癌の予後の検知方法
【課題】癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知する方法及びキットを提供すること。
【解決手段】生体から採取した検体に存在するコア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法。「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ」は、「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ」であることが好ましい。また、ここにいう「生体」は、ヒトの生体であることが好ましく、「検体」は生体組織であることが好ましい。
【解決手段】生体から採取した検体に存在するコア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法。「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ」は、「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ」であることが好ましい。また、ここにいう「生体」は、ヒトの生体であることが好ましく、「検体」は生体組織であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年３月１９日出願の米国仮出願番号６０／４５５、５８５に基づき、その優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、癌の検知方法及び検知キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
Ｃ２ＧｎＴ：コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Core-2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase）
Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ：コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Core-2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase-I）。
本明細書においては、「GenBank accession No. Ｍ９７３４７」として特定されるＣ２ＧｎＴを指す。
ＧｎＴ−Ｖ：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（N-acetylglucosaminyltransferase-V）
ＰＳＡ：前立腺特異抗原
ｓＬｅｘ：シアリルルイスＸ
【０００４】
Ｃ２ＧｎＴやＧｎＴ-Ｖは、糖蛋白糖鎖の分岐構造の制御に関与する糖転移酵素である。非特許文献１には、GnT-Vとその産物である分岐したN-glycanが、大腸癌において転移能と相関することが開示されている。一方、非特許文献２には、肝細胞癌においてはGnT-Vの発現は癌化の初期のイベントとして捉えられ、転移を有する例ではむしろ発現が低下することが開示されている。C2GnTは、O-glycanの分岐酵素であって、core2構造を形成する。C2GnTはGnT-Vと同様にβ-1-6分岐糖鎖を形成し、種々の癌細胞の転移能とその発現に相関があることが知られている。非特許文献３及び４には、C2GnTの発現は腫瘍の深達度やリンパ節転移能とよく相関することが開示されている。
【非特許文献１】Clin. Cancer. Res., 6, 1772-1777 (2000)
【非特許文献２】Int. J. Cancer, 91, 631-637 (2001)
【非特許文献３】Cancer Res., 57, 5201-5206 (1997)
【非特許文献４】Cancer Res., 61, 2226-2231 (2001)
【０００５】
しかし、C2GnTと癌の予後との関係については知られていなかった。
癌の一種である前立腺癌は、通常、ＰＳＡによって発見される。前立腺癌に対しては一般に前立腺全摘術が適用されるが、最近は術式が多様化している。すなわち、開腹してリンパ節郭清をして全摘する、腹腔鏡で除去する、会陰を切開して除去する、さらに癌の進行が遅い場合には、症状が発現するまで経過観察するというオプションまである。
この多彩な治療方針の決定に使用されるパラメーターとしては、グリーソン・スコア（Gleason score）、ＰＳＡ、臨床ＴＮＭ分類等が挙げられる。しかし、これらのパラメータのみでは、治療前（例えば前立腺全摘前）の時点において、治療後の予後を正確に予測することは困難である。治療前の時点のデータで、治療後の予後の予測を正確に行うことができれば、前立腺全摘の必要性の有無、前立腺の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。このことは、無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができ、患者の利益にもつながることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知する方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、C2GnTを検出することによって癌の予後を検知できることを見出し、これに基づき癌の予後の検知方法及び検知キットを提供するに至り、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、生体から採取した検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法（以下「本発明方法」という）を提供する。ここにいう「Ｃ２ＧｎＴ」は、「Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ」であることが好ましい。また、ここにいう「生体」は、ヒトの生体であることが好ましく、「検体」は生体組織であることが好ましい。
また、Ｃ２ＧｎＴの検出は、Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましい。ここにいう「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
また予後の検知の対象となる「癌」は、前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌であることが好ましい。ここにいう「癌の予後」は、「癌の転移又は再発の可能性」であることが好ましい。
本発明方法は、癌組織を摘出する前に行われることが好ましい。ここにいう「摘出」は、全摘出であることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キット（以下「本発明キット」という）を提供する。
（Ａ）Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド
本発明キットは、さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことが好ましい。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの。
ここにいう「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知できる方法及びキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、生体から採取した検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法である。
ここで、「Ｃ２ＧｎＴ」は、「Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ」（GenBank accession No. Ｍ９７３４７として特定されるＣ２ＧｎＴ）が好ましい。
ここで、検体の採取の対象となる「生体」は、脊椎動物の生体であることが
好ましく、哺乳動物の生体であることがより好ましく、なかでもヒトの生体であることが特に好ましい。
【００１１】
本発明方法における「検体」は、生体に由来するものである限りにおいて特に限定されず、生体組織や体液（例えば、尿、血液（本明細書では、血清及び血漿を含む概念として用いる）、唾液、汗、涙液、関節液、軟骨の抽出液、細胞の培養上清等）等が例示される。なかでも生体組織が好ましく、予後の検知を所望する癌が存在する生体組織であることがより好ましい。
【００１２】
検体を生体から採取する方法は、用いる検体の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、検体として「生体組織」を用いる場合には、通常のバイオプシーの方法によって採取することができる。採取した検体が「生体組織」である場合には、当該生体組織から切片標本を作製することが好ましい。切片標本の作製方法も特に限定されず、通常の方法を用いることができる。例えば、採取した生体組織を固定し、次いでパラフィン等で包埋して、これを薄切することによって作製することができる。
