発酵培養液からの不溶性酵素の回収及び不溶性酵素の製剤
本発明は、微生物細胞又は細胞残屑を除去せずに、微生物発酵培養液から不溶性酵素を回収し製剤するための方法を提供する。不溶性酵素を含む粒状及び液体の製剤もまた提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年６月９日に出願した米国仮出願第６１／０６０，０８７の優先権を主張し、その出願は参照により本明細書にその全体が取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、微生物細胞又は細胞残屑の存在下、微生物の発酵培養液から一以上の目的酵素を回収する方法、及び回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物から調製される固体及び液体製剤に関する。
【０００３】
背景技術
従来、液体又は固体製品形態で用いる酵素を工業用微生物発酵培養液から回収することは、一般的にいくつかの処理工程を含む。多くの従来的回収方法は、連続的に起こる４つの似たような工程、すなわち、
微生物培養液からの産生物ではない不溶性成分の除去、
生産物の単離、
精製、及び
ポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、
を含む。（例えば、Enzymes in Industry: Production and Applications (2007) Wolfgang Aehle, ed., 3rd edition, Wiley-VCH, p. 49; Bioseparations: Science and Engineering (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, Oxford University Press,p.32を参照願いたい。）例えば、細胞内に生産される酵素の回収及び製剤化は一般的に以下の処理工程を含む。それは、
（１）細胞溶解、
（２）前処理、
（３）細胞分離、
（４）濃縮、及び
（５）製剤化―（ａ）液体安定性のために化学薬品添加、その後、仕上げ用ろ過（ｐｏｌｉｓｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、又は（ｂ）固体安定性のための化学薬品添加、その後、乾燥
である。
【０００４】
細胞溶解は細胞壁を破壊することにより細胞から目的の酵素を放出する。細胞溶解は、細胞をリゾチームのような細胞壁を分解する酵素と接触させることにより、ｐＨ、温度、可溶化酸素の濃度、グルコース濃度、塩濃度、又は、自然発生的な可溶化を生じる他の添加剤の濃度の変化のような発酵環境の変化を導入することにより、均質化によるような細胞壁の機械的破壊により、又は、これらの方法の組み合わせにより、達成されてよい。細胞外に発現される（培養培地に分泌される）場合、細胞溶解は任意である。（Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul and B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc.,pp.1-27を参照願いたい。）
【０００５】
細胞溶解後、細胞分離工程を用いて目的の酵素を含む清澄溶液を生成する。一般的に、細胞分離は遠心及び／又はろ過を含み、発酵の間及び／又は発酵後、及び／又は細胞溶解の結果として生成する細胞残屑及び任意の不溶性物質を除去する。適切な遠心方法はディスクスタック（disk stack）又はデンカンター型遠心分離機を含む。適切なろ過方法はロータリー型真空ろ過、プレート‐フレームろ過プレス装置を通したろ過、又は精密ろ過膜を通したろ過を含む。
【０００６】
遠心分離を用いる細胞分離は、しばしば清澄度及び処理能力の間の妥協で得られる。高い処理能力の遠心分離を用い、それから高い処理能力のろ過を通してその後の処理工程を妨害するのに十分な量の微量のけん濁固形物を除去することは、一般的なやり方である。今日実施される多くのろ過方法は、効率的な分離を達成するために、珪藻土又はその類似物のような加工助剤及び炭素（ＰＣＴ出願WO01/87468）の使用を必要とする。珪藻土は、ろ過工程の処理能力及びろ過物の清澄性を改善する。
【０００７】
前処理工程は、一般的に目的酵素を含む液体から細胞又は細胞残屑の物理的分離を行う前に用いる。そのような工程を用いずに細胞残屑を分離することは、小さな粒子サイズの残屑及び溶解発酵培養液の粘性のある性質によって、一般的にコスト高であり時間もかかる。しばしば、前処理は溶解又は非溶解培養液への凝集剤の導入を含む。高分子電解質は発酵培養液から細菌細胞を除去する場合において細胞凝集を増強する方法として多くの注目を集めた。Baran (1988) Colloids Surf. 31:259-264; Bautista他、(1986) Biotechnol. Lett. 8:315-318; Chen and Berg (1993) Chem. Eng. Sci. 48:1775-1784; Cumming他、(1996) Biotechnol. Tech. 4:55-60; Hustedt及びTheelen (1989) DeChema Biotechnology Conferences − VCH Veragsgesselschaft 3:1071-1075; Ramsden他、(1998) Biotechnol. Tech. 12:599-603; Shan他、(1996) J. Biotechnol. 49:173-178。
【０００８】
凝集は目的酵素を含む液体部分から細胞残屑を除去する働きをする。いくつかの通常用いる凝集剤は、ポリエチレンイミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、及びメタクリロイルオキシエチル トリメチルアンモニウムクロライド‐アクリルアミドコポリマーを含む。細胞残屑の凝集は、電荷に基づく現象であり、有効性のために低イオン強度を必要とする。結果として、水による発酵培養液の希釈は、細胞残屑を凝集することが一般的に必要となる。
【０００９】
所望の最終産物濃度及び純度次第で、細胞分離工程からの目的酵素を含む上澄み溶液は、製品を製造する製剤化のための条件にあわせてよい。しかしながら、製剤化前の酵素の濃度を増加するために度々さらなる処理が必要となる。濃縮は、典型的には、熱安定性酵素のための限外ろ過又は蒸留により達成される脱水工程を含む。濃縮のための他の方法は、沈殿、結晶化、及びクロマトグラフィーを含む。（ＰＣＴ出願WO 91/09941を参照願いたい。）これらは、費用が高いので、工業的酵素回収において一般的なやり方ではない。
【００１０】
上述のように、従来の酵素の回収及び製剤化は、複数の工程を含む。製造方法に追加される各工程は、最終の生産量を減少させ、エネルギー、時間、及び労力の点でコストがかかる。
【００１１】
発現方法の進歩により、発酵培養液中に比較的高い酵素濃度（例えば、１０から１００ｇ／ｌ）を得ることができるようになった。ある場合、発現レベルは、目的酵素の溶解限度を超え、酵素は、発酵の終わりに沈殿状態又は結晶状態で存在する。上述のように、従来の回収工程を発酵培養液から酵素を回収するために用いる場合、酵素沈殿物は、細胞分離工程の間、不溶性細胞残屑及び他の不溶性物質を伴って同時に除かれるであろう。結果として、回収収量は低くなるであろう。この問題を解決するひとつの案は、回収工程の後すぐにポリオールを過飽和酵素溶液に添加し、その沈殿を防ぐことを含む。（欧州特許第EP1417301）しかしながら、そのような方法は、さらなる材料コストを必要とし、回収方法のために余分な工程を追加する。ポリオールの添加をせずに不溶性酵素を回収する方法が有利であろう。
【００１２】
酵素含有顆粒は、洗剤、織物処理、食品（例えば、ベーキング）、動物飼料、及び燃料エタノール産業を含むいくつかの産業において製品へ取り込まれる。そのような顆粒は、流動床スプレーコーティング、高せん断造粒、押し出し、球形化、顆粒化、及びスプレー乾燥を含む多くの技術により調製されてよい。
【００１３】
従来、そのような酵素含有顆粒は、顆粒へ取り込まれる前に溶解性形態である酵素を含み、微生物宿主中に発現する場合、酵素は、細胞溶解から生成される微生物細胞及び／又は細胞残屑を除くために少なくとも部分的に精製される。
【００１４】
不溶性酵素が、微生物培養液中に存在する場合、回収前に可溶化が必要となる。いくつかの場合、これはｐＨ及び／又は温度の変化により又は単塩の添加により容易に達成できる。他の場合、ポリオール又は糖の添加が必要となる。可溶化の後で、細胞分離を行うことができる。得られる上澄みストリームは、一般的にとても薄くて製剤化のために用いることができない。一般的に、限外ろ過を濃縮工程に使用する。添加される糖は、限外ろ過膜を自由に通過し、破棄用ストリームになる。得られる濃縮物を一般的に液体製品へ製剤化し得る。しかしながら、必ずしも顆粒化に適応するわけではない。結果として、顆粒化前に糖の除去が必要となる。これは、透析ろ過により達成でき、それにより、さらに多くの廃棄物が発生する。このアプローチの問題点は、プロセス工程及び破棄物の故に、培養液及び固体産物の重大なコスト上昇が生じることである。本発明はそのような培養液から経済的に産物を生成する方法の代替的方法である。
【００１５】
酵素が不溶性状態であり細胞及び／又は不溶性細胞成分が除去されないような顆粒状酵素製剤の必要性がある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、不溶性酵素の回収及び製剤に関する方法、及び本明細書に記載のように回収された及び製剤化された不溶性酵素を含む組成物を提供する。
【００１７】
ある態様においては、本発明の方法は、
微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収すること、
それにより回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成すること、
ここで、酵素の少なくとも一部が、微生物培養液に不溶性であることを特徴とすることを含む、
微生物細胞及び／又は微生物細胞からの細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法を提供する。ある態様においては、方法は、
（ａ）微生物細胞及び酵素を含む微生物培養液を提供する工程、ここで、少なくとも一部の酵素が微生物培養液中で不溶性であるようにする工程、及び
（ｂ）微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収し、それにより回収された不溶性酵素を含む組成物を生成する工程、ここで、組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含むようにする工程、
を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素は、酵素的に活性である（言い換えると、酵素が、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００１８】
幾つかの実施態様においては、微生物培養液が、
酵素を微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液とブレンドすることであって、酵素が微生物細胞により生成されず、及び酵素が微生物培養液に不溶性であるか、酵素が微生物培養液に溶解性であるが沈殿剤の添加により、酵素の少なくとも一部が不溶性なることをさらに含むこと、
微生物細胞により発現された溶解性酵素を含む微生物培養液に沈殿剤を添加し、それにより酵素の少なくとも一部が不溶性にさせられること、及び
微生物細胞中の酵素を発酵培地に発現し、ここに酵素の少なくとも一部が発酵培地に不溶性であるようにすること、
から選択される方法により生成される。
【００１９】
幾つかの実施態様においては、回収操作が、培養液調整、細胞溶解、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、及び固液分離から選択される少なくとも一つの回収操作を含む。幾つかの実施態様においては、回収は、任意の順序で実施される、培養液調整、細胞溶解、均質化、透析ろ過及び固液分離から選択される二以上の回収操作を実施することを含む。
【００２０】
幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の回収は、微生物培養液の液相の少なくとも一部を除去すること含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の液相の少なくとも一部の除去は、微生物培養液を濃縮することを含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の濃縮は、限外ろか、精密ろ過、逆浸透、及びナノろ過から選択される膜ろ過法を含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の液相の少なくとも一部の除去、例えば、微生物培養液の濃縮は、回転式ドラム型真空ろ過、プレート‐フレームろ過、ベルト型ろ過、遠心分離、サイクロン分離、デカンテーション、及び、蒸留から選択される方法を含む。
【００２１】
幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の回収は、透析ろ過を含む。
【００２２】
幾つかの実施態様においては、微生物培養液は、酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中に酵素を発現する微生物細胞を増殖することにより生成され、ここで、酵素は、増殖条件下にて不溶性である。他の実施態様においては、微生物培養液は、酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中に酵素を発現する微生物細胞を増殖することにより生成され、ここで、酵素は、増殖条件下にて溶解性であり、酵素を回収する前に沈殿剤を添加し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性となる。幾つかの実施態様においては、沈殿剤はｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくとも一つの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、高分子電解質の添加、及びそれらの組み合わせから選択される。ある実施態様においては、不溶性酵素は、沈殿剤を溶解性酵素を含む微生物培養液に添加することより酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性となって生成される。ここで、沈殿剤がｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくともひとつの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、及び高分子電解質の添加、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００２３】
幾つかの実施態様においては、回収される不溶性酵素を含む組成物は、無傷の微生物細胞を含む。ある実施態様においては、無傷の微生物細胞は生きている微生物細胞である。別の実施態様においては、無傷の微生物細胞は死んでいる微生物細胞である。他の実施態様においては、回収される不溶性酵素を含む組成物は、溶解した微生物細胞を含む。
【００２４】
微生物培養液中で発現される酵素が不溶性である、幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素の回収前又は後に、微生物細胞膜を破壊し、微生物細胞溶解物を生成することを含む。微生物培養液中で発現される酵素が溶解性である、他の実施態様においては、方法は、沈殿される酵素の回収の前に、沈殿剤の添加の前又は後に、微生物細胞膜を破壊することを含む。
【００２５】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液は、無傷の微生物細胞の微生物細胞膜を破壊することにより生成される微生物細胞溶解物を含む。
【００２６】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、微生物細胞溶解を生じることができる酵素と微生物細胞を接触することを含む。ある実施態様においては、微生物細胞溶解を生じることができる酵素は、リゾチーム酵素である。他の実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、均質化のような機械的細胞膜破壊方法を含む。幾つかの実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、例えば、均質化、高せん断混合（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｍｉｘｉｎｇ）、押出圧力、及び高せん断ポンピング（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｐｕｍｐｉｎｇ）から選択される機械的せん断方法を含む。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成することをさらに含む。
【００２７】
幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を透析ろ過することをさらに含む。幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を均質化する及び透析ろ過することをさらに含む。
【００２８】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞は、細菌細胞である。幾つかの実施態様においては、細菌細胞は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。幾つかの実施態様においては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。
【００２９】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞は、真菌細胞である。幾つかの実施態様においては、真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。幾つかの実施態様においては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞は、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。
【００３０】
幾つかの実施態様においては、酵素の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％が微生物培養液中に不溶性である。
【００３１】
回収方法の幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の純度が、少なくとも約１０％増加している。
【００３２】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載のように、微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法に従って生成される組成物を提供し、ここで、組成物は、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む。ある実施態様においては、組成物は、少なくとも一つの製剤成分をさらに含む。
【００３３】
別の態様においては、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書に記載のように、微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法に従って生成される、微生物不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）酵素が少なくとも部分的に溶解するように、酵素を溶解する物質の一以上を添加することにより及び／又は物理的条件を変化することにより、不溶性酵素の少なくとも一部を溶解し、それにより、溶解性酵素溶液を生成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で調製された溶液から固形物を除去し、それにより、清澄液体酵素溶液を生成する工程
を含む清澄液体酵素溶液を生成する方法を提供する。
【００３４】
別の態様においては、本発明は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有顆粒を生成することを含む、酵素含有顆粒を作成する方法を提供する。ある実施態様においては、方法は、
（ａ）不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を提供する工程、及び
（ｂ）不溶性酵素を含む酵素含有顆粒を生成する工程を含む。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載のいずれかの方法に従って生成される。ある実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、ここで、酵素の少なくとも一部は、微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００３５】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、トップスプレー流動床方法で生成される。幾つかの実施態様においては、酵素含有顆粒は、トップスプレー流動床方法、ボトムスプレーウルスターコーター（Ｗｕｒｓｔｅｒ ｃｏａｔｅｒ）方法、高せん断造粒（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、押し出し成形、及びパンコーティングから選択される造粒方法により生成される。
【００３６】
ある実施態様においては、方法は、トップスプレー流動床装置において、コアの上に不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有層をコーティングすることを含む。方法は、任意に、コアと酵素含有層の間に塩層をコーティングすることを含む。ある実施態様においては、方法は、酵素含有層の上にバリア塩を含む層をコーティングすることをさらに含む。ある実施態様においては、方法は、バリア塩層の上にポリマー及び／又は色素を含む外側のコーティング層をコーティングすることをさらに含む。
【００３７】
ある実施態様においては、方法は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む酵素含有コアの上にバリア塩層及び／又は一以上のコーティング層をコーティングすることを含む。ある実施態様においては、酵素含有コアは、トップスプレー流動床装置により生成される。ある実施態様においては、酵素含有コアは、高せん断造粒により生成される。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、
コア、
任意に、コアの上にコーティングされる塩層、及び
コアの上にコーティングされる酵素含有層を含み、ここで、酵素含有層が、コア又は塩層の上にコーティングされ、酵素含有層が、本明細書に記載のいずれかの方法に従って生成される不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有層である
ことを含む酵素含有顆粒を提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００３９】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、酵素含有層の上にコーティングされるバリア塩層をさらに含む。ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、バリア塩層の上にコーティングされる外側のコーティング層をさらに含み、ここで外側のコーティング層がポリマー及び／又は色素を含む。
【００４０】
別の実施態様においては、本発明は、酵素含有コア及びバリア塩層及び／又はコアを囲んでいる一以上のコーティング層を含む酵素含有顆粒を提供し、ここで、コアが不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物含むことを特徴とする。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００４１】
ある実施態様においては、酵素含有コアは、トップスプレー流動床装置により生成される。ある実施態様においては、酵素含有コアは、高せん断造粒により生成される。
【００４２】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載の任意の酵素含有顆粒を含む組成物を提供する。ある実施態様においては、その組成物は、洗剤組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、織物処理組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、動物飼料組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、食品組成物である。
【００４３】
別の態様においては、本発明は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有液体製剤を提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、液体製剤中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。幾つかの実施態様においては、酵素含有液体製剤は、ポリオール、塩、保存剤、界面活性剤、及び抗酸化剤から選択される製剤成分の一以上をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤はポリオールをさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、塩をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、保存剤をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、界面活性剤をさらに含む。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載の任意の方法に従って生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を液体中に懸濁することを含む酵素含有液体製剤を調製する方法を提供する。
【００４５】
別の態様においては、本発明は、
（ａ）本明細書に記載の任意の方法に従って生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、及び
（ｂ）組成物中に不溶性酵素を溶解する工程
を含む酵素含有液体製剤を調製する方法を提供する。ある実施態様においては、方法は、工程（ｂ）の後及び工程（ｃ）の前に微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去する工程をさらに含み、それにより清澄液体製剤を生成する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１３に記載のように、洗剤中に保存後、実施例４に記載のように調製された、酵素含有顆粒の洗浄使用活性性能を示す。
【図２】図２は、洗剤中に保存後、実施例１、２、４、及び６において調整した顆粒の酵素的安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
本発明は、培養液から微生物細胞又は溶解された不溶性細胞残屑を除去せずに微生物発酵培溶液から不溶性酵素を回収し、製剤化するための方法を提供する。また、本発明は、本明細書に記載の方法に従って回収された、例えば、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む顆粒及び液体製剤を提供する。
【００４８】
特段の断りがない限り、本発明の実施は、当業者の知っている、従来の分子生物学（組み換え方法を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学、の従来の方法を使用する。そのような方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook他、1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel他、eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis他、eds., 1994); and Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990)の文献に十分説明される。
【００４９】
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。本明細書に記載されているものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施及び実験に用いられ得る。
【００５０】
数値域は範囲を限定する数値を含む。
【００５１】
他に示していない限り、それぞれ、核酸は５´から３´の方向において左から右へ記載され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボシキル基の方向において左から右へ記載される。
【００５２】
定義
本明細書にて用いる用語、「ポリヌクレオチド」は、任意の長さ及び任意の３次構造及び１本鎖又は複数鎖（例えば、１本鎖、２本鎖、三重螺旋、等）のヌクレオチドの重合体をいい、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの類似物又は修飾された形態を含み、修飾されたヌクレオチド又は塩基又はその類似物を含む。遺伝子コードは、縮重するので、２以上のコドンを、特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。使用条件下にて、ポリヌクレオチドが所望の機能性を維持する限り、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似物の任意のタイプを用いてよく、ヌクレアーゼ耐性（デオキシ、２´‐Ｏ‐‐Ｍｅ、ホスホロチオネート等）を増加する修飾を含む。また、ラベルを欠失又は捕捉の目的のために含んでよく、例えば、放射能又は非放射能ラベル又は例えば、ビオチンのような、アンカーを含む。また、用語ポリヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。ポリヌクレオチドは自然に発生し又は非自然に発生してよい。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は本明細書にて互換的に用いる。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、又は両方、及び／又は修飾された形態及び／又はそれらの類似物を含んでよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により割りこまれてよい。一以上のホスホジエステル結合は代替的な結合グループにより置換されてよい。これらの代替的結合グループは、次の態様を含むが、これらに限定されない。それは、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ(「チオエート（ｔｈｉｏａｔｅ）」)、Ｐ（Ｓ）Ｓ(「ジチオエート（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）」)、（Ｏ）ＮＲ２(「アミデート（ａｍｉｄａｔｅ）」)、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２「ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」)、により置換される。ここで、各Ｒ又はＲ’は独立的にＨ又は置換又は非置換のアルキル（１−２０Ｃ）であって、任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はアラルジルを含む。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同定される必要はない。ポリヌクレオチドは直鎖又は環状でよく、又は直鎖及び環状の一部の組み合わせを含む。
【００５３】
本明細書で用いる「ポリペプチド」は、アミノ酸を含む任意の組成物及び当業者によりタンパク質と認識される任意の組成物をいう。従来のアミノ酸残基のための１文字又は３文字コードは本明細書にて用いる。任意の長さのアミノ酸ポリマーをいうために、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は本明細書にて互換可能に用いられる。ポリマーは直鎖又は分岐鎖でよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸により割り込まれてよい。また、その用語は、自然に修飾されたアミノ酸ポリマー又は介在により修飾されたアミノ酸ポリマーを含み、ここで介在は、例えば、ジスフィルド結合形成、グリコシル化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化、又はラベル成分を結合するような任意の他の操作又は修飾である。また、その定義の中には例えば、アミノ酸の一以上の類似物（例えば、非天然アミノ酸等を含む）及び周知の他の修飾を含むポリペプチドを含む。
【００５４】
「ベクター」は、一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
【００５５】
本明細書にて用いる用語、「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される方法をいう。その方法は、転写及び翻訳を含む。
【００５６】
「発現ベクター」は、宿主においてコード配列の発現を可能にする適切な制御配列の一以上に作動可能に結合されたＤＮＡコード配列（例えば、遺伝子配列）を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は、転写を行うプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードしている配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。ベクターはプラスミド、ファージ粒子でもよく、単に潜在遺伝子の挿入体でもよい。適切な宿主へ形質転換されたら、ベクターは複製し、宿主遺伝子から独立して機能する可能性があり、又はある場合はその遺伝子自身へ組み込まれる可能性がある。プラスミドは、ベクターの形態として最も普通に用いる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし周知であるか又は周知になる発現ベクターの他の形態を含むものである。
【００５７】
「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。プロモーターは、誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。本発明に用いてよい誘導プロモーターの例は、誘導プロモーターである、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１であり、これに限定されない。
【００５８】
用語「作動可能に結合する」とは、要素が機能的に関連できるよう要素が並んでいることをいう。例えば、プロモーターが、コード配列の転写を制御する場合、プロモーターは、コード領域に作動可能に結合する。
【００５９】
用語「転写制御下にて」は、ポリヌクレオチド配列の転写が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動可能に結合することにより依存することを意味し、このことは当業者に周知である。
【００６０】
用語「翻訳制御下にて」は、ｍＲＮＡが形成された後におこる調節プロセスを示すことは周知である。
【００６１】
「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するＤＮＡセグメントをいい、コード領域の前後の領域、及び個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００６２】
本明細書にて用いる用語「宿主細胞」は、ポリペプチドの生産のための組み換え発現ベクターがポリペプチドの発現のためにトランスフェクションされた細胞又はセルラインをいう。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然に、偶然に、又は意図的な変異によって、オリジナルの親細胞に必ずしも完全に同一（形態学的に又は総合的なゲノムＤＮＡ相補的に）である必要はない。宿主細胞は、発現ベクターとインビボでトランスフェクト又は形質転換した細胞を含む。「宿主細胞」は、糸状真菌株及び特にトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）株の細胞から創製された細胞及びプロトプラスト両者をいう。
【００６３】
細胞、核酸、タンパク質、又はベクターについて用いられる時、用語「組み換え体」は、異種の核酸もしくはタンパク質又は天然の核酸もしくはタンパク質の改変の導入により修飾された細胞、核酸、タンパク質、又はベクターを示す、又は細胞がそのように修飾された細胞由来していることを示す。つまり、例えば、組み換え細胞が、細胞の天然の形（非組み換え体）には見出されない遺伝子を発現し、異常に発現した天然遺伝子を発現し、遺伝子を不充分に発現し、又は全く発現しない場合をいう。
【００６４】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端部分に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞からタンパク質の成熟型の分泌を機能する。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。
【００６５】
用語「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、導入される核酸又はベクターを含む宿主の選択を容易にする宿主中の発現可能な遺伝子をいう。選択的マーカーの例は、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、文脈次第で「を起源とする（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」、「から得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ）」、「から得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ ｆｒｏｍ）」、から「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」、及び「から創生される（ｃｒｅａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」を意味する。
【００６７】
用語「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態いう（Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New Yorkを参照願いたい）。これらの菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合ポリサッカロイドからなる細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の延長によるものであり、炭素異化は、絶対的好気性による。本明細書にて糸状菌親細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（トリコデルマ ロンギプラチアタム（Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として以前分類及び現在ヒポクレア ジェコリアナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）としても知られる）、トリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ））、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ.）（例えば、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフミコーラ グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ））、クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）（例えば、クリソスポリウム ルクノウエンス（Ｃ. ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ.）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例えば、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、及びアスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ））、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ.）、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ.）、ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ.）、又はエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐ.）（また、Innis 他 (1985) Sci． 228:21-26を参照願いたい)を含むがこれらに限定されない。
【００６８】
本明細書にてもちいる用語、「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」は、従来又は現在トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類される任意の真菌属をいう。
【００６９】
用語「培養する」は、液体又は固体培地において成長に適切な条件下にて、微生物細胞の集団を増殖することをいう。
【００７０】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「異種の（heterologous）」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。いくつかの実施態様においては、タンパク質は、商業的に重要な産業用タンパク質である。その用語は、自然的に発生する遺伝子、変異された遺伝子、及び／又は合成遺伝子によりコードされるタンパク質を含むことを意図する。ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「相同の（homologous）」は、宿主細胞中自然的に発生するポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。
【００７１】
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞の遺伝子（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ取り込まれ、自律レプリコンへ転換し、又は一時的に発現する原核細胞又は真核細胞への核酸配列の取り込みに関することを含む。
【００７２】
本明細書にて用いる用語「形質転換される」、「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして保持される外来種（例えば、異種の）の核酸配列を有することを意味する。
【００７３】
用語、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合する少なくとも一つの成分から除去される物質（例えば、タンパク質、核酸、又は細胞）をいう。例えば、これらの用語は、例えば、自然のままの生物系など、その天然状態中に見られるように通常それを伴っている成分が、実質的又は本質的に無い物質をいうことができる。
【００７４】
本明細書にて用いる用語「回収される」は、微生物培養液の一以上の溶解性成分から酵素の少なくとも一部の分離、及び／又は例えば、培養液中の水又はエタノールのような一以上の溶剤から少なくとも一部の分離をいう。回収される酵素は、しばしば回収プロセス前より高い純度である。しかしながら、いくつかの実施態様においては、回収される酵素は、回収プロセス前より同じか低い純度でもよい。
【００７５】
用語、「分泌タンパク質」は、細胞から遊離されるポリペプチドの領域をいう。いくつかの実施態様においては、分泌タンパク質は、組み換え融合ポリペプチドから放出又は切断されるタンパク質である。
【００７６】
用語、「分泌」は、宿主細胞において膜から細胞外スペース及び周りの培地へ通過するタンパク質の選択的動きをいう。
【００７７】
本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下にて、単位時間当たり酵素調製物によって産物に転換される基質のモル数をいう。特異的活性は単位（Ｕ）／タンパク質のｍｇとして表わされる。
【００７８】
本明細書にて用いる、「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」の用語は、汚れた物の洗浄用洗浄媒体において使用を意図する混合物に関して用いる。幾つかの好ましい実施態様において、この用語は、布地及び／又は衣類の洗濯に関して用いる（例えば、「洗濯洗剤」）。別の実施態様においては、この用語は食器、刃物など洗浄に用いるもののような他の洗剤（例えば、「食器洗浄洗剤」）をいう。本発明は任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定することを意図しない。実際、この用語は界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤、及び安定化剤を含む洗剤が考えられる。
【００７９】
本明細書にて用いる用語「殺菌」は、表面から混入物の除去、並びに、ものの表面上の微生物の阻害又は死滅をいう。本発明は任意の特定の表面、もの、又は取り除くべき混入物又は微生物に限定しない。
【００８０】
「微生物培養液」又は「発酵培養液」は、微生物の（例えば、細菌の又は真菌の）細胞が増殖する成長培地及び本明細書に記載のように酵素の発現に適した成長培地をいう。
【００８１】
「不溶性酵素」は、固相に存在する酵素をいう。不溶性酵素は固相及び液相、例えば、微生物培養液の固相及び液相の分離の際固相を用いて分離される（即ち、パーティション）。微生物培養液全体において、固相の一部である不溶性酵素に加えて、一般的に、幾つかの酵素が、培地中液相に見られることも理解できる。不溶性酵素は、細胞固形物又は他の固形成分など、微生物培養液中固形物に生じてよく、微生物培養液内で沈殿又は結晶化されてよい。
【００８２】
本明細書にて用いる「可溶化」又は「溶解する」は、酵素の沈殿を生じさせる又は不溶性形態中に酵素を維持させる条件又は物質の除去、又は物理的条件の変化（例えば、温度の変化、混合、超音波処理）又は不溶性酵素を溶解性の状態にさせる可溶化物質（例えば、可溶化溶剤、例えば、水、ポリオール類、塩類、酸類、塩基類、界面活性剤類）の添加をいう。
【００８３】
不溶性酵素を「精製すること」又は不溶性酵素の「精製」は、目的としない成分、例えば、目的としない微生物培養液の液体成分を部分的又は完全に除去することによる目的の酵素の精製をいう。精製酵素含有組成物は、酵素が精製された混合物より一以上の成分の量が低い。
【００８４】
サンプル中、酵素の「純度」は、乾燥固体の全体量で酵素活性を割ることにより計算できる。乾燥固体は液体が除去された後すべての物質の存在の尺度となる。乾燥固体は、とりわけ、タンパク質、塩、炭水化物、代謝産物、核酸、脂質、細胞、細胞残屑、及び消費した発酵培地を含むことができる。酵素純度は、乾燥固体中の成分の一以上に関連する割合として表現できる。
【００８５】
「細胞残屑」は、細胞膜破壊後、つまり、微生物細胞の溶解後、放出される細胞壁及び他の不溶性細胞の成分をいう。
【００８６】
