痛みの軽減のためのガンマ阻害剤化合物の使用方法
本明細書の開示は、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチド、かかるペプチドを作製する方法、およびγＰＫＣ阻害性ペプチドを痛みの治療に使用するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、異なる分類の痛みを調節する化合物に関し、該化合物は、少なくとも１以上の担体部分と連結した１または２以上のガンマＰＫＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチドを含み、該阻害性ペプチド、該担体部分、またはその両方が、得られた化合物の安定性、効力、またはその両方が増大するように原型配列から修飾されている。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）は、細胞成長、遺伝子発現の制御、およびイオンチャネル活性を含む様々な細胞機能に関与するシグナル伝達の主要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムは、少なくとも１１種の異なるプロテインキナーゼを含み、これらは、そのホモロジーおよび活性化因子への感受性に基づいて少なくとも３つのサブファミリーに分けることができる。そのファミリーは、在来型（classical）、新型（novel）、非定型（atypical）サブファミリーである。各アイソザイムは、いくつもの相同性（「保存された」または「Ｃ」）ドメインと散在するアイソザイム固有（「可変」または「Ｖ」）ドメインを含む。ガンマＰＫＣ（γＰＫＣ）は、α、βＩ（Ｂ２としても知られている）、およびβＩＩ（Ｂ１としても知られている）ＰＫＣとともに、「在来型」サブファミリーのメンバーである。
【０００３】
ＰＫＣの個々のアイソザイムは、様々な病態の機序に関係があるとされてきた。εＰＫＣ由来のイプシロンＰＫＣ阻害性ペプチドが作製され、痛覚への影響を示されている。例えばＵＳ特許第６，３７６，４６７号および同第６，６８６，３３４号を参照。γＰＫＣ由来のガンマＰＫＣ阻害性ペプチドもまたＵＳ２００３０２２３９８１号公報に内包され、それは本明細書に参照として組込まれる。
【０００４】
このアプローチの１つの問題点は、切り取られた断片の「裸の」終端は、タンパク質中でのそれらの状況とは異なり、断片がタンパク質の残りと連結するポイントにおいて、遊離アミンおよびカルボキシル基を露呈していることである。これらの外来の部分は、ペプチドを、プロテアーゼに対してより敏感にし得る。これらの不利な点の結果として、ペプチドの効力は、所望のものよりも低くなり得、in vivo半減期は顕著に短くなり得る。
【０００５】
先行技術の第２の領域は、「担体」ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔおよび他のタンパク質の断片として設計されるという、同様の戦略を利用する。これらのペプチド断片は、親タンパク質の細胞膜を横断する能力を模倣する。特に興味深い能力は、これらの担体ペプチド断片によって、カーゴおよび担体ペプチドの両方が細胞内に運ばれるように、「カーゴ」ペプチドをこれらの担体ペプチドに取り付けることができるという特性である。
担体ペプチドが断片であるという認識から、上述したような同様の欠点がカーゴペプチドに適用され得る。すなわち、露呈した末端が、プロテアーゼ感受性を含む望ましくない特性を授け得ることである。
【０００６】
先行技術のカーゴ／担体ペプチド構築物は、カーゴと担体との間のＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を利用し、それは、ペプチドが細胞に入った場合に、グルタチオン還元などの多くの媒介物により開裂することができる。この特性は、カーゴおよび担体が物理的に分離することによって二つの部分が細胞内でその独立した効果を発揮するため、生物学的活性にとって重要であると考えられている。しかしながらこの仮説について信頼性のある試験がなされたことはなく、非開裂性アナログは、実際のところ、良好な活性を有し得る。さらに、ジスルフィド結合は、組み立てるのが面倒であり、化学分解しやすい。
【０００７】
特定のカーゴ／担体ペプチド先行技術の設計は、タンパク質からのアミノ酸の連続配列に基づいている。しかしながら、ペプチドの最適な長さは、経験に基づくアナログ試験よりも、配列比較分析および望ましい配列の理論的予測に基づいており、未だよく定義されていない。したがって、それが由来するγＰＫＣドメインに対応する付加的な残基を含む、前述のカーゴペプチドのアナログから、効能の増大が予測され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、γＰＫＣ阻害性タンパク質で処理した試料のウェスタンブロットを示し、サイトゾル中および膜画分における酵素レベルにおける阻害剤の影響を示す。
【図２】図２は、２グラムのフォンフレイ（Von Frey）フィラメントを用いた研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足を引っ込めた数をプロットした線グラフを示す。
【図３】図３は、１２グラムのフォンフレイフィラメントを用いた研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足を引っ込めた数をプロットした線グラフを示す。
【０００９】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２グラムおよび１２グラムのフォンフレイフィラメントを用いた２つの研究における、切断後の日数に対して足を引っ込めた平均数をプロットした２つの線グラフ、および切断後７．５日目における交叉イベントを示す。
【図５】図５は、温熱性痛覚過敏の研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。
【図６】図６は、温熱性痛覚過敏の研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフ、および７．５日目における交差イベントを示す。
【００１０】
【図７】図７は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後第１〜７日目の間ポンプを通してペプチドを与えた後、第１４日目において阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【図８】図８は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後第７〜１４日目の間ポンプを通してペプチドを与えた後、第１４日目において阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【図９】図９は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後１４日目に阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書の開示は、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチド、かかるペプチドを作製する方法、およびγＰＫＣ阻害性ペプチドを痛みの治療に利用する方法に関する。他の側面および態様は、以下の詳細な記載から当業者に明らかである。
【００１２】
発明の記載
ここに記載される発明は、ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）アイソザイムを阻害する修飾されたペプチドに関する。典型的には、本明細書中で論じられるγＰＫＣ阻害性ペプチドは、阻害性ペプチドの標的細胞内への輸送を促進する担体部位と連結している。カーゴ阻害ペプチド、担体ペプチド、またはその両方は、得られるカーゴ／担体ペプチド構築物の安定性の増大を制御するため、原型対照と比較して修飾されることができる。開示された修飾γＰＫＣペプチドは、急性の痛み、慢性の痛みおよび炎症性の痛みなど、様々なタイプの痛みを防ぐおよび治療するのに有用である。
【００１３】
定義
本明細書中で使用される場合、以下の語および語句は、その語が使用された文脈が他の意味を意図している場合を除き、一般的に以下に記載された意味を有することを意図している。
「ＰＫＣ阻害性ペプチド」は、γＰＫＣ酵素を阻害するかまたは不活性化することができるペプチドをいう。
「キャップされた」という語は、アミノ末端、カルボキシ末端またはその両方を変更するように化学的に修飾されたペプチドをいう。未修飾カーゴペプチドとジスルフィド結合した、キャップされた担体ペプチドを図２に示す。
【００１４】
「担体」という語は、例えばＵＳ特許および公報第４，８４７，２４０号、第５，８８８，７６２号、第５，７４７，６４１号、第６，５９３，２９２号、ＵＳ２００３／０１０４６２２号、ＵＳ２００３／０１９９６７７号およびＵＳ２００３／０２０６９００号などに記載されているように、ポリリジン、ポリアルギニン、アンテナペディア由来ペプチド、ＨＩＶ Ｔａｔ由来ペプチドなどを含む、カチオンポリマー、ペプチドおよび抗体配列など、細胞内取り込みを促進する部位をいう。担体部分の例は、輸送体ペプチドに化学的に連結又は結合されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの細胞内取り込みを促進する「担体ペプチド」である。
【００１５】
