真珠層の製造方法
【課題】 平板状アラゴナイト結晶を具備した真珠層の製造方法を提供する。
【解決手段】 パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、次いで、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加える。 この操作を繰り返すことによって、多層構造の真珠層が得られる。
【解決手段】 パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、次いで、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加える。 この操作を繰り返すことによって、多層構造の真珠層が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然真珠の真珠層の人為的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然真珠の真珠層は、平板状のアラゴナイト結晶の層間に、バインダーとして機能するコンキオリンと呼ばれる層間有機基質（層間タンパク質）が介在して構築された構造を具備している。
【０００３】
本出願人らはこれまでに、真珠層のアラゴナイト結晶の形成に関与する物質、すなわち、15kDaの分子量を有する酸性真珠タンパク質（以下、「パーリン」と称する）と20kDaの分子量を有する真珠タンパク質（以下、「パールケラチン」と称する）などが重合したタンパク質複合体（以下、単に「タンパク質複合体」と称する）［特許文献１参照］を開示している。 そして、このタンパク質複合体を、結晶形成剤、好ましくは、炭酸カルシウムの過飽和溶液（結晶形成母液）に添加すると、真珠層の微小結晶束（crystalites）が無数に点在して出現することを確認した。
【０００４】
しかしながら、これら点状の微小結晶束は、時間の経過と共にある程度は成長するものの、それらが互いに連続して層状結晶を形成するには至らなかった。
【０００５】
現在までのところ、天然真珠の多層状構造の内部に認められるアラゴナイトの平板状結晶を再現する方法は未だ実現されておらず、その完成が待望されていたのである。
【特許文献１】特開２００３−１２６９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上掲した従来技術で認められた技術課題、すなわち、層状構造のアラゴナイト結晶を具備した真珠層を製造する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨とするところは、繊維性タンパク質、好ましくは、シルクフィブロインの表面にパーリンを展開させて得られた基盤タンパク質に対して結晶形成剤、好ましくは、タンパク質複合体を含む結晶形成母液を添加する工程を含む真珠層の製造方法にある。 また、一旦製造された真珠層の表面に、追加のパーリンまたはタンパク質複合体、それに結晶形成剤（結晶形成母液）をさらに添加することで、真珠層の多層化を達成することができる。 さらに、本発明の他の態様によれば、これら一連の製造工程に従って製造された層状構造を具備した有用な真珠層が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、所期の目的であった、層状構造のアラゴナイト結晶を具備した真珠層の製造方法が実現される。 これにより、真珠層の工業的量産化が図れ、それらを建築構造物、家具類、車両などのコーティング用途での利用が可能となる。 さらに、本発明に従って製造される真珠層は、建築用材や医療用素材などの様々な形態の製品の提供を可能ならしめる新素材として機能するなど、幾多の優れた作用効果を相乗的に奏するのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の真珠層の製造方法を詳細に説明する。
【００１０】
生体の硬組織に関して最も研究の進んでいる事例は、アコヤ貝、黒チョウ貝、白チョウ貝、マベ貝などの貝類、特に、アコヤ貝（Pinctada fucata）での真珠層である。 貝殻の構造は、基本的に、外層、中層および内層から構成されている。
【００１１】
外層は、殻皮層とも呼ばれ、硬タンパク質からなるものであるが、石灰化には至っていない。 これに対して、中層と内層は、そのいずれもが炭酸カルシウムの結晶を主成分としており、これが約95％を占めている。 しかしながら、中層と内層とでは結晶構造は異なっており、具体的には、稜柱層とも称されている中層は方解石構造（カルサイト結晶：三方晶系）であるのに対し、真珠層とも称されている内層はアラレ石構造（アラゴナイト結晶：斜方晶系）である。 そして、残りの約５％は、外套膜より分泌される有機質から構成されている。 中層および内層のいずれもが、炭酸カルシウムの結晶の層と有機質の層が、交互に積層した構造となっている。 このような積層構造は、外套膜の表面で作られるものであって、通常は、血流に乗って運ばれてきたカルシウムイオンが、外套膜より分泌されたタンパク質、ナクレイン（Nacrein、特表平８−835786号参照）の触媒作用の下に生成された炭酸イオンと結合し、炭酸カルシウムの結晶として、有機タンパク質層の上に沈着して形成される。 これらのことから、炭酸カルシウムの結晶が、カルサイト結晶となるかアラゴナイト結晶となるかは、外套膜より分泌された有機タンパク質層、つまり、繊維性タンパク質の表面に展開した個々の酸性タンパク質の種類によって制御されているものと考えられる。
