生理活性高分子物質の分離方法
【課題】生理活性高分子物質の分離方法を提供すること。
【解決手段】移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで脱着させる操作を行なうこと。
【解決手段】移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで脱着させる操作を行なうこと。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学、薬学等の分野において有用な蛋白質を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを被覆した固定相に水系移動相で特定の条件下で操作することで分離するという新規な蛋白質分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在普及している液体クロマトグラフィー技術は、固定相と移動相との組み合わせや分離に係わる相互作用の様式により多種多様にわたる。この技術により、技術的に制約はあるものの生化学分野の医薬品の分離精製、ペプチドや蛋白質、核酸などの分離が行えるようになってきた。そして、遺伝子工学手法により生産される組換え蛋白質などのバイオ医薬への応用が盛んになるにつれ、これらの分離精製技術のさらなる革新が強まりつつある。
【０００３】
現在、生化学分野に広く用いられているクロマトグラフィーとして、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーとは不溶性保持担体表面の電解質を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着させることで分離する方法である。保持担体にはシリカ、セルロースやデキストラン、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体などが良く用いられている。これら担体に通常、スルホン酸基、四級アンモニウム基などのイオン交換基を導入される。溶質は、移動相の水素イオン濃度に応じてカチオン、アニオン、両性イオンに解離し、この溶質をイオン交換カラムに流した時担体表面の逆荷電の交換基に移動相内のイオンと競合して結合し、移動相と固定相表面の間に一定の割合で分配する。イオン交換クロマトグラフィーとは、この結合の強さによりカラム内を移動する速度が異なることを利用して分離するものである。この分配の割合は幾つかの方法により変化させることができる。例えば、移動相中の競合するイオン種の濃度を変える方法、或いは移動相の水素イオン濃度を変化させ、担体表面のイオン交換基のイオン化程度の割合を変化させる方法が挙げられる。すなわち、イオン交換クロマトグラフィーにおいては、移動相のイオン強度や水素イオン濃度を調節することで分離する方法が一般的に行われている。その際、移動相として酸や高塩濃度の緩衝液を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。
【０００４】
一方、逆相クロマトグラフィーは、疎水性の固定相と極性の移動相からなる方法である。溶質はその疎水性度に応じて移動相と固定相との間で分配され分離される。この場合にも移動相の溶媒の疎水性度を変化させ移動相と固定相との間の分配を変化させ溶出させている。その際、移動相の溶媒として有機溶媒を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。
【０００５】
生化学分野で有用な医薬品、ペプチド、蛋白質、核酸等の分離はイオン交換クロマトグラフィー技術や逆相クロマトグラフィー技術による方法が一般的である。しかしながら、現行の方法では上述のように分離対象の活性を損なうという問題点があり、そのことは対象物質が本発明のように生理活性を有する高分子物質となると顕著な課題となり、また仮に分離できたとしてもその効率は極めて低く、以前よりさらなる技術改革が望まれていた。
【０００６】
そのような中、特願平１０−１４０７２２号公報では、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の有効荷電密度を物理刺激によって変化させられる荷電を有する共重合体を含む充填剤を用いたクロマトグラフィーによって分離する技術を提案している。この方法によれば、イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィー等のときのような特殊な移動相を使わずに温度変化だけで分離できるようになり、従って分離したい物質の活性を損なうことなく回収できるようになった。しかしながら、ここで示される分離メカニズムとは、固定相表面に被覆された０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマー鎖が温度変化により収縮、膨潤するわけだが、ポリマー鎖が収縮した際にポリマー鎖内のイオン交換基が隠れ、そのイオン交換基が隠れることによって溶質は固定相表面に保持されず、逆に、ポリマー鎖が膨潤した際にポリマー鎖内のイオン交換基が露出し、そのイオン交換基が露出することによって溶質は固定相表面に保持されるようになるというものであった。本発明のように溶質を高分子物質とした場合、溶質の分子自身が嵩高く、上述のような固定相表面に保持させようとしても、溶質分子及び固定相表面の高分子鎖のお互いが嵩高く、効率良く保持できない問題点があった。そして、この特願平１０−１４０７２２号公報には、このことを解決する方法については何ら示されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以上のような従来技術の問題点を解決することを目的にしてなされたものである。すなわち、本発明は、生化学分野において有用な生理活性高分子物質を効率良く分離できるシステムを提供することを目的とする。また、本発明は、その方法を利用した生理活性高分子物質の精製、分取方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは上記の課題を解決すべく種々の観点から検討および開発を行った。その結果、生理活性高分子物質の分離を、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いることで生理活性高分子物質を分離させられるようになることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
