真菌病罹病性作物を処置するためのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の使用
【課題】真菌病罹病性作物を処置するためのアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの使用方法を提供する。
【解決手段】マグナポルテ・グリセアケトール酸レダクトイソメラーゼ、サッカロミセス・セレビシエケトール酸レダクトイソメラーゼおよび／またはニューロスポラ・クラッサケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤、例えばジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの有効量を含む殺真菌組成物により、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードしているＩＬＶ５遺伝子を不活性化する。
【解決手段】マグナポルテ・グリセアケトール酸レダクトイソメラーゼ、サッカロミセス・セレビシエケトール酸レダクトイソメラーゼおよび／またはニューロスポラ・クラッサケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤、例えばジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの有効量を含む殺真菌組成物により、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードしているＩＬＶ５遺伝子を不活性化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌病罹病性作物を処置するためのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は、様々な植物種の作物の相当な損失を招く破壊的な流行病の原因である。病原性真菌からの酵素の阻害剤を利用する原理およびこれらの真菌に対して有効な新規分子を特定するための試験におけるこれらの酵素を使用する原理は、それ自体知られている。しかし、真菌酵素の単純な特性付けでは、目的−潜在的な殺真菌分子の対象として選択される酵素が、真菌の生存に不可欠なものでもあり、その殺真菌分子による阻害の結果、真菌の死がもたらされねばならない、または真菌の病理発生に不可欠でもあり、その阻害が、真菌にとって致命的ではなく、その発病能力を単に阻害するものでなければならない−を達成するために充分ではない。従って、代謝経路の特定ならびに病理発生および真菌の生存に不可欠な酵素の特定が、新規殺真菌製品の開発には必要である。
【０００３】
ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物ならびに細菌および酵母菌などの微生物においてよく特性付けされている酵素である。この酵素は、分枝鎖アミノ酸についての生合成経路の第二酵素であり、基質２Ｓ−２−アセト乳酸（ＡＬ）または２Ｓ−２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）から、それぞれ、２，３−ジヒドロキシ−３−イソ吉草酸（ＤＨＩＶ）または２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸（ＤＨＩＭ）への転化を触媒する。この反応は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在を必要とし、また、メチルまたはエチル基の異性化、その後のＮＡＤＰＨによる還元という２段階で発生する。除草剤の対象としての植物イソメロリダクターゼ（ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄａｃｔａｓｅ）については膨大な知識が得られており（Ｗｉｔｔｅｎｂａｃｈら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，Ｎｏ．１，Ｓｕｐｐｌ．，９４，１９９１；Ｓｃｈｕｌｚら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３８：３７５−３７８，１９９８）、また、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、除草剤として記載されている（欧州特許第１０６１１４号；米国特許第４，５９４，０９８号、欧州特許第１９６０２６号、欧州特許第４８１４０７号、国際公開公報第９４／２３０６３号、カナダ特許第２００２０２１号）。しかし、これらの化合物は、植物に対して有効な除草作用を示さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第１０６１１４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５９４，０９８号明細書
【特許文献３】欧州特許第１９６０２６号明細書
【特許文献４】欧州特許第４８１４０７号明細書
【特許文献５】国際公開第９４／２３０６３号
【特許文献６】カナダ特許第２００２０２１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｉｔｔｅｎｂａｃｈら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，Ｎｏ．１，Ｓｕｐｐｌ．，９４，１９９１
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｌｚら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３８：３７５−３７８，１９９８
【発明の概要】
【０００６】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を施用することを含む、真菌病に対して作物を処置する方法である。マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（イネいもち病菌）においてケトール酸レダクトイソメラーゼをコードしているＩＬＶ５遺伝子を不活性化することによって、真菌の成長が阻害されるということがわかった。この真菌の成長の阻害は、ケトール酸レダクトイソメラーゼに特異的な阻害剤の存在下、インビボでも観察される。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）は、米などの多くの作物植物種に対して病原性である。
【０００７】
（配列表の説明）
配列番号１ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【０００８】
配列番号２ サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【０００９】
配列番号３ ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【００１０】
配列番号４ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｃＤＮＡ。
【００１１】
配列番号５ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【００１２】
配列番号６ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子。
【００１３】
配列番号７から１８ ＰＣＲのためのプライマー。
【００１４】
本発明の主題は、有効量のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を施用することによる、真菌病に対して作物を処置するための方法である。
【００１５】
本発明の主題は、有効（耕種学的に有効）且つ非植物毒性量のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を、植物が生育しているまたは生育しそうな土壌に、植物の葉および／もしくは果実に、または植物の種子に施用することを特徴とする、植物病原性真菌罹病性作物を治療的または予防的立場で退治するための方法である。「有効且つ非植物毒性量」という表現は、作物に存在するまたは出現しがちな真菌を防除または駆除するために充分であり、はっきりと感知できるいかなる植物毒性症状も前記作物に生じさせない阻害剤の量を意味するものと解釈する。そうした量は、退治すべき真菌、作物のタイプ、気候条件、および本発明の殺真菌組成物に含まれる化合物に依存して、広範に変化しうる。この量は、当業者の範囲内である系統的な現地試験によって決定することができる。
【００１６】
本発明の方法は、穀類（特に、コムギ、ライムギ、ライコムギおよびオオムギ）、バレイショ、綿、エンドウ、ナタネ、トウモロコシもしくはアマの種子、または他に森林の木の種子、または他にこれらの植物の遺伝修飾を受けた種子の処理に有用である。本発明は、農作植物への塗布、すなわち、該当植物の葉、花、果実および／または幹への経葉塗布にも関する。本発明の方法の対象となる植物の中で、米、トウモロコシ、綿、穀類（コムギ、オオムギまたはライコムギなど）、果樹（特に、リンゴの木、西洋ナシの木、モモの木、ブドウの木、バナナの木、オレンジの木、レモンの木など）、油生産作物、例えば、ナタネまたはヒマワリ、市場向けの農園および野菜作物、トマト、サラダ用野菜、蛋白質生産作物、エンドウ、ナス科植物、例えば、バレイショ、ビートの根、アマ、および森林の木、およびまた、これらの作物の遺伝修飾相同体を挙げることができる。
【００１７】
本発明の方法の対象となる植物の中で、
