生産性および不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質とその製造方法
【課題】必要十分な氷結晶成長抑制能を有し、ＤＮＡ組換え発現による大量生産を可能とする優れた生産性を有する改良型不凍タンパク質を提供する。
【解決手段】ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【解決手段】ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固点降下、氷結晶成長抑制、氷の再結晶化阻害、氷の形状修飾、非凍結低温環境下における細胞保護等の機能を有する不凍タンパク質、特に魚類由来III型不凍タンパク質において、アミノ酸残基置換によってＤＮＡ組換え法による生産性及び不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不凍タンパク質には２つの機能が見出されている。その１つは、氷結晶面に特異的に結合し、その成長を抑制する機能である。通常、水溶液中において氷核が現れると、まず扁平な六角あるいは円盤状の氷晶に成長する。板状平面に対し垂直方向への成長は、板状平面方向に対する成長に比べ１００倍程度遅い。これに対して、水溶液中に不凍タンパク質が存在すると板状平面方向への氷晶の成長は阻止され、最初に形成された板状体を基底面として、この基底面に対し垂直方向に、順次、より小さい板状体が積み重ねられていき、最終的にはピラミッドを二つ重ねたバイピラミッド型に氷結晶は形状修飾される（図１）。
【０００３】
したがって、不凍タンパク質を含有する水溶液を０℃以下にした場合、その水溶液中には不凍タンパク質によって互いに結びつかない無数の微細なバイピラミダル氷結晶が生成される。このことが、巨視的には、水溶液の非凍結現象として観測され、水溶液の凝固点が降下する。不凍タンパク質の氷結晶抑制能の限界を超える温度まで冷却した場合、水溶液は無数の微細なバイピラミダル氷結晶の集合体として凍結する。その結果、氷結晶どうしの融合が起こり難くなり、再結晶化が抑制される。
【０００４】
不凍タンパク質のもう一つの機能は、低温に曝された細胞の障害を低減する機能である。低温環境下では細胞の代謝が低下しＡＴＰの生産量が減少する。その結果、細胞の様々な機能が障害を受け恒常性が保てなくなる。また、細胞膜を構成する脂質二重膜の相転移に伴う膜タンパク質の機能障害、脂質二重膜そのものの破綻が生ずる。不凍タンパク質は、低温下での脂質二重膜の相転移、もしくはＡＴＰ依存性イオンポンプの破綻によって生ずるカルシウムイオンの細胞内流入を防ぐことで細胞死を回避すると考えられている。
【０００５】
近年、上述した不凍タンパク質の機能を利用し、氷結晶の成長に伴う内容物の物理的破壊を防ぐことができる冷凍保存試薬や氷を細孔源とした高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞・臓器の冷蔵・冷凍保存のための新たな技術を開発しようとする試みが盛んになっている（特許文献１、２、３、４、５、６）。不凍タンパク質は魚、昆虫、植物、バクテリア、菌類と多くの生物種で発見されているが、原材料の入手の容易さ、資源量の豊富さから、その大量生産は主に植物、魚類の生物原料から行なわれてきた。しかし、植物の不凍タンパク質含有量は非常に低く、極めて大量の原材料を収集する必要がある。また、植物や魚類を含め生物は複数種類の不凍タンパク質アイソファームを発現しており、その混合比は生物固体、季節等により変動する。これらアイソフォーム間の活性には大きな差があるため、常に安定した機能を示す不凍タンパク質を生物材料から生産するのは困難であった。さらに、生物原料には汚染物質の濃縮、未知の病原体による感染症リスク等の懸念があり、生物由来製品はその安全性確保が問題となる。一方、大腸菌由来の遺伝子組換え製品は医薬品原体の製造にも用いられるなど、汚染物質の濃縮、感染症のリスクの蓋然性が極めて低いものと認識されており、今後は特定の不凍タンパク質アイソファーム組換え体の需要が益々増加すると予想される。
【０００６】
魚類由来III型不凍タンパク質は詳細な研究が行われている不凍タンパク質で、分子量６５００〜７０００Ｄａからなる球状ペプチドである。組換え体発現の宿主として最も取り扱いが容易な大腸菌での発現系が確立されている。III型不凍タンパク質は同一魚体中に複数のアイソフォームが産生され、これらはイオン交換樹脂への吸着特性の違いからＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇグループ（以下、ＱＡＥグループに属するIII型不凍タンパク質群を「ＱＡＥ」とする）とＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇグループ（以下、ＳＰグループに属するIII型不凍タンパク質群を「ＳＰ」とする）に分類される（非特許文献１）。ＱＡＥとＳＰの一次構造上の配列同一性はおよそ５６％であり、アミノ酸残基の比較によっても、ＱＡＥとＳＰのどちらに属するか容易に判断できる。III型不凍タンパク質アイソフォームはいずれも、氷核をバイピラミダル型氷結晶（図１）に修飾することが知られているが、ＱＡＥと比較してＳＰの凝固点降下能と氷結晶成長抑制能が低いことが報告されている（非特許文献２）。それゆえ、産業用途にはこれまでＱＡＥの使用が推奨されてきた（特許文献７）。
【０００７】
しかし、魚体中のＱＡＥアイソフォームの含有比はＳＰアイソフォームに比べ小さい。例えばＯｃｅａｎ ｐｏｕｔの場合、１２種類確認されているIII型不凍タンパク質のアイソフォームのうちＱＡＥは一種類のみで残り１１種類のアイソフォームはＳＰである。また、Ｎｏｔｃｈｅｄ−ｆｉｎ ｅｅｌｐｏｕｔで最も多く発現されているアイソフォームは、ＳＰであることが明らかになっている。ＤＮＡ組換え発現によりＱＡＥを得ることも可能であるが、ＱＡＥはＳＰより溶解度が低く、より凝集しやすいために、ＳＰに比べて、回収・精製率が極めて低い。そのため、実用規模で必要な大量のＱＡＥを生産するのは困難な状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１０−５０８７５９号公報
【特許文献２】特表平１０−５１１９４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５１３０６９号公報
【特許文献４】特開２００３−２８４９３７号公報
【特許文献５】特開２００４−２８４９８３号公報
【特許文献６】特開２００５−８９３５３号公報
【特許文献７】特開２００４−４３４８４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Structure of an Antifreeze Polypeptide and Its Precursor from the Ocean Pout, Macrozoarces americanus. Xiao-Mao Li, Khiet-Yen Trinh, and Choy L. Hew. J. Biol. Chem., 260, 12904-12909, (1985).