「培養液調整」は、後の工程での培養液操作に関する特性を改善するために設計された微生物発酵培養液の前処理をいう。培養調整液は、培養液の化学成物及び／又は物理的特性及び／又はレオロジー的特性を変化させ、下流の回収及び／又は製剤化プロセスにおいてその使用を機能させる。培養液調整は、更なる処理をせずにｐＨ変化、加熱処理、冷却、添加剤の添加（例えば、カルシウム、塩、凝集剤、還元剤、酵素活性化剤、酵素阻害剤、及び／又は界面活性剤）、混合、及び／又は培養液の時間に制限を設けた維持（例えば、０．５から２００時間）など、一以上の処理を含んでよい。
【００８７】
「ＡＴＣＣ」はマナッサス、バージニア、２０１０８に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）をいう。
【００８８】
「ＮＲＲＬ」はアグリカルチャー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナルセンター・フォー・アグリカルチャー・ユーティリゼーション・リサーチ（以前はＵＳＤＡ ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーとして知られる）ピオリア、イリノイをいう。
【００８９】
「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００９０】
回収方法
本発明は、微生物培養液から細胞又は細胞残屑を除去せずに、微生物培養液（即ち、酵素を発現する細胞が増殖した微生物の発酵培地）から不溶性酵素を回収する方法を提供する。不溶性酵素の回収は、微生物培養液の可溶性成分から、不溶性酵素を部分的に又は実質的に完全に分離すること、言い換えると、微生物培養液の可溶性成分の少なくとも一部分から不溶性酵素を分離することを含む。本明細書に記載の回収プロセスは、目的の不溶性酵素を一以上含む発酵培養液を細胞又は細胞残屑の除去をせずに、使用のための製剤化されうる目的の回収酵素へ転換する。
【００９１】
ある実施態様においては、方法は、酵素を発現する微生物細胞が増殖した微生物培養液及び酵素の少なくとも一部が不溶性である微生物培養液を提供すること、及び細胞を除去せずに不溶性酵素を回収すること、それにより回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成することを含む。別の実施態様においては、発現された酵素は、微生物培養液中可溶性であり、酵素の少なくとも一部が、沈殿剤の一以上の添加により、不溶性の状態になる。別の実施態様においては、酵素は、微生物細胞により発現されず、微生物細胞が増殖した微生物培養液に添加される。微生物培養液に添加された酵素は、不溶性であるか又は溶解性で、一以上の沈殿剤の添加により不溶性の状態となり得る。微生物細胞は、不溶性酵素の回収前に又は後に溶解してよく、不溶性細胞残屑を生成する。
【００９２】
幾つかの実施態様においては、発現された溶解性又は不溶性酵素を含む微生物培養液を外部的に生成された溶解性又は不溶性酵素を含む組成物と組み合わせる。一以上の沈殿剤を少なくとも一つの酵素（微生物培養液を生産した微生物細胞により発現された酵素及び／又は微生物培養液に添加された酵素）を不溶性にするように添加する。
【００９３】
幾つかの実施態様においては、液相の少なくとも一部が微生物培養液から除去される時、溶解性酵素は不溶性酵素と一緒に回収されてよい。
【００９４】
一般的に、回収された不溶性酵素は、封入体として存在する。
【００９５】
幾つかの実施態様においては、別個の微生物発酵からの微生物培養液の２以上を組み合わせ、及び不溶性酵素の一以上を組み合わせた微生物培養液から回収する。
【００９６】
本発明の方法は、不溶性酵素は酵素的に活性である。即ち、酵素的反応を触媒できる。不溶性酵素は、触媒的ポテンシャルを有し、即ち、酵素が不溶性の形態中において及び／又は溶剤中に可溶化となった後、及び触媒活性が生ずるのに適切な条件下にて触媒的に活性である。ある実施態様においては、不溶性酵素が不溶性形態中及び可溶化後両方において触媒的に活性である。ある実施態様においては、不溶性酵素は、不溶性形態中不活性であり、可溶化後触媒的に活性になる。
【００９７】
種々の実施態様においては、酵素の少なくとも約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％が、不溶性酵素の回収前に微生物培養液中に不溶性である。いくつかの実施態様においては、不溶性酵素の純度は、不溶性酵素の回収後少なくとも約１０％増加する。
【００９８】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液中の不溶性酵素の回収は、例えば、濃縮及び／又は透析ろ過によるものを含んでよい。不溶性酵素を含む微生物培養液は、培養液の溶解性部分の少なくとも一部を除去するように周知の技術の一以上により、濃縮してよく、それにより、培養液中の不溶性酵素の濃度が増加する。周知の技術は、膜処理（例えば、限外ろ過、精密ろ過、ナノフィルタレーション）、遠心分離、及び抽出を含むが、これらに限定されない。濃縮に代えて、又は、濃縮と共に、透析ろ過を一般的に、水に対して微生物培養液を透析ろ過する膜処理を用いることにより、微生物培養液の溶解性部分の少なくとも一部を置換するために用いてよい。
【００９９】
本発明の方法では、微生物細胞を目的の酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中で培養し、それにより、目的の酵素を含む微生物培養液を生成する。例えば、目的の酵素は、発現ベクターから宿主細胞中に発現してよい。目的の酵素を培養培地へ分泌してよく、又は分泌されずに細胞内に発現してよい。
【０１００】
培養培地に分泌される酵素は、細胞の増殖に用いる条件下にて、培養培地中で本来不溶性であってよく、又は酵素の不溶性が酵素の回収前に沈殿剤を添加することにより誘発されてよい。沈殿剤の例は、塩類（例えば、ＮａＣl、ＮａＳＯ４、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、約０．１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度）、高分子電解質（例えば、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、タンニン酸、ポリリン酸塩）、及び温度又はｐＨの変化、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。（Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul及びB. Mattiasson, ed., Marcel Dekker, Inc., pp.225-275; Bioseparations: Science and Engineering (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, pp. 243-271; Protein Purification: Principles and Practice (1994) R.K. Scopes, Springer, pp. 71-101.; Protein Purification Process Engineering (1994) R.G. Harrison, ed., Marcel Dekker Inc.,“Differential Precipitation of Proteins,” pp.115-208を参照願いたい。）
【０１０１】
また、溶解性酵素も例えば、基質‐酵素相互作用又は阻害剤‐酵素相互作用などの親和性相互作用により、例えば、親和性樹脂と接触することにより、不溶性の状態になってよい。
【０１０２】
細胞内に発現する及び分泌されない酵素は細胞の可溶化により放出してよい。放出された酵素をそれが放出される培養培地中の条件下では本来不溶性の物質であってよく、又は不溶性は、上述のように酵素の回収の前に沈殿剤の添加により誘発されてよい。
【０１０３】
本明細書に記載の目的の酵素を発現のために用いることができる微生物細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌の微生物又は真菌の微生物でよい。用いられ得る真核微生物の例は、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）種、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ.）及びフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）を含むが、これらに限定されない。用いられ得る原核微生物の例は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトミセス種(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．)、パントエア種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ.）、エシェリキア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ.）及びシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
不溶性の形態で発現される酵素又は例えば、沈殿剤の添加により、溶解性の形態で発現され、不溶性の状態にできる酵素は本明細書に記載の方法に従って回収されてよく、任意に、本明細書に記載のように粒状の又は液体の製剤中に製剤化してよい。いくつかの実施態様においては、酵素は、加水分解酵素、例えば、プロテアーゼ（細菌の（例えばスブチリシン）又は真菌類、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（アルファ又はベータ）、リパーゼ、又はセルラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、例えば、米国特許第４，７６０，０２５、ＥＰ特許第１３０ ７５６、又はＰＣＴ出願番号ＷＯ ９１／０６６３７に記載のスブチリシンである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ０８／１１２４５９に記載のアルファ‐アミラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、セルラーゼであり、例えば、マルチフェクトＬ２５０（商標）（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｌ２５０）、又はプラダックス（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ）であり、これらはGenencor, Division of Danisco US, Inc.から商業的に入手できる。いくつかの実施態様においては、酵素は、オキダーゼ、オキシゲナーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼ、ペクチン分解酵素、又はマンナナーゼ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施態様においては、酵素は、フィターゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ペルヒドロラーゼ酵素であり、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０５／０５６７８２に記載の酵素である。
【０１０５】
本明細書に記載の回収方法により、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が生産される。いくつかの実施態様においては、組成物は、傷が無い微生物細胞を含む。ある実施態様においては、傷が無い微生物細胞は、生きた微生物細胞である。ある実施態様においては、傷の無い微生物細胞は、死んだ細胞である。（例えば、発酵混合物のｐＨを、鉱物酸を用いる相溶性有機酸のｐＫａの約２ｐＨ単位以下に調整することにより、及び混合物に相溶性有機酸及び／又は有機酸塩の十分な量を添加し、実質的に完全な細胞死を与えることにより、細胞を死滅する方法を記載する米国特許第5,801,034を参照願いたい。）
【０１０６】
幾つかの実施態様においては、組成物は、可溶化された微生物細胞、即ち、微生物細胞の可溶化により生成された細胞残屑を含む。ある実施態様においては、方法は、不溶性タンパク質の回収前に、微生物細胞膜を破壊し、微生物細胞可溶化物を生成することを含む。微生物培養液中に溶解する酵素及び一以上の沈殿剤の添加により誘発される不溶性の酵素の場合において、微生物細胞膜の破壊が、沈殿剤の添加前又は後いずれかで生じてよい。いくつかの実施態様においては、細胞膜の破壊は、細胞が微生物細胞を可溶化できる酵素、例えば、リゾチーム酵素と接触することにより達成される。ある実施態様においては、微生物細胞を可溶化できる酵素で可溶化した細胞をさらに均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成する。他の実施態様においては、細胞膜の破壊は、機械的均質化により達成できる。
【０１０７】
本明細書に記載のように調製された一以上の不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有組成物を粒状又は液体の製剤に製剤化してよい。
【０１０８】
粒状製剤
低いダスティングの、安定した酵素顆粒を不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から生成してよい。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液は、上述の任意の回収方法に従って生成される。酵素顆粒は周知の方法により生成してよく、その例は、トップスプレー流動床コーティング装置で、ボトムスプレー式ウルスター（Ｗｕｒｓｔｅｒ）コーティング装置で、又はドラム造粒（例えば、高せん断粒状）押し出し成型、又はパンコーティングである。
【０１０９】
本発明は、例えば、上述のような回収方法を通して生成された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供し、組成物を含む酵素含有顆粒を生成し、ここで、顆粒中の不溶性酵素が、酵素的に活性であるとき、即ち、生じるべき触媒活性のために適切な条件下、酵素が基質と接触する時、酵素的に活性化できることを特徴とする、酵素含有顆粒を作成する方法を提供する。酵素は、例えば、酵素含有顆粒の使用において、生じるべき酵素活性のために適切な条件下にて、基質存在下、不溶性形態中及び／又は溶剤に溶解している場合、触媒的に活性である。ある実施態様においては、酵素は不溶性形態中及び可溶化後両方において触媒的に活性である。ある実施態様においては、酵素は不溶性形態中不活性であり、可溶化後、触媒的に活性になる。
【０１１０】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒をトップスプレー流動床装置で生成する。ある実施態様においては、上述のような不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有層をトップスプレー流動床装置でコアの表面上にコーティングする。任意に、顆粒は、コアと酵素含有層の間に塩層を含んでよい。塩は、例えば、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、又はそれらの混合物から選択されてよい。一以上の更なる層を酵素含有層の表面上にコーティングしてよい。例えば、バリア塩層を酵素含有層の表面上にコーティングしてよい。幾つかの実施態様においては、外側コーティング層の一以上を酵素含有層の表面上、又は酵素含有層の表面上にコーティングされたバリア塩層の表面上にコーティングしてよい。外側コーティング層は、例えば、ポリマー及び／又は色素を含んでよい。
【０１１１】
幾つかの実施態様においては、上述のように、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、コアの中に取り込まれ、一以上の層は酵素含有コアの表面上にコーティングされる。例えば、バリア塩層は、酵素含有コアの表面上にコーティングされてよい。幾つかの実施態様においては、一以上の外側コーティング層は、酵素含有コアの表面上、又は、酵素含有コアの表面上にコーティングされたバリア塩層の表面上にコーティングされてよい。外側コーティング層は、例えば、ポリマー及び／又は色素を含んでよい。
【０１１２】
いくつかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む顆粒を高せん断造粒など、ドラム式造粒により生成する。そのような顆粒は、酵素含有コア（不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む）及びコアを覆うコーティング層の一以上を含む。そのようなコーティング層は、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコール等、ポリマー、二酸化チタン又はグリセロールなど色素を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
また、本発明の顆粒は、可塑剤、充填剤、及び潤滑剤などのような成分をさらに含んでよいが、これらに限定されない。
【０１１４】
本発明は、コア及びコアの周りの層中の酵素含有組成物又はコアに取り込まれている酵素含有組成物、及び任意に一以上の追加的な層を含む酵素含有顆粒を提供する。酵素含有組成物は、例えば、上述のように生成した不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は微生物細胞残屑を含む。不溶性酵素は、顆粒中で酵素的に活性であるとき、つまり、生じるべき触媒活性のために適切な条件下、酵素が基質と接触する場合、酵素的に活性化されうる。また、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物中の溶解性酵素（例えば、溶解性酵素及び細胞及び／又は細胞残屑を有する微生物培養液）も本明細書に記載のように、粒状の製剤において製剤設計してよい。
【０１１５】
本発明の顆粒は低いダストを有する。例えば、ホイバッハ摩耗試験により測定して、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、２、１、又は０．５ ｍｇ／ｐａｄ未満である。周囲の湿度及び温度条件下にて貯蔵される場合、顆粒は安定であるが、使用時に、水と接触して溶解又は分散し、酵素を放出する。
【０１１６】
保護コーティングの無い小さな顆粒は、酵素顆粒製造プラント中及び使用者の製造プラントでの両方で、空気輸送及び充填作業の間、大量のダストを発生させる。ダストは、衛生問題及び製造問題の両方を生じうるので、出来る限り最小限にすべきである。いくつかの産業用試験が、摩耗に対する機械的耐性及び異なる粒状の酵素製剤のダスティング形成を測定するために開発されてきた。これらは、ホイバッハ摩耗試験及びエルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）試験を含む。ホイバッハ試験は、回転するパドルを用いて、シリンダーチャンバー内に含まれる顆粒床を通って、鋼球を転がし、及び同時にその床を通って空気流をいきわたらせ、発生する任意のダストをはぎ取ることにより、対象粒子を所定の粉砕化及び流動化する力で評価する。発生したダストは、チューブを通して吸引により引きつけられ、ホイバッハチャンバーの外でフィルターパッド上に沈殿される。回収されたダストの重量又は活性成分をホイバッハダストと呼ぶ。エルトリエーション試験において、顆粒を背の高い試験管内でガラスフリット上に置き、一定の時間の間にわたって、一定の乾燥空気流で流動化する。ホイバッハ及びエルトリエーションダスト試験の原理、操作、及び限定の説明は例えば、“Enzymes In Detergency” ed. Jan H. van Ee., Ch. 15, pgs. 310 − 312, (Marcel Dekker, Inc. New York (1997)及び本明細書に引用される文献に記載される。また、ホイバッハダスト試験は米国特許第５，３２４，６４９、５，８７９，９２０、及び７，１０８，８２１に記載される。
【０１１７】
コアは、顆粒の内側の核である。本発明にて用いるために有用なコアは、好ましくは、高い水和性の物質（言い換えると、水中にて容易に分散又は溶解する物質）である。コア材料は、真性水溶液への移行により、水中で分散（水和された時に分散される）しても、又は水中で溶解してもよい。クレイ（ベントライト、カオリン）、ノンパレイル及び凝集ジャガイモデンプンは、分散すると考えられる。ノンパレイルは、コーティング装置で粉体及び溶液の層をシードクリスタルに結合することにより、球状体の表面上に構築され及び球状へ丸くしたシードクリスタルからなる球状粒子である。一般的に、ノンパレイルは、スクロースなど糖及びトウモロコシデンプンなど粉体の組み合わせから作られる。適切なコアは、スクロース結晶、塩化ナトリウム、又は硫酸ナトリウムシード、及び硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムなどで構成されてよい他の無機塩を含むシード結晶物質をさらに含む。
【０１１８】
無機塩及び／又は糖及び／又は小さい有機分子から構成される顆粒は、本発明のコアとして用いてよい。コアの中に取り込んでよい適切な水溶性成分は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、尿素、クエン酸、スクロース、乳糖等を含む。水溶性成分は水分散性成分と組み合わせることができる。本発明のコアは、次の一以上をさらに含んでよい。それは、活性成分、ポリマー、充填剤、可塑剤、繊維材料、増量剤及びコアに用いるのに知られる他の化合物である。適切なポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール、酸化ポリエチレン、及びポリビニルピロリジンを含む。ＰＶＡは、部分的に加水分解された（７０−９０％）、中程度に加水分解された（９０−９８％）、完全に加水分解された（９８−９９％）、かなり加水分解された（９９−１００％）ＰＶＡ又は低粘度から高粘度を伴うそれらの混合物でよい。
【０１１９】
本明細書に記載される酵素含有顆粒のコアは、一以上の無機塩又はスクロース結晶からなってよい。いくつかの実施態様においては、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カルシウム、又はそれらの組み合わせからなる。ある実施態様においては、コアは、硫酸ナトリウムからなる。
【０１２０】
コアに用いるために有用な充填剤は、嵩高さを加え及びコストを低減するために用いる不活性物質、又は最終顆粒中に意図された酵素活性を調整の目的のために用いる不活性物質を含む。充填剤などの例は、尿素、塩類、糖類、及びクレイ、タルク、シリケート、カルボキシメチルセルロース及びデンプン類などのような水溶性剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明のコアに用いるために好適な可塑剤は、そのガラス転移温度を低減するためにポリマーに添加された不揮発性溶剤であり、それにより、もろさが低減し、及び変形能が増強される。一般的な可塑剤は、低分子量の有機化合物であり、特に可塑化されるポリマーに高い特異性がある。その例としては、糖類（グルコース、フルクトース、及びスクロース等）、糖アルコール（ソルビトール、キシリトール、及びマルチトールなど）、ポリオール（例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールなど多くのヒドロキシラジカル基を有するアルコールのような多価アルコール）尿素又はジブチル又はジメチルフタレートなど他の知られる可塑剤など極性の低分子有機化合物、又は水を含むがこれらに限定されない。
【０１２２】
本発明のコア中に用いるために有用な繊維物質は、高い引張強さを有する物質及び１から５０ミクロンの直径及び少なくとも直径の４倍に等しい長さを有する微細なフィラメントに形成できる物質を含む。一般的な繊維物質は、セルロース、グラスファイバー、メタルファイバー、ゴムファイバー、アズロン（トウモロコシ、ピーナッツ、及び牛乳中に自然的に発生するたんぱく質から製造される）及び合成ポリマーファイバーを含むが、これらに限定されない。合成物は、レイヨン（商標）（Rayon）、ナイロン（Nylon）、アクリル、ポリエステル、オレフィン、サラン（Saran）スパンデックス（Spandex）及ビナル（Vinal）を含む。典型的なセルロースファイバーは直径約３０ミクロンを有する１６０ミクロンの平均繊維長さを有する。
【０１２３】
コアは、周知の多様な造粒方法により加工でき、結晶化、沈殿、パンコーティング、流動床コーティング、回転式噴霧、押し出し成形、球状化、ドラム式造粒、及び高せん断凝集を含む。
【０１２４】
本発明のある実施態様においては、コアは、任意にさらにコーティングできる水溶性又は分散性ノンパレイル（上述のように糖でも又は塩でも）又は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）単独でも、二酸化チタン、タルク、又は、スクロース若しくはポリオールなど可塑剤のような抗凝固剤と組み合わせても用いるシードクリスタル（ノンパレイル）から構築される水溶性又は分散性ノンパレイルである。ノンパレイルのコーティング中ＰＶＡのレベルは、コーティングされるノンパレイルの重量の約０．５％から２０％存在してよい。
【０１２５】
一般的に、本明細書に取り込まれる任意の活性成分を含むコアは、衝撃感度粒子である。しかしながら、本発明は、コアのタイプにより限定されず、多くの特許及び刊行物は、本発明に用いられるコアを記載し、引用文献はUSP 5,879,920、USP 4,689,287及びWO 00/24877である。
【０１２６】
酵素
一以上不溶性酵素を本発明の低いダスティングの、安定的な酵素顆粒中に用いてよい。上述のように調製される、一以上の不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有組成物は、本明細書に記載する顆粒に取り込まれてよい。
【０１２７】
いくつかの実施態様においては、酵素は、一般的に加水分解酵素、例えば、プロテアーゼ（細菌の（例えばスブチリシン）又は真菌類、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（アルファ又はベータ）、リパーゼ、又はセルラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、例えば、米国特許第４，７６０，０２５、ＥＰ特許第１３０ ７５６、又はＰＣＴ出願番号ＷＯ ９１／０６６３７に記載のスブチリシンである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のアルファ‐アミラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素はセルラーゼであり、例えば、マルチフェクトＬ２５０（商標）（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｌ２５０）、プラダックス（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ）であり、これらはGenencor, Division of Danisco US, Inc.から商業的に入手できる。いくつかの実施態様においては、酵素は、オキダーゼ、オキシゲナーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼ、ペクチン分解酵素、又はマンナナーゼ又は、それらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、酵素は、フィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、酵素は、ペルヒドロラーゼ酵素を含み、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０５／０５６７８２に記載の酵素である。いくつかの実施態様においては、酵素は、基質（例えば、汚れ）を加水分解できる。
【０１２８】
ある態様において、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物中の一以上の不溶性酵素は、顆粒のコアに取り込まれる。別の好ましい態様においては、微生物細胞及び／又は細胞残屑に含まれる組成物中の一以上の酵素は、コアの周りに積層される。コアの周りに積層された場合、酵素を含む層は、ポリマーなどバインダーをさらに含む。例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのビニルポリマーである。
【０１２９】
任意に、酵素を含む層は、酵素含有組成物に加えて一以上の他の成分をさらに含んでよい。そのような非酵素成分は、ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール）、糖（例えば、スクロース、サッカロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトデキストリン）、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、化学的又は物理的修飾デンプン）、デキストリン、消泡剤（例えば、Ｆｏａｍｂｌａｓｔ ８８２ (Emerald Foam Control)、Ｅｒｏｌ ＤＦ ２０４Ｋ (Ouvrie PMC)、ＤＧ４３６ (ODG Industries, Inc.)、ＫＦＯ ８８０ (KABO Chemicals, Inc.)のようなポリエーテルポリオール）、糖アルコール（例えば、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール）、界面活性剤（例えば、Ｎｅｏｄｏｌ ２３−６．５（Shell Chemical LP, Houston, TX)及び Ｌｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ６５ (BASF)のようなアルコールエトキシレート）、及び再付着防止剤（例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ ＳＲＰ６ (Rhodia, Inc.)、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＮ−１００又はＳＲＮ−１７０ (Clariant GmbH)、Ｓｏｒｅｚ−１００(ISP Corp.)のようなポリエチレングリコールポリエステル）を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
「消泡剤」は泡を防ぎ、泡を壊すために用いる化合物である。また、これらは、デフォーマー（ｄｅｆｏａｍｅｒ）又はデフォーマー剤（ｄｅｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）といわれる。これらの化合物は液体の表面弾性を減少し、準安定性な泡の形成を防ぐ界面活性物質である。液体の表面弾性及び界面活性物質の間で平衡に達する性質の結果として泡が壊れる。(Vardar-Sukan (1991) Recent Adv. Biotechnol. 113-146)。本明細書に記載の顆粒に有用な消泡剤は、一般的にバイオプロセス中の使用に適している。適切な消泡剤は、脂質、油、ワックス、脂肪酸、又はエステル、アルコール、硫酸塩、スルホン酸塩、脂肪酸、石鹸、窒素化合物、リン酸塩、ポリグリコール、硫黄化物、チオ化合物、シロキサン及びハロゲン化及び無機化合物を含むが、これらに限定されない。(Ghildyal (1988) Adv. Appl. Microbiol. (1988) 33:173-222)。いくつかの実施態様においては、油、脂肪酸、エステル、ポリグルコール、及びシロキサンが有用である。いくつかの実施態様においては、消泡剤は、エチレンオキシドプロピレンオキシドコポリマーである。ある実施態様においては、オキシドプロピレンオキシドコポリマーは、約２２００の分子量(例えば、Ｍａｚｕ（商標）としてMazer Chemicals, Inc.から入手可能である)を有する。
【０１３１】
本発明の顆粒を酵素固形物（上述のように生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑）の重量に基づき０．０１％から５０％又は７５％を含んでよい。種々の実施態様においては、顆粒は、少なくとも約０．５、５、１０、２０、３０、又は４０％重量の酵素固形物を含んでよい。任意のバインダー及び本明細書に記載の他の成分を含む酵素固形物を含む層は、顆粒の重量に基づき、約０．２％から７０％又は８０％の間を含んでよい。
【０１３２】
いくつかの実施態様においては、２０センチポイズ未満の粘度を有する酵素含有層により、凝集が生じないように造粒できる。
【０１３３】
コーティング層
本発明の顆粒は、一以上の他のコーティング層をさらに含んでよい。コーティング層は、顆粒の最終用途に応じて任意の多くの機能に役立ってよい。例えば、コーティングは、活性成分、特に酵素に漂白による酸化に対する耐性を与え、コーティング層は、顆粒を水性媒体へ導入する時に所望の溶解速度を与え、又は顆粒の保管安定性を増強し及び顆粒内で微生物の増殖の可能性を低減するために環境湿度に対して防壁となりうる。
【０１３４】
本発明の実施態様においては、コーティング層は、一以上のポリマー、及び任意に、低残渣色素又は潤滑剤など他の賦形剤を含む。そのような賦形剤は、当業者に知られている。さらに、コーティング剤を同じ又は異なるカテゴリーの他の活性剤とともに用いてよい。
【０１３５】
適切なポリマーは、ＰＶＡ及び／又はＰＶＰ又は両者の混合物を含む。もしＰＶＡが用いられる場合、ＰＶＡは、部分的に加水分解された、完全に加水分解された、又は中程度に加水分解されたＰＶＡであって、低度から高程度の粘度を有するＰＶＡ（好ましくは、低粘度を有する部分的に加水分解されたＰＶＡ）でよい。有用な他のビニルポリマーは、ポリビニルアセテート及びポリビニルピロリドンを含む。例えば、有用なコポリマーは、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマーを含む。ＰＥＧなど他のポリマーは外側の層に用いてもよい。これらのさらなるコーティング層は、一以上の次のものをさらに含む。それは、可塑剤、色素、界面活性剤又は静電気防止剤などの潤滑剤及び任意に追加的な酵素である。本発明のコーティング層に用いるのに好適な可塑剤は、本明細書に既に記載したものである。本発明のコーティング層に用いるのに好適な色素は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムなど微細に分割されたホワイトナー、又は着色色素又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好ましいそのような色素は、溶解時、低残渣色素である。
【０１３６】
本明細書にて用いる「潤滑剤」は、表面の摩擦を低減する、顆粒の表面を滑らかにする、静電気を低減する、又は顆粒のもろさを低減する任意の物質をいう。また、潤滑剤は、コーティングプロセスでのバインダーの粘着性を低減することにより、コーティングプロセスを改善する点で関係する役割もまたになう。つまり、潤滑剤は、抗凝集剤及び湿潤剤として働くことができる。
【０１３７】
好適な潤滑剤は、界面活性剤（イオン性、非イオン性、又はインイオン性）、脂肪酸、抗静電気剤、及び防塵剤を含むが、これらに限定されない。好ましい潤滑剤は、界面活性剤、及びより好ましくは、９から１５炭素原子鎖の長さのアルカン又はアルケン直鎖、第一級アルコール又はそれら、エトキシレート又はエトキシサルフェート誘導体などアルコールをベースとした界面活性剤である。そのような界面活性剤は、Shell International Petroleum Company製のネオドール（商標）（Neodol）製品ラインとして商業的に入手可能である。他の適切な潤滑剤は、スタティックガード（商標）（StaticGuard）、ダウニー（商標）（Downey）、トリトン（Triton） X100又は120等のような抗静電気剤、テフロン（Teflon）等のような防塵剤、又は当業者に知られている他の潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
バインダー、構造化剤、及びバリア層など、他の中間層を含んでよい。好適なバリア物質は、例えば、無機塩、糖類、又は、有機酸又は塩類を含む。構造化剤は、ポリサッカロイド類又はポリペプチドでよい。好ましい構造化剤は、デンプン、修飾デンプン、カラギーナン、セルロース、修飾セルロース、アラビアゴム、グアーゴム、アカシアゴム、キサンタンゴム、ローカスビームゴム、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸を含む。好ましい、構造化剤は、低アレルギー性である。構造化剤２以上の組み合わせを本発明の顆粒中に用いることができる。バインダーは、糖類及び糖アルコール類を含むが、これらに限定されない。好適な糖類は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース及びマルトースを含むが、これらに限定されない。好適な糖アルコール類は、ソルビトール、マンニトール及びイノシトールを含む。
【０１３９】
バリア層
いくつかの実施態様においては、バリア層は、本明細書に記載のように、酵素含有顆粒中、酵素層表面又は酵素含有コアの表面にコーティングされる。いくつかの実施態様においては、バリア層は、例えば、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、及び／又は硫酸アンモニウムのような一以上の塩を含む。いくつかの実施態様においては、バリア層は、硫酸ナトリウムを含む、硫酸ナトリウムからなる、又は実質的に硫酸ナトリウムからなる。いくつかの実施態様においては、バリア層は、糖（例えば、スクロース）、ポリサッカライド（例えば、デンプン）、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１４０】
いくつかの実施態様においては、バリア層は水和物である。用語「水和した」は、バリア物質が遊離形態または結合形態、もしくはそれら２つの組合せで水を含有することを意味する。水和の水は、コーティングプロセス中またはその後のいずれかに加えてよい。水和の程度は、物質それ自体及び温度、それが適用される湿度及び乾燥条件の関数となる。
【０１４１】
「中程度又は高い」水分活性は少なくとも約０．２５、０．３０、又は０．３５の水分活性を有することを意味する。本明細書にて称される水分活性は、顆粒が顆粒上にコーティングされるバリア物質の一層を有する（が、さらなるコーティングが無い）場合の、その顆粒自身の水分活性をいう。さらなるコーティングは異なる層としてバリア物質の水分活性の正確な測定を困難にするおそれがある。
【０１４２】
理論で拘束されることを意図しないが、０．２５より大きい水分活性を有する物質が２５％より大きい相対湿度での貯蔵条件下に水分を取り込む駆動力を低減することが予想される。たいていの気候は２５％以上の相対湿度を有する。多くの洗剤は約０．３から０．４の範囲で水分活性を有する。顆粒の水分活性が、周囲の洗剤又は貯蔵天候のものより実際に高いならば、顆粒により水分を取り込む駆動力は除去され、さらに水分は顆粒からその周囲に放出されるに至る。たとえ顆粒の水分活性が洗剤又は対応する相対湿度の水分活性より低くても、バリア層に存在する水分は顆粒により取り込まれる水分の量を制限し、タンパク質コアに影響を与えるシールドとして働くだろう。
【０１４３】
塩水和物の場合、水和物物質は、結晶の結合水を有する結晶塩水和物である。その水和物は、得られるコーティングされる顆粒が０．２５を上回る水分活性を有するように、又は触感では乾燥している状態である顆粒を維持しながらできるだけ高い水分活性を有するような方法で選択され、適用されるべきである。塩水和物又は任意の他の適切な水和バリア物質をそのような方法にて、適用することにより、顆粒による水分のさらなる取り込みを誘発するすべての駆動力を除去する。重要な結果として、過ホウ酸塩又は過酸化物の陰イオンのような酵素活性に有害な物質の輸送の駆動力が除去される。媒体として水がない場合、これらの物質は、酵素コアへ浸透する可能性が低くなる。実験データは、顆粒中の酵素活性が安定な塩水和物で酵素コアをコーティングすることにより実質的に増強されることを示す。
【０１４４】
水和バリア層の生産のために有用な塩の例は、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸銅５水和物、リン酸ナトリウム２塩基性７水和物、硝酸マグネシウム６水和物、ホウ酸ナトリウム１０水和物、クエン酸ナトリウム２水和物及び酢酸マグネシウム４水和物を含む。
【０１４５】
外側のコーティング層
いくつかの実施態様においては、酵素含有顆粒は外側のコーティング層を含む。ある実施態様においては、外側のコーティング層を酵素層の表面にコーティングする。いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層を一以上の中間コーティング層の表面にコーティングする。ある実施態様においては、外側のコーティング層を酵素層の表面を又は酵素含有コアの表面をコーティングするバリア層の表面にコーティングする。
【０１４６】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層は一以上のポリマーを含む。適切なポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアセテート、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマー、ＰＶＰ−ＰＶＡコポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、キトサン、アラビアゴム、キサンタン、カラギーナン、ラテックスポリマー、及び腸溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層はＰＶＡを含む。外側のコーティング層中に含まれる有用なＰＶＡは、低粘度から高粘度を有する、部分的に加水分解される、完全に加水分解される、及び中程度に加水分解されるＰＶＡを含む。（例えば、米国特許第5,324,649を参照願いたい。）ある実施態様においては、外側のコーティング層は低粘度を有する部分的に加水分解されるＰＶＡを含む。
【０１４８】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層は一以上の色素を含む。有用な色素の例は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムのような白い微粉、硫酸カルシウム、タルク、又は着色顔料又は染料を含むが、これらに限定されない。一般的にそのような色素は、溶解すると低残渣色素である。ポリマー及び／又は色素に加えて外側のコーティング層は可塑剤、増量剤、潤滑剤、界面活性剤、及び再付着防止剤の一以上を含んでもよい。
【０１４９】
有用な可塑剤は、ポリオール（例えば、糖類、糖アルコール類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ類）、グリコール、プロピレングリコール）、尿素、クエン酸トリエチル、フタル酸ジブチル又はジメチル、又は水を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
有用な増量剤は、糖類（例えば、スクロース、マルトデキストリン又はトウモロコシシロップ固形物のようなデンプン加水分解物）、クレイ（例えば、カオリン又はベントナイト）、及びタルクを含むが、これらに限定されない。「増量剤」は、別の物質（一般的に高いコスト及び高い性能）に加える物質（一般的に低いコスト）であり、物質を修飾し、希釈する。
【０１５１】
有用な潤滑剤は、非イオン界面活性剤類（例えば、Ｎｅｏｄｏｌ、Ｌｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ ６５）、牛脂アルコール類、脂肪酸類、脂肪酸塩類（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、及び脂肪酸エステル類を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
有用な界面活性剤は、Ｎｅｏｄｏｌ ２３−６．５及びＬｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ６５のようなアルコールエトキシレ−ト類を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
有用な再付着防止剤は、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ ＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＮ−１００又はＳＲＮ−１７０、及びＳｏｒｅｘ−１００のようなポリエチレングリコールポリエステル類を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
他の補助成分
補助成分を本発明の酵素含有顆に添加してもよい。補助成分としては、金属塩、可溶化剤、活性化剤、酸化防止剤、染料、阻害剤、結合剤、香料、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、尿素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンのような酵素保護剤／スカベンジャーやグリシン、グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸、ウシ血清アルブミン、カゼイン等などのようなタンパク質、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩を含む界面活性剤、ビルダー、アルカリまたは無機電解質、漂白剤、青味剤及び蛍光染料及び凝固阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
マトリックス顆粒
ある実施態様においては、顆粒は、糖又は糖アルコール及び構造化剤と組み合わせて混合された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含むタンパク質「マトリックス」を含む（EP1037968B1を参照願いたい。）任意に、バリア層を酵素含有マトリックスの表面上に積層してよく、又はバリア物質は酵素含有マトリックスに含まれてよい。また、任意にコーティングをシード粒子、シード粒子周辺の酵素マトリックス及び／又はバリア層の表面上に適用してよい。いくつかの実施態様においては、構造化剤はポリサッカライド又はポリペプチドである。マトリックスはコアを通して均一であり、又はシード粒子の表面上に積層してよい。シード粒子及びマトリックスの間又はマトリックス及びバリア層の間に一以上の層があり、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のようなコーティングである。マトリックス顆粒は、例えば、トップスプレー流動床装置で生成されることができる。
【０１５６】
酵素マトリックスが積層される時に不活性な粒子であるシード粒子は、無機塩類、糖類、糖アルコール類、有機酸又は塩類など小さな有機分子、クレイ又はシリケートなど鉱物類、又はこれらの２以上の組み合わせから構成できる。シード粒子に取り込まれるために好適な可溶性成分は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、尿素、クエン酸、クエン酸塩、ソルビトール、マンニトール、オレイン酸塩、スクロース、ラクトース等を含む。可溶性成分をタルク、カオリン、またはベントナイトなど分散成分と組み合わせてよい。シード粒子を多様な造粒方法により作成してよく、造粒方法は、結晶化、沈殿、パンコ−ティング、流動床コーティング、流動床凝集、回転式噴霧、押し出し成形、顆粒化、球状化、ドラム式造粒及び高せん断凝集を含む。本発明の顆粒において、シード粒子を用いる場合、シード粒子：顆粒の比は１：１である。
【０１５７】
好適な糖類は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース及びマルトースような糖を含む。好適な糖アルコール類は、ソルビトール、マンニトール及びイノシトールを含む。マトリックス中の糖又は糖アルコール対構造化剤の割合は、好ましくは、タンパク質マトリックスの重量に基づき０．１％から９０％である。マトリックス中の糖又は糖アルコールは、タンパク質に添加される糖又は糖アルコールで良く、又はタンパク質が存在する発酵培養液由来でよい。
【０１５８】
構造化剤はポリサッカライド又はポリペプチドでよい。化合物のこれらの分類は、高い分子量及び高い水の溶解度の同時に存在する所望の特性ある。理論に拘束されずに、構造化剤の高い分子量は、糖又は糖アルコールマトリックス単独での欠ている二つの重要な特性に寄与する。それは、
（１）粒子のダストになる性質を顕著に低減する粒子への凝集性及び強さを提供する、及び