−次の種子の病気：赤かび病［ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）およびフザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、黒穂病［チルレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チルレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）またはチルレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｉｎｄｉｃａ）］、セプトリア病［セプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）］、裸黒穂病［ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）］、と闘うことに関して、コムギ；
−地上の植物の部分の次の病気：穀物眼紋病［タペシア・ヤルンダ（Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ）、タペシア・アクイフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ ａｃｕｉｆｏｒｍｉｓ）］、立枯病［ガエウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）］、フットブライト病［フザリウム・セルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）］、ヘッドブライト病［フザリウム・セルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ミクロドキウム・ニバル（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）］、黒斑点病［リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）］、うどんこ病［エリシペ・グラミニス；以前種名トリチシ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｉｅ ｔｒｉｔｉｃｉ）］、さび［プッシニア・ストリフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プッシニア・レコンデイタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）］、およびセプトリア病［セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）およびセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）］、と闘うことに関して、コムギ；
−次の種子の病気：網斑病［ピレノホラ・グラミニア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ）、ピレノホラ・トレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）およびコクリオボラス・サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）］、裸黒穂病［ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）］および赤かび病［ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）およびフザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、と戦うことに関して、オオムギ；
−地上の植物の部分の次の病気：穀物眼紋病［タペシア・ヤルンダ（Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ）］、網斑病［ピレノホラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）およびコクリオボラス・サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）］、うどんこ病［エリシペ・グラミニス；以前種名ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｉｅ ｈｏｒｄｅｉ）］、小さび病［プクシニア・ホルデリ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｄｅｉ）］および汚斑病［リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）］、と闘うことに関して、オオムギ；
−塊茎の病気［特に、ヘルミントスポリウム・ソラニ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フォーマ・チューベローサ（Ｐｈｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓａ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）］およびベト病［フィトプソラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］と戦うことに関して、バレイショ；
−次の葉の病気：夏疫病［アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、ベト病［フィトプソラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］、と闘うことに関して、バレイショ；
−種子から成長した若い植物の次の病気：立枯病および頚領腐れ［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）］、黒根病［シエラビオプシス・バシコーラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）］、と闘うことに関して、綿；
−次の種子の病気：炭疽病［アスコチタ・ピシ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｉｓｉ）、ミコスフェレラ・ピノデス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｐｉｎｏｄｅｓ）］、赤かび病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）］、灰色かび病［ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）］、ベト病［ヘロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｉｓｉ）］、と闘うことに関して、蛋白質生産穀物、例えば、エンドウ；
−次の種子の病気：フォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ）、アルテルナリア・ブラッシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）およびスクレロチニア・スクレロイオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）と闘うことに関して、油生産作物、例えば、ナタネ；
−種子の病気：［リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ペネシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギウス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびギビレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）］と闘うことに関して、トウモロコシ；
−種子の病気：アルテルナリア・リニコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｉｎｉｃｏｌａ）と闘うことに関して、アマ；
−立枯病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、と闘うことに関して、森林の木；
−地上部分の次の病気：いもち病［マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）］、黒斑点病［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、と闘うことに関して、米；
−次の実生の病気または種子から成長した若い植物の病気：立枯病および頚領腐れ［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ．）］、と闘うことに関して、作物野菜；
−地上部分の次の病気：灰色かび病［ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐ．）］、うどんこ病［特に、エリシフェ・シコラセアラム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、スフェロセカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、レベイルラ・タウリカ（Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｔａｕｒｉｃａ）］、赤かび病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、斑点病［クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）］、アルテルナリア斑点病［アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．）］、炭疽病［コレトトリチューム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）］、セプトリア斑点病［セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ．）］、黒斑点病［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、べと病［例えばブレミア・ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）、ペロノスポラ属種（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、シュードペロノスポラ属名（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、フィトソラ属名（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｓｐ．）］、と闘うことに関して、作物野菜；
