真核微生物の活性測定法
【課題】測定毎の変動係数が小さく、より信頼性の高い真核微生物の活性測定法を提供する。
【解決手段】ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、好ましくは触媒の存在下で化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定する。この発明においては、キノン類の溶媒として微生物にダメージを与えにくいジメチルスルホキシドを用いているため、微生物の有機物質代謝活性を害することなく、微生物活性および有機物質量に応じた微生物の活性を測定することを可能とするといったすぐれた効果を奏する。
【解決手段】ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、好ましくは触媒の存在下で化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定する。この発明においては、キノン類の溶媒として微生物にダメージを与えにくいジメチルスルホキシドを用いているため、微生物の有機物質代謝活性を害することなく、微生物活性および有機物質量に応じた微生物の活性を測定することを可能とするといったすぐれた効果を奏する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核微生物の活性測定法に関する。更に詳しくは、化学発光を用いた真核微生物の活性測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川や産業排水の水質管理に重要な項目として、BOD(生物化学的酸素要求量)があり、国際的な有機性水質汚濁の指標とされている。有機化合物に起因する水質汚濁は、好気性微生物による酸化反応で減少し、消去され、その有機物質濃度に対応して溶存酸素が消費されるため、この消費された酸素量を計測することで、水質汚濁が明らかになるのである。したがって、BODは有機化合物濃度を酸素量により間接的に表したものである。
【０００３】
BOD測定法としては、種々の方法が提案されている。例えば特許文献１には、トリコスポロン属の酵母を溶存酸素電極の表面に固定して、酵母が河川や排水中に含まれる有機汚濁物質を資化することで消費された溶存酸素の濃度を酸素電極で測定する方法が提案されている。この方法によれば、河川や排水中に含まれるさまざまな有機物質の総量を有機汚濁物質としてまとめて測定ができる特徴があるものの、測定溶液中にごく僅かしか溶存しない酸素の濃度を高感度に測定する必要があることから、測定システムが必然的に大きくなってしまうなどの問題点があり、試験室や工場などの屋内に限らず、現場での計測も必要となるBODの測定には向かない場合があった。また測定システム上、溶存酸素の非常に低い廃液にあっては正確な値を測定することが難しいという限界もあった。
【特許文献１】特公昭６１−７２５８号公報
【０００４】
かかる問題に対して、溶存酸素量が低い場合にあってもBODの正確な測定を可能とするメディエーターを用いたBOD測定法が開発された。かかる測定法は、溶存酸素に比べて液体中の溶解濃度が高い電子の濃度を指標とした電気化学(電極)測定型であり、BODの正確な測定および測定装置の小型化を可能とするといった画期的なものであった。
【特許文献２】特開平０７−１６７８２４号公報
【０００５】
しかるに、かかる測定法は微生物が有機物質を代謝することによる電子伝達系の電子の移動を検知するものであるため、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合には、測定感度に乏しいとされ、原核微生物を利用した測定法が単に数多く提案されているにとどまるのが現状である。しかしながら、原核微生物は培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題があり、種々の測定法に応用し、実用化する場合の障壁となっており、真核微生物を用いたメディエーター型のBOD測定法の開発が望まれている。
【０００６】
一方、真核微生物の検出手段としてその呼吸活性を高感度に測定する方法として、微生物をエタノールに溶解した酸化型キノンとともに培養液中でインキュベーションして、生成物をモリブデンなどの重金属イオンの存在下で化学発光試薬と反応させて定量するという方法が提案されている。かかる方法は、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合にも、測定感度の向上が期待される方法であると考えられるが、測定毎の変動係数が10％以上と大きく、再現性に欠けるものであった。
【特許文献３】特開平１１−２９００９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、測定毎の変動係数が小さく、より信頼性の高い真核微生物の活性測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる本発明の目的は、ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、好ましくは触媒の存在下で化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定することによって達成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明においては、キノン類の溶媒として微生物にダメージを与えにくいジメチルスルホキシドを用いているため、微生物の有機物質代謝活性を害することなく、微生物活性および有機物質量に応じた微生物の活性を測定することを可能とするといったすぐれた効果を奏する。
【００１０】
従って、培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題がある原核微生物を用いることなく、真核微生物を用いて再現性の高いBODの測定することができるとともに、その測定感度も、従来提案されていた真核微生物を用いたBOD測定法と比較して、0.2〜500μlといった少量の試料で、数倍程度高感度となるといったすぐれた効果を奏する。
【００１１】
本発明方法はまた、有機物質を含む例えば培地中に、微生物の有無を調べる食品、土壌などの検体を添加して一定時間培養後、微生物の活性を測定することにより、真核微生物を含めた全微生物の存在を極めて高感度かつ確実に行うことも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
真核微生物としては、これに属する微生物であれば特に限定されないが、BODの測定にあたっては、好ましくは適用技術により分離・培養可能な微生物が用いられ、取扱い容易といった観点からは、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneum、Trichosporon fermentans、Trichosporon brassicae、Candida属、Aspergillus属などが挙げられ、好ましくはパン酵母として周知のSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneumなどが用いられる。Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セルビジエ)は、市販品をそのまま用いることができる。
【００１３】
これらの真核微生物は、例えばBODの測定に際して担体へ固定化して用いることもできる。微生物を固定化することにより、固定化された微生物を使用後に回収・洗浄後、再度測定に用いることが可能となる。固定化は、真核微生物の活性を阻害しないものであれば公知のいずれの方法も用いることができ、例えば担体共有結合法、包括法などが用いられる。また固定化に用いられる担体としては特に限定されないが、アルギン酸カルシウム、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドゲル、その他キトサンを素材とする多糖類系粒状ゲルのキトパール(登録商標)などの天然高分子、合成高分子類などが用いられ、好ましくは調製が容易なアルギン酸カルシウムが用いられる。真核微生物は、例えば担体1gに対し、湿重量にして0.05〜0.1g程度の担持量で固定化される。
【００１４】
真核微生物の有機物質の代謝は、ジメチルスルホキシドに溶解された酸化型キノン類の存在下で行われる。例えば酸化型キノンの一つであるメナジオンは、エタノール、ベンゼン、植物油、クロロホルム、CCl4などに溶解することが知られており、上記特許文献３においてもその溶媒としてエタノールが用いられているが、エタノールを用いた場合には、後記比較例にも示される如く測定毎の変動係数が大きい上、バックが生じやすく、信頼性の高いデータの取得は困難であるため好ましくない。
【００１５】