【非特許文献２】Co-operative effect of the isoforms of type III antifreeze protein expressed in Notched-fin eelpout, Zoarces elongatus Kner. Yoshiyuki Nishimiya, Ryoko Sato, Manabu Takamichi, Ai Miura and Sakae Tsuda. FEBS J., 272, 482-492 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、ＱＡＥを生物原料から大量精製することもＤＮＡ組換え技術を利用して大量発現させることも極めて困難な状況にある中、本発明は、上記の従来技術の問題を解決する手段を与えるものである。すなわち、冷凍保存試薬や氷を細孔源とする高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞の冷蔵・冷凍保存に十分な機能を有し且つ、ＤＮＡ組換え発現による生産性が向上し大量生産を可能とする改良型不凍タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者はＳＰの氷結晶成長抑制能に重要なアミノ酸残基について鋭意研究を行なっていたところ、十数個ある氷結晶結合残基のうち、意外にも１または２個のアミノ酸残基の寄与が非常に大きく、この残基の置換が氷結晶成長抑制能を劇的に向上させることを初めて見出した。また、およそ６６アミノ酸残基からなるＱＡＥの僅か１残基を置換することで、活性を保持したまま組換え体のＤＮＡ組換え発現による生産性を劇的に向上させることが出来ることも見出した。
【００１２】
これらの知見に基づいて本発明者らは、ＳＰの氷結晶成長抑制に重要なアミノ酸残基をＱＡＥの氷結晶成長抑制に重要なアミノ酸残基に置換した変異体がＱＡＥに匹敵する氷結晶成長抑制能を発揮すること、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基をＳＰの分子表面に存在するアミノ酸残基に置換した変異体がＤＮＡ組換え発現において高い生産性を示すことを確認して本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の通りである。
[１] ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[２] ＳＰ型不凍タンパク質の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８番目および１９番目から選択される１または２つのアミノ酸残基を、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該１８番目および１９番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、[１]の改変型不凍タンパク質。
[３] （i）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；
（ii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[２]の改変型不凍タンパク質。
[４] ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[５] ＱＡＥ型不凍タンパク質の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基を、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該８番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、[４]の改変型不凍タンパク質。
【００１４】
[６] （i）配列番号４のアミノ酸配列；
（ii）配列番号４のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[５]の改変型不凍タンパク質。
[７] [１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡ。
[８] [７]のＤＮＡを含む組換えベクター。
[９] [８]の組換えベクターを含む細胞。
[１０] ＤＮＡ組換え法を用いて合成することを含む、[１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
[１１] [９]の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、[１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
【００１５】
尚、不凍タンパク質の呼称は、熱ヒステリシスタンパク質あるいは抗凍結タンパク質など様々な名称で呼ばれる場合がある。また、不凍タンパク質、不凍ペプチド、抗凍結タンパク質、抗凍結ペプチド、氷結晶結合タンパク質、氷結晶結合ペプチド、再結晶化阻害タンパク質、再結晶化阻害ペプチドなどと表記される場合がある。また、Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、Ｉｃｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＢＰ）、Ｉｃｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＳＰ）など複数の呼び名がある。本発明においては、これらを全て不凍タンパク質とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、向上した不凍活性またはＤＮＡ組換え発現による大量生産を可能とする向上した生産性を有する改良型不凍タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、バイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図である。
【図２】図２は、組換えベクター構築に用いたプライマー及び鋳型を示す図である。
【図３】図３は、III型不凍タンパク質ＳＰ、ＱＡＥまたはＱＡＥ Ｎ８Ｔを組換え発現させた大腸菌内タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】図４は、III型不凍タンパク質ＳＰ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８ＬまたはＳＰ Ａ１９Ｖを組換え発現させた大腸菌内タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】図５はIII型不凍タンパク質または各種改変III型不凍タンパク質を含む試料を融点から０．２℃低い温度に保った時に観察された氷結晶の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において不凍タンパク質とは、不凍活性を有するタンパク質を意味し、魚類等の生体内において、凍結温度域で細胞内に生成する氷結晶の表面に特異的に結合してその成長を抑制し、組織の凍結から身を守る生体防御物質である。本明細書において、不凍タンパク質とは、不凍活性を有するペプチドおよびタンパク質の双方を包含するものとする。
【００１９】
不凍タンパク質の不凍活性は、該タンパク質が添加された含水物に対し、熱ヒステリシス、氷結晶の成長阻害および氷の再結晶阻害のいずれかをもたらす活性として評価される。あるいは、不凍タンパク質が存在する含水物中には、特徴的な形状の氷結晶（例えば、魚類由来の不凍タンパク質では、ピラミッドを二つ底面で重ねたバイピラミダル型氷結晶（図１））が生成することから、氷結晶の形状を顕微鏡で観察することにより対象とするタンパク質の不凍活性を評価することもできる。
【００２０】
通常、水の凝固点と氷の融点は同一であるが、不凍タンパク質が存在するとそれが氷結晶と結合するため、水の凝固点と氷の融点に差が生じる。この現象を熱ヒステリシスという。不凍タンパク質における不凍活性の大きさは、通常、不凍タンパク質が存在するときに生じる氷の融点と水の凝固点の差によって評価され、本明細書において、この融点と凝固点の差を熱ヒステリシス活性として定義する。熱ヒステリシス活性は、浸透圧計（オスモメーター）を用いることによって測定することができる。また、形成した氷結晶は、−１０℃以上の比較的高い温度での昇華または一部融解によって、生じた水分を吸収し成長する。氷の再結晶阻害とは、この現象を阻害する効果をいう。
【００２１】
本明細書において「含水物」とは、水分子と水分子以外の分子とを含む物質を意味し、例えば、溶質と溶媒からなる水溶液、水に溶解しない物質と水との混合液、穀類、麺類、卵、野菜、果実、肉類、魚介類、パン生地、氷菓子および加工食品などの食品、医療品、診断薬、試薬、化粧品、化粧水、血液、血清、血小板、精子、卵子、単細胞、多細胞、生体組織、心臓、膵臓、肝臓および腎臓などの臓器ならびにこれらの保存液、融雪剤、霜害防止剤等が挙げられる。
【００２２】
本発明において使用する不凍タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、魚類由来、昆虫由来、菌類由来、哺乳動物由来および植物由来の不凍タンパク質が挙げられる。好ましくは魚類に由来する不凍タンパク質であり、さらに好ましくはナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ）属の魚類、特に好ましくはナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ Ｋｎｅｒ）の筋肉から得られる不凍タンパク質である。魚類由来不凍タンパク質には主として４つのタイプがあり、分子量約３,０００〜４,５００のＩ型不凍タンパク質、分子量約２０,０００のＩＩ型不凍タンパク質、分子量約７,０００のＩＩＩ型不凍タンパク質、および分子量約１１,０００のＩＶ型不凍タンパク質に分類されている。本発明において好ましい不凍タンパク質は、ＩＩＩ型不凍タンパク質である。
【００２３】
本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、陽イオン交換樹脂、特に荷電基としてスルホプロピル（ＳＰ）基を有するイオン交換樹脂に結合する不凍タンパク質を意味する。
【００２４】
また本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＳＰのアミノ酸配列(配列番号１９)において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。さらに、本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＳＰのアミノ酸配列(配列番号１９)と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２５】
本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」を「ＳＰ」と記載する場合がある。
【００２６】
また、本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、陰イオン交換樹脂、例えば荷電基として第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基を有するイオン交換樹脂、に結合する不凍タンパク質を意味する。
【００２７】
また本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＱＡＥのアミノ酸配列(配列番号２０)において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、上記定義のとおりである。さらに、本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＱＡＥのアミノ酸配列(配列番号２０)と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、上記のとおり当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができる。
【００２８】
本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」を「ＱＡＥ」と記載する場合がある。
【００２９】
本発明において、「ＳＰ」および「ＱＡＥ」は公知のものを利用することができる。例えば、ＳＰおよびＱＡＥはSwiss-Prot等のデータベースにP19613およびP19614などとしてそれぞれ登録されている。好ましくはＳＰは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、さらに好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また好ましくはＱＡＥは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、さらに好ましくは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３０】
本発明において、ＳＰおよびＱＡＥにはそれぞれのタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。「機能的に同等のタンパク質」とは、各タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、上記定義のとおりである。また、「機能的に同等のタンパク質」には各タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、上記のとおり当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができる。
【００３１】