−地上部分の病気：モニリア病［モニリア・フルクティガーナ（Ｍｏｎｉｌｉａ ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａｅ）、モニリア・ラクサ（Ｍ．ｌａｘａ）］、黒星病［ベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）］、うどんこ病［ポドスフェラ・リューコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）］、に関して、果樹；
−葉の病気：特に、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）］、うどんこ病［ウンシヌラ・ネカトール（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）］、黒腐病［グイニャーディア・ビウェリ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｖｉｗｅｌｌｉ）］、べと病［プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）］、に関して、ブドウの木；
−地上部分の次の病気：サーコスポラ葉枯病［サーコスポラ・ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、うどんこ病［エリシフェ・ベチコラ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、斑点病［ラムラリア・ベチコラ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、に関して、ビートの根
を挙げることができる。
【００１８】
ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物および微生物（細菌、酵母菌、真菌）において見出される、よく特性付けされた酵素である。本発明の方法は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用する。本実施形態において、本発明は、真菌病罹病性作物を処置するための、真菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤の使用、さらに好ましくは、植物病原性真菌のケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤の使用に関する。本発明の特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはニユーロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のケトール酸レダクトイソメラーゼを阻害する。もう一つの特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性の阻害剤である。
【００１９】
あらゆるケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を本発明の方法において使用することができる。ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、当業者によく知られており、これらの阻害剤は、特に、欧州特許第１０６１１４号、米国特許第４，５９４，０９８号、欧州特許第１９６０２６号、欧州特許第４８１４０７号、国際公開公報第９４／２３０６３号、カナダ特許第２００２０２１号および国際公開公報第９７／３７６６０号に記載されている。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性部位に結合している反応中間類似体である。
【００２１】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートである。
【００２２】
さらに好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、殺真菌組成物の形態である。本発明は、有効量の少なくとも一つのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を含む殺真菌組成物にも関する。本発明の殺真菌組成物は、前記阻害剤に加えて、農業上許容可能な固体もしくは液体担体および／または界面活性剤（これも、農業上許容可能なものである）を含む。詳細には、通常の不活性担体および通常の界面活性剤を使用することができる。本発明のこれらの殺真菌組成物は、例えば、保護コロイド、粘着剤、増粘剤、チキソトロープ剤、浸透剤、安定剤、金属イオン封鎖剤などの、あらゆるタイプの他の成分も含有することができる。さらに一般的には、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、通常の調合法に対応するすべての固体または液体添加剤と併用することができる。
【００２４】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤および別の殺真菌化合物を含む殺真菌組成物でもある。他の殺真菌剤との混合物、詳細には、アシベンゾラ−Ｓ−メチル；アゾキシストロビン；ベナラキシル；ベノミル；ブラスチシジン−Ｓ、ブロムコナゾール；カプタホール；カプタン；カルベンダジム；カルボキシン；カルプロパミド；クロロサロニル；銅、または水酸化銅もしくはオキシ塩化銅などの銅誘導体をベースにした殺真菌組成物；シアゾファミド；シモキサニル；シクプロコナゾール；シプロジニル；ジクロラン；ジクロシメット；ジクロラン；ジエトフェンカルブ；ジフェノコナゾール；ジフルメトリム；ジメトモルフ；ジニコナゾール；ジスコストロビン；ドデモルフ；ドジン；エジフェンフォス；エポキシコナゾール；エタボキサム；エチリモール；ファモキサドン；フェナミドン；フェナリモール；フェンブコナゾール；フェンヘキサミド；フェンピクロニル；フェンプロピジン；フェンプロピモルフ；フェリムゾン；フルアジナム；フルジオキソニル；フルメトーバー；フルキノコナゾール；フルシラゾール；フルスルファミド；フルトラニル；フルトリアホール；ホルペット；フララキシル；フラメトピル；グアザチン；ヘキサコナゾール；ヒメキサゾール；イマザリル；イプロベンホス；イプロジオン；イソプロチオラン；カスガマイシン；クレゾキシム−メチル；マンコゼブ；マネブ；メフェノキサム；メパニピリム；メタラキシル、およびメタラキシル−Ｍなどのその誘導体；メタコナゾール；メチラム−亜鉛；メトミノストロビン；オキサジキシル；ペフラゾエート；ペンコナゾール；ペンシクロン；リン酸およびホセチル−Ａｌなどのその誘導体；フタリド、ピコオキシストロビン；プロベナゾール；プロクロラズ；プロシミドン；プロパモカルブ；プロピコナゾール；ピラクロストロビン；ピリメタニル；ピロキロン；キノキシフェン；シルチオファム；シメコナゾール；スピロキサミン；テブコナゾール；テトラコナゾール；チアベンダゾール；チフルザミド；チオファナート、例えば、チオファナート−メチル；チラム；トリジメホン；トリアジメノール；トリシクラゾール；トリデモルフ；トリフロキシストロビン；トリチコナゾール；例えば、イプロバリカルブなどのバリンアミド誘導体；ビンクロゾリン；ジネブおよびゾキサミドとの混合物は、特に有利である。こうして得られた混合物は、より広い活性範囲を有する。本発明の組成物は、一つ以上の殺虫剤、殺菌剤または殺ダニ剤またはフェロモンまたは生物活性を有する他の化合物も含むことができる。
【００２５】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用する殺真菌組成物の製造法でもある。
【００２６】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定することを含む殺真菌化合物の調製法でもある。
【００２７】
そのケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性の阻害を測定するために、試験化合物の存在下で酵素反応を行う。ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を測定するための、従って、この酵素活性を阻害する化合物を特定するためのすべての生化学的アッセイを、本発明の方法に使用することができる。前記生化学的アッセイは、当業者によく知られている（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８：８６５−８７４，１９９２；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：８１３−８２０，１９９４；Ｄｕｍａｓら，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０８：１５６−１６０，１９９７；Ｈａｌｇａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：４７７３−４７８１，１９９８；Ｗｅｓｓｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１２７５３−１２７６０，１９９８；Ｈａｌｇａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：６０２５−６０３４，１９９９）。