酸化型のキノン類としては、メナジオン(2-メチル-1,4-ナフトキノン)、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、ユビキノン、ハイドロキノン、2,6-ジクロロベンゾキノン、2-メチルベンゾキノン、2,5-ジヒドロキシベンゾキノン、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンなどが用いられ、好ましくはメナジオン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、コエンザイムＱ１が用いられる。この酸化型のキノン類は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解されて用いられる。メナジオンをDMSOに溶解して用いるに際しては、反応液中のメナジオン濃度が20〜2000μM、好ましくは100〜400μMとなるように用いられる。メナジオンが、これ以上の濃度で用いられると、セルの再利用が困難になり、一方これ以下の濃度で用いられると有機物に対する応答が低下する。また、DMSOは反応液中に4％以下、好ましくは1％以下となるように用いられる。DMSOがこれ以上の割合で反応液中に添加されると、酵母の有機物に対する資化性が低くなるため好ましくない。
【００１６】
酸化型キノンは、ミトコンドリア内で行われる呼吸鎖の電子伝達によらず、細胞質内で行われる解糖系で生成されるNHD(P)H＋H+によって還元型キノンとなり、これが酸素と反応することで過酸化水素または酸素ラジカルを生成する。従って、酸化型キノンを用いることにより、BODの測定にあっては、0.2〜500μlといった少量の測定試料を用いて高感度な測定が可能となるといった優れた効果を奏する。
【００１７】
酸化型キノンは、真核微生物懸濁液、有機物質含有溶液などからなる測定試料液中に40nM以上、好ましくは100nM〜5mM、さらに好ましくは200nM〜1mM程度の濃度となるように用いられる。これ以下の濃度で用いられると、化学発光により検出可能な過酸化水素等の生成がみられず、一方、これ以上の濃度で用いられても、生成される過酸化水素等の量に変化はみられない。
【００１８】
酸化型キノンに加えて、好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ(EC 1.15.1.1)が用いられる。スーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素ともよばれ、スーパーオキシドアニオンラジカルの不均化反応を触媒する働きを有するため、酸素ラジカルから酸素および過酸化水素を生成する。したがって、酸化型のキノンの存在下、真核微生物が有機物質を代謝する際に過酸化水素とともに生じる酸素ラジカル(O2-)を過酸化水素に変換するため、本方法での測定感度を向上させることができる。
【００１９】
代謝反応に際しては、有機物質の代謝中における菌体の活性を良好に保つため、反応溶液中に少なくとも10mM程度以上のリン酸イオンが含まれることが望ましい。これは、10mMリン酸緩衝液(phosphate buffer; PBは Na2HPO4・12H2O 3.58gまたはNaH2PO4・2H2O 1.56gをそれぞれ純水に溶解して、各溶液を1lとし、両者を混ぜ合わせてpH 7.0に調整し、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの、あるいは1倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 8g、Na2HPO4・12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2gを純水に溶解してpH 7.0に調整した後、全量を純水で1lとし、121℃、15分間オートクレーブ滅菌したものなど、好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。ここで、10mM程度のリン酸イオンが含まれることで、試料液のpHの影響を緩衝する作用も奏する。
【００２０】
微生物の有機物質代謝活動により生成された過酸化水素等は、化学発光により検出または定量が行われる。過酸化水素または酸素ラジカルの検出に用いられる化学発光試薬としては、公知のものを用いることができ、好ましくはルミノール(化学名：5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン)が用いられる。
【００２１】
ルミノール反応は、触媒の存在下、例えばペルオキシダーゼ、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、モリブデン、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの遷移金属、好ましくはペルオキシダーゼ、ヘキサシアノ鉄(III)カリウムの存在下で行われる。前記特許文献３記載の実施例では、大腸菌の菌液とメナジオンとの反応が重金属イオンの存在下で行われているが、微生物によってはこれらの重金属イオンに対して耐性を有しないものもあり、かかる観点からはこれらの重金属イオンを触媒として用いることは好ましくない。
【００２２】
化学発光試薬とともに触媒が用いられる場合には、触媒をキノン類存在下における微生物の有機物質代謝活動時に共存させることもできるが、好ましくはペルオキシダーゼを、微生物の有機物質代謝活動を行った後に、化学発光試薬とともに微生物および有機物質の反応溶液中に添加される。微生物の代謝活動中に触媒を存在させないことにより、触媒として用いられる金属に対して耐性を有しない微生物を検出する場合であっても、触媒の影響による代謝活性の阻害といった弊害を回避することができる。
【００２３】
化学発光の測定は発光検出装置によって行われ、例えば発光検出装置を備えたバッチ式の発光測定装置やフローインジェクション式の発光測定装置によって測定を行うこともできる。得られた発光量より、微生物の存否の確認や予め設定された検量線に基づいて試料液中の有機物量が算出される。
【００２４】
バッチ式の測定システムとしては、光検出器を備えた発光測定用システムまたは蛍光発光測定装置のいずれも使用することができる。光検出器は、フォトダイオードを搭載したシステムであれば装置構成が簡便であり、低価格であるが、その一方で、検出感度については次に示す光電子増倍管には劣るものであり、光電子増倍管は、検出感度にすぐれるものの、高価格で携帯を目的としたコンパクトなシステム化は期待できない。そのため、両者は使用条件に合わせて選択される。例えば、携帯用の測定装置にはフォトダイオードを使用したシステムが経済的かつコンパクトな設計が可能であるために好ましい。
【００２５】
バッチ式の測定システムで、微生物の活性を測定するBODの測定を行う一例を述べる。測定装置としては、市販品、例えばATTO社製品化学光検出器(ルミネッセンサーPSN)を使用することができる。この装置は外付けの送液ポンプにより、外部から暗室内に納めた発光検出用のセルへ溶液を送り込むことができる。予め直径1cm、長さ5cmの透明のポリスチレン製セル内に酵母懸濁液、酸化型キノンとしてメナジオンを溶解させたDMSO溶液および試料液を導入し、このセルを化学光検出器内に格納した上で装置内攪拌機でセル内の混合液を所定の時間攪拌すると、試料液の有機物量に相当する過酸化水素が生成される。その後、ルミノールとフェリシアン化カリウムのアルカリ性混合溶液を一定量添加すると直ちに化学発光が起こるため、発光反応により生じる光を光検出器で検出することができる。
【００２６】
複数の検体について測定する場合には、多項目同時測定バッチ式システムや、FIAシステムを用いることもできる。かかるシステムを用いることにより、測定に際して検体が注入されるセルの洗浄操作が必要なくなり、FIAシステムにあっては同一条件における連続測定が可能となる。
【００２７】
バッチ式の多項目同時測定システムとしては、市販の多項目同時測定を可能とした化学発光検出器や蛍光測定器を用いることができる。これらのシステムでは一枚のプレートに複数のセルが配置されており、それらには24試料液が同時に測定可能な24穴プレートの他に、96穴プレート、384穴プレートなどがある。このような多項目同時測定システムを用いることにより、例えば、検量線作成用の標準液と複数の試料液とを同一のプレート上に配置させて、多試料を同時に計測することもできる。
【００２８】
FIAシステムとしては、例えばチューブ内の溶液を扱き出すペリスタリックポンプと試料注入器(サンプルインジェクター)、溶液混合部(ミキシングジョイント)、化学発光検出器から構成されたシステムなどを用い、移相用の流路としては、微生物・有機物質移相用流路、化学発光試薬移送用流路の少なくとも2本が用いられる。これは、微生物移相用溶液と化学発光試薬移送用溶液とでは使用する緩衝液のpHが、前者は中性付近、後者はアルカリ性と異なるためである。
【００２９】