【００１３】
検体に存在するＣ２ＧｎＴ検出の方法も、Ｃ２ＧｎＴがある程度特異的に検出できる方法である限りにおいて特に限定されず、例えばＣ２ＧｎＴに結合する物質を用いて検出する方法や、検体からＣ２ＧｎＴを抽出し、その物理化学的性質や酵素学的性質によって検出する方法等が例示される。なかでもＣ２ＧｎＴに結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましく、Ｃ２ＧｎＴに特異的に結合するポリペプチドを用いて行われることがより好ましい。 このような「ポリペプチド」としては、抗体又はその抗原結合部位（Ｆａｂ）を有するポリペプチドが好ましい。「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、抗体のＦａｂを含むフラグメントが例示される。Ｆａｂを含むフラグメントは、例えばＦａｂを分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理することによって製造することができる。「Ｆａｂを含むフラグメント」としては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。
【００１４】
また「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、目的とするＦａｂを有するキメラ抗体を挙げることができる。抗体をコードする遺伝子の塩基配列や抗体のアミノ酸配列が決定されれば、目的とするＦａｂ部位を有するキメラ抗体や、目的とするＦａｂ部位を含むフラグメント等を遺伝子工学的に製造することができる。
この「ポリペプチド」は、予め精製されているものが好ましい。例えば、ポリペプチドが「抗体」であって、その免疫グロブリンクラスがＩｇＧである場合にはプロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。また、抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＭである場合には、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等によって精製することができる。
ここで用いる「抗体」は、C2GnTに特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されず、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。このような抗体は、公知の方法によって製造することができる。
【００１５】
Ｃ２ＧｎＴの検出を「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」を用いて行う場合には、「検体」とこのポリペプチドとを接触させて、検体中に存在するＣ２ＧｎＴに結合した当該ポリペプチドを検出すればよい。「検体」と「ポリペプチド」との接触は、検体中に存在するＣ２ＧｎＴ分子とポリペプチド分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
これら両者を接触させた後、検体中のＣ２ＧｎＴ分子とポリペプチド分子とを十分に結合させるために、例えば４〜３７℃、好ましくは２０℃程度で１時間程度反応させることが好ましい。
この反応後に、固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかったポリペプチドを除去することが好ましい。
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
【００１６】
このポリペプチドは、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125Ｉ、131Ｉ、3Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンIII(ATIII)、多糖類とその結合タンパク質（ヒアルロン酸とヒアルロン酸結合性タンパク質(HABP)など）のいずれか一方の物質等が例示される。
【００１７】
また、「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」自体が標識されていなくても、このポリペプチド（第１のポリペプチド）に特異的に結合するポリペプチド（第２のポリペプチド）を用いて、当該第１のポリペプチドを検出してもよい。この「第２のポリペプチド」は、第１のポリペプチドに特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、第１のポリペプチドが抗体（免疫グロブリン）である場合には、当該免疫グロブリンが由来する動物及びクラス等に応じて、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば、第１のポリペプチド（一次抗体）がマウスの免疫グロブリン（マウス由来のIgG1）である場合には、第２のポリペプチド（二次抗体）として抗マウスIgG1抗体を用いることができる。第２のポリペプチドは、標識物質で標識されているか又は標識されるものを用いる。用いることができる標識物質は前記と同様である。
【００１８】
「ポリペプチド」を標識物質で標識する方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば酵素で標識する場合はグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法など、放射性同位元素で標識する場合はクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人（１９８７年）参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシミドエステル誘導体又はヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）を用いることができる。
「ポリペプチド」は、標識物質で予め標識されていることが好ましい。
検体中に存在するＣ２ＧｎＴに結合したポリペプチドは、標識物質を検出することによって検出することができる。
【００１９】
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素、o-フェニレンジアミン、3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを測定することによって、標識物質を検出することができる。
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
【００２０】
このような方法によって検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出することができるが、その検出は定量的なものであってもよく、定性的なもの（Ｃ２ＧｎＴの存否の検出）であってもよい。すなわち、このような方法によって得られる「Ｃ２ＧｎＴの検出結果」は、定量的な結果であっても、定性的な結果であってもよい。
例えば、Ｃ２ＧｎＴの定性的な測定（Ｃ２ＧｎＴの存否の検知）を所望する場合には、標識物質の検知の有無をそのままＣ２ＧｎＴの検出結果とすることができる。
また、Ｃ２ＧｎＴの定量的な検出を所望する場合には、放射能のカウント、発色強度、蛍光強度、発光強度などをそのままＣ２ＧｎＴ量の指標とすることができる。
【００２１】
本発明方法において、Ｃ２ＧｎＴの検出結果との関連づけがなされ、かつ、予後の検知の対象となる「癌」は、当技術分野において癌として認識される疾患である限りにおいて特に限定されないが、「前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌」であることが好ましい。本発明における「癌の予後」の内容も特に限定されないが、「癌の転移又は再発の可能性」であることが好ましい。特に「癌の再発の可能性」であることが好ましい。
【００２２】
「Ｃ２ＧｎＴの検出結果」と「癌の予後」との関連づけは、以下の通り行うことができる。
前記の通り、「癌の転移又は再発の可能性」が高い場合には、検体に存在するＣ２ＧｎＴが有意に増加している。よって検体に存在するＣ２ＧｎＴの検出結果（Ｃ２ＧｎＴの量）が一定レベル以上である場合には、今後、「癌が転移する可能性が高い」又は「癌が再発する可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、検体に存在するＣ２ＧｎＴの検出結果（Ｃ２ＧｎＴの量）が一定レベル以下である場合には、今後、「癌が転移する可能性が低い」又は「癌が再発する可能性が低い」と関連づけることができる。