【００２８】
その酵素反応は、適するバッファ中の溶液中で行うと有利である。このタイプの反応媒体の使用によって、多数の反応を並行して行うことが可能となり、従って、例えば、マイクロプレートフォーマットで多数の化合物を試験することが可能となる。
【００２９】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定するための方法は、これらの化合物を、マグネシウムの存在下、基質中のＮＡＤＰＨの存在下で、ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させるし、この酵素活性を測定することを含む。
【００３０】
有利には、本発明の方法における酵素活性の測定は，３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することを含み、その酵素反応に使用される基質は、２−アセト酪酸（ＡＬまたは２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）である。当業者には公知の他の酵素活性測定法を本発明の方法に使用できることは理解される。
【００３１】
あらゆるケトール酸レダクトイソメラーゼを本発明の方法において使用することができる。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物、細菌、酵母菌および真菌などの一部の微生物において特性付けされている。対応する遺伝子をクローン化することによって、この酵素の蛋白質の配列を決定することが可能となる（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：６９−４７５，１９９１；Ｃｕｒｉｅｎら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７１７−７２２，１９９３；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４：８２１−８２８，１９９３；Ｂｉｏｕら，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３４０５−３４１５，１９９７；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６０２６−６０３６，１９９５；Ｄｕｍａｓら，Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：３９９−４０８，２００１；Ｓｉｓｔａら，Ｇｅｎｅ，１２０：１１５−１１８，１９９２；Ｚｅｌｅｎａｙａ−Ｔｒｏｉｔｓｋａｙａら，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３２６８−３２７６，１９９５）。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるケトール酸レダクトイソメラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５で表される。
【００３３】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、その自然環境から単離され、精製または不完全精製される。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、様々な方法を利用して調製することができる。これらの方法は、詳細には、これらのポリペプチドを自然発現する細胞などの天然供給源からの精製；適切な宿主細胞による組換えポリペプチドの生産およびその後のそれらの精製；化学合成による製造であり、または最終的にはこれらの様々なアプローチの組合せである。これらの様々な製造法は、当業者によく知られている。
【００３４】
本発明の第一の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、例えば、Ｅ．コリ菌などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母菌、またはＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）もしくはＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）などの真菌のようなこの酵素を自然生産する生物から精製される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、組換え宿主生物において過発現される。ＤＮＡフラグメントを設計するための方法および宿主細胞内でポリペプチドを発現させるための方法は、当業者によく知られており、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版（１９８９）された「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」の１巻および２巻、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら著、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）に記載されている。
【００３６】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定するための方法は、宿主生物においてケトール酸レダクトイソメラーゼを発現させること、その宿主生物によって生産されたケトール酸レダクトイソメラーゼを精製すること、これらの化合物と精製されたケトール酸レダクトイソメラーゼとをマグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で接触させること、ならびに酵素活性を測定することを含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、これらの方法はすべて、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する前記化合物が真菌の成長および／または病理発生を阻害するかどうかを判定する追加段階を含む。
【００３８】
従って、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害することによって真菌の成長および／または病理発生を阻害する化合物を特定するための方法に関する。これらの方法は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害化合物の特定に適するアッセイに化合物または化合物の混合物を付すし、前記アッセイに対して正に反応する化合物を選択すること、適切な場合にはそれらを単離するし、その後、それらを特定することに存する。
【００３９】
好ましくは、前記の適するアッセイとは、上で定義したようなケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性についてのアッセイである。
【００４０】
好ましくは、これらの方法に従って特定した化合物を、その後、当業者には公知の方法に従って、その抗真菌特性について、ならびに植物に対する真菌の病理発生および／または成長を阻害するその能力について試験する。好ましくは、葉または植物全体に対する病理発生分析を利用して化合物を評価する。
【００４１】
本発明によると、用語「化合物」は、ペプチドおよび蛋白質を含むあらゆる化学化合物または化学化合物の混合物を意味するものと解釈される。
【００４２】
本発明によると、用語「化合物の混合物」は、例えば、分子の立体異性体（ジアステレオ異性体）、生物材料（植物、植物組織、細菌培養物、酵母菌培養物もしくは真菌培養物、昆虫、動物組織など）の抽出物由来の天然起源の混合物、または未精製、完全精製もしくは不完全精製反応混合物、または他にコンビナトリアルケミストリーによって誘導された生成物の混合物などの、少なくとも二つの異なる化合物を意味するものと理解される。
【００４３】
最後に、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する新規真菌病発生阻害化合物、詳細には、本発明の方法によって特定された化合物および／または本発明の方法によって特定された化合物から誘導された化合物に関する。
【００４４】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する真菌病発生阻害化合物は、一般的な酵素阻害剤ではない。また、好ましくは、本発明の化合物は、殺真菌活性および／または真菌の病理発生に対して活性を有することが既に知られている化合物ではない。
【００４５】
本発明の主題は、植物病原性真菌に備えて植物を処理する方法でもあり、この方法は、本発明の方法によって特定された化合物で前記植物を処理することを含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明は、本発明の特定法によって、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する真菌病発生阻害化合物を特定することに存する段階、およびその後、通常の化学合成法、酵素的合成法および／または生物材料の抽出法によって前記特定化合物を調製することに存する段階を含む、真菌病発生阻害化合物を調製するための方法にも関する。化合物を調製する段階を進めて、適切な場合には、本発明の特定法により特定された化合物から誘導された化合物を特定し、その後、前記誘導化合物を通常の方法により調製する「最適化」段階を行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較を示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．４）ソフトウェアを使用して配列したもの。 ．：類似のアミノ酸 ＊：同じアミノ酸
