真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現システム
本発明は１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ作製用組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は遺伝的にプログラムされた位置に１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを真正細菌で効率的に発現させるためのプラスミドシステムを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物を含む組成物であって、前記構築物が
（ａ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記発現可能なヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターヌクレオチド配列は前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；
（ｃ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列；又は
（ｄ）複数のｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロンを含む前記組成物。
【請求項２】
前記構築物が（ａ）及び（ｂ）の両者を含み、（ａ）及び（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が相互に異なる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記構築物が（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードし、（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ＲＳをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がｔＲＮＡをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｔＲＮＡが１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導される請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｔＲＮＡが配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列によりコードされる請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現可能なヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現可能なヌクレオチド配列が複数の前記ポリシストロン性オペロンである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードし、前記Ｏ−ＲＳが対応するＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡ−Ｔｙｒ ＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系であって、前記系が
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを含む前記翻訳系。
【請求項２７】
前記核酸構築物が
（ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡを含むか又はコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡは前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ｉｉｉ）複数の前記Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項２８】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項２９】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３０】
前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含む請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３１】
前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３２】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３３】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３４】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３５】
前記Ｏ−ｔＲＮＡが１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３６】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がＯ−ｔＲＮＡをコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３７】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３８】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３９】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４０】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４１】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４２】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む宿主細胞を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４３】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞である請求項４２に記載の翻訳系。
【請求項４４】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項４２に記載の翻訳系。
【請求項４５】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項４６】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
核酸構築物を準備する前記段階が、
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡが大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡから選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階がｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞を準備する段階が真正細菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞を準備する段階が大腸菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｖ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む宿主細胞を準備し、
（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前記核酸構築物が
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を集合的に含むようにこれらを準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項６４】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡが大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡから選択される請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
（ＩＩＩ）の核酸構築物を準備する前記段階が複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
（ＩＩＩ）の核酸構築物を準備する前記段階が複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階がｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
宿主細胞を準備する段階が真正細菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７９】
宿主細胞を準備する段階が大腸菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系の作製方法であって、
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを準備する段階を含む前記方法。
【請求項８１】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む宿主細胞を含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの作製方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を含む翻訳系を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項１】
核酸構築物を含む組成物であって、前記構築物が
（ａ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記発現可能なヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターヌクレオチド配列は前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；
（ｃ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列；又は
（ｄ）複数のｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロンを含む前記組成物。
【請求項２】
前記構築物が（ａ）及び（ｂ）の両者を含み、（ａ）及び（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が相互に異なる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記構築物が（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードし、（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ＲＳをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がｔＲＮＡをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｔＲＮＡが１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導される請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｔＲＮＡが配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列によりコードされる請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現可能なヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現可能なヌクレオチド配列が複数の前記ポリシストロン性オペロンである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードし、前記Ｏ−ＲＳが対応するＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡ−Ｔｙｒ ＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系であって、前記系が
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを含む前記翻訳系。
【請求項２７】
前記核酸構築物が
（ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡを含むか又はコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡは前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ｉｉｉ）複数の前記Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項２８】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項２９】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３０】
前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含む請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３１】
前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３２】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３３】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３４】
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項２７に記載の翻訳系。
【請求項３５】
前記Ｏ−ｔＲＮＡが１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３６】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がＯ−ｔＲＮＡをコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３７】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３８】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項３９】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４０】
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４１】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４２】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む宿主細胞を含む請求項２６に記載の翻訳系。
【請求項４３】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞である請求項４２に記載の翻訳系。
【請求項４４】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項４２に記載の翻訳系。
【請求項４５】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項４６】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
核酸構築物を準備する前記段階が、
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡが大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡから選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階がｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞を準備する段階が真正細菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞を準備する段階が大腸菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｖ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む宿主細胞を準備し、
（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前記核酸構築物が
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を集合的に含むようにこれらを準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項６４】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
核酸構築物を準備する前記段階が１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
核酸構築物を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
核酸構築物を準備する前記段階が配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡが大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡから選択される請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
（Ｉ）の核酸構築物を準備する前記段階が大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列に対応するヌクレオチド配列を準備する段階を含み、前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
（ＩＩＩ）の核酸構築物を準備する前記段階が複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
（ＩＩＩ）の核酸構築物を準備する前記段階が複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なる請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含む異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階がｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを準備する前記段階が配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーを準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
宿主細胞を準備する段階が真正細菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７９】
宿主細胞を準備する段階が大腸菌宿主細胞を準備する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系の作製方法であって、
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを準備する段階を含む前記方法。
【請求項８１】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む宿主細胞を含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの作製方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を含む翻訳系を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【図８−６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【図８−６】
【公表番号】特表２００９−５２９３２８（Ｐ２００９−５２９３２８Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８３９３（Ｐ２００８−５５８３９３）
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５９１４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３４９０
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５９１４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３４９０
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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