本明細書において、「氷結晶結合に関与するアミノ酸残基」とは、不凍タンパク質のアミノ酸配列において、当該不凍タンパク質が氷結晶の表面に特異的に結合するのに必要とされるアミノ酸残基を意味する。ＳＰおよびＱＡＥにおける氷結晶結合に関与するアミノ酸残基はそれぞれ明らかにされており、不凍タンパク質の分子表面において比較的平面性が高く、かつやや疎水的性質を有する部位を構成するアミノ酸残基がそれにあたる(Davies et al. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357: 927-935, 2002.)。例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列において、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４３、６０番にあるアミノ酸残基（すなわち、Gln、Pro、Ile、Asn、Thr、Ala、Thr、Pro、Ala、Met、Val、Gly、Gln、Lys）がそれにあたり、例えば配列番号８に示されるアミノ酸配列において、９、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、４１、４２、４４、６１番にあるアミノ酸残基（すなわち、Gln、Pro、Ile、Asn、Thr、Ala、Thr、Leu、Val、Val、Met、Val、Ser、Gln、Lys）がそれにあたる(Chen and Jia. Biophys J. 77: 1602-1608, 1999.)が特にこれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、「相対的に対応する位置」とは、ＳＰをコードするアミノ酸配列とＱＡＥをコードするアミノ酸配列とを、上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて配列比較した場合に、対応する関係にある位置を意味する。例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列における８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４３、６０番にあるアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８に示されるアミノ酸配列における９、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、４１、４２、４４、６１番にあるアミノ酸残基と相対的に対応する位置関係にある。
【００３３】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥにおいて相対的に対応する位置にある氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる。したがって、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＱＡＥの氷結晶の表面に特異的に結合するのに必要とされるアミノ酸残基が導入された改変型ＳＰである。
【００３４】
ＳＰのアミノ酸配列において置換される氷結晶結合に関与するアミノ酸残基は任意のものを、１または複数個選択することができる。ここで「複数個」とは２〜５個の範囲内で適宜選択することができ、好ましくは２個である。好ましくは上記氷結晶結合に関与するアミノ酸残基において、隣接して連続するアミノ酸残基のうち、端部にあるまたは端部に近いアミノ酸残基が選択される。好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８および１９番目にあるアミノ酸残基より、１または２個のアミノ酸残基が選択される。
【００３５】
一方、ＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基と置換して導入されるＱＡＥのアミノ酸残基は、選択されたＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基と上記相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基である。あるいは、当該相対的に対応する位置にあるＱＡＥのアミノ酸残基と同様の性質を有するアミノ酸残基であっても良い。このような同様の性質を有するアミノ酸残基は公知であり、側鎖の生化学的性質に基づいて以下のグループに分類することができる。すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）である。また、中性側鎖を有するアミノ酸グループは、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することができる。当該相対的に対応する位置にあるＱＡＥのアミノ酸残基と、上記同じグループ内にあるアミノ酸残基は「同様の性質を有するアミノ酸残基」であり、上記置換に用いることができる。
【００３６】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８番目のアミノ酸残基（すなわち、Pro）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９番目のアミノ酸残基（すなわち、Leu）によって置換されてなり、配列番号１のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ｐ１８Ｌ」と記載する場合がある。
【００３７】
また別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１９番目のアミノ酸残基（すなわち、Ala）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの２０番目のアミノ酸残基（すなわち、Val）によって置換されてなり、配列番号２のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ａ１９Ｖ」と記載する場合がある。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８および１９番目のアミノ酸残基（すなわち、ProおよびAla）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９および２０番目のアミノ酸残基（すなわち、LeuおよびVal）によって置換されてなり、配列番号３のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ」と記載する場合がある。
【００３９】
本発明において上記改変型不凍タンパク質には、（i）配列番号１〜３の各アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。また、上記改変型不凍タンパク質には、（ii）配列番号１〜３の各アミノ酸配列と少なくとも８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて決定することができる。ただし、これら（i）および（ii）の改変型不凍タンパク質において、上記置換により導入された、ＱＡＥのアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基）またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなく保存されているものとする。
【００４０】
本発明の改変型不凍タンパク質は、未改変のＳＰと比べて不凍活性が向上しており、熱ヒステリシス、氷結晶の成長阻害および氷の再結晶阻害を用いて評価した場合に、３〜５０倍またはそれ以上、例えば、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍以上の不凍活性を示す。好ましくは、氷結晶の成長阻害を用いて評価した場合に、未改変のＳＰと比べてＳＰ Ｐ１８Ｌであれば１０倍またはそれ以上、ＳＰ Ａ１９Ｖであれば３０倍またはそれ以上、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖであれば４５倍またはそれ以上の不凍活性を示す。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰにおいて相対的に対応する位置にある分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる。したがって、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＳＰの分子表面に存在するアミノ酸残基が導入された改変型ＱＡＥである。
【００４２】
本発明において、ＱＡＥおよびＳＰにおける「分子表面に存在するアミノ酸残基」としては、不凍タンパク質の分子表面に存在する極性アミノ酸残基であって、かつ下に詳述するＤＮＡ組換え法を用いて不凍タンパク質を生産した場合に、その生産性に大きく関与するアミノ酸残基を意味する。このような「分子表面に存在するアミノ酸残基」としては、例えば配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番にある極性アミノ酸残基（すなわち、Asn）がそれにあたり、例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列において、７番にある極性アミノ酸残基（すなわち、Thr）がそれにあたるが特にこれらに限定されない。
【００４３】
ＱＡＥのアミノ酸配列において、置換される分子表面に存在するアミノ酸残基は任意のものを、１または複数個選択することができる。ここで「複数個」とは２〜５個の範囲内で適宜選択することができる。好ましくは、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目にあるアミノ酸残基が選択される。
【００４４】
一方、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基と置換して導入されるＳＰのアミノ酸残基は、選択されたＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基と上記相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基である。あるいは、当該相対的に対応する位置にあるＳＰのアミノ酸残基と同様の性質を有するアミノ酸残基であっても良い。このような同様の性質を有するアミノ酸残基は上に定義される。
【００４５】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの８番目のアミノ酸残基（すなわち、Asn）が、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの７番目のアミノ酸残基（すなわち、Thr）によって置換されてなり、配列番号４のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＱＡＥ Ｎ８Ｔ」と記載する場合がある。
【００４６】
本発明において上記改変型不凍タンパク質には、（i）配列番号４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。また、上記改変型不凍タンパク質には、（ii）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて決定することができる。ただし、これら（i）および（ii）の改変型不凍タンパク質において、上記置換により導入された、ＳＰのアミノ酸残基（すなわち、配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基）またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなく保存されているものとする。
【００４７】
本発明の改変型不凍タンパク質は、未改変のＱＡＥと比べてＤＮＡ組換え法による生産性が向上しており、当該手法を用いて宿主細胞にて発現させた場合に、回収される可溶性画分における不凍タンパク質の含有量で評価して未改変のＱＡＥと比べて、２倍、３倍、４倍、５倍以上またはそれ以上の生産量を示す。「回収される可溶性画分」とは、当該組換え細胞またはその破砕物を、タンパク質抽出に一般的に用いられる水溶液、例えば、蒸留水、または緩衝液、例えば、Tris緩衝液、リン酸緩衝液、Tricine緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液など（特にこれらに限定されない）またはこれら水溶液から選択される２以上の組み合わせに懸濁し、必要に応じて破砕した後、遠心分離して得られる上清を指す。
【００４８】
本発明の改変型不凍タンパク質は、公開されているアミノ酸配列情報および／または上記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより合成することができる。
【００４９】
また、本発明の改変型不凍タンパク質は、遺伝子組換え手法を用いて合成することができる。当該手法においては、不凍タンパク質をコードするＤＮＡを上記アミノ酸残基の置換に基づいて部分的に改変することにより得られる、本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを利用する。
【００５０】
不凍タンパク質をコードするＤＮＡ、特にＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡは公知のもの、および上記ＳＰおよびＱＡＥのアミノ酸配列に基づく塩基配列情報を利用することができる。好ましくは、ＳＰをコードするＤＮＡは配列番号５に示される塩基配列を含み、ＱＡＥをコードするＤＮＡは配列番号７に示される塩基配列を含む。本発明においてＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から10個、好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。また、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、2〜6×SSC（1×SSCの組成：0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム, pH 7.0）および0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中42〜55℃にてハイブリダイズを行い、0.1〜0.2×SSCおよび0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中55〜65℃にて洗浄を行う条件をいう。さらに、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列と上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて計算したときに、85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００５１】
本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡは、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡにおいて、上記置換されるアミノ酸残基をコードする塩基配列部位に、上記置換により導入されるアミノ酸残基をコードする塩基配列を、ＰＣＲによる特異的変異導入法などの公知の手法によって導入することによって得ることができる。
【００５２】
このような手法により、配列番号１５〜１８で示される塩基配列からなる本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。各配列番号によって示される塩基配列はそれぞれ以下の改変型不凍タンパク質をコードする。
【００５３】
配列番号１５：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号１のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５４】