【図２】Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（ＩｐＯＨＡ）の存在下、様々な培養条件下でのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）についての成長アッセイを示す図である。 病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤ＩｐＯＨＡの効果を、様々な濃度の阻害剤の存在下、様々な培地中で７日間にわたってこの真菌の成長変化を追跡することによって、試験する。２００μＬの培地、最小培地（ＭＮ）、または最小培地＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン（ＭＮ＋ＩＬＶ）、に胞子数１０５／ｍＬの最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種する。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、０、３、４、５、６および７日（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７）目に、６３０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６３０）を測定する。この光学密度によって、菌糸の成長寸法が提供される。
【図３】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対するＮＡＤＰＨの濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０〜１７５μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。ＮＡＤＰＨについてのＫＭは、１．６μＭである。
【図４】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対する基質ＡＨＢ［Ａ］およびＡＬ［Ｂ］の濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰ）、および１ｍＬの５０ｍＭナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、ＡＨＢ［Ａ］およびＡＬ［Ｂ］の存在下、２５℃で行う。曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。Ａ：ＡＨＢのＫＭは、１．０４μＭである。Ｂ：ＡＬのＫＭは、２６６μＭである。
【図５】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対するマグネシウムの濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（０〜４０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。 曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。Ｍｇ２＋についてのＫＭは、９６８μＭである。
【図６】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートおよびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの結合についての化学量論比を示す図である。阻害剤Ｈｏｅ ７０４［Ａ］およびＩｐＯＨＡ［Ｂ］（０．１ｎｍｏｌ）を、酵素の量を変化させて（０〜０．４ｎｍｏｌ）２０分間２５℃で１０μＬ量のＮＡＤＰＨ（２５ｎｍｏｌ）およびＭｇ２＋（０．２５μｍｏｌ）と共にインキュベートする。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。
【図７】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の存在下での酵母菌イソメロレダクターゼの阻害の動態を示す図である。酵素活性の測定は、５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中の反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）１ｍＬ中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。 反応は、様々な量の阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］（２μＭ〜３０μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。方程式（１）に従って曲線をプロットし、それによって、Ｋｏｂｓ（酵素−阻害剤複合体の生成の見掛けの速度）の値を決定することが可能となる。
【図８】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の存在下での酵母菌イソメロレダクターゼの阻害の動態を示す図である。酵素活性の測定は、５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中の反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）１ｍＬ中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。 反応は、様々な量の阻害剤［Ａ］および［Ｂ］（２μＭ〜５０μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。
【図９】基質ＡＨＢの濃度の関数としての式１／Ｋｏｂｓの使用による、酵母イソメロレダクターゼに対するジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の結合定数ｋ０の決定を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、１２５μＭ〜２．３７５ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。前記反応は、様々な量の基質ＡＨＢ（１２５μＭ〜２．３７５ｍＭ）および阻害剤［Ａ］（１０μＭ）および［Ｂ］（１５μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。 方程式（３）に従って曲線をプロットし、それによって、Ｋ０（阻害と酵素の結合速度）の値を決定することが可能となる。
【００４８】
（実施例）
【実施例１】
【００４９】
マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（イネいもち病菌）ＩＬＶ５遺伝子のクローニング
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントを、真菌イソメロレダクターゼ間に保存されている蛋白質ドメインに対応する対の縮重プライマーを使用して、この真菌のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ生成物を、その後、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、配列して、新たな対のプライマーでＰＣＲにより増幅した。後者のＰＣＲ生成物を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドＤＮＡライブラリをスクリーニングするための相同プローブとして使用した。その後、正のクローンのうちの一つと、既に得られているＰＣＲ生成物の配列から誘導したオリゴヌクレオチドとを使用して、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列を製作した。
【００５０】
１．１．縮重オリゴヌクレオチドを使用する増幅によるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの分離
１．１．１．縮重オリゴヌクレオチドの選択
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの増幅は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって行った。これらの縮重オリゴヌクレオチドは、Ｎ．クラツサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較に基づいて選択した。この比較によって、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のイソメロレダクターゼ中に存在するはずである、これら二つの真菌イソメロレダクターゼ配列間に保存されている４つのドメインを示すことができた。これら４つの保存ドメインは、連続した少なくとも７つの保存アミノ酸から成る。縮重オリゴヌクレオチドのこの配列は、遺伝子コードに従って翻訳された保存ドメインのアミノ酸のものから決定した。縮重度（所定のアミノ酸についてのコドンの数）をできるだけ低くするために、アルギニン、ロイシンまたはセリンなどのアミノ酸は、６つのコドンがそれらに対応するので、避けなければならない。そうしたものとしては、アミノ酸メチオニンおよびトリプトファンが望ましい。たった一つのコドンがそれらに対応するからである。縮重度は、増幅の特異性を増すために、そのオリゴヌクレオチドの３’末端では低くあらねばならない。本発明者らは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＤＮＡの（＋）鎖上のオリゴヌクレオチド１（＋）および３（＋）ならびに（−）鎖上のオリゴヌクレオチド２（−）および４（−）という４つのオリゴヌクレオチドを規定することができた。従って、ＰＣＲ増幅は、１（＋）と２（−）、１（＋）と４（−）、３（＋）と２（−）、３（＋）と４（−）という縮重オリゴヌクレオチドの４つの異なる対を使用して行うことができる。