「予防」という語は、「処置」の一要素として、本明細書で定義される「防ぐこと」および「抑制すること」の両方を包含することを意図する。ヒトの医薬品において、「防ぐこと」と「抑制すること」とを区別することが常に可能なわけではないことは、当業者に理解されるだろう。なぜならば、最終的に誘導される出来事が未知であるか、潜在的であるか、または出来事の発生から十分後になるまで患者が確認されないことがあるからである。
【００１６】
「安定性」という語は一般的に、例えば保存期間に基づくｃｙｓ−ｃｙｓ交換を遅延させることにより、タンパク質分解を遅延させることにより、またはその両方により、保存期限を改善する修飾をいう。「効能」という語は、特定の結果を達成するのに必要な特定のペプチド組成物の量に関する。所望の終点を達成するための１つの組成物の投与量を減少させられるとき、そのペプチド組成物は他よりも効能が高い。所与のペプチド組成物の特定の修飾を行うことにより、その組成物の効能を増大させることができる。
【００１７】
ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチド
様々なγＰＫＣ阻害剤が本明細書に記載され、本明細書により開示された方法によって使用することができる。阻害性ペプチドは、可変または保存性の、あらゆるドメインに由来することができる。したがって、阻害性ペプチドはＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４またはＶ５に由来することができる。阻害性ペプチドはまた、保存性領域Ｃ１（Ｃ１ａ、Ｃ１ｂ）、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５に由来することもできる。１または２以上のこれらの領域と重複するペプチドもまた企図される。カーゴペプチドは様々なドメインに由来し、長さについて５〜３０アミノ酸の長さの範囲にある。より好ましくは、ＰＫＣドメインに由来するペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基の長さである。他の原型ペプチドの給源は、「プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異性アンタゴニスト」と標題された、ＵＳ特許出願番号１１／０１１，５５７に見出すことができ、そこでは活性化ペプチドを採取し、それを阻害性ペプチドに変換しており、その全てが本明細書に参照として組込まれる。
【００１８】
１つの態様において、カーゴペプチドは、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ（配列番号１）のアミノ酸配列、ペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内部に位置するシステイン残基、およびカーゴペプチドに結合した担体ペプチドを含む、γＰＫＣのγＰＫＣ阻害性ペプチド誘導体である。上記のカーゴペプチドはさらに、互いに連結し、最終的に担体ペプチドに連結する、１または２以上の付加的なカーゴペプチドを含むことができる。
【００１９】
担体およびカーゴの両方への修飾は、効能、生物学的液体／組織中での安定性および化学的安定性の改善の目的で行われた。これらの変化は、γＰＫＣ阻害剤に、様々な臨床的適応における使用のための増強された特性を与える。
適用されるいくつかの修飾は以下を含む：
１．カーゴおよび／または担体ペプチドをキャップしてin vivoでのタンパク質分解を防止し、それにより効能および／または薬効の持続時間を増大する；
２．効能を改善するために親タンパク質の付加的な連続領域を組込んだ重複ペプチドを作製する；
３．化学的安定性および薬物製品の保存期間を改善するためにカーゴおよび担体を単一のペプチド鎖内に有するリニアペプチドを作製する；
４．プロテアーゼ抵抗性および効能を改善するために２またはそれ以上の活性ペプチドのコピーを有するマルチマーペプチドを作製する；
５．タンパク質分解を防止するためにペプチドのレトロ−インベルソアナログを作製する；および
６．改善された化学安定性を提供するためにジスルフィドアナログを導入する。
【００２０】
本明細書に記載された修飾は、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの効能、血漿安定性、および化学的安定性を改善する。γＰＫＣ阻害性ペプチドへの効果的な修飾は、原型γＰＫＣ阻害性ペプチドを選択し、それらのペプチドを痛みの治療のためのカーゴペプチドとして供するために修飾することによって同定される。原型ペプチドは、現在既知のペプチドであってもまだγＰＫＣ阻害性ペプチドとして同定されていないものであってもよい。あらゆる阻害性γＰＫＣペプチドが開始カーゴ配列として用いることができるけれども、好ましい原型配列はＲ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ（配列番号１）であり、ここでペプチドは修飾されておらず、カーゴおよび担体ペプチドのアミノ末端に位置するＣｙｓ残基を通じて担体に接合している。
【００２１】
様々な修飾されたまたはアナログのペプチドが企図される。かかるアナログのいくつかは、原型配列と重複しおよびそれを超えて拡張したアミノ酸配列を含む。他のアナログペプチドは原型と比べて短縮されている。加えて、原型配列のアナログは、原型配列と比べて１または２以上のアミノ酸置換を有してもよく、ここでアミノ酸置換はアラニン残基またはアスパラギン酸残基である。かかるアラニンまたはアスパラギン酸を含むペプチドの体系的な作製は、「スキャニング」として知られている。このようなアナログおよび修飾された担体ペプチドを含むリニアペプチドの作製もさらに企図される。
【００２２】
原型配列へのさらなる修飾は、カーゴペプチド（単数もしくは複数）、担体ペプチド（単数もしくは複数）またはこれらの両方の中の特定の分解部位を修飾することに向けられており、これらの部位を分解から遮断するアミノ酸置換または他の化学的修飾を導入することに向けられている。
以下の表は、本発明に原型配列として用いられる例示的なガンマＰＫＣ阻害性ペプチドの数々を列挙したものである。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
【表１１】
【００３４】
【表１２】
【００３５】
【表１３】
【００３６】
【表１４】
【００３７】
【表１５】
【００３８】
【表１６】
【００３９】
【表１７】
【００４０】
さらなる変異体：
・ホモシステインとメルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］との全ての順列組み合わせは適用可能である。
・ホモシステインカーゴとあらゆるメルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］担体およびその逆。
・全ての場合においてホモシステインはＮ末端であってもＣ末端であってもよい。
・メルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］はＮ末端のみであり得る。
・上記全ての表中の担体は、アンテナペディア、ポリアルギニンまたは他の担体に置き換え可能である。
【００４１】
以下により十分に論じるように、γＰＫＣ阻害性ペプチドは、担体ペプチドなどの担体部位と化学的に結合しているのが好ましい。１つの態様において、阻害性ペプチドおよび担体ペプチドはジスルフィド結合を介して結合している。静電気的および疎水的相互作用もまた、担体部位とγＰＫＣ阻害性ペプチドを化学的に結合するのに利用できる。ジスルフィド結合を形成する場合、ＰＫＣ阻害性ペプチド配列または担体ペプチド配列にＣｙｓ残基を付加することは有利であり得る。Ｃｙｓ残基はアミノまたはカルボキシ末端またはその両方に付加可能である。Ｃｙｓ残基はまた、カーゴまたは担体ペプチドのアミノ酸配列中に位置することもできる。かかる内在性Ｃｙｓ残基は、担体およびカーゴペプチドの間のジスルフィド結合を安定化することを示す。
【００４２】
担体部位
細胞内取り込みを目的とした様々な分子（特にペプチドなどの巨大分子）は、細胞膜を横切って輸送されにくいことが見出されている。細胞内取り込みを促進するために提案された解決方法のうちには、カチオン（すなわち正に荷電した）ポリマー、ペプチドおよび抗体配列などの担体部位を利用するものがあり、ポリリジン、ポリアルギニン、アンテナペディア由来ペプチドおよびＨＩＶ−Ｔａｔ由来ペプチドなどを含む（例えば、ＵＳ特許公開第４，８４７，２４０号、第５，８８８，７６２号、第５，７４７，６４１号、第６，５９３，２９２号、ＵＳ２００３／０１０４６２２号公報、ＵＳ２００３／０１９９４７７号公報およびＵＳ２００３／０２０６９００号公報を参照）。
【００４３】
使用方法および処方
本明細書に記載された修飾ペプチドは、痛みを予防および処置するのに有用である。この議論の目的のため、痛みおよびその治療を、異なるクラスに分類する：急性、慢性、神経性および炎症性の痛みの処置。本明細書に記載された修飾γＰＫＣ阻害性ペプチドは、急性、慢性、神経性および炎症性の痛みの治療に有用である。
【００４４】
興味深いことに、本明細書で開示された化合物はまた、複数の刺激による神経性の痛みの進行を弱めるまたは予防するのにも有用である。本開示は、予防的に、痛みを誘導する刺激と同時に、または痛みを誘導する刺激を受け取った後のどちらかに、本明細書中に記載されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを投与することは、慢性の炎症性または神経性の痛みの病態の進行を弱めるまたは予防するのに効果的であることを企図している。