配列番号１６：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１９番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの２０番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号２のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５５】
配列番号１７：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８および１９番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９および２０番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号３のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５６】
配列番号１８：配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの８番目のアミノ酸残基が、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの７番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号４のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５７】
本発明において改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列において１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。「１から数個」の範囲は上に定義するとおりである。また、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、上に定義するとおりである。さらに、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列と上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて計算したときに、８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。さらにまた、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、アミノ酸変化を伴わない、縮重変異体も含まれる。ただし、これらの改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、上記置換により導入されたＳＰまたはＱＡＥのアミノ酸残基またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなくコードされているものとする。
【００５８】
以下、上記改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを用いたＤＮＡ組換え法による改変型不凍タンパク質の生産に関して説明する。ＤＮＡ組換え法は、例えば、「Sambrook et al. “Molecular Cloning, A Laboratory Manual/Second edition”Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)」に記載されている。
【００５９】
改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターは、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターを、改変型不凍タンパク質が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００６０】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００６１】
ベクターに改変型不凍タンパク質ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６２】
その他、哺乳動物細胞において用いられる改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターには、プロモーター、改変型不凍タンパク質ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
【００６３】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターを作製する。
【００６４】
形質転換に使用する宿主としては、改変型不凍タンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞などの原核細胞または真核細胞が挙げられる。
【００６５】
一例として、細菌を宿主とする場合は、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、改変型不凍タンパク質ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６６】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞を宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、改変型不凍タンパク質を生産することができる。
【００６７】
改変型不凍タンパク質は、上記作製した形質転換された細胞を培養し、その培養物から回収することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６９】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７０】
培養後、改変型不凍タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、改変型不凍タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から改変型不凍タンパク質を単離精製することができる。
【００７１】
改変型不凍タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００７２】
なお、以上の方法によって得られる組換え改変型不凍タンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも改変型不凍タンパク質として用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
【００７４】
（実施例１）配列番号１〜４で表される改変III型不凍タンパク質の組換えベクターの構築
配列番号１〜４の改変III型不凍タンパク質、ＳＰ Ｐ１８Ｌ、ＳＰ Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ、ＱＡＥ Ｎ８ＴをコードするＤＮＡの作製にはそれぞれ、図２に示すプライマーと鋳型を用いた。以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの発現ベクター構築法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現ベクターも同様に構築した。
【００７５】
ＳＰをコードするＤＮＡ(配列番号５)がクローニングされているｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）／ＳＰを鋳型にして、ＳＰ １８１９ ｂａｃｋ(配列番号１０)／ＳＰ Ｐ１８Ｌ ｆｏｒ(配列番号９)のプライマー組を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）でＰＣＲを行なうことによりベクター全域のＤＮＡ断片を増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｒｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてリン酸化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてライゲーションを行った後、大腸菌ＤＨ５α株に形質導入した。作製した形質転換体から、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列を確認したものを組換えベクターとした。
【００７６】
（実施例２）改変III型不凍タンパク質の大腸菌での発現
以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの発現法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現も同様に行なった。
【００７７】
上記のように構築した発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が導入されているため、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に大腸菌を塗布し、一晩２８℃でインキュベートすることで形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地２０ｍｌに植え２８℃で一晩培養した。２０ｍｌの培養液のうち５ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地５００ｍｌに植継ぎ、波長６００ｎｍの吸光度で大腸菌の増殖度を監視しながら２８℃で培養した。波長６００ｎｍの吸光度が０．５になったところでイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを終濃度０．５ｍＭ になるように加えることで不凍タンパク質の発現を誘導し、さらに１６時間培養を行った。培養液を３６００ｇ、４℃で１５分遠心分離し、菌体を回収した。菌体を培養液の１／２０量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８．０））に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを１１９００ｇ、４℃で３０分遠心分離し、不凍タンパク質を含む可溶性画分と不溶性画分を分離した。一般的なプロトコールに従い不凍タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。図３および図４にその結果を示す。可溶性画分におけるＱＡＥの含有量は可溶性画分におけるＳＰの含有量に比べ明らかに少ないが、改変型であるＱＡＥ Ｎ８Ｔの可溶性画分における含有量はＳＰと同等となった（図３）。また、可溶性画分におけるＳＰ Ｐ１８Ｌ、ＳＰ Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖの含有量もＳＰと同等の含有量を示した（図４）。
【００７８】
（実施例３）III型不凍タンパク質変異体の精製
以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの精製法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の精製も同様に行なった。
【００７９】
回収した可溶性画分を１２．５倍量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）で２回透析した。この時、夾雑タンパク質の多くが酸変性し、凝集・沈殿した。沈殿を１１９００ｇ、４℃で３０分遠心分離することで除去した。この試料溶液に対し、陽イオン交換カラム処理を施した。予め、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）で平衡化しておいたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥヘルスケア）に試料溶液をかけ、不凍タンパク質をカラムに吸着させた。５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）でカラムを洗浄後、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いて不凍タンパク質をカラムから溶出させた。溶出タンパク質を波長２８０ｎｍの吸光度で検出し、フラクションコレクターで分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製された不凍タンパク質を含む画分を確認し、回収した。精製不凍タンパク質を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で透析し、限外ろ過膜で濃縮した。
【００８０】
（実施例４）氷結晶成長抑制能の測定
１／３長に切断したガラスキャピラリー管（ＥＭマイスターミニキャップス、内径０．９２ｍｍ、外径１．３９ｍｍ）の中央に０．１ｍＭの不凍タンパク質を含む試料溶液０．７μｌを入れ、蒸発を防止するために両端をミネラルオイルで塞いだ。これを銅製のホルダーにはめ込み、ライカ社製ＤＭＬＢ１００型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ １００ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。そして３０μｌのエチレングリコールでガラスキャピラリー管と銅製ホルダーの隙間を満たした。冷却箱および銅製ホルダーの上下には直径１ｍｍの光取り入れ穴をあけ、顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。この上下の穴により規定される光軸上に試料溶液をセットすることで、光軸上にある試料溶液中の物質を顕微鏡観察することができる。試料溶液がセットされた冷却箱の中の温度は、リンカム社製ＬＫ６００温度制御装置（ＬＫ６００ 温度コントローラー）により制御される。室温下で試料溶液をセットした後、温度制御装置により冷却箱内の温度を毎秒３０℃でマイナス３０℃まで下降させた。およそマイナス１４℃からマイナス２５℃の間の温度のどこかで試料溶液の全体が凍結する。凍結の後に毎秒１０℃で冷却箱内温度を上昇させ零℃で上昇を停止し、そのまま１０秒程度の間、零℃を維持していると凍結が溶け、無数の亀裂の入った氷結晶状態を経たのちに、数えられる程度の氷結晶粒が水中に浮かんだものが観測された。更に冷却箱内温度を±０．０５℃の範囲で繰り返し上昇・降下させることで氷結晶を溶解させその数を減らし、最終的に一つだけの氷結晶を試料溶液中に得た。この氷結晶が溶け初める温度を融点として予め記録しておき、融点より０．２０℃低い温度で一つの氷結晶を含む試料溶液を保持し、１０分間隔で氷結晶の形状と大きさを観察した。観察結果を図５に示す。ＳＰを含む試料溶液中では、バイピラミダル氷結晶の体積が１０分間のうちに９１倍に成長した。これに対し、ＳＰ Ｐ１８Ｌでは７．５倍、ＳＰ Ａ１９Ｖでは２．７倍、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖでは１．９倍であった。３０分後においても、ＳＰ Ｐ１８Ｌでは４９倍、ＳＰ Ａ１９Ｖでは７．４倍、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖでは２．４倍であり、これらの改変III型不凍タンパク質で氷結晶成長抑制能の大幅な向上が確認された。また、ＱＡＥ Ｎ８ＴがＱＡＥと同等の氷結晶成長抑制能を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の改変型不凍タンパク質は、向上した不凍活性またはＤＮＡ組換え発現による大量生産を可能とする向上した生産性を有する。この特徴より、本発明は冷凍保存試薬や氷を細孔源とする高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞の冷蔵・冷凍保存などの分野において利用されることが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固点降下、氷結晶成長抑制、氷の再結晶化阻害、氷の形状修飾、非凍結低温環境下における細胞保護等の機能を有する不凍タンパク質、特に魚類由来III型不凍タンパク質において、アミノ酸残基置換によってＤＮＡ組換え法による生産性及び不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不凍タンパク質には２つの機能が見出されている。その１つは、氷結晶面に特異的に結合し、その成長を抑制する機能である。通常、水溶液中において氷核が現れると、まず扁平な六角あるいは円盤状の氷晶に成長する。板状平面に対し垂直方向への成長は、板状平面方向に対する成長に比べ１００倍程度遅い。これに対して、水溶液中に不凍タンパク質が存在すると板状平面方向への氷晶の成長は阻止され、最初に形成された板状体を基底面として、この基底面に対し垂直方向に、順次、より小さい板状体が積み重ねられていき、最終的にはピラミッドを二つ重ねたバイピラミッド型に氷結晶は形状修飾される（図１）。