【００５１】
１．１．２．縮重オリゴヌクレオチドを使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの増幅
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のの増幅に最適な条件は、プライマーの対およびそれらのハイブリダイゼーション温度を変化させることによって決定した。最初の３増幅サイクルは、可変的なハイブリダイゼーション温度（４２℃、５０℃または５５℃）で行ったのに対して、他のサイクルのハイブリダイゼーション温度は、５５℃である。正の対照は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡを用い、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のゲノムＤＮＡについてのものと同じ条件下で行った。ハイブリダイゼーション温度４２℃で、プライマー対（１−４）、（１−２）、（３−４）および（３−２）をそれぞれ用いてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡフラグメントを期待サイズ、すなわち５９０ｂｐ、６１０ｂｐ、４４０ｂｐおよび４７０ｂｐ、で増幅した。しかし、プライマー対（１−４）および（３−２）でのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールは、複合している。ハイブリダイゼーション温度５０℃については、プライマー対（１−４）、（１−２）、（３−４）および（３−２）をそれぞれ使用してＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＤＮＡフラグメントを期待サイズ、すなわち６６０ｂｐ、６８５ｂｐ、５２３ｂｐおよび５４４ｂｐ、で増幅したが、プライマー対（１−４）および（３−４）での増幅プロフィールは、複合している。様々な縮重オリゴヌクレオチド対によって、酵母菌ゲノムＤＮＡおよびＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ゲノムＤＮＡから期待サイズのフラグメントを増幅することができた。そのため、これらの縮重オリゴヌクレオチドを、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を増幅するために、使用することができた。ハイブリダイゼーション温度４２℃で試験した、オリゴヌクレオチドの使用量は、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅に対してなんらかの影響を及ぼすようには見えない。最初のＰＣＲでのハイブリダイゼーション温度４２℃で、様々なプライマー対を用いて得られたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールは、かなり複合している。ハイブリダイゼーション温度５０℃で、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールの単純化が、殆どのプライマー対について、特に、プライマー対（１−２）（期待サイズ（６８５ｂｐ）での単一のＤＮＡフラグメントの増幅を可能にする）について観察された。最初のＰＣＲサイクルでのハイブリダイゼーション温度が５５℃では、プライマー対（１−２）および（３−２）での増幅の特異性を上昇させることおよびその収率を低下させることが可能とならない。従って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡからの増幅についての最良の条件は、オリゴヌクレオチド対（１−２）を使用して、最初のＰＣＲサイクルでのプライマーハイブリダイゼーション温度５０℃で得られた。
【００５２】
１．１．３．プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにおける、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のＰＣＲ増幅内部フラグメントのクローニング
プライマー対（１−２）を使用し、３サイクルはプライマーハイブリダイゼーション温度５０℃、その後、他の増幅サイクルは５５℃でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントを増幅した。約６８０ｐｂのこのＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動のよって分離した後、精製し、その後、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングする。形質転換後、ホワイト／ブルー選択システム（Ｘ−Ｇａｌ）を使用して得られた細菌コロニーは、ホワイト、ブルー、およびコロニーの中心がブルーであるホワイト（ホワイト／ブルーコロニーと呼ばれる）という３つの異なる表現型を示した。プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙのクローニング部位のいずれかの側にハイブリダイズする万能プライマーＳｐ６およびＴ７を使用するＰＣＲによって、様々な表現型の３０のコロニーを分析した。２０のホワイトコロニーおよび１０のホワイト／ブルーコロニーが正である。実際、これらのコロニーから、挿入体のサイズ（６８０ｂｐ）＋プライマーＳｐ６およびＴ７各々と挿入体とを分かつ距離（１２０ｂｐ）に対応する期待サイズ（８１０ｂｐ）で、ＤＮＡフラグメントを増幅した。その後、異なる表現型の二つのクローン、ホワイトおよびホワイト／ブルー、を選択して、配列した。これらが、クローン番号４（ホワイト）および番号２０（ホワイト／ブルー）である。
【００５３】
１．１．４．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のクローン化内部フラグメントの配列の分析
二つのクローン、番号４および番号２０、のヌクレオチド配列の比較は、それらが、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙに異なる配向でクローニングした同じＤＮＡフラグメントに対応することを示し、それによって、それらの表現型の違い（ホワイトおよびホワイト／ブルー）を説明することができた。このクローン化フラグメントの二本鎖ヌクレオチド配列は、このようにして得られた。既知蛋白質をコードしているものとこのヌクレオチド配列との相同性を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：（米国）バイオテクノロジー情報センター）からのＢｌａｓｔｘプログラムを使用して探索した。このプログラムは、ヌクレオチド配列の６つのリーディングフレームの翻訳配列を、そのデータベースに収容されているすべてのたんぱく質配列と比較する。前記クローン化フラグメントのヌクレオチド配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列（ｅ−１０２のエラー）の間に有意な相同性が確認された。これら２つの配列と比較するために前記ソフトウェアにより規定された領域内でのアミノ酸の同一度は、９４％である。従って、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングしたフラグメントは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントに対応する。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＩＬＶ５遺伝子のものは、強い相同性を示すが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列の中心に違いが存在する。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ではこの位置に７７ｂｐのイントロンが存在するので、この違いは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）配列内のイントロンの存在に対応しうる。このイントロンの配列中での位置を探索した。５’スプライシングコンセンサスモチーフと共に、３’スプライシングコンセンサスモチーフおよび投げ縄型配列を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントのヌクレオチド配列において特定した。従って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの推定イントロン（８６ｂｐ）を特定した。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの配列のイントロンのスプライシングによって、「理論上の」ｃＤＮＡフラグメントを得ることが可能となる。その後、この「理論上の」ｃＤＮＡから理論的に導き出したＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列のフラグメントをＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼのものと比較すると、それは、これら二つの酵素の主配列の間の非常に強い同一性を示した（図１）。
【００５４】
１．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用のプローブでのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリのスクリーニング
１．２．１Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブの構築
プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングしたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列に基づき規定したプライマー１３Ｕおよび５４９Ｌを使用して、クローン番号４からＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントをＰＣＲにより増幅した。アガロースゲルで精製した後、このフラグメントを、ＩＬＶ５遺伝子用の標識プローブを作成するためのマトリックスとして使用した。
【００５５】
１．２．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子に特異的なプライマーを使用するＰＣＲによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｇｕｙ１１コスミドライブラリのスクリーニング
Ｇｕｙ１１コスミドライブラリは、９６ウエルプレート内に存在する９６の異なるコスミドに対応する９６のＤＮＡミニ作成体の２８のプール（２６８８クローン）の形で表される。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の既知配列に基づいて規定したプライマー３００Ｕおよび５４９Ｌを使用し、これらのＤＮＡミニ作成体プールに対してＰＣＲ増幅を行うことによって、このコスミドライブラリにおいて、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を探索した。プール番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９から、期待サイズ（２４９ｂｐ）のフラグメントを増幅した。前記ＩＬＶ５遺伝子についての検索は、前記ＩＬＶ５遺伝子用のプローブと、前記プレート番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９からのコスミドをハイブリダイズさせることにより継続した。
【００５６】
１．２．３．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブでのハイブリダイゼーションによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｇｕｙ１１コスミドライブラリのスクリーニング
プレート番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９由来の細菌コロニーをナイロン膜上に複製し、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用のプローブでハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションによって、プレート番号２０および２７からそれぞれコスミドＧ６およびＧ７を、ならびにプレート２９からコスミドＢ５およびＢ６を選択することができた。
【００５７】
１．２．４．コスミド２０／Ｇ６を使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の特性付け
ａ）コスミド２０／Ｇ６を使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列
前記ＩＬＶ５遺伝子の配列を段階的に行った。第一の配列反応は、ＰＣＲによって得られたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの既知配列から選択した分岐プライマーを使用して行った。この新たなＩＬＶ遺伝子配列に基づき、さらなるプライマーを規定して、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子が完全に配列されるまで、他の配列反応を行った。６つのリーディングフレームのＩＬＶ５遺伝子の全ヌクレオチド配列から翻訳された配列をＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列と比較して、翻訳開始ＡＴＧ、翻訳停止の停止コドン、および様々な可能なイントロンの位置を確認した。このようにして、翻訳開始ＡＴＧをＩＬＶ５遺伝子のヌクレオチド配列上で特定した。これは、前記配列の他の要素を位置決めするリフェレンス（＋１）として役立つ。３つの推定イントロンが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のヌクレオチド配列内にあった。第一のイントロンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の位置１９９と２８０（単位：ｂｐ）の間、第二のイントロンは、位置３１４〜３９０にあると考えられ、第三のイントロンは、位置６７０と７５５の間にあると考えられる。翻訳停止の停止コドンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列の位置１４４９にあると考えられる。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡの単離を行って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）およびＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の蛋白質配列の比較により、推測イントロンの位置を確認した。
【００５８】
ｂ）Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡの単離およびＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のイントロンについての検索
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡは、ＩＬＶ５遺伝子配列に基づき規定したオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２２Ｕおよび１０６３Ｌ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリから分離体Ｐ１．２（完全培地中で培養した菌糸のＲＮＡ）のＰＣＲ増幅を行うことによって単離した。オリゴヌクレオチド２２Ｕは、翻訳開始ＡＴＧの前にあり、オリゴヌクレオチド１６０３Ｌは、翻訳停止ＳＴＯＰコドンの後、９３ｂｐにある。二つのフラグメント（サイズ５００ｂｐ未満のフラグメントおよび期待サイズ、すなわち１．６ｋｂ、で増幅したフラグメント）をこのプライマー対で増幅する。期待サイズで増幅したフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離した後、精製し、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングする。形質転換後に得られた２４の細菌クローンを、プライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析する。ＤＮＡフラグメントが、期待サイズ（１．６ｋｂ）で実際に増幅されたので、これら２４のクローンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡを有する。クローン番号１８を選択して、万能プライマーＳｐ６およびＴ７を使用して配列した。ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較によって、イントロンの正確な位置を決定することができた。３つのイントロンは、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列とＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の翻訳体の蛋白質配列の比較によって予測される位置にある。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）では、前記ＩＬＶ５遺伝子は、４つのイントロンを有し、それらは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子と比較して異なる位置にあり、長さが異なる。
【００５９】
ｃ）Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を使用して得られたすべてのデータから導き出されたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の蛋白質配列をこの遺伝子のｃＤＮＡ配列から導き出した。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）、アカバンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較は、これら３種のイソメロレダクターゼの非常に強い同一性を示す。実際、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの配列の間の同一度は、８６％である。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼと酵母菌イソメロレダクターゼの間の同一度は、７０％であり、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼと酵母菌イソメロレダクターゼの間の同一度は、７２％である（図１）。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）とＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）は、非常に類似した真菌種（核菌類）であり、そのことによってこれら二つの種のイソメロレダクターゼの間の高い同一度が説明できる。
【００６０】
