発光測定方法
【課題】基板表面へ供給する発光反応試薬溶液を十分に展開させ、かつ揮発を防止する。
【解決手段】被検物質が表面に固定化され、前記被検物質の固定化領域を囲む堰30が配置されたマイクロアレイ基板1上に予め、発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液50を供給し、その後に発光反応試薬溶液51を供給する。
【解決手段】被検物質が表面に固定化され、前記被検物質の固定化領域を囲む堰30が配置されたマイクロアレイ基板1上に予め、発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液50を供給し、その後に発光反応試薬溶液51を供給する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面に固定化あるいは定着された被検物質を発光法で測定する発光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子、特に遺伝子の解析に、マイクロアレイが広く利用されている。マイクロアレイの作成はたとえば、１×３インチ大のガラス基板上に、検査対象の遺伝子（群）と相補性のある配列の一部を含んだ遺伝子溶液の液滴をナノリットル単位で点着してマイクロメートル単位の微小なスポットを形成し、このスポットされたアレイ上に試料の遺伝子断片を固定化する方法がとられている。スポットされたアレイに対して２種類の試料より抽出した遺伝子を混合し、それぞれの試料、すなわち、細胞、組織、あるいは個体中での遺伝子の発現比のプロファイリングを網羅的に解析することも可能となっている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
マイクロアレイの解析には、蛍光分光を利用した測定方法が採用されてきたが、蛍光分光法よりも高感度な発光法も採用されてきており、近年では、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）の性能向上に伴って、ＣＣＤを発光検出器としてシグナルの有無・増減を検出する方法がとられている。
【０００４】
ここで、蛍光分光法を利用する場合はマイクロアレイは湿潤した状態である必要はないのに対して、発光法を利用する場合は、発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給（滴下）して発光基質との反応により生じる発光量を測定するので、基板上の少なくとも測定領域は前記試薬溶液で湿潤した状態となる。
【０００５】
このため発光法を利用する測定では、発光反応試薬溶液の漏れを防止するために基板表面上に堰を設けるほか、基板を前記試薬溶液に浸漬させることが提案されている（例えば、特許文献３参照）。その他、前記試薬溶液の漏れおよび蒸発を防止するために、多孔性基板の表面に前記試薬溶液を送液できる流路を設け、当該基板をカートリッジに挟み込むこと（例えば、特許文献４参照）や、非多孔性の基板の表面に前記試薬溶液の展開を容易にする僅かな凹部を有するカバータイルを設け、このカバータイルを前記試薬溶液の滴下後に基板表面を覆うようにスライドさせること（例えば、特許文献５参照）も提案されている。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開平１１−３４２０００号公報
【特許文献３】特開２００３−２２７７９９号公報
【特許文献４】特開２００５−１７２７０６号公報
【特許文献５】特表２０００−５０８４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記した各種のマイクロアレイ基板でも、発光反応試薬溶液が揮発や表面張力等により展開不十分となったり、反応中に揮発してしまうという問題があった。
本発明は上記問題を解決するもので、基板表面へ供給する発光反応試薬溶液を十分に展開させ、かつ、揮発を防止することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために本発明は、被検物質が表面に固定化あるいは定着されており、その固定化あるいは定着された領域を囲む堰が配置された基板上に、前記被検物質を認識する分子を発光酵素で標識した標識分子を定着させ、次いで発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給して、前記発光酵素と発光基質との反応により生じる発光を測定する発光測定方法において、前記発光反応試薬溶液の供給に先立って、前記発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液を前記基板上に供給することを特徴とする。これによれば、発光反応試薬溶液は保護液の下層となって基板表面で容易に展開して被検物質と接触することとなり、それによる発光の測定は保護液を通して直ちに行うことができ、その間の発光反応試薬溶液の揮発は保護液によって防止することができる。
【０００８】
発光反応試薬溶液が水性溶液であり、保護液が水よりも比重が小さいことを特徴とする。保護液は、基板上に１ｍｍの液層厚となるように供給することが好ましい。保護液は、発光反応試薬溶液の成分に作用せず、沸点が１００℃以上であることが好ましい。
【０００９】
保護液としては、たとえば、流動パラフィン、イソパラフィン、シリコンオイル、水添ポリオレフィン、大豆メチルエステルから選ばれる１種あるいは複数種の混合物を使用することができる。
【００１０】
基板はマイクロアレイ基板であって基板表面に固定化された試薬で被検物質を捕捉しており、発光の測定は、被検物質の種別を判別するべくマイクロアレイ領域を撮像にて経時的に行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、発光反応試薬溶液は保護液の下層となって基板表面で容易に展開して被検物質と接触することとなり、それによる発光の測定は保護液を通して直ちに行うことができ、その間の発光反応試薬溶液の揮発は保護液によって防止することができる。よって、発光反応速度が大きくなり、検出感度が大幅に向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