【０００３】
したがって、不凍タンパク質を含有する水溶液を０℃以下にした場合、その水溶液中には不凍タンパク質によって互いに結びつかない無数の微細なバイピラミダル氷結晶が生成される。このことが、巨視的には、水溶液の非凍結現象として観測され、水溶液の凝固点が降下する。不凍タンパク質の氷結晶抑制能の限界を超える温度まで冷却した場合、水溶液は無数の微細なバイピラミダル氷結晶の集合体として凍結する。その結果、氷結晶どうしの融合が起こり難くなり、再結晶化が抑制される。
【０００４】
不凍タンパク質のもう一つの機能は、低温に曝された細胞の障害を低減する機能である。低温環境下では細胞の代謝が低下しＡＴＰの生産量が減少する。その結果、細胞の様々な機能が障害を受け恒常性が保てなくなる。また、細胞膜を構成する脂質二重膜の相転移に伴う膜タンパク質の機能障害、脂質二重膜そのものの破綻が生ずる。不凍タンパク質は、低温下での脂質二重膜の相転移、もしくはＡＴＰ依存性イオンポンプの破綻によって生ずるカルシウムイオンの細胞内流入を防ぐことで細胞死を回避すると考えられている。
【０００５】
近年、上述した不凍タンパク質の機能を利用し、氷結晶の成長に伴う内容物の物理的破壊を防ぐことができる冷凍保存試薬や氷を細孔源とした高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞・臓器の冷蔵・冷凍保存のための新たな技術を開発しようとする試みが盛んになっている（特許文献１、２、３、４、５、６）。不凍タンパク質は魚、昆虫、植物、バクテリア、菌類と多くの生物種で発見されているが、原材料の入手の容易さ、資源量の豊富さから、その大量生産は主に植物、魚類の生物原料から行なわれてきた。しかし、植物の不凍タンパク質含有量は非常に低く、極めて大量の原材料を収集する必要がある。また、植物や魚類を含め生物は複数種類の不凍タンパク質アイソファームを発現しており、その混合比は生物固体、季節等により変動する。これらアイソフォーム間の活性には大きな差があるため、常に安定した機能を示す不凍タンパク質を生物材料から生産するのは困難であった。さらに、生物原料には汚染物質の濃縮、未知の病原体による感染症リスク等の懸念があり、生物由来製品はその安全性確保が問題となる。一方、大腸菌由来の遺伝子組換え製品は医薬品原体の製造にも用いられるなど、汚染物質の濃縮、感染症のリスクの蓋然性が極めて低いものと認識されており、今後は特定の不凍タンパク質アイソファーム組換え体の需要が益々増加すると予想される。
【０００６】
魚類由来III型不凍タンパク質は詳細な研究が行われている不凍タンパク質で、分子量６５００〜７０００Ｄａからなる球状ペプチドである。組換え体発現の宿主として最も取り扱いが容易な大腸菌での発現系が確立されている。III型不凍タンパク質は同一魚体中に複数のアイソフォームが産生され、これらはイオン交換樹脂への吸着特性の違いからＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇグループ（以下、ＱＡＥグループに属するIII型不凍タンパク質群を「ＱＡＥ」とする）とＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇグループ（以下、ＳＰグループに属するIII型不凍タンパク質群を「ＳＰ」とする）に分類される（非特許文献１）。ＱＡＥとＳＰの一次構造上の配列同一性はおよそ５６％であり、アミノ酸残基の比較によっても、ＱＡＥとＳＰのどちらに属するか容易に判断できる。III型不凍タンパク質アイソフォームはいずれも、氷核をバイピラミダル型氷結晶（図１）に修飾することが知られているが、ＱＡＥと比較してＳＰの凝固点降下能と氷結晶成長抑制能が低いことが報告されている（非特許文献２）。それゆえ、産業用途にはこれまでＱＡＥの使用が推奨されてきた（特許文献７）。
【０００７】
しかし、魚体中のＱＡＥアイソフォームの含有比はＳＰアイソフォームに比べ小さい。例えばＯｃｅａｎ ｐｏｕｔの場合、１２種類確認されているIII型不凍タンパク質のアイソフォームのうちＱＡＥは一種類のみで残り１１種類のアイソフォームはＳＰである。また、Ｎｏｔｃｈｅｄ−ｆｉｎ ｅｅｌｐｏｕｔで最も多く発現されているアイソフォームは、ＳＰであることが明らかになっている。ＤＮＡ組換え発現によりＱＡＥを得ることも可能であるが、ＱＡＥはＳＰより溶解度が低く、より凝集しやすいために、ＳＰに比べて、回収・精製率が極めて低い。そのため、実用規模で必要な大量のＱＡＥを生産するのは困難な状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１０−５０８７５９号公報
【特許文献２】特表平１０−５１１９４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５１３０６９号公報
【特許文献４】特開２００３−２８４９３７号公報
【特許文献５】特開２００４−２８４９８３号公報
【特許文献６】特開２００５−８９３５３号公報
【特許文献７】特開２００４−４３４８４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Structure of an Antifreeze Polypeptide and Its Precursor from the Ocean Pout, Macrozoarces americanus. Xiao-Mao Li, Khiet-Yen Trinh, and Choy L. Hew. J. Biol. Chem., 260, 12904-12909, (1985).
【非特許文献２】Co-operative effect of the isoforms of type III antifreeze protein expressed in Notched-fin eelpout, Zoarces elongatus Kner. Yoshiyuki Nishimiya, Ryoko Sato, Manabu Takamichi, Ai Miura and Sakae Tsuda. FEBS J., 272, 482-492 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、ＱＡＥを生物原料から大量精製することもＤＮＡ組換え技術を利用して大量発現させることも極めて困難な状況にある中、本発明は、上記の従来技術の問題を解決する手段を与えるものである。すなわち、冷凍保存試薬や氷を細孔源とする高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞の冷蔵・冷凍保存に十分な機能を有し且つ、ＤＮＡ組換え発現による生産性が向上し大量生産を可能とする改良型不凍タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者はＳＰの氷結晶成長抑制能に重要なアミノ酸残基について鋭意研究を行なっていたところ、十数個ある氷結晶結合残基のうち、意外にも１または２個のアミノ酸残基の寄与が非常に大きく、この残基の置換が氷結晶成長抑制能を劇的に向上させることを初めて見出した。また、およそ６６アミノ酸残基からなるＱＡＥの僅か１残基を置換することで、活性を保持したまま組換え体のＤＮＡ組換え発現による生産性を劇的に向上させることが出来ることも見出した。
【００１２】
これらの知見に基づいて本発明者らは、ＳＰの氷結晶成長抑制に重要なアミノ酸残基をＱＡＥの氷結晶成長抑制に重要なアミノ酸残基に置換した変異体がＱＡＥに匹敵する氷結晶成長抑制能を発揮すること、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基をＳＰの分子表面に存在するアミノ酸残基に置換した変異体がＤＮＡ組換え発現において高い生産性を示すことを確認して本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の通りである。
[１] ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[２] ＳＰ型不凍タンパク質の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８番目および１９番目から選択される１または２つのアミノ酸残基を、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該１８番目および１９番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、[１]の改変型不凍タンパク質。
[３] （i）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；
（ii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[２]の改変型不凍タンパク質。
[４] ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[５] ＱＡＥ型不凍タンパク質の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基を、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該８番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、[４]の改変型不凍タンパク質。
【００１４】
[６] （i）配列番号４のアミノ酸配列；
（ii）配列番号４のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[５]の改変型不凍タンパク質。
[７] [１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡ。
[８] [７]のＤＮＡを含む組換えベクター。
[９] [８]の組換えベクターを含む細胞。
[１０] ＤＮＡ組換え法を用いて合成することを含む、[１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
[１１] [９]の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、[１]〜[６]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
【００１５】
尚、不凍タンパク質の呼称は、熱ヒステリシスタンパク質あるいは抗凍結タンパク質など様々な名称で呼ばれる場合がある。また、不凍タンパク質、不凍ペプチド、抗凍結タンパク質、抗凍結ペプチド、氷結晶結合タンパク質、氷結晶結合ペプチド、再結晶化阻害タンパク質、再結晶化阻害ペプチドなどと表記される場合がある。また、Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、Ｉｃｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＢＰ）、Ｉｃｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＳＰ）など複数の呼び名がある。本発明においては、これらを全て不凍タンパク質とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、向上した不凍活性またはＤＮＡ組換え発現による大量生産を可能とする向上した生産性を有する改良型不凍タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、バイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図である。
【図２】図２は、組換えベクター構築に用いたプライマー及び鋳型を示す図である。
【図３】図３は、III型不凍タンパク質ＳＰ、ＱＡＥまたはＱＡＥ Ｎ８Ｔを組換え発現させた大腸菌内タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】図４は、III型不凍タンパク質ＳＰ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８ＬまたはＳＰ Ａ１９Ｖを組換え発現させた大腸菌内タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】図５はIII型不凍タンパク質または各種改変III型不凍タンパク質を含む試料を融点から０．２℃低い温度に保った時に観察された氷結晶の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において不凍タンパク質とは、不凍活性を有するタンパク質を意味し、魚類等の生体内において、凍結温度域で細胞内に生成する氷結晶の表面に特異的に結合してその成長を抑制し、組織の凍結から身を守る生体防御物質である。本明細書において、不凍タンパク質とは、不凍活性を有するペプチドおよびタンパク質の双方を包含するものとする。
【００１９】
不凍タンパク質の不凍活性は、該タンパク質が添加された含水物に対し、熱ヒステリシス、氷結晶の成長阻害および氷の再結晶阻害のいずれかをもたらす活性として評価される。あるいは、不凍タンパク質が存在する含水物中には、特徴的な形状の氷結晶（例えば、魚類由来の不凍タンパク質では、ピラミッドを二つ底面で重ねたバイピラミダル型氷結晶（図１））が生成することから、氷結晶の形状を顕微鏡で観察することにより対象とするタンパク質の不凍活性を評価することもできる。