例えば、生体組織の切片標本を用いた場合には、顕微鏡で観察して癌細胞全体の１０％以上にＣ２ＧｎＴが検出されている場合には「陽性」（(+)）と、それ以外を「陰性」((-))と判定し、陽性（(+)）の場合には「癌の転移又は再発の可能性が高い」と関連づけることができる。
【００２３】
本発明方法を癌組織を摘出する前に行うと、癌組織を摘出した後の予後の予測ができることから、組織の摘出の必要性の有無、組織の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。さらに、無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができる。したがって、本発明方法は癌組織を摘出する前に行われることが好ましい。特に「全摘出」をする前に行われることが好ましい。
【００２４】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キットである。
（Ａ）Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド
本発明キットは、さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことが好ましい。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの。
【００２５】
「Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド」の説明は、前記の「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」と同様である。「第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチド」の説明も、前記の「第２のポリペプチド」と同様である。また、本発明キットにおけるその他の用語の意義についても、前記と同様である。
したがって、ここにいう「ポリペプチド」は、前記と同様に、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
本発明キットを用いた癌の予後の検知は、前記の「本発明方法」（Ｃ２ＧｎＴの検出を「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」を用いて行う場合）に従って行うことができる。
【００２６】
本発明キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに標識物質の検知試薬等を構成として加えることができる。
また、これらの構成の他に、洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
これらの構成は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例において用いた検体、試薬等は以下の通りである。
（試薬等）
抗C2GnT抗体（ポリクローナル抗体）は、Skrincosky D, Kain R, El-Battari A, et al, J. Biol. Chem., 272, 22695-22702,（1997）に記載されたものを用いた。
抗sLex抗体（CSLEX-1）としては、ＡＴＣＣから入手したハイブリドーマ（ATCC Number HB-8580）が産生するものを用いた。
抗GnT-V抗体は、Int. J. Cancer, 91(5) p631-637 (2001)に記載されたものを用いた。
二次抗体として用いたペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇ抗体は、株式会社ニチレイ製の、ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO（商品名）を用いた。ペルオキシダーゼの基質や発色物質としては、株式会社ニチレイ製のAEC基質キットを用いた。
【００２９】
実施例１
前立腺癌：
前立腺組織の抗C2GnT抗体による染色性と、前立腺癌の悪性度や予後との関係を調べるために、以下の実験を行った。
根治的前立腺全摘術を施行するT1症例およびT2症例の患者（６９例）から、バイオプシーによって前立腺組織を採取した。これらの患者は、術前術後にホルモン療法を行わなかった患者である。採取した前立腺組織を通常の方法でホルマリン固定し、パラフィン包埋切片を作製した。この切片標本について免疫組織染色を行った。
免疫組織染色は、抗C2GnT抗体を一次抗体として用いて４℃で一晩反応させ、次いでペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇ抗体を二次抗体として用いて室温で１時間反応させた後、発色基質を用いて発色させることによって行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」((-))とした。
抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図１に示した。糖鎖を付加する糖転移酵素の細胞内局在はゴルジ体なので、C2GnTは核近傍に粒状に染色される。一般に、グリーソン・グレードの低い部分では陰性で、グレードが高くなると明瞭なゴルジパターンとして染色される。
【００３０】
（１）悪性度とC2GnTとの関係
抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、グリーソン・スコア（Gleason score）とを対比した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
この通り、C2GnT陽性率は、グリーソン・スコア６以下の群においては６/18 (33%)、スコア７の群においては18/26 (69%)、スコア８以上の群においては23/25 (92%)であった。このことから、C2GnTの陽性率が高くなるにつれて、グリーソン・スコアも有意に高くなることが示された。
一次抗体として抗sLex抗体(CSLEX-1；ATCC Number HB-8580で示されるハイブリドーマを用いて調製)を用いて、sLeｘの染色性についても調べたところ、同様の結果が得られた。しかし、p-valueはsLeｘよりもC2GnTの方が低かったことから、悪性度をより鋭敏に反映するのはC2GnTであることが示唆された。
【００３３】
（２）予後とC2GnTとの関係
（２−１）抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、ｐＴ（病理的な原発巣のステージを示す。「ｐＴ２」は原発巣が前立腺内に限局しており、「ｐＴ３」は原発巣が被膜を破って外部に出ている状態を示す）とを対比した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
この通り、C2GnT陽性率は、バイオプシー標本のｐＴ診断において「ｐＴ２」と判定された群においては23/44 (52%)、「ｐＴ３」と判定された群においては24/25 (96%)であった。このことから、C2GnTの陽性率が高くなるにつれて、ｐＴも高くなることが示された
【００３６】
（２−２）抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、PSA failureとの関係を調べた。前立腺全摘後の期間と、PSA failure（PSA非再発率）との関係を図２に示す。
図２より、C2GnT陽性群が前立腺全摘後においてPSA failureに陥る可能性は、C2GnT陰性群のそれに比して高い（PSA非再発率が低い）ことが示された。この結果は、統計学的に有意であった（p<0.0464；Logrank test）。
なお、PSA failureの頻度は、C2GnT陽性例においては19/47 (40%)、C2GnT陰性例においては3/22 (13%)であった（平均観察期間38.3ヶ月）。
この結果から、病理学的病期予測因子および全摘後のPSA failure予知因子として、C2GnTの有用性が示唆された。
【００３７】
実施例２
精巣腫瘍：
精巣腫瘍組織の抗C2GnT抗体による染色性と、精巣腫瘍の悪性度等の関係を調べるために、以下の実験を行った。
精巣摘除術を施行した患者（１４４例）のうち、生殖細胞腫瘍（germ cell tumor）の１３３例を対象とした。その構成は以下の通りである。
【００３８】
生殖細胞腫瘍 １３３例
セミノーマ（Seminoma） ６８例
転移なし（ステージＩ） ４６例
転移あり（ステージII以上） ２２例
非セミノーマ（non-Seminoma） ６５例
転移なし（ステージＩ） ２８例
転移あり（ステージII以上） ３７例
【００３９】
採取した精巣組織について、前記と同様にパラフィン切片標本を作製し、抗C2GnT抗体又は抗GnT-V抗体を一次抗体として用いて、前記と同様に免疫組織染色を行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」（(-)））とした。
抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図３に示す。図３（Ａ）は胎児性癌におけるC2GnT陽性の染色例を、図３（Ｂ）は絨毛性癌におけるC2GnT陽性の染色性を示す。