本発明は、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることでその生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで生理活性高分子物質を脱着させることを特徴とする生理活性高分子物質の分離方法に関するものである。本発明は、また、この生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の精製、分取方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で示される技術は従来技術にはなかった新規な方法による生理活性高分子物質の分離方法である。本発明により、生化学分野において有用な生理活性を有する高分子物質の活性を損ねることもなく効率良く分離できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、生理活性を有する高分子物質の分離方法を提供するものである。本発明で対象となる物質は、生理活性を有する高分子物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、ペプチド、蛋白質、核酸等が挙げられる。その中で、特に蛋白質は３次元構造を有した高分子物質であるため本発明の対象物質として好適なものとなる。本発明において、その蛋白質は特に限定されないが、本発明が荷電を有する固定相表面を利用した分離方法であるため、酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質が好ましい。ここで示す酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質とはそれぞれ一般的なもので良く、具体的には、酸性蛋白質として、アルブミン、ビメンチン、アンキリン３、アクチン、ミオシン等が挙げられ、塩基性蛋白質として、リゾチーム、ヘモグロビンβ鎖、カタラーゼ、アネキシン、エズリン等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、上述のような生理活性高分子物質を、中性で低塩濃度の緩衝液を移動相とし、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで当該生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで当該生理活性高分子物質を脱着させる操作を行なうことで分離を行なうものである。本発明で用いられる緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。具体的には、リン酸緩衝液、トリスバッファ−、塩化アンモニウム緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に制約されるものではない。その無機塩類の濃度は５〜５０ｍＭが良く、好ましくは１０〜４０ｍＭが良く、さらに好ましくは１５〜３５ｍＭが良い。移動相の無機塩類の濃度が５ｍＭより低いと、溶質である生理活性物質の活性を損ねる問題があり、またクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、無機塩類の濃度が５０ｍＭより高くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。
【００１３】
本発明で用いられる中性の緩衝液とは、ｐＨが６．５〜７．５が良く、好ましくは６．８〜７．２が良く、さらに好ましくは７．０が良い。固定相表面に導入されるイオン交換基がカチオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが６．５より低くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが７．５より高くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。同様に、固定相表面に導入されるイオン交換基がアニオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが７．５より高くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが６．５より低くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。
【００１４】
本発明で示す、温度変化により固定相表面のイオン交換基周辺の物性やポリマー鎖構造を変化させることは、例えば担体表面に温度応答性ポリマーを導入することで達成される。本発明に示す技術とは、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーが被覆された固定相が必要である。その０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーとしては温度応答性ポリマーが挙げられ、特に限定されるわけではないが、このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
【００１５】
この中で、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界温度を有するので、このポリマーで化学修飾した固定相表面はこの臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させるため、これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって変化させられる結果、溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロールすることができるようになる。下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどの親水性のコモノマーをＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの疎水性のコモノマーとの共重合によって調整することができる。
【００１６】
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境として親水性／疎水性に表面物性が変化し、前述のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いはポリマーの被覆によって作製される。
【００１７】
本発明の固定相表面に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等の作業性が悪くなり好ましくない。また、０℃より低いと移動相が凍結する場合があり、やはり好ましくない。
【００１８】
本発明で使用される固定相表面のポリマーは荷電されたものである。その荷電を与える方法は特に限定されないが、通常、固定相表面に被覆されるポリマー鎖を合成する際、例えば、上述したような温度応答性ポリマーを合成する際、イオン性モノマーも含めて共重合する方法が良い。その結果としては、アミノ基を有するポリマーの構成単位としてジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノスチレン、アミノアルキルスチレン、アミノアルキル（メタ）アクリルアミド、アルキルオキシアルキルトリメチルアンモニウム塩、（メタ）アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩等が挙げられる。また、カルボキシル基を有するポリマーの構成単位としてアクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸を有するポリマーの構成単位として（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
【００１９】
被覆を施される固定相の支持体としては、クロマトグラフィーの担体に用いられるシリカ、多糖類、ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等をはじめとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００２０】