まず、図１から図３を参照して、従来より行われているマイクロアレイ解析方法の原理を説明する。被検物質を検出するために抗原−抗体反応を利用すること、またその抗体を発光酵素で標識して、抗原と結合した抗体を発光酵素の発光により検出することとする。
【００１３】
図１に示すように、マイクロアレイ基板１には、被検物質を検出するための第一の抗体を固定化した複数のスポット２０からなるマイクロアレイ１０が形成されている。スポット２０の数は理解しやすいように便宜的に示したもので、図示した個数に限られない。スポット２０の形成後の基板表面は、後続の処理で非特異的な反応が生じないように、牛血清アルブミン、スキムミルク、ゼラチン等の溶液を供給するブロッキング処理が施されている。
【００１４】
被検物質はたとえば、血液中の癌マーカーであり、その例に、α−フィトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ−II、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、γ―セミノプロテイン、免疫抑制酸性タンパク質などがある。第一の抗体は、対象とする被検物質と特異的に結合するものが選ばれる。つまり第一の抗体は、被検物質を基板表面の目的とするスポット２０に定着させるために利用されるものであり、各スポット２０は、第一の抗体が何を認識し結合するのかによって、何を検出するものであるかが特徴付けられることになる。
【００１５】
このマイクロアレイ基板１は、図示したように、マイクロアレイ１０領域を囲む枠状の堰３０（透視して図示している）を基板表面に載置し、適当な方法により圧着して使用される。
【００１６】
図２（ａ）はスポット２０部分を拡大して示している。２１は第一の抗体である。上述の基板１上、堰３０の内側に検体（液）を滴下して展開させると、図２（ｂ）に示すように、検体中に含まれる特定の被検物質２２は各スポットにおいて第一の抗体２１と特異的に結合し、この第一の抗体２１を介して基板表面に定着する。検体中の多くの夾雑物質は、第一の抗体２１に結合せず、基板表面より排除されることとなる。
【００１７】
その後に、基板１上、堰３０の内側に試薬溶液を滴下して展開させる。この試薬溶液は、第二の抗体２３を発光酵素２４で標識したものを含むものとする。第二の抗体２３としては、第一の抗体２１と同様に被検物質２２を特異的に認識し結合するが、被検物質２２における結合部位が第一の抗体２１とは異なるものが使用される。このことにより、図２（ｃ）に示すように、第二の抗体２３が被検物質２２に結合し、被検物質２２は第一の抗体２１と第二の抗体２３とでサンドイッチ状に挟まれた状態を呈する。
【００１８】
その後に発光基質を含んだ発光反応試薬溶液（図示せず）を基板表面に供給する。このことにより、第二の抗体２３を標識している発光酵素２４による発光が生じることとなる。この発光の強度は、スポット２０に定着している第二の抗体２３の量に依存し、この第二の抗体２３の量は被検物質２２の量に依存するため、発光強度を測定することによって被検物質２２の量が測定可能となる。図３に、発光反応試薬溶液を滴下した後の発光輝度の経時的変化を示す。
【００１９】
この方法では、基板１上に検体、試薬溶液、発光反応試薬溶液という異なる液滴を順次に滴下しているが、堰３０によって基板１上にリザーバーが形成され、必要な液滴がスポット２０上に貯留されるため、一連の処理を効率よく実施することができる。検体および各試薬溶液を滴下する各時に液滴が基板１外へ流れ出る危険を防止することもできる。しかしその一方で、検体および各試薬溶液は一般に水性溶液であり、また一連の処理は空気中で実施するため、滴下した液滴の基板１からの揮発を回避することは困難である。
【００２０】
以下、本発明に係る発光測定方法を用いるマイクロアレイ解析方法について図４を参照して説明する。基板１の構成および解析原理は従来と同様であるため図１および図２をも参照する。
【００２１】
図４（ａ）は上述の図２（ｃ）までの処理を終えた基板１を示す。検体中に含まれていた被検物質２２が第一の抗体２１を介してスポット２０部分に定着し、この被検物質２２に第二の抗体２３が結合していて、被検物質２２は第一の抗体２１と第二の抗体２３とでサンドイッチ状に挟まれた状態を呈している。
【００２２】
この基板１に対して、図４（ｂ）（ｃ）に示すように、保護液５０をノズル４０から吐出させて、堰３０の内側の基板表面全面に展開させる。この保護液５０は、無色透明で、水と混和せず、比重が水より軽く、沸点が１００℃以上で、且つ発光反応を実施する温度条件下で液状のものが使用される。
【００２３】
次に、図４（ｄ）（ｅ）に示すように、発光反応試薬溶液５１をノズル４１から吐出させて、堰３０内側で展開させる。このことにより、堰３０に囲まれた基板表面上に保護液５０と発光反応試薬溶液５１との２層の液層が形成され、発光反応試薬溶液５１の液層は比重差によって保護液５０の液層の下層となり、発光反応試薬溶液５１が基板表面に接触する。そして、発光反応試薬溶液５１中に含まれている発光基質が、第二の抗体２３を標識している発光酵素２４と反応し、発光酵素２４による発光が発生する。
【００２４】
この際に、発光反応試薬溶液５１は上述の比重差によって基板１の表面と保護液５０の間に流れ込むため、堰３０で囲った基板１の表面全面に容易に展開することとなる。そしてその発光反応試薬溶液５１の液層の上層に保護液５０の液層が存在することとなるため、発光酵素２４の至適反応温度が室温より高い場合、たとえば４０℃以上である場合も、発光反応試薬溶液５１の揮発が防止されて一定条件に維持することが可能となり、至適温度条件下での発光反応が実現可能となる。結果として、反応速度が大きくなり、マイクロアレイ１０の検出感度が大幅に向上する。
【００２５】
表１に、発光酵素として繁用される西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、牛小腸由来アルカリホスファターゼ、細菌由来アルカリホスファターゼの反応至適温度を示す。いずれも４０℃以上と比較的高い。至適温度４０℃の２つのペルオキシダーゼは入手源が異なる。
【００２６】