【００２０】
通常、水の凝固点と氷の融点は同一であるが、不凍タンパク質が存在するとそれが氷結晶と結合するため、水の凝固点と氷の融点に差が生じる。この現象を熱ヒステリシスという。不凍タンパク質における不凍活性の大きさは、通常、不凍タンパク質が存在するときに生じる氷の融点と水の凝固点の差によって評価され、本明細書において、この融点と凝固点の差を熱ヒステリシス活性として定義する。熱ヒステリシス活性は、浸透圧計（オスモメーター）を用いることによって測定することができる。また、形成した氷結晶は、−１０℃以上の比較的高い温度での昇華または一部融解によって、生じた水分を吸収し成長する。氷の再結晶阻害とは、この現象を阻害する効果をいう。
【００２１】
本明細書において「含水物」とは、水分子と水分子以外の分子とを含む物質を意味し、例えば、溶質と溶媒からなる水溶液、水に溶解しない物質と水との混合液、穀類、麺類、卵、野菜、果実、肉類、魚介類、パン生地、氷菓子および加工食品などの食品、医療品、診断薬、試薬、化粧品、化粧水、血液、血清、血小板、精子、卵子、単細胞、多細胞、生体組織、心臓、膵臓、肝臓および腎臓などの臓器ならびにこれらの保存液、融雪剤、霜害防止剤等が挙げられる。
【００２２】
本発明において使用する不凍タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、魚類由来、昆虫由来、菌類由来、哺乳動物由来および植物由来の不凍タンパク質が挙げられる。好ましくは魚類に由来する不凍タンパク質であり、さらに好ましくはナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ）属の魚類、特に好ましくはナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ Ｋｎｅｒ）の筋肉から得られる不凍タンパク質である。魚類由来不凍タンパク質には主として４つのタイプがあり、分子量約３,０００〜４,５００のＩ型不凍タンパク質、分子量約２０,０００のＩＩ型不凍タンパク質、分子量約７,０００のＩＩＩ型不凍タンパク質、および分子量約１１,０００のＩＶ型不凍タンパク質に分類されている。本発明において好ましい不凍タンパク質は、ＩＩＩ型不凍タンパク質である。
【００２３】
本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、陽イオン交換樹脂、特に荷電基としてスルホプロピル（ＳＰ）基を有するイオン交換樹脂に結合する不凍タンパク質を意味する。
【００２４】
また本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＳＰのアミノ酸配列(配列番号１９)において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。さらに、本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＳＰのアミノ酸配列(配列番号１９)と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２５】
本明細書において、「ＳＰ型不凍タンパク質」を「ＳＰ」と記載する場合がある。
【００２６】
また、本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、陰イオン交換樹脂、例えば荷電基として第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基を有するイオン交換樹脂、に結合する不凍タンパク質を意味する。
【００２７】
また本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＱＡＥのアミノ酸配列(配列番号２０)において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、上記定義のとおりである。さらに、本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」とは、Macrozoarces americanus由来のＱＡＥのアミノ酸配列(配列番号２０)と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、上記のとおり当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができる。
【００２８】
本明細書において、「ＱＡＥ型不凍タンパク質」を「ＱＡＥ」と記載する場合がある。
【００２９】
本発明において、「ＳＰ」および「ＱＡＥ」は公知のものを利用することができる。例えば、ＳＰおよびＱＡＥはSwiss-Prot等のデータベースにP19613およびP19614などとしてそれぞれ登録されている。好ましくはＳＰは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、さらに好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また好ましくはＱＡＥは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、さらに好ましくは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３０】
本発明において、ＳＰおよびＱＡＥにはそれぞれのタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。「機能的に同等のタンパク質」とは、各タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、上記定義のとおりである。また、「機能的に同等のタンパク質」には各タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、上記のとおり当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができる。
【００３１】
本明細書において、「氷結晶結合に関与するアミノ酸残基」とは、不凍タンパク質のアミノ酸配列において、当該不凍タンパク質が氷結晶の表面に特異的に結合するのに必要とされるアミノ酸残基を意味する。ＳＰおよびＱＡＥにおける氷結晶結合に関与するアミノ酸残基はそれぞれ明らかにされており、不凍タンパク質の分子表面において比較的平面性が高く、かつやや疎水的性質を有する部位を構成するアミノ酸残基がそれにあたる(Davies et al. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357: 927-935, 2002.)。例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列において、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４３、６０番にあるアミノ酸残基（すなわち、Gln、Pro、Ile、Asn、Thr、Ala、Thr、Pro、Ala、Met、Val、Gly、Gln、Lys）がそれにあたり、例えば配列番号８に示されるアミノ酸配列において、９、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、４１、４２、４４、６１番にあるアミノ酸残基（すなわち、Gln、Pro、Ile、Asn、Thr、Ala、Thr、Leu、Val、Val、Met、Val、Ser、Gln、Lys）がそれにあたる(Chen and Jia. Biophys J. 77: 1602-1608, 1999.)が特にこれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、「相対的に対応する位置」とは、ＳＰをコードするアミノ酸配列とＱＡＥをコードするアミノ酸配列とを、上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて配列比較した場合に、対応する関係にある位置を意味する。例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列における８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４３、６０番にあるアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８に示されるアミノ酸配列における９、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、４１、４２、４４、６１番にあるアミノ酸残基と相対的に対応する位置関係にある。
【００３３】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥにおいて相対的に対応する位置にある氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる。したがって、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＱＡＥの氷結晶の表面に特異的に結合するのに必要とされるアミノ酸残基が導入された改変型ＳＰである。
【００３４】
ＳＰのアミノ酸配列において置換される氷結晶結合に関与するアミノ酸残基は任意のものを、１または複数個選択することができる。ここで「複数個」とは２〜５個の範囲内で適宜選択することができ、好ましくは２個である。好ましくは上記氷結晶結合に関与するアミノ酸残基において、隣接して連続するアミノ酸残基のうち、端部にあるまたは端部に近いアミノ酸残基が選択される。好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８および１９番目にあるアミノ酸残基より、１または２個のアミノ酸残基が選択される。
【００３５】
一方、ＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基と置換して導入されるＱＡＥのアミノ酸残基は、選択されたＳＰの氷結晶結合に関与するアミノ酸残基と上記相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基である。あるいは、当該相対的に対応する位置にあるＱＡＥのアミノ酸残基と同様の性質を有するアミノ酸残基であっても良い。このような同様の性質を有するアミノ酸残基は公知であり、側鎖の生化学的性質に基づいて以下のグループに分類することができる。すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）である。また、中性側鎖を有するアミノ酸グループは、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸グループ（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することができる。当該相対的に対応する位置にあるＱＡＥのアミノ酸残基と、上記同じグループ内にあるアミノ酸残基は「同様の性質を有するアミノ酸残基」であり、上記置換に用いることができる。
【００３６】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８番目のアミノ酸残基（すなわち、Pro）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９番目のアミノ酸残基（すなわち、Leu）によって置換されてなり、配列番号１のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ｐ１８Ｌ」と記載する場合がある。
【００３７】
また別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１９番目のアミノ酸残基（すなわち、Ala）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの２０番目のアミノ酸残基（すなわち、Val）によって置換されてなり、配列番号２のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ａ１９Ｖ」と記載する場合がある。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８および１９番目のアミノ酸残基（すなわち、ProおよびAla）が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９および２０番目のアミノ酸残基（すなわち、LeuおよびVal）によって置換されてなり、配列番号３のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ」と記載する場合がある。
【００３９】
本発明において上記改変型不凍タンパク質には、（i）配列番号１〜３の各アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。また、上記改変型不凍タンパク質には、（ii）配列番号１〜３の各アミノ酸配列と少なくとも８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて決定することができる。ただし、これら（i）および（ii）の改変型不凍タンパク質において、上記置換により導入された、ＱＡＥのアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基）またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなく保存されているものとする。
【００４０】
本発明の改変型不凍タンパク質は、未改変のＳＰと比べて不凍活性が向上しており、熱ヒステリシス、氷結晶の成長阻害および氷の再結晶阻害を用いて評価した場合に、３〜５０倍またはそれ以上、例えば、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍以上の不凍活性を示す。好ましくは、氷結晶の成長阻害を用いて評価した場合に、未改変のＳＰと比べてＳＰ Ｐ１８Ｌであれば１０倍またはそれ以上、ＳＰ Ａ１９Ｖであれば３０倍またはそれ以上、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖであれば４５倍またはそれ以上の不凍活性を示す。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰにおいて相対的に対応する位置にある分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる。したがって、本発明の改変型不凍タンパク質は、ＳＰの分子表面に存在するアミノ酸残基が導入された改変型ＱＡＥである。
【００４２】