固定相表面へポリマーを導入するための化学修飾法は表面グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。固定相表面へのポリマーの被覆方法は、具体的には、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従って良く、特に限定されるものではない。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、シランカップリング剤によるカップリング反応、熱反応、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応等が挙げられる。
【００２１】
本発明は移動相を緩衝液に固定したまま、固定相の表面のイオン交換基周辺の物性や構造を物理刺激により、制御して表面のイオン交換基の荷電を調節することによって分離を行うものである。即ち、本発明によれば、外部温度を固定相表面のポリマー鎖が収縮するようにしたときでもイオン交換基が固定相表面に表出し、分離する生体成分はイオン交換基との相互作用し、イオン交換クロマトグラフィーのモードで分離する。外部温度を変化させ、固定相表面のポリマー鎖が膨潤すると、固定相表面の荷電に変化ないが、固定相表層のポリマー鎖が嵩高くなり、溶質が高分子量の場合、相互作用が弱まり、その結果、固定表面に溶質が保持できなくなる。外部温度により担体表面の状態を可逆的に変えられ、本発明のような生理活性を有する高分子物質の分離ができるようになる。以上のように、本発明で示すところの技術とは、従来技術とは全く異なるメカニズムからなるものである。また、そのメカニズムは、本発明が対象とする生理活性高分子物質に好適なものであることも判明した。
【００２２】
本発明で示す生理活性高分子物質の分離方法は、上述のような液体クロマトグラフィーによる分析に利用できるだけではなく、生体から抽出したような生理活性高分子物質を精製する手段として、或いは分取する手段としても有効である。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
正荷電固定相表面を、下記２段階を経て作製した。
１−ａ）アミノプロピルシリカゲルへ重合開始剤の導入するために下記の化合物を使用した。
アミノプロピルシリカゲル ５ｇ
Ｖ−５０１［４，４’−アゾビス（４−シアノバレリン酸（４，４’−ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）（分子量：２８０・２８）］ ３．５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）
ＥＥＤＱ［Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（Ｎ−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２−ｅｔｈｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（分子量：２４７．３０）］ ６．１８ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）
それぞれのものを上述の割合で配合し、Ｖ−５０１に対しＥＥＤＱを縮合剤として使用し、これらをＤＭＦ ５０ｍｌに溶解させ、その中にアミノプロピルシリカゲルを分散させることで反応させた。これを遮光下で３０分間Ｎ２（窒素）ガスでバブリングし、その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて室温で６時間反応させた。反応後、ろ過してからＤＭＦで洗浄した。これによりシリカゲル表面に重合開始剤を導入した。
１−ｂ）正荷電固定相表面の形成のために下記の化合物を使用した。
１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル４ｇ
ＩＰＡＡｍ １０ｇ
ＢＩＳ［Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（Ｎ，Ｎ’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））（分子量：１５４．１７）］ ０．２７ｇ
ＤＭＡＥＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：１０となる量
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：４．５となる量
上述の量で１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳをＥｔＯＨ２００ｍｌに溶解させた。ＤＭＡＥＭＡならびにＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後、完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これにより正荷電を持つＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後、ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【実施例２】
【００２５】
正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電蛋白質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。結果を図１、並びに図２に示す。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。４０℃で保持されたアルブミンはカラム温度を１０℃に冷却することで溶出した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【比較例１】
【００２６】
移動相のイオン強度の変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を被覆したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件でアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）の分離に関する比較を行った。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝６６．７ｍＭを用いた。結果を図３に示す。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度６６．７ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃と４０℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
【実施例３】
【００２７】
負荷電ハイドロゲル表面の形成のために下記の化合物を使用した。
実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル ４ｇ、
ＩＰＡＡｍ １０ｇ
ＢＩＳ ０．２７ｇ、
ＡＡ［アクリル酸］ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：１０になる量、
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：４．５になる量