触媒としてペルオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼをルミノールに溶解させた混合溶液を化学発光試薬として用いることもできるが、かかる使用はペルオキシダーゼの必要量が多くなる傾向がある。従って、例えば光化学発光出器の近傍にペルオキシダーゼを担持させた担体を配置させるためのフローセルを設けることもできる。
【００３０】
さらに触媒としてフェリシアン化カリウムが用いられる場合には、図１に示される如く微生物移相用流路、ルミノール溶液用流路およびフェリシアン化カリウム溶液用流路の計3本の流路を使用することが好ましい。これは、両者を混ぜた後に長時間放置すると、過酸化水素との化学発光反応が効率的に行われないためである。ただし、フェリシアン化カリウムをルミノールと混合した際に微弱ながら発光を起こすため、予め混ぜておく必要があり、さらに好ましくは両者を混合してから過酸化水素と接触するまでの間を3分間程度おくための長流路が、例えば遅延コイルなどとして設けられる。
【００３１】
BODの測定に当っては、図２に示される如くさらに微生物が固定化されたカラムを用いることもできる。この微生物固定化カラムを用いることにより、測定毎に微生物を調製する必要がなくなり、また同一微生物を繰り返し使用可能となるといった効果を奏する。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００３３】
実施例１
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径ラ180mmの試験管に入れたYPD液体培地2mlに接種し、シリコーン栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。なお、YPD液体培地としては、酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解し、全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが、YPD寒天培地としては、酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解し、全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが用いられた。
【００３４】
YPD寒天培地上のコロニーから菌体を白金耳でYPD液体培地2mlに接種し、28℃、180rpm、好気条件下で13〜14時間振とう培養を行い、さらに500ml容量の坂口フラスコ中で、YPD液体培地50mlに最終濃度が0.5％となるよう前培養液を接種し、シリコーン栓で蓋をして、28℃、120rpm、好気条件下で9〜10時間本培養を行った。細胞の増殖相は、対数増殖期(OD600=0.9以上)に達していた。
【００３５】
本培養液全量を遠沈管に移した後、4℃、3000rpmの条件下で3分間の遠心分離を行い、集菌を行った。集菌後、0.9％生理食塩水で3回洗浄を行い、ペレット状の酵母を25mlの0.9％生理食塩水で懸濁して50ml遠沈管内で2時間エアレーションを行った後、再び洗浄操作を三回繰り返した。洗浄後、最終菌体濃度がOD600=15〜45となるように0.9％生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて菌体懸濁液(酵母液)を調製した。菌体懸濁液(酵母液)は使用まで4℃で保管した。
【００３６】
透明のポリスチレン製化学発光セル内に、純水48.5μl、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 80g、Na2HPO4・12H2O 29g、KCl 2g、KH2PO4 2gを超純水に溶解してpH 7.0に調製し、その後全量を1l とし、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの)46.5μl、0.9%生理食塩水25μl、DMSOで調製した20mMメナジオン(MP Biomedicals社製品)溶液5μl、測定試料液としてグルコース・グルタミン酸(GGA)で調製した110mg O2/l、220mg O2/l、330mg O2/l、440mg O2/lのBOD値を示す標準溶液または純水350μl 、0.9％生理食塩水によって3倍に希釈された調製された酵母(S. cerevisiae)液(OD600=15)25μlを加えてから、化学光検出器(ATTO社製ルミネッセンサーPSN)にセットし、蓋を閉じてから攪拌を開始した。セルのセットから正確に5分間経過した後、蓋を開け、0.7mMルミノール溶液と20mMフェリシアン化カリウム溶液を測定前に予め1:2の割合で混合しておいた発光試薬溶液(pH 10.9)を1.5ml添加し、その直後に化学発光測定を開始した。測定値は化学発光の検出時間を15秒間に設定し、その間の発光強度(任意の値；a.u.)を積分値として算出した。
【００３７】
得られた結果は、図３に示される。この図に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(発光強度)により測定できることが示された。ここで、各標準溶液を５回ずつ測定して得た変動係数(CV値)の平均値は7.41％、相関係数はr=0.993であった。
【００３８】
比較例１
実施例１において、メナジオンの溶媒としてDMSOの代わりにエタノールを用い、BOD値440mg O2/lを示すGGA標準溶液を用いて５回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は4.39×10-6であり、変動係数(CV値)は、15.1％であった。
【００３９】
比較例２
比較例１において、GGA標準溶液の代わりに純水を用いて５回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は8.05×10-6であり、変動係数(CV値)は、13.8％であった。
【００４０】
実施例１および比較例１〜２で得られた結果より、メナジオンの溶媒としてエタノールを用いた場合には、変動係数が大きくなることに加えて、測定値のバックがDMSOを用いた場合に比べて非常に高いことが示された。
【００４１】
実施例２
実施例１において、酵母液としてOD600=21.4のものが同量用いられ、また10倍PBS緩衝液量が50μlに、純水量が70μlにそれぞれ変更され、さらに測定試料液として5.5 O2/l、11mg O2/l、22mg O2/l、55mg O2/l、110mg O2/l、165mg O2/l、220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液または純水を同量用いて、反応溶液の攪拌を振とう機(NISSIN Co., NA-201 series 2)に変更し、振とう速度を180rpmとして正確に5分間振とう後に化学光検出器にセルをセットし、発光試薬溶液を同量添加して化学発光測定が行われた。
【００４２】
得られた結果は、図４に示される。この図に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(発光強度)により測定できることが示された。ここで、得られた検量線の直線範囲は5.5〜220mg O2/l GGAであり、極めてダイナミックレンジの広い実用的な結果が得られた。さらに、各標準溶液を3回ずつ測定して得た変動係数(CV値)は5.74％(0mg O2/l)、1.91％(5.5mg O2/l)、1.57％(11mg O2/l)、1.64％(22mg O2/l)、4.87％(55mg O2/l)、3.16％(110mg O2/l)、3.93％(165mg O2/l)、1.82％(220mg O2/l)、その平均値は3.08％、相関係数はr=0.998であった。以上より、攪拌の変更により、繰り返し測定の回数を実施例１の5回から3回に減らしたにもかかわらず、セル内の溶液の反応が再現性よく行われた結果、検出下限を実用的な範囲にまで改善できた。これにより、もともと良好であった本法のダイナミックレンジの広さがさらに改善された。
【００４３】
実施例３
図１に示すFIAシステムを用い、流路1に発光試薬溶液としての0.7mMルミノール試薬を、流路2に20mMフェリシアン化カリウム試薬を、流路3にキャリヤー溶液であるPBS緩衝液を、それぞれ室温下、流速約0.7ml/分でポンプにより送液した。発光試薬溶液はキャリヤー溶液(流路3)と混合する前に、ルミノール試薬(流路1)とフェリシアン化カリウム試薬(流路2)とを予め混合した後、遅延コイルを通過させた。試料液としては、10倍PBS緩衝液46.5μl、純水48.5μl、0.9％生理食塩水25μl、DMSOで調製した20mMメナジオン溶液5μl、110mg O2/l、220mg O2/l、330mg O2/l、440mg O2/lのBOD値を示すGGA標準溶液または純水350μlと酵母液(OD600=15)25μlの混合液500μlを遮光性のマイクロチューブ内で振とうしながら正確に5分間反応させたものが用いられ、これをサンプルインジェクター(REODYNE社製7125型、100μlサンプルループ)により流路3のキャリヤー溶液中に注入した。注入された試料液は、発光試薬液との混合部に移送してT字管で混合し、渦巻状のフローセルまで送液した。