【００１２】
本発明者らは、酸性タンパク質（パーリン）やタンパク質複合体が、アラゴナイト結晶の誘導化と密接な関係にあると言われているアコヤ貝に関して認められた真珠層形成のメカニズムに着目した。 そしてまず、繊維性タンパク質に酸性タンパク質を混在せしめて調製したタンパク質の層（薄層）を真珠層の基盤とし、これに対して、結晶形成剤（好ましくは、タンパク質複合体を含有する結晶形成母液）を加えることで、人工的に真珠層を形成することを想到したのである。 なお、最終的に平板状の真珠層を得る観点に立脚すれば、繊維性タンパク質を、支持体の平坦な表面上に置くことが望ましい。
【００１３】
本発明の製造方法で使用する繊維性タンパク質としては、後述するように、パーリンやタンパク質複合体などに対する化学的親和性や入手容易性などの条件を考慮すれば、シルクフィブロインが本発明において好適に利用することができる。
【００１４】
同様に、本発明の製造方法で使用する結晶形成剤としては、真珠層の構成成分の供給源として機能するものであり、例えば、飽和Ca(HCO3)2−50mM MgCl2の溶液などが、結晶形成母液として好適に利用することができる。
【００１５】
また、繊維性タンパク質に添加されるパーリンや、タンパク質複合体とは、いずれも天然真珠の真珠層に含まれるタンパク質に由来する物質であり、一般的には、以下の手順に従って取得される。
【００１６】
まず、貝殻または真珠の珠から真珠層のみを剥がして、これをイオン交換水で洗浄する。 この場合、イオン交換水は時折交換し、真珠層に付着した汚れがある程度なくなるまで洗浄を続け、その後、乾燥させる。 そして、洗浄を終えた真珠層の約20ｇを粉砕器（Wonder Blender）で粉砕して粉状にする。 このようにして得られた粉状の真珠層を、300ml容の三角フラスコに入れ、そこに、0.5M EDTAを100ml、0.1％アジ化ナトリウム（防腐剤、NaN3）を100μl注入し、フラスコを３日間振とうする。 次に、この懸濁液を、30,000×ｇで、20分間、４℃の条件下で遠心分離する。 遠心分離後の上清を捨て、沈渣に適量の滅菌水を足し、これを攪拌して得られた懸濁液を、渦巻き攪拌（Vortex）した後、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。 上清を捨てた後に、30ml〜40mlのアセトンを足して攪拌して得られた懸濁液を、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。 上清を捨てた後に、適量の滅菌水を足して攪拌して得られた懸濁液を、渦巻き攪拌（Vortex）した後、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。
【００１７】
次に、タンパク質の抽出を行う。 まず、パーリンの抽出溶媒として、８Ｍ尿素を0.5M EDTAに溶解し、次いで水で100mlに体積調整（fill-up）した溶液を調製する。 この溶液を、先の遠心分離で最終的に得られた沈殿物に加えて、パーリンの抽出を行う。 一方で、タンパク質複合体の抽出については、８Ｍ尿素を30mM Tris-HCl (pH 8.0)に溶解したものを抽出溶媒として用いる以外は、パーリンの抽出と同様の手順に従って抽出を行う。
【００１８】
そして、抽出溶媒を加えた沈殿物を、60℃で、一晩振とうする。 振とうを終えた懸濁液を、30,000×ｇで、20分間、４℃の条件下で遠心分離して、上清を回収する。
【００１９】
回収した上清を透析膜（3500cut）に移す。 この透析膜に滅菌水を加え、スターラーで攪拌しながら透析を行う。 その間、約４〜６時間の間隔で、滅菌水を３回交換する。
【００２０】
透析を終え次第に、タンパク質溶液を凍結乾燥する。 具体的には、ナス型フラスコを−80℃に予め冷却しておき、砕いたドライアイスと適量のエタノールを発泡スチロールの箱に入れておく。 その後、透析したタンパク質溶液をフラスコ内に入れる。 冷却したエタノールに浸したナス型フラスコを回転させながら、フラスコの内容物を凍結せしめる。 凍結に至れば、−80℃に設定した冷凍庫にてフラスコを若干冷却した後に、フラスコを凍結乾燥機に装着する。 そして、その凍結乾燥機を稼働させて、凍結した状態のままで真空乾燥する。
【００２１】
凍結乾燥を終えたナス型フラスコの内容物を、できるだけ少量（約１〜約２ml）の30mM Tris-HCl (pH 8.0)に溶解し、これを透析膜に移して、予め別個に調製しておいた30mM Tris-HCl (pH 8.0)の数mlをさらに加え、そして、スターラーで攪拌しながら透析を行う。