上述の量で１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳならびにＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これにより正荷電を持つＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【実施例４】
【００２８】
負荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で正荷電タンパク質であるリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。負荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではリゾチームを保持しなかったが、４０℃でリゾチームを保持した。これにより、リゾチームの分離が可能となった。これにより、本発明の技術によればリゾチームの分離が可能であることが分かる。
【比較例２】
【００２９】
ハイドロゲル表面の形成のために下記の化合物を使用した。
実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル ４ｇ
ＩＰＡＡｍ １０ｇ、ＢＩＳ ０．２７ｇ
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で９５：５になる量
上述の量で、実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳをＥｔＯＨ ２００ｍｌに溶解させた。ＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これによりＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【比較例３】
【００３０】
分離担体に於ける荷電の有無による分析能の変化を検討するため、ハイドロゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件でアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）の分離に関する比較を行った。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ）（９５：５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。結果を図４に示す。ハイドロゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃と４０℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
【実施例５】
【００３１】
移動相のイオン強度の変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電タンパク質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０．イオン強度＝２５．０ｍＭを用いた。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度１０．０ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【実施例６】
【００３２】
移動相のｐＨの変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電タンパク質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．５、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明で示される分離方法であれば、生理活性を有する高分子物質の活性を損ねることもなく効率良く分離できるようになる。この方法に従えば、生理活性を有する高分子物質の精製、分取も可能となり、本発明は、生物学、医学、薬学等の分野において極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】 実施例２に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図２】 実施例２に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図３】 比較例１に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図４】 比較例３に示すハイドロゲル固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学、薬学等の分野において有用な蛋白質を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを被覆した固定相に水系移動相で特定の条件下で操作することで分離するという新規な蛋白質分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在普及している液体クロマトグラフィー技術は、固定相と移動相との組み合わせや分離に係わる相互作用の様式により多種多様にわたる。この技術により、技術的に制約はあるものの生化学分野の医薬品の分離精製、ペプチドや蛋白質、核酸などの分離が行えるようになってきた。そして、遺伝子工学手法により生産される組換え蛋白質などのバイオ医薬への応用が盛んになるにつれ、これらの分離精製技術のさらなる革新が強まりつつある。
【０００３】
現在、生化学分野に広く用いられているクロマトグラフィーとして、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーとは不溶性保持担体表面の電解質を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着させることで分離する方法である。保持担体にはシリカ、セルロースやデキストラン、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体などが良く用いられている。これら担体に通常、スルホン酸基、四級アンモニウム基などのイオン交換基を導入される。溶質は、移動相の水素イオン濃度に応じてカチオン、アニオン、両性イオンに解離し、この溶質をイオン交換カラムに流した時担体表面の逆荷電の交換基に移動相内のイオンと競合して結合し、移動相と固定相表面の間に一定の割合で分配する。イオン交換クロマトグラフィーとは、この結合の強さによりカラム内を移動する速度が異なることを利用して分離するものである。この分配の割合は幾つかの方法により変化させることができる。例えば、移動相中の競合するイオン種の濃度を変える方法、或いは移動相の水素イオン濃度を変化させ、担体表面のイオン交換基のイオン化程度の割合を変化させる方法が挙げられる。すなわち、イオン交換クロマトグラフィーにおいては、移動相のイオン強度や水素イオン濃度を調節することで分離する方法が一般的に行われている。その際、移動相として酸や高塩濃度の緩衝液を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。
【０００４】