【００４５】
カーゴ／担体ペプチド構築物は、組み立てられ、原型と比較して増大した安定性、効能、またはその両方について試験さた後で、構築物は、痛み誘導性のイベントに先立って、その間に、またはその間を通じて継続的に患者に投与するために薬剤的に許容できる形態に組込まれる。
【００４６】
「薬剤的に許容できる形態」は、所望の結果を与え、患者に対する潜在的な害がその患者に対する潜在的な利益よりも大きいと医者に納得させるのに十分なほどの有害な副作用をもたらさない様式で、修飾されたγＰＫＣ阻害剤を投与するのに適したものを含む。修飾されたγＰＫＣ阻害剤とともに用いるために好適な薬剤的に許容できる形態の構成成分は、投与の経路および方法によって部分的に決定される。形態は一般的に、糖、アミノ酸または電解質などの単純な化学物質を典型的に含む薬剤的に許容できる担体に併合された１または２以上の修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを含む。
【００４７】
例示的な溶液は、典型的には、生理食塩水または緩衝液により調製される。薬剤的に許容できる担体は、当業者によく知られた賦形剤を含んでもよく、様々な形態で用いられてもよい。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、A. R. Gennaro編、Mack Publishing Company (1990)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、A. R. Gennaro編、Lippincott Williams & Wilkins (2000)；Handbook of Pharmaceutical Excipients、第３版、A. H. Kibbe編、American Pharmaceutical Association, and Pharmaceutical Press (2000)；およびHandbook of Pharmaceutical Additives、Michael and Irene Ash編集、Gower (1995)参照。
【００４８】
形態中の阻害剤投与量は、カーゴ／担体構築物の安定性および効能、投与経路、および所望の投与レジメンによって影響される様々なパラメータにしたがって変化する。体重当たり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、もっとも好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の一日の投与量が企図される。
【００４９】
修飾されたγＰＫＣ阻害剤は、局所的投与または全身投与することができる。局所投与は、局所性投与、皮内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、または皮下注射によって達成される。修飾されたγＰＫＣ阻害剤の全身投与は、好ましくは非経口であるが、経口、口腔、および経鼻投与もまた企図される。非経口投与は一般的に、皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内のいずれかの注射によって特徴付けられる。修飾された阻害性ペプチドの注射可能な形態は、液体の溶液または懸濁液、注射前に液体中で溶液または懸濁液に再構築するのに適した固体（例えば乾燥または凍結乾燥された）形態として、または乳液としてのいずれかの従来の形態で調製できる。
【００５０】
一般的に、好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどを含む。加えて、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、シクロデキストリンなどを含む、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、溶解性増強剤（solubility enhancer）、等張剤（tonicifier）など、少量の非毒性補助物質も使用することができる。
【００５１】
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドは必要に応じて痛みを治療するために投与できる。予防のために、修飾されたγＰＫＣ化合物を痛み誘導イベントに先立って投与してもよい。例えば、ペプチドを、予測される痛み誘導イベントの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分、１時間、数時間、１日、数日、１週間または数週間前に投与できる。より長い期間の予防的投与であっても、in vivoで特に安定した修飾されたペプチドを用いて、または例えば髄腔内ポンプによる送達など、ペプチドの徐放性形態を用いることによって、達成することができる。
【実施例】
【００５２】
以下の例は、上記の発明の使用の様式をより十分に記載するために、および本発明の様々な側面を実行するために企図される最良の形態を説明するために供されるものである。これらの例は本発明の真の範囲を制限するために供されるものではなく、むしろ説明を目的とするものであると解される。本明細書において参照される全ての参考文献は、その全体が参照として組込まれる。
【００５３】
例１
γＰＫＣ阻害剤の投与は膜結合性酵素を減少させる
オスのHoltzmanラット（Harlan, Indianapolis, IN）を以下に論じる研究に用いた。実験を通して、動物の不快感を最小化するため、および使用する動物の数を減らすための努力が行われた。全てのラット（神経切断時２００〜２５０ｇ）を、１２時間の明／暗サイクル（午前７時点灯）中で、食事および水をいつでも利用可能にして、飼育した。
【００５４】
Ｌ５脊髄神経切断を研究動物に実施した。ラットをＯ２担体中のハロタン（導入４％、維持２％）で麻酔した。Ｌ５〜Ｓ１上にある皮膚に小さな切り込みを入れ、続いて椎骨横突起からの傍脊椎筋系の退縮を行った。Ｌ６横突起を一部除去してＬ４およびＬ５脊髄神経を露出した。Ｌ５脊髄神経を同定し、わずかに持ち上げ、切断した。傷を生理食塩水で洗浄し、３−０ポリエステル縫合糸（筋膜面）およびサージカルスキンステープル（surgical skin staple）で二重に閉じた。
【００５５】
ウェスタンブロット分析を、切断後７日の動物から採取した腰部脊髄サンプルで行った。動物を、１０、１００、１０００ｐｍｏｌで阻害剤を供給する皮下ポンプを用いて投与されるγＰＫＣ阻害剤で処置した。
図１に示されるように、増大した量の阻害剤により、膜調製物中の検出可能なγＰＫＣの量が減少する結果となった。試験した細胞質サンプルにおいて、増大したレベルの酵素が検出された。これらの結果は、γＰＫＣ阻害性ペプチドの皮下投与はγＰＫＣ酵素の転移を誘導するのに効果的であったことを実証する。
【００５６】
例２
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドによる末梢神経損傷誘導性機械的アロディニアの予防
全身性予防パラダイムを用いて、皮下注入ポンプの移植によって、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチド治療を手術直前に開始した。注入は７日間続けられた。
【００５７】
Sweitzer et al., (1999) Brain Res 829: 209-221に前述されているように、全ての動物を２−および１２−ｇフォンフレイフィラメント（Stoelting, Wood Dale, IL）を用いて、同側後足蹠上で、機械的アロディニアの試験を行った。動物を試験手順に慣れさせた。３回の基準計測を、手術の日より前に行った。ラットに、鋭敏化を避けるために各刺激セットの間を少なくとも１０分あけて、それぞれのフィラメントで３セットの１０回刺激を与えた。アロディニアを、この通常は不快でない刺激に対する意図的な足の引っ込めとして特徴付けた。結果は、２−または１２−ｇフォンフレイフィラメントのどちらかによる３０回の刺激からの足引っ込めの平均回数として報告されている。
【００５８】
皮下注入ポンプ設置による交差研究（ｎ＝８／処置）もまた行われた。１つの動物グループを、痛み予防パラダイムによって処置した。ここで、処置はＬ５脊髄神経切断によって開始し、切断後７日間続けられた。切断後７日目にＰＫＣ阻害剤処置を終了し、動物を１４日目まで飼育した。既存の痛みパラダイム中にある第２の動物グループに、皮下ポンプを切断後７日目に与え、１４日目まで続けた。
【００５９】
図２、３および４（交差研究）に示されているように、１０および１００ｐｍｏｌのγＰＫＣ阻害性ペプチドの投与は、２および１２グラムフォンフレイフィラメントに対する機械的アロディニア応答を減じるのに効果的であった。興味深いことに、より高い投与量であっても抗アロディニア的ではなかった。この結果は、本研究のガンマ阻害剤の濃度はεＰＫＣ阻害剤を用いたものより１０倍高いけれども、εＰＫＣイプシロン阻害剤を用いた研究によってもたらされた結果と類似する。
【００６０】
例３
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドによる温熱性痛覚過敏の軽減