【００４４】
混合された液体から発した化学発光の発光量を化学発光検出器(浜松フォトニクス製SiフォトダイオードS2281-01)によって発光強度として検出し、さらにフォトアンプ(同社製品フォトセンサーアンプC9329)により信号を増幅して濃度に応じたピークをパソコンを用いて記録した。なお、この装置において、ポンプは4チャンネルのペリスタリック型ポンプ(GILSON社製MINIPLUS 3)を、ポンプチューブは内径１mmのPherMedチューブ(NORTON社製)を使用し、その他の流路にはテトラフルオロエチレンチューブ及びシリコンチューブを使用した。
【００４５】
実施例３で得られた結果は、図５示される。図５に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、化学発光検出型フローインジェクション分析システムにおいても応答値(発光強度)により測定できることが示された。また、各標準溶液を3回ずつ測定して得た相関係数はr =0.986と良好な値であった。
【００４６】
実施例４
実施例３において、図２に示すFIAシステムを用い、試薬液としては酵母液が全量純水に置き換えられたもの用いて、応答値(発光強度)の測定を3回行ったところ、各々1mVの出力が認められた。ここで、酵母固定化カラムとしては、直径0.745cm、長さ5.0cm、容積2.19mlのステンレス製容器内に、S. cerevisiaeをアルギン酸カルシウム担体に固定化した酵素固定化ゲルビーズを充填したものが用いられた。ここで酵素固定化ゲルビーズは、(OD600=45)の酵母懸濁液3gを0.9％塩化ナトリウム水溶液9mlに入れて20分間攪拌後、2％アルギン酸ナトリウム溶液15mlを入れてさらに20分間攪拌後、1mLのシリンジを用いて1％塩化カルシウム溶液300ml中に添加して30分間攪拌することにより調製された。
【００４７】
比較例３
実施例４において、試薬液中のGGA標準溶液の代わりに同量の純水が用いられたところ、3回の測定のいずれも0mVであった。
【００４８】
実施例５
実施例２において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=22.3のものが同量用いられ、また攪拌時間が20秒に変更されて化学発光の測定が行われた。
【００４９】
得られた結果は、図６に示される。この図には、反応時間を可能な限り短縮したうえでの、重金属イオンの化学発光反応へ及ぼす影響が、測定試料液として重金属イオン非存在下(コントロール)のものを用いた場合の結果とともに示され、Cu2+以外、特にFe3+は応答値を大きくする傾向が示されている。このことは、化学発光試薬の触媒として、フェリシアン化カリウム以外にFe3+を添加することで、化学発光が増強され、より高感度なBOD検出を可能とすることを示唆している。
【００５０】
実施例６
実施例２において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=23.2のものが同量用いられて化学発光の測定が行われた。
【００５１】
得られた結果は、図７に示される。この図には、反応時間を通常の5分間としていることから、重金属イオンの化学発光反応へ及ぼす影響に加えて、酵母への影響があわせて示されており、実施例５と同様にCu2+の影響は観察されなかった一方で、Mn2+、Fe3+およびPb2+については実施例５では化学発光(応答値)を増強したにもかかわらず、コントロール値と比べて低い応答値を示した。これは、Mn2+、Fe3+およびPb2+が酵母の代謝活性に甚大な影響を及ぼしたためと考えられる。他方、Cr3+については実施例５で化学発光をやや増強する結果を示したのに加え、酵母の代謝を効果的に活性化する活性化剤としての効果が示された。以上より、本法では測定試料液中に重金属イオンが存在すると、応答値に影響を及ぼす可能性が示されたものの、酵母活性を高める手段としてのCr3+の効果が示された。
【００５２】
実施例５および６の結果より、Fe3+による化学発光の増強効果およびCr3+による酵母の代謝活性化剤としての作用の組み合わせによって、さらに高感度なBOD計測の可能性が示された。なお、これらの実施例で用いられた重金属イオンの濃度は天然の河川水に存在する濃度をはるかに上回るため、実際の河川水に応用する場合には大きな支障は生じないものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明にかかる微生物の活性測定法は、用いる微生物量を一定とすることによる河川や産業排水中の有機物質量の測定や、有機物質量を一定とすることによる食品中の微生物の検出確認あるいは土壌中に存在する微生物量などの測定などに有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明で用いられるFIAシステムの一例を示す図である
【図２】本発明で用いられるBOD測定用FIAシステムの一例を示す図である
【図３】実施例１で得られた結果を示すグラフである
【図４】実施例２で得られた結果を示すグラフである
【図５】実施例３で得られた結果を示すグラフである
【図６】実施例４で得られた結果を示すグラフである
【図７】実施例５で得られた結果を示すグラフである
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核微生物の活性測定法に関する。更に詳しくは、化学発光を用いた真核微生物の活性測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川や産業排水の水質管理に重要な項目として、BOD(生物化学的酸素要求量)があり、国際的な有機性水質汚濁の指標とされている。有機化合物に起因する水質汚濁は、好気性微生物による酸化反応で減少し、消去され、その有機物質濃度に対応して溶存酸素が消費されるため、この消費された酸素量を計測することで、水質汚濁が明らかになるのである。したがって、BODは有機化合物濃度を酸素量により間接的に表したものである。
【０００３】
BOD測定法としては、種々の方法が提案されている。例えば特許文献１には、トリコスポロン属の酵母を溶存酸素電極の表面に固定して、酵母が河川や排水中に含まれる有機汚濁物質を資化することで消費された溶存酸素の濃度を酸素電極で測定する方法が提案されている。この方法によれば、河川や排水中に含まれるさまざまな有機物質の総量を有機汚濁物質としてまとめて測定ができる特徴があるものの、測定溶液中にごく僅かしか溶存しない酸素の濃度を高感度に測定する必要があることから、測定システムが必然的に大きくなってしまうなどの問題点があり、試験室や工場などの屋内に限らず、現場での計測も必要となるBODの測定には向かない場合があった。また測定システム上、溶存酸素の非常に低い廃液にあっては正確な値を測定することが難しいという限界もあった。
【特許文献１】特公昭６１−７２５８号公報
【０００４】
かかる問題に対して、溶存酸素量が低い場合にあってもBODの正確な測定を可能とするメディエーターを用いたBOD測定法が開発された。かかる測定法は、溶存酸素に比べて液体中の溶解濃度が高い電子の濃度を指標とした電気化学(電極)測定型であり、BODの正確な測定および測定装置の小型化を可能とするといった画期的なものであった。
【特許文献２】特開平０７−１６７８２４号公報
【０００５】
しかるに、かかる測定法は微生物が有機物質を代謝することによる電子伝達系の電子の移動を検知するものであるため、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合には、測定感度に乏しいとされ、原核微生物を利用した測定法が単に数多く提案されているにとどまるのが現状である。しかしながら、原核微生物は培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題があり、種々の測定法に応用し、実用化する場合の障壁となっており、真核微生物を用いたメディエーター型のBOD測定法の開発が望まれている。
【０００６】
一方、真核微生物の検出手段としてその呼吸活性を高感度に測定する方法として、微生物をエタノールに溶解した酸化型キノンとともに培養液中でインキュベーションして、生成物をモリブデンなどの重金属イオンの存在下で化学発光試薬と反応させて定量するという方法が提案されている。かかる方法は、呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われる真核微生物を用いた場合にも、測定感度の向上が期待される方法であると考えられるが、測定毎の変動係数が10％以上と大きく、再現性に欠けるものであった。