【表１】
このような温度条件では、上述した従来法であれば、発光反応を継続する間に発光反応試薬溶液の液体成分が揮発して枯渇し、発光試薬の濃度が当初と比べて高濃度となり、望ましい試薬濃度に対して乖離が生じるだけでなく、発光試薬が不溶化すること等の不都合が生じ、発光反応が途中で進行しなくなる。
【００２７】
以下、本発明に係る発光測定方法を用いるマイクロアレイ解析方法について、図５を参照して更に説明する。
図５（ａ）は、基板１を、堰３０を載置した状態で示すとともに、スポット２０部分を拡大して示している。各スポット２０には、濃度既知のヒトＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）２４を次の量ずつ固定化した：０．５ｆｍｏｌ，０．１ｆｍｏｌ、０．０５ｆｍｏｌ、０．０１ｆｍｏｌ、０．００５ｆｍｏｌ、０．００１ｆｍｏｌ、０．０００５ｆｍｏｌ。スポット２０の形成後の基板表面はブロッキング処理した。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、３％スキムミルクを含有するＴＢＳＴ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４））溶液を液層厚１ｍｍになるように滴下し、室温で３０分間、振盪した。
【００２８】
次に、図５（ｂ）に示すように、ビオチン２５で標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６をヒトＩｇＥ２６を介してスポット２０部分に定着させた。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、３.３μＭのビオチン２５を標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６を液層厚１ｍｍになるように滴下し、室温で６０分間、振盪し、その後にＴＢＳＴにて１分間の洗浄処理を３回繰り返して余剰の抗ヒトＩｇＥ抗体２６を除去した。
【００２９】
次に、図５（ｃ）に示すように、ビオチン２９で標識したルシフェラーゼ２８を結合させたストレプトアビジン２７を、先のビオチン２５標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６、ヒトＩｇＥ２６を介してスポット２０部分に定着させた。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、１ｎＭのストレプトアビジン２７とビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８の複合体（キッコーマン社製）を滴下し、室温で６０分間、振盪し、その後にＴＢＳＴにて１分間の洗浄処理を３回繰り返して、余剰のストレプトアビジン２７/ビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８の複合体を除去した。これにより、基板１のスポット２０上に、ビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８がヒトＩｇＥの量に応じて定着した状態となる。
【００３０】
ここで、ヒトＩｇＥ２４は被検物質として使用したもので、濃度が決定されているものを用いて、各スポット２０に固定化されるヒトＩｇＥ濃度（量）を既知とすることで、図２でいう「第一の抗体２１」を省略している。このように濃度既知のスポット２０を基板１上に幾つか設けることは、検体中に含まれる特定の被検物質濃度を決定するために利用されている。一方、抗ＩｇＥ抗体２６は図２でいう「第二の抗体２３」に相当する。抗ＩｇＥ抗体２６を標識したビオチン２５とビオチン標識したルシフェラーゼ２８のビオチン２９とがストレプトアビジン２７に結合していることにより、抗ヒトＩｇＥ抗体２６（つまり第二の抗体）はルシフェラーゼ２８（つまり発光酵素）で標識されている。ビオチン２５−ストレプトアビジン２７−ビオチン２９はリンカーの役割を担っている。かかる抗体と酵素とを結合させるリンカーは、図２には示していないが、ビオチン−ストレプトアビジンに限らず介在させることが一般的である。なおリンカーを介した結合は通常は共有結合であるが、ビオチン−ストレプトアビジンを介した結合は親和性結合である。
【００３１】
以上の処理を終えた各基板１を図６に示した発光測定装置に設置して発光測定を行った。発光測定装置は、暗箱となる本体６０と、発光測定可能なＣＣＤ６１と、本体６０内に配置されたレンズ群６２およびステージ６３を有している。
【００３２】
まず、堰３０を備えた基板１をステージ６３上にセットし、レンズ群６２により焦点を合わせた後、基板１の堰３０に囲まれた領域に、保護液５０としてのミネラルオイルを所望の液厚になるよう吐出させ、堰３０の内側の基板表面全面に展開させた（先の図４（ｂ）（ｃ）参照）。
【００３３】
次に、基板１の堰３０に囲まれた領域に、発光反応試薬溶液５１を液厚１ｍｍになるように滴下し、展開させ（先の図４（ｄ）（ｅ）参照）、ＣＣＤ６１を５分間露光させて輝度を測定した。発光反応試薬溶液５１の組成は、１ｍＭアデノシン５´―三リン酸、１ｍＭルシフェリン、１ｍＭ補酵素Ａ、０．１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３５ｍＭジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２５ｍＭトリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）とした。発光反応試薬溶液５１の液厚１ｍｍは、基板表面を覆う程度の厚みとして規定した。発光反応は、ルシフェラーゼの反応活性条件を同一にするため、２５℃で実施した。結果を図７および表２に示す。
【００３４】
図７は、ＩｇＥ量と発光輝度値との関係を示している。黒丸は、被検物質の展開後の基板表面に発光反応試薬溶液のみを展開したときの結果である。黒三角、黒四角、黒菱形はそれぞれ、基板表面にミネラルオイルを液厚１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍになるように展開した後に発光反応試薬溶液を展開したときの結果であり、いずれも発光反応試薬溶液層の上層にミネラルオイル層がある。