【００４０】
・ 悪性度とC2GnTやGnT-Vとの関係
C2GnT陽性率は、セミノーマで０／６８、非セミノーマで４２／６５であった。すなわち、セミノーマではC2GnTの発現は認められなかった。
種々の悪性度の癌組織を用いた場合における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図４に、抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を図５にそれぞれ示す。図４、図５ともに、図面の上から下に向かって悪性度が高い組織を用いている。
この結果、GnT-Vの染色性が高い組織は悪性度が低く、C2GnTの染色性が高い組織は悪性度が高いことが示された。このことから、C2GnTとGnT-Vは、組織の悪性度に関して全く反対の挙動を示すことが示された。
【００４１】
（２）転移とC2GnTとの関係
C2GnT陽性群とC2GnT陰性群のそれぞれについて、精巣組織の癌転移の有無の数を調べた。結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
表３から、C2GnT陽性群では転移を有する例が有意に多いことが示された。
【００４４】
（３）予後とC2GnTとの関係
抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、の非再発率との関係を調べた。精巣摘除後の期間と、非再発率との関係は、以下の通りであった。
C2GnT陰性群（n=19）については、３５ヵ月経過後であっても非再発率は８５％と高かった。一方、C2GnT陽性群（n=9）については、徐々に再発が増加し、５ヵ月経過後には非再発率が２０％にまで低下していた。この結果から、抗C2GnT抗体陽性例では、高い再発率を呈することが明らかとなった。
【００４５】
実施例３
膀胱癌：
膀胱癌組織の抗C2GnT抗体による染色性と、膀胱癌の悪性度等の関係を調べるために、以下の実験を行った。
健常人及び膀胱癌患者（計８１例）を対象とした。その構成は以下の通りである。なお「ｐＴ」は腫瘍の深達度を示し、ｐＴａが最も浅く、数字が大きいほど深達度が高いことを示す。
【００４６】
健常な膀胱 １５例
膀胱癌 ６６例
パピローマ（papilloma） ２例
ｐＴａ ２３例
ｐＴ１ ２０例
ｐＴ２〜ｐＴ４ １４例
リンパ節転移 ５例
正常のリンパ節 ２例
【００４７】
採取した膀胱組織について、前記と同様にパラフィン切片標本を作製し、抗C2GnT抗体又は抗GnT-V抗体を一次抗体として用いて、前記と同様に免疫組織染色を行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」（(-)）とした。
【００４８】
（１）悪性度とC2GnTやGnT-Vとの関係
抗C2GnT抗体及び抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を図６に示す。図６のＡ〜Ｃは抗GnT-V抗体による免疫染色の結果を、Ｄ〜Ｅは抗C2GnT抗体による免疫染色の結果を示す。ＡとＤが最も悪性度が低く、ＢとＥは中程度の悪性度であり、ＣとＦは最も悪性度が高い組織を示す。
この結果、精巣腫瘍と同様に、GnT-Vの染色性が高い組織は悪性度が低く、C2GnTの染色性が高い組織は悪性度が高いことが示された。このことから、C2GnTとGnT-Vは、組織の悪性度に関して全く反対の挙動を示すことが示された。
また、種々の悪性度におけるGnT-V及びC2GnT陽性群の数を調べた。結果を表４及び表５に示す。なお表５における「Ｇ１」、「Ｇ２」及び「Ｇ３」は悪性度のグレードを意味し、数字が大きくなるほど悪性度が高いことを示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
これらの結果から、Gnt-V陽性群では有意に悪性度（浸潤度）が低く、C2GnT陽性群では有意に悪性度（浸潤度）が高いことが示された。
【００５２】
実施例４
本発明キットの作製：
以下の構成からなる本発明キットを作製した。
【００５３】
１．抗C2GnT抗体（マウス） １本 （一次抗体）
２．ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体 １本 （二次抗体）
３．ＴＭＢ溶液 １本 （基質）
【００５４】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。すべての引用される参照は内容として取り込まれる。
本出願は、２００３年３月１９日出願の米国仮特許出願６０／４５５、５８５に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明方法は、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知することができることから、極めて有用である。また本発明キットを用いると、このような本発明方法をさらに簡便かつ迅速に実施できることから、極めて有用である。本発明によって、治療前の時点のデータで、治療後の予後の予測を正確に行うことができ、前立腺全摘の必要性の有無、前立腺の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。さらに無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができ、患者の利益にもつながることになる。また、本発明方法を、グリーソン・スコアやＰＳＡ値等のパラメータと組み合わせて総合的に評価することによって、癌の悪性度、進行性、予後、リンパ節転移の有無、再発の有無等をさらに正確に予測できるようになり、従って、本発明方法は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】前立腺癌における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図２】前立腺全摘後の期間と、PSA failure（PSA非再発率）との関係を示す図である。
【図３】精巣腫瘍における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図４】種々の悪性度の精巣腫瘍組織を用いた場合における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図５】種々の悪性度の精巣腫瘍組織を用いた場合における、抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図６】膀胱癌における、抗C2GnT抗体及び抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年３月１９日出願の米国仮出願番号６０／４５５、５８５に基づき、その優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、癌の検知方法及び検知キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
Ｃ２ＧｎＴ：コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Core-2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase）
Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ：コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Core-2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase-I）。
本明細書においては、「GenBank accession No. Ｍ９７３４７」として特定されるＣ２ＧｎＴを指す。
ＧｎＴ−Ｖ：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（N-acetylglucosaminyltransferase-V）
ＰＳＡ：前立腺特異抗原
ｓＬｅｘ：シアリルルイスＸ
【０００４】
Ｃ２ＧｎＴやＧｎＴ-Ｖは、糖蛋白糖鎖の分岐構造の制御に関与する糖転移酵素である。非特許文献１には、GnT-Vとその産物である分岐したN-glycanが、大腸癌において転移能と相関することが開示されている。一方、非特許文献２には、肝細胞癌においてはGnT-Vの発現は癌化の初期のイベントとして捉えられ、転移を有する例ではむしろ発現が低下することが開示されている。C2GnTは、O-glycanの分岐酵素であって、core2構造を形成する。C2GnTはGnT-Vと同様にβ-1-6分岐糖鎖を形成し、種々の癌細胞の転移能とその発現に相関があることが知られている。非特許文献３及び４には、C2GnTの発現は腫瘍の深達度やリンパ節転移能とよく相関することが開示されている。
【非特許文献１】Clin. Cancer. Res., 6, 1772-1777 (2000)