（２）マトリックス構造を通してポリマーネットワーク又は「ケージ」を形成する理由により水及び小さい分子に対して拡散するバリアとして役立つことである。これは、顕著に顆粒の安定性を改善する。
【０１５９】
好ましい構造化剤は、デンプン、修飾デンプン、カラギーナン、セルロース、修飾セルロース、アラビアゴム、グアーゴム、アカシアゴム、キサンタンゴム、ローカスビームゴム、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸を含む。好ましくは、構造化剤は、低アレルギー性である。構造化剤２以上の組み合わせを本発明の顆粒中に用いることができる。
【０１６０】
酵素含有マトリックスは、一以上の合成ポリマー又は当業者が知っている他の賦形剤をさらに含んでよい。適切な合成ポリマーは、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドを含む。また、酵素含有マトリックスは、可塑剤及び抗凝集剤もさらに含んでよい。本発明の使用に有用な可塑剤は、グリセロール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリオール、尿素、又はクエン酸トリエチル、ジブチル又はジメチルフタレートなど他の知られる可塑剤、又は水を含む。好適な抗凝集剤は、微細な不溶性物質又はタルク、ＴｉＯ２、クレイ、アモルファスシリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び炭酸カルシウムなど溶けにくい物質を含む。
【０１６１】
マトリックス顆粒は、バリア層をさらに含むことができる。バリア層はマトリックス中のタンパク質または酵素に不利に影響し得る基質の拡散を遅くする、または防止するために使用できる。バリア層は、バリア物質から構成され、タンパク質コアの表面上にコーティングされ、又はバリア物質はタンパク質コア中に含まれていてもよい。適当なバリア物質としては、例えば、無機塩類又は有機酸類または塩類が挙げられる。また、タンパク質のないマトリックスをバリア層として用いることができる。
【０１６２】
また、本発明のマトリックス顆粒は、一以上のコーティング層を含んでよい。例えば、そのようなコーティング層は、例えば、そのようなコーティング層は１以上の中間のコーティング層、またはそのようなコーティング層は１以上の外側のコーティング層またはそれらの組合わせでよい。酵素顆粒の最終用途に依存して、顆粒組成物において多くの機能のいくつかを果たすことができる。例えば、コーティングは漂白剤による酸化に対して酵素耐性を与えることができ、水性媒体へ顆粒を導入する際に望ましい溶出速度を生じ、または酵素の貯蔵安定性を高めてかつ顆粒内の微生物の増殖の可能性を減少させるための周囲湿度に対する防壁となる。
【０１６３】
適切なコーティングは、水溶性ポリマー又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など水分散性フィルム形成ポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、キトサン、アラビアゴム、キサンタン、カラギーナン、キトサン、ラテックスポリマー、及び腸溶性コーティング剤を含む。さらに、コーティング剤を同じ又は異なるカテゴリーの他の活性剤とともに使用してよい。
【０１６４】
コーティング層中に含まれる有用なＰＶＡは、低粘度から高粘度を有する、部分的に加水分解される、完全に加水分解される、及び中程度に加水分解されるＰＶＡを含む。好ましくは、外側のコーティング層は低粘度を有する部分的に加水分解されるＰＶＡを含む。他の有用なビニルポリマーは、ポリビニルアセテート及びポリビニルピロリドンを含む。有用なコポリマーは、例えば、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマー及びＰＶＰ−ＰＶＡコポリマーを含む。さらに、本発明のコーティング層は、一以上の次のものを含む。それは、可塑剤、増量剤、潤滑剤、色素、及び任意に追加される酵素である。本発明のコーティング層に用いるために有用な可塑剤は、糖類、糖アルコール類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、尿素、グリコール、プロピレングリコール、又はクエン酸トリエチル、フタル酸ジブチル又はジメチルなどのような他に知られる可塑剤、又は水を含む。本発明のコーティング層に用いるために有用な色素は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムのような白い微粉、着色顔料及び染料又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。好ましいそのような色素は、溶解すると低残渣色素である。有用な増量剤は、スクロースなどの糖類又はマルトデキストリン及びトウモロコシシロップ固形物などデンプン加水分解物、カオリン及びベントナイトなどクレイ及びタルクを含む。有用な潤滑剤は、Ｎｅｏｄｏｌなど非イオン界面活性剤、牛脂アルコール、脂肪酸、ステアリン酸マグネシウムなど脂肪酸塩及び脂肪酸エステルを含む。
【０１６５】
液体製剤
本発明は、例えば、上述のように回収される、微生物細胞及び／又は細胞残屑を有する組成物中に不溶性酵素を含む酵素含有液体製剤を提供する。酵素は、酵素的に活性である又は触媒的ポテンシャルを有する、言い換えると、液体製剤において、適切な溶剤中、及び生じるべき触媒活性のための条件下にて、試験又は使用適用中に触媒的活性を有し得る。種々の実施態様においては、液体製剤は、保存の間に製品の物理的及び生化学的特性を「安定させる」、言い換えると維持する製剤成分（安定化物質）を含んでよい。これは、次のものを含むが、これらに限定されない。それは、一以上のポリオール類、一以上の塩類、一以上の保存剤、又は一以上の緩衝塩（及びｐＨ調整のための酸又は塩基）、一以上の界面活性剤、一以上のアミノ酸類、一以上の抗酸化剤又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施態様においては、液体製剤は、約１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上のポリオール類、例えば、グルコース、スクロース、ソルビトール、グリセロール、ラクトース、デキストロース、プロピレングリコールを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の塩類、例えば、NaCl、CaCl2、Na2SO4、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルタミン酸１ナトリウム、塩化カルシウムを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約５％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の保存剤、例えば、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約２０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の緩衝塩、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳを含む。酸（例えば、酢酸若しくはギ酸など弱酸、又はHCl若しくはH2SO4など強酸）又は塩基（例えば、NaOH又はKOH）は、ｐＨ調整のために用いてよい。液体製剤を記載する引用文献に関しては、Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul and B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc., pp. 549-604を参照願いたい。
【０１６６】
また、本発明は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を有する組成物中、例えば、上記のように回収される、不溶性酵素を含む液体製剤であって、ここで酵素が液体製剤中酵素的に活性であることを特徴とする製剤を調製する方法を提供する。ある実施態様においては、例えば、上述のように回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は微生物残屑を含む組成物を提供すること、任意に、液体中、典型的には水中に、上述のように、一以上の製剤成分、例えば、一以上のポリオール、一以上の塩、一以上の保存剤、及び／又は一以上の緩衝塩と組成物を混合することにより、部分的に又は完全に不溶性酵素を溶解すること、それにより液体製剤を生産することを含む。ある実施態様においては、方法は、例えば、上述のように回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供すること、不溶性酵素を溶解すること、任意に、液体中、典型的には水中に、例えば、上述のように、一以上の製剤成分、例えば、一以上のポリオール、一以上の塩、一以上の保存剤、及び／又は一以上の緩衝塩を有する組成物を回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物と混合すること、膜ろ過、及び／又は遠心分離など、例えば、ろ過により微生物細胞及び／又は細胞残屑を除くことにより溶解性酵素を含む組成物を清澄化にすること、それにより、清澄液体製剤を製造することを含む。
【０１６７】
組成物
本発明は、酵素含有顆粒又は上述のように液体製剤を含む組成物を提供する。酵素含有顆粒または液体製剤に加えて、組成物は、洗浄（例えば、洗剤）、織物処理、又は動物飼料、醸造、焼成、食品又は飲料水のような特定の利用にて顆粒又は液体製剤の使用に適する成分を含む。
【０１６８】
洗浄組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、洗浄性能及び／又は洗浄効果を提供するために例えば、洗濯又は食器洗浄に用いる洗剤のような洗浄組成物に含有される。洗浄組成物中に含有されるのに有用な酵素は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。一般的な組み合わせはアミラーゼと併せて、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／又はセルラーゼのような従来の適用酵素のカクテルである。
【０１６９】
また、例えば、洗浄性能を手助けし、又は増強するために、洗浄すべき物質の処理のために、又は香料、着色剤、染料などを有する場合のように洗浄組成物の美しさを修正するために補助的な材料も洗浄組成物中に含まれてよい。そのような補助的な材料は本明細書に記載の酵素含有顆粒に追加して、添加されるものである。これらの添加成分の正確な性質、及びその含有レベルは、組成物の物理的形態及びそれが用いられる洗浄操作の性質に依存する。適切な補助的な材料は、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料移動阻害剤、沈着補助剤（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｉｄｓ）、分散剤、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白促進剤、プリフォーム過酸、ポリマー分散剤、クレイ汚れ除去／再付着防止剤、光沢剤、泡立ち抑制剤、染料、香料、構造弾性剤、生地柔軟剤、担体、ヒドロトープ、処理補助剤及び／又は色素を含むが、これらに限定されない。下記の開示に加え、そのような他の補助的材料の適切な例及び使用のレベルは、米国特許第５，５７６，２８２、６，３０６，８１２、及び６，３２６，３４８に記載される。
【０１７０】
幾つかの実施態様においては、洗浄組成物はリン酸塩を含まない。幾つかの実施態様においては、洗浄組成物は、非リン酸塩含有食器洗浄洗剤である。幾つかの実施態様においては、非リン酸塩洗浄組成物は、非リン酸塩ビルダー、例えば、クエン酸塩を含む。
【０１７１】
界面活性剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、界面活性剤又は界面活性剤システムを含んでよく、ここで界面活性剤は非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤（ａｍｐｈｏｌｙｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、両性界面活性剤（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、半極性非イオン界面活性剤、及びそれらの混合物から選択される。一般的に界面活性剤は、対象の洗浄組成物の重量に基づいて、約０．１％から約６０％、約１％から約５０％又は約５％から約４０％のレベルで存在する。
【０１７２】
ビルダー
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステムを含んでよい。ビルダーを使用する場合、一般的に本明細書に記載の洗浄組成物は、その洗浄組成物の重量に基づいて少なくとも約１％、約３％から約６０％、又は約５％から約４０％のビルダーを含む。
【０１７３】
ビルダーはアルカリ金属、ポリリン酸アンモニウム及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸塩アルカリ金属、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダー、ポリカルボキシレート化合物、エーテル ヒドロキシポリカルボキシレート、エチレン又はビニルメチルエーテルを有する無水マレイン酸のコポリマー、１、３、５−トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、多様なアルカリ金属、エチレンジアミン４酢酸及びニトリル３酢酸のようなポリ酢酸のアンモニウム及び置換アンモニウム塩、及びメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボキシリック酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びそれらの可溶性塩のようなポリカルボキシレートを含むが、これらに限定されない。
【０１７４】
キレート剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上のキレート剤を含んでよい。適切なキレート剤は銅、鉄、及び／又はマンガンキレート剤及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。キレート剤を用いる場合、キレート組成物は、対象洗浄組成物の重量に基づき約０．１％から約１５％、又は約３．０％から約１０％のキレート剤を含んでよい。
【０１７５】
沈着補助剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の沈着補助剤を含んでよい。適切な沈着補助剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸のような汚れ放出ポリマー、及びカオリナイト、モントモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物等のクレイを含む。
【０１７６】
染料移動阻害剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の染料移動阻害剤を含んでよい。適切なポリマー製染料移動阻害剤は、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載の洗浄組成物に存在する場合、染料移動阻害剤は、その洗浄組成物の重量に基づき約０．０００１％から約１０％、約０．０１％から約５％、又は約０．１％から約３％のレベルにて存在してよい。
【０１７７】
分散剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の分散剤を含んでよい。適切な水溶性有機分散剤は、次のものを含むが、これらに限定されない。それは、ホモ−又はコポリマー酸又はそれらの塩を含み、ポリカルボン酸の場合には、２炭素原子を超えない間隔でお互いに分離しているカルボキシルラジカルを少なくとも２つ含んでいる。
【０１７８】
酵素安定剤
洗剤に用いることができる酵素は、多様な方法により安定化される。本明細書にて用いる酵素は、例えば、イオン等を酵素に提供する最終組成物において、カルシウム及び／又はマグネシウムイオンの水溶性の供給源の存在によって安定化される。
【０１７９】
触媒金属複合体
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の触媒金属複合体を含んでよい。金属含有漂白触媒のひとつのタイプは、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン等の明らかな漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン、亜鉛又はアルミウムカチオン等の僅かな漂白活性を有するか又は漂白活性を有しない予備的な金属カチオン、及び触媒及び予備的な金属カチオンに明らかな安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、及びこれらの水溶性塩を含む触媒システムである。そのような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３に開示されている。本明細書にて用いるマンガン含有触媒は、周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２に記載される。本明細書にて用いるコバルト漂白触媒は、周知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７に記載される。そのようなコバルト触媒は、既知の方法で容易に調製することができ、例えば、米国特許第５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７に記載される。
【０１８０】
また、本明細書に記載の組成物は少なくとも１つのマクロポリサイクリックリジッドリガンド（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｒｉｇｉｄ ｌｉｇａｎｄ）、ＭＲＬとして略される遷移金属複合体、を含む。実際的には、これは限定するものではないが、本明細書に記載の組成物及び洗浄プロセスは水溶性の洗浄媒体中に、活性ＭＲＬ類が少なくとも１ｐｐｍのオーダーで存在するように調節可能であり、しばしば、約０．００５ｐｐｍから約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍから約１０ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍから約５ｐｐｍのＭＲＬが、洗浄液中に存在する。遷移金属漂白触媒における最適な遷移金属は、マンガン、鉄、及びクロミウムを含む。ある実施態様においては、ＭＲＬは、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンのような架橋固定された非常に強固なリガンドである。適切な遷移金属ＭＲＬは、既知の方法で容易に調製することができ、例えば、ＷＯ００／３３２６０１及び米国特許第６，２２５，４６４に記載される。
【０１８１】
本明細書に記載の洗浄組成物を表面又は織物上の場所を洗浄するために用いることができる。一般的に、少なくともその場所の一部は、原液の状態の中又は洗浄液で希釈された中で上述の洗浄組成物と接触し、それからその場所は、任意に洗浄及び／又は濯がれる。洗浄はゴシゴシ洗うこと、機械的攪拌を含むが、これらに限定されない。織物は、通常の消費者が使用する条件で洗濯できるほとんどの織物を含んでよい。開示する洗浄組成物は、一般的に溶液中約５００ｐｐｍから約１５，０００ｐｐｍまでの濃度にて洗浄してよい。洗浄溶剤が水の場合、一般的に水の温度は約５℃から約９０℃の範囲であり、その場所が織物を含む場合、水対織物の質量比は一般的に約１：１から約３０：１である。
【０１８２】
織物処理組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、織物処理組成物に含まれる。織物処理組成物に含有されるのに適切な酵素は、セルラーゼ、ペルヒドロラーゼ、ポリエステラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、ペクチナーゼ、及びラッカーゼを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様においては、織物処理組成物は、再付着防止剤（例えば、Ｒｅｐｅｌ−Ｏ−Ｔｅｘ、Ｓｏｒｅｚ １００ (ISP Corp.)）も含んでよい。
【０１８３】
動物飼料組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、動物飼料組成物に含まれる。飼料組成物に含有されるのに適切な酵素は、セルロース分解性酵素及び／又はヘミセルロース分解酵素を含む。飼料組成物に含有するのに適切な酵素の例は、フィターゼ、キシラナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、リパーゼ、トランスフェラーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、リグニナーゼ、及びベータ‐グルカナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
次の実施例は説明を意図し、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例１
従来の回収方法を用いる部分的に沈殿する酵素を含有する発酵培養液からの酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
細菌溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、遠心分離前の培養液全量中に測定された全酵素活性の１０％を含んだ。酵素の９０％は、不溶性だった。アルファ‐アミラーゼ活性を米国特許出願番号12/041,917に記載のように測定した。
【０１８６】
細胞溶解物に関して、培養液温度を４０℃に調整し、０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを添加した。培養液を４８時間維持し、それから、０．６部（ｐａｒｔ）の水で希釈し、すぐに４％の陽イオンポリマー（C581、Cytec Industries, Inc.製）で凝集させた。珪藻土（FW12、World Minerals製）を凝集された培養液に４％ｗ／ｗで添加し、ＦＷ１２珪藻土ケーキでコーティングしたＨＲ９０００フィルターパッドを取り付けたデッドエンド真空フィルターを通してろ過した。細胞分離後、ろ液中の酵素の収率は６％であった。
【０１８７】
清澄ろ液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）らせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は１１．５ｇ／ｌ又は１．１５％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び２７．０４％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０１８８】
この方法のおける全体の収量は、全体培養液における最初の酵素活性の５％であり、純度は４．３％（活性乾燥固体物／全量の乾燥固体物）であった。
【０１８９】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように酵素濃縮物から調製した。
【０１９０】
スプレー１
粒径サイズが１５０μｍから３５０μｍの範囲を有する５１３グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１１．５ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、１．６％のタルク（Nytal 400）、０．５％のポリビニルアルコール（Erkol ５／８８）、１．０％の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び１．６％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む２０６２グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて1３.６ gpmに上げる。後の実験工程の間1３.６ gpmにて維持する。
インレット温度 ６９℃、３０分後７２℃に上昇。
アウトレット温度 ４３．９℃と４６．２℃の間
流動化空気流 ７６．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、１．５時間かけて４０ psiに増加する。
１０４３ｇの産物を取り出した。
【０１９１】
スプレー２
スプレー１から１０４３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１６６７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．３ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１５分かけて1９．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１９．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ６３℃、１５分後８０℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．２℃と４７．８℃の間
流動化空気流 ７９．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１３６３グラムの産物を取り出した。
【０１９２】
スプレー３
スプレー２から１３６３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。８３グラムの（顆粒組成物の５％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、８３グラムの（顆粒組成物の５％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び２５グラム（顆粒組成物の１．５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０６５グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．２ gpm (ｇ／分（grams per minute)）、 ３０分かけて1２．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１２．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃、３０分後７８℃に上昇。
アウトレット温度 ４６．０℃と５２．４℃の間
流動化空気流 ７８．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１４８７グラムの最終産物を取り出した。
【０１９３】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒のダストを分析した。顆粒のダストレベルは１．６６ｍｇ／ｐａｄであった。
【０１９４】
実施例２
沈殿物を溶解し、続いて従来の回収方法により部分的に沈殿した酵素を含有する発酵培養液から酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
酵素濃縮物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは遠心分離前の培養液全量中に測定された総酵素活性の５％を含んだ。酵素の９５％酵素は、不溶性だった。
【０１９５】
細胞溶解物に関して、培養液温度を４０℃に調整し、０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを添加した。培養液を１．５時間維持した。それから温度を６０℃に上げ１時間６０℃にて維持した。培養液をそれから１部（ｐａｒｔ）の水で希釈した。
【０１９６】
加熱段階及び希釈後沈殿された酵素が不溶性で残った。それらから溶解物を室温にて２８時間、５％グルコース及び３％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌとｐＨ９にて穏やかに混合しながらインキュベートし、細胞を分離した。沈殿されたアルファ‐アミラーゼ活性（８４％）の多くが溶解された。
【０１９７】
溶解物をそれから４％（ｗ／ｗ）陽イオンポリマー（Cytec Industries, Inc.製C581）で凝集した。珪藻土（World Minerals製FW12）を凝集された培養液に４％（ｗ／ｗ）で添加し、ＦＷ１２珪藻土ケーキでプレコーティングした回転式真空ドラムフィルターを通してろ過した。細胞分離後、ろ液中に得られた酵素は、８７％であった。
【０１９８】
清澄ろ液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は６０ｇ／ｌ又は６％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び２７％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０１９９】
この方法のおける全体の収量は、全体培養液における最初の酵素活性の８４％であり、純度は２２％（活性乾燥固体物／全量の乾燥固体物）であった。しかしながら、濃縮物はグルコース及びＮａＣｌを含んだ。これらの物質の除去は、方法の費用に返って影響を与える。
【０２００】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように酵素濃縮物から調製した。
【０２０１】
スプレー１
２００μｍから６００μｍの範囲の粒径サイズを有する４７８グラムのスクロース結晶をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、これに、６０．０ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、及び１１５グラム（顆粒組成物の９．８％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む６２８グラムの溶液をスクロース結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ２．９ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、５２分かけて１７．３ gpmに上げる。後の実験工程の間２０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 スプレー１について７１℃と７４℃の間
アウトレット温度 ４４．７℃と４８．５℃の間
流動化空気流 ８３．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８７．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３２ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５２分かけて４０ psiに増加する。
７００ｇの産物を取り出した。
【０２０２】
スプレー２
スプレー１から７００グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。１２０グラム（顆粒組成物の１０．２％）のスクロース（C&H Sugars）、１２０グラム（顆粒組成物の１０．２％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、７２グラム（顆粒組成物の６．１％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び１５グラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１３０８グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １２．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１０分かけて２０．２ gpmに上げる。後の実験工程の間２０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７４℃、１５分後８２℃に上昇。
アウトレット温度 ４６．３℃と４７．７℃の間
流動化空気流 ８５．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８８．０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３５psiと３６psiの間
９８８グラムの産物を取り出した。
【０２０３】
スプレー３
スプレー２から９８８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２９グラムの（顆粒組成物の２．５％）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC E-15 Dow Chemicals製）、及び４グラム（顆粒組成物の０．３％）のポリエチレングリコール６００(Carbowax Electron Microscopy Sciences製）を含む５８６グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．１ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、４５分かけて1５．６ gpmに上げる。後の実験工程の間1５．６ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃と８２℃の間
アウトレット温度 ４３．６℃と５０．３℃の間
流動化空気流 ８５．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８７．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１０１４グラムの最終産物を取り出した。
【０２０４】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは２．８０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２０５】
実施例３
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から均質化される細胞溶解物由来酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
均質化される細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、遠心分離前の培養液全量中に測定された総酵素活性の６％を含んだ。
【０２０６】
溶解物を実施例２に記載のように処理した。それから、溶解物を１０℃に冷却し、Gaulin ホモゲナイザー中６，０００ｐｓｉにて均質化した。酵素の収率は９０％であり、純度は６％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。
【０２０７】
粒状の製剤
粒状の組成物を均質化溶解物から次のように調製した。
【０２０８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する１７．６４キログラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１２．５３ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５．８８キログラム（顆粒組成物の５％）のタルク（Nytal 400）、１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び７．０６キログラム（顆粒組成物の６％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、及び１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）ネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む２５９．４１キログラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ５０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３時間かけて５００ gpmに上げる。後の実験工程の間５００ gpmにて維持する。
インレット温度 ７３℃及び８５℃の間
アウトレット温度 ４２．７℃と５５．７℃の間
流動化空気流 ８００ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と９５２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５時間かけて６８ psiに増加する。
６５．２キログラムの産物を取り出した。
【０２０９】
スプレー２
スプレー１から６５．２キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２２．２２キログラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１１１．１１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー２全体にわたって５００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から５８０ gpmの間
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４８．３℃と５４．１℃の間
流動化空気流 １１０９ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１２３４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi
８８キログラムの産物を取り出した。
【０２１０】
スプレー３
スプレー２から８４．９６７キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のタルク（Nytal 400）、及び１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals製23-6.5）を含む８４．９７キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー３全体にわたって３１０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から４００ gpmの間
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４８．８℃と５６．８℃の間
流動化空気流 １０７０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２３８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psiと７６ psiの間
９７．６キログラムの産物を取り出した。
【０２１１】
スプレー４
スプレー３から９７．６キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４７１グラム（顆粒組成物の０．４％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む９．４１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって２９５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４７．１℃と５１．１℃の間
流動化空気流 １１２６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２２０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６５ psiと６８ psiの間
１０１．２キログラムの産物を取り出した。
【０２１２】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは０．３３ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２１３】
実施例４
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から均質化され、透析ろ過される細胞溶解物由来酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
均質化された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。均質化された溶解物を実施例３のように調製した。
【０２１４】
均質化された溶解物を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて透析ろ過し濃縮した。最終濃縮物は１１ｇ／ｌ又は１．１％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び１６．７％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０２１５】
均質化された溶解物を水道用水を用いて透析ろ過（diafilter）した。一定体積の透析ろ過を実施した。即ち、均質化された溶解物を含む供給タンクにおいて体積を一定に保ち、システムから除かれる透過物の体積を交換するために水道水を加えることにより実施した。透析ろ過水の全量は０．５ｘの初期の均質化された溶解物であった。透析ろ過した均質化溶解物を１６％（ｗ／ｗ）乾燥固形物にさらに濃縮した。得られた調製物の純度は９．３％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。純度は実施例３で調製された均質化された溶解物より１．２５倍高かった。
【０２１６】
粒状の製剤
粒状の組成物を均質化され、透析ろ過した溶解物から次のように調製した。
【０２１７】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する２９．６０６キログラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１４．２ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５．８８キログラム（顆粒組成物の５％）のタルク（Nytal 400）、１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び１１．７７キログラム（顆粒組成物の１０％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、及び１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）ネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１７０．７９キログラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １０６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、５時間かけて５５０ gpmに上げる。後の実験工程の間５５０ gpmにて維持する。
インレット温度 ８０℃及び８２．６℃の間
アウトレット温度 ５１．０℃と６０．９℃の間
流動化空気流 ８０４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１０５８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６５ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５時間かけて７０ psiに増加する。
６６．６キログラムの産物を取り出した。
【０２１８】
スプレー２
スプレー１から６６．６キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２２．２２キログラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１１１．１１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー２全体にわたって４００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から６４０ gpmの間
インレット温度 ８３．５℃と８５．６℃の間
アウトレット温度 ５１．４℃と５４．８℃の間
流動化空気流 １０９７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１２４６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
９３．８キログラムの産物を取り出した。
【０２１９】
スプレー３
スプレー２から９３．８キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のタルク（Nytal 400）、及び１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む８４．９７キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー３全体にわたって２００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から４１０ gpmの間
インレット温度 ７９．６℃と８３．９℃の間
アウトレット温度 ５５．９℃と５９．６℃の間
流動化空気流 １１２１ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２４４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psiと７５ psiの間
１０８．４キログラムの産物を取り出した。
【０２２０】
スプレー４
スプレー３から１０８．４キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４７１グラム（顆粒組成物の０．４％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む９．４１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって２５０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）
インレット温度 ８２．７℃と８２．９℃の間
アウトレット温度 ５７．４℃と５９．７℃の間
流動化空気流 １１５７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２９９ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi
１１０．０キログラムの産物を取り出した。
【０２２１】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは０．１５ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２２２】
実施例５
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から透析ろ過された（Diafiltered）細胞溶解物由来の酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
透析ろ過された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。細胞を実施例２に記載のように溶解した。溶解物を実施例４に記載のように水道水を用いて透析ろ過した。透析ろ過した溶解物を１８．２％（ｗ／ｗ）乾燥固体にさらに濃縮した。得られた調製物の純度は１７％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。純度は実施例３で調製された均質化された溶解物より１．７倍高かった。
【０２２３】
実施例６
部分的に沈殿された酵素を含有する発酵培養液から透析ろ過された細胞溶解物由来の酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