【００２２】
その間、約４〜６時間の間隔で、透析外液30mM Tris-HCl (pH 8.0)を３回交換する。
【００２３】
透析を終えたタンパク質の溶液は、濃縮キット（VIVAPORE 5）を使って、約10倍（約500μl）に濃縮される。 この濃縮物を、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過によって精製する。 イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過の手法は、当該技術分野で周知のもの（例えば、特開2003−12696号公報に記載の手法）が利用できる。
【００２４】
精製したタンパク質を、15％SDSゲル電気泳動で分析する。 その結果、15kDaの分子量を有するパーリンと、15kDaと20kDaの双方の分子量にてバンドが出現するタンパク質複合体とが確認される。 EDTA不溶性画分をEDTA-尿素で処理して得られるパーリンは、硫黄含有糖タンパク質であり、カルシウム結合性をも有しているので、アラゴナイト結晶化を誘導・開始するタンパク質であると考えられる。 さらに、タンパク質複合体は、アラゴナイト結晶の成長を促す働きがあると考えられる。
【００２５】
以下に、本発明をその実施例に沿って説明するが、この実施例の開示に基づいて本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【実施例】
【００２６】
実施例１：真珠層の調製
前出の一般的手順に従って、パーリンおよびタンパク質複合体の双方を準備した。
【００２７】
次に、0.3ｇのシルクフィブロインを５mlの９Ｍ臭化リチウム溶液に溶解したものを、透析膜に入れて、滅菌水で５回透析した。 透析後に出た若干の不溶物を除去するために、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離した。 得られた上清を、シルクフィブロイン溶液（終濃度約２％）として用いた。
【００２８】
そして、12ウェルのマイクロプレートを用意して、各ウェルに以下のタンパク質試料を注加し、一晩乾燥せしめて、各ウェルの底部を試料タンパク質の薄層（以下、単に「コーティング」と称する）で覆った。
【００２９】
次に、各ウェルに、２mlの飽和Ca(HCO3)2−50mM MgCl2からなる結晶形成母液またはタンパク質複合体を含む結晶形成母液を加えて、数日間放置した。
【００３０】
実施例Ａ：50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３１】
実施例Ｂ：50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３２】
実施例Ｃ：５μｇのウシ血清タンパク質を含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３３】
実施例Ｄ：５μｇのウシ血清タンパク質を含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３４】
実施例Ｅ：５μｇのパーリンを含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３５】
実施例Ｆ：５μｇのパーリンを含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３６】
実施例Ａ〜Ｆの試料に関して出現した結晶を、光学顕微鏡（拡大倍率：×２００）によって観察した。 その結果を、以下の表１にまとめた。
【００３７】
【表１】
表１に記載の結果から明らかなように、実施例Ａ〜Ｄでは従前の点粒状の結晶が認められるに過ぎなかった。 とりわけ、パーリンを利用しなかった実施例Ａ〜Ｂにて認められた結晶は、シルクフィブロインの基盤から遊離していた。 また、実施例Ｅでは、シルクフィブロインに接着した渦巻状のアラゴナイト結晶の成長が認められたが、それらが互いに結合して板状構造を形成するまでには至らなかった。 実施例Ａ〜Ｅに対して、実施例Ｆでは、シルクフィブロインに接着し、かつ広い面積に展開した平板状のアラゴナイト結晶の出現が認められた。
【００３８】
これらの結果から、繊維性タンパク質に接着したパーリンは、渦巻状のアラゴナイト結晶の形成を開始・誘導する重要な因子であると考えられる。 また、タンパク質複合体は、パーリン存在下において、繊維性タンパク質上に形成され始めた渦巻状のアラゴナイト結晶を、平板状に成長・発展させる機能を具備しているものと考えられる。
【００３９】
実施例２：板状結晶の構造分析
実施例Ｆの結晶構造を、赤外分光光度計に適用して解析を行った。
【００４０】
まず、ウェルの底部の白い集積物をスパーテルでかき集めた。 これをプロテアーゼで処理して不純物を除去し、これをフーリエ変換赤外分光光度計（Shimadzu IR Prestige-21）に適用して解析を行った。 分析結果を、図７に示した。 図７に記載の結果から明らかなように、854.47にメインピークが現れ、実施例Ｆの結晶がアラゴナイト結晶であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