【非特許文献２】Int. J. Cancer, 91, 631-637 (2001)
【非特許文献３】Cancer Res., 57, 5201-5206 (1997)
【非特許文献４】Cancer Res., 61, 2226-2231 (2001)
【０００５】
しかし、C2GnTと癌の予後との関係については知られていなかった。
癌の一種である前立腺癌は、通常、ＰＳＡによって発見される。前立腺癌に対しては一般に前立腺全摘術が適用されるが、最近は術式が多様化している。すなわち、開腹してリンパ節郭清をして全摘する、腹腔鏡で除去する、会陰を切開して除去する、さらに癌の進行が遅い場合には、症状が発現するまで経過観察するというオプションまである。
この多彩な治療方針の決定に使用されるパラメーターとしては、グリーソン・スコア（Gleason score）、ＰＳＡ、臨床ＴＮＭ分類等が挙げられる。しかし、これらのパラメータのみでは、治療前（例えば前立腺全摘前）の時点において、治療後の予後を正確に予測することは困難である。治療前の時点のデータで、治療後の予後の予測を正確に行うことができれば、前立腺全摘の必要性の有無、前立腺の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。このことは、無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができ、患者の利益にもつながることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知する方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、C2GnTを検出することによって癌の予後を検知できることを見出し、これに基づき癌の予後の検知方法及び検知キットを提供するに至り、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、生体から採取した検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法（以下「本発明方法」という）を提供する。ここにいう「Ｃ２ＧｎＴ」は、「Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ」であることが好ましい。また、ここにいう「生体」は、ヒトの生体であることが好ましく、「検体」は生体組織であることが好ましい。
また、Ｃ２ＧｎＴの検出は、Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましい。ここにいう「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
また予後の検知の対象となる「癌」は、前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌であることが好ましい。ここにいう「癌の予後」は、「癌の転移又は再発の可能性」であることが好ましい。
本発明方法は、癌組織を摘出する前に行われることが好ましい。ここにいう「摘出」は、全摘出であることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キット（以下「本発明キット」という）を提供する。
（Ａ）Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド
本発明キットは、さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことが好ましい。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの。
ここにいう「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知できる方法及びキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、生体から採取した検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法である。
ここで、「Ｃ２ＧｎＴ」は、「Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ」（GenBank accession No. Ｍ９７３４７として特定されるＣ２ＧｎＴ）が好ましい。
ここで、検体の採取の対象となる「生体」は、脊椎動物の生体であることが
好ましく、哺乳動物の生体であることがより好ましく、なかでもヒトの生体であることが特に好ましい。
【００１１】
本発明方法における「検体」は、生体に由来するものである限りにおいて特に限定されず、生体組織や体液（例えば、尿、血液（本明細書では、血清及び血漿を含む概念として用いる）、唾液、汗、涙液、関節液、軟骨の抽出液、細胞の培養上清等）等が例示される。なかでも生体組織が好ましく、予後の検知を所望する癌が存在する生体組織であることがより好ましい。
【００１２】
検体を生体から採取する方法は、用いる検体の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、検体として「生体組織」を用いる場合には、通常のバイオプシーの方法によって採取することができる。採取した検体が「生体組織」である場合には、当該生体組織から切片標本を作製することが好ましい。切片標本の作製方法も特に限定されず、通常の方法を用いることができる。例えば、採取した生体組織を固定し、次いでパラフィン等で包埋して、これを薄切することによって作製することができる。
【００１３】
検体に存在するＣ２ＧｎＴ検出の方法も、Ｃ２ＧｎＴがある程度特異的に検出できる方法である限りにおいて特に限定されず、例えばＣ２ＧｎＴに結合する物質を用いて検出する方法や、検体からＣ２ＧｎＴを抽出し、その物理化学的性質や酵素学的性質によって検出する方法等が例示される。なかでもＣ２ＧｎＴに結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましく、Ｃ２ＧｎＴに特異的に結合するポリペプチドを用いて行われることがより好ましい。 このような「ポリペプチド」としては、抗体又はその抗原結合部位（Ｆａｂ）を有するポリペプチドが好ましい。「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、抗体のＦａｂを含むフラグメントが例示される。Ｆａｂを含むフラグメントは、例えばＦａｂを分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理することによって製造することができる。「Ｆａｂを含むフラグメント」としては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。
【００１４】
また「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、目的とするＦａｂを有するキメラ抗体を挙げることができる。抗体をコードする遺伝子の塩基配列や抗体のアミノ酸配列が決定されれば、目的とするＦａｂ部位を有するキメラ抗体や、目的とするＦａｂ部位を含むフラグメント等を遺伝子工学的に製造することができる。
この「ポリペプチド」は、予め精製されているものが好ましい。例えば、ポリペプチドが「抗体」であって、その免疫グロブリンクラスがＩｇＧである場合にはプロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。また、抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＭである場合には、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等によって精製することができる。
ここで用いる「抗体」は、C2GnTに特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されず、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。このような抗体は、公知の方法によって製造することができる。
【００１５】
Ｃ２ＧｎＴの検出を「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」を用いて行う場合には、「検体」とこのポリペプチドとを接触させて、検体中に存在するＣ２ＧｎＴに結合した当該ポリペプチドを検出すればよい。「検体」と「ポリペプチド」との接触は、検体中に存在するＣ２ＧｎＴ分子とポリペプチド分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
これら両者を接触させた後、検体中のＣ２ＧｎＴ分子とポリペプチド分子とを十分に結合させるために、例えば４〜３７℃、好ましくは２０℃程度で１時間程度反応させることが好ましい。
この反応後に、固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかったポリペプチドを除去することが好ましい。