【００３５】
図７の結果によれば、ミネラルオイル層厚が２ｍｍまでは、発光反応試薬溶液のみ（ミネラルオイル層なし）の場合と同等の発光輝度値を示している。ミネラルオイル層厚を３ｍｍにすると、発光輝度値は５％程度低下している。これは、ミネラルオイル層の液厚の上昇に伴い、同層を透過する発光光量の減衰が生じたためであると考えられる。
【００３６】
表２は、基板表面のミネラルオイルの液厚が０ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍのときの変動係数（％）を示している。
【００３７】
【表２】
表２の結果によれば、若干のバラツキはあるものの、ミネラルオイル層厚が高くなるに従い、スポット毎の発光再現性の指標である変動係数値は良化傾向にあった。発光反応試薬溶液層の上層にミネラルオイル層を形成することで、液面乱れが防止されたためと考えられる。
【００３８】
以上のことから、発光反応により測定を実施するマイクロアレイにおいて、ミネラルオイルを保護液として用いると、液厚が大きくなるにしたがって発光再現性がよくなるが、その一方で発光輝度値が低下するので、基板表面を覆う程度の液厚１ｍｍでよいと言うことができる。
【００３９】
上記の実施形態では、保護液としてミネラルオイルを例示したが、これに限られるものではない。ミネラルオイル等の、無色透明で、水と混和せず、水よりも比重が小さく、水よりも揮発しにくいよう沸点が１００℃以上で、発光反応を実施する温度条件下で液体である保護液を予め展開させればよい。このことにより、後続の発光反応試薬溶液を該保護液と該基板との間に配置して基板表面への展開を容易にできると共に、３５℃以上のある程度の高温条件下で（ルシフェラーゼなどの酵素反応は通常２５℃、場合によって３７℃（ヒトの体温付近）の温度条件が設定される）、発光反応を実施する場合の発光反応試薬溶液の揮発を防止することができ、該基板に形成したスポットより生じる発光輝度の再現性を向上させることが可能となる。
【００４０】
ノズルからの吐出を容易にするためには保護液は絶対粘度が３０ｃＰ（センチポイズ）以下であることが好ましい。ノズルから液漏れし難い絶対粘度を有することも必要である。０．８〜２５ｃＰの物質がより好適である。本発明において使用可能な保護液を表３に例示する。
【００４１】
【表３】
表中に示した、ミネラルオイル（流動パラフィン）、イソパラフィン、ジメチルポリシロキサン、水添ポリオレフィン、大豆油メチルエステルは、水と混和せず、比重が水よりも小さい。ミネラルオイルは、流動パラフィン、ヌジョール、石油スピリット、ホワイトオイルなどと呼ばれているが、本発明においては同一に扱われる。これらの他に、ポリブテン、ポリイソブテン、シリコン等も使用可能である。
【００４２】
これらを混合して使用してもよく、粘度の異なる保護液を混合することにより所望の粘度を得ることが可能である。３０ｃＰを超える保護液でも、低粘度の保護液を混合することで３０ｃＰ以下として使用することが可能である。表中に示した保護液でも等級によっては３０ｃＰを超えるが、低粘度の等級のものと混合することで使用可能となる。
【００４３】
保護液の色相は、目視観察により決定も可能であるが、無色透明度の指標であるＳａｙｂｏｌｔ数で＋３０あるいはＨａｚｅｎ数で０〜１０の物質がより好ましい。
上述のマイクロアレイでの測定に限らず、マイクロプレート、メンブレン（膜）を利用した測定でも同様に実施可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の発光測定方法は、生体情報解析装置などに用いる測定方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の発光測定方法の対象であるマイクロアレイ基板の概念図
【図２】従来より行われているマイクロアレイ解析方法の原理を説明する概念図
【図３】図２の方法で得られる発光輝度と反応時間との相関図
【図４】本発明の発光測定方法の要部工程を示す概念図
【図５】本発明の発光測定方法における発光準備を示す概念図
【図６】本発明の発光測定方法に用いる発光測定装置の概念図
【図７】本発明の発光測定方法における保護液の液層厚の影響を示すグラフ
【符号の説明】
【００４６】
１ 基板
１０ マイクロアレイ
２０ スポット
２１ 第一の抗体
２２ 被検物質
２３ 第二の抗体
３０ 堰
４０ ノズル
５０ 保護液
５１ 発光反応試薬溶液
６０ 発光測定装置
６１ ＣＣＤ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面に固定化あるいは定着された被検物質を発光法で測定する発光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子、特に遺伝子の解析に、マイクロアレイが広く利用されている。マイクロアレイの作成はたとえば、１×３インチ大のガラス基板上に、検査対象の遺伝子（群）と相補性のある配列の一部を含んだ遺伝子溶液の液滴をナノリットル単位で点着してマイクロメートル単位の微小なスポットを形成し、このスポットされたアレイ上に試料の遺伝子断片を固定化する方法がとられている。スポットされたアレイに対して２種類の試料より抽出した遺伝子を混合し、それぞれの試料、すなわち、細胞、組織、あるいは個体中での遺伝子の発現比のプロファイリングを網羅的に解析することも可能となっている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
マイクロアレイの解析には、蛍光分光を利用した測定方法が採用されてきたが、蛍光分光法よりも高感度な発光法も採用されてきており、近年では、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）の性能向上に伴って、ＣＣＤを発光検出器としてシグナルの有無・増減を検出する方法がとられている。
【０００４】
