００３６】
本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基体表面に塗布した後、乾燥させる工程において、高分子化合物中のシラノール基は、他の高分子化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに基体表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基体表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基体表面に被覆された高分子化合物は容易に溶解したり、基体から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
【００３７】
本発明に使用するバイオアッセイ用基体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【００３８】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００３９】
基体表面と表面に被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基体表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００４０】
高分子化合物を基体に塗布することで容易に基体に生理活性物質の非特異的吸着を抑制された生理活性物質固定化基体を作製できる。さらに該高分子化合物を架橋することで、基体上の高分子化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基体はエライザ用プレート、プロテインチップ用基板に好適に用いることができる。
【００４１】
本発明の固定化方法を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質はタンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパクなどがある。
【００４２】
本発明に使用するリン酸塩緩衝液は、各種リン酸塩が０．１Ｍ以上４．０Ｍ以下の高濃度で溶解していることが好ましい。より好ましくは０．６Ｍ以上２．４Ｍ以下、もっとも好ましくは０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下である。濃度が下限値未満では生理活性物質が十分に固定化できずシグナルが検出されないという問題が発生する恐れがあり、濃度が上限値を超えると生理活性物質が変性を起こし生理活性物質が特異的な反応を起こさず機能しないという問題が発生する恐れがある。
【００４３】
本発明に使用するリン酸塩は、特に限定されるものではないが、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムリン酸ナトリウム、リン酸インジウム、リン酸サマリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素バリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸二カリウムリン酸二水素２−アミノエチル、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素マンガン、リン酸二水素リチウム、リン酸二バリウム、リン酸ヒドロキシアンモニウム、リン酸尿素、リン酸リチウム、リン酸ジフェニル、リン酸トリエチル、リン酸トリオクチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリブチル、リン酸トリメチル、リン酸ホウ素、リン酸マグネシウム、などが挙げられる。特に好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。
【００４４】
前記高濃度リン酸塩緩衝液に、生理活性物質を溶解した溶液を基体に接触させることにより、容易に生理活性物質を固定化できる。
【００４５】
生理活性物質を溶解した溶液を基体表面に接触させる方法は、基体の形状にさまざまであるが、たとえば９６穴プレートの場合は溶液をそれぞれのウェルに分注するだけでよい。スライド形状の場合は点着により接触することが好ましい。
【実施例】
【００４６】
（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４７】
（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約４７５ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を96穴プレート形状（1ウェルの寸法：底面直径６．４ｍｍ×高さ１１ｍｍ）に加工して固定基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この固定基板を高分子化合物の合成例１、２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬後、６５℃で４時間加熱乾燥することにより、基板表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる高分子化合物を含む層を導入した。合成例１の高分子化合物にて作製された基板を基板１、合成例２の高分子化合物にて作製された基板を基板２とする。
【００５０】
（実験１）：１次抗体の固定化とリン酸塩濃度の関係を調べた。
《実施例１》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
【００５１】
（固定化処理）
工程１
作製した固定化溶液を基板１に１００ｕｌ／ウェルの割合で分注し、室温で４時間静置した。固定化反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５２】
工程２
その後、吸着防止処理を行わなかった。
【００５３】
工程３（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス IgG2aを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液および抗原であるマウス IgG2aを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５４】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウス IgG2aをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５５】
工程５（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（秋田住友ベーク製）を用いて発色反応を行った。
【００５６】
発色反応を行った。基板について４５０ｎｍの吸光量測定を行った。吸光量の測定には、ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いた。
シグナル強度の結果を表２示す。
【００５７】
《比較例１》
（固定化溶液の調整）
０．０５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
以下実施例１と同様な工程により評価した。結果を表２に示す。
【００５８】
実施例１および比較例１を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用した実施例１が抗原の量に応じたシグナルが検出できたため１次抗体を固定化できることが確認できた。
【００５９】
【表２】
【００６０】
（実験２）：基板２とノンコート基板との比較を行った。
《実施例２》
基板として基板２を用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
《比較例２》
基板として酸素プラズマ後の基板を高分子化合物を塗布せずに用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
【００６１】
実施例２および比較例２を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用することでアルキレングリコール残基を有さない表面に対しても、１次抗体の固定化は可能であるが、アルキレングリコール残基を有さない基板を用いた比較例２はバックグランドが高く抗原濃度とシグナルの検出範囲が狭いことがわかった。アルキレングリコール残基を有する基板を用いた実施例２ではバックグランドの上昇がなく、広い検出範囲を示すことがわかった。
【００６２】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子において蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。
【０００６】
固定化する方法としては２通りの方法が実施されている。その一つは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、基材表面が蛋白質を吸着しやすいために、蛋白質を固定化した後に抗原や２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオアッセイ用基材が求められている。
【０００７】
もう一つが官能基を用いて蛋白質を表面に結合する方法である。蛋白質が吸着しにくいマトリクス形成成分に蛋白質と反応する官能基を導入し、これを介して蛋白質を固定化するが（たとえば、特許文献２）、蛋白質を固定化する工程と、固定化後に官能基を不活性化する工程とが必要なため、次の工程に入るまでの時間がかかる問題があった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特表２００４−５３１３９０号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、官能基を導入することなく、生理活性物質を固定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の通りである。
（１）生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
（２）前記基体表面に、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有している（１）記載の生理活性物質の固定化方法。
（３）前記基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している（２）記載の生理活性物質の固定化方法。
（４）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである（３）記載の生理活性物質の固定化方法。
【化１】
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（５）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである（４）記載の生理活性物質の固定化方法。
（６）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である（５）記載の生理活性物質の固定化方法。
（７）架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である（３）〜（６）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（８）架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである（３）〜（６）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【化２】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