一方、逆相クロマトグラフィーは、疎水性の固定相と極性の移動相からなる方法である。溶質はその疎水性度に応じて移動相と固定相との間で分配され分離される。この場合にも移動相の溶媒の疎水性度を変化させ移動相と固定相との間の分配を変化させ溶出させている。その際、移動相の溶媒として有機溶媒を用いるために分離対象になる生体成分の活性を損なう問題点があった。
【０００５】
生化学分野で有用な医薬品、ペプチド、蛋白質、核酸等の分離はイオン交換クロマトグラフィー技術や逆相クロマトグラフィー技術による方法が一般的である。しかしながら、現行の方法では上述のように分離対象の活性を損なうという問題点があり、そのことは対象物質が本発明のように生理活性を有する高分子物質となると顕著な課題となり、また仮に分離できたとしてもその効率は極めて低く、以前よりさらなる技術改革が望まれていた。
【０００６】
そのような中、特願平１０−１４０７２２号公報では、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の有効荷電密度を物理刺激によって変化させられる荷電を有する共重合体を含む充填剤を用いたクロマトグラフィーによって分離する技術を提案している。この方法によれば、イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィー等のときのような特殊な移動相を使わずに温度変化だけで分離できるようになり、従って分離したい物質の活性を損なうことなく回収できるようになった。しかしながら、ここで示される分離メカニズムとは、固定相表面に被覆された０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマー鎖が温度変化により収縮、膨潤するわけだが、ポリマー鎖が収縮した際にポリマー鎖内のイオン交換基が隠れ、そのイオン交換基が隠れることによって溶質は固定相表面に保持されず、逆に、ポリマー鎖が膨潤した際にポリマー鎖内のイオン交換基が露出し、そのイオン交換基が露出することによって溶質は固定相表面に保持されるようになるというものであった。本発明のように溶質を高分子物質とした場合、溶質の分子自身が嵩高く、上述のような固定相表面に保持させようとしても、溶質分子及び固定相表面の高分子鎖のお互いが嵩高く、効率良く保持できない問題点があった。そして、この特願平１０−１４０７２２号公報には、このことを解決する方法については何ら示されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以上のような従来技術の問題点を解決することを目的にしてなされたものである。すなわち、本発明は、生化学分野において有用な生理活性高分子物質を効率良く分離できるシステムを提供することを目的とする。また、本発明は、その方法を利用した生理活性高分子物質の精製、分取方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは上記の課題を解決すべく種々の観点から検討および開発を行った。その結果、生理活性高分子物質の分離を、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いることで生理活性高分子物質を分離させられるようになることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
本発明は、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることでその生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで生理活性高分子物質を脱着させることを特徴とする生理活性高分子物質の分離方法に関するものである。本発明は、また、この生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の精製、分取方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で示される技術は従来技術にはなかった新規な方法による生理活性高分子物質の分離方法である。本発明により、生化学分野において有用な生理活性を有する高分子物質の活性を損ねることもなく効率良く分離できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、生理活性を有する高分子物質の分離方法を提供するものである。本発明で対象となる物質は、生理活性を有する高分子物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、ペプチド、蛋白質、核酸等が挙げられる。その中で、特に蛋白質は３次元構造を有した高分子物質であるため本発明の対象物質として好適なものとなる。本発明において、その蛋白質は特に限定されないが、本発明が荷電を有する固定相表面を利用した分離方法であるため、酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質が好ましい。ここで示す酸性蛋白質、もしくは塩基性蛋白質とはそれぞれ一般的なもので良く、具体的には、酸性蛋白質として、アルブミン、ビメンチン、アンキリン３、アクチン、ミオシン等が挙げられ、塩基性蛋白質として、リゾチーム、ヘモグロビンβ鎖、カタラーゼ、アネキシン、エズリン等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、上述のような生理活性高分子物質を、中性で低塩濃度の緩衝液を移動相とし、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで当該生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで当該生理活性高分子物質を脱着させる操作を行なうことで分離を行なうものである。本発明で用いられる緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。具体的には、リン酸緩衝液、トリスバッファ−、塩化アンモニウム緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に制約されるものではない。その無機塩類の濃度は５〜５０ｍＭが良く、好ましくは１０〜４０ｍＭが良く、さらに好ましくは１５〜３５ｍＭが良い。移動相の無機塩類の濃度が５ｍＭより低いと、溶質である生理活性物質の活性を損ねる問題があり、またクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、無機塩類の濃度が５０ｍＭより高くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。
【００１３】
本発明で用いられる中性の緩衝液とは、ｐＨが６．５〜７．５が良く、好ましくは６．８〜７．２が良く、さらに好ましくは７．０が良い。固定相表面に導入されるイオン交換基がカチオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが６．５より低くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが７．５より高くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。同様に、固定相表面に導入されるイオン交換基がアニオン性のものであるとき、緩衝液のｐＨが７．５より高くなるとイオン交換基の解離度が高くなり、固定相表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で固定相表面から溶質を剥がすことが困難となり好ましくない。逆に、ｐＨが６．５より低くなるとクラマトグラフィー固定相表面のイオン交換基の解離度が低くなり、固定相表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となり好ましくない。