透析ろ過された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を実施例１に記載のように発酵した。溶解物を実施例５に記載のように透析ろ過及び濃縮した。得られた調製物は２．１４％の酵素活性を有し、乾燥固体は１７．２％であった。
【０２２４】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように透析ろ過された溶解物から調製した。
【０２２５】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する６９１グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、２３．４１ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５％のタルク（Nytal 400）、１．０％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む６９１グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ２．６gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて1４.１ gpmに上げる。
インレット温度 ６９℃、３０分後７２℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．９℃と４５．８℃の間
流動化空気流 ７８．６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８０．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、１．５時間かけて４０ psiに増加する。
１０５０ｇの産物を取り出した。
【０２２６】
スプレー２
スプレー１から１０５０グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１６６７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と1７．４ gpmの間
インレット温度 ７８℃ と８２℃の間
アウトレット温度 ４６．０℃と４７．５℃の間
流動化空気流 ７８．６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１３５２グラムの産物を取り出した。
【０２２７】
スプレー３
スプレー２から１３５２グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。８８グラムの（顆粒組成物の５％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、８８グラムの（顆粒組成物の５％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び２６グラム（顆粒組成物の１．５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１１２７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて1０．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃、１０分後８０℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．０℃と５３．７℃の間
流動化空気流 ８２．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．１ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１５３５グラムの最終産物を取り出した。
【０２２８】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．５０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２２９】
実施例７
溶解性酵素を有する微生物培養液濃縮物の調製及び粒状製剤の調製
酵素濃縮物の調製
スブチリシンプロテアーゼを発現するバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性のスブチリシン酵素を含んだ。培養液を５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、全体の培養液サンプル中の活性と同じように活性を含んだ。培養液をｐＨ５．８±０．２に調整し、１．５±０．２部（ｐａｒｔ）の水道用水で希釈し、すぐに８％Ｃ３１１（Ｋｅｍｉｒａ）で凝集した。凝集した培養液をＦＷ１２珪藻土（World Minerals製FW12）でプレコーティングした回転式真空ドラムフィルターを通してろ過した。清澄ろ液を１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は５７．２３ｇ／Ｌ及び１９．１％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。酵素濃縮物の上澄み（１４，０００ｒｐｍ、４分）活性により測定したように、酵素濃縮物スブチリシン活性は造粒前に溶解物に残存し、全体の酵素濃縮物と同様の活性であった。
【０２３０】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように限外ろ過された濃縮物から調製した。
【０２３１】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する６４３グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む６４３グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて９.０ gpmに上げる。
インレット温度 ５７℃、１時間１５分後８６℃に上昇。
アウトレット温度 ４５．２℃と４８．９℃の間
流動化空気流 ７２．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８３．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、３０分かけて３７ psiに増加する。
７６９グラムの産物を取り出した。
【０２３２】
スプレー２
スプレー１から７６９グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４００グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む２００１グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と1７．５ gpmの間
インレット温度 ７３℃と７６℃の間
アウトレット温度 ４４．６℃と４５．７℃の間
流動化空気流 ７９．７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１１７８グラムの産物を取り出した。
【０２３３】
スプレー３
スプレー２から１１７８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１１２７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３０分かけて１２．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１２．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７０℃、１５分後７６℃に上昇。
アウトレット温度 ５１．０℃と５２．５℃の間
流動化空気流 ８０．７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８４．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１３５６グラムの産物を取り出した。
【０２３４】
スプレー４
スプレー３から１３５６グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６７．０グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１７．０ gpm
インレット温度 ７６℃
アウトレット温度 ４４．０℃と４６．５℃の間
流動化空気流 ８０．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．７ｃｆｍの間
１３５９グラムの最終産物を取り出した。
【０２３５】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．０３ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２３６】
実施例８
沈殿物を有する酵素濃縮物及び粒状の製剤の調製
沈殿される酵素を含む酵素濃縮物の調製
硫酸ナトリウムを実施例７での限外ろ過の後、最終酵素濃縮物に１２％（ｗ／ｖ）の濃度にて添加し、沈殿を誘発した。硫酸ナトリウムを含む濃縮物を１８時間１０℃にて混合した。得られたスラリーを造粒用に用いるために使用した。
【０２３７】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように沈殿物を含む酵素濃縮物から調製した。
【０２３８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する５００グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む９９９グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３０分かけて１０.６ gpmに上げる。
インレット温度 ６９．０℃と７４℃の間
アウトレット温度 ４４．５℃と４７．１℃の間
流動化空気流 ７９．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、６０分かけて４０ psiに増加する。
７０５グラムの産物を取り出した。
【０２３９】
スプレー２
スプレー１から７０５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３６９グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む１８４７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と１８．２ gpmの間
インレット温度 ７０℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４２．９℃と４５．１℃の間
流動化空気流 ８０．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１０６１グラムの産物を取り出した。
【０２４０】
スプレー３
スプレー２から１０６１グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、７２グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７２グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１８グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び１８グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０００グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．８ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて９．９ gpmに上げる。後の実験工程の間９．９ gpmを維持する。
インレット温度 ７２℃、１５分後８４℃に上昇。
アウトレット温度 ５１．４℃と５２．９℃の間
流動化空気流８０．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８２．３ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１２２６グラムの産物を取り出した。
【０２４１】
スプレー４
スプレー３から１２２６グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６２．０グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１７．０ gpm
インレット温度 ６９℃
アウトレット温度 ４１．４℃と４２．３℃の間
流動化空気流 ８０．８ cfm (立方フィート／分（cubic feet per minute）と８０．５ｃｆｍの間
１２２８グラムの最終産物を取り出した。
【０２４２】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは２．５０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２４３】
実施例９
酵素沈殿物を有する溶解された微生物培養液及び粒状の製剤の調製
沈殿された酵素を有する微生物培養液溶解物の調製
実施例７で記載のようにスブチリシンプロテアーゼを発現するバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性スブチリシン酵素を含んだ。リゾチームを１％濃度にて培養液に添加し、３時間３７℃にて維持した。得られた溶解物は、溶解性及び不溶性酵素両者を含み、５７ｇ／ｍＬ活性及び１８．２３％乾燥固体を含んだ。
【０２４４】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように沈殿された酵素有する溶解物から調製した。
【０２４５】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する５８５グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む９９３グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、２時間かけて１２.５ gpmに上げる。
インレット温度 ６３．０℃と７０℃の間
アウトレット温度 ４３．０℃と４７．５℃の間
流動化空気流 ７９．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．１ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、３０分かけて３８ psiに増加する。
７８５グラムの産物を取り出した。
【０２４６】
スプレー２
スプレー１から７８５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４００グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む２００１グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と２１．２ gpmの間
インレット温度 ６５℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４４．１℃と４５．６℃の間
流動化空気流 ７８．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３９ psiと４０ psiの間
１１６８グラムの産物を取り出した。
【０２４７】
スプレー３
スプレー２から１１６８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０８３グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、 ６０分かけて８．０ gpmに上げる。後の実験工程の間８．０ gpmを維持する。
インレット温度 ７３℃、３０分後７８℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．０℃と５２．９℃の間
流動化空気流 ８０．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．７ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１３４７グラムの産物を取り出した。
【０２４８】
スプレー４
スプレー３から１３４７グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６７．０グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１２．６ gpm
インレット温度 ６３℃
アウトレット温度 ４１．１℃と４４．１℃の間
流動化空気流 ８０．９ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．５ｃｆｍの間
１３４９グラムの最終産物を取り出した。
【０２４９】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．４ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２５０】
実施例１０
溶解性酵素有する濃縮された真菌の培養液及び粒状の製剤の調製
溶解性酵素を有する濃縮された真菌発酵培養液の調製
グルコアミラーゼを発現するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性グルコ‐アミラーゼを含んだ。グルコアミラーゼ活性をU.S. Patent Application No.７２６２０４１に記載のように測定した。細胞をU.S. Patent Application No.２００７/０２４６４０６のように精密ろ過により除去した。清澄培養液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜を用いて１０倍に濃縮した。酵素濃縮物を使用時まで１０℃にて保存した。貯蔵の時、沈殿物が形成された。沈殿物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分、１０℃）により除去した。得られた透明な上澄みを下記に記載のように粒状の組成物の調製のために用いた。
【０２５１】
粒状の製剤
次のように、粒状の組成物を真菌発酵培養液中の溶解性酵素から調製した。
【０２５２】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する４６６グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）及び１％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む５１２グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１５分かけて１０．１ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．１ gpmを維持する。
インレット温度 ７１℃と７７℃の間
アウトレット温度 ４６．７℃と４９．１℃の間
流動化空気流 ７５．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８０．７ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、４５分かけて４１ psiに増加する。
６１５グラムの産物を取り出した。
【０２５３】
スプレー２
スプレー１から６１５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、５３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の４０％）を含む２６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．４ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と１８．５ gpmの間
インレット温度 ７２℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４３．８℃と４５．７℃の間
流動化空気流 ８０．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３８ psi
１１１３グラムの産物を取り出した。
【０２５４】
スプレー３
スプレー２から１１１３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４０グラムの（顆粒組成物の３％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）及び８０グラム（顆粒組成物の６％）のタルク（Nytal 400）を含む６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて１１．０ gpmに上げる。
インレット温度 ６８℃、１０分後８２℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．２℃と５２．４℃の間
流動化空気流 ８２．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．５ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１２２１グラムの最終産物を取り出した。
【０２５５】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．６６ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２５６】
実施例１１
酵素沈殿物を有する真菌の培養液及び粒状の製剤の調製
実施例１０に記載のようにグルコ‐アミラーゼを発現するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知の方法で発現した。発酵後、培養液は多くの溶解性グルコ‐アミラーゼを含んだ。米国特許第５，８０１，０３４に記載のように溶解せずに細胞を死滅した。実施例１０から酵素濃縮物を遠心分離することにより得られる沈殿物を死滅細胞を含む培養液へ添加した。得られた培養液は、溶解性及び不溶性酵素両者を含んだ。酵素含有培養液は、４４７Ｕ／ｍＬ活性及び１９．７％（ｗ／ｗ）乾燥固体であった。沈殿物に存在する量を全体のサンプルの活性及び上澄み（１４，０００ｒｐｍ、５分）を測定することにより決定した。データを下記表１にまとめる。９０％の活性が、上澄み（溶解性酵素として）に存在し及び１０％が沈殿された形態中に存在した。
【表１】
【０２５７】
粒状の製剤
次のように、粒状の組成物を沈殿された酵素含有真菌培養液から調製した。
【０２５８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する４７２グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）及び１％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む４９４グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１０分かけて１０．８ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．８ gpmを維持する。
インレット温度 ６８℃と７１℃の間
アウトレット温度 ４４．７℃と４６．５℃の間
流動化空気流 ７８．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と７９．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３３ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、２０分かけて４０ psiに増加する。
６１２グラムの産物を取り出した。
【０２５９】
スプレー２
スプレー１から６１２グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、５３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の４０％）を含む２６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １７．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と２３．４ gpmの間
インレット温度 ７４℃と８２℃の間
アウトレット温度 ４４．６℃と４５．５℃の間
流動化空気流 ８１．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．９ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３８ psi
１０８１グラムの産物を取り出した。
【０２６０】
スプレー３
スプレー２から１０８１グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４０グラムの（顆粒組成物の３％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）及び８０グラム（顆粒組成物の６％）のタルク（Nytal 400）を含む６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ７．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて１０．８ gpmに上げる。
インレット温度 ７８℃、 ６０分後８１℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．７℃と５３．１℃の間
流動化空気流 ８３．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４１ psi
１１９０グラムの最終産物を取り出した。
【０２６１】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは７．９ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２６２】
実施例１２
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製した顆粒での洗剤中の酵素安定性
実施例４に記載のように調製した酵素顆粒の安定性を多様な洗剤基剤において評価した。洗剤基剤は、Calgonite 5-1、クエン酸塩を有するWFK、リン酸塩を有するWFK、及びSomat(Henkel)であった。WFK洗剤基剤はwfk Testgewebe GmbH (www.testgewebe.de)から入手できる。洗剤中酵素顆粒（２％ｗ／ｗ）を密閉容器中２２℃に保った。残存酵素活性を０、５週間、２カ月、及び４カ月の時間にて貯蔵後測定した。データを下記表２にまとめる。
【表２】
【０２６３】
実施例１３
細胞成分及び不溶性酵素を有する沈殿物から調製される顆粒の適用性能
実施例４に記載のように調製された酵素顆粒の洗浄性能を漂白洗剤基剤を含むＩＥＣ Ａ＊中に貯蔵前及び後で評価した。サンプルを１週間３７℃／７０％相対湿度（ＲＨ）にて蓋のあいたカップに保存した。新しい顆粒及び新しい洗剤を用いた並びに１週間洗剤中に保存した顆粒を用いた適用試験を多様な汚れ、即ち、CS-26(綿上トウモロコシデンプン)、CS-27(綿上ジャガイモデンプン)、CS-28(綿上コメデンプン)、CS-29(綿上タピオカデンプン)、及びEMPA-161(綿上デンプン)、を用いて実施した。
【０２６４】
洗浄試験
洗浄試験をMiele Novotronic W822洗浄機中で実施した。プログラムは「通常」／「綿」、温度は４０℃、水硬度は８．５ＧＨ、洗剤は、０．１５ｇのPurafect 4000 E (Genencor Division of Danisco US Inc.より入手) 及び０．１３９ｇの実施例４の顆粒を含む８ｇ／Ｌ（＝１３６ｇ／洗浄）用量の漂白剤を伴うＩＥＣ Ａ＊であった。
【０２６５】
性能測定
測定をMinolta CR300 Colorimeter、CIELAB L*abスケール、D65スタンダード イルミネイト、UVフィルター無し、白のバックグラウンドで行った。汚れ除去（ＳＲ）を次の式を用いて計算した。
【０２６６】
図１は実施例４の顆粒の試験性能が貯蔵の間変化せずに維持されたことを示す。
【０２６７】
実施例１４
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製される顆粒での保存の間の酵素安定性
実施例７−９に記載のように調製された酵素顆粒を保存安定性について評価した。用いた条件は、開いた容器に入れたサンプルを用いて７０％相対湿度のチャンバー中３７℃にて行った。残存活性を測定し、最初の活性に基づいて計算した。データを下記表３にまとめる。
【表３】
【０２６８】
実施例１５
実施例1−５に記載の回収方法の特性比較
上記実施例１−５に記載のように回収されたアルファ‐アミラーゼの活性及び精製を表４に記載する。酵素純度は、酵素活性を乾燥固体の総量で割ることにより算出した。
【表４】
【０２６９】
実施例１６
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製される顆粒に関する漂白剤含有洗剤基剤中に保存する間の酵素安定性
実施例１、２、４、及び６に記載のように調製される酵素顆粒を漂白粉を有するＩＥＣ Ａ＊洗剤基剤中の安定性について評価した。ＩＥＣ Ａ＊粉洗剤をＷＦＫから購入した。それは漂白洗剤を含んでいない。次の漂白系を加えた。それは、３％ＴＥＡＤ、及び２０％過ホウ酸塩２Ｈ２Ｏである。用いた保存条件は、３７℃、７０％相対湿度のチャンバーの中、開いたポリプロピレン容器中にサンプルを入れた。残存活性を測定し、最初の活性に基づいて計算した。データを図２に示す。
【０２７０】
実施例１７
酵素結晶を含む発酵培養液からの清澄酵素溶液の調製
すべての操作を室温で行った。
【０２７１】
出発材料
アスパラギン酸プロテアーゼを発現するように遺伝子組み換えされたトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知な標準条件下にて発酵した。例えば、米国特許第7,429,476を参照願いたい。採取時点の発酵培養液のｐＨは４．６２であり、酵素は、スピンダウン中全体の活性の９８％を有する大きな結晶を形成した。
【０２７２】
ろ過１−プロテアーゼ結晶の回収
５２１グラムの採取した培養液を６３ｇの珪藻土ろ過助剤Celatom FW-6とビーカーの中でブレンドした。０．４５μｍナイロン膜フィルター（Nalgene 154-0045）を通して、３０２ｇのブレンドをろ過した。１５５ｇのろ液及び１４６ｇのフィルターケーキを回収した。酵素活性の９８％がフィルターケーキ中に残存した。ろ液を破棄した。
【０２７３】
結晶の可溶化
前段階のフィルターケーキの１３１ｇをビーカーへ移し、８７ｇの５０ｍＭ硫酸とブレンドした。室温にて４５分間放置後、ブレンドはｐＨ３．２を有し、顕微鏡ですべてのプロテアーゼ結晶が溶解されたことを確認した。
【０２７４】
ろ過２−プロテアーゼ溶液の清澄化
前段階からの結晶の可溶化ブレンドの１８４ｇをろ過１にて用いたフィルターと同じ型でろ過した。ケーキの表面が乾燥したとき、５０ｇの水で洗浄することにより沈殿固形物からろ液を除いた。１５４ｇのろ液を回収し、８０ｇのフィルターケーキを破棄した。透明なろ液は、出発培養液の力価より１６％より高い力価にて出発酵素活性の８８％を含んだ。
【０２７５】
実施例１８
清澄酵素製剤調製
出発材料：細菌発酵培養液
アルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知な方法を用いて発酵した。発酵後、培養液を０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを用いて２時間溶解し、続いて２時間６０℃の温度で温めた。
【０２７６】
１８．１ 溶解性酵素（従来の回収）を含む培養液からの調製
５ｇの出発材料を１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。上澄みは、８８％の酵素活性を含んだ。乾燥固体による純度は、６％であった。全タンパク質による純度は、１４％であった。
【０２７７】
１８．２ 不溶性酵素を含む培養液から調製
溶解物中アルファ‐アミラーゼ酵素の結晶化
４０ｇの出発物質を用いた。２０％酢酸を用いて、溶解物のｐＨを５に調整した。そのｐＨ調製物をシェーカーでインキュベートした。５０℃及び８０ｒｐｍの振盪条件であった。
【０２７８】
遠心分離１−アルファ‐アミラーゼ結晶及び細胞残屑の回収
４４時間のインキュベート後、５ｇの溶解物を１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。
【０２７９】
アルファ‐アミラーゼ結晶の可溶化
回収された固形物を水道水中にもとの溶解物の重量の５ｇに達するまで再懸濁した。３ｇのプロピレングリコールを懸濁液に添加した。５％ＮａＯＨを用いて、ｐＨを６．５に調整し、室温にて１８時間反転することにより混合した。それから、混合物を４０℃にて２時間インキュベートした。
【０２８０】
遠心分離２−アルファ‐アミラーゼ溶液の清澄化
結晶可溶化ブレンドを１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。０．４５μｍシリンジフィルターを用いて、得られたもの（液体上澄み）をさらに清澄化した。透明なアミラーゼ溶液は、結晶化に用いた最初の溶解物中にあった活性の８５％を含んだ。乾燥固体による純度は、４２％であった。総タンパク質による純度は、３４％であった。
【０２８１】
１８．３ 凝集剤を用いる不溶性酵素を含む培養液から調製
凝集
実施例１８．２から溶解アルファ‐アミラーゼ結晶を含む５ｇ溶解物に１０ｇ／ＬのＣ５８１陽イオンポリマーを添加した。それから、手で１０回上下に反転することにより優しく混合した。
【０２８２】
遠心分離２−アミラーゼ溶液の清澄化
凝集結晶可溶化ブレンドを１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。透明なものは、結晶化に用いた最初の溶解物中にあった活性の８５％を含んだ。全タンパク質による純度は、３９％であった。
【０２８３】
実施例１８．１、１８．２及び１８．３に記載のように回収されるアルファ‐アミラーゼの純度を表５に示す。酵素純度を乾燥固体の総量で、又は総タンパク質濃度で酵素活性を割ることにより計算した。
【表５】
【０２８４】
理解を明らかにする目的のために図及び実施例の方法で、発明を詳細に説明したけれども、ある変更及び修飾は本発明の特許請求の範囲及び精神を逸脱せずに実施できることは当業者にとって明らかである。従って、説明は、本発明の特許請求の範囲に限定することを意図していない。
【０２８５】
あたかも各々個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的に及び個別に参考により組み入れられていることを示すように、本明細書にて引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、参考により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年６月９日に出願した米国仮出願第６１／０６０，０８７の優先権を主張し、その出願は参照により本明細書にその全体が取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、微生物細胞又は細胞残屑の存在下、微生物の発酵培養液から一以上の目的酵素を回収する方法、及び回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物から調製される固体及び液体製剤に関する。
【０００３】
背景技術
従来、液体又は固体製品形態で用いる酵素を工業用微生物発酵培養液から回収することは、一般的にいくつかの処理工程を含む。多くの従来的回収方法は、連続的に起こる４つの似たような工程、すなわち、
微生物培養液からの産生物ではない不溶性成分の除去、
生産物の単離、
精製、及び
ポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、
を含む。（例えば、Enzymes in Industry: Production and Applications (2007) Wolfgang Aehle, ed., 3rd edition, Wiley-VCH, p. 49; Bioseparations: Science and Engineering (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, Oxford University Press,p.32を参照願いたい。）例えば、細胞内に生産される酵素の回収及び製剤化は一般的に以下の処理工程を含む。それは、
（１）細胞溶解、
（２）前処理、
（３）細胞分離、
（４）濃縮、及び
（５）製剤化―（ａ）液体安定性のために化学薬品添加、その後、仕上げ用ろ過（ｐｏｌｉｓｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、又は（ｂ）固体安定性のための化学薬品添加、その後、乾燥
である。
【０００４】
細胞溶解は細胞壁を破壊することにより細胞から目的の酵素を放出する。細胞溶解は、細胞をリゾチームのような細胞壁を分解する酵素と接触させることにより、ｐＨ、温度、可溶化酸素の濃度、グルコース濃度、塩濃度、又は、自然発生的な可溶化を生じる他の添加剤の濃度の変化のような発酵環境の変化を導入することにより、均質化によるような細胞壁の機械的破壊により、又は、これらの方法の組み合わせにより、達成されてよい。細胞外に発現される（培養培地に分泌される）場合、細胞溶解は任意である。（Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul and B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc.,pp.1-27を参照願いたい。）
【０００５】
細胞溶解後、細胞分離工程を用いて目的の酵素を含む清澄溶液を生成する。一般的に、細胞分離は遠心及び／又はろ過を含み、発酵の間及び／又は発酵後、及び／又は細胞溶解の結果として生成する細胞残屑及び任意の不溶性物質を除去する。適切な遠心方法はディスクスタック（disk stack）又はデンカンター型遠心分離機を含む。適切なろ過方法はロータリー型真空ろ過、プレート‐フレームろ過プレス装置を通したろ過、又は精密ろ過膜を通したろ過を含む。
【０００６】
遠心分離を用いる細胞分離は、しばしば清澄度及び処理能力の間の妥協で得られる。高い処理能力の遠心分離を用い、それから高い処理能力のろ過を通してその後の処理工程を妨害するのに十分な量の微量のけん濁固形物を除去することは、一般的なやり方である。今日実施される多くのろ過方法は、効率的な分離を達成するために、珪藻土又はその類似物のような加工助剤及び炭素（ＰＣＴ出願WO01/87468）の使用を必要とする。珪藻土は、ろ過工程の処理能力及びろ過物の清澄性を改善する。
【０００７】
前処理工程は、一般的に目的酵素を含む液体から細胞又は細胞残屑の物理的分離を行う前に用いる。そのような工程を用いずに細胞残屑を分離することは、小さな粒子サイズの残屑及び溶解発酵培養液の粘性のある性質によって、一般的にコスト高であり時間もかかる。しばしば、前処理は溶解又は非溶解培養液への凝集剤の導入を含む。高分子電解質は発酵培養液から細菌細胞を除去する場合において細胞凝集を増強する方法として多くの注目を集めた。Baran (1988) Colloids Surf. 31:259-264; Bautista他、(1986) Biotechnol. Lett. 8:315-318; Chen and Berg (1993) Chem. Eng. Sci. 48:1775-1784; Cumming他、(1996) Biotechnol. Tech. 4:55-60; Hustedt及びTheelen (1989) DeChema Biotechnology Conferences − VCH Veragsgesselschaft 3:1071-1075; Ramsden他、(1998) Biotechnol. Tech. 12:599-603; Shan他、(1996) J. Biotechnol. 49:173-178。
【０００８】
凝集は目的酵素を含む液体部分から細胞残屑を除去する働きをする。いくつかの通常用いる凝集剤は、ポリエチレンイミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、及びメタクリロイルオキシエチル トリメチルアンモニウムクロライド‐アクリルアミドコポリマーを含む。細胞残屑の凝集は、電荷に基づく現象であり、有効性のために低イオン強度を必要とする。結果として、水による発酵培養液の希釈は、細胞残屑を凝集することが一般的に必要となる。
【０００９】
所望の最終産物濃度及び純度次第で、細胞分離工程からの目的酵素を含む上澄み溶液は、製品を製造する製剤化のための条件にあわせてよい。しかしながら、製剤化前の酵素の濃度を増加するために度々さらなる処理が必要となる。濃縮は、典型的には、熱安定性酵素のための限外ろ過又は蒸留により達成される脱水工程を含む。濃縮のための他の方法は、沈殿、結晶化、及びクロマトグラフィーを含む。（ＰＣＴ出願WO 91/09941を参照願いたい。）これらは、費用が高いので、工業的酵素回収において一般的なやり方ではない。
【００１０】
上述のように、従来の酵素の回収及び製剤化は、複数の工程を含む。製造方法に追加される各工程は、最終の生産量を減少させ、エネルギー、時間、及び労力の点でコストがかかる。
【００１１】
発現方法の進歩により、発酵培養液中に比較的高い酵素濃度（例えば、１０から１００ｇ／ｌ）を得ることができるようになった。ある場合、発現レベルは、目的酵素の溶解限度を超え、酵素は、発酵の終わりに沈殿状態又は結晶状態で存在する。上述のように、従来の回収工程を発酵培養液から酵素を回収するために用いる場合、酵素沈殿物は、細胞分離工程の間、不溶性細胞残屑及び他の不溶性物質を伴って同時に除かれるであろう。結果として、回収収量は低くなるであろう。この問題を解決するひとつの案は、回収工程の後すぐにポリオールを過飽和酵素溶液に添加し、その沈殿を防ぐことを含む。（欧州特許第EP1417301）しかしながら、そのような方法は、さらなる材料コストを必要とし、回収方法のために余分な工程を追加する。ポリオールの添加をせずに不溶性酵素を回収する方法が有利であろう。
【００１２】
酵素含有顆粒は、洗剤、織物処理、食品（例えば、ベーキング）、動物飼料、及び燃料エタノール産業を含むいくつかの産業において製品へ取り込まれる。そのような顆粒は、流動床スプレーコーティング、高せん断造粒、押し出し、球形化、顆粒化、及びスプレー乾燥を含む多くの技術により調製されてよい。
【００１３】
従来、そのような酵素含有顆粒は、顆粒へ取り込まれる前に溶解性形態である酵素を含み、微生物宿主中に発現する場合、酵素は、細胞溶解から生成される微生物細胞及び／又は細胞残屑を除くために少なくとも部分的に精製される。
【００１４】
不溶性酵素が、微生物培養液中に存在する場合、回収前に可溶化が必要となる。いくつかの場合、これはｐＨ及び／又は温度の変化により又は単塩の添加により容易に達成できる。他の場合、ポリオール又は糖の添加が必要となる。可溶化の後で、細胞分離を行うことができる。得られる上澄みストリームは、一般的にとても薄くて製剤化のために用いることができない。一般的に、限外ろ過を濃縮工程に使用する。添加される糖は、限外ろ過膜を自由に通過し、破棄用ストリームになる。得られる濃縮物を一般的に液体製品へ製剤化し得る。しかしながら、必ずしも顆粒化に適応するわけではない。結果として、顆粒化前に糖の除去が必要となる。これは、透析ろ過により達成でき、それにより、さらに多くの廃棄物が発生する。このアプローチの問題点は、プロセス工程及び破棄物の故に、培養液及び固体産物の重大なコスト上昇が生じることである。本発明はそのような培養液から経済的に産物を生成する方法の代替的方法である。
【００１５】
酵素が不溶性状態であり細胞及び／又は不溶性細胞成分が除去されないような顆粒状酵素製剤の必要性がある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、不溶性酵素の回収及び製剤に関する方法、及び本明細書に記載のように回収された及び製剤化された不溶性酵素を含む組成物を提供する。
【００１７】
ある態様においては、本発明の方法は、
微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収すること、
それにより回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成すること、
ここで、酵素の少なくとも一部が、微生物培養液に不溶性であることを特徴とすることを含む、
微生物細胞及び／又は微生物細胞からの細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法を提供する。ある態様においては、方法は、
（ａ）微生物細胞及び酵素を含む微生物培養液を提供する工程、ここで、少なくとも一部の酵素が微生物培養液中で不溶性であるようにする工程、及び
（ｂ）微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収し、それにより回収された不溶性酵素を含む組成物を生成する工程、ここで、組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含むようにする工程、
を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素は、酵素的に活性である（言い換えると、酵素が、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００１８】
幾つかの実施態様においては、微生物培養液が、
酵素を微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液とブレンドすることであって、酵素が微生物細胞により生成されず、及び酵素が微生物培養液に不溶性であるか、酵素が微生物培養液に溶解性であるが沈殿剤の添加により、酵素の少なくとも一部が不溶性なることをさらに含むこと、
微生物細胞により発現された溶解性酵素を含む微生物培養液に沈殿剤を添加し、それにより酵素の少なくとも一部が不溶性にさせられること、及び
微生物細胞中の酵素を発酵培地に発現し、ここに酵素の少なくとも一部が発酵培地に不溶性であるようにすること、
から選択される方法により生成される。
【００１９】
幾つかの実施態様においては、回収操作が、培養液調整、細胞溶解、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、及び固液分離から選択される少なくとも一つの回収操作を含む。幾つかの実施態様においては、回収は、任意の順序で実施される、培養液調整、細胞溶解、均質化、透析ろ過及び固液分離から選択される二以上の回収操作を実施することを含む。
【００２０】
幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の回収は、微生物培養液の液相の少なくとも一部を除去すること含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の液相の少なくとも一部の除去は、微生物培養液を濃縮することを含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の濃縮は、限外ろか、精密ろ過、逆浸透、及びナノろ過から選択される膜ろ過法を含む。幾つかの実施態様においては、微生物培養液の液相の少なくとも一部の除去、例えば、微生物培養液の濃縮は、回転式ドラム型真空ろ過、プレート‐フレームろ過、ベルト型ろ過、遠心分離、サイクロン分離、デカンテーション、及び、蒸留から選択される方法を含む。
【００２１】
幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の回収は、透析ろ過を含む。
【００２２】