現在流通している化学素材の多くは、無機的材料に対して高い活性化エネルギーを負荷して、高温下で工学的加工を施されて製造されたものである。 従って、その製造過程にあっては、化学合成して素材を形成するために膨大なエネルギーが消費されると共に、地球温暖化の原因とされている二酸化炭素を大量に放出する。 一方で、生物の多くは、カルシウムなどを含む無機質と少量の有機質からなる複合材料である硬組織を常温、常圧下で合成する能力、いわゆるバイオミネラリゼーションの能力を備えている。 例えば、貝殻は、天然あるいは人造の方解石や真珠層には認められない「しなやかさ」と硬度を具備している。 生物によるこのような硬組織形成能力は、タンパク質によって制御されており、遺伝子によって規定されているものである。
【００４２】
このような観点に立脚すれば、上述したように、本発明の製造方法によって、アラゴナイトの板状結晶を具備した真珠層の量産が可能となるので、無脊椎動物の硬組織形成におけるタンパク質の機能解明のヒントを提供するのみならず、硬組織の人工的形成・制御への途も開かれることになる。 これにより、本発明によれば、無機−有機の複合材料を利用した新素材のみならず、複雑な三次元構造を有する骨や歯などの代替物としての医療用・歯科用移植片の実現をも期待できるなど、本発明は、実に様々な用途において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】シルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図２】シルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図３】ウシ血清タンパク質を含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図４】ウシ血清タンパク質を含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図５】パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図６】パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図７】本発明の真珠層に関する赤外分光光度計の計測結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然真珠の真珠層の人為的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然真珠の真珠層は、平板状のアラゴナイト結晶の層間に、バインダーとして機能するコンキオリンと呼ばれる層間有機基質（層間タンパク質）が介在して構築された構造を具備している。
【０００３】
本出願人らはこれまでに、真珠層のアラゴナイト結晶の形成に関与する物質、すなわち、15kDaの分子量を有する酸性真珠タンパク質（以下、「パーリン」と称する）と20kDaの分子量を有する真珠タンパク質（以下、「パールケラチン」と称する）などが重合したタンパク質複合体（以下、単に「タンパク質複合体」と称する）［特許文献１参照］を開示している。 そして、このタンパク質複合体を、結晶形成剤、好ましくは、炭酸カルシウムの過飽和溶液（結晶形成母液）に添加すると、真珠層の微小結晶束（crystalites）が無数に点在して出現することを確認した。
【０００４】
しかしながら、これら点状の微小結晶束は、時間の経過と共にある程度は成長するものの、それらが互いに連続して層状結晶を形成するには至らなかった。
【０００５】
現在までのところ、天然真珠の多層状構造の内部に認められるアラゴナイトの平板状結晶を再現する方法は未だ実現されておらず、その完成が待望されていたのである。
【特許文献１】特開２００３−１２６９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上掲した従来技術で認められた技術課題、すなわち、層状構造のアラゴナイト結晶を具備した真珠層を製造する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨とするところは、繊維性タンパク質、好ましくは、シルクフィブロインの表面にパーリンを展開させて得られた基盤タンパク質に対して結晶形成剤、好ましくは、タンパク質複合体を含む結晶形成母液を添加する工程を含む真珠層の製造方法にある。 また、一旦製造された真珠層の表面に、追加のパーリンまたはタンパク質複合体、それに結晶形成剤（結晶形成母液）をさらに添加することで、真珠層の多層化を達成することができる。 さらに、本発明の他の態様によれば、これら一連の製造工程に従って製造された層状構造を具備した有用な真珠層が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、所期の目的であった、層状構造のアラゴナイト結晶を具備した真珠層の製造方法が実現される。 これにより、真珠層の工業的量産化が図れ、それらを建築構造物、家具類、車両などのコーティング用途での利用が可能となる。 さらに、本発明に従って製造される真珠層は、建築用材や医療用素材などの様々な形態の製品の提供を可能ならしめる新素材として機能するなど、幾多の優れた作用効果を相乗的に奏するのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の真珠層の製造方法を詳細に説明する。