放射熱源を、アクリル試験チャンバー（４”×８”×４”）中で飼育する自由に動ける動物の足蹠の底面に照準し、温熱性痛覚過敏に対する修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの影響の評価のために足引っ込め待ち時間を計測した。未処理の動物において〜１０秒の足引っ込め待ち時間を提供するのに求められるランプ強度を決定するため、パイロット実験を行った。組織損傷が発生しないことを保証するため、製造業者の仕様書にしたがって、全ての試験は３０秒で中断した。炎症性刺激の前に、各動物の両足蹠を基準感度について試験した。各試験は同一の足蹠について３つの計測からなり、各決定の間隔は最低５分であった。足引っ込め閾値はこれら３つの決定の平均値であった。
【００６１】
図５および６に示されているように、γＰＫＣ阻害性ペプチドの投与は、７日目まで効果的な抗痛覚過敏症剤であった。図６のデータは、例１に記載されたように行われた交差研究の結果を示す。
【００６２】
例４
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを用いた皮下チャレンジ（Subcutaneous Challenge）
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの皮下投与の有効性を評価するための研究。例２に記載された方法にしたがって動物を準備した。１つの動物群に、チャレンジに先立ってγＰＫＣ阻害性ペプチドを切断後１〜７日目に投与した。第２の群に、チャレンジに先立ってγＰＫＣ阻害性ペプチドを切断後７〜１４日目に投与した。第３の群に、阻害性ペプチドの事前投与無しにチャレンジした。３つの群全てにおいて、動物は１００ｐｍｏｌの阻害性ペプチドまたはビヒクルの皮下チャレンジを受け、それは切断後１４日目に投与された。
【００６３】
次いで、足引っ込め待ち時間を計測した。第１、第２および第３の群からのデータは図７、８および９にそれぞれ示されている。これらの研究からの結果の多数は特に興味深い。第１に、事前の阻害性ペプチド投与にかかわらず、阻害性ペプチドを受けた全ての群において足引っ込め待ち時間が基準よりも上昇した状態が１００分以上保たれた。第２に、ペプチドによる事前処置を受けていない動物であっても、ビヒクルコントロールと比較して足引っ込め待ち時間の顕著な増大を見せた。第３に、皮下投与された阻害性ペプチドの保護効果は全身性であり、すなわち、四足蹠全てに適用され、局所的ではなかった。
【００６４】
本発明の精神および範囲から解離することなく本発明に関連する代替的な態様は、当業者には明らかである。したがって、本発明の範囲は前述の記載よりもむしろ添付の請求の範囲によって定義される。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、異なる分類の痛みを調節する化合物に関し、該化合物は、少なくとも１以上の担体部分と連結した１または２以上のガンマＰＫＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチドを含み、該阻害性ペプチド、該担体部分、またはその両方が、得られた化合物の安定性、効力、またはその両方が増大するように原型配列から修飾されている。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）は、細胞成長、遺伝子発現の制御、およびイオンチャネル活性を含む様々な細胞機能に関与するシグナル伝達の主要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムは、少なくとも１１種の異なるプロテインキナーゼを含み、これらは、そのホモロジーおよび活性化因子への感受性に基づいて少なくとも３つのサブファミリーに分けることができる。そのファミリーは、在来型（classical）、新型（novel）、非定型（atypical）サブファミリーである。各アイソザイムは、いくつもの相同性（「保存された」または「Ｃ」）ドメインと散在するアイソザイム固有（「可変」または「Ｖ」）ドメインを含む。ガンマＰＫＣ（γＰＫＣ）は、α、βＩ（Ｂ２としても知られている）、およびβＩＩ（Ｂ１としても知られている）ＰＫＣとともに、「在来型」サブファミリーのメンバーである。
【０００３】
ＰＫＣの個々のアイソザイムは、様々な病態の機序に関係があるとされてきた。εＰＫＣ由来のイプシロンＰＫＣ阻害性ペプチドが作製され、痛覚への影響を示されている。例えばＵＳ特許第６，３７６，４６７号および同第６，６８６，３３４号を参照。γＰＫＣ由来のガンマＰＫＣ阻害性ペプチドもまたＵＳ２００３０２２３９８１号公報に内包され、それは本明細書に参照として組込まれる。
【０００４】
このアプローチの１つの問題点は、切り取られた断片の「裸の」終端は、タンパク質中でのそれらの状況とは異なり、断片がタンパク質の残りと連結するポイントにおいて、遊離アミンおよびカルボキシル基を露呈していることである。これらの外来の部分は、ペプチドを、プロテアーゼに対してより敏感にし得る。これらの不利な点の結果として、ペプチドの効力は、所望のものよりも低くなり得、in vivo半減期は顕著に短くなり得る。
【０００５】
先行技術の第２の領域は、「担体」ペプチドがＨＩＶ−Ｔａｔおよび他のタンパク質の断片として設計されるという、同様の戦略を利用する。これらのペプチド断片は、親タンパク質の細胞膜を横断する能力を模倣する。特に興味深い能力は、これらの担体ペプチド断片によって、カーゴおよび担体ペプチドの両方が細胞内に運ばれるように、「カーゴ」ペプチドをこれらの担体ペプチドに取り付けることができるという特性である。
担体ペプチドが断片であるという認識から、上述したような同様の欠点がカーゴペプチドに適用され得る。すなわち、露呈した末端が、プロテアーゼ感受性を含む望ましくない特性を授け得ることである。
【０００６】
先行技術のカーゴ／担体ペプチド構築物は、カーゴと担体との間のＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を利用し、それは、ペプチドが細胞に入った場合に、グルタチオン還元などの多くの媒介物により開裂することができる。この特性は、カーゴおよび担体が物理的に分離することによって二つの部分が細胞内でその独立した効果を発揮するため、生物学的活性にとって重要であると考えられている。しかしながらこの仮説について信頼性のある試験がなされたことはなく、非開裂性アナログは、実際のところ、良好な活性を有し得る。さらに、ジスルフィド結合は、組み立てるのが面倒であり、化学分解しやすい。
【０００７】
特定のカーゴ／担体ペプチド先行技術の設計は、タンパク質からのアミノ酸の連続配列に基づいている。しかしながら、ペプチドの最適な長さは、経験に基づくアナログ試験よりも、配列比較分析および望ましい配列の理論的予測に基づいており、未だよく定義されていない。したがって、それが由来するγＰＫＣドメインに対応する付加的な残基を含む、前述のカーゴペプチドのアナログから、効能の増大が予測され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、γＰＫＣ阻害性タンパク質で処理した試料のウェスタンブロットを示し、サイトゾル中および膜画分における酵素レベルにおける阻害剤の影響を示す。
【図２】図２は、２グラムのフォンフレイ（Von Frey）フィラメントを用いた研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足を引っ込めた数をプロットした線グラフを示す。
【図３】図３は、１２グラムのフォンフレイフィラメントを用いた研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足を引っ込めた数をプロットした線グラフを示す。
【０００９】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２グラムおよび１２グラムのフォンフレイフィラメントを用いた２つの研究における、切断後の日数に対して足を引っ込めた平均数をプロットした２つの線グラフ、および切断後７．５日目における交叉イベントを示す。
【図５】図５は、温熱性痛覚過敏の研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。
【図６】図６は、温熱性痛覚過敏の研究における、Ｌ５切断後の日数に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフ、および７．５日目における交差イベントを示す。
【００１０】
【図７】図７は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後第１〜７日目の間ポンプを通してペプチドを与えた後、第１４日目において阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【図８】図８は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後第７〜１４日目の間ポンプを通してペプチドを与えた後、第１４日目において阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【図９】図９は、温熱性痛覚過敏の研究における、時間に対して足引っ込めの待ち時間を秒単位でプロットした線グラフを示す。ここで、動物に、切断後１４日目に阻害性ペプチドの用量の皮下投与をチャレンジした。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書の開示は、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチド、かかるペプチドを作製する方法、およびγＰＫＣ阻害性ペプチドを痛みの治療に利用する方法に関する。他の側面および態様は、以下の詳細な記載から当業者に明らかである。