【００１４】
本発明で示す、温度変化により固定相表面のイオン交換基周辺の物性やポリマー鎖構造を変化させることは、例えば担体表面に温度応答性ポリマーを導入することで達成される。本発明に示す技術とは、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーが被覆された固定相が必要である。その０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーとしては温度応答性ポリマーが挙げられ、特に限定されるわけではないが、このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
【００１５】
この中で、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界温度を有するので、このポリマーで化学修飾した固定相表面はこの臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させるため、これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって変化させられる結果、溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロールすることができるようになる。下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどの親水性のコモノマーをＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの疎水性のコモノマーとの共重合によって調整することができる。
【００１６】
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境として親水性／疎水性に表面物性が変化し、前述のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いはポリマーの被覆によって作製される。
【００１７】
本発明の固定相表面に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等の作業性が悪くなり好ましくない。また、０℃より低いと移動相が凍結する場合があり、やはり好ましくない。
【００１８】
本発明で使用される固定相表面のポリマーは荷電されたものである。その荷電を与える方法は特に限定されないが、通常、固定相表面に被覆されるポリマー鎖を合成する際、例えば、上述したような温度応答性ポリマーを合成する際、イオン性モノマーも含めて共重合する方法が良い。その結果としては、アミノ基を有するポリマーの構成単位としてジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノスチレン、アミノアルキルスチレン、アミノアルキル（メタ）アクリルアミド、アルキルオキシアルキルトリメチルアンモニウム塩、（メタ）アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩等が挙げられる。また、カルボキシル基を有するポリマーの構成単位としてアクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸を有するポリマーの構成単位として（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
【００１９】
被覆を施される固定相の支持体としては、クロマトグラフィーの担体に用いられるシリカ、多糖類、ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等をはじめとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００２０】
固定相表面へポリマーを導入するための化学修飾法は表面グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。固定相表面へのポリマーの被覆方法は、具体的には、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従って良く、特に限定されるものではない。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、シランカップリング剤によるカップリング反応、熱反応、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応等が挙げられる。
【００２１】
本発明は移動相を緩衝液に固定したまま、固定相の表面のイオン交換基周辺の物性や構造を物理刺激により、制御して表面のイオン交換基の荷電を調節することによって分離を行うものである。即ち、本発明によれば、外部温度を固定相表面のポリマー鎖が収縮するようにしたときでもイオン交換基が固定相表面に表出し、分離する生体成分はイオン交換基との相互作用し、イオン交換クロマトグラフィーのモードで分離する。外部温度を変化させ、固定相表面のポリマー鎖が膨潤すると、固定相表面の荷電に変化ないが、固定相表層のポリマー鎖が嵩高くなり、溶質が高分子量の場合、相互作用が弱まり、その結果、固定表面に溶質が保持できなくなる。外部温度により担体表面の状態を可逆的に変えられ、本発明のような生理活性を有する高分子物質の分離ができるようになる。以上のように、本発明で示すところの技術とは、従来技術とは全く異なるメカニズムからなるものである。また、そのメカニズムは、本発明が対象とする生理活性高分子物質に好適なものであることも判明した。
【００２２】
本発明で示す生理活性高分子物質の分離方法は、上述のような液体クロマトグラフィーによる分析に利用できるだけではなく、生体から抽出したような生理活性高分子物質を精製する手段として、或いは分取する手段としても有効である。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
正荷電固定相表面を、下記２段階を経て作製した。
１−ａ）アミノプロピルシリカゲルへ重合開始剤の導入するために下記の化合物を使用した。
アミノプロピルシリカゲル ５ｇ
Ｖ−５０１［４，４’−アゾビス（４−シアノバレリン酸（４，４’−ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）（分子量：２８０・２８）］ ３．５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）
ＥＥＤＱ［Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（Ｎ−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２−ｅｔｈｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（分子量：２４７．３０）］ ６．１８ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）