【００１０】
生体の硬組織に関して最も研究の進んでいる事例は、アコヤ貝、黒チョウ貝、白チョウ貝、マベ貝などの貝類、特に、アコヤ貝（Pinctada fucata）での真珠層である。 貝殻の構造は、基本的に、外層、中層および内層から構成されている。
【００１１】
外層は、殻皮層とも呼ばれ、硬タンパク質からなるものであるが、石灰化には至っていない。 これに対して、中層と内層は、そのいずれもが炭酸カルシウムの結晶を主成分としており、これが約95％を占めている。 しかしながら、中層と内層とでは結晶構造は異なっており、具体的には、稜柱層とも称されている中層は方解石構造（カルサイト結晶：三方晶系）であるのに対し、真珠層とも称されている内層はアラレ石構造（アラゴナイト結晶：斜方晶系）である。 そして、残りの約５％は、外套膜より分泌される有機質から構成されている。 中層および内層のいずれもが、炭酸カルシウムの結晶の層と有機質の層が、交互に積層した構造となっている。 このような積層構造は、外套膜の表面で作られるものであって、通常は、血流に乗って運ばれてきたカルシウムイオンが、外套膜より分泌されたタンパク質、ナクレイン（Nacrein、特表平８−835786号参照）の触媒作用の下に生成された炭酸イオンと結合し、炭酸カルシウムの結晶として、有機タンパク質層の上に沈着して形成される。 これらのことから、炭酸カルシウムの結晶が、カルサイト結晶となるかアラゴナイト結晶となるかは、外套膜より分泌された有機タンパク質層、つまり、繊維性タンパク質の表面に展開した個々の酸性タンパク質の種類によって制御されているものと考えられる。
【００１２】
本発明者らは、酸性タンパク質（パーリン）やタンパク質複合体が、アラゴナイト結晶の誘導化と密接な関係にあると言われているアコヤ貝に関して認められた真珠層形成のメカニズムに着目した。 そしてまず、繊維性タンパク質に酸性タンパク質を混在せしめて調製したタンパク質の層（薄層）を真珠層の基盤とし、これに対して、結晶形成剤（好ましくは、タンパク質複合体を含有する結晶形成母液）を加えることで、人工的に真珠層を形成することを想到したのである。 なお、最終的に平板状の真珠層を得る観点に立脚すれば、繊維性タンパク質を、支持体の平坦な表面上に置くことが望ましい。
【００１３】
本発明の製造方法で使用する繊維性タンパク質としては、後述するように、パーリンやタンパク質複合体などに対する化学的親和性や入手容易性などの条件を考慮すれば、シルクフィブロインが本発明において好適に利用することができる。
【００１４】
同様に、本発明の製造方法で使用する結晶形成剤としては、真珠層の構成成分の供給源として機能するものであり、例えば、飽和Ca(HCO3)2−50mM MgCl2の溶液などが、結晶形成母液として好適に利用することができる。
【００１５】
また、繊維性タンパク質に添加されるパーリンや、タンパク質複合体とは、いずれも天然真珠の真珠層に含まれるタンパク質に由来する物質であり、一般的には、以下の手順に従って取得される。
【００１６】
まず、貝殻または真珠の珠から真珠層のみを剥がして、これをイオン交換水で洗浄する。 この場合、イオン交換水は時折交換し、真珠層に付着した汚れがある程度なくなるまで洗浄を続け、その後、乾燥させる。 そして、洗浄を終えた真珠層の約20ｇを粉砕器（Wonder Blender）で粉砕して粉状にする。 このようにして得られた粉状の真珠層を、300ml容の三角フラスコに入れ、そこに、0.5M EDTAを100ml、0.1％アジ化ナトリウム（防腐剤、NaN3）を100μl注入し、フラスコを３日間振とうする。 次に、この懸濁液を、30,000×ｇで、20分間、４℃の条件下で遠心分離する。 遠心分離後の上清を捨て、沈渣に適量の滅菌水を足し、これを攪拌して得られた懸濁液を、渦巻き攪拌（Vortex）した後、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。 上清を捨てた後に、30ml〜40mlのアセトンを足して攪拌して得られた懸濁液を、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。 上清を捨てた後に、適量の滅菌水を足して攪拌して得られた懸濁液を、渦巻き攪拌（Vortex）した後、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離する。
【００１７】