ここで、蛍光分光法を利用する場合はマイクロアレイは湿潤した状態である必要はないのに対して、発光法を利用する場合は、発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給（滴下）して発光基質との反応により生じる発光量を測定するので、基板上の少なくとも測定領域は前記試薬溶液で湿潤した状態となる。
【０００５】
このため発光法を利用する測定では、発光反応試薬溶液の漏れを防止するために基板表面上に堰を設けるほか、基板を前記試薬溶液に浸漬させることが提案されている（例えば、特許文献３参照）。その他、前記試薬溶液の漏れおよび蒸発を防止するために、多孔性基板の表面に前記試薬溶液を送液できる流路を設け、当該基板をカートリッジに挟み込むこと（例えば、特許文献４参照）や、非多孔性の基板の表面に前記試薬溶液の展開を容易にする僅かな凹部を有するカバータイルを設け、このカバータイルを前記試薬溶液の滴下後に基板表面を覆うようにスライドさせること（例えば、特許文献５参照）も提案されている。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開平１１−３４２０００号公報
【特許文献３】特開２００３−２２７７９９号公報
【特許文献４】特開２００５−１７２７０６号公報
【特許文献５】特表２０００−５０８４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記した各種のマイクロアレイ基板でも、発光反応試薬溶液が揮発や表面張力等により展開不十分となったり、反応中に揮発してしまうという問題があった。
本発明は上記問題を解決するもので、基板表面へ供給する発光反応試薬溶液を十分に展開させ、かつ、揮発を防止することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために本発明は、被検物質が表面に固定化あるいは定着されており、その固定化あるいは定着された領域を囲む堰が配置された基板上に、前記被検物質を認識する分子を発光酵素で標識した標識分子を定着させ、次いで発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給して、前記発光酵素と発光基質との反応により生じる発光を測定する発光測定方法において、前記発光反応試薬溶液の供給に先立って、前記発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液を前記基板上に供給することを特徴とする。これによれば、発光反応試薬溶液は保護液の下層となって基板表面で容易に展開して被検物質と接触することとなり、それによる発光の測定は保護液を通して直ちに行うことができ、その間の発光反応試薬溶液の揮発は保護液によって防止することができる。
【０００８】
発光反応試薬溶液が水性溶液であり、保護液が水よりも比重が小さいことを特徴とする。保護液は、基板上に１ｍｍの液層厚となるように供給することが好ましい。保護液は、発光反応試薬溶液の成分に作用せず、沸点が１００℃以上であることが好ましい。
【０００９】
保護液としては、たとえば、流動パラフィン、イソパラフィン、シリコンオイル、水添ポリオレフィン、大豆メチルエステルから選ばれる１種あるいは複数種の混合物を使用することができる。
【００１０】
基板はマイクロアレイ基板であって基板表面に固定化された試薬で被検物質を捕捉しており、発光の測定は、被検物質の種別を判別するべくマイクロアレイ領域を撮像にて経時的に行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、発光反応試薬溶液は保護液の下層となって基板表面で容易に展開して被検物質と接触することとなり、それによる発光の測定は保護液を通して直ちに行うことができ、その間の発光反応試薬溶液の揮発は保護液によって防止することができる。よって、発光反応速度が大きくなり、検出感度が大幅に向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
まず、図１から図３を参照して、従来より行われているマイクロアレイ解析方法の原理を説明する。被検物質を検出するために抗原−抗体反応を利用すること、またその抗体を発光酵素で標識して、抗原と結合した抗体を発光酵素の発光により検出することとする。
【００１３】
図１に示すように、マイクロアレイ基板１には、被検物質を検出するための第一の抗体を固定化した複数のスポット２０からなるマイクロアレイ１０が形成されている。スポット２０の数は理解しやすいように便宜的に示したもので、図示した個数に限られない。スポット２０の形成後の基板表面は、後続の処理で非特異的な反応が生じないように、牛血清アルブミン、スキムミルク、ゼラチン等の溶液を供給するブロッキング処理が施されている。
【００１４】
被検物質はたとえば、血液中の癌マーカーであり、その例に、α−フィトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ−II、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、γ―セミノプロテイン、免疫抑制酸性タンパク質などがある。第一の抗体は、対象とする被検物質と特異的に結合するものが選ばれる。つまり第一の抗体は、被検物質を基板表面の目的とするスポット２０に定着させるために利用されるものであり、各スポット２０は、第一の抗体が何を認識し結合するのかによって、何を検出するものであるかが特徴付けられることになる。
【００１５】
このマイクロアレイ基板１は、図示したように、マイクロアレイ１０領域を囲む枠状の堰３０（透視して図示している）を基板表面に載置し、適当な方法により圧着して使用される。
【００１６】
図２（ａ）はスポット２０部分を拡大して示している。２１は第一の抗体である。上述の基板１上、堰３０の内側に検体（液）を滴下して展開させると、図２（ｂ）に示すように、検体中に含まれる特定の被検物質２２は各スポットにおいて第一の抗体２１と特異的に結合し、この第一の抗体２１を介して基板表面に定着する。検体中の多くの夾雑物質は、第一の抗体２１に結合せず、基板表面より排除されることとなる。
【００１７】