それぞれのものを上述の割合で配合し、Ｖ−５０１に対しＥＥＤＱを縮合剤として使用し、これらをＤＭＦ ５０ｍｌに溶解させ、その中にアミノプロピルシリカゲルを分散させることで反応させた。これを遮光下で３０分間Ｎ２（窒素）ガスでバブリングし、その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて室温で６時間反応させた。反応後、ろ過してからＤＭＦで洗浄した。これによりシリカゲル表面に重合開始剤を導入した。
１−ｂ）正荷電固定相表面の形成のために下記の化合物を使用した。
１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル４ｇ
ＩＰＡＡｍ １０ｇ
ＢＩＳ［Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（Ｎ，Ｎ’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））（分子量：１５４．１７）］ ０．２７ｇ
ＤＭＡＥＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：１０となる量
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：４．５となる量
上述の量で１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳをＥｔＯＨ２００ｍｌに溶解させた。ＤＭＡＥＭＡならびにＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後、完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これにより正荷電を持つＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後、ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【実施例２】
【００２５】
正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電蛋白質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。結果を図１、並びに図２に示す。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。４０℃で保持されたアルブミンはカラム温度を１０℃に冷却することで溶出した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【比較例１】
【００２６】
移動相のイオン強度の変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を被覆したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件でアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）の分離に関する比較を行った。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝６６．７ｍＭを用いた。結果を図３に示す。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度６６．７ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃と４０℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
【実施例３】
【００２７】
負荷電ハイドロゲル表面の形成のために下記の化合物を使用した。
実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル ４ｇ、
ＩＰＡＡｍ １０ｇ
ＢＩＳ ０．２７ｇ、
ＡＡ［アクリル酸］ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：１０になる量、
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で８４．５：４．５になる量
上述の量で１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳならびにＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これにより正荷電を持つＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【実施例４】
【００２８】
負荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で正荷電タンパク質であるリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。負荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではリゾチームを保持しなかったが、４０℃でリゾチームを保持した。これにより、リゾチームの分離が可能となった。これにより、本発明の技術によればリゾチームの分離が可能であることが分かる。
【比較例２】
【００２９】
ハイドロゲル表面の形成のために下記の化合物を使用した。
実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル ４ｇ
ＩＰＡＡｍ １０ｇ、ＢＩＳ ０．２７ｇ
ＢＭＡ ＩＰＡＡｍに対してモル比で９５：５になる量
上述の量で、実施例１−ａで作製したＶ−５０１結合シリカゲル、ＩＰＡＡｍ、ＢＩＳをＥｔＯＨ ２００ｍｌに溶解させた。ＢＭＡを添加し、これを遮光下で１時間Ｎ２バブリングした。その後完全にＮ２置換し、Ｎ２風船をつけて７０℃（油浴）で５時間反応させた。これによりＰＩＰＡＡｍ表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
【比較例３】
【００３０】
分離担体に於ける荷電の有無による分析能の変化を検討するため、ハイドロゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件でアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）の分離に関する比較を行った。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ）（９５：５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。結果を図４に示す。ハイドロゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃と４０℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
【実施例５】
【００３１】
移動相のイオン強度の変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電タンパク質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．０．イオン強度＝２５．０ｍＭを用いた。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度１０．０ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【実施例６】