【００１２】
発明の記載
ここに記載される発明は、ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）アイソザイムを阻害する修飾されたペプチドに関する。典型的には、本明細書中で論じられるγＰＫＣ阻害性ペプチドは、阻害性ペプチドの標的細胞内への輸送を促進する担体部位と連結している。カーゴ阻害ペプチド、担体ペプチド、またはその両方は、得られるカーゴ／担体ペプチド構築物の安定性の増大を制御するため、原型対照と比較して修飾されることができる。開示された修飾γＰＫＣペプチドは、急性の痛み、慢性の痛みおよび炎症性の痛みなど、様々なタイプの痛みを防ぐおよび治療するのに有用である。
【００１３】
定義
本明細書中で使用される場合、以下の語および語句は、その語が使用された文脈が他の意味を意図している場合を除き、一般的に以下に記載された意味を有することを意図している。
「ＰＫＣ阻害性ペプチド」は、γＰＫＣ酵素を阻害するかまたは不活性化することができるペプチドをいう。
「キャップされた」という語は、アミノ末端、カルボキシ末端またはその両方を変更するように化学的に修飾されたペプチドをいう。未修飾カーゴペプチドとジスルフィド結合した、キャップされた担体ペプチドを図２に示す。
【００１４】
「担体」という語は、例えばＵＳ特許および公報第４，８４７，２４０号、第５，８８８，７６２号、第５，７４７，６４１号、第６，５９３，２９２号、ＵＳ２００３／０１０４６２２号、ＵＳ２００３／０１９９６７７号およびＵＳ２００３／０２０６９００号などに記載されているように、ポリリジン、ポリアルギニン、アンテナペディア由来ペプチド、ＨＩＶ Ｔａｔ由来ペプチドなどを含む、カチオンポリマー、ペプチドおよび抗体配列など、細胞内取り込みを促進する部位をいう。担体部分の例は、輸送体ペプチドに化学的に連結又は結合されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの細胞内取り込みを促進する「担体ペプチド」である。
【００１５】
「予防」という語は、「処置」の一要素として、本明細書で定義される「防ぐこと」および「抑制すること」の両方を包含することを意図する。ヒトの医薬品において、「防ぐこと」と「抑制すること」とを区別することが常に可能なわけではないことは、当業者に理解されるだろう。なぜならば、最終的に誘導される出来事が未知であるか、潜在的であるか、または出来事の発生から十分後になるまで患者が確認されないことがあるからである。
【００１６】
「安定性」という語は一般的に、例えば保存期間に基づくｃｙｓ−ｃｙｓ交換を遅延させることにより、タンパク質分解を遅延させることにより、またはその両方により、保存期限を改善する修飾をいう。「効能」という語は、特定の結果を達成するのに必要な特定のペプチド組成物の量に関する。所望の終点を達成するための１つの組成物の投与量を減少させられるとき、そのペプチド組成物は他よりも効能が高い。所与のペプチド組成物の特定の修飾を行うことにより、その組成物の効能を増大させることができる。
【００１７】
ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチド
様々なγＰＫＣ阻害剤が本明細書に記載され、本明細書により開示された方法によって使用することができる。阻害性ペプチドは、可変または保存性の、あらゆるドメインに由来することができる。したがって、阻害性ペプチドはＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４またはＶ５に由来することができる。阻害性ペプチドはまた、保存性領域Ｃ１（Ｃ１ａ、Ｃ１ｂ）、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５に由来することもできる。１または２以上のこれらの領域と重複するペプチドもまた企図される。カーゴペプチドは様々なドメインに由来し、長さについて５〜３０アミノ酸の長さの範囲にある。より好ましくは、ＰＫＣドメインに由来するペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基の長さである。他の原型ペプチドの給源は、「プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異性アンタゴニスト」と標題された、ＵＳ特許出願番号１１／０１１，５５７に見出すことができ、そこでは活性化ペプチドを採取し、それを阻害性ペプチドに変換しており、その全てが本明細書に参照として組込まれる。
【００１８】
１つの態様において、カーゴペプチドは、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ（配列番号１）のアミノ酸配列、ペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内部に位置するシステイン残基、およびカーゴペプチドに結合した担体ペプチドを含む、γＰＫＣのγＰＫＣ阻害性ペプチド誘導体である。上記のカーゴペプチドはさらに、互いに連結し、最終的に担体ペプチドに連結する、１または２以上の付加的なカーゴペプチドを含むことができる。
【００１９】
担体およびカーゴの両方への修飾は、効能、生物学的液体／組織中での安定性および化学的安定性の改善の目的で行われた。これらの変化は、γＰＫＣ阻害剤に、様々な臨床的適応における使用のための増強された特性を与える。
適用されるいくつかの修飾は以下を含む：
１．カーゴおよび／または担体ペプチドをキャップしてin vivoでのタンパク質分解を防止し、それにより効能および／または薬効の持続時間を増大する；
２．効能を改善するために親タンパク質の付加的な連続領域を組込んだ重複ペプチドを作製する；
３．化学的安定性および薬物製品の保存期間を改善するためにカーゴおよび担体を単一のペプチド鎖内に有するリニアペプチドを作製する；
４．プロテアーゼ抵抗性および効能を改善するために２またはそれ以上の活性ペプチドのコピーを有するマルチマーペプチドを作製する；
５．タンパク質分解を防止するためにペプチドのレトロ−インベルソアナログを作製する；および
６．改善された化学安定性を提供するためにジスルフィドアナログを導入する。
【００２０】
本明細書に記載された修飾は、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの効能、血漿安定性、および化学的安定性を改善する。γＰＫＣ阻害性ペプチドへの効果的な修飾は、原型γＰＫＣ阻害性ペプチドを選択し、それらのペプチドを痛みの治療のためのカーゴペプチドとして供するために修飾することによって同定される。原型ペプチドは、現在既知のペプチドであってもまだγＰＫＣ阻害性ペプチドとして同定されていないものであってもよい。あらゆる阻害性γＰＫＣペプチドが開始カーゴ配列として用いることができるけれども、好ましい原型配列はＲ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ（配列番号１）であり、ここでペプチドは修飾されておらず、カーゴおよび担体ペプチドのアミノ末端に位置するＣｙｓ残基を通じて担体に接合している。
【００２１】
様々な修飾されたまたはアナログのペプチドが企図される。かかるアナログのいくつかは、原型配列と重複しおよびそれを超えて拡張したアミノ酸配列を含む。他のアナログペプチドは原型と比べて短縮されている。加えて、原型配列のアナログは、原型配列と比べて１または２以上のアミノ酸置換を有してもよく、ここでアミノ酸置換はアラニン残基またはアスパラギン酸残基である。かかるアラニンまたはアスパラギン酸を含むペプチドの体系的な作製は、「スキャニング」として知られている。このようなアナログおよび修飾された担体ペプチドを含むリニアペプチドの作製もさらに企図される。
【００２２】
原型配列へのさらなる修飾は、カーゴペプチド（単数もしくは複数）、担体ペプチド（単数もしくは複数）またはこれらの両方の中の特定の分解部位を修飾することに向けられており、これらの部位を分解から遮断するアミノ酸置換または他の化学的修飾を導入することに向けられている。
以下の表は、本発明に原型配列として用いられる例示的なガンマＰＫＣ阻害性ペプチドの数々を列挙したものである。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
【表１１】
【００３４】
【表１２】
【００３５】
【表１３】
【００３６】
【表１４】
【００３７】
【表１５】
【００３８】
【表１６】
【００３９】
【表１７】
【００４０】
さらなる変異体：
・ホモシステインとメルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］との全ての順列組み合わせは適用可能である。
・ホモシステインカーゴとあらゆるメルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］担体およびその逆。
・全ての場合においてホモシステインはＮ末端であってもＣ末端であってもよい。
・メルカプト酸［プロピオン酸、酢酸、酪酸］はＮ末端のみであり得る。
・上記全ての表中の担体は、アンテナペディア、ポリアルギニンまたは他の担体に置き換え可能である。
【００４１】