その後に、基板１上、堰３０の内側に試薬溶液を滴下して展開させる。この試薬溶液は、第二の抗体２３を発光酵素２４で標識したものを含むものとする。第二の抗体２３としては、第一の抗体２１と同様に被検物質２２を特異的に認識し結合するが、被検物質２２における結合部位が第一の抗体２１とは異なるものが使用される。このことにより、図２（ｃ）に示すように、第二の抗体２３が被検物質２２に結合し、被検物質２２は第一の抗体２１と第二の抗体２３とでサンドイッチ状に挟まれた状態を呈する。
【００１８】
その後に発光基質を含んだ発光反応試薬溶液（図示せず）を基板表面に供給する。このことにより、第二の抗体２３を標識している発光酵素２４による発光が生じることとなる。この発光の強度は、スポット２０に定着している第二の抗体２３の量に依存し、この第二の抗体２３の量は被検物質２２の量に依存するため、発光強度を測定することによって被検物質２２の量が測定可能となる。図３に、発光反応試薬溶液を滴下した後の発光輝度の経時的変化を示す。
【００１９】
この方法では、基板１上に検体、試薬溶液、発光反応試薬溶液という異なる液滴を順次に滴下しているが、堰３０によって基板１上にリザーバーが形成され、必要な液滴がスポット２０上に貯留されるため、一連の処理を効率よく実施することができる。検体および各試薬溶液を滴下する各時に液滴が基板１外へ流れ出る危険を防止することもできる。しかしその一方で、検体および各試薬溶液は一般に水性溶液であり、また一連の処理は空気中で実施するため、滴下した液滴の基板１からの揮発を回避することは困難である。
【００２０】
以下、本発明に係る発光測定方法を用いるマイクロアレイ解析方法について図４を参照して説明する。基板１の構成および解析原理は従来と同様であるため図１および図２をも参照する。
【００２１】
図４（ａ）は上述の図２（ｃ）までの処理を終えた基板１を示す。検体中に含まれていた被検物質２２が第一の抗体２１を介してスポット２０部分に定着し、この被検物質２２に第二の抗体２３が結合していて、被検物質２２は第一の抗体２１と第二の抗体２３とでサンドイッチ状に挟まれた状態を呈している。
【００２２】
この基板１に対して、図４（ｂ）（ｃ）に示すように、保護液５０をノズル４０から吐出させて、堰３０の内側の基板表面全面に展開させる。この保護液５０は、無色透明で、水と混和せず、比重が水より軽く、沸点が１００℃以上で、且つ発光反応を実施する温度条件下で液状のものが使用される。
【００２３】
次に、図４（ｄ）（ｅ）に示すように、発光反応試薬溶液５１をノズル４１から吐出させて、堰３０内側で展開させる。このことにより、堰３０に囲まれた基板表面上に保護液５０と発光反応試薬溶液５１との２層の液層が形成され、発光反応試薬溶液５１の液層は比重差によって保護液５０の液層の下層となり、発光反応試薬溶液５１が基板表面に接触する。そして、発光反応試薬溶液５１中に含まれている発光基質が、第二の抗体２３を標識している発光酵素２４と反応し、発光酵素２４による発光が発生する。
【００２４】
この際に、発光反応試薬溶液５１は上述の比重差によって基板１の表面と保護液５０の間に流れ込むため、堰３０で囲った基板１の表面全面に容易に展開することとなる。そしてその発光反応試薬溶液５１の液層の上層に保護液５０の液層が存在することとなるため、発光酵素２４の至適反応温度が室温より高い場合、たとえば４０℃以上である場合も、発光反応試薬溶液５１の揮発が防止されて一定条件に維持することが可能となり、至適温度条件下での発光反応が実現可能となる。結果として、反応速度が大きくなり、マイクロアレイ１０の検出感度が大幅に向上する。
【００２５】
表１に、発光酵素として繁用される西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、牛小腸由来アルカリホスファターゼ、細菌由来アルカリホスファターゼの反応至適温度を示す。いずれも４０℃以上と比較的高い。至適温度４０℃の２つのペルオキシダーゼは入手源が異なる。
【００２６】
【表１】
このような温度条件では、上述した従来法であれば、発光反応を継続する間に発光反応試薬溶液の液体成分が揮発して枯渇し、発光試薬の濃度が当初と比べて高濃度となり、望ましい試薬濃度に対して乖離が生じるだけでなく、発光試薬が不溶化すること等の不都合が生じ、発光反応が途中で進行しなくなる。
【００２７】
以下、本発明に係る発光測定方法を用いるマイクロアレイ解析方法について、図５を参照して更に説明する。
図５（ａ）は、基板１を、堰３０を載置した状態で示すとともに、スポット２０部分を拡大して示している。各スポット２０には、濃度既知のヒトＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）２４を次の量ずつ固定化した：０．５ｆｍｏｌ，０．１ｆｍｏｌ、０．０５ｆｍｏｌ、０．０１ｆｍｏｌ、０．００５ｆｍｏｌ、０．００１ｆｍｏｌ、０．０００５ｆｍｏｌ。スポット２０の形成後の基板表面はブロッキング処理した。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、３％スキムミルクを含有するＴＢＳＴ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４））溶液を液層厚１ｍｍになるように滴下し、室温で３０分間、振盪した。
【００２８】
次に、図５（ｂ）に示すように、ビオチン２５で標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６をヒトＩｇＥ２６を介してスポット２０部分に定着させた。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、３.３μＭのビオチン２５を標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６を液層厚１ｍｍになるように滴下し、室温で６０分間、振盪し、その後にＴＢＳＴにて１分間の洗浄処理を３回繰り返して余剰の抗ヒトＩｇＥ抗体２６を除去した。
【００２９】