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
【００１６】
このポリペプチドは、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125Ｉ、131Ｉ、3Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンIII(ATIII)、多糖類とその結合タンパク質（ヒアルロン酸とヒアルロン酸結合性タンパク質(HABP)など）のいずれか一方の物質等が例示される。
【００１７】
また、「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」自体が標識されていなくても、このポリペプチド（第１のポリペプチド）に特異的に結合するポリペプチド（第２のポリペプチド）を用いて、当該第１のポリペプチドを検出してもよい。この「第２のポリペプチド」は、第１のポリペプチドに特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、第１のポリペプチドが抗体（免疫グロブリン）である場合には、当該免疫グロブリンが由来する動物及びクラス等に応じて、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば、第１のポリペプチド（一次抗体）がマウスの免疫グロブリン（マウス由来のIgG1）である場合には、第２のポリペプチド（二次抗体）として抗マウスIgG1抗体を用いることができる。第２のポリペプチドは、標識物質で標識されているか又は標識されるものを用いる。用いることができる標識物質は前記と同様である。
【００１８】
「ポリペプチド」を標識物質で標識する方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば酵素で標識する場合はグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法など、放射性同位元素で標識する場合はクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人（１９８７年）参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシミドエステル誘導体又はヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）を用いることができる。
「ポリペプチド」は、標識物質で予め標識されていることが好ましい。
検体中に存在するＣ２ＧｎＴに結合したポリペプチドは、標識物質を検出することによって検出することができる。
【００１９】
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素、o-フェニレンジアミン、3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを測定することによって、標識物質を検出することができる。
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
【００２０】
このような方法によって検体に存在するＣ２ＧｎＴを検出することができるが、その検出は定量的なものであってもよく、定性的なもの（Ｃ２ＧｎＴの存否の検出）であってもよい。すなわち、このような方法によって得られる「Ｃ２ＧｎＴの検出結果」は、定量的な結果であっても、定性的な結果であってもよい。
例えば、Ｃ２ＧｎＴの定性的な測定（Ｃ２ＧｎＴの存否の検知）を所望する場合には、標識物質の検知の有無をそのままＣ２ＧｎＴの検出結果とすることができる。
また、Ｃ２ＧｎＴの定量的な検出を所望する場合には、放射能のカウント、発色強度、蛍光強度、発光強度などをそのままＣ２ＧｎＴ量の指標とすることができる。
【００２１】
本発明方法において、Ｃ２ＧｎＴの検出結果との関連づけがなされ、かつ、予後の検知の対象となる「癌」は、当技術分野において癌として認識される疾患である限りにおいて特に限定されないが、「前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌」であることが好ましい。本発明における「癌の予後」の内容も特に限定されないが、「癌の転移又は再発の可能性」であることが好ましい。特に「癌の再発の可能性」であることが好ましい。
【００２２】
「Ｃ２ＧｎＴの検出結果」と「癌の予後」との関連づけは、以下の通り行うことができる。
前記の通り、「癌の転移又は再発の可能性」が高い場合には、検体に存在するＣ２ＧｎＴが有意に増加している。よって検体に存在するＣ２ＧｎＴの検出結果（Ｃ２ＧｎＴの量）が一定レベル以上である場合には、今後、「癌が転移する可能性が高い」又は「癌が再発する可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、検体に存在するＣ２ＧｎＴの検出結果（Ｃ２ＧｎＴの量）が一定レベル以下である場合には、今後、「癌が転移する可能性が低い」又は「癌が再発する可能性が低い」と関連づけることができる。
例えば、生体組織の切片標本を用いた場合には、顕微鏡で観察して癌細胞全体の１０％以上にＣ２ＧｎＴが検出されている場合には「陽性」（(+)）と、それ以外を「陰性」((-))と判定し、陽性（(+)）の場合には「癌の転移又は再発の可能性が高い」と関連づけることができる。
【００２３】
本発明方法を癌組織を摘出する前に行うと、癌組織を摘出した後の予後の予測ができることから、組織の摘出の必要性の有無、組織の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。さらに、無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができる。したがって、本発明方法は癌組織を摘出する前に行われることが好ましい。特に「全摘出」をする前に行われることが好ましい。
【００２４】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キットである。
（Ａ）Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド
本発明キットは、さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことが好ましい。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの。
【００２５】
「Ｃ２ＧｎＴに結合する第１のポリペプチド」の説明は、前記の「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」と同様である。「第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチド」の説明も、前記の「第２のポリペプチド」と同様である。また、本発明キットにおけるその他の用語の意義についても、前記と同様である。
したがって、ここにいう「ポリペプチド」は、前記と同様に、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
本発明キットを用いた癌の予後の検知は、前記の「本発明方法」（Ｃ２ＧｎＴの検出を「Ｃ２ＧｎＴに結合するポリペプチド」を用いて行う場合）に従って行うことができる。
【００２６】
本発明キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに標識物質の検知試薬等を構成として加えることができる。
また、これらの構成の他に、洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
これらの構成は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例において用いた検体、試薬等は以下の通りである。
（試薬等）
抗C2GnT抗体（ポリクローナル抗体）は、Skrincosky D, Kain R, El-Battari A, et al, J. Biol. Chem., 272, 22695-22702,（1997）に記載されたものを用いた。
抗sLex抗体（CSLEX-1）としては、ＡＴＣＣから入手したハイブリドーマ（ATCC Number HB-8580）が産生するものを用いた。
抗GnT-V抗体は、Int. J. Cancer, 91(5) p631-637 (2001)に記載されたものを用いた。
二次抗体として用いたペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇ抗体は、株式会社ニチレイ製の、ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO（商品名）を用いた。ペルオキシダーゼの基質や発色物質としては、株式会社ニチレイ製のAEC基質キットを用いた。
【００２９】
実施例１
前立腺癌：