幾つかの実施態様においては、微生物培養液は、酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中に酵素を発現する微生物細胞を増殖することにより生成され、ここで、酵素は、増殖条件下にて不溶性である。他の実施態様においては、微生物培養液は、酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中に酵素を発現する微生物細胞を増殖することにより生成され、ここで、酵素は、増殖条件下にて溶解性であり、酵素を回収する前に沈殿剤を添加し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性となる。幾つかの実施態様においては、沈殿剤はｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくとも一つの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、高分子電解質の添加、及びそれらの組み合わせから選択される。ある実施態様においては、不溶性酵素は、沈殿剤を溶解性酵素を含む微生物培養液に添加することより酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性となって生成される。ここで、沈殿剤がｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくともひとつの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、及び高分子電解質の添加、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００２３】
幾つかの実施態様においては、回収される不溶性酵素を含む組成物は、無傷の微生物細胞を含む。ある実施態様においては、無傷の微生物細胞は生きている微生物細胞である。別の実施態様においては、無傷の微生物細胞は死んでいる微生物細胞である。他の実施態様においては、回収される不溶性酵素を含む組成物は、溶解した微生物細胞を含む。
【００２４】
微生物培養液中で発現される酵素が不溶性である、幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素の回収前又は後に、微生物細胞膜を破壊し、微生物細胞溶解物を生成することを含む。微生物培養液中で発現される酵素が溶解性である、他の実施態様においては、方法は、沈殿される酵素の回収の前に、沈殿剤の添加の前又は後に、微生物細胞膜を破壊することを含む。
【００２５】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液は、無傷の微生物細胞の微生物細胞膜を破壊することにより生成される微生物細胞溶解物を含む。
【００２６】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、微生物細胞溶解を生じることができる酵素と微生物細胞を接触することを含む。ある実施態様においては、微生物細胞溶解を生じることができる酵素は、リゾチーム酵素である。他の実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、均質化のような機械的細胞膜破壊方法を含む。幾つかの実施態様においては、微生物細胞膜の破壊は、例えば、均質化、高せん断混合（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｍｉｘｉｎｇ）、押出圧力、及び高せん断ポンピング（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｐｕｍｐｉｎｇ）から選択される機械的せん断方法を含む。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成することをさらに含む。
【００２７】
幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を透析ろ過することをさらに含む。幾つかの実施態様においては、方法は、不溶性酵素を回収する前又は後に、微生物細胞溶解物を均質化する及び透析ろ過することをさらに含む。
【００２８】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞は、細菌細胞である。幾つかの実施態様においては、細菌細胞は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。幾つかの実施態様においては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。
【００２９】
幾つかの実施態様においては、微生物細胞は、真菌細胞である。幾つかの実施態様においては、真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。幾つかの実施態様においては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞は、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。
【００３０】
幾つかの実施態様においては、酵素の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％が微生物培養液中に不溶性である。
【００３１】
回収方法の幾つかの実施態様においては、不溶性酵素の純度が、少なくとも約１０％増加している。
【００３２】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載のように、微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法に従って生成される組成物を提供し、ここで、組成物は、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む。ある実施態様においては、組成物は、少なくとも一つの製剤成分をさらに含む。
【００３３】
別の態様においては、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書に記載のように、微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法に従って生成される、微生物不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）酵素が少なくとも部分的に溶解するように、酵素を溶解する物質の一以上を添加することにより及び／又は物理的条件を変化することにより、不溶性酵素の少なくとも一部を溶解し、それにより、溶解性酵素溶液を生成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で調製された溶液から固形物を除去し、それにより、清澄液体酵素溶液を生成する工程
を含む清澄液体酵素溶液を生成する方法を提供する。
【００３４】
別の態様においては、本発明は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有顆粒を生成することを含む、酵素含有顆粒を作成する方法を提供する。ある実施態様においては、方法は、
（ａ）不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を提供する工程、及び
（ｂ）不溶性酵素を含む酵素含有顆粒を生成する工程を含む。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載のいずれかの方法に従って生成される。ある実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、ここで、酵素の少なくとも一部は、微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００３５】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、トップスプレー流動床方法で生成される。幾つかの実施態様においては、酵素含有顆粒は、トップスプレー流動床方法、ボトムスプレーウルスターコーター（Ｗｕｒｓｔｅｒ ｃｏａｔｅｒ）方法、高せん断造粒（ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、押し出し成形、及びパンコーティングから選択される造粒方法により生成される。
【００３６】
ある実施態様においては、方法は、トップスプレー流動床装置において、コアの上に不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有層をコーティングすることを含む。方法は、任意に、コアと酵素含有層の間に塩層をコーティングすることを含む。ある実施態様においては、方法は、酵素含有層の上にバリア塩を含む層をコーティングすることをさらに含む。ある実施態様においては、方法は、バリア塩層の上にポリマー及び／又は色素を含む外側のコーティング層をコーティングすることをさらに含む。
【００３７】
ある実施態様においては、方法は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む酵素含有コアの上にバリア塩層及び／又は一以上のコーティング層をコーティングすることを含む。ある実施態様においては、酵素含有コアは、トップスプレー流動床装置により生成される。ある実施態様においては、酵素含有コアは、高せん断造粒により生成される。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、
コア、
任意に、コアの上にコーティングされる塩層、及び
コアの上にコーティングされる酵素含有層を含み、ここで、酵素含有層が、コア又は塩層の上にコーティングされ、酵素含有層が、本明細書に記載のいずれかの方法に従って生成される不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有層である
ことを含む酵素含有顆粒を提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００３９】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、酵素含有層の上にコーティングされるバリア塩層をさらに含む。ある実施態様においては、酵素含有顆粒は、バリア塩層の上にコーティングされる外側のコーティング層をさらに含み、ここで外側のコーティング層がポリマー及び／又は色素を含む。
【００４０】
別の実施態様においては、本発明は、酵素含有コア及びバリア塩層及び／又はコアを囲んでいる一以上のコーティング層を含む酵素含有顆粒を提供し、ここで、コアが不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物含むことを特徴とする。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、顆粒中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、固体の状態で触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。
【００４１】
ある実施態様においては、酵素含有コアは、トップスプレー流動床装置により生成される。ある実施態様においては、酵素含有コアは、高せん断造粒により生成される。
【００４２】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載の任意の酵素含有顆粒を含む組成物を提供する。ある実施態様においては、その組成物は、洗剤組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、織物処理組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、動物飼料組成物である。別の実施態様においては、その組成物は、食品組成物である。
【００４３】
別の態様においては、本発明は、不溶性酵素、例えば、回収された不溶性酵素、及び微生物細胞及び／又は細胞残屑、を含む組成物を含む酵素含有液体製剤を提供する。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、微生物培養液から不溶性酵素の回収のための本明細書に記載の任意の方法に従って生成される。ある実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物培養液から不溶性酵素を回収することを含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性である。幾つかの実施態様においては、酵素は、液体製剤中にて酵素的に活性である（言い換えると、酵素は、触媒的に活性であるか、触媒のポテンシャルを有するか、生じるべき触媒作用の適切な条件下にて及び適切な溶剤中に溶解する場合触媒的に活性になる）。幾つかの実施態様においては、酵素含有液体製剤は、ポリオール、塩、保存剤、界面活性剤、及び抗酸化剤から選択される製剤成分の一以上をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤はポリオールをさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、塩をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、保存剤をさらに含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、界面活性剤をさらに含む。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載の任意の方法に従って生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を液体中に懸濁することを含む酵素含有液体製剤を調製する方法を提供する。
【００４５】
別の態様においては、本発明は、
（ａ）本明細書に記載の任意の方法に従って生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、及び
（ｂ）組成物中に不溶性酵素を溶解する工程
を含む酵素含有液体製剤を調製する方法を提供する。ある実施態様においては、方法は、工程（ｂ）の後及び工程（ｃ）の前に微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去する工程をさらに含み、それにより清澄液体製剤を生成する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１３に記載のように、洗剤中に保存後、実施例４に記載のように調製された、酵素含有顆粒の洗浄使用活性性能を示す。
【図２】図２は、洗剤中に保存後、実施例１、２、４、及び６において調整した顆粒の酵素的安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
本発明は、培養液から微生物細胞又は溶解された不溶性細胞残屑を除去せずに微生物発酵培溶液から不溶性酵素を回収し、製剤化するための方法を提供する。また、本発明は、本明細書に記載の方法に従って回収された、例えば、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む顆粒及び液体製剤を提供する。
【００４８】
特段の断りがない限り、本発明の実施は、当業者の知っている、従来の分子生物学（組み換え方法を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学、の従来の方法を使用する。そのような方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook他、1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel他、eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis他、eds., 1994); and Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990)の文献に十分説明される。
【００４９】
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。本明細書に記載されているものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施及び実験に用いられ得る。
【００５０】
数値域は範囲を限定する数値を含む。
【００５１】
他に示していない限り、それぞれ、核酸は５´から３´の方向において左から右へ記載され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボシキル基の方向において左から右へ記載される。
【００５２】
定義
本明細書にて用いる用語、「ポリヌクレオチド」は、任意の長さ及び任意の３次構造及び１本鎖又は複数鎖（例えば、１本鎖、２本鎖、三重螺旋、等）のヌクレオチドの重合体をいい、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの類似物又は修飾された形態を含み、修飾されたヌクレオチド又は塩基又はその類似物を含む。遺伝子コードは、縮重するので、２以上のコドンを、特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。使用条件下にて、ポリヌクレオチドが所望の機能性を維持する限り、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似物の任意のタイプを用いてよく、ヌクレアーゼ耐性（デオキシ、２´‐Ｏ‐‐Ｍｅ、ホスホロチオネート等）を増加する修飾を含む。また、ラベルを欠失又は捕捉の目的のために含んでよく、例えば、放射能又は非放射能ラベル又は例えば、ビオチンのような、アンカーを含む。また、用語ポリヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。ポリヌクレオチドは自然に発生し又は非自然に発生してよい。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は本明細書にて互換的に用いる。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、又は両方、及び／又は修飾された形態及び／又はそれらの類似物を含んでよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により割りこまれてよい。一以上のホスホジエステル結合は代替的な結合グループにより置換されてよい。これらの代替的結合グループは、次の態様を含むが、これらに限定されない。それは、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ(「チオエート（ｔｈｉｏａｔｅ）」)、Ｐ（Ｓ）Ｓ(「ジチオエート（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）」)、（Ｏ）ＮＲ２(「アミデート（ａｍｉｄａｔｅ）」)、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２「ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」)、により置換される。ここで、各Ｒ又はＲ’は独立的にＨ又は置換又は非置換のアルキル（１−２０Ｃ）であって、任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はアラルジルを含む。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同定される必要はない。ポリヌクレオチドは直鎖又は環状でよく、又は直鎖及び環状の一部の組み合わせを含む。
【００５３】
本明細書で用いる「ポリペプチド」は、アミノ酸を含む任意の組成物及び当業者によりタンパク質と認識される任意の組成物をいう。従来のアミノ酸残基のための１文字又は３文字コードは本明細書にて用いる。任意の長さのアミノ酸ポリマーをいうために、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は本明細書にて互換可能に用いられる。ポリマーは直鎖又は分岐鎖でよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸により割り込まれてよい。また、その用語は、自然に修飾されたアミノ酸ポリマー又は介在により修飾されたアミノ酸ポリマーを含み、ここで介在は、例えば、ジスフィルド結合形成、グリコシル化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化、又はラベル成分を結合するような任意の他の操作又は修飾である。また、その定義の中には例えば、アミノ酸の一以上の類似物（例えば、非天然アミノ酸等を含む）及び周知の他の修飾を含むポリペプチドを含む。
【００５４】
「ベクター」は、一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
【００５５】
本明細書にて用いる用語、「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される方法をいう。その方法は、転写及び翻訳を含む。
【００５６】
「発現ベクター」は、宿主においてコード配列の発現を可能にする適切な制御配列の一以上に作動可能に結合されたＤＮＡコード配列（例えば、遺伝子配列）を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は、転写を行うプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードしている配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。ベクターはプラスミド、ファージ粒子でもよく、単に潜在遺伝子の挿入体でもよい。適切な宿主へ形質転換されたら、ベクターは複製し、宿主遺伝子から独立して機能する可能性があり、又はある場合はその遺伝子自身へ組み込まれる可能性がある。プラスミドは、ベクターの形態として最も普通に用いる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし周知であるか又は周知になる発現ベクターの他の形態を含むものである。
【００５７】
「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。プロモーターは、誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。本発明に用いてよい誘導プロモーターの例は、誘導プロモーターである、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１であり、これに限定されない。
【００５８】
用語「作動可能に結合する」とは、要素が機能的に関連できるよう要素が並んでいることをいう。例えば、プロモーターが、コード配列の転写を制御する場合、プロモーターは、コード領域に作動可能に結合する。
【００５９】
用語「転写制御下にて」は、ポリヌクレオチド配列の転写が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動可能に結合することにより依存することを意味し、このことは当業者に周知である。
【００６０】
用語「翻訳制御下にて」は、ｍＲＮＡが形成された後におこる調節プロセスを示すことは周知である。
【００６１】
「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するＤＮＡセグメントをいい、コード領域の前後の領域、及び個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００６２】
本明細書にて用いる用語「宿主細胞」は、ポリペプチドの生産のための組み換え発現ベクターがポリペプチドの発現のためにトランスフェクションされた細胞又はセルラインをいう。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然に、偶然に、又は意図的な変異によって、オリジナルの親細胞に必ずしも完全に同一（形態学的に又は総合的なゲノムＤＮＡ相補的に）である必要はない。宿主細胞は、発現ベクターとインビボでトランスフェクト又は形質転換した細胞を含む。「宿主細胞」は、糸状真菌株及び特にトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）株の細胞から創製された細胞及びプロトプラスト両者をいう。
【００６３】
細胞、核酸、タンパク質、又はベクターについて用いられる時、用語「組み換え体」は、異種の核酸もしくはタンパク質又は天然の核酸もしくはタンパク質の改変の導入により修飾された細胞、核酸、タンパク質、又はベクターを示す、又は細胞がそのように修飾された細胞由来していることを示す。つまり、例えば、組み換え細胞が、細胞の天然の形（非組み換え体）には見出されない遺伝子を発現し、異常に発現した天然遺伝子を発現し、遺伝子を不充分に発現し、又は全く発現しない場合をいう。
【００６４】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端部分に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞からタンパク質の成熟型の分泌を機能する。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。
【００６５】
用語「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、導入される核酸又はベクターを含む宿主の選択を容易にする宿主中の発現可能な遺伝子をいう。選択的マーカーの例は、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、文脈次第で「を起源とする（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」、「から得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ）」、「から得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ ｆｒｏｍ）」、から「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」、及び「から創生される（ｃｒｅａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」を意味する。
【００６７】
用語「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態いう（Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New Yorkを参照願いたい）。これらの菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合ポリサッカロイドからなる細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の延長によるものであり、炭素異化は、絶対的好気性による。本明細書にて糸状菌親細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（トリコデルマ ロンギプラチアタム（Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として以前分類及び現在ヒポクレア ジェコリアナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）としても知られる）、トリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ））、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ.）（例えば、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフミコーラ グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ））、クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）（例えば、クリソスポリウム ルクノウエンス（Ｃ. ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ.）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例えば、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、及びアスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ））、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ.）、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ.）、ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ.）、又はエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐ.）（また、Innis 他 (1985) Sci． 228:21-26を参照願いたい)を含むがこれらに限定されない。
【００６８】
本明細書にてもちいる用語、「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」は、従来又は現在トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類される任意の真菌属をいう。
【００６９】
用語「培養する」は、液体又は固体培地において成長に適切な条件下にて、微生物細胞の集団を増殖することをいう。
【００７０】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「異種の（heterologous）」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。いくつかの実施態様においては、タンパク質は、商業的に重要な産業用タンパク質である。その用語は、自然的に発生する遺伝子、変異された遺伝子、及び／又は合成遺伝子によりコードされるタンパク質を含むことを意図する。ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「相同の（homologous）」は、宿主細胞中自然的に発生するポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。
【００７１】
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞の遺伝子（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ取り込まれ、自律レプリコンへ転換し、又は一時的に発現する原核細胞又は真核細胞への核酸配列の取り込みに関することを含む。
【００７２】
本明細書にて用いる用語「形質転換される」、「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして保持される外来種（例えば、異種の）の核酸配列を有することを意味する。
【００７３】
用語、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合する少なくとも一つの成分から除去される物質（例えば、タンパク質、核酸、又は細胞）をいう。例えば、これらの用語は、例えば、自然のままの生物系など、その天然状態中に見られるように通常それを伴っている成分が、実質的又は本質的に無い物質をいうことができる。
【００７４】
本明細書にて用いる用語「回収される」は、微生物培養液の一以上の溶解性成分から酵素の少なくとも一部の分離、及び／又は例えば、培養液中の水又はエタノールのような一以上の溶剤から少なくとも一部の分離をいう。回収される酵素は、しばしば回収プロセス前より高い純度である。しかしながら、いくつかの実施態様においては、回収される酵素は、回収プロセス前より同じか低い純度でもよい。
【００７５】
用語、「分泌タンパク質」は、細胞から遊離されるポリペプチドの領域をいう。いくつかの実施態様においては、分泌タンパク質は、組み換え融合ポリペプチドから放出又は切断されるタンパク質である。
【００７６】
用語、「分泌」は、宿主細胞において膜から細胞外スペース及び周りの培地へ通過するタンパク質の選択的動きをいう。
【００７７】
本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下にて、単位時間当たり酵素調製物によって産物に転換される基質のモル数をいう。特異的活性は単位（Ｕ）／タンパク質のｍｇとして表わされる。
【００７８】
本明細書にて用いる、「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」の用語は、汚れた物の洗浄用洗浄媒体において使用を意図する混合物に関して用いる。幾つかの好ましい実施態様において、この用語は、布地及び／又は衣類の洗濯に関して用いる（例えば、「洗濯洗剤」）。別の実施態様においては、この用語は食器、刃物など洗浄に用いるもののような他の洗剤（例えば、「食器洗浄洗剤」）をいう。本発明は任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定することを意図しない。実際、この用語は界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤、及び安定化剤を含む洗剤が考えられる。
【００７９】
本明細書にて用いる用語「殺菌」は、表面から混入物の除去、並びに、ものの表面上の微生物の阻害又は死滅をいう。本発明は任意の特定の表面、もの、又は取り除くべき混入物又は微生物に限定しない。
【００８０】
「微生物培養液」又は「発酵培養液」は、微生物の（例えば、細菌の又は真菌の）細胞が増殖する成長培地及び本明細書に記載のように酵素の発現に適した成長培地をいう。
【００８１】
「不溶性酵素」は、固相に存在する酵素をいう。不溶性酵素は固相及び液相、例えば、微生物培養液の固相及び液相の分離の際固相を用いて分離される（即ち、パーティション）。微生物培養液全体において、固相の一部である不溶性酵素に加えて、一般的に、幾つかの酵素が、培地中液相に見られることも理解できる。不溶性酵素は、細胞固形物又は他の固形成分など、微生物培養液中固形物に生じてよく、微生物培養液内で沈殿又は結晶化されてよい。
【００８２】
本明細書にて用いる「可溶化」又は「溶解する」は、酵素の沈殿を生じさせる又は不溶性形態中に酵素を維持させる条件又は物質の除去、又は物理的条件の変化（例えば、温度の変化、混合、超音波処理）又は不溶性酵素を溶解性の状態にさせる可溶化物質（例えば、可溶化溶剤、例えば、水、ポリオール類、塩類、酸類、塩基類、界面活性剤類）の添加をいう。
【００８３】
不溶性酵素を「精製すること」又は不溶性酵素の「精製」は、目的としない成分、例えば、目的としない微生物培養液の液体成分を部分的又は完全に除去することによる目的の酵素の精製をいう。精製酵素含有組成物は、酵素が精製された混合物より一以上の成分の量が低い。
【００８４】
サンプル中、酵素の「純度」は、乾燥固体の全体量で酵素活性を割ることにより計算できる。乾燥固体は液体が除去された後すべての物質の存在の尺度となる。乾燥固体は、とりわけ、タンパク質、塩、炭水化物、代謝産物、核酸、脂質、細胞、細胞残屑、及び消費した発酵培地を含むことができる。酵素純度は、乾燥固体中の成分の一以上に関連する割合として表現できる。
【００８５】
「細胞残屑」は、細胞膜破壊後、つまり、微生物細胞の溶解後、放出される細胞壁及び他の不溶性細胞の成分をいう。
【００８６】
「培養液調整」は、後の工程での培養液操作に関する特性を改善するために設計された微生物発酵培養液の前処理をいう。培養調整液は、培養液の化学成物及び／又は物理的特性及び／又はレオロジー的特性を変化させ、下流の回収及び／又は製剤化プロセスにおいてその使用を機能させる。培養液調整は、更なる処理をせずにｐＨ変化、加熱処理、冷却、添加剤の添加（例えば、カルシウム、塩、凝集剤、還元剤、酵素活性化剤、酵素阻害剤、及び／又は界面活性剤）、混合、及び／又は培養液の時間に制限を設けた維持（例えば、０．５から２００時間）など、一以上の処理を含んでよい。
【００８７】
「ＡＴＣＣ」はマナッサス、バージニア、２０１０８に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）をいう。
【００８８】
「ＮＲＲＬ」はアグリカルチャー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナルセンター・フォー・アグリカルチャー・ユーティリゼーション・リサーチ（以前はＵＳＤＡ ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーとして知られる）ピオリア、イリノイをいう。
【００８９】
「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００９０】
回収方法
本発明は、微生物培養液から細胞又は細胞残屑を除去せずに、微生物培養液（即ち、酵素を発現する細胞が増殖した微生物の発酵培地）から不溶性酵素を回収する方法を提供する。不溶性酵素の回収は、微生物培養液の可溶性成分から、不溶性酵素を部分的に又は実質的に完全に分離すること、言い換えると、微生物培養液の可溶性成分の少なくとも一部分から不溶性酵素を分離することを含む。本明細書に記載の回収プロセスは、目的の不溶性酵素を一以上含む発酵培養液を細胞又は細胞残屑の除去をせずに、使用のための製剤化されうる目的の回収酵素へ転換する。
【００９１】
ある実施態様においては、方法は、酵素を発現する微生物細胞が増殖した微生物培養液及び酵素の少なくとも一部が不溶性である微生物培養液を提供すること、及び細胞を除去せずに不溶性酵素を回収すること、それにより回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成することを含む。別の実施態様においては、発現された酵素は、微生物培養液中可溶性であり、酵素の少なくとも一部が、沈殿剤の一以上の添加により、不溶性の状態になる。別の実施態様においては、酵素は、微生物細胞により発現されず、微生物細胞が増殖した微生物培養液に添加される。微生物培養液に添加された酵素は、不溶性であるか又は溶解性で、一以上の沈殿剤の添加により不溶性の状態となり得る。微生物細胞は、不溶性酵素の回収前に又は後に溶解してよく、不溶性細胞残屑を生成する。
【００９２】
幾つかの実施態様においては、発現された溶解性又は不溶性酵素を含む微生物培養液を外部的に生成された溶解性又は不溶性酵素を含む組成物と組み合わせる。一以上の沈殿剤を少なくとも一つの酵素（微生物培養液を生産した微生物細胞により発現された酵素及び／又は微生物培養液に添加された酵素）を不溶性にするように添加する。
【００９３】
幾つかの実施態様においては、液相の少なくとも一部が微生物培養液から除去される時、溶解性酵素は不溶性酵素と一緒に回収されてよい。
【００９４】
一般的に、回収された不溶性酵素は、封入体として存在する。
【００９５】
幾つかの実施態様においては、別個の微生物発酵からの微生物培養液の２以上を組み合わせ、及び不溶性酵素の一以上を組み合わせた微生物培養液から回収する。
【００９６】
本発明の方法は、不溶性酵素は酵素的に活性である。即ち、酵素的反応を触媒できる。不溶性酵素は、触媒的ポテンシャルを有し、即ち、酵素が不溶性の形態中において及び／又は溶剤中に可溶化となった後、及び触媒活性が生ずるのに適切な条件下にて触媒的に活性である。ある実施態様においては、不溶性酵素が不溶性形態中及び可溶化後両方において触媒的に活性である。ある実施態様においては、不溶性酵素は、不溶性形態中不活性であり、可溶化後触媒的に活性になる。
【００９７】
種々の実施態様においては、酵素の少なくとも約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％が、不溶性酵素の回収前に微生物培養液中に不溶性である。いくつかの実施態様においては、不溶性酵素の純度は、不溶性酵素の回収後少なくとも約１０％増加する。
【００９８】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液中の不溶性酵素の回収は、例えば、濃縮及び／又は透析ろ過によるものを含んでよい。不溶性酵素を含む微生物培養液は、培養液の溶解性部分の少なくとも一部を除去するように周知の技術の一以上により、濃縮してよく、それにより、培養液中の不溶性酵素の濃度が増加する。周知の技術は、膜処理（例えば、限外ろ過、精密ろ過、ナノフィルタレーション）、遠心分離、及び抽出を含むが、これらに限定されない。濃縮に代えて、又は、濃縮と共に、透析ろ過を一般的に、水に対して微生物培養液を透析ろ過する膜処理を用いることにより、微生物培養液の溶解性部分の少なくとも一部を置換するために用いてよい。
【００９９】
本発明の方法では、微生物細胞を目的の酵素の発現に適した条件下にて、培養培地中で培養し、それにより、目的の酵素を含む微生物培養液を生成する。例えば、目的の酵素は、発現ベクターから宿主細胞中に発現してよい。目的の酵素を培養培地へ分泌してよく、又は分泌されずに細胞内に発現してよい。
【０１００】
培養培地に分泌される酵素は、細胞の増殖に用いる条件下にて、培養培地中で本来不溶性であってよく、又は酵素の不溶性が酵素の回収前に沈殿剤を添加することにより誘発されてよい。沈殿剤の例は、塩類（例えば、ＮａＣl、ＮａＳＯ４、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、約０．１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度）、高分子電解質（例えば、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、タンニン酸、ポリリン酸塩）、及び温度又はｐＨの変化、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。（Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul及びB. Mattiasson, ed., Marcel Dekker, Inc., pp.225-275; Bioseparations: Science and Engineering (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, pp. 243-271; Protein Purification: Principles and Practice (1994) R.K. Scopes, Springer, pp. 71-101.; Protein Purification Process Engineering (1994) R.G. Harrison, ed., Marcel Dekker Inc.,“Differential Precipitation of Proteins,” pp.115-208を参照願いたい。）
【０１０１】
また、溶解性酵素も例えば、基質‐酵素相互作用又は阻害剤‐酵素相互作用などの親和性相互作用により、例えば、親和性樹脂と接触することにより、不溶性の状態になってよい。
【０１０２】
細胞内に発現する及び分泌されない酵素は細胞の可溶化により放出してよい。放出された酵素をそれが放出される培養培地中の条件下では本来不溶性の物質であってよく、又は不溶性は、上述のように酵素の回収の前に沈殿剤の添加により誘発されてよい。
【０１０３】
本明細書に記載の目的の酵素を発現のために用いることができる微生物細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌の微生物又は真菌の微生物でよい。用いられ得る真核微生物の例は、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）種、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ.）及びフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）を含むが、これらに限定されない。用いられ得る原核微生物の例は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトミセス種(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．)、パントエア種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ.）、エシェリキア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ.）及びシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
不溶性の形態で発現される酵素又は例えば、沈殿剤の添加により、溶解性の形態で発現され、不溶性の状態にできる酵素は本明細書に記載の方法に従って回収されてよく、任意に、本明細書に記載のように粒状の又は液体の製剤中に製剤化してよい。いくつかの実施態様においては、酵素は、加水分解酵素、例えば、プロテアーゼ（細菌の（例えばスブチリシン）又は真菌類、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（アルファ又はベータ）、リパーゼ、又はセルラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、例えば、米国特許第４，７６０，０２５、ＥＰ特許第１３０ ７５６、又はＰＣＴ出願番号ＷＯ ９１／０６６３７に記載のスブチリシンである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ０８／１１２４５９に記載のアルファ‐アミラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、セルラーゼであり、例えば、マルチフェクトＬ２５０（商標）（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｌ２５０）、又はプラダックス（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ）であり、これらはGenencor, Division of Danisco US, Inc.から商業的に入手できる。いくつかの実施態様においては、酵素は、オキダーゼ、オキシゲナーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼ、ペクチン分解酵素、又はマンナナーゼ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施態様においては、酵素は、フィターゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ペルヒドロラーゼ酵素であり、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０５／０５６７８２に記載の酵素である。
【０１０５】
本明細書に記載の回収方法により、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が生産される。いくつかの実施態様においては、組成物は、傷が無い微生物細胞を含む。ある実施態様においては、傷が無い微生物細胞は、生きた微生物細胞である。ある実施態様においては、傷の無い微生物細胞は、死んだ細胞である。（例えば、発酵混合物のｐＨを、鉱物酸を用いる相溶性有機酸のｐＫａの約２ｐＨ単位以下に調整することにより、及び混合物に相溶性有機酸及び／又は有機酸塩の十分な量を添加し、実質的に完全な細胞死を与えることにより、細胞を死滅する方法を記載する米国特許第5,801,034を参照願いたい。）
【０１０６】
幾つかの実施態様においては、組成物は、可溶化された微生物細胞、即ち、微生物細胞の可溶化により生成された細胞残屑を含む。ある実施態様においては、方法は、不溶性タンパク質の回収前に、微生物細胞膜を破壊し、微生物細胞可溶化物を生成することを含む。微生物培養液中に溶解する酵素及び一以上の沈殿剤の添加により誘発される不溶性の酵素の場合において、微生物細胞膜の破壊が、沈殿剤の添加前又は後いずれかで生じてよい。いくつかの実施態様においては、細胞膜の破壊は、細胞が微生物細胞を可溶化できる酵素、例えば、リゾチーム酵素と接触することにより達成される。ある実施態様においては、微生物細胞を可溶化できる酵素で可溶化した細胞をさらに均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成する。他の実施態様においては、細胞膜の破壊は、機械的均質化により達成できる。
【０１０７】
本明細書に記載のように調製された一以上の不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有組成物を粒状又は液体の製剤に製剤化してよい。
【０１０８】
粒状製剤