次に、タンパク質の抽出を行う。 まず、パーリンの抽出溶媒として、８Ｍ尿素を0.5M EDTAに溶解し、次いで水で100mlに体積調整（fill-up）した溶液を調製する。 この溶液を、先の遠心分離で最終的に得られた沈殿物に加えて、パーリンの抽出を行う。 一方で、タンパク質複合体の抽出については、８Ｍ尿素を30mM Tris-HCl (pH 8.0)に溶解したものを抽出溶媒として用いる以外は、パーリンの抽出と同様の手順に従って抽出を行う。
【００１８】
そして、抽出溶媒を加えた沈殿物を、60℃で、一晩振とうする。 振とうを終えた懸濁液を、30,000×ｇで、20分間、４℃の条件下で遠心分離して、上清を回収する。
【００１９】
回収した上清を透析膜（3500cut）に移す。 この透析膜に滅菌水を加え、スターラーで攪拌しながら透析を行う。 その間、約４〜６時間の間隔で、滅菌水を３回交換する。
【００２０】
透析を終え次第に、タンパク質溶液を凍結乾燥する。 具体的には、ナス型フラスコを−80℃に予め冷却しておき、砕いたドライアイスと適量のエタノールを発泡スチロールの箱に入れておく。 その後、透析したタンパク質溶液をフラスコ内に入れる。 冷却したエタノールに浸したナス型フラスコを回転させながら、フラスコの内容物を凍結せしめる。 凍結に至れば、−80℃に設定した冷凍庫にてフラスコを若干冷却した後に、フラスコを凍結乾燥機に装着する。 そして、その凍結乾燥機を稼働させて、凍結した状態のままで真空乾燥する。
【００２１】
凍結乾燥を終えたナス型フラスコの内容物を、できるだけ少量（約１〜約２ml）の30mM Tris-HCl (pH 8.0)に溶解し、これを透析膜に移して、予め別個に調製しておいた30mM Tris-HCl (pH 8.0)の数mlをさらに加え、そして、スターラーで攪拌しながら透析を行う。
【００２２】
その間、約４〜６時間の間隔で、透析外液30mM Tris-HCl (pH 8.0)を３回交換する。
【００２３】
透析を終えたタンパク質の溶液は、濃縮キット（VIVAPORE 5）を使って、約10倍（約500μl）に濃縮される。 この濃縮物を、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過によって精製する。 イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過の手法は、当該技術分野で周知のもの（例えば、特開2003−12696号公報に記載の手法）が利用できる。
【００２４】
精製したタンパク質を、15％SDSゲル電気泳動で分析する。 その結果、15kDaの分子量を有するパーリンと、15kDaと20kDaの双方の分子量にてバンドが出現するタンパク質複合体とが確認される。 EDTA不溶性画分をEDTA-尿素で処理して得られるパーリンは、硫黄含有糖タンパク質であり、カルシウム結合性をも有しているので、アラゴナイト結晶化を誘導・開始するタンパク質であると考えられる。 さらに、タンパク質複合体は、アラゴナイト結晶の成長を促す働きがあると考えられる。
【００２５】
以下に、本発明をその実施例に沿って説明するが、この実施例の開示に基づいて本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【実施例】
【００２６】
実施例１：真珠層の調製
前出の一般的手順に従って、パーリンおよびタンパク質複合体の双方を準備した。
【００２７】
次に、0.3ｇのシルクフィブロインを５mlの９Ｍ臭化リチウム溶液に溶解したものを、透析膜に入れて、滅菌水で５回透析した。 透析後に出た若干の不溶物を除去するために、3,500rpm、５分間、４℃の条件下で遠心分離した。 得られた上清を、シルクフィブロイン溶液（終濃度約２％）として用いた。
【００２８】
そして、12ウェルのマイクロプレートを用意して、各ウェルに以下のタンパク質試料を注加し、一晩乾燥せしめて、各ウェルの底部を試料タンパク質の薄層（以下、単に「コーティング」と称する）で覆った。
【００２９】
次に、各ウェルに、２mlの飽和Ca(HCO3)2−50mM MgCl2からなる結晶形成母液またはタンパク質複合体を含む結晶形成母液を加えて、数日間放置した。
【００３０】
実施例Ａ：50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３１】
実施例Ｂ：50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３２】
実施例Ｃ：５μｇのウシ血清タンパク質を含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３３】
実施例Ｄ：５μｇのウシ血清タンパク質を含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３４】
実施例Ｅ：５μｇのパーリンを含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３５】