前立腺組織の抗C2GnT抗体による染色性と、前立腺癌の悪性度や予後との関係を調べるために、以下の実験を行った。
根治的前立腺全摘術を施行するT1症例およびT2症例の患者（６９例）から、バイオプシーによって前立腺組織を採取した。これらの患者は、術前術後にホルモン療法を行わなかった患者である。採取した前立腺組織を通常の方法でホルマリン固定し、パラフィン包埋切片を作製した。この切片標本について免疫組織染色を行った。
免疫組織染色は、抗C2GnT抗体を一次抗体として用いて４℃で一晩反応させ、次いでペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇ抗体を二次抗体として用いて室温で１時間反応させた後、発色基質を用いて発色させることによって行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」((-))とした。
抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図１に示した。糖鎖を付加する糖転移酵素の細胞内局在はゴルジ体なので、C2GnTは核近傍に粒状に染色される。一般に、グリーソン・グレードの低い部分では陰性で、グレードが高くなると明瞭なゴルジパターンとして染色される。
【００３０】
（１）悪性度とC2GnTとの関係
抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、グリーソン・スコア（Gleason score）とを対比した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
この通り、C2GnT陽性率は、グリーソン・スコア６以下の群においては６/18 (33%)、スコア７の群においては18/26 (69%)、スコア８以上の群においては23/25 (92%)であった。このことから、C2GnTの陽性率が高くなるにつれて、グリーソン・スコアも有意に高くなることが示された。
一次抗体として抗sLex抗体(CSLEX-1；ATCC Number HB-8580で示されるハイブリドーマを用いて調製)を用いて、sLeｘの染色性についても調べたところ、同様の結果が得られた。しかし、p-valueはsLeｘよりもC2GnTの方が低かったことから、悪性度をより鋭敏に反映するのはC2GnTであることが示唆された。
【００３３】
（２）予後とC2GnTとの関係
（２−１）抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、ｐＴ（病理的な原発巣のステージを示す。「ｐＴ２」は原発巣が前立腺内に限局しており、「ｐＴ３」は原発巣が被膜を破って外部に出ている状態を示す）とを対比した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
この通り、C2GnT陽性率は、バイオプシー標本のｐＴ診断において「ｐＴ２」と判定された群においては23/44 (52%)、「ｐＴ３」と判定された群においては24/25 (96%)であった。このことから、C2GnTの陽性率が高くなるにつれて、ｐＴも高くなることが示された
【００３６】
（２−２）抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、PSA failureとの関係を調べた。前立腺全摘後の期間と、PSA failure（PSA非再発率）との関係を図２に示す。
図２より、C2GnT陽性群が前立腺全摘後においてPSA failureに陥る可能性は、C2GnT陰性群のそれに比して高い（PSA非再発率が低い）ことが示された。この結果は、統計学的に有意であった（p<0.0464；Logrank test）。
なお、PSA failureの頻度は、C2GnT陽性例においては19/47 (40%)、C2GnT陰性例においては3/22 (13%)であった（平均観察期間38.3ヶ月）。
この結果から、病理学的病期予測因子および全摘後のPSA failure予知因子として、C2GnTの有用性が示唆された。
【００３７】
実施例２
精巣腫瘍：
精巣腫瘍組織の抗C2GnT抗体による染色性と、精巣腫瘍の悪性度等の関係を調べるために、以下の実験を行った。
精巣摘除術を施行した患者（１４４例）のうち、生殖細胞腫瘍（germ cell tumor）の１３３例を対象とした。その構成は以下の通りである。
【００３８】
生殖細胞腫瘍 １３３例
セミノーマ（Seminoma） ６８例
転移なし（ステージＩ） ４６例
転移あり（ステージII以上） ２２例
非セミノーマ（non-Seminoma） ６５例
転移なし（ステージＩ） ２８例
転移あり（ステージII以上） ３７例
【００３９】
採取した精巣組織について、前記と同様にパラフィン切片標本を作製し、抗C2GnT抗体又は抗GnT-V抗体を一次抗体として用いて、前記と同様に免疫組織染色を行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」（(-)））とした。
抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図３に示す。図３（Ａ）は胎児性癌におけるC2GnT陽性の染色例を、図３（Ｂ）は絨毛性癌におけるC2GnT陽性の染色性を示す。
【００４０】
・ 悪性度とC2GnTやGnT-Vとの関係
C2GnT陽性率は、セミノーマで０／６８、非セミノーマで４２／６５であった。すなわち、セミノーマではC2GnTの発現は認められなかった。
種々の悪性度の癌組織を用いた場合における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を図４に、抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を図５にそれぞれ示す。図４、図５ともに、図面の上から下に向かって悪性度が高い組織を用いている。
この結果、GnT-Vの染色性が高い組織は悪性度が低く、C2GnTの染色性が高い組織は悪性度が高いことが示された。このことから、C2GnTとGnT-Vは、組織の悪性度に関して全く反対の挙動を示すことが示された。
【００４１】
（２）転移とC2GnTとの関係
C2GnT陽性群とC2GnT陰性群のそれぞれについて、精巣組織の癌転移の有無の数を調べた。結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
表３から、C2GnT陽性群では転移を有する例が有意に多いことが示された。
【００４４】
（３）予後とC2GnTとの関係
抗C2GnT抗体による染色性（陽性率）と、の非再発率との関係を調べた。精巣摘除後の期間と、非再発率との関係は、以下の通りであった。
C2GnT陰性群（n=19）については、３５ヵ月経過後であっても非再発率は８５％と高かった。一方、C2GnT陽性群（n=9）については、徐々に再発が増加し、５ヵ月経過後には非再発率が２０％にまで低下していた。この結果から、抗C2GnT抗体陽性例では、高い再発率を呈することが明らかとなった。
【００４５】
実施例３
膀胱癌：
膀胱癌組織の抗C2GnT抗体による染色性と、膀胱癌の悪性度等の関係を調べるために、以下の実験を行った。
健常人及び膀胱癌患者（計８１例）を対象とした。その構成は以下の通りである。なお「ｐＴ」は腫瘍の深達度を示し、ｐＴａが最も浅く、数字が大きいほど深達度が高いことを示す。
【００４６】
健常な膀胱 １５例
膀胱癌 ６６例
パピローマ（papilloma） ２例
ｐＴａ ２３例
ｐＴ１ ２０例
ｐＴ２〜ｐＴ４ １４例
リンパ節転移 ５例
正常のリンパ節 ２例
【００４７】
採取した膀胱組織について、前記と同様にパラフィン切片標本を作製し、抗C2GnT抗体又は抗GnT-V抗体を一次抗体として用いて、前記と同様に免疫組織染色を行った。
染色後、光学顕微鏡で観察して、癌細胞全体の１０％以上が染色されている場合に「陽性」（(+)）と判定し、それ以外を「陰性」（(-)）とした。
【００４８】
（１）悪性度とC2GnTやGnT-Vとの関係
抗C2GnT抗体及び抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を図６に示す。図６のＡ〜Ｃは抗GnT-V抗体による免疫染色の結果を、Ｄ〜Ｅは抗C2GnT抗体による免疫染色の結果を示す。ＡとＤが最も悪性度が低く、ＢとＥは中程度の悪性度であり、ＣとＦは最も悪性度が高い組織を示す。
この結果、精巣腫瘍と同様に、GnT-Vの染色性が高い組織は悪性度が低く、C2GnTの染色性が高い組織は悪性度が高いことが示された。このことから、C2GnTとGnT-Vは、組織の悪性度に関して全く反対の挙動を示すことが示された。
また、種々の悪性度におけるGnT-V及びC2GnT陽性群の数を調べた。結果を表４及び表５に示す。なお表５における「Ｇ１」、「Ｇ２」及び「Ｇ３」は悪性度のグレードを意味し、数字が大きくなるほど悪性度が高いことを示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