低いダスティングの、安定した酵素顆粒を不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から生成してよい。幾つかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液は、上述の任意の回収方法に従って生成される。酵素顆粒は周知の方法により生成してよく、その例は、トップスプレー流動床コーティング装置で、ボトムスプレー式ウルスター（Ｗｕｒｓｔｅｒ）コーティング装置で、又はドラム造粒（例えば、高せん断粒状）押し出し成型、又はパンコーティングである。
【０１０９】
本発明は、例えば、上述のような回収方法を通して生成された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供し、組成物を含む酵素含有顆粒を生成し、ここで、顆粒中の不溶性酵素が、酵素的に活性であるとき、即ち、生じるべき触媒活性のために適切な条件下、酵素が基質と接触する時、酵素的に活性化できることを特徴とする、酵素含有顆粒を作成する方法を提供する。酵素は、例えば、酵素含有顆粒の使用において、生じるべき酵素活性のために適切な条件下にて、基質存在下、不溶性形態中及び／又は溶剤に溶解している場合、触媒的に活性である。ある実施態様においては、酵素は不溶性形態中及び可溶化後両方において触媒的に活性である。ある実施態様においては、酵素は不溶性形態中不活性であり、可溶化後、触媒的に活性になる。
【０１１０】
ある実施態様においては、酵素含有顆粒をトップスプレー流動床装置で生成する。ある実施態様においては、上述のような不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有層をトップスプレー流動床装置でコアの表面上にコーティングする。任意に、顆粒は、コアと酵素含有層の間に塩層を含んでよい。塩は、例えば、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、又はそれらの混合物から選択されてよい。一以上の更なる層を酵素含有層の表面上にコーティングしてよい。例えば、バリア塩層を酵素含有層の表面上にコーティングしてよい。幾つかの実施態様においては、外側コーティング層の一以上を酵素含有層の表面上、又は酵素含有層の表面上にコーティングされたバリア塩層の表面上にコーティングしてよい。外側コーティング層は、例えば、ポリマー及び／又は色素を含んでよい。
【０１１１】
幾つかの実施態様においては、上述のように、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物は、コアの中に取り込まれ、一以上の層は酵素含有コアの表面上にコーティングされる。例えば、バリア塩層は、酵素含有コアの表面上にコーティングされてよい。幾つかの実施態様においては、一以上の外側コーティング層は、酵素含有コアの表面上、又は、酵素含有コアの表面上にコーティングされたバリア塩層の表面上にコーティングされてよい。外側コーティング層は、例えば、ポリマー及び／又は色素を含んでよい。
【０１１２】
いくつかの実施態様においては、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む顆粒を高せん断造粒など、ドラム式造粒により生成する。そのような顆粒は、酵素含有コア（不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む）及びコアを覆うコーティング層の一以上を含む。そのようなコーティング層は、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコール等、ポリマー、二酸化チタン又はグリセロールなど色素を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
また、本発明の顆粒は、可塑剤、充填剤、及び潤滑剤などのような成分をさらに含んでよいが、これらに限定されない。
【０１１４】
本発明は、コア及びコアの周りの層中の酵素含有組成物又はコアに取り込まれている酵素含有組成物、及び任意に一以上の追加的な層を含む酵素含有顆粒を提供する。酵素含有組成物は、例えば、上述のように生成した不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は微生物細胞残屑を含む。不溶性酵素は、顆粒中で酵素的に活性であるとき、つまり、生じるべき触媒活性のために適切な条件下、酵素が基質と接触する場合、酵素的に活性化されうる。また、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物中の溶解性酵素（例えば、溶解性酵素及び細胞及び／又は細胞残屑を有する微生物培養液）も本明細書に記載のように、粒状の製剤において製剤設計してよい。
【０１１５】
本発明の顆粒は低いダストを有する。例えば、ホイバッハ摩耗試験により測定して、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、２、１、又は０．５ ｍｇ／ｐａｄ未満である。周囲の湿度及び温度条件下にて貯蔵される場合、顆粒は安定であるが、使用時に、水と接触して溶解又は分散し、酵素を放出する。
【０１１６】
保護コーティングの無い小さな顆粒は、酵素顆粒製造プラント中及び使用者の製造プラントでの両方で、空気輸送及び充填作業の間、大量のダストを発生させる。ダストは、衛生問題及び製造問題の両方を生じうるので、出来る限り最小限にすべきである。いくつかの産業用試験が、摩耗に対する機械的耐性及び異なる粒状の酵素製剤のダスティング形成を測定するために開発されてきた。これらは、ホイバッハ摩耗試験及びエルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）試験を含む。ホイバッハ試験は、回転するパドルを用いて、シリンダーチャンバー内に含まれる顆粒床を通って、鋼球を転がし、及び同時にその床を通って空気流をいきわたらせ、発生する任意のダストをはぎ取ることにより、対象粒子を所定の粉砕化及び流動化する力で評価する。発生したダストは、チューブを通して吸引により引きつけられ、ホイバッハチャンバーの外でフィルターパッド上に沈殿される。回収されたダストの重量又は活性成分をホイバッハダストと呼ぶ。エルトリエーション試験において、顆粒を背の高い試験管内でガラスフリット上に置き、一定の時間の間にわたって、一定の乾燥空気流で流動化する。ホイバッハ及びエルトリエーションダスト試験の原理、操作、及び限定の説明は例えば、“Enzymes In Detergency” ed. Jan H. van Ee., Ch. 15, pgs. 310 − 312, (Marcel Dekker, Inc. New York (1997)及び本明細書に引用される文献に記載される。また、ホイバッハダスト試験は米国特許第５，３２４，６４９、５，８７９，９２０、及び７，１０８，８２１に記載される。
【０１１７】
コアは、顆粒の内側の核である。本発明にて用いるために有用なコアは、好ましくは、高い水和性の物質（言い換えると、水中にて容易に分散又は溶解する物質）である。コア材料は、真性水溶液への移行により、水中で分散（水和された時に分散される）しても、又は水中で溶解してもよい。クレイ（ベントライト、カオリン）、ノンパレイル及び凝集ジャガイモデンプンは、分散すると考えられる。ノンパレイルは、コーティング装置で粉体及び溶液の層をシードクリスタルに結合することにより、球状体の表面上に構築され及び球状へ丸くしたシードクリスタルからなる球状粒子である。一般的に、ノンパレイルは、スクロースなど糖及びトウモロコシデンプンなど粉体の組み合わせから作られる。適切なコアは、スクロース結晶、塩化ナトリウム、又は硫酸ナトリウムシード、及び硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムなどで構成されてよい他の無機塩を含むシード結晶物質をさらに含む。
【０１１８】
無機塩及び／又は糖及び／又は小さい有機分子から構成される顆粒は、本発明のコアとして用いてよい。コアの中に取り込んでよい適切な水溶性成分は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、尿素、クエン酸、スクロース、乳糖等を含む。水溶性成分は水分散性成分と組み合わせることができる。本発明のコアは、次の一以上をさらに含んでよい。それは、活性成分、ポリマー、充填剤、可塑剤、繊維材料、増量剤及びコアに用いるのに知られる他の化合物である。適切なポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール、酸化ポリエチレン、及びポリビニルピロリジンを含む。ＰＶＡは、部分的に加水分解された（７０−９０％）、中程度に加水分解された（９０−９８％）、完全に加水分解された（９８−９９％）、かなり加水分解された（９９−１００％）ＰＶＡ又は低粘度から高粘度を伴うそれらの混合物でよい。
【０１１９】
本明細書に記載される酵素含有顆粒のコアは、一以上の無機塩又はスクロース結晶からなってよい。いくつかの実施態様においては、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カルシウム、又はそれらの組み合わせからなる。ある実施態様においては、コアは、硫酸ナトリウムからなる。
【０１２０】
コアに用いるために有用な充填剤は、嵩高さを加え及びコストを低減するために用いる不活性物質、又は最終顆粒中に意図された酵素活性を調整の目的のために用いる不活性物質を含む。充填剤などの例は、尿素、塩類、糖類、及びクレイ、タルク、シリケート、カルボキシメチルセルロース及びデンプン類などのような水溶性剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明のコアに用いるために好適な可塑剤は、そのガラス転移温度を低減するためにポリマーに添加された不揮発性溶剤であり、それにより、もろさが低減し、及び変形能が増強される。一般的な可塑剤は、低分子量の有機化合物であり、特に可塑化されるポリマーに高い特異性がある。その例としては、糖類（グルコース、フルクトース、及びスクロース等）、糖アルコール（ソルビトール、キシリトール、及びマルチトールなど）、ポリオール（例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールなど多くのヒドロキシラジカル基を有するアルコールのような多価アルコール）尿素又はジブチル又はジメチルフタレートなど他の知られる可塑剤など極性の低分子有機化合物、又は水を含むがこれらに限定されない。
【０１２２】
本発明のコア中に用いるために有用な繊維物質は、高い引張強さを有する物質及び１から５０ミクロンの直径及び少なくとも直径の４倍に等しい長さを有する微細なフィラメントに形成できる物質を含む。一般的な繊維物質は、セルロース、グラスファイバー、メタルファイバー、ゴムファイバー、アズロン（トウモロコシ、ピーナッツ、及び牛乳中に自然的に発生するたんぱく質から製造される）及び合成ポリマーファイバーを含むが、これらに限定されない。合成物は、レイヨン（商標）（Rayon）、ナイロン（Nylon）、アクリル、ポリエステル、オレフィン、サラン（Saran）スパンデックス（Spandex）及ビナル（Vinal）を含む。典型的なセルロースファイバーは直径約３０ミクロンを有する１６０ミクロンの平均繊維長さを有する。
【０１２３】
コアは、周知の多様な造粒方法により加工でき、結晶化、沈殿、パンコーティング、流動床コーティング、回転式噴霧、押し出し成形、球状化、ドラム式造粒、及び高せん断凝集を含む。
【０１２４】
本発明のある実施態様においては、コアは、任意にさらにコーティングできる水溶性又は分散性ノンパレイル（上述のように糖でも又は塩でも）又は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）単独でも、二酸化チタン、タルク、又は、スクロース若しくはポリオールなど可塑剤のような抗凝固剤と組み合わせても用いるシードクリスタル（ノンパレイル）から構築される水溶性又は分散性ノンパレイルである。ノンパレイルのコーティング中ＰＶＡのレベルは、コーティングされるノンパレイルの重量の約０．５％から２０％存在してよい。
【０１２５】
一般的に、本明細書に取り込まれる任意の活性成分を含むコアは、衝撃感度粒子である。しかしながら、本発明は、コアのタイプにより限定されず、多くの特許及び刊行物は、本発明に用いられるコアを記載し、引用文献はUSP 5,879,920、USP 4,689,287及びWO 00/24877である。
【０１２６】
酵素
一以上不溶性酵素を本発明の低いダスティングの、安定的な酵素顆粒中に用いてよい。上述のように調製される、一以上の不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有組成物は、本明細書に記載する顆粒に取り込まれてよい。
【０１２７】
いくつかの実施態様においては、酵素は、一般的に加水分解酵素、例えば、プロテアーゼ（細菌の（例えばスブチリシン）又は真菌類、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（アルファ又はベータ）、リパーゼ、又はセルラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素は、例えば、米国特許第４，７６０，０２５、ＥＰ特許第１３０ ７５６、又はＰＣＴ出願番号ＷＯ ９１／０６６３７に記載のスブチリシンである。いくつかの実施態様においては、酵素は、ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のアルファ‐アミラーゼである。いくつかの実施態様においては、酵素はセルラーゼであり、例えば、マルチフェクトＬ２５０（商標）（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｌ２５０）、プラダックス（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ）であり、これらはGenencor, Division of Danisco US, Inc.から商業的に入手できる。いくつかの実施態様においては、酵素は、オキダーゼ、オキシゲナーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼ、ペクチン分解酵素、又はマンナナーゼ又は、それらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様においては、酵素は、フィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、酵素は、ペルヒドロラーゼ酵素を含み、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０５／０５６７８２に記載の酵素である。いくつかの実施態様においては、酵素は、基質（例えば、汚れ）を加水分解できる。
【０１２８】
ある態様において、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物中の一以上の不溶性酵素は、顆粒のコアに取り込まれる。別の好ましい態様においては、微生物細胞及び／又は細胞残屑に含まれる組成物中の一以上の酵素は、コアの周りに積層される。コアの周りに積層された場合、酵素を含む層は、ポリマーなどバインダーをさらに含む。例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのビニルポリマーである。
【０１２９】
任意に、酵素を含む層は、酵素含有組成物に加えて一以上の他の成分をさらに含んでよい。そのような非酵素成分は、ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール）、糖（例えば、スクロース、サッカロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトデキストリン）、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、化学的又は物理的修飾デンプン）、デキストリン、消泡剤（例えば、Ｆｏａｍｂｌａｓｔ ８８２ (Emerald Foam Control)、Ｅｒｏｌ ＤＦ ２０４Ｋ (Ouvrie PMC)、ＤＧ４３６ (ODG Industries, Inc.)、ＫＦＯ ８８０ (KABO Chemicals, Inc.)のようなポリエーテルポリオール）、糖アルコール（例えば、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール）、界面活性剤（例えば、Ｎｅｏｄｏｌ ２３−６．５（Shell Chemical LP, Houston, TX)及び Ｌｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ６５ (BASF)のようなアルコールエトキシレート）、及び再付着防止剤（例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ ＳＲＰ６ (Rhodia, Inc.)、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＮ−１００又はＳＲＮ−１７０ (Clariant GmbH)、Ｓｏｒｅｚ−１００(ISP Corp.)のようなポリエチレングリコールポリエステル）を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
「消泡剤」は泡を防ぎ、泡を壊すために用いる化合物である。また、これらは、デフォーマー（ｄｅｆｏａｍｅｒ）又はデフォーマー剤（ｄｅｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）といわれる。これらの化合物は液体の表面弾性を減少し、準安定性な泡の形成を防ぐ界面活性物質である。液体の表面弾性及び界面活性物質の間で平衡に達する性質の結果として泡が壊れる。(Vardar-Sukan (1991) Recent Adv. Biotechnol. 113-146)。本明細書に記載の顆粒に有用な消泡剤は、一般的にバイオプロセス中の使用に適している。適切な消泡剤は、脂質、油、ワックス、脂肪酸、又はエステル、アルコール、硫酸塩、スルホン酸塩、脂肪酸、石鹸、窒素化合物、リン酸塩、ポリグリコール、硫黄化物、チオ化合物、シロキサン及びハロゲン化及び無機化合物を含むが、これらに限定されない。(Ghildyal (1988) Adv. Appl. Microbiol. (1988) 33:173-222)。いくつかの実施態様においては、油、脂肪酸、エステル、ポリグルコール、及びシロキサンが有用である。いくつかの実施態様においては、消泡剤は、エチレンオキシドプロピレンオキシドコポリマーである。ある実施態様においては、オキシドプロピレンオキシドコポリマーは、約２２００の分子量(例えば、Ｍａｚｕ（商標）としてMazer Chemicals, Inc.から入手可能である)を有する。
【０１３１】
本発明の顆粒を酵素固形物（上述のように生成された、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑）の重量に基づき０．０１％から５０％又は７５％を含んでよい。種々の実施態様においては、顆粒は、少なくとも約０．５、５、１０、２０、３０、又は４０％重量の酵素固形物を含んでよい。任意のバインダー及び本明細書に記載の他の成分を含む酵素固形物を含む層は、顆粒の重量に基づき、約０．２％から７０％又は８０％の間を含んでよい。
【０１３２】
いくつかの実施態様においては、２０センチポイズ未満の粘度を有する酵素含有層により、凝集が生じないように造粒できる。
【０１３３】
コーティング層
本発明の顆粒は、一以上の他のコーティング層をさらに含んでよい。コーティング層は、顆粒の最終用途に応じて任意の多くの機能に役立ってよい。例えば、コーティングは、活性成分、特に酵素に漂白による酸化に対する耐性を与え、コーティング層は、顆粒を水性媒体へ導入する時に所望の溶解速度を与え、又は顆粒の保管安定性を増強し及び顆粒内で微生物の増殖の可能性を低減するために環境湿度に対して防壁となりうる。
【０１３４】
本発明の実施態様においては、コーティング層は、一以上のポリマー、及び任意に、低残渣色素又は潤滑剤など他の賦形剤を含む。そのような賦形剤は、当業者に知られている。さらに、コーティング剤を同じ又は異なるカテゴリーの他の活性剤とともに用いてよい。
【０１３５】
適切なポリマーは、ＰＶＡ及び／又はＰＶＰ又は両者の混合物を含む。もしＰＶＡが用いられる場合、ＰＶＡは、部分的に加水分解された、完全に加水分解された、又は中程度に加水分解されたＰＶＡであって、低度から高程度の粘度を有するＰＶＡ（好ましくは、低粘度を有する部分的に加水分解されたＰＶＡ）でよい。有用な他のビニルポリマーは、ポリビニルアセテート及びポリビニルピロリドンを含む。例えば、有用なコポリマーは、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマーを含む。ＰＥＧなど他のポリマーは外側の層に用いてもよい。これらのさらなるコーティング層は、一以上の次のものをさらに含む。それは、可塑剤、色素、界面活性剤又は静電気防止剤などの潤滑剤及び任意に追加的な酵素である。本発明のコーティング層に用いるのに好適な可塑剤は、本明細書に既に記載したものである。本発明のコーティング層に用いるのに好適な色素は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムなど微細に分割されたホワイトナー、又は着色色素又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好ましいそのような色素は、溶解時、低残渣色素である。
【０１３６】
本明細書にて用いる「潤滑剤」は、表面の摩擦を低減する、顆粒の表面を滑らかにする、静電気を低減する、又は顆粒のもろさを低減する任意の物質をいう。また、潤滑剤は、コーティングプロセスでのバインダーの粘着性を低減することにより、コーティングプロセスを改善する点で関係する役割もまたになう。つまり、潤滑剤は、抗凝集剤及び湿潤剤として働くことができる。
【０１３７】
好適な潤滑剤は、界面活性剤（イオン性、非イオン性、又はインイオン性）、脂肪酸、抗静電気剤、及び防塵剤を含むが、これらに限定されない。好ましい潤滑剤は、界面活性剤、及びより好ましくは、９から１５炭素原子鎖の長さのアルカン又はアルケン直鎖、第一級アルコール又はそれら、エトキシレート又はエトキシサルフェート誘導体などアルコールをベースとした界面活性剤である。そのような界面活性剤は、Shell International Petroleum Company製のネオドール（商標）（Neodol）製品ラインとして商業的に入手可能である。他の適切な潤滑剤は、スタティックガード（商標）（StaticGuard）、ダウニー（商標）（Downey）、トリトン（Triton） X100又は120等のような抗静電気剤、テフロン（Teflon）等のような防塵剤、又は当業者に知られている他の潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
バインダー、構造化剤、及びバリア層など、他の中間層を含んでよい。好適なバリア物質は、例えば、無機塩、糖類、又は、有機酸又は塩類を含む。構造化剤は、ポリサッカロイド類又はポリペプチドでよい。好ましい構造化剤は、デンプン、修飾デンプン、カラギーナン、セルロース、修飾セルロース、アラビアゴム、グアーゴム、アカシアゴム、キサンタンゴム、ローカスビームゴム、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸を含む。好ましい、構造化剤は、低アレルギー性である。構造化剤２以上の組み合わせを本発明の顆粒中に用いることができる。バインダーは、糖類及び糖アルコール類を含むが、これらに限定されない。好適な糖類は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース及びマルトースを含むが、これらに限定されない。好適な糖アルコール類は、ソルビトール、マンニトール及びイノシトールを含む。
【０１３９】
バリア層
いくつかの実施態様においては、バリア層は、本明細書に記載のように、酵素含有顆粒中、酵素層表面又は酵素含有コアの表面にコーティングされる。いくつかの実施態様においては、バリア層は、例えば、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、及び／又は硫酸アンモニウムのような一以上の塩を含む。いくつかの実施態様においては、バリア層は、硫酸ナトリウムを含む、硫酸ナトリウムからなる、又は実質的に硫酸ナトリウムからなる。いくつかの実施態様においては、バリア層は、糖（例えば、スクロース）、ポリサッカライド（例えば、デンプン）、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１４０】
いくつかの実施態様においては、バリア層は水和物である。用語「水和した」は、バリア物質が遊離形態または結合形態、もしくはそれら２つの組合せで水を含有することを意味する。水和の水は、コーティングプロセス中またはその後のいずれかに加えてよい。水和の程度は、物質それ自体及び温度、それが適用される湿度及び乾燥条件の関数となる。
【０１４１】
「中程度又は高い」水分活性は少なくとも約０．２５、０．３０、又は０．３５の水分活性を有することを意味する。本明細書にて称される水分活性は、顆粒が顆粒上にコーティングされるバリア物質の一層を有する（が、さらなるコーティングが無い）場合の、その顆粒自身の水分活性をいう。さらなるコーティングは異なる層としてバリア物質の水分活性の正確な測定を困難にするおそれがある。
【０１４２】
理論で拘束されることを意図しないが、０．２５より大きい水分活性を有する物質が２５％より大きい相対湿度での貯蔵条件下に水分を取り込む駆動力を低減することが予想される。たいていの気候は２５％以上の相対湿度を有する。多くの洗剤は約０．３から０．４の範囲で水分活性を有する。顆粒の水分活性が、周囲の洗剤又は貯蔵天候のものより実際に高いならば、顆粒により水分を取り込む駆動力は除去され、さらに水分は顆粒からその周囲に放出されるに至る。たとえ顆粒の水分活性が洗剤又は対応する相対湿度の水分活性より低くても、バリア層に存在する水分は顆粒により取り込まれる水分の量を制限し、タンパク質コアに影響を与えるシールドとして働くだろう。
【０１４３】
塩水和物の場合、水和物物質は、結晶の結合水を有する結晶塩水和物である。その水和物は、得られるコーティングされる顆粒が０．２５を上回る水分活性を有するように、又は触感では乾燥している状態である顆粒を維持しながらできるだけ高い水分活性を有するような方法で選択され、適用されるべきである。塩水和物又は任意の他の適切な水和バリア物質をそのような方法にて、適用することにより、顆粒による水分のさらなる取り込みを誘発するすべての駆動力を除去する。重要な結果として、過ホウ酸塩又は過酸化物の陰イオンのような酵素活性に有害な物質の輸送の駆動力が除去される。媒体として水がない場合、これらの物質は、酵素コアへ浸透する可能性が低くなる。実験データは、顆粒中の酵素活性が安定な塩水和物で酵素コアをコーティングすることにより実質的に増強されることを示す。
【０１４４】
水和バリア層の生産のために有用な塩の例は、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸銅５水和物、リン酸ナトリウム２塩基性７水和物、硝酸マグネシウム６水和物、ホウ酸ナトリウム１０水和物、クエン酸ナトリウム２水和物及び酢酸マグネシウム４水和物を含む。
【０１４５】
外側のコーティング層
いくつかの実施態様においては、酵素含有顆粒は外側のコーティング層を含む。ある実施態様においては、外側のコーティング層を酵素層の表面にコーティングする。いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層を一以上の中間コーティング層の表面にコーティングする。ある実施態様においては、外側のコーティング層を酵素層の表面を又は酵素含有コアの表面をコーティングするバリア層の表面にコーティングする。
【０１４６】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層は一以上のポリマーを含む。適切なポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアセテート、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマー、ＰＶＰ−ＰＶＡコポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、キトサン、アラビアゴム、キサンタン、カラギーナン、ラテックスポリマー、及び腸溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層はＰＶＡを含む。外側のコーティング層中に含まれる有用なＰＶＡは、低粘度から高粘度を有する、部分的に加水分解される、完全に加水分解される、及び中程度に加水分解されるＰＶＡを含む。（例えば、米国特許第5,324,649を参照願いたい。）ある実施態様においては、外側のコーティング層は低粘度を有する部分的に加水分解されるＰＶＡを含む。
【０１４８】
いくつかの実施態様においては、外側のコーティング層は一以上の色素を含む。有用な色素の例は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムのような白い微粉、硫酸カルシウム、タルク、又は着色顔料又は染料を含むが、これらに限定されない。一般的にそのような色素は、溶解すると低残渣色素である。ポリマー及び／又は色素に加えて外側のコーティング層は可塑剤、増量剤、潤滑剤、界面活性剤、及び再付着防止剤の一以上を含んでもよい。
【０１４９】
有用な可塑剤は、ポリオール（例えば、糖類、糖アルコール類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ類）、グリコール、プロピレングリコール）、尿素、クエン酸トリエチル、フタル酸ジブチル又はジメチル、又は水を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
有用な増量剤は、糖類（例えば、スクロース、マルトデキストリン又はトウモロコシシロップ固形物のようなデンプン加水分解物）、クレイ（例えば、カオリン又はベントナイト）、及びタルクを含むが、これらに限定されない。「増量剤」は、別の物質（一般的に高いコスト及び高い性能）に加える物質（一般的に低いコスト）であり、物質を修飾し、希釈する。
【０１５１】
有用な潤滑剤は、非イオン界面活性剤類（例えば、Ｎｅｏｄｏｌ、Ｌｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ ６５）、牛脂アルコール類、脂肪酸類、脂肪酸塩類（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、及び脂肪酸エステル類を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
有用な界面活性剤は、Ｎｅｏｄｏｌ ２３−６．５及びＬｕｔｅｎｓｏｌ ＴＯ６５のようなアルコールエトキシレ−ト類を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
有用な再付着防止剤は、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ ＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＮ−１００又はＳＲＮ−１７０、及びＳｏｒｅｘ−１００のようなポリエチレングリコールポリエステル類を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
他の補助成分
補助成分を本発明の酵素含有顆に添加してもよい。補助成分としては、金属塩、可溶化剤、活性化剤、酸化防止剤、染料、阻害剤、結合剤、香料、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、尿素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンのような酵素保護剤／スカベンジャーやグリシン、グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸、ウシ血清アルブミン、カゼイン等などのようなタンパク質、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩を含む界面活性剤、ビルダー、アルカリまたは無機電解質、漂白剤、青味剤及び蛍光染料及び凝固阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
マトリックス顆粒
ある実施態様においては、顆粒は、糖又は糖アルコール及び構造化剤と組み合わせて混合された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含むタンパク質「マトリックス」を含む（EP1037968B1を参照願いたい。）任意に、バリア層を酵素含有マトリックスの表面上に積層してよく、又はバリア物質は酵素含有マトリックスに含まれてよい。また、任意にコーティングをシード粒子、シード粒子周辺の酵素マトリックス及び／又はバリア層の表面上に適用してよい。いくつかの実施態様においては、構造化剤はポリサッカライド又はポリペプチドである。マトリックスはコアを通して均一であり、又はシード粒子の表面上に積層してよい。シード粒子及びマトリックスの間又はマトリックス及びバリア層の間に一以上の層があり、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のようなコーティングである。マトリックス顆粒は、例えば、トップスプレー流動床装置で生成されることができる。
【０１５６】
酵素マトリックスが積層される時に不活性な粒子であるシード粒子は、無機塩類、糖類、糖アルコール類、有機酸又は塩類など小さな有機分子、クレイ又はシリケートなど鉱物類、又はこれらの２以上の組み合わせから構成できる。シード粒子に取り込まれるために好適な可溶性成分は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、尿素、クエン酸、クエン酸塩、ソルビトール、マンニトール、オレイン酸塩、スクロース、ラクトース等を含む。可溶性成分をタルク、カオリン、またはベントナイトなど分散成分と組み合わせてよい。シード粒子を多様な造粒方法により作成してよく、造粒方法は、結晶化、沈殿、パンコ−ティング、流動床コーティング、流動床凝集、回転式噴霧、押し出し成形、顆粒化、球状化、ドラム式造粒及び高せん断凝集を含む。本発明の顆粒において、シード粒子を用いる場合、シード粒子：顆粒の比は１：１である。
【０１５７】
好適な糖類は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース及びマルトースような糖を含む。好適な糖アルコール類は、ソルビトール、マンニトール及びイノシトールを含む。マトリックス中の糖又は糖アルコール対構造化剤の割合は、好ましくは、タンパク質マトリックスの重量に基づき０．１％から９０％である。マトリックス中の糖又は糖アルコールは、タンパク質に添加される糖又は糖アルコールで良く、又はタンパク質が存在する発酵培養液由来でよい。
【０１５８】
構造化剤はポリサッカライド又はポリペプチドでよい。化合物のこれらの分類は、高い分子量及び高い水の溶解度の同時に存在する所望の特性ある。理論に拘束されずに、構造化剤の高い分子量は、糖又は糖アルコールマトリックス単独での欠ている二つの重要な特性に寄与する。それは、
（１）粒子のダストになる性質を顕著に低減する粒子への凝集性及び強さを提供する、及び
（２）マトリックス構造を通してポリマーネットワーク又は「ケージ」を形成する理由により水及び小さい分子に対して拡散するバリアとして役立つことである。これは、顕著に顆粒の安定性を改善する。
【０１５９】
好ましい構造化剤は、デンプン、修飾デンプン、カラギーナン、セルロース、修飾セルロース、アラビアゴム、グアーゴム、アカシアゴム、キサンタンゴム、ローカスビームゴム、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸を含む。好ましくは、構造化剤は、低アレルギー性である。構造化剤２以上の組み合わせを本発明の顆粒中に用いることができる。
【０１６０】
酵素含有マトリックスは、一以上の合成ポリマー又は当業者が知っている他の賦形剤をさらに含んでよい。適切な合成ポリマーは、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドを含む。また、酵素含有マトリックスは、可塑剤及び抗凝集剤もさらに含んでよい。本発明の使用に有用な可塑剤は、グリセロール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリオール、尿素、又はクエン酸トリエチル、ジブチル又はジメチルフタレートなど他の知られる可塑剤、又は水を含む。好適な抗凝集剤は、微細な不溶性物質又はタルク、ＴｉＯ２、クレイ、アモルファスシリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び炭酸カルシウムなど溶けにくい物質を含む。
【０１６１】
マトリックス顆粒は、バリア層をさらに含むことができる。バリア層はマトリックス中のタンパク質または酵素に不利に影響し得る基質の拡散を遅くする、または防止するために使用できる。バリア層は、バリア物質から構成され、タンパク質コアの表面上にコーティングされ、又はバリア物質はタンパク質コア中に含まれていてもよい。適当なバリア物質としては、例えば、無機塩類又は有機酸類または塩類が挙げられる。また、タンパク質のないマトリックスをバリア層として用いることができる。
【０１６２】
また、本発明のマトリックス顆粒は、一以上のコーティング層を含んでよい。例えば、そのようなコーティング層は、例えば、そのようなコーティング層は１以上の中間のコーティング層、またはそのようなコーティング層は１以上の外側のコーティング層またはそれらの組合わせでよい。酵素顆粒の最終用途に依存して、顆粒組成物において多くの機能のいくつかを果たすことができる。例えば、コーティングは漂白剤による酸化に対して酵素耐性を与えることができ、水性媒体へ顆粒を導入する際に望ましい溶出速度を生じ、または酵素の貯蔵安定性を高めてかつ顆粒内の微生物の増殖の可能性を減少させるための周囲湿度に対する防壁となる。
【０１６３】
適切なコーティングは、水溶性ポリマー又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など水分散性フィルム形成ポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、キトサン、アラビアゴム、キサンタン、カラギーナン、キトサン、ラテックスポリマー、及び腸溶性コーティング剤を含む。さらに、コーティング剤を同じ又は異なるカテゴリーの他の活性剤とともに使用してよい。
【０１６４】
コーティング層中に含まれる有用なＰＶＡは、低粘度から高粘度を有する、部分的に加水分解される、完全に加水分解される、及び中程度に加水分解されるＰＶＡを含む。好ましくは、外側のコーティング層は低粘度を有する部分的に加水分解されるＰＶＡを含む。他の有用なビニルポリマーは、ポリビニルアセテート及びポリビニルピロリドンを含む。有用なコポリマーは、例えば、ＰＶＡ−メチルメタクリレートコポリマー及びＰＶＰ−ＰＶＡコポリマーを含む。さらに、本発明のコーティング層は、一以上の次のものを含む。それは、可塑剤、増量剤、潤滑剤、色素、及び任意に追加される酵素である。本発明のコーティング層に用いるために有用な可塑剤は、糖類、糖アルコール類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、尿素、グリコール、プロピレングリコール、又はクエン酸トリエチル、フタル酸ジブチル又はジメチルなどのような他に知られる可塑剤、又は水を含む。本発明のコーティング層に用いるために有用な色素は、二酸化チタン又は炭酸カルシウムのような白い微粉、着色顔料及び染料又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。好ましいそのような色素は、溶解すると低残渣色素である。有用な増量剤は、スクロースなどの糖類又はマルトデキストリン及びトウモロコシシロップ固形物などデンプン加水分解物、カオリン及びベントナイトなどクレイ及びタルクを含む。有用な潤滑剤は、Ｎｅｏｄｏｌなど非イオン界面活性剤、牛脂アルコール、脂肪酸、ステアリン酸マグネシウムなど脂肪酸塩及び脂肪酸エステルを含む。
【０１６５】
液体製剤
本発明は、例えば、上述のように回収される、微生物細胞及び／又は細胞残屑を有する組成物中に不溶性酵素を含む酵素含有液体製剤を提供する。酵素は、酵素的に活性である又は触媒的ポテンシャルを有する、言い換えると、液体製剤において、適切な溶剤中、及び生じるべき触媒活性のための条件下にて、試験又は使用適用中に触媒的活性を有し得る。種々の実施態様においては、液体製剤は、保存の間に製品の物理的及び生化学的特性を「安定させる」、言い換えると維持する製剤成分（安定化物質）を含んでよい。これは、次のものを含むが、これらに限定されない。それは、一以上のポリオール類、一以上の塩類、一以上の保存剤、又は一以上の緩衝塩（及びｐＨ調整のための酸又は塩基）、一以上の界面活性剤、一以上のアミノ酸類、一以上の抗酸化剤又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施態様においては、液体製剤は、約１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上のポリオール類、例えば、グルコース、スクロース、ソルビトール、グリセロール、ラクトース、デキストロース、プロピレングリコールを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約５０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の塩類、例えば、NaCl、CaCl2、Na2SO4、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルタミン酸１ナトリウム、塩化カルシウムを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約５％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の保存剤、例えば、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンを含む。幾つかの実施態様においては、液体製剤は、約０．１から約２０％（ｗ／ｖ）濃度で、一以上の緩衝塩、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳを含む。酸（例えば、酢酸若しくはギ酸など弱酸、又はHCl若しくはH2SO4など強酸）又は塩基（例えば、NaOH又はKOH）は、ｐＨ調整のために用いてよい。液体製剤を記載する引用文献に関しては、Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul and B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc., pp. 549-604を参照願いたい。
【０１６６】
また、本発明は、微生物細胞及び／又は細胞残屑を有する組成物中、例えば、上記のように回収される、不溶性酵素を含む液体製剤であって、ここで酵素が液体製剤中酵素的に活性であることを特徴とする製剤を調製する方法を提供する。ある実施態様においては、例えば、上述のように回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は微生物残屑を含む組成物を提供すること、任意に、液体中、典型的には水中に、上述のように、一以上の製剤成分、例えば、一以上のポリオール、一以上の塩、一以上の保存剤、及び／又は一以上の緩衝塩と組成物を混合することにより、部分的に又は完全に不溶性酵素を溶解すること、それにより液体製剤を生産することを含む。ある実施態様においては、方法は、例えば、上述のように回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供すること、不溶性酵素を溶解すること、任意に、液体中、典型的には水中に、例えば、上述のように、一以上の製剤成分、例えば、一以上のポリオール、一以上の塩、一以上の保存剤、及び／又は一以上の緩衝塩を有する組成物を回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物と混合すること、膜ろ過、及び／又は遠心分離など、例えば、ろ過により微生物細胞及び／又は細胞残屑を除くことにより溶解性酵素を含む組成物を清澄化にすること、それにより、清澄液体製剤を製造することを含む。
【０１６７】
組成物
本発明は、酵素含有顆粒又は上述のように液体製剤を含む組成物を提供する。酵素含有顆粒または液体製剤に加えて、組成物は、洗浄（例えば、洗剤）、織物処理、又は動物飼料、醸造、焼成、食品又は飲料水のような特定の利用にて顆粒又は液体製剤の使用に適する成分を含む。
【０１６８】
洗浄組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、洗浄性能及び／又は洗浄効果を提供するために例えば、洗濯又は食器洗浄に用いる洗剤のような洗浄組成物に含有される。洗浄組成物中に含有されるのに有用な酵素は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。一般的な組み合わせはアミラーゼと併せて、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／又はセルラーゼのような従来の適用酵素のカクテルである。
【０１６９】
また、例えば、洗浄性能を手助けし、又は増強するために、洗浄すべき物質の処理のために、又は香料、着色剤、染料などを有する場合のように洗浄組成物の美しさを修正するために補助的な材料も洗浄組成物中に含まれてよい。そのような補助的な材料は本明細書に記載の酵素含有顆粒に追加して、添加されるものである。これらの添加成分の正確な性質、及びその含有レベルは、組成物の物理的形態及びそれが用いられる洗浄操作の性質に依存する。適切な補助的な材料は、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料移動阻害剤、沈着補助剤（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｉｄｓ）、分散剤、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白促進剤、プリフォーム過酸、ポリマー分散剤、クレイ汚れ除去／再付着防止剤、光沢剤、泡立ち抑制剤、染料、香料、構造弾性剤、生地柔軟剤、担体、ヒドロトープ、処理補助剤及び／又は色素を含むが、これらに限定されない。下記の開示に加え、そのような他の補助的材料の適切な例及び使用のレベルは、米国特許第５，５７６，２８２、６，３０６，８１２、及び６，３２６，３４８に記載される。
【０１７０】
幾つかの実施態様においては、洗浄組成物はリン酸塩を含まない。幾つかの実施態様においては、洗浄組成物は、非リン酸塩含有食器洗浄洗剤である。幾つかの実施態様においては、非リン酸塩洗浄組成物は、非リン酸塩ビルダー、例えば、クエン酸塩を含む。
【０１７１】
界面活性剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、界面活性剤又は界面活性剤システムを含んでよく、ここで界面活性剤は非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤（ａｍｐｈｏｌｙｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、両性界面活性剤（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、半極性非イオン界面活性剤、及びそれらの混合物から選択される。一般的に界面活性剤は、対象の洗浄組成物の重量に基づいて、約０．１％から約６０％、約１％から約５０％又は約５％から約４０％のレベルで存在する。
【０１７２】
ビルダー
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステムを含んでよい。ビルダーを使用する場合、一般的に本明細書に記載の洗浄組成物は、その洗浄組成物の重量に基づいて少なくとも約１％、約３％から約６０％、又は約５％から約４０％のビルダーを含む。
【０１７３】
ビルダーはアルカリ金属、ポリリン酸アンモニウム及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸塩アルカリ金属、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダー、ポリカルボキシレート化合物、エーテル ヒドロキシポリカルボキシレート、エチレン又はビニルメチルエーテルを有する無水マレイン酸のコポリマー、１、３、５−トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、多様なアルカリ金属、エチレンジアミン４酢酸及びニトリル３酢酸のようなポリ酢酸のアンモニウム及び置換アンモニウム塩、及びメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボキシリック酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びそれらの可溶性塩のようなポリカルボキシレートを含むが、これらに限定されない。