（９）前記高濃度リン酸塩緩衝液の濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（１）〜（８）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１０）前記生理活性物質が核酸、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、又は糖タンパクである（１）〜（９）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１１）前記基体がプラスチックである（１）〜（１０）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１２）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである（１１）記載の生理活性物質の固定化方法。
（１３）前記基体がガラスである（１）〜（１０）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（１４）前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である（１）〜（１３）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、官能基を導入することなく、生理活性物質を固定化することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法である。
基体表面には、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有していることが好ましい。アルキレングリコール残基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つ。
【００１３】
アルキレングリコール残基を含有する化合物としては、各種の化合物が挙げられるが、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物であることが好ましい。この高分子化合物は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つポリマーで、アルキレングリコール残基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。
【００１４】
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００１５】
【化３】
【００１６】
式中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Xの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００１７】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール （メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００１８】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。
【００１９】
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、(メタ)アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。
【００２０】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、なかでもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。
【００２１】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した一般式［２］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
【００２２】
【化４】
【００２３】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【００２４】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００２５】
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の望ましい組成比は１〜２０mol％であり、好ましくは２〜１５mol％、最も好ましくは２〜１０mol％である。
【００２６】
本発明に使用する高分子化合物は、アルキレングリコール残基および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー以外に他の基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含んでもよい。例えば、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合させてもよく、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）としてはｎ―ブチルメタクリレートもしくはｎ−ドデシルメタクリレートもしくはｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。
【００２７】
本発明に使用する高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）および架橋可能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
【００２８】
溶媒としては、それぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基体に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基体を変性させないため好ましい。
【００２９】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３０】
本発明に使用する高分子化合物の化学構造は、少なくともアルキレングリコール残基及び架橋可能な官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３１】
本発明に使用する高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３２】
本発明に使用する高分子化合物は、基体表面を該高分子化合物で被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つことから、基体表面を被覆した後に、架橋させることが可能である。これにより、基体上の高分子に不溶性を付与することができ、基体洗浄による信号低下を低減することができる。
【００３３】
基体表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．００１〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子の主鎖同士を架橋させる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基の場合の高分子化合物の被覆については、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該合成高分子中にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。
【００３４】
含水量が少ないとシラノール基の生成が不十分で、架橋結合が弱くなる。一方、含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が含有されていれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。
【００３５】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。
【００３６】
本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基体表面に塗布した後、乾燥させる工程において、高分子化合物中のシラノール基は、他の高分子化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに基体表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基体表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基体表面に被覆された高分子化合物は容易に溶解したり、基体から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
【００３７】
本発明に使用するバイオアッセイ用基体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【００３８】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００３９】
基体表面と表面に被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基体表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００４０】
高分子化合物を基体に塗布することで容易に基体に生理活性物質の非特異的吸着を抑制された生理活性物質固定化基体を作製できる。さらに該高分子化合物を架橋することで、基体上の高分子化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基体はエライザ用プレート、プロテインチップ用基板に好適に用いることができる。
【００４１】
本発明の固定化方法を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質はタンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパクなどがある。
【００４２】
本発明に使用するリン酸塩緩衝液は、各種リン酸塩が０．１Ｍ以上４．０Ｍ以下の高濃度で溶解していることが好ましい。より好ましくは０．６Ｍ以上２．４Ｍ以下、もっとも好ましくは０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下である。濃度が下限値未満では生理活性物質が十分に固定化できずシグナルが検出されないという問題が発生する恐れがあり、濃度が上限値を超えると生理活性物質が変性を起こし生理活性物質が特異的な反応を起こさず機能しないという問題が発生する恐れがある。
【００４３】
本発明に使用するリン酸塩は、特に限定されるものではないが、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムリン酸ナトリウム、リン酸インジウム、リン酸サマリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素バリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸二カリウムリン酸二水素２−アミノエチル、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素マンガン、リン酸二水素リチウム、リン酸二バリウム、リン酸ヒドロキシアンモニウム、リン酸尿素、リン酸リチウム、リン酸ジフェニル、リン酸トリエチル、リン酸トリオクチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリブチル、リン酸トリメチル、リン酸ホウ素、リン酸マグネシウム、などが挙げられる。特に好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。
【００４４】
前記高濃度リン酸塩緩衝液に、生理活性物質を溶解した溶液を基体に接触させることにより、容易に生理活性物質を固定化できる。
【００４５】
生理活性物質を溶解した溶液を基体表面に接触させる方法は、基体の形状にさまざまであるが、たとえば９６穴プレートの場合は溶液をそれぞれのウェルに分注するだけでよい。スライド形状の場合は点着により接触することが好ましい。
【実施例】
【００４６】