以下により十分に論じるように、γＰＫＣ阻害性ペプチドは、担体ペプチドなどの担体部位と化学的に結合しているのが好ましい。１つの態様において、阻害性ペプチドおよび担体ペプチドはジスルフィド結合を介して結合している。静電気的および疎水的相互作用もまた、担体部位とγＰＫＣ阻害性ペプチドを化学的に結合するのに利用できる。ジスルフィド結合を形成する場合、ＰＫＣ阻害性ペプチド配列または担体ペプチド配列にＣｙｓ残基を付加することは有利であり得る。Ｃｙｓ残基はアミノまたはカルボキシ末端またはその両方に付加可能である。Ｃｙｓ残基はまた、カーゴまたは担体ペプチドのアミノ酸配列中に位置することもできる。かかる内在性Ｃｙｓ残基は、担体およびカーゴペプチドの間のジスルフィド結合を安定化することを示す。
【００４２】
担体部位
細胞内取り込みを目的とした様々な分子（特にペプチドなどの巨大分子）は、細胞膜を横切って輸送されにくいことが見出されている。細胞内取り込みを促進するために提案された解決方法のうちには、カチオン（すなわち正に荷電した）ポリマー、ペプチドおよび抗体配列などの担体部位を利用するものがあり、ポリリジン、ポリアルギニン、アンテナペディア由来ペプチドおよびＨＩＶ−Ｔａｔ由来ペプチドなどを含む（例えば、ＵＳ特許公開第４，８４７，２４０号、第５，８８８，７６２号、第５，７４７，６４１号、第６，５９３，２９２号、ＵＳ２００３／０１０４６２２号公報、ＵＳ２００３／０１９９４７７号公報およびＵＳ２００３／０２０６９００号公報を参照）。
【００４３】
使用方法および処方
本明細書に記載された修飾ペプチドは、痛みを予防および処置するのに有用である。この議論の目的のため、痛みおよびその治療を、異なるクラスに分類する：急性、慢性、神経性および炎症性の痛みの処置。本明細書に記載された修飾γＰＫＣ阻害性ペプチドは、急性、慢性、神経性および炎症性の痛みの治療に有用である。
【００４４】
興味深いことに、本明細書で開示された化合物はまた、複数の刺激による神経性の痛みの進行を弱めるまたは予防するのにも有用である。本開示は、予防的に、痛みを誘導する刺激と同時に、または痛みを誘導する刺激を受け取った後のどちらかに、本明細書中に記載されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを投与することは、慢性の炎症性または神経性の痛みの病態の進行を弱めるまたは予防するのに効果的であることを企図している。
【００４５】
カーゴ／担体ペプチド構築物は、組み立てられ、原型と比較して増大した安定性、効能、またはその両方について試験さた後で、構築物は、痛み誘導性のイベントに先立って、その間に、またはその間を通じて継続的に患者に投与するために薬剤的に許容できる形態に組込まれる。
【００４６】
「薬剤的に許容できる形態」は、所望の結果を与え、患者に対する潜在的な害がその患者に対する潜在的な利益よりも大きいと医者に納得させるのに十分なほどの有害な副作用をもたらさない様式で、修飾されたγＰＫＣ阻害剤を投与するのに適したものを含む。修飾されたγＰＫＣ阻害剤とともに用いるために好適な薬剤的に許容できる形態の構成成分は、投与の経路および方法によって部分的に決定される。形態は一般的に、糖、アミノ酸または電解質などの単純な化学物質を典型的に含む薬剤的に許容できる担体に併合された１または２以上の修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを含む。
【００４７】
例示的な溶液は、典型的には、生理食塩水または緩衝液により調製される。薬剤的に許容できる担体は、当業者によく知られた賦形剤を含んでもよく、様々な形態で用いられてもよい。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、A. R. Gennaro編、Mack Publishing Company (1990)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、A. R. Gennaro編、Lippincott Williams & Wilkins (2000)；Handbook of Pharmaceutical Excipients、第３版、A. H. Kibbe編、American Pharmaceutical Association, and Pharmaceutical Press (2000)；およびHandbook of Pharmaceutical Additives、Michael and Irene Ash編集、Gower (1995)参照。
【００４８】
形態中の阻害剤投与量は、カーゴ／担体構築物の安定性および効能、投与経路、および所望の投与レジメンによって影響される様々なパラメータにしたがって変化する。体重当たり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、もっとも好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の一日の投与量が企図される。
【００４９】
修飾されたγＰＫＣ阻害剤は、局所的投与または全身投与することができる。局所投与は、局所性投与、皮内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、または皮下注射によって達成される。修飾されたγＰＫＣ阻害剤の全身投与は、好ましくは非経口であるが、経口、口腔、および経鼻投与もまた企図される。非経口投与は一般的に、皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内のいずれかの注射によって特徴付けられる。修飾された阻害性ペプチドの注射可能な形態は、液体の溶液または懸濁液、注射前に液体中で溶液または懸濁液に再構築するのに適した固体（例えば乾燥または凍結乾燥された）形態として、または乳液としてのいずれかの従来の形態で調製できる。
【００５０】
一般的に、好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどを含む。加えて、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、シクロデキストリンなどを含む、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、溶解性増強剤（solubility enhancer）、等張剤（tonicifier）など、少量の非毒性補助物質も使用することができる。
【００５１】
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドは必要に応じて痛みを治療するために投与できる。予防のために、修飾されたγＰＫＣ化合物を痛み誘導イベントに先立って投与してもよい。例えば、ペプチドを、予測される痛み誘導イベントの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分、１時間、数時間、１日、数日、１週間または数週間前に投与できる。より長い期間の予防的投与であっても、in vivoで特に安定した修飾されたペプチドを用いて、または例えば髄腔内ポンプによる送達など、ペプチドの徐放性形態を用いることによって、達成することができる。
【実施例】
【００５２】
以下の例は、上記の発明の使用の様式をより十分に記載するために、および本発明の様々な側面を実行するために企図される最良の形態を説明するために供されるものである。これらの例は本発明の真の範囲を制限するために供されるものではなく、むしろ説明を目的とするものであると解される。本明細書において参照される全ての参考文献は、その全体が参照として組込まれる。
【００５３】
例１
γＰＫＣ阻害剤の投与は膜結合性酵素を減少させる
オスのHoltzmanラット（Harlan, Indianapolis, IN）を以下に論じる研究に用いた。実験を通して、動物の不快感を最小化するため、および使用する動物の数を減らすための努力が行われた。全てのラット（神経切断時２００〜２５０ｇ）を、１２時間の明／暗サイクル（午前７時点灯）中で、食事および水をいつでも利用可能にして、飼育した。
【００５４】
Ｌ５脊髄神経切断を研究動物に実施した。ラットをＯ２担体中のハロタン（導入４％、維持２％）で麻酔した。Ｌ５〜Ｓ１上にある皮膚に小さな切り込みを入れ、続いて椎骨横突起からの傍脊椎筋系の退縮を行った。Ｌ６横突起を一部除去してＬ４およびＬ５脊髄神経を露出した。Ｌ５脊髄神経を同定し、わずかに持ち上げ、切断した。傷を生理食塩水で洗浄し、３−０ポリエステル縫合糸（筋膜面）およびサージカルスキンステープル（surgical skin staple）で二重に閉じた。
【００５５】
ウェスタンブロット分析を、切断後７日の動物から採取した腰部脊髄サンプルで行った。動物を、１０、１００、１０００ｐｍｏｌで阻害剤を供給する皮下ポンプを用いて投与されるγＰＫＣ阻害剤で処置した。
図１に示されるように、増大した量の阻害剤により、膜調製物中の検出可能なγＰＫＣの量が減少する結果となった。試験した細胞質サンプルにおいて、増大したレベルの酵素が検出された。これらの結果は、γＰＫＣ阻害性ペプチドの皮下投与はγＰＫＣ酵素の転移を誘導するのに効果的であったことを実証する。
【００５６】
例２
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドによる末梢神経損傷誘導性機械的アロディニアの予防
全身性予防パラダイムを用いて、皮下注入ポンプの移植によって、修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチド治療を手術直前に開始した。注入は７日間続けられた。