【特許文献３】特開平１１−２９００９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、測定毎の変動係数が小さく、より信頼性の高い真核微生物の活性測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる本発明の目的は、ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、好ましくは触媒の存在下で化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定することによって達成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明においては、キノン類の溶媒として微生物にダメージを与えにくいジメチルスルホキシドを用いているため、微生物の有機物質代謝活性を害することなく、微生物活性および有機物質量に応じた微生物の活性を測定することを可能とするといったすぐれた効果を奏する。
【００１０】
従って、培養や前処理などにおける操作性や保存安定性に問題がある原核微生物を用いることなく、真核微生物を用いて再現性の高いBODの測定することができるとともに、その測定感度も、従来提案されていた真核微生物を用いたBOD測定法と比較して、0.2〜500μlといった少量の試料で、数倍程度高感度となるといったすぐれた効果を奏する。
【００１１】
本発明方法はまた、有機物質を含む例えば培地中に、微生物の有無を調べる食品、土壌などの検体を添加して一定時間培養後、微生物の活性を測定することにより、真核微生物を含めた全微生物の存在を極めて高感度かつ確実に行うことも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
真核微生物としては、これに属する微生物であれば特に限定されないが、BODの測定にあたっては、好ましくは適用技術により分離・培養可能な微生物が用いられ、取扱い容易といった観点からは、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneum、Trichosporon fermentans、Trichosporon brassicae、Candida属、Aspergillus属などが挙げられ、好ましくはパン酵母として周知のSaccharomyces cerevisiae、Trichosporon cutaneumなどが用いられる。Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セルビジエ)は、市販品をそのまま用いることができる。
【００１３】
これらの真核微生物は、例えばBODの測定に際して担体へ固定化して用いることもできる。微生物を固定化することにより、固定化された微生物を使用後に回収・洗浄後、再度測定に用いることが可能となる。固定化は、真核微生物の活性を阻害しないものであれば公知のいずれの方法も用いることができ、例えば担体共有結合法、包括法などが用いられる。また固定化に用いられる担体としては特に限定されないが、アルギン酸カルシウム、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドゲル、その他キトサンを素材とする多糖類系粒状ゲルのキトパール(登録商標)などの天然高分子、合成高分子類などが用いられ、好ましくは調製が容易なアルギン酸カルシウムが用いられる。真核微生物は、例えば担体1gに対し、湿重量にして0.05〜0.1g程度の担持量で固定化される。
【００１４】
真核微生物の有機物質の代謝は、ジメチルスルホキシドに溶解された酸化型キノン類の存在下で行われる。例えば酸化型キノンの一つであるメナジオンは、エタノール、ベンゼン、植物油、クロロホルム、CCl4などに溶解することが知られており、上記特許文献３においてもその溶媒としてエタノールが用いられているが、エタノールを用いた場合には、後記比較例にも示される如く測定毎の変動係数が大きい上、バックが生じやすく、信頼性の高いデータの取得は困難であるため好ましくない。
【００１５】
酸化型のキノン類としては、メナジオン(2-メチル-1,4-ナフトキノン)、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、ユビキノン、ハイドロキノン、2,6-ジクロロベンゾキノン、2-メチルベンゾキノン、2,5-ジヒドロキシベンゾキノン、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンなどが用いられ、好ましくはメナジオン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノン、コエンザイムＱ１が用いられる。この酸化型のキノン類は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解されて用いられる。メナジオンをDMSOに溶解して用いるに際しては、反応液中のメナジオン濃度が20〜2000μM、好ましくは100〜400μMとなるように用いられる。メナジオンが、これ以上の濃度で用いられると、セルの再利用が困難になり、一方これ以下の濃度で用いられると有機物に対する応答が低下する。また、DMSOは反応液中に4％以下、好ましくは1％以下となるように用いられる。DMSOがこれ以上の割合で反応液中に添加されると、酵母の有機物に対する資化性が低くなるため好ましくない。
【００１６】
酸化型キノンは、ミトコンドリア内で行われる呼吸鎖の電子伝達によらず、細胞質内で行われる解糖系で生成されるNHD(P)H＋H+によって還元型キノンとなり、これが酸素と反応することで過酸化水素または酸素ラジカルを生成する。従って、酸化型キノンを用いることにより、BODの測定にあっては、0.2〜500μlといった少量の測定試料を用いて高感度な測定が可能となるといった優れた効果を奏する。
【００１７】
酸化型キノンは、真核微生物懸濁液、有機物質含有溶液などからなる測定試料液中に40nM以上、好ましくは100nM〜5mM、さらに好ましくは200nM〜1mM程度の濃度となるように用いられる。これ以下の濃度で用いられると、化学発光により検出可能な過酸化水素等の生成がみられず、一方、これ以上の濃度で用いられても、生成される過酸化水素等の量に変化はみられない。
【００１８】
酸化型キノンに加えて、好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ(EC 1.15.1.1)が用いられる。スーパーオキシドジスムターゼは、超酸化物不均化酵素ともよばれ、スーパーオキシドアニオンラジカルの不均化反応を触媒する働きを有するため、酸素ラジカルから酸素および過酸化水素を生成する。したがって、酸化型のキノンの存在下、真核微生物が有機物質を代謝する際に過酸化水素とともに生じる酸素ラジカル(O2-)を過酸化水素に変換するため、本方法での測定感度を向上させることができる。
【００１９】
代謝反応に際しては、有機物質の代謝中における菌体の活性を良好に保つため、反応溶液中に少なくとも10mM程度以上のリン酸イオンが含まれることが望ましい。これは、10mMリン酸緩衝液(phosphate buffer; PBは Na2HPO4・12H2O 3.58gまたはNaH2PO4・2H2O 1.56gをそれぞれ純水に溶解して、各溶液を1lとし、両者を混ぜ合わせてpH 7.0に調整し、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの、あるいは1倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 8g、Na2HPO4・12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2gを純水に溶解してpH 7.0に調整した後、全量を純水で1lとし、121℃、15分間オートクレーブ滅菌したものなど、好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。ここで、10mM程度のリン酸イオンが含まれることで、試料液のpHの影響を緩衝する作用も奏する。
【００２０】
微生物の有機物質代謝活動により生成された過酸化水素等は、化学発光により検出または定量が行われる。過酸化水素または酸素ラジカルの検出に用いられる化学発光試薬としては、公知のものを用いることができ、好ましくはルミノール(化学名：5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン)が用いられる。
【００２１】
ルミノール反応は、触媒の存在下、例えばペルオキシダーゼ、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、モリブデン、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの遷移金属、好ましくはペルオキシダーゼ、ヘキサシアノ鉄(III)カリウムの存在下で行われる。前記特許文献３記載の実施例では、大腸菌の菌液とメナジオンとの反応が重金属イオンの存在下で行われているが、微生物によってはこれらの重金属イオンに対して耐性を有しないものもあり、かかる観点からはこれらの重金属イオンを触媒として用いることは好ましくない。