【０１７４】
キレート剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上のキレート剤を含んでよい。適切なキレート剤は銅、鉄、及び／又はマンガンキレート剤及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。キレート剤を用いる場合、キレート組成物は、対象洗浄組成物の重量に基づき約０．１％から約１５％、又は約３．０％から約１０％のキレート剤を含んでよい。
【０１７５】
沈着補助剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の沈着補助剤を含んでよい。適切な沈着補助剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸のような汚れ放出ポリマー、及びカオリナイト、モントモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物等のクレイを含む。
【０１７６】
染料移動阻害剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の染料移動阻害剤を含んでよい。適切なポリマー製染料移動阻害剤は、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載の洗浄組成物に存在する場合、染料移動阻害剤は、その洗浄組成物の重量に基づき約０．０００１％から約１０％、約０．０１％から約５％、又は約０．１％から約３％のレベルにて存在してよい。
【０１７７】
分散剤
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の分散剤を含んでよい。適切な水溶性有機分散剤は、次のものを含むが、これらに限定されない。それは、ホモ−又はコポリマー酸又はそれらの塩を含み、ポリカルボン酸の場合には、２炭素原子を超えない間隔でお互いに分離しているカルボキシルラジカルを少なくとも２つ含んでいる。
【０１７８】
酵素安定剤
洗剤に用いることができる酵素は、多様な方法により安定化される。本明細書にて用いる酵素は、例えば、イオン等を酵素に提供する最終組成物において、カルシウム及び／又はマグネシウムイオンの水溶性の供給源の存在によって安定化される。
【０１７９】
触媒金属複合体
本明細書に記載の洗浄組成物は、一以上の触媒金属複合体を含んでよい。金属含有漂白触媒のひとつのタイプは、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン等の明らかな漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン、亜鉛又はアルミウムカチオン等の僅かな漂白活性を有するか又は漂白活性を有しない予備的な金属カチオン、及び触媒及び予備的な金属カチオンに明らかな安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、及びこれらの水溶性塩を含む触媒システムである。そのような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３に開示されている。本明細書にて用いるマンガン含有触媒は、周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２に記載される。本明細書にて用いるコバルト漂白触媒は、周知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７に記載される。そのようなコバルト触媒は、既知の方法で容易に調製することができ、例えば、米国特許第５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７に記載される。
【０１８０】
また、本明細書に記載の組成物は少なくとも１つのマクロポリサイクリックリジッドリガンド（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｒｉｇｉｄ ｌｉｇａｎｄ）、ＭＲＬとして略される遷移金属複合体、を含む。実際的には、これは限定するものではないが、本明細書に記載の組成物及び洗浄プロセスは水溶性の洗浄媒体中に、活性ＭＲＬ類が少なくとも１ｐｐｍのオーダーで存在するように調節可能であり、しばしば、約０．００５ｐｐｍから約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍから約１０ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍから約５ｐｐｍのＭＲＬが、洗浄液中に存在する。遷移金属漂白触媒における最適な遷移金属は、マンガン、鉄、及びクロミウムを含む。ある実施態様においては、ＭＲＬは、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンのような架橋固定された非常に強固なリガンドである。適切な遷移金属ＭＲＬは、既知の方法で容易に調製することができ、例えば、ＷＯ００／３３２６０１及び米国特許第６，２２５，４６４に記載される。
【０１８１】
本明細書に記載の洗浄組成物を表面又は織物上の場所を洗浄するために用いることができる。一般的に、少なくともその場所の一部は、原液の状態の中又は洗浄液で希釈された中で上述の洗浄組成物と接触し、それからその場所は、任意に洗浄及び／又は濯がれる。洗浄はゴシゴシ洗うこと、機械的攪拌を含むが、これらに限定されない。織物は、通常の消費者が使用する条件で洗濯できるほとんどの織物を含んでよい。開示する洗浄組成物は、一般的に溶液中約５００ｐｐｍから約１５，０００ｐｐｍまでの濃度にて洗浄してよい。洗浄溶剤が水の場合、一般的に水の温度は約５℃から約９０℃の範囲であり、その場所が織物を含む場合、水対織物の質量比は一般的に約１：１から約３０：１である。
【０１８２】
織物処理組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、織物処理組成物に含まれる。織物処理組成物に含有されるのに適切な酵素は、セルラーゼ、ペルヒドロラーゼ、ポリエステラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、ペクチナーゼ、及びラッカーゼを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様においては、織物処理組成物は、再付着防止剤（例えば、Ｒｅｐｅｌ−Ｏ−Ｔｅｘ、Ｓｏｒｅｚ １００ (ISP Corp.)）も含んでよい。
【０１８３】
動物飼料組成物
いくつかの実施態様においては、本明細書に記載の酵素含有顆粒又は液体製剤は、動物飼料組成物に含まれる。飼料組成物に含有されるのに適切な酵素は、セルロース分解性酵素及び／又はヘミセルロース分解酵素を含む。飼料組成物に含有するのに適切な酵素の例は、フィターゼ、キシラナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、リパーゼ、トランスフェラーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼ、リグニナーゼ、及びベータ‐グルカナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
次の実施例は説明を意図し、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例１
従来の回収方法を用いる部分的に沈殿する酵素を含有する発酵培養液からの酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
細菌溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、遠心分離前の培養液全量中に測定された全酵素活性の１０％を含んだ。酵素の９０％は、不溶性だった。アルファ‐アミラーゼ活性を米国特許出願番号12/041,917に記載のように測定した。
【０１８６】
細胞溶解物に関して、培養液温度を４０℃に調整し、０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを添加した。培養液を４８時間維持し、それから、０．６部（ｐａｒｔ）の水で希釈し、すぐに４％の陽イオンポリマー（C581、Cytec Industries, Inc.製）で凝集させた。珪藻土（FW12、World Minerals製）を凝集された培養液に４％ｗ／ｗで添加し、ＦＷ１２珪藻土ケーキでコーティングしたＨＲ９０００フィルターパッドを取り付けたデッドエンド真空フィルターを通してろ過した。細胞分離後、ろ液中の酵素の収率は６％であった。
【０１８７】
清澄ろ液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）らせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は１１．５ｇ／ｌ又は１．１５％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び２７．０４％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０１８８】
この方法のおける全体の収量は、全体培養液における最初の酵素活性の５％であり、純度は４．３％（活性乾燥固体物／全量の乾燥固体物）であった。
【０１８９】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように酵素濃縮物から調製した。
【０１９０】
スプレー１
粒径サイズが１５０μｍから３５０μｍの範囲を有する５１３グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１１．５ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、１．６％のタルク（Nytal 400）、０．５％のポリビニルアルコール（Erkol ５／８８）、１．０％の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び１．６％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む２０６２グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて1３.６ gpmに上げる。後の実験工程の間1３.６ gpmにて維持する。
インレット温度 ６９℃、３０分後７２℃に上昇。
アウトレット温度 ４３．９℃と４６．２℃の間
流動化空気流 ７６．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、１．５時間かけて４０ psiに増加する。
１０４３ｇの産物を取り出した。
【０１９１】
スプレー２
スプレー１から１０４３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１６６７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．３ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１５分かけて1９．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１９．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ６３℃、１５分後８０℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．２℃と４７．８℃の間
流動化空気流 ７９．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１３６３グラムの産物を取り出した。
【０１９２】
スプレー３
スプレー２から１３６３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。８３グラムの（顆粒組成物の５％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、８３グラムの（顆粒組成物の５％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び２５グラム（顆粒組成物の１．５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０６５グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．２ gpm (ｇ／分（grams per minute)）、 ３０分かけて1２．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１２．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃、３０分後７８℃に上昇。
アウトレット温度 ４６．０℃と５２．４℃の間
流動化空気流 ７８．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１４８７グラムの最終産物を取り出した。
【０１９３】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒のダストを分析した。顆粒のダストレベルは１．６６ｍｇ／ｐａｄであった。
【０１９４】
実施例２
沈殿物を溶解し、続いて従来の回収方法により部分的に沈殿した酵素を含有する発酵培養液から酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
酵素濃縮物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは遠心分離前の培養液全量中に測定された総酵素活性の５％を含んだ。酵素の９５％酵素は、不溶性だった。
【０１９５】
細胞溶解物に関して、培養液温度を４０℃に調整し、０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを添加した。培養液を１．５時間維持した。それから温度を６０℃に上げ１時間６０℃にて維持した。培養液をそれから１部（ｐａｒｔ）の水で希釈した。
【０１９６】
加熱段階及び希釈後沈殿された酵素が不溶性で残った。それらから溶解物を室温にて２８時間、５％グルコース及び３％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌとｐＨ９にて穏やかに混合しながらインキュベートし、細胞を分離した。沈殿されたアルファ‐アミラーゼ活性（８４％）の多くが溶解された。
【０１９７】
溶解物をそれから４％（ｗ／ｗ）陽イオンポリマー（Cytec Industries, Inc.製C581）で凝集した。珪藻土（World Minerals製FW12）を凝集された培養液に４％（ｗ／ｗ）で添加し、ＦＷ１２珪藻土ケーキでプレコーティングした回転式真空ドラムフィルターを通してろ過した。細胞分離後、ろ液中に得られた酵素は、８７％であった。
【０１９８】
清澄ろ液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は６０ｇ／ｌ又は６％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び２７％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０１９９】
この方法のおける全体の収量は、全体培養液における最初の酵素活性の８４％であり、純度は２２％（活性乾燥固体物／全量の乾燥固体物）であった。しかしながら、濃縮物はグルコース及びＮａＣｌを含んだ。これらの物質の除去は、方法の費用に返って影響を与える。
【０２００】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように酵素濃縮物から調製した。
【０２０１】
スプレー１
２００μｍから６００μｍの範囲の粒径サイズを有する４７８グラムのスクロース結晶をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、これに、６０．０ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、及び１１５グラム（顆粒組成物の９．８％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む６２８グラムの溶液をスクロース結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ２．９ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、５２分かけて１７．３ gpmに上げる。後の実験工程の間２０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 スプレー１について７１℃と７４℃の間
アウトレット温度 ４４．７℃と４８．５℃の間
流動化空気流 ８３．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８７．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３２ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５２分かけて４０ psiに増加する。
７００ｇの産物を取り出した。
【０２０２】
スプレー２
スプレー１から７００グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。１２０グラム（顆粒組成物の１０．２％）のスクロース（C&H Sugars）、１２０グラム（顆粒組成物の１０．２％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、７２グラム（顆粒組成物の６．１％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び１５グラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１３０８グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １２．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１０分かけて２０．２ gpmに上げる。後の実験工程の間２０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７４℃、１５分後８２℃に上昇。
アウトレット温度 ４６．３℃と４７．７℃の間
流動化空気流 ８５．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８８．０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３５psiと３６psiの間
９８８グラムの産物を取り出した。
【０２０３】
スプレー３
スプレー２から９８８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２９グラムの（顆粒組成物の２．５％）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC E-15 Dow Chemicals製）、及び４グラム（顆粒組成物の０．３％）のポリエチレングリコール６００(Carbowax Electron Microscopy Sciences製）を含む５８６グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．１ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、４５分かけて1５．６ gpmに上げる。後の実験工程の間1５．６ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃と８２℃の間
アウトレット温度 ４３．６℃と５０．３℃の間
流動化空気流 ８５．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８７．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１０１４グラムの最終産物を取り出した。
【０２０４】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは２．８０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２０５】
実施例３
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から均質化される細胞溶解物由来酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
均質化される細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。培養液のサンプルを５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、遠心分離前の培養液全量中に測定された総酵素活性の６％を含んだ。
【０２０６】
溶解物を実施例２に記載のように処理した。それから、溶解物を１０℃に冷却し、Gaulin ホモゲナイザー中６，０００ｐｓｉにて均質化した。酵素の収率は９０％であり、純度は６％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。
【０２０７】
粒状の製剤
粒状の組成物を均質化溶解物から次のように調製した。
【０２０８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する１７．６４キログラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１２．５３ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５．８８キログラム（顆粒組成物の５％）のタルク（Nytal 400）、１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び７．０６キログラム（顆粒組成物の６％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、及び１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）ネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む２５９．４１キログラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ５０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３時間かけて５００ gpmに上げる。後の実験工程の間５００ gpmにて維持する。
インレット温度 ７３℃及び８５℃の間
アウトレット温度 ４２．７℃と５５．７℃の間
流動化空気流 ８００ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と９５２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５時間かけて６８ psiに増加する。
６５．２キログラムの産物を取り出した。
【０２０９】
スプレー２
スプレー１から６５．２キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２２．２２キログラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１１１．１１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー２全体にわたって５００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から５８０ gpmの間
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４８．３℃と５４．１℃の間
流動化空気流 １１０９ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１２３４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi
８８キログラムの産物を取り出した。
【０２１０】
スプレー３
スプレー２から８４．９６７キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のタルク（Nytal 400）、及び１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals製23-6.5）を含む８４．９７キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー３全体にわたって３１０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から４００ gpmの間
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４８．８℃と５６．８℃の間
流動化空気流 １０７０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２３８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psiと７６ psiの間
９７．６キログラムの産物を取り出した。
【０２１１】
スプレー４
スプレー３から９７．６キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４７１グラム（顆粒組成物の０．４％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む９．４１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって２９５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）
インレット温度 ８５℃
アウトレット温度 ４７．１℃と５１．１℃の間
流動化空気流 １１２６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２２０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６５ psiと６８ psiの間
１０１．２キログラムの産物を取り出した。
【０２１２】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは０．３３ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２１３】
実施例４
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から均質化され、透析ろ過される細胞溶解物由来酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
均質化された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。均質化された溶解物を実施例３のように調製した。
【０２１４】
均質化された溶解物を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて透析ろ過し濃縮した。最終濃縮物は１１ｇ／ｌ又は１．１％（ｗ／ｖ）の活性アルファ‐アミラーゼ及び１６．７％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。
【０２１５】
均質化された溶解物を水道用水を用いて透析ろ過（diafilter）した。一定体積の透析ろ過を実施した。即ち、均質化された溶解物を含む供給タンクにおいて体積を一定に保ち、システムから除かれる透過物の体積を交換するために水道水を加えることにより実施した。透析ろ過水の全量は０．５ｘの初期の均質化された溶解物であった。透析ろ過した均質化溶解物を１６％（ｗ／ｗ）乾燥固形物にさらに濃縮した。得られた調製物の純度は９．３％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。純度は実施例３で調製された均質化された溶解物より１．２５倍高かった。
【０２１６】
粒状の製剤
粒状の組成物を均質化され、透析ろ過した溶解物から次のように調製した。
【０２１７】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する２９．６０６キログラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、１４．２ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５．８８キログラム（顆粒組成物の５％）のタルク（Nytal 400）、１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）の消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び１１．７７キログラム（顆粒組成物の１０％）のトウモロコシデンプン（Cargill Foods）、及び１．１８キログラム（顆粒組成物の１．０％）ネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１７０．７９キログラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １０６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、５時間かけて５５０ gpmに上げる。後の実験工程の間５５０ gpmにて維持する。
インレット温度 ８０℃及び８２．６℃の間
アウトレット温度 ５１．０℃と６０．９℃の間
流動化空気流 ８０４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１０５８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ６５ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、５時間かけて７０ psiに増加する。
６６．６キログラムの産物を取り出した。
【０２１８】
スプレー２
スプレー１から６６．６キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。２２．２２キログラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１１１．１１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー２全体にわたって４００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から６４０ gpmの間
インレット温度 ８３．５℃と８５．６℃の間
アウトレット温度 ５１．４℃と５４．８℃の間
流動化空気流 １０９７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と１２４６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
９３．８キログラムの産物を取り出した。
【０２１９】
スプレー３
スプレー２から９３．８キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、６．１２キログラムの（顆粒組成物の５．２％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のタルク（Nytal 400）、及び１．５３キログラム（顆粒組成物の１．３％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む８４．９７キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー３全体にわたって２００ gpm(ｇ／分（grams per minute)）から４１０ gpmの間
インレット温度 ７９．６℃と８３．９℃の間
アウトレット温度 ５５．９℃と５９．６℃の間
流動化空気流 １１２１ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２４４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psiと７５ psiの間
１０８．４キログラムの産物を取り出した。
【０２２０】
スプレー４
スプレー３から１０８．４キログラムの酵素顆粒をＤｅｓｅｒｅｔ ６０流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４７１グラム（顆粒組成物の０．４％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む９．４１キログラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって２５０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）
インレット温度 ８２．７℃と８２．９℃の間
アウトレット温度 ５７．４℃と５９．７℃の間
流動化空気流 １１５７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と１２９９ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ７０ psi
１１０．０キログラムの産物を取り出した。
【０２２１】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは０．１５ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２２２】
実施例５
部分的に沈殿される酵素を含有する発酵培養液から透析ろ過された（Diafiltered）細胞溶解物由来の酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
透析ろ過された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知の従来技術を用いて発酵した。発酵後、培養液は沈殿された酵素を含んだ。細胞を実施例２に記載のように溶解した。溶解物を実施例４に記載のように水道水を用いて透析ろ過した。透析ろ過した溶解物を１８．２％（ｗ／ｗ）乾燥固体にさらに濃縮した。得られた調製物の純度は１７％（活性乾燥固体／乾燥固体の全量）であった。純度は実施例３で調製された均質化された溶解物より１．７倍高かった。
【０２２３】
実施例６
部分的に沈殿された酵素を含有する発酵培養液から透析ろ過された細胞溶解物由来の酵素濃縮物及び粒状製剤の調製
透析ろ過された細胞溶解物の調製
ＰＣＴ出願番号WO08/112459に記載のようにアルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を実施例１に記載のように発酵した。溶解物を実施例５に記載のように透析ろ過及び濃縮した。得られた調製物は２．１４％の酵素活性を有し、乾燥固体は１７．２％であった。
【０２２４】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように透析ろ過された溶解物から調製した。
【０２２５】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する６９１グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、２３．４１ｇ／Ｌの活性アミラーゼ、５％のタルク（Nytal 400）、１．０％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）を含む６９１グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ２．６gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて1４.１ gpmに上げる。
インレット温度 ６９℃、３０分後７２℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．９℃と４５．８℃の間
流動化空気流 ７８．６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８０．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、１．５時間かけて４０ psiに増加する。
１０５０ｇの産物を取り出した。
【０２２６】
スプレー２
スプレー１から１０５０グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２０％）を含む１６６７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と1７．４ gpmの間
インレット温度 ７８℃ と８２℃の間
アウトレット温度 ４６．０℃と４７．５℃の間
流動化空気流 ７８．６ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．０ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１３５２グラムの産物を取り出した。
【０２２７】
スプレー３
スプレー２から１３５２グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。８８グラムの（顆粒組成物の５％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、８８グラムの（顆粒組成物の５％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、及び２６グラム（顆粒組成物の１．５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１１２７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて1０．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７５℃、１０分後８０℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．０℃と５３．７℃の間
流動化空気流 ８２．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．１ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１５３５グラムの最終産物を取り出した。
【０２２８】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．５０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２２９】
実施例７
溶解性酵素を有する微生物培養液濃縮物の調製及び粒状製剤の調製
酵素濃縮物の調製
スブチリシンプロテアーゼを発現するバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性のスブチリシン酵素を含んだ。培養液を５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上澄みは、全体の培養液サンプル中の活性と同じように活性を含んだ。培養液をｐＨ５．８±０．２に調整し、１．５±０．２部（ｐａｒｔ）の水道用水で希釈し、すぐに８％Ｃ３１１（Ｋｅｍｉｒａ）で凝集した。凝集した培養液をＦＷ１２珪藻土（World Minerals製FW12）でプレコーティングした回転式真空ドラムフィルターを通してろ過した。清澄ろ液を１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳらせん状にねじれた膜（KOCH Membrane Systems）を備えた限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。最終濃縮物は５７．２３ｇ／Ｌ及び１９．１％（ｗ／ｗ）の乾燥固体物質を含んだ。酵素濃縮物の上澄み（１４，０００ｒｐｍ、４分）活性により測定したように、酵素濃縮物スブチリシン活性は造粒前に溶解物に残存し、全体の酵素濃縮物と同様の活性であった。
【０２３０】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように限外ろ過された濃縮物から調製した。
【０２３１】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する６４３グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む６４３グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１．５時間かけて９.０ gpmに上げる。
インレット温度 ５７℃、１時間１５分後８６℃に上昇。
アウトレット温度 ４５．２℃と４８．９℃の間
流動化空気流 ７２．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８３．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧３０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、３０分かけて３７ psiに増加する。
７６９グラムの産物を取り出した。
【０２３２】
スプレー２
スプレー１から７６９グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。４００グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む２００１グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と1７．５ gpmの間
インレット温度 ７３℃と７６℃の間
アウトレット温度 ４４．６℃と４５．７℃の間
流動化空気流 ７９．７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１１７８グラムの産物を取り出した。
【０２３３】
スプレー３
スプレー２から１１７８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１１２７グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３０分かけて１２．２ gpmに上げる。後の実験工程の間１２．２ gpmにて維持する。
インレット温度 ７０℃、１５分後７６℃に上昇。
アウトレット温度 ５１．０℃と５２．５℃の間
流動化空気流 ８０．７ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８４．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１３５６グラムの産物を取り出した。
【０２３４】
スプレー４
スプレー３から１３５６グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６７．０グラムの水溶液をそれから酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１７．０ gpm
インレット温度 ７６℃
アウトレット温度 ４４．０℃と４６．５℃の間
流動化空気流 ８０．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．７ｃｆｍの間
１３５９グラムの最終産物を取り出した。
【０２３５】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．０３ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２３６】
実施例８
沈殿物を有する酵素濃縮物及び粒状の製剤の調製
沈殿される酵素を含む酵素濃縮物の調製
硫酸ナトリウムを実施例７での限外ろ過の後、最終酵素濃縮物に１２％（ｗ／ｖ）の濃度にて添加し、沈殿を誘発した。硫酸ナトリウムを含む濃縮物を１８時間１０℃にて混合した。得られたスラリーを造粒用に用いるために使用した。
【０２３７】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように沈殿物を含む酵素濃縮物から調製した。
【０２３８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する５００グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む９９９グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、３０分かけて１０.６ gpmに上げる。
インレット温度 ６９．０℃と７４℃の間
アウトレット温度 ４４．５℃と４７．１℃の間
流動化空気流 ７９．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８２．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、６０分かけて４０ psiに増加する。
７０５グラムの産物を取り出した。
【０２３９】
スプレー２
スプレー１から７０５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３６９グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む１８４７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と１８．２ gpmの間
インレット温度 ７０℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４２．９℃と４５．１℃の間
流動化空気流 ８０．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．２ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)
１０６１グラムの産物を取り出した。
【０２４０】
スプレー３
スプレー２から１０６１グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、７２グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７２グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、１８グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び１８グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０００グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．８ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて９．９ gpmに上げる。後の実験工程の間９．９ gpmを維持する。
インレット温度 ７２℃、１５分後８４℃に上昇。
アウトレット温度 ５１．４℃と５２．９℃の間
流動化空気流８０．４ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８２．３ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１２２６グラムの産物を取り出した。
【０２４１】
スプレー４
スプレー３から１２２６グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol） (Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６２．０グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１７．０ gpm
インレット温度 ６９℃
アウトレット温度 ４１．４℃と４２．３℃の間
流動化空気流 ８０．８ cfm (立方フィート／分（cubic feet per minute）と８０．５ｃｆｍの間