実施例Ｆ：５μｇのパーリンを含む50μlのシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングした後、５μｇのタンパク質複合体を含む２mlの結晶形成母液を加えて放置する。
【００３６】
実施例Ａ〜Ｆの試料に関して出現した結晶を、光学顕微鏡（拡大倍率：×２００）によって観察した。 その結果を、以下の表１にまとめた。
【００３７】
【表１】
表１に記載の結果から明らかなように、実施例Ａ〜Ｄでは従前の点粒状の結晶が認められるに過ぎなかった。 とりわけ、パーリンを利用しなかった実施例Ａ〜Ｂにて認められた結晶は、シルクフィブロインの基盤から遊離していた。 また、実施例Ｅでは、シルクフィブロインに接着した渦巻状のアラゴナイト結晶の成長が認められたが、それらが互いに結合して板状構造を形成するまでには至らなかった。 実施例Ａ〜Ｅに対して、実施例Ｆでは、シルクフィブロインに接着し、かつ広い面積に展開した平板状のアラゴナイト結晶の出現が認められた。
【００３８】
これらの結果から、繊維性タンパク質に接着したパーリンは、渦巻状のアラゴナイト結晶の形成を開始・誘導する重要な因子であると考えられる。 また、タンパク質複合体は、パーリン存在下において、繊維性タンパク質上に形成され始めた渦巻状のアラゴナイト結晶を、平板状に成長・発展させる機能を具備しているものと考えられる。
【００３９】
実施例２：板状結晶の構造分析
実施例Ｆの結晶構造を、赤外分光光度計に適用して解析を行った。
【００４０】
まず、ウェルの底部の白い集積物をスパーテルでかき集めた。 これをプロテアーゼで処理して不純物を除去し、これをフーリエ変換赤外分光光度計（Shimadzu IR Prestige-21）に適用して解析を行った。 分析結果を、図７に示した。 図７に記載の結果から明らかなように、854.47にメインピークが現れ、実施例Ｆの結晶がアラゴナイト結晶であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
現在流通している化学素材の多くは、無機的材料に対して高い活性化エネルギーを負荷して、高温下で工学的加工を施されて製造されたものである。 従って、その製造過程にあっては、化学合成して素材を形成するために膨大なエネルギーが消費されると共に、地球温暖化の原因とされている二酸化炭素を大量に放出する。 一方で、生物の多くは、カルシウムなどを含む無機質と少量の有機質からなる複合材料である硬組織を常温、常圧下で合成する能力、いわゆるバイオミネラリゼーションの能力を備えている。 例えば、貝殻は、天然あるいは人造の方解石や真珠層には認められない「しなやかさ」と硬度を具備している。 生物によるこのような硬組織形成能力は、タンパク質によって制御されており、遺伝子によって規定されているものである。
【００４２】
このような観点に立脚すれば、上述したように、本発明の製造方法によって、アラゴナイトの板状結晶を具備した真珠層の量産が可能となるので、無脊椎動物の硬組織形成におけるタンパク質の機能解明のヒントを提供するのみならず、硬組織の人工的形成・制御への途も開かれることになる。 これにより、本発明によれば、無機−有機の複合材料を利用した新素材のみならず、複雑な三次元構造を有する骨や歯などの代替物としての医療用・歯科用移植片の実現をも期待できるなど、本発明は、実に様々な用途において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】シルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図２】シルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図３】ウシ血清タンパク質を含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図４】ウシ血清タンパク質を含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図５】パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図６】パーリンを含有したシルクフィブロイン溶液でウェルをコーティングし、タンパク質複合体を含有した結晶形成母液を加えて形成された結晶の光学顕微鏡写真である。
【図７】本発明の真珠層に関する赤外分光光度計の計測結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠層の製造方法であって、当該方法が、繊維性タンパク質に対して、１５kＤaの分子量を有する真珠タンパク質および結晶形成剤を添加する工程を含む、ことを特徴とする真珠層の製造方法。
【請求項２】
製造された真珠層に対して、追加の前記真珠タンパク質および前記結晶形成剤を新たに添加する工程をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