（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４７】
（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約４７５ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を96穴プレート形状（1ウェルの寸法：底面直径６．４ｍｍ×高さ１１ｍｍ）に加工して固定基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この固定基板を高分子化合物の合成例１、２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬後、６５℃で４時間加熱乾燥することにより、基板表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる高分子化合物を含む層を導入した。合成例１の高分子化合物にて作製された基板を基板１、合成例２の高分子化合物にて作製された基板を基板２とする。
【００５０】
（実験１）：１次抗体の固定化とリン酸塩濃度の関係を調べた。
《実施例１》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
【００５１】
（固定化処理）
工程１
作製した固定化溶液を基板１に１００ｕｌ／ウェルの割合で分注し、室温で４時間静置した。固定化反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５２】
工程２
その後、吸着防止処理を行わなかった。
【００５３】
工程３（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス IgG2aを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液および抗原であるマウス IgG2aを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５４】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウス IgG2aをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５５】
工程５（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（秋田住友ベーク製）を用いて発色反応を行った。
【００５６】
発色反応を行った。基板について４５０ｎｍの吸光量測定を行った。吸光量の測定には、ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いた。
シグナル強度の結果を表２示す。
【００５７】
《比較例１》
（固定化溶液の調整）
０．０５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
以下実施例１と同様な工程により評価した。結果を表２に示す。
【００５８】
実施例１および比較例１を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用した実施例１が抗原の量に応じたシグナルが検出できたため１次抗体を固定化できることが確認できた。
【００５９】
【表２】
【００６０】
（実験２）：基板２とノンコート基板との比較を行った。
《実施例２》
基板として基板２を用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
《比較例２》
基板として酸素プラズマ後の基板を高分子化合物を塗布せずに用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
【００６１】
実施例２および比較例２を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用することでアルキレングリコール残基を有さない表面に対しても、１次抗体の固定化は可能であるが、アルキレングリコール残基を有さない基板を用いた比較例２はバックグランドが高く抗原濃度とシグナルの検出範囲が狭いことがわかった。アルキレングリコール残基を有する基板を用いた実施例２ではバックグランドの上昇がなく、広い検出範囲を示すことがわかった。
【００６２】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
【請求項２】
前記基体表面に、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有している請求項１記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項３】
前記基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している請求項２記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項４】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである請求項３記載の生理活性物質の固定化方法。
【化１】
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
【請求項５】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである請求項４記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項６】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である請求項５記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項７】
架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項３〜６いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項８】
架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである請求項３〜６いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【化２】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項９】
前記高濃度リン酸塩緩衝液の濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である請求項１〜８いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１０】
前記生理活性物質が核酸、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、又は糖タンパクである請求項１〜９いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１１】
前記基体がプラスチックである請求項１〜１０いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１２】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである請求項１１記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１３】
前記基体がガラスである請求項１〜１０いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１４】
前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である請求項１〜１３いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１】
生理活性物質を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解した溶液を、基体表面上に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
【請求項２】
前記基体表面に、アルキレングリコール残基を含有する化合物を有している請求項１記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項３】
前記基体表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を共重合して得られる高分子化合物を有している請求項２記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項４】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである請求項３記載の生理活性物質の固定化方法。
【化１】
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
【請求項５】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである請求項４記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項６】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である請求項５記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項７】
架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項３〜６いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項８】
架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである請求項３〜６いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【化２】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項９】
前記高濃度リン酸塩緩衝液の濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である請求項１〜８いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１０】
前記生理活性物質が核酸、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、又は糖タンパクである請求項１〜９いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１１】
前記基体がプラスチックである請求項１〜１０いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１２】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである請求項１１記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１３】
前記基体がガラスである請求項１〜１０いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１４】
前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である請求項１〜１３いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
【公開番号】特開２００８−８２９７７（Ｐ２００８−８２９７７Ａ）
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６５８６９（Ｐ２００６−２６５８６９）
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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