次に、図５（ｃ）に示すように、ビオチン２９で標識したルシフェラーゼ２８を結合させたストレプトアビジン２７を、先のビオチン２５標識した抗ヒトＩｇＥ抗体２６、ヒトＩｇＥ２６を介してスポット２０部分に定着させた。この際には、堰３０で囲まれた基板表面に、１ｎＭのストレプトアビジン２７とビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８の複合体（キッコーマン社製）を滴下し、室温で６０分間、振盪し、その後にＴＢＳＴにて１分間の洗浄処理を３回繰り返して、余剰のストレプトアビジン２７/ビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８の複合体を除去した。これにより、基板１のスポット２０上に、ビオチン２９標識したルシフェラーゼ２８がヒトＩｇＥの量に応じて定着した状態となる。
【００３０】
ここで、ヒトＩｇＥ２４は被検物質として使用したもので、濃度が決定されているものを用いて、各スポット２０に固定化されるヒトＩｇＥ濃度（量）を既知とすることで、図２でいう「第一の抗体２１」を省略している。このように濃度既知のスポット２０を基板１上に幾つか設けることは、検体中に含まれる特定の被検物質濃度を決定するために利用されている。一方、抗ＩｇＥ抗体２６は図２でいう「第二の抗体２３」に相当する。抗ＩｇＥ抗体２６を標識したビオチン２５とビオチン標識したルシフェラーゼ２８のビオチン２９とがストレプトアビジン２７に結合していることにより、抗ヒトＩｇＥ抗体２６（つまり第二の抗体）はルシフェラーゼ２８（つまり発光酵素）で標識されている。ビオチン２５−ストレプトアビジン２７−ビオチン２９はリンカーの役割を担っている。かかる抗体と酵素とを結合させるリンカーは、図２には示していないが、ビオチン−ストレプトアビジンに限らず介在させることが一般的である。なおリンカーを介した結合は通常は共有結合であるが、ビオチン−ストレプトアビジンを介した結合は親和性結合である。
【００３１】
以上の処理を終えた各基板１を図６に示した発光測定装置に設置して発光測定を行った。発光測定装置は、暗箱となる本体６０と、発光測定可能なＣＣＤ６１と、本体６０内に配置されたレンズ群６２およびステージ６３を有している。
【００３２】
まず、堰３０を備えた基板１をステージ６３上にセットし、レンズ群６２により焦点を合わせた後、基板１の堰３０に囲まれた領域に、保護液５０としてのミネラルオイルを所望の液厚になるよう吐出させ、堰３０の内側の基板表面全面に展開させた（先の図４（ｂ）（ｃ）参照）。
【００３３】
次に、基板１の堰３０に囲まれた領域に、発光反応試薬溶液５１を液厚１ｍｍになるように滴下し、展開させ（先の図４（ｄ）（ｅ）参照）、ＣＣＤ６１を５分間露光させて輝度を測定した。発光反応試薬溶液５１の組成は、１ｍＭアデノシン５´―三リン酸、１ｍＭルシフェリン、１ｍＭ補酵素Ａ、０．１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３５ｍＭジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２５ｍＭトリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）とした。発光反応試薬溶液５１の液厚１ｍｍは、基板表面を覆う程度の厚みとして規定した。発光反応は、ルシフェラーゼの反応活性条件を同一にするため、２５℃で実施した。結果を図７および表２に示す。
【００３４】
図７は、ＩｇＥ量と発光輝度値との関係を示している。黒丸は、被検物質の展開後の基板表面に発光反応試薬溶液のみを展開したときの結果である。黒三角、黒四角、黒菱形はそれぞれ、基板表面にミネラルオイルを液厚１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍになるように展開した後に発光反応試薬溶液を展開したときの結果であり、いずれも発光反応試薬溶液層の上層にミネラルオイル層がある。
【００３５】
図７の結果によれば、ミネラルオイル層厚が２ｍｍまでは、発光反応試薬溶液のみ（ミネラルオイル層なし）の場合と同等の発光輝度値を示している。ミネラルオイル層厚を３ｍｍにすると、発光輝度値は５％程度低下している。これは、ミネラルオイル層の液厚の上昇に伴い、同層を透過する発光光量の減衰が生じたためであると考えられる。
【００３６】
表２は、基板表面のミネラルオイルの液厚が０ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍのときの変動係数（％）を示している。
【００３７】
【表２】
表２の結果によれば、若干のバラツキはあるものの、ミネラルオイル層厚が高くなるに従い、スポット毎の発光再現性の指標である変動係数値は良化傾向にあった。発光反応試薬溶液層の上層にミネラルオイル層を形成することで、液面乱れが防止されたためと考えられる。
【００３８】
以上のことから、発光反応により測定を実施するマイクロアレイにおいて、ミネラルオイルを保護液として用いると、液厚が大きくなるにしたがって発光再現性がよくなるが、その一方で発光輝度値が低下するので、基板表面を覆う程度の液厚１ｍｍでよいと言うことができる。
【００３９】
上記の実施形態では、保護液としてミネラルオイルを例示したが、これに限られるものではない。ミネラルオイル等の、無色透明で、水と混和せず、水よりも比重が小さく、水よりも揮発しにくいよう沸点が１００℃以上で、発光反応を実施する温度条件下で液体である保護液を予め展開させればよい。このことにより、後続の発光反応試薬溶液を該保護液と該基板との間に配置して基板表面への展開を容易にできると共に、３５℃以上のある程度の高温条件下で（ルシフェラーゼなどの酵素反応は通常２５℃、場合によって３７℃（ヒトの体温付近）の温度条件が設定される）、発光反応を実施する場合の発光反応試薬溶液の揮発を防止することができ、該基板に形成したスポットより生じる発光輝度の再現性を向上させることが可能となる。
【００４０】
ノズルからの吐出を容易にするためには保護液は絶対粘度が３０ｃＰ（センチポイズ）以下であることが好ましい。ノズルから液漏れし難い絶対粘度を有することも必要である。０．８〜２５ｃＰの物質がより好適である。本発明において使用可能な保護液を表３に例示する。
【００４１】
【表３】