【００２２】
化学発光試薬とともに触媒が用いられる場合には、触媒をキノン類存在下における微生物の有機物質代謝活動時に共存させることもできるが、好ましくはペルオキシダーゼを、微生物の有機物質代謝活動を行った後に、化学発光試薬とともに微生物および有機物質の反応溶液中に添加される。微生物の代謝活動中に触媒を存在させないことにより、触媒として用いられる金属に対して耐性を有しない微生物を検出する場合であっても、触媒の影響による代謝活性の阻害といった弊害を回避することができる。
【００２３】
化学発光の測定は発光検出装置によって行われ、例えば発光検出装置を備えたバッチ式の発光測定装置やフローインジェクション式の発光測定装置によって測定を行うこともできる。得られた発光量より、微生物の存否の確認や予め設定された検量線に基づいて試料液中の有機物量が算出される。
【００２４】
バッチ式の測定システムとしては、光検出器を備えた発光測定用システムまたは蛍光発光測定装置のいずれも使用することができる。光検出器は、フォトダイオードを搭載したシステムであれば装置構成が簡便であり、低価格であるが、その一方で、検出感度については次に示す光電子増倍管には劣るものであり、光電子増倍管は、検出感度にすぐれるものの、高価格で携帯を目的としたコンパクトなシステム化は期待できない。そのため、両者は使用条件に合わせて選択される。例えば、携帯用の測定装置にはフォトダイオードを使用したシステムが経済的かつコンパクトな設計が可能であるために好ましい。
【００２５】
バッチ式の測定システムで、微生物の活性を測定するBODの測定を行う一例を述べる。測定装置としては、市販品、例えばATTO社製品化学光検出器(ルミネッセンサーPSN)を使用することができる。この装置は外付けの送液ポンプにより、外部から暗室内に納めた発光検出用のセルへ溶液を送り込むことができる。予め直径1cm、長さ5cmの透明のポリスチレン製セル内に酵母懸濁液、酸化型キノンとしてメナジオンを溶解させたDMSO溶液および試料液を導入し、このセルを化学光検出器内に格納した上で装置内攪拌機でセル内の混合液を所定の時間攪拌すると、試料液の有機物量に相当する過酸化水素が生成される。その後、ルミノールとフェリシアン化カリウムのアルカリ性混合溶液を一定量添加すると直ちに化学発光が起こるため、発光反応により生じる光を光検出器で検出することができる。
【００２６】
複数の検体について測定する場合には、多項目同時測定バッチ式システムや、FIAシステムを用いることもできる。かかるシステムを用いることにより、測定に際して検体が注入されるセルの洗浄操作が必要なくなり、FIAシステムにあっては同一条件における連続測定が可能となる。
【００２７】
バッチ式の多項目同時測定システムとしては、市販の多項目同時測定を可能とした化学発光検出器や蛍光測定器を用いることができる。これらのシステムでは一枚のプレートに複数のセルが配置されており、それらには24試料液が同時に測定可能な24穴プレートの他に、96穴プレート、384穴プレートなどがある。このような多項目同時測定システムを用いることにより、例えば、検量線作成用の標準液と複数の試料液とを同一のプレート上に配置させて、多試料を同時に計測することもできる。
【００２８】
FIAシステムとしては、例えばチューブ内の溶液を扱き出すペリスタリックポンプと試料注入器(サンプルインジェクター)、溶液混合部(ミキシングジョイント)、化学発光検出器から構成されたシステムなどを用い、移相用の流路としては、微生物・有機物質移相用流路、化学発光試薬移送用流路の少なくとも2本が用いられる。これは、微生物移相用溶液と化学発光試薬移送用溶液とでは使用する緩衝液のpHが、前者は中性付近、後者はアルカリ性と異なるためである。
【００２９】
触媒としてペルオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼをルミノールに溶解させた混合溶液を化学発光試薬として用いることもできるが、かかる使用はペルオキシダーゼの必要量が多くなる傾向がある。従って、例えば光化学発光出器の近傍にペルオキシダーゼを担持させた担体を配置させるためのフローセルを設けることもできる。
【００３０】
さらに触媒としてフェリシアン化カリウムが用いられる場合には、図１に示される如く微生物移相用流路、ルミノール溶液用流路およびフェリシアン化カリウム溶液用流路の計3本の流路を使用することが好ましい。これは、両者を混ぜた後に長時間放置すると、過酸化水素との化学発光反応が効率的に行われないためである。ただし、フェリシアン化カリウムをルミノールと混合した際に微弱ながら発光を起こすため、予め混ぜておく必要があり、さらに好ましくは両者を混合してから過酸化水素と接触するまでの間を3分間程度おくための長流路が、例えば遅延コイルなどとして設けられる。
【００３１】
BODの測定に当っては、図２に示される如くさらに微生物が固定化されたカラムを用いることもできる。この微生物固定化カラムを用いることにより、測定毎に微生物を調製する必要がなくなり、また同一微生物を繰り返し使用可能となるといった効果を奏する。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００３３】
実施例１
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径ラ180mmの試験管に入れたYPD液体培地2mlに接種し、シリコーン栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。なお、YPD液体培地としては、酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解し、全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが、YPD寒天培地としては、酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解し、全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが用いられた。
【００３４】
YPD寒天培地上のコロニーから菌体を白金耳でYPD液体培地2mlに接種し、28℃、180rpm、好気条件下で13〜14時間振とう培養を行い、さらに500ml容量の坂口フラスコ中で、YPD液体培地50mlに最終濃度が0.5％となるよう前培養液を接種し、シリコーン栓で蓋をして、28℃、120rpm、好気条件下で9〜10時間本培養を行った。細胞の増殖相は、対数増殖期(OD600=0.9以上)に達していた。
【００３５】
本培養液全量を遠沈管に移した後、4℃、3000rpmの条件下で3分間の遠心分離を行い、集菌を行った。集菌後、0.9％生理食塩水で3回洗浄を行い、ペレット状の酵母を25mlの0.9％生理食塩水で懸濁して50ml遠沈管内で2時間エアレーションを行った後、再び洗浄操作を三回繰り返した。洗浄後、最終菌体濃度がOD600=15〜45となるように0.9％生理食塩水を加え、酵母液をボルテクスミキサーとピペッティングでよく分散させて菌体懸濁液(酵母液)を調製した。菌体懸濁液(酵母液)は使用まで4℃で保管した。
【００３６】
透明のポリスチレン製化学発光セル内に、純水48.5μl、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffer saline；PBSはNaCl 80g、Na2HPO4・12H2O 29g、KCl 2g、KH2PO4 2gを超純水に溶解してpH 7.0に調製し、その後全量を1l とし、121℃, 15分間オートクレーブ滅菌したもの)46.5μl、0.9%生理食塩水25μl、DMSOで調製した20mMメナジオン(MP Biomedicals社製品)溶液5μl、測定試料液としてグルコース・グルタミン酸(GGA)で調製した110mg O2/l、220mg O2/l、330mg O2/l、440mg O2/lのBOD値を示す標準溶液または純水350μl 、0.9％生理食塩水によって3倍に希釈された調製された酵母(S. cerevisiae)液(OD600=15)25μlを加えてから、化学光検出器(ATTO社製ルミネッセンサーPSN)にセットし、蓋を閉じてから攪拌を開始した。セルのセットから正確に5分間経過した後、蓋を開け、0.7mMルミノール溶液と20mMフェリシアン化カリウム溶液を測定前に予め1:2の割合で混合しておいた発光試薬溶液(pH 10.9)を1.5ml添加し、その直後に化学発光測定を開始した。測定値は化学発光の検出時間を15秒間に設定し、その間の発光強度(任意の値；a.u.)を積分値として算出した。
【００３７】