【００５７】
Sweitzer et al., (1999) Brain Res 829: 209-221に前述されているように、全ての動物を２−および１２−ｇフォンフレイフィラメント（Stoelting, Wood Dale, IL）を用いて、同側後足蹠上で、機械的アロディニアの試験を行った。動物を試験手順に慣れさせた。３回の基準計測を、手術の日より前に行った。ラットに、鋭敏化を避けるために各刺激セットの間を少なくとも１０分あけて、それぞれのフィラメントで３セットの１０回刺激を与えた。アロディニアを、この通常は不快でない刺激に対する意図的な足の引っ込めとして特徴付けた。結果は、２−または１２−ｇフォンフレイフィラメントのどちらかによる３０回の刺激からの足引っ込めの平均回数として報告されている。
【００５８】
皮下注入ポンプ設置による交差研究（ｎ＝８／処置）もまた行われた。１つの動物グループを、痛み予防パラダイムによって処置した。ここで、処置はＬ５脊髄神経切断によって開始し、切断後７日間続けられた。切断後７日目にＰＫＣ阻害剤処置を終了し、動物を１４日目まで飼育した。既存の痛みパラダイム中にある第２の動物グループに、皮下ポンプを切断後７日目に与え、１４日目まで続けた。
【００５９】
図２、３および４（交差研究）に示されているように、１０および１００ｐｍｏｌのγＰＫＣ阻害性ペプチドの投与は、２および１２グラムフォンフレイフィラメントに対する機械的アロディニア応答を減じるのに効果的であった。興味深いことに、より高い投与量であっても抗アロディニア的ではなかった。この結果は、本研究のガンマ阻害剤の濃度はεＰＫＣ阻害剤を用いたものより１０倍高いけれども、εＰＫＣイプシロン阻害剤を用いた研究によってもたらされた結果と類似する。
【００６０】
例３
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドによる温熱性痛覚過敏の軽減
放射熱源を、アクリル試験チャンバー（４”×８”×４”）中で飼育する自由に動ける動物の足蹠の底面に照準し、温熱性痛覚過敏に対する修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの影響の評価のために足引っ込め待ち時間を計測した。未処理の動物において〜１０秒の足引っ込め待ち時間を提供するのに求められるランプ強度を決定するため、パイロット実験を行った。組織損傷が発生しないことを保証するため、製造業者の仕様書にしたがって、全ての試験は３０秒で中断した。炎症性刺激の前に、各動物の両足蹠を基準感度について試験した。各試験は同一の足蹠について３つの計測からなり、各決定の間隔は最低５分であった。足引っ込め閾値はこれら３つの決定の平均値であった。
【００６１】
図５および６に示されているように、γＰＫＣ阻害性ペプチドの投与は、７日目まで効果的な抗痛覚過敏症剤であった。図６のデータは、例１に記載されたように行われた交差研究の結果を示す。
【００６２】
例４
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドを用いた皮下チャレンジ（Subcutaneous Challenge）
修飾されたγＰＫＣ阻害性ペプチドの皮下投与の有効性を評価するための研究。例２に記載された方法にしたがって動物を準備した。１つの動物群に、チャレンジに先立ってγＰＫＣ阻害性ペプチドを切断後１〜７日目に投与した。第２の群に、チャレンジに先立ってγＰＫＣ阻害性ペプチドを切断後７〜１４日目に投与した。第３の群に、阻害性ペプチドの事前投与無しにチャレンジした。３つの群全てにおいて、動物は１００ｐｍｏｌの阻害性ペプチドまたはビヒクルの皮下チャレンジを受け、それは切断後１４日目に投与された。
【００６３】
次いで、足引っ込め待ち時間を計測した。第１、第２および第３の群からのデータは図７、８および９にそれぞれ示されている。これらの研究からの結果の多数は特に興味深い。第１に、事前の阻害性ペプチド投与にかかわらず、阻害性ペプチドを受けた全ての群において足引っ込め待ち時間が基準よりも上昇した状態が１００分以上保たれた。第２に、ペプチドによる事前処置を受けていない動物であっても、ビヒクルコントロールと比較して足引っ込め待ち時間の顕著な増大を見せた。第３に、皮下投与された阻害性ペプチドの保護効果は全身性であり、すなわち、四足蹠全てに適用され、局所的ではなかった。
【００６４】
本発明の精神および範囲から解離することなく本発明に関連する代替的な態様は、当業者には明らかである。したがって、本発明の範囲は前述の記載よりもむしろ添付の請求の範囲によって定義される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチド組成物であって、細胞内担体ペプチドと共有結合したγＰＫＣを含み、該細胞内担体ペプチド、該阻害性ペプチドまたはその両方が、Ｎ末端において修飾されている、前記組成物。
【請求項２】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、細胞内担体ペプチドに、ジスルフィド結合によって結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞内担体ペプチドが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６）を含む修飾されたｔａｔペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞内担体ペプチドが、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を含む修飾されたｔａｔペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
修飾されたｔａｔペプチドが、そのＮ末端において、アシル、アルキルまたはスルホニル基によって修飾されている、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
修飾されたｔａｔペプチドが、そのＮ末端において、アシル化されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ｔａｔペプチドが、さらにそのＣ末端において修飾されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
阻害性ペプチドが、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓのアミノ酸配列および末端のＣｙｓを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
末端のＣｙｓが、阻害性ペプチドのＣ末端に位置する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
阻害性ペプチドが、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｇのアミノ酸配列および末端のＣｙｓを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
末端のＣｙｓが、阻害性ペプチドのＣ末端に位置する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ｔａｔペプチドが、そのＣ末端において、アミド形成によってさらに修飾されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、修飾されたｔａｔペプチドのアミノ酸の側鎖と共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、リジン、チロシンおよびグルタミンから選択される残基の側鎖と共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、Ｎ末端システイン残基の側鎖と共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｔａｔペプチドのＮ末端システインが、アシル化されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ｔａｔペプチドのＣ末端アルギニンが、第一級カルボキサミドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、そのＮ末端におけるアシル化またはそのＣ末端におけるアミド化によって、あるいはＮ末端におけるアシル化およびＣ末端におけるアミド化の両方によって修飾されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
ｔａｔペプチドが、Ａｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ−ＮＨ２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、ｔａｔペプチドと、ｔａｔペプチドのシステイン残基のスルフィドリル基を通して共有結合している、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
第２の膜輸送ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
直鎖の治療用ペプチドであって、担体ペプチドおよびγＰＫＣ阻害性カーゴペプチドを含み、該担体ペプチドおよび該カーゴペプチドが、ペプチド結合によって結合している、前記直鎖の治療用ペプチド。