これらの結果から、Gnt-V陽性群では有意に悪性度（浸潤度）が低く、C2GnT陽性群では有意に悪性度（浸潤度）が高いことが示された。
【００５２】
実施例４
本発明キットの作製：
以下の構成からなる本発明キットを作製した。
【００５３】
１．抗C2GnT抗体（マウス） １本 （一次抗体）
２．ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体 １本 （二次抗体）
３．ＴＭＢ溶液 １本 （基質）
【００５４】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。すべての引用される参照は内容として取り込まれる。
本出願は、２００３年３月１９日出願の米国仮特許出願６０／４５５、５８５に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明方法は、癌の予後を高い正確性をもって、簡便、迅速的かつ安価に検知することができることから、極めて有用である。また本発明キットを用いると、このような本発明方法をさらに簡便かつ迅速に実施できることから、極めて有用である。本発明によって、治療前の時点のデータで、治療後の予後の予測を正確に行うことができ、前立腺全摘の必要性の有無、前立腺の全摘のみで根治する可能性、他の処置方法の選択の必要性等、治療方針の決定に際して極めて有用な情報が提供される。さらに無用な医学的処置が防止されることにもつながり、患者に対しても高い正確性をもって情報を提供することができ、患者の利益にもつながることになる。また、本発明方法を、グリーソン・スコアやＰＳＡ値等のパラメータと組み合わせて総合的に評価することによって、癌の悪性度、進行性、予後、リンパ節転移の有無、再発の有無等をさらに正確に予測できるようになり、従って、本発明方法は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】前立腺癌における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図２】前立腺全摘後の期間と、PSA failure（PSA非再発率）との関係を示す図である。
【図３】精巣腫瘍における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図４】種々の悪性度の精巣腫瘍組織を用いた場合における、抗C2GnT抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図５】種々の悪性度の精巣腫瘍組織を用いた場合における、抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【図６】膀胱癌における、抗C2GnT抗体及び抗GnT-V抗体による免疫染色の一例を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した検体に存在するコア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法。
【請求項２】
「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ」が、「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ」であることを特徴とする、請求項１に記載の検知方法。
【請求項３】
「生体」が、ヒトの生体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
「検体」が、生体組織であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの検出が、コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに結合するポリペプチドを用いて行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
「ポリペプチド」が、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
「癌」が、前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
「癌の予後」が、癌の転移又は再発の可能性であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
癌組織を摘出する前に行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
「摘出」が、全摘出であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キット。
（Ａ）コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに結合する第１のポリペプチド
【請求項１２】
さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
【請求項１３】
ポリペプチドが、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項１１又は１２に記載の検知キット。
【請求項１】
生体から採取した検体に存在するコア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを検出し、その検出結果と前記生体の癌の予後とを関連づけるステップを少なくとも含む、癌の予後の検知方法。
【請求項２】
「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ」が、「コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ」であることを特徴とする、請求項１に記載の検知方法。
【請求項３】
「生体」が、ヒトの生体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
「検体」が、生体組織であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの検出が、コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに結合するポリペプチドを用いて行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
「ポリペプチド」が、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
「癌」が、前立腺癌、精巣腫瘍及び膀胱癌からなる群から選ばれる１又は２以上の癌であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
「癌の予後」が、癌の転移又は再発の可能性であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
癌組織を摘出する前に行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
「摘出」が、全摘出であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の構成成分（Ａ）を少なくとも含む、癌の予後の検知キット。
（Ａ）コア２ β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに結合する第１のポリペプチド
【請求項１２】
さらに下記の構成成分（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
（Ｂ）（Ａ）に示す第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
【請求項１３】
ポリペプチドが、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項１１又は１２に記載の検知キット。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５２０９１２（Ｐ２００６−５２０９１２Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８９１８（Ｐ２００６−５０８９１８）
【出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９３６６２
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【出願人】（５００１１４５８６）ザ バーナム インスティチュート (8)
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９３６６２
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【出願人】（５００１１４５８６）ザ バーナム インスティチュート (8)
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