得られた結果は、図３に示される。この図に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(発光強度)により測定できることが示された。ここで、各標準溶液を５回ずつ測定して得た変動係数(CV値)の平均値は7.41％、相関係数はr=0.993であった。
【００３８】
比較例１
実施例１において、メナジオンの溶媒としてDMSOの代わりにエタノールを用い、BOD値440mg O2/lを示すGGA標準溶液を用いて５回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は4.39×10-6であり、変動係数(CV値)は、15.1％であった。
【００３９】
比較例２
比較例１において、GGA標準溶液の代わりに純水を用いて５回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は8.05×10-6であり、変動係数(CV値)は、13.8％であった。
【００４０】
実施例１および比較例１〜２で得られた結果より、メナジオンの溶媒としてエタノールを用いた場合には、変動係数が大きくなることに加えて、測定値のバックがDMSOを用いた場合に比べて非常に高いことが示された。
【００４１】
実施例２
実施例１において、酵母液としてOD600=21.4のものが同量用いられ、また10倍PBS緩衝液量が50μlに、純水量が70μlにそれぞれ変更され、さらに測定試料液として5.5 O2/l、11mg O2/l、22mg O2/l、55mg O2/l、110mg O2/l、165mg O2/l、220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液または純水を同量用いて、反応溶液の攪拌を振とう機(NISSIN Co., NA-201 series 2)に変更し、振とう速度を180rpmとして正確に5分間振とう後に化学光検出器にセルをセットし、発光試薬溶液を同量添加して化学発光測定が行われた。
【００４２】
得られた結果は、図４に示される。この図に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、応答値(発光強度)により測定できることが示された。ここで、得られた検量線の直線範囲は5.5〜220mg O2/l GGAであり、極めてダイナミックレンジの広い実用的な結果が得られた。さらに、各標準溶液を3回ずつ測定して得た変動係数(CV値)は5.74％(0mg O2/l)、1.91％(5.5mg O2/l)、1.57％(11mg O2/l)、1.64％(22mg O2/l)、4.87％(55mg O2/l)、3.16％(110mg O2/l)、3.93％(165mg O2/l)、1.82％(220mg O2/l)、その平均値は3.08％、相関係数はr=0.998であった。以上より、攪拌の変更により、繰り返し測定の回数を実施例１の5回から3回に減らしたにもかかわらず、セル内の溶液の反応が再現性よく行われた結果、検出下限を実用的な範囲にまで改善できた。これにより、もともと良好であった本法のダイナミックレンジの広さがさらに改善された。
【００４３】
実施例３
図１に示すFIAシステムを用い、流路1に発光試薬溶液としての0.7mMルミノール試薬を、流路2に20mMフェリシアン化カリウム試薬を、流路3にキャリヤー溶液であるPBS緩衝液を、それぞれ室温下、流速約0.7ml/分でポンプにより送液した。発光試薬溶液はキャリヤー溶液(流路3)と混合する前に、ルミノール試薬(流路1)とフェリシアン化カリウム試薬(流路2)とを予め混合した後、遅延コイルを通過させた。試料液としては、10倍PBS緩衝液46.5μl、純水48.5μl、0.9％生理食塩水25μl、DMSOで調製した20mMメナジオン溶液5μl、110mg O2/l、220mg O2/l、330mg O2/l、440mg O2/lのBOD値を示すGGA標準溶液または純水350μlと酵母液(OD600=15)25μlの混合液500μlを遮光性のマイクロチューブ内で振とうしながら正確に5分間反応させたものが用いられ、これをサンプルインジェクター(REODYNE社製7125型、100μlサンプルループ)により流路3のキャリヤー溶液中に注入した。注入された試料液は、発光試薬液との混合部に移送してT字管で混合し、渦巻状のフローセルまで送液した。
【００４４】
混合された液体から発した化学発光の発光量を化学発光検出器(浜松フォトニクス製SiフォトダイオードS2281-01)によって発光強度として検出し、さらにフォトアンプ(同社製品フォトセンサーアンプC9329)により信号を増幅して濃度に応じたピークをパソコンを用いて記録した。なお、この装置において、ポンプは4チャンネルのペリスタリック型ポンプ(GILSON社製MINIPLUS 3)を、ポンプチューブは内径１mmのPherMedチューブ(NORTON社製)を使用し、その他の流路にはテトラフルオロエチレンチューブ及びシリコンチューブを使用した。
【００４５】
実施例３で得られた結果は、図５示される。図５に示されるように、有機物質量の増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、化学発光検出型フローインジェクション分析システムにおいても応答値(発光強度)により測定できることが示された。また、各標準溶液を3回ずつ測定して得た相関係数はr =0.986と良好な値であった。
【００４６】
実施例４
実施例３において、図２に示すFIAシステムを用い、試薬液としては酵母液が全量純水に置き換えられたもの用いて、応答値(発光強度)の測定を3回行ったところ、各々1mVの出力が認められた。ここで、酵母固定化カラムとしては、直径0.745cm、長さ5.0cm、容積2.19mlのステンレス製容器内に、S. cerevisiaeをアルギン酸カルシウム担体に固定化した酵素固定化ゲルビーズを充填したものが用いられた。ここで酵素固定化ゲルビーズは、(OD600=45)の酵母懸濁液3gを0.9％塩化ナトリウム水溶液9mlに入れて20分間攪拌後、2％アルギン酸ナトリウム溶液15mlを入れてさらに20分間攪拌後、1mLのシリンジを用いて1％塩化カルシウム溶液300ml中に添加して30分間攪拌することにより調製された。
【００４７】
比較例３
実施例４において、試薬液中のGGA標準溶液の代わりに同量の純水が用いられたところ、3回の測定のいずれも0mVであった。
【００４８】
実施例５
実施例２において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=22.3のものが同量用いられ、また攪拌時間が20秒に変更されて化学発光の測定が行われた。
【００４９】
得られた結果は、図６に示される。この図には、反応時間を可能な限り短縮したうえでの、重金属イオンの化学発光反応へ及ぼす影響が、測定試料液として重金属イオン非存在下(コントロール)のものを用いた場合の結果とともに示され、Cu2+以外、特にFe3+は応答値を大きくする傾向が示されている。このことは、化学発光試薬の触媒として、フェリシアン化カリウム以外にFe3+を添加することで、化学発光が増強され、より高感度なBOD検出を可能とすることを示唆している。
【００５０】
実施例６
実施例２において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=23.2のものが同量用いられて化学発光の測定が行われた。
【００５１】
得られた結果は、図７に示される。この図には、反応時間を通常の5分間としていることから、重金属イオンの化学発光反応へ及ぼす影響に加えて、酵母への影響があわせて示されており、実施例５と同様にCu2+の影響は観察されなかった一方で、Mn2+、Fe3+およびPb2+については実施例５では化学発光(応答値)を増強したにもかかわらず、コントロール値と比べて低い応答値を示した。これは、Mn2+、Fe3+およびPb2+が酵母の代謝活性に甚大な影響を及ぼしたためと考えられる。他方、Cr3+については実施例５で化学発光をやや増強する結果を示したのに加え、酵母の代謝を効果的に活性化する活性化剤としての効果が示された。以上より、本法では測定試料液中に重金属イオンが存在すると、応答値に影響を及ぼす可能性が示されたものの、酵母活性を高める手段としてのCr3+の効果が示された。
【００５２】
実施例５および６の結果より、Fe3+による化学発光の増強効果およびCr3+による酵母の代謝活性化剤としての作用の組み合わせによって、さらに高感度なBOD計測の可能性が示された。なお、これらの実施例で用いられた重金属イオンの濃度は天然の河川水に存在する濃度をはるかに上回るため、実際の河川水に応用する場合には大きな支障は生じないものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明にかかる微生物の活性測定法は、用いる微生物量を一定とすることによる河川や産業排水中の有機物質量の測定や、有機物質量を一定とすることによる食品中の微生物の検出確認あるいは土壌中に存在する微生物量などの測定などに有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明で用いられるFIAシステムの一例を示す図である