本発明において、ＱＡＥおよびＳＰにおける「分子表面に存在するアミノ酸残基」としては、不凍タンパク質の分子表面に存在する極性アミノ酸残基であって、かつ下に詳述するＤＮＡ組換え法を用いて不凍タンパク質を生産した場合に、その生産性に大きく関与するアミノ酸残基を意味する。このような「分子表面に存在するアミノ酸残基」としては、例えば配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番にある極性アミノ酸残基（すなわち、Asn）がそれにあたり、例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列において、７番にある極性アミノ酸残基（すなわち、Thr）がそれにあたるが特にこれらに限定されない。
【００４３】
ＱＡＥのアミノ酸配列において、置換される分子表面に存在するアミノ酸残基は任意のものを、１または複数個選択することができる。ここで「複数個」とは２〜５個の範囲内で適宜選択することができる。好ましくは、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目にあるアミノ酸残基が選択される。
【００４４】
一方、ＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基と置換して導入されるＳＰのアミノ酸残基は、選択されたＱＡＥの分子表面に存在するアミノ酸残基と上記相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基である。あるいは、当該相対的に対応する位置にあるＳＰのアミノ酸残基と同様の性質を有するアミノ酸残基であっても良い。このような同様の性質を有するアミノ酸残基は上に定義される。
【００４５】
一実施形態において、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの８番目のアミノ酸残基（すなわち、Asn）が、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの７番目のアミノ酸残基（すなわち、Thr）によって置換されてなり、配列番号４のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質である。好ましくは、本発明の改変型不凍タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列からなる。本明細書において、当該改変型不凍タンパク質を「ＱＡＥ Ｎ８Ｔ」と記載する場合がある。
【００４６】
本発明において上記改変型不凍タンパク質には、（i）配列番号４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ不凍活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、通常、２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。また、上記改変型不凍タンパク質には、（ii）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、不凍活性を有するタンパク質も包含される。アミノ酸配列の同一性は、当技術分野において通常用いられる方法によって決定することができ、例えば上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて決定することができる。ただし、これら（i）および（ii）の改変型不凍タンパク質において、上記置換により導入された、ＳＰのアミノ酸残基（すなわち、配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基）またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなく保存されているものとする。
【００４７】
本発明の改変型不凍タンパク質は、未改変のＱＡＥと比べてＤＮＡ組換え法による生産性が向上しており、当該手法を用いて宿主細胞にて発現させた場合に、回収される可溶性画分における不凍タンパク質の含有量で評価して未改変のＱＡＥと比べて、２倍、３倍、４倍、５倍以上またはそれ以上の生産量を示す。「回収される可溶性画分」とは、当該組換え細胞またはその破砕物を、タンパク質抽出に一般的に用いられる水溶液、例えば、蒸留水、または緩衝液、例えば、Tris緩衝液、リン酸緩衝液、Tricine緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液など（特にこれらに限定されない）またはこれら水溶液から選択される２以上の組み合わせに懸濁し、必要に応じて破砕した後、遠心分離して得られる上清を指す。
【００４８】
本発明の改変型不凍タンパク質は、公開されているアミノ酸配列情報および／または上記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより合成することができる。
【００４９】
また、本発明の改変型不凍タンパク質は、遺伝子組換え手法を用いて合成することができる。当該手法においては、不凍タンパク質をコードするＤＮＡを上記アミノ酸残基の置換に基づいて部分的に改変することにより得られる、本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを利用する。
【００５０】
不凍タンパク質をコードするＤＮＡ、特にＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡは公知のもの、および上記ＳＰおよびＱＡＥのアミノ酸配列に基づく塩基配列情報を利用することができる。好ましくは、ＳＰをコードするＤＮＡは配列番号５に示される塩基配列を含み、ＱＡＥをコードするＤＮＡは配列番号７に示される塩基配列を含む。本発明においてＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から10個、好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。また、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、2〜6×SSC（1×SSCの組成：0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム, pH 7.0）および0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中42〜55℃にてハイブリダイズを行い、0.1〜0.2×SSCおよび0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中55〜65℃にて洗浄を行う条件をいう。さらに、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡには、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列と上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて計算したときに、85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００５１】
本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡは、ＳＰおよびＱＡＥをコードするＤＮＡにおいて、上記置換されるアミノ酸残基をコードする塩基配列部位に、上記置換により導入されるアミノ酸残基をコードする塩基配列を、ＰＣＲによる特異的変異導入法などの公知の手法によって導入することによって得ることができる。
【００５２】
このような手法により、配列番号１５〜１８で示される塩基配列からなる本発明の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。各配列番号によって示される塩基配列はそれぞれ以下の改変型不凍タンパク質をコードする。
【００５３】
配列番号１５：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号１のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５４】
配列番号１６：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１９番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの２０番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号２のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５５】
配列番号１７：配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの１８および１９番目のアミノ酸残基が、配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの１９および２０番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号３のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５６】
配列番号１８：配列番号８に示されるアミノ酸配列によって示されるＱＡＥの８番目のアミノ酸残基が、配列番号６に示されるアミノ酸配列によって示されるＳＰの７番目のアミノ酸残基によって置換されてなり、配列番号４のアミノ酸配列を含む不凍タンパク質。
【００５７】
本発明において改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列において１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。「１から数個」の範囲は上に定義するとおりである。また、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、上に定義するとおりである。さらに、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１５〜１８に示される塩基配列と上記ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いて計算したときに、８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ不凍活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。さらにまた、改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡには、アミノ酸変化を伴わない、縮重変異体も含まれる。ただし、これらの改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、上記置換により導入されたＳＰまたはＱＡＥのアミノ酸残基またはそれと同様の性質を有するアミノ酸残基は、置換、欠失等されることなくコードされているものとする。
【００５８】
以下、上記改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡを用いたＤＮＡ組換え法による改変型不凍タンパク質の生産に関して説明する。ＤＮＡ組換え法は、例えば、「Sambrook et al. “Molecular Cloning, A Laboratory Manual/Second edition”Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)」に記載されている。
【００５９】
改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターは、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターを、改変型不凍タンパク質が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００６０】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００６１】
ベクターに改変型不凍タンパク質ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６２】
その他、哺乳動物細胞において用いられる改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターには、プロモーター、改変型不凍タンパク質ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
【００６３】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターを作製する。
【００６４】
形質転換に使用する宿主としては、改変型不凍タンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞などの原核細胞または真核細胞が挙げられる。
【００６５】
一例として、細菌を宿主とする場合は、改変型不凍タンパク質生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、改変型不凍タンパク質ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６６】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞を宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、改変型不凍タンパク質を生産することができる。
【００６７】
改変型不凍タンパク質は、上記作製した形質転換された細胞を培養し、その培養物から回収することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６９】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７０】
培養後、改変型不凍タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、改変型不凍タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から改変型不凍タンパク質を単離精製することができる。
【００７１】
改変型不凍タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００７２】
なお、以上の方法によって得られる組換え改変型不凍タンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも改変型不凍タンパク質として用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
【００７４】
（実施例１）配列番号１〜４で表される改変III型不凍タンパク質の組換えベクターの構築