１２２８グラムの最終産物を取り出した。
【０２４２】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは２．５０ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２４３】
実施例９
酵素沈殿物を有する溶解された微生物培養液及び粒状の製剤の調製
沈殿された酵素を有する微生物培養液溶解物の調製
実施例７で記載のようにスブチリシンプロテアーゼを発現するバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性スブチリシン酵素を含んだ。リゾチームを１％濃度にて培養液に添加し、３時間３７℃にて維持した。得られた溶解物は、溶解性及び不溶性酵素両者を含み、５７ｇ／ｍＬ活性及び１８．２３％乾燥固体を含んだ。
【０２４４】
粒状の製剤
粒状の組成物を次のように沈殿された酵素有する溶解物から調製した。
【０２４５】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する５８５グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、０．７％のタルク（Nytal 400）、０．９％消泡剤（Foamblast 882 Emerald Performance Materials製）、及び０．５％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む９９３グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．５ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、２時間かけて１２.５ gpmに上げる。
インレット温度 ６３．０℃と７０℃の間
アウトレット温度 ４３．０℃と４７．５℃の間
流動化空気流 ７９．８ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．１ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、３０分かけて３８ psiに増加する。
７８５グラムの産物を取り出した。
【０２４６】
スプレー２
スプレー１から７８５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４００グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の２７．７％）を含む２００１グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と２１．２ gpmの間
インレット温度 ６５℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４４．１℃と４５．６℃の間
流動化空気流 ７８．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３９ psiと４０ psiの間
１１６８グラムの産物を取り出した。
【０２４７】
スプレー３
スプレー２から１１６８グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）、７８グラムの（顆粒組成物の５．４％）の二酸化チタン（DuPont製R902）、２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のタルク（Nytal 400）、及び２０グラム（顆粒組成物の１．３５％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む１０８３グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ３．０ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、 ６０分かけて８．０ gpmに上げる。後の実験工程の間８．０ gpmを維持する。
インレット温度 ７３℃、３０分後７８℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．０℃と５２．９℃の間
流動化空気流 ８０．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．７ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psiと４２ psiの間
１３４７グラムの産物を取り出した。
【０２４８】
スプレー４
スプレー３から１３４７グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、３グラム（顆粒組成物の０．２２％）のネオドール（Neodol）(Shell Chemicals 製23-6.5）を含む６７．０グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 スプレー４全体にわたって１２．６ gpm
インレット温度 ６３℃
アウトレット温度 ４１．１℃と４４．１℃の間
流動化空気流 ８０．９ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８１．５ｃｆｍの間
１３４９グラムの最終産物を取り出した。
【０２４９】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．４ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２５０】
実施例１０
溶解性酵素有する濃縮された真菌の培養液及び粒状の製剤の調製
溶解性酵素を有する濃縮された真菌発酵培養液の調製
グルコアミラーゼを発現するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知の方法を用いて発酵した。発酵後、培養液は多くの溶解性グルコ‐アミラーゼを含んだ。グルコアミラーゼ活性をU.S. Patent Application No.７２６２０４１に記載のように測定した。細胞をU.S. Patent Application No.２００７/０２４６４０６のように精密ろ過により除去した。清澄培養液を１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＰＥＳらせん状にねじれた膜を用いて１０倍に濃縮した。酵素濃縮物を使用時まで１０℃にて保存した。貯蔵の時、沈殿物が形成された。沈殿物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分、１０℃）により除去した。得られた透明な上澄みを下記に記載のように粒状の組成物の調製のために用いた。
【０２５１】
粒状の製剤
次のように、粒状の組成物を真菌発酵培養液中の溶解性酵素から調製した。
【０２５２】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する４６６グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）及び１％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む５１２グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１５分かけて１０．１ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．１ gpmを維持する。
インレット温度 ７１℃と７７℃の間
アウトレット温度 ４６．７℃と４９．１℃の間
流動化空気流 ７５．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８０．７ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３１ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、４５分かけて４１ psiに増加する。
６１５グラムの産物を取り出した。
【０２５３】
スプレー２
スプレー１から６１５グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、５３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の４０％）を含む２６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １５．４ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と１８．５ gpmの間
インレット温度 ７２℃と７８℃の間
アウトレット温度 ４３．８℃と４５．７℃の間
流動化空気流 ８０．０ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．８ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３８ psi
１１１３グラムの産物を取り出した。
【０２５４】
スプレー３
スプレー２から１１１３グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４０グラムの（顆粒組成物の３％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）及び８０グラム（顆粒組成物の６％）のタルク（Nytal 400）を含む６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ４．６ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて１１．０ gpmに上げる。
インレット温度 ６８℃、１０分後８２℃に上昇。
アウトレット温度 ４４．２℃と５２．４℃の間
流動化空気流 ８２．３ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．５ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４０ psi
１２２１グラムの最終産物を取り出した。
【０２５５】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは１．６６ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２５６】
実施例１１
酵素沈殿物を有する真菌の培養液及び粒状の製剤の調製
実施例１０に記載のようにグルコ‐アミラーゼを発現するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知の方法で発現した。発酵後、培養液は多くの溶解性グルコ‐アミラーゼを含んだ。米国特許第５，８０１，０３４に記載のように溶解せずに細胞を死滅した。実施例１０から酵素濃縮物を遠心分離することにより得られる沈殿物を死滅細胞を含む培養液へ添加した。得られた培養液は、溶解性及び不溶性酵素両者を含んだ。酵素含有培養液は、４４７Ｕ／ｍＬ活性及び１９．７％（ｗ／ｗ）乾燥固体であった。沈殿物に存在する量を全体のサンプルの活性及び上澄み（１４，０００ｒｐｍ、５分）を測定することにより決定した。データを下記表１にまとめる。９０％の活性が、上澄み（溶解性酵素として）に存在し及び１０％が沈殿された形態中に存在した。
【表１】
【０２５７】
粒状の製剤
次のように、粒状の組成物を沈殿された酵素含有真菌培養液から調製した。
【０２５８】
スプレー１
１５０μｍから３５０μｍの範囲の粒径サイズを有する４７２グラムの硫酸ナトリウム結晶（Saltec）をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。これに、活性プロテアーゼ、５％トウモロコシデンプン（Cargill Foods）及び１％ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）を含む４９４グラムの溶液を硫酸ナトリウム結晶の表面にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ８．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、１０分かけて１０．８ gpmに上げる。後の実験工程の間１０．８ gpmを維持する。
インレット温度 ６８℃と７１℃の間
アウトレット温度 ４４．７℃と４６．５℃の間
流動化空気流 ７８．５ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と７９．４ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３３ psi（ポンド／平方インチ（pounds per square inch）)、２０分かけて４０ psiに増加する。
６１２グラムの産物を取り出した。
【０２５９】
スプレー２
スプレー１から６１２グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、５３３グラムの硫酸ナトリウム（顆粒組成物の４０％）を含む２６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 １７．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）と２３．４ gpmの間
インレット温度 ７４℃と８２℃の間
アウトレット温度 ４４．６℃と４５．５℃の間
流動化空気流 ８１．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute)）と８１．９ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ３８ psi
１０８１グラムの産物を取り出した。
【０２６０】
スプレー３
スプレー２から１０８１グラムの酵素顆粒をＶｅｃｔｏｒ ＦＬ−１流動床コーティング装置へ充填し、流動化した。それから、４０グラムの（顆粒組成物の３％）ポリビニルアルコール（Erkol製５／８８）及び８０グラム（顆粒組成物の６％）のタルク（Nytal 400）を含む６６７グラムの水溶液を酵素顆粒上にスプレーコーティングした。スプレーコーティングパラメーターを下記に示す。
溶液スプレー速度 ７．２ gpm(ｇ／分（grams per minute)）、６０分かけて１０．８ gpmに上げる。
インレット温度 ７８℃、 ６０分後８１℃に上昇。
アウトレット温度 ５２．７℃と５３．１℃の間
流動化空気流 ８３．２ cfm(立方フィート／分（cubic feet per minute）と８３．６ｃｆｍの間
噴霧空気圧 ４１ psi
１１９０グラムの最終産物を取り出した。
【０２６１】
ホイバッハ摩耗試験を使用して、顆粒をダストに関して分析した。顆粒のダストレベルは７．９ｍｇ／ｐａｄであった。
【０２６２】
実施例１２
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製した顆粒での洗剤中の酵素安定性
実施例４に記載のように調製した酵素顆粒の安定性を多様な洗剤基剤において評価した。洗剤基剤は、Calgonite 5-1、クエン酸塩を有するWFK、リン酸塩を有するWFK、及びSomat(Henkel)であった。WFK洗剤基剤はwfk Testgewebe GmbH (www.testgewebe.de)から入手できる。洗剤中酵素顆粒（２％ｗ／ｗ）を密閉容器中２２℃に保った。残存酵素活性を０、５週間、２カ月、及び４カ月の時間にて貯蔵後測定した。データを下記表２にまとめる。
【表２】
【０２６３】
実施例１３
細胞成分及び不溶性酵素を有する沈殿物から調製される顆粒の適用性能
実施例４に記載のように調製された酵素顆粒の洗浄性能を漂白洗剤基剤を含むＩＥＣ Ａ＊中に貯蔵前及び後で評価した。サンプルを１週間３７℃／７０％相対湿度（ＲＨ）にて蓋のあいたカップに保存した。新しい顆粒及び新しい洗剤を用いた並びに１週間洗剤中に保存した顆粒を用いた適用試験を多様な汚れ、即ち、CS-26(綿上トウモロコシデンプン)、CS-27(綿上ジャガイモデンプン)、CS-28(綿上コメデンプン)、CS-29(綿上タピオカデンプン)、及びEMPA-161(綿上デンプン)、を用いて実施した。
【０２６４】
洗浄試験
洗浄試験をMiele Novotronic W822洗浄機中で実施した。プログラムは「通常」／「綿」、温度は４０℃、水硬度は８．５ＧＨ、洗剤は、０．１５ｇのPurafect 4000 E (Genencor Division of Danisco US Inc.より入手) 及び０．１３９ｇの実施例４の顆粒を含む８ｇ／Ｌ（＝１３６ｇ／洗浄）用量の漂白剤を伴うＩＥＣ Ａ＊であった。
【０２６５】
性能測定
測定をMinolta CR300 Colorimeter、CIELAB L*abスケール、D65スタンダード イルミネイト、UVフィルター無し、白のバックグラウンドで行った。汚れ除去（ＳＲ）を次の式を用いて計算した。
【０２６６】
図１は実施例４の顆粒の試験性能が貯蔵の間変化せずに維持されたことを示す。
【０２６７】
実施例１４
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製される顆粒での保存の間の酵素安定性
実施例７−９に記載のように調製された酵素顆粒を保存安定性について評価した。用いた条件は、開いた容器に入れたサンプルを用いて７０％相対湿度のチャンバー中３７℃にて行った。残存活性を測定し、最初の活性に基づいて計算した。データを下記表３にまとめる。
【表３】
【０２６８】
実施例１５
実施例1−５に記載の回収方法の特性比較
上記実施例１−５に記載のように回収されたアルファ‐アミラーゼの活性及び精製を表４に記載する。酵素純度は、酵素活性を乾燥固体の総量で割ることにより算出した。
【表４】
【０２６９】
実施例１６
細胞成分及び不溶性酵素を含む濃縮物から調製される顆粒に関する漂白剤含有洗剤基剤中に保存する間の酵素安定性
実施例１、２、４、及び６に記載のように調製される酵素顆粒を漂白粉を有するＩＥＣ Ａ＊洗剤基剤中の安定性について評価した。ＩＥＣ Ａ＊粉洗剤をＷＦＫから購入した。それは漂白洗剤を含んでいない。次の漂白系を加えた。それは、３％ＴＥＡＤ、及び２０％過ホウ酸塩２Ｈ２Ｏである。用いた保存条件は、３７℃、７０％相対湿度のチャンバーの中、開いたポリプロピレン容器中にサンプルを入れた。残存活性を測定し、最初の活性に基づいて計算した。データを図２に示す。
【０２７０】
実施例１７
酵素結晶を含む発酵培養液からの清澄酵素溶液の調製
すべての操作を室温で行った。
【０２７１】
出発材料
アスパラギン酸プロテアーゼを発現するように遺伝子組み換えされたトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を周知な標準条件下にて発酵した。例えば、米国特許第7,429,476を参照願いたい。採取時点の発酵培養液のｐＨは４．６２であり、酵素は、スピンダウン中全体の活性の９８％を有する大きな結晶を形成した。
【０２７２】
ろ過１−プロテアーゼ結晶の回収
５２１グラムの採取した培養液を６３ｇの珪藻土ろ過助剤Celatom FW-6とビーカーの中でブレンドした。０．４５μｍナイロン膜フィルター（Nalgene 154-0045）を通して、３０２ｇのブレンドをろ過した。１５５ｇのろ液及び１４６ｇのフィルターケーキを回収した。酵素活性の９８％がフィルターケーキ中に残存した。ろ液を破棄した。
【０２７３】
結晶の可溶化
前段階のフィルターケーキの１３１ｇをビーカーへ移し、８７ｇの５０ｍＭ硫酸とブレンドした。室温にて４５分間放置後、ブレンドはｐＨ３．２を有し、顕微鏡ですべてのプロテアーゼ結晶が溶解されたことを確認した。
【０２７４】
ろ過２−プロテアーゼ溶液の清澄化
前段階からの結晶の可溶化ブレンドの１８４ｇをろ過１にて用いたフィルターと同じ型でろ過した。ケーキの表面が乾燥したとき、５０ｇの水で洗浄することにより沈殿固形物からろ液を除いた。１５４ｇのろ液を回収し、８０ｇのフィルターケーキを破棄した。透明なろ液は、出発培養液の力価より１６％より高い力価にて出発酵素活性の８８％を含んだ。
【０２７５】
実施例１８
清澄酵素製剤調製
出発材料：細菌発酵培養液
アルファ‐アミラーゼ酵素を組み換え的に発現するバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を周知な方法を用いて発酵した。発酵後、培養液を０．０１％（ｗ／ｗ）リゾチームを用いて２時間溶解し、続いて２時間６０℃の温度で温めた。
【０２７６】
１８．１ 溶解性酵素（従来の回収）を含む培養液からの調製
５ｇの出発材料を１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。上澄みは、８８％の酵素活性を含んだ。乾燥固体による純度は、６％であった。全タンパク質による純度は、１４％であった。
【０２７７】
１８．２ 不溶性酵素を含む培養液から調製
溶解物中アルファ‐アミラーゼ酵素の結晶化
４０ｇの出発物質を用いた。２０％酢酸を用いて、溶解物のｐＨを５に調整した。そのｐＨ調製物をシェーカーでインキュベートした。５０℃及び８０ｒｐｍの振盪条件であった。
【０２７８】
遠心分離１−アルファ‐アミラーゼ結晶及び細胞残屑の回収
４４時間のインキュベート後、５ｇの溶解物を１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。
【０２７９】
アルファ‐アミラーゼ結晶の可溶化
回収された固形物を水道水中にもとの溶解物の重量の５ｇに達するまで再懸濁した。３ｇのプロピレングリコールを懸濁液に添加した。５％ＮａＯＨを用いて、ｐＨを６．５に調整し、室温にて１８時間反転することにより混合した。それから、混合物を４０℃にて２時間インキュベートした。
【０２８０】
遠心分離２−アルファ‐アミラーゼ溶液の清澄化
結晶可溶化ブレンドを１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。０．４５μｍシリンジフィルターを用いて、得られたもの（液体上澄み）をさらに清澄化した。透明なアミラーゼ溶液は、結晶化に用いた最初の溶解物中にあった活性の８５％を含んだ。乾燥固体による純度は、４２％であった。総タンパク質による純度は、３４％であった。
【０２８１】
１８．３ 凝集剤を用いる不溶性酵素を含む培養液から調製
凝集
実施例１８．２から溶解アルファ‐アミラーゼ結晶を含む５ｇ溶解物に１０ｇ／ＬのＣ５８１陽イオンポリマーを添加した。それから、手で１０回上下に反転することにより優しく混合した。
【０２８２】
遠心分離２−アミラーゼ溶液の清澄化
凝集結晶可溶化ブレンドを１０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離し、液相から固相を分離した。透明なものは、結晶化に用いた最初の溶解物中にあった活性の８５％を含んだ。全タンパク質による純度は、３９％であった。
【０２８３】
実施例１８．１、１８．２及び１８．３に記載のように回収されるアルファ‐アミラーゼの純度を表５に示す。酵素純度を乾燥固体の総量で、又は総タンパク質濃度で酵素活性を割ることにより計算した。
【表５】
【０２８４】
理解を明らかにする目的のために図及び実施例の方法で、発明を詳細に説明したけれども、ある変更及び修飾は本発明の特許請求の範囲及び精神を逸脱せずに実施できることは当業者にとって明らかである。従って、説明は、本発明の特許請求の範囲に限定することを意図していない。
【０２８５】
あたかも各々個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的に及び個別に参考により組み入れられていることを示すように、本明細書にて引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、参考により本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程、及び
回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成する工程であって、
酵素の少なくとも一部が、微生物培養液に不溶性であるように設けられる工程を含む、
微生物細胞及び／又は微生物細胞からの細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法。
【請求項２】
微生物培養液が、
酵素を微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液とブレンドすること、ここで、前記酵素が微生物細胞により生成されず、及び前記酵素が微生物培養液に不溶性であるか、又は前記酵素が微生物培養液に溶解性であるが沈殿剤の添加により、該酵素の少なくとも一部を不溶性にすることをさらに含むこと、
沈殿剤を微生物細胞により発現された溶解性酵素を含む微生物培養液に添加し、それにより酵素の少なくとも一部を不溶性とすること、及び
発酵培地において微生物細胞中の酵素を発現し、酵素の少なくとも一部が発酵培地に不溶性であるように設けること、
から選択される方法により生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
回収する工程が、培養液調整、細胞溶解、均質化、透析ろ過、及び固液分離から選択される少なくとも一つの回収操作を含み、
ここで、回収する工程が、二以上の回収操作を実施することを含む時、回収操作が、任意の順序で実施されてよいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
回収する工程が、微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することが、微生物培養液を濃縮することを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物培養液を濃縮することが、限外ろか、精密ろ過、逆浸透、及びナノろ過から選択される膜ろ過法を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することが、回転式ドラム型真空ろ過、プレート‐フレームろ過、ベルト型ろ過、遠心分離、サイクロン分離、デカンテーション、及び、蒸留から選択される方法を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
不溶性酵素が溶解性酵素を含む微生物培養液に沈殿剤を添加することにより生成され、それにより酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性になり、ここで、沈殿剤がｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくともひとつの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、及び高分子電解質の添加、又はそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
回収された不溶性酵素を含む組成物が、無傷の微生物細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
無傷の微生物細胞が生きている微生物細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
無傷の微生物細胞が死んでいる微生物細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液が、微生物細胞溶解物を含み、ここで、微生物細胞溶解物が、微生物細胞膜を破壊することにより生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、無傷の微生物細胞の微生物細胞膜を破壊し、回収される不溶性酵素を含む微生物細胞溶解物を生成することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
微生物細胞膜を破壊することが、微生物細胞溶解ができる酵素と微生物細胞を接触することを含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
微生物細胞溶解ができる酵素が、リゾチーム酵素であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
微生物細胞膜を破壊することが、均質化、高せん断混合、押出圧力、及び高せん断ポンピングから選択される機械的せん断方法を含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
微生物細胞溶解物を均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１８】
微生物細胞溶解物を透析ろ過することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
微生物細胞が細菌細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細菌細胞がバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
微生物細胞が真菌細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
真菌細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞がトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
酵素の少なくとも約１０％が、微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
不溶性酵素の純度が、回収する前の不溶性酵素の純度と比較して、少なくとも１０％増加していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法により生成される組成物。
【請求項２８】
少なくとも一つの製剤成分をさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
（ａ）不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）酵素が少なくとも部分的に溶解するように、酵素を溶解する物質の一以上を添加することにより及び／又は物理的条件を変化することにより、不溶性酵素の少なくとも一部を溶解し、それにより、溶解性酵素溶液を生成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）に従って調製された溶液から固形物を除去し、それにより、清澄液体酵素溶液を生成する工程
を含む清澄液体酵素溶液を生成する方法。
【請求項３０】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有顆粒を生成することを含む、
酵素を含有する粒状製剤を作成する方法。
【請求項３１】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、ここで、酵素の少なくとも一部が、微生物培養液中で不溶性であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
酵素含有顆粒が、トップスプレー流動床方法、ボトムスプレーウルスターコーター方法、高せん断造粒、押し出し成形、及びパンコーティングから選択される造粒方法により生成されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
トップスプレー流動床装置において、コアの上に不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有層をコーティングすることを含み、任意に、コアと酵素含有層の間に塩層をコーティングすることを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
酵素含有層の上にバリア塩を含む層をコーティングすることをさらに含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
バリア塩層の上にポリマー及び／又は色素を含む外側のコーティング層をコーティングすることをさらに含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
酵素含有顆粒が、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有コアの上にバリア塩層及び／又は一以上のコーティング層をコーティングすることにより生成されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
酵素含有コアがトップスプレー流動床装置により生成されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
酵素含有コアが高せん断造粒により生成されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
酵素含有顆粒であって、
コア、
任意にコアの上にコーティングされる塩層、及び
コア又は塩層の上にコーティングされる酵素含有層を含み、ここで、酵素含有層が不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む
酵素含有顆粒。
【請求項４０】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４１】
酵素含有層の上にコーティングされるバリア塩層をさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４２】
バリア塩層の上にコーティングされる外側のコーティング層をさらに含み、ここで外側のコーティング層がポリマー及び／又は色素を含むことを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４３】
酵素含有顆粒であって、
酵素含有コア及びバリア塩層及び／又はコアを囲んでいる一以上のコーティング層を含み、ここで、コアが不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む
酵素含有顆粒。
【請求項４４】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４５】
酵素含有コアがトップスプレー流動床装置により生成されることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４６】
酵素含有コアが高せん断造粒により生成されることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４７】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む洗剤組成物。
【請求項４８】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む織物処理組成物。
【請求項４９】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む動物飼料組成物。
【請求項５０】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む食品組成物。
【請求項５１】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有液体製剤。
【請求項５２】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項５１に記載の液体製剤。
【請求項５３】
ポリオール、塩、保存剤、界面活性剤、及び抗酸化剤から選択される製剤成分の一以上をさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の液体製剤。
【請求項１】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程、及び
回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成する工程であって、
酵素の少なくとも一部が、微生物培養液に不溶性であるように設けられる工程を含む、
微生物細胞及び／又は微生物細胞からの細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する方法。
【請求項２】
微生物培養液が、
酵素を微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液とブレンドすること、ここで、前記酵素が微生物細胞により生成されず、及び前記酵素が微生物培養液に不溶性であるか、又は前記酵素が微生物培養液に溶解性であるが沈殿剤の添加により、該酵素の少なくとも一部を不溶性にすることをさらに含むこと、
沈殿剤を微生物細胞により発現された溶解性酵素を含む微生物培養液に添加し、それにより酵素の少なくとも一部を不溶性とすること、及び
発酵培地において微生物細胞中の酵素を発現し、酵素の少なくとも一部が発酵培地に不溶性であるように設けること、
から選択される方法により生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
回収する工程が、培養液調整、細胞溶解、均質化、透析ろ過、及び固液分離から選択される少なくとも一つの回収操作を含み、
ここで、回収する工程が、二以上の回収操作を実施することを含む時、回収操作が、任意の順序で実施されてよいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
回収する工程が、微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することが、微生物培養液を濃縮することを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物培養液を濃縮することが、限外ろか、精密ろ過、逆浸透、及びナノろ過から選択される膜ろ過法を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物培養液から液相の少なくとも一部を除去することが、回転式ドラム型真空ろ過、プレート‐フレームろ過、ベルト型ろ過、遠心分離、サイクロン分離、デカンテーション、及び、蒸留から選択される方法を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
不溶性酵素が溶解性酵素を含む微生物培養液に沈殿剤を添加することにより生成され、それにより酵素の少なくとも一部が微生物培養液中で不溶性になり、ここで、沈殿剤がｐＨの調整、温度調整、塩の添加、酸の添加、塩基の添加、少なくともひとつの他のタンパク質の添加、緩衝液の添加、及び高分子電解質の添加、又はそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
回収された不溶性酵素を含む組成物が、無傷の微生物細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
無傷の微生物細胞が生きている微生物細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
無傷の微生物細胞が死んでいる微生物細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液が、微生物細胞溶解物を含み、ここで、微生物細胞溶解物が、微生物細胞膜を破壊することにより生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、無傷の微生物細胞の微生物細胞膜を破壊し、回収される不溶性酵素を含む微生物細胞溶解物を生成することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
微生物細胞膜を破壊することが、微生物細胞溶解ができる酵素と微生物細胞を接触することを含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
微生物細胞溶解ができる酵素が、リゾチーム酵素であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
微生物細胞膜を破壊することが、均質化、高せん断混合、押出圧力、及び高せん断ポンピングから選択される機械的せん断方法を含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
微生物細胞溶解物を均質化し、均質化した微生物細胞溶解物を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１８】
微生物細胞溶解物を透析ろ過することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
微生物細胞が細菌細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細菌細胞がバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
微生物細胞が真菌細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
真菌細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞がトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
酵素の少なくとも約１０％が、微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
不溶性酵素の純度が、回収する前の不溶性酵素の純度と比較して、少なくとも１０％増加していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、回収される不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法により生成される組成物。
【請求項２８】
少なくとも一つの製剤成分をさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
（ａ）不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）酵素が少なくとも部分的に溶解するように、酵素を溶解する物質の一以上を添加することにより及び／又は物理的条件を変化することにより、不溶性酵素の少なくとも一部を溶解し、それにより、溶解性酵素溶液を生成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）に従って調製された溶液から固形物を除去し、それにより、清澄液体酵素溶液を生成する工程
を含む清澄液体酵素溶液を生成する方法。
【請求項３０】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有顆粒を生成することを含む、
酵素を含有する粒状製剤を作成する方法。
【請求項３１】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、ここで、酵素の少なくとも一部が、微生物培養液中で不溶性であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
酵素含有顆粒が、トップスプレー流動床方法、ボトムスプレーウルスターコーター方法、高せん断造粒、押し出し成形、及びパンコーティングから選択される造粒方法により生成されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
トップスプレー流動床装置において、コアの上に不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有層をコーティングすることを含み、任意に、コアと酵素含有層の間に塩層をコーティングすることを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
酵素含有層の上にバリア塩を含む層をコーティングすることをさらに含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
バリア塩層の上にポリマー及び／又は色素を含む外側のコーティング層をコーティングすることをさらに含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
酵素含有顆粒が、不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む酵素含有コアの上にバリア塩層及び／又は一以上のコーティング層をコーティングすることにより生成されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
酵素含有コアがトップスプレー流動床装置により生成されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
酵素含有コアが高せん断造粒により生成されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
酵素含有顆粒であって、
コア、
任意にコアの上にコーティングされる塩層、及び
コア又は塩層の上にコーティングされる酵素含有層を含み、ここで、酵素含有層が不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む
酵素含有顆粒。
【請求項４０】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４１】
酵素含有層の上にコーティングされるバリア塩層をさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４２】
バリア塩層の上にコーティングされる外側のコーティング層をさらに含み、ここで外側のコーティング層がポリマー及び／又は色素を含むことを特徴とする請求項３９に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４３】
酵素含有顆粒であって、
酵素含有コア及びバリア塩層及び／又はコアを囲んでいる一以上のコーティング層を含み、ここで、コアが不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む
酵素含有顆粒。
【請求項４４】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４５】
酵素含有コアがトップスプレー流動床装置により生成されることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４６】
酵素含有コアが高せん断造粒により生成されることを特徴とする請求項４３に記載の酵素含有顆粒。
【請求項４７】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む洗剤組成物。
【請求項４８】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む織物処理組成物。
【請求項４９】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む動物飼料組成物。
【請求項５０】
請求項３９から４６のいずれか一つに記載の酵素含有顆粒を含む食品組成物。
【請求項５１】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を含む酵素含有液体製剤。
【請求項５２】
不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物が、微生物細胞及び／又は細胞残屑を除去せずに、微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む微生物培養液から不溶性酵素を回収する工程を含む方法により生成され、それにより、回収された不溶性酵素及び微生物細胞及び／又は細胞残屑を含む組成物を生成し、酵素の少なくとも一部が微生物培養液中に不溶性であることを特徴とする請求項５１に記載の液体製剤。
【請求項５３】
ポリオール、塩、保存剤、界面活性剤、及び抗酸化剤から選択される製剤成分の一以上をさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の液体製剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２３５６２（Ｐ２０１１−５２３５６２Ａ）
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３６４０（Ｐ２０１１−５１３６４０）
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２１７６
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２１７６
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
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