【図２】本発明で用いられるBOD測定用FIAシステムの一例を示す図である
【図３】実施例１で得られた結果を示すグラフである
【図４】実施例２で得られた結果を示すグラフである
【図５】実施例３で得られた結果を示すグラフである
【図６】実施例４で得られた結果を示すグラフである
【図７】実施例５で得られた結果を示すグラフである
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定することを特徴とする真核微生物の活性測定法。
【請求項２】
化学発光が、触媒の存在下で行われる請求項１記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項３】
酸化型のキノン類に加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させて過酸化水素を生成させる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項４】
酸化型のキノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノンまたはコエンザイムＱ１である請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項５】
真核微生物が酵母である請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項６】
化学発光の試薬として、ルミノールが用いられる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項７】
触媒が、ヘキサシアノ鉄(III)カリウムまたはペルオキシダーゼである請求項６記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項８】
酸化型のキノン類の存在下で、微生物に有機物質を代謝させて過酸化水素を生成させた後、化学発光により過酸化水素の検出が行われる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項９】
発光強度がバッチ式の発光測定装置により測定される請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１０】
移相液を連続的に通した流路に、真核微生物、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液を混合した試料液を導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるといったフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１１】
真核微生物をカラム内に固定化し、そこに移相液を連続的に通した上で、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液とを混合した溶液を移相液へ導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１２】
真核微生物により有機物質を代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりBODの測定が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１３】
真核微生物によりグルコースを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりグルコースの検出・定量が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１４】
真核微生物によりエタノールを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりエタノールの検出・定量が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１５】
土壌中に生息する微生物または酒醸製造工程で用いられる微生物の活性測定に用いられる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１】
ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定することを特徴とする真核微生物の活性測定法。
【請求項２】
化学発光が、触媒の存在下で行われる請求項１記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項３】
酸化型のキノン類に加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させて過酸化水素を生成させる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項４】
酸化型のキノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノンまたはコエンザイムＱ１である請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項５】
真核微生物が酵母である請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項６】
化学発光の試薬として、ルミノールが用いられる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項７】
触媒が、ヘキサシアノ鉄(III)カリウムまたはペルオキシダーゼである請求項６記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項８】
酸化型のキノン類の存在下で、微生物に有機物質を代謝させて過酸化水素を生成させた後、化学発光により過酸化水素の検出が行われる請求項１または２記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項９】
発光強度がバッチ式の発光測定装置により測定される請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１０】
移相液を連続的に通した流路に、真核微生物、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液を混合した試料液を導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるといったフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１１】
真核微生物をカラム内に固定化し、そこに移相液を連続的に通した上で、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液とを混合した溶液を移相液へ導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項１乃至８のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１２】
真核微生物により有機物質を代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりBODの測定が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１３】
真核微生物によりグルコースを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりグルコースの検出・定量が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１４】
真核微生物によりエタノールを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりエタノールの検出・定量が行われる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【請求項１５】
土壌中に生息する微生物または酒醸製造工程で用いられる微生物の活性測定に用いられる請求項１乃至１１のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−９２９３８（Ｐ２００８−９２９３８Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３１９０（Ｐ２００７−２３１９０）
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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