配列番号１〜４の改変III型不凍タンパク質、ＳＰ Ｐ１８Ｌ、ＳＰ Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖ、ＱＡＥ Ｎ８ＴをコードするＤＮＡの作製にはそれぞれ、図２に示すプライマーと鋳型を用いた。以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの発現ベクター構築法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現ベクターも同様に構築した。
【００７５】
ＳＰをコードするＤＮＡ(配列番号５)がクローニングされているｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）／ＳＰを鋳型にして、ＳＰ １８１９ ｂａｃｋ(配列番号１０)／ＳＰ Ｐ１８Ｌ ｆｏｒ(配列番号９)のプライマー組を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）でＰＣＲを行なうことによりベクター全域のＤＮＡ断片を増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｒｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてリン酸化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてライゲーションを行った後、大腸菌ＤＨ５α株に形質導入した。作製した形質転換体から、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列を確認したものを組換えベクターとした。
【００７６】
（実施例２）改変III型不凍タンパク質の大腸菌での発現
以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの発現法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現も同様に行なった。
【００７７】
上記のように構築した発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が導入されているため、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に大腸菌を塗布し、一晩２８℃でインキュベートすることで形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地２０ｍｌに植え２８℃で一晩培養した。２０ｍｌの培養液のうち５ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地５００ｍｌに植継ぎ、波長６００ｎｍの吸光度で大腸菌の増殖度を監視しながら２８℃で培養した。波長６００ｎｍの吸光度が０．５になったところでイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを終濃度０．５ｍＭ になるように加えることで不凍タンパク質の発現を誘導し、さらに１６時間培養を行った。培養液を３６００ｇ、４℃で１５分遠心分離し、菌体を回収した。菌体を培養液の１／２０量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８．０））に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを１１９００ｇ、４℃で３０分遠心分離し、不凍タンパク質を含む可溶性画分と不溶性画分を分離した。一般的なプロトコールに従い不凍タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。図３および図４にその結果を示す。可溶性画分におけるＱＡＥの含有量は可溶性画分におけるＳＰの含有量に比べ明らかに少ないが、改変型であるＱＡＥ Ｎ８Ｔの可溶性画分における含有量はＳＰと同等となった（図３）。また、可溶性画分におけるＳＰ Ｐ１８Ｌ、ＳＰ Ａ１９Ｖ、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖの含有量もＳＰと同等の含有量を示した（図４）。
【００７８】
（実施例３）III型不凍タンパク質変異体の精製
以下、ＳＰ Ｐ１８Ｌの精製法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の精製も同様に行なった。
【００７９】
回収した可溶性画分を１２．５倍量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）で２回透析した。この時、夾雑タンパク質の多くが酸変性し、凝集・沈殿した。沈殿を１１９００ｇ、４℃で３０分遠心分離することで除去した。この試料溶液に対し、陽イオン交換カラム処理を施した。予め、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）で平衡化しておいたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥヘルスケア）に試料溶液をかけ、不凍タンパク質をカラムに吸着させた。５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）でカラムを洗浄後、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いて不凍タンパク質をカラムから溶出させた。溶出タンパク質を波長２８０ｎｍの吸光度で検出し、フラクションコレクターで分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製された不凍タンパク質を含む画分を確認し、回収した。精製不凍タンパク質を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で透析し、限外ろ過膜で濃縮した。
【００８０】
（実施例４）氷結晶成長抑制能の測定
１／３長に切断したガラスキャピラリー管（ＥＭマイスターミニキャップス、内径０．９２ｍｍ、外径１．３９ｍｍ）の中央に０．１ｍＭの不凍タンパク質を含む試料溶液０．７μｌを入れ、蒸発を防止するために両端をミネラルオイルで塞いだ。これを銅製のホルダーにはめ込み、ライカ社製ＤＭＬＢ１００型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ １００ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。そして３０μｌのエチレングリコールでガラスキャピラリー管と銅製ホルダーの隙間を満たした。冷却箱および銅製ホルダーの上下には直径１ｍｍの光取り入れ穴をあけ、顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。この上下の穴により規定される光軸上に試料溶液をセットすることで、光軸上にある試料溶液中の物質を顕微鏡観察することができる。試料溶液がセットされた冷却箱の中の温度は、リンカム社製ＬＫ６００温度制御装置（ＬＫ６００ 温度コントローラー）により制御される。室温下で試料溶液をセットした後、温度制御装置により冷却箱内の温度を毎秒３０℃でマイナス３０℃まで下降させた。およそマイナス１４℃からマイナス２５℃の間の温度のどこかで試料溶液の全体が凍結する。凍結の後に毎秒１０℃で冷却箱内温度を上昇させ零℃で上昇を停止し、そのまま１０秒程度の間、零℃を維持していると凍結が溶け、無数の亀裂の入った氷結晶状態を経たのちに、数えられる程度の氷結晶粒が水中に浮かんだものが観測された。更に冷却箱内温度を±０．０５℃の範囲で繰り返し上昇・降下させることで氷結晶を溶解させその数を減らし、最終的に一つだけの氷結晶を試料溶液中に得た。この氷結晶が溶け初める温度を融点として予め記録しておき、融点より０．２０℃低い温度で一つの氷結晶を含む試料溶液を保持し、１０分間隔で氷結晶の形状と大きさを観察した。観察結果を図５に示す。ＳＰを含む試料溶液中では、バイピラミダル氷結晶の体積が１０分間のうちに９１倍に成長した。これに対し、ＳＰ Ｐ１８Ｌでは７．５倍、ＳＰ Ａ１９Ｖでは２．７倍、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖでは１．９倍であった。３０分後においても、ＳＰ Ｐ１８Ｌでは４９倍、ＳＰ Ａ１９Ｖでは７．４倍、ＳＰ Ｐ１８Ｌ／Ａ１９Ｖでは２．４倍であり、これらの改変III型不凍タンパク質で氷結晶成長抑制能の大幅な向上が確認された。また、ＱＡＥ Ｎ８ＴがＱＡＥと同等の氷結晶成長抑制能を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の改変型不凍タンパク質は、向上した不凍活性またはＤＮＡ組換え発現による大量生産を可能とする向上した生産性を有する。この特徴より、本発明は冷凍保存試薬や氷を細孔源とする高気孔構造体の構築、氷スラリーの安定化、細胞の冷蔵・冷凍保存などの分野において利用されることが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【請求項２】
ＳＰ型不凍タンパク質の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８番目および１９番目から選択される１または２つのアミノ酸残基を、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該１８番目および１９番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、請求項１記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項３】
（i）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；
（ii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項２記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項４】
ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【請求項５】
ＱＡＥ型不凍タンパク質の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基を、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該８番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、請求項４記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項６】
（i）配列番号４のアミノ酸配列；
（ii）配列番号４のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項５記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含む細胞。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え法を用いて合成することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
【請求項１】
ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数が、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【請求項２】
ＳＰ型不凍タンパク質の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１８番目および１９番目から選択される１または２つのアミノ酸残基を、ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該１８番目および１９番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、請求項１記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項３】
（i）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；
（ii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号１のアミノ酸配列における１８番目、配列番号２のアミノ酸配列における１９番目、ならびに配列番号３のアミノ酸配列における１８番目および１９番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項２記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項４】
ＱＡＥ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数が、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の１または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の１または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【請求項５】
ＱＡＥ型不凍タンパク質の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基を、ＳＰ型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該８番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、請求項４記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項６】
（i）配列番号４のアミノ酸配列；
（ii）配列番号４のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列；または
（iii）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号４のアミノ酸配列において８番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項５記載の改変型不凍タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含む細胞。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え法を用いて合成することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２９５０４（Ｐ２０１１−２２９５０４Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０５５８３（Ｐ２０１０−１０５５８３）
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
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