表中に示した、ミネラルオイル（流動パラフィン）、イソパラフィン、ジメチルポリシロキサン、水添ポリオレフィン、大豆油メチルエステルは、水と混和せず、比重が水よりも小さい。ミネラルオイルは、流動パラフィン、ヌジョール、石油スピリット、ホワイトオイルなどと呼ばれているが、本発明においては同一に扱われる。これらの他に、ポリブテン、ポリイソブテン、シリコン等も使用可能である。
【００４２】
これらを混合して使用してもよく、粘度の異なる保護液を混合することにより所望の粘度を得ることが可能である。３０ｃＰを超える保護液でも、低粘度の保護液を混合することで３０ｃＰ以下として使用することが可能である。表中に示した保護液でも等級によっては３０ｃＰを超えるが、低粘度の等級のものと混合することで使用可能となる。
【００４３】
保護液の色相は、目視観察により決定も可能であるが、無色透明度の指標であるＳａｙｂｏｌｔ数で＋３０あるいはＨａｚｅｎ数で０〜１０の物質がより好ましい。
上述のマイクロアレイでの測定に限らず、マイクロプレート、メンブレン（膜）を利用した測定でも同様に実施可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の発光測定方法は、生体情報解析装置などに用いる測定方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の発光測定方法の対象であるマイクロアレイ基板の概念図
【図２】従来より行われているマイクロアレイ解析方法の原理を説明する概念図
【図３】図２の方法で得られる発光輝度と反応時間との相関図
【図４】本発明の発光測定方法の要部工程を示す概念図
【図５】本発明の発光測定方法における発光準備を示す概念図
【図６】本発明の発光測定方法に用いる発光測定装置の概念図
【図７】本発明の発光測定方法における保護液の液層厚の影響を示すグラフ
【符号の説明】
【００４６】
１ 基板
１０ マイクロアレイ
２０ スポット
２１ 第一の抗体
２２ 被検物質
２３ 第二の抗体
３０ 堰
４０ ノズル
５０ 保護液
５１ 発光反応試薬溶液
６０ 発光測定装置
６１ ＣＣＤ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が表面に固定化あるいは定着されており、その固定化あるいは定着された領域を囲む堰が配置された基板上に、前記被検物質を認識する分子を発光酵素で標識した標識分子を定着させ、次いで発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給して、前記発光酵素と発光基質との反応により生じる発光を測定する発光測定方法において、
前記発光反応試薬溶液の供給に先立って、前記発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液を前記基板上に供給することを特徴とする発光測定方法。
【請求項２】
発光反応試薬溶液は水性溶液であり、保護液は水よりも比重が小さいことを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項３】
保護液は、基板上に１ｍｍの液層厚となるように供給することを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項４】
保護液は、発光反応試薬溶液の成分に作用せず、沸点が１００℃以上であることを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項５】
保護液は、流動パラフィン、イソパラフィン、シリコンオイル、水添ポリオレフィン、大豆メチルエステルから選ばれる１種あるいは複数種の混合物であることを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項６】
基板はマイクロアレイ基板であって基板表面に固定化された試薬で被検物質を捕捉しており、発光の測定は、被検物質の種別を判別するべくマイクロアレイ領域を撮像にて経時的に行うことを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項１】
被検物質が表面に固定化あるいは定着されており、その固定化あるいは定着された領域を囲む堰が配置された基板上に、前記被検物質を認識する分子を発光酵素で標識した標識分子を定着させ、次いで発光基質を含んだ発光反応試薬溶液を供給して、前記発光酵素と発光基質との反応により生じる発光を測定する発光測定方法において、
前記発光反応試薬溶液の供給に先立って、前記発光反応試薬溶液と混和せず前記発光反応試薬溶液を覆う液層を形成する光透過性の保護液を前記基板上に供給することを特徴とする発光測定方法。
【請求項２】
発光反応試薬溶液は水性溶液であり、保護液は水よりも比重が小さいことを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項３】
保護液は、基板上に１ｍｍの液層厚となるように供給することを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項４】
保護液は、発光反応試薬溶液の成分に作用せず、沸点が１００℃以上であることを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項５】
保護液は、流動パラフィン、イソパラフィン、シリコンオイル、水添ポリオレフィン、大豆メチルエステルから選ばれる１種あるいは複数種の混合物であることを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【請求項６】
基板はマイクロアレイ基板であって基板表面に固定化された試薬で被検物質を捕捉しており、発光の測定は、被検物質の種別を判別するべくマイクロアレイ領域を撮像にて経時的に行うことを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−４３８８２（Ｐ２０１０−４３８８２Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０６４９２（Ｐ２００８−２０６４９２）
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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