【００３２】
移動相のｐＨの変化による分析能の変化を検討するため、正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））で修飾したシリカゲル担体を充填したカラムを用いて、下記の分離条件で負荷電タンパク質であるアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を分離した。
（分離条件）カラムとしてポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ）（８５．５：１０：４．５）ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてＮａ２ＰＯ３／ＮａＨＰＯ３緩衝液ｐＨ＝７．５、イオン強度＝３３．４ｍＭを用いた。正荷電ゲル（ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ））を充填したカラムでは、イオン強度３３．４ｍＭの移動相を用いたとき、１０℃ではアルブミンを保持しなかったが、４０℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明で示される分離方法であれば、生理活性を有する高分子物質の活性を損ねることもなく効率良く分離できるようになる。この方法に従えば、生理活性を有する高分子物質の精製、分取も可能となり、本発明は、生物学、医学、薬学等の分野において極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】 実施例２に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図２】 実施例２に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図３】 比較例１に示す正荷電固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【図４】 比較例３に示すハイドロゲル固定相表面でアルブミンを分離した際のようすを示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性高分子物質の分離が、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで当該生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで当該生理活性高分子物質を脱着させることを特徴とする生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項２】
生理活性高分子物質が酸性蛋白質、又は塩基性蛋白質である、請求項１記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項３】
生理活性高分子物質がアルブミンである、請求項２記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項４】
緩衝液が、５〜５０ｍＭのリン酸緩衝液である、請求項１〜３いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項５】
緩衝液のｐＨが６．５〜７．５である、請求項１〜４いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項６】
荷電を有するポリマーが、ポリアルキルアクリルアミドの共重合物である、請求項１〜５いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項７】
ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、及び／またはポリ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）である、請求項６記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項８】
請求項１〜７記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の精製方法。
【請求項９】
請求項１〜７記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の分取方法。
【請求項１】
生理活性高分子物質の分離が、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで当該生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで当該生理活性高分子物質を脱着させることを特徴とする生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項２】
生理活性高分子物質が酸性蛋白質、又は塩基性蛋白質である、請求項１記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項３】
生理活性高分子物質がアルブミンである、請求項２記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項４】
緩衝液が、５〜５０ｍＭのリン酸緩衝液である、請求項１〜３いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項５】
緩衝液のｐＨが６．５〜７．５である、請求項１〜４いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項６】
荷電を有するポリマーが、ポリアルキルアクリルアミドの共重合物である、請求項１〜５いずれか１項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項７】
ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、及び／またはポリ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）である、請求項６記載の生理活性高分子物質の分離方法。
【請求項８】
請求項１〜７記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の精製方法。
【請求項９】
請求項１〜７記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の分取方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２４１６７９（Ｐ２００８−２４１６７９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１４８３４（Ｐ２００７−１１４８３４）
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（５０１３４５２２０）株式会社セルシード (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（５０１３４５２２０）株式会社セルシード (39)
【Ｆターム（参考）】
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