【請求項２３】
担体ペプチドおよびカーゴペプチドの間に位置するリンカーペプチドをさらに含み、該担体ペプチドおよび該カーゴペプチドが、リンカーペプチドとペプチド結合によって結合している、請求項２２に記載の直鎖の治療用ペプチド。
【請求項２４】
痛みを処置する方法であって、有効量の修飾されたガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性構築物を、痛みを患う対象に投与することを含み、該修飾γＰＫＣペプチドが、原型配列と比較して、より安定であるか、より強力であるか、またはその両方である、前記方法。
【請求項２５】
対象が患う痛みが、急性の痛み、慢性の痛み、神経性の痛み、および炎症性の痛みからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
増加した効力が、原型配列と比べて作用のより早い発現または活性のより長い持続に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
修飾されたγＰＫＣが、対象が痛み刺激を受け取る前、受け取っている間、または受け取った後に対象に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
阻害性ペプチドが、痛み刺激の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分、一時間、数時間、一日、数日、一週間、または数週間前に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
ガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性ペプチド組成物であって、細胞内担体ペプチドと共有結合したγＰＫＣを含み、該細胞内担体ペプチド、該阻害性ペプチドまたはその両方が、Ｎ末端において修飾されている、前記組成物。
【請求項２】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、細胞内担体ペプチドに、ジスルフィド結合によって結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞内担体ペプチドが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６）を含む修飾されたｔａｔペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞内担体ペプチドが、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を含む修飾されたｔａｔペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
修飾されたｔａｔペプチドが、そのＮ末端において、アシル、アルキルまたはスルホニル基によって修飾されている、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
修飾されたｔａｔペプチドが、そのＮ末端において、アシル化されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ｔａｔペプチドが、さらにそのＣ末端において修飾されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
阻害性ペプチドが、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓのアミノ酸配列および末端のＣｙｓを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
末端のＣｙｓが、阻害性ペプチドのＣ末端に位置する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
阻害性ペプチドが、Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｇのアミノ酸配列および末端のＣｙｓを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
末端のＣｙｓが、阻害性ペプチドのＣ末端に位置する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ｔａｔペプチドが、そのＣ末端において、アミド形成によってさらに修飾されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、修飾されたｔａｔペプチドのアミノ酸の側鎖と共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、リジン、チロシンおよびグルタミンから選択される残基の側鎖と共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、Ｎ末端システイン残基の側鎖と共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｔａｔペプチドのＮ末端システインが、アシル化されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ｔａｔペプチドのＣ末端アルギニンが、第一級カルボキサミドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、そのＮ末端におけるアシル化またはそのＣ末端におけるアミド化によって、あるいはＮ末端におけるアシル化およびＣ末端におけるアミド化の両方によって修飾されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
ｔａｔペプチドが、Ａｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ−ＮＨ２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＫＣ阻害性ペプチドが、ｔａｔペプチドと、ｔａｔペプチドのシステイン残基のスルフィドリル基を通して共有結合している、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
第２の膜輸送ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
直鎖の治療用ペプチドであって、担体ペプチドおよびγＰＫＣ阻害性カーゴペプチドを含み、該担体ペプチドおよび該カーゴペプチドが、ペプチド結合によって結合している、前記直鎖の治療用ペプチド。
【請求項２３】
担体ペプチドおよびカーゴペプチドの間に位置するリンカーペプチドをさらに含み、該担体ペプチドおよび該カーゴペプチドが、リンカーペプチドとペプチド結合によって結合している、請求項２２に記載の直鎖の治療用ペプチド。
【請求項２４】
痛みを処置する方法であって、有効量の修飾されたガンマプロテインキナーゼＣ（γＰＫＣ）阻害性構築物を、痛みを患う対象に投与することを含み、該修飾γＰＫＣペプチドが、原型配列と比較して、より安定であるか、より強力であるか、またはその両方である、前記方法。
【請求項２５】
対象が患う痛みが、急性の痛み、慢性の痛み、神経性の痛み、および炎症性の痛みからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
増加した効力が、原型配列と比べて作用のより早い発現または活性のより長い持続に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
修飾されたγＰＫＣが、対象が痛み刺激を受け取る前、受け取っている間、または受け取った後に対象に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
阻害性ペプチドが、痛み刺激の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５分、一時間、数時間、一日、数日、一週間、または数週間前に投与される、請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５２３５９８（Ｐ２０１０−５２３５９８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２３５０（Ｐ２０１０−５０２３５０）
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９５９１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４６９８
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０７３３７９６８）カイ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９５９１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４６９８
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５０７３３７９６８）カイ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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