製造された真珠層に対して、１５kＤaの分子量を有する真珠タンパク質と２０kＤaの分子量を有する真珠タンパク質とが重合したタンパク質複合体および前記結晶形成剤を添加する工程をさらに含む請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記繊維性タンパク質が、シルクフィブロインである請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記繊維性タンパク質が、平坦な支持体上に置かれている請求項１乃至４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記真珠タンパク質が、真珠貝の殻体の真珠層から精製されたタンパク質である請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記真珠貝が、アコヤ貝、黒チョウ貝、白チョウ貝およびマベ貝からなるグループから選択される貝である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記結晶形成剤が、炭酸カルシウム過飽和溶液からなる結晶形成母液である請求項１乃至７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記結晶形成母液が、５０ｍＭ 塩化マグネシウム［MgCl2］を含む炭酸カルシウム過飽和溶液［Ca(HCO3)2］である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記真珠層が、層状結晶である請求項１乃至９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記層状結晶が、シルクフィブロインの層とアラゴナイトの平板状結晶の層とが交互に積層した構造の結晶である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法で製造された真珠層。
【請求項１】
真珠層の製造方法であって、当該方法が、繊維性タンパク質に対して、１５kＤaの分子量を有する真珠タンパク質および結晶形成剤を添加する工程を含む、ことを特徴とする真珠層の製造方法。
【請求項２】
製造された真珠層に対して、追加の前記真珠タンパク質および前記結晶形成剤を新たに添加する工程をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
製造された真珠層に対して、１５kＤaの分子量を有する真珠タンパク質と２０kＤaの分子量を有する真珠タンパク質とが重合したタンパク質複合体および前記結晶形成剤を添加する工程をさらに含む請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記繊維性タンパク質が、シルクフィブロインである請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記繊維性タンパク質が、平坦な支持体上に置かれている請求項１乃至４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記真珠タンパク質が、真珠貝の殻体の真珠層から精製されたタンパク質である請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記真珠貝が、アコヤ貝、黒チョウ貝、白チョウ貝およびマベ貝からなるグループから選択される貝である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記結晶形成剤が、炭酸カルシウム過飽和溶液からなる結晶形成母液である請求項１乃至７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記結晶形成母液が、５０ｍＭ 塩化マグネシウム［MgCl2］を含む炭酸カルシウム過飽和溶液［Ca(HCO3)2］である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記真珠層が、層状結晶である請求項１乃至９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記層状結晶が、シルクフィブロインの層とアラゴナイトの平板状結晶の層とが交互に積層した構造の結晶である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法で製造された真珠層。
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１８５１（Ｐ２００６−１８５１Ａ）
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１７７８０９（Ｐ２００４−１７７８０９）
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（５９１１４１６１４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（５９１１４１６１４）
【Ｆターム（参考）】
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