ｄ）様々なストレス条件に付したＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの発現の研究
様々なストレス条件に付した菌糸から発生させたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）全ＲＮＡを抽出して、膜に転移させ、その後、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブとハイブリダイズさせた。ＩＬＶ５遺伝子は、構成的に発現される。それ故、ｃＡＭＰによる導入のための高浸透ストレスもしくは窒素系栄養欠乏、熱ショックまたは酸化ストレス中に同じレベルで発現される。しかし、炭素系栄養欠乏中には発現されない。
【実施例２】
【００６１】
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の分解
ＩＬＶ５遺伝子の単離および特性付けに次ぐ目的は、病原性能力を試験するためにＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の突然変異体を得ることであった。ＩＬＶ５遺伝子を分解するために使用した手法は、インビトロでの転置による挿入突然変異誘発である。
【００６２】
２．１．プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋におけるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のサブクローニング
前記ＩＬＶ５遺伝子のサブクローニングをプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋において行い、その後、トランスポゾンに基づく挿入突然変異誘発を行う。ＩＬＶ５遺伝子を含むコスミド２０／Ｇ６は、アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子を有し、そのため、この挿入突然変異誘発のターゲットとして直接使用することはできない。実際、カナマイシンとアンプリシンの二重選択は、トランスポゾン供与プラスミド（ｐＧＰＳ３ Ｈｙｇｒｏ（登録商標））もカナマイシンおよびアンピシリンに対して耐性であるので、トランスポゾンが組み込まれたターゲットプラスミドに対して充分に選択的ではない。そのため、クロラムフェニコールに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミド、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋、にＩＬＶ５遺伝子をサブクローニングした。ターゲットプラスミドにトランスポゾンが組み込まれたクローン（ＩＬＶ５遺伝子を有するｐＢＣ ＳＫ＋）は、カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する二重の耐性のために、選択することができる。加えて、コスミド挿入体のサイズが、あまりにも大きい（４０ｋｂ）。プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋にサブクローニングした、ＩＬＶ５遺伝子を含む約１５ｋｂのフラグメントを選択した。実際、トランスポゾンがＩＬＶ５遺伝子に組み込まれる確立は、ＩＬＶ５遺伝子を有するフラグメントのサイズを低下させると大きくなる。ＩＬＶ５遺伝子は、長さ約３ｋｂであり、トランスポゾンがコスミド（４６ｋｂ）中に存在する遺伝子に組み込まれる確立は、６．５％であるのに対し、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋（１８ｋｂ）にサブクローンニングしたＩＬＶ５遺伝子にトランスポゾンが組み込まれる確立は、約３倍高い、すなわち、約１７％である。ＩＬＶ５遺伝子を有するゲノムＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、挿入体の中心にこの遺伝子を配置することによって行った。このタイプの構築体は、相同組換えによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムへの突然変異ＩＬＶ５遺伝子の組み込みを促進する。ＩＬＶ５を有するコスミド２０／Ｇ６の領域をマッピングすることによって、ＩＬＶ５遺伝子が比較的よく中心に配置されている１５ｋｂのＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントを選択することが可能になる。実際、ＩＬＶ５遺伝子は、前記ゲノム配列の５ｋｂによって５’位に、および５．５ｋｂによって３’位に配列される。ＣｌａＩでコスミド２０／Ｇ６を消化した後、ＩＬＶ５遺伝子を含む１５ｋｂのフラグメントをアガロースゲルで分離し、その後、精製して、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋にサブクローニングした。形質転換後に得られた２４のコロニーを、ＩＬＶ５遺伝子に特異的なプライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析した。５つのクローンが、ＩＬＶ５遺伝子を有する期待サイズ（１．６ｋｂ）のフラグメントを増幅する。ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転置に基づく挿入突然変異誘発を行うために、クローン番号１９を選択した。
【００６３】
２．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転位に基づく挿入突然変異誘発
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転置に基づく挿入突然変異誘発は、クローン番号１９を使用して、ＧＰＳ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で行った。プラスミドｐＧＰＳ３ Ｈｙｇｒｏ（登録商標）（このトランスプライマー中にカナマイシンおよびヒグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子を有する）をトランスポゾン供与体として使用する。ＩＬＶ５遺伝子およびクロラムフェニコールに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋は、ターゲットプラスミドに相当する。挿入突然変異誘発を行ったら、熱反応性細菌ＤＨ５αまたは電気反応性細菌ＤＨ１０Ｂを「突然変異誘発混合物」で形質転換する。形質転換後、ターゲットプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋へのトランスポゾンの組み込みがある細菌クローンを、カナマイシンとクロラムフェニコールの両方に対する耐性によって選択する。この二重耐性は、ターゲットプラスミドと無損傷の供与体プラスミドを両方有する細菌クローンに対しても付与されている可能性がある。Ｐ１−ＳｃｅＩでの消化による供与体プラスミドの分解によって、この問題を克服することが可能となる。トランスポゾンがＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子に組み込まれているかどうか判定するために、選択した細菌クローンを、ＩＬＶ５遺伝子のコード領域の両側に位置するプライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析する。具体的には、トランスポゾンＴｎ７がＩＬＶ５遺伝子に挿入されると、プライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対での増幅はない。これら二つのプライマーの間にあるＤＮＡフラグメントのサイズが大きすぎて（４．３ｋｂ）、増幅できないからである。このサイズは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子（１．６ｋｂ）のコード領域のサイズと２．７ｋｂのＴｎ７トランスポゾンのコード領域のサイズの合計に相当する。熱反応性細胞ＤＨ５の形質転換後、試験した３２のコロニーのうち、４つのコロニー（クローン番号３、４、８および１８）について、増幅の不在が観察された（１２．５％）。従って、これらの細菌クローンには、ＩＬＶ５遺伝子への前記トランスプライマーの挿入がある。電気反応性細胞ＤＨ１０Ｂの形質転換後、ＰＣＲによって試験した３８のコロニーのうち、１つだけ（２．６％）が、増幅の不在を示す（クローン番号２９）。トランスポゾンの各末端に位置する縮重プライマーＴｎ７ＬおよびＴｎ７Ｒを使用して細菌クローン番号３、８、１８および２９を配列して、ＩＬＶ５遺伝子の配列内のＴｎ７トランスポゾンの挿入部位の正確な位置を確認した。トランスポゾンは、クローン番号１８についてはＡＴＧの前２１ｂｐ、クローン番号８についてはＡＴＧの後９ｂｐ、クローン番号３についてはＡＴＧの後８０９ｂｐおよびクローン番号２９についてはＡＴＧの後１１７６ｂｐに組み込まれることとなった。本発明者らは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の形質転換のためにクローン番号８を選択した。実際、このクローンでは、トランスポゾンが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のコード領域の開始点（ＡＴＧの後＋９ｂｐ）に組み込まれ、その結果、ＩＬＶ５遺伝子の不活性化が生じた。
【００６４】
２．３．そのコード領域において分解されたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子でのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の形質転換
そのコード領域（ＡＴＧの後９ｂｐ）において分解されたネいもち病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を有するクローン番号８の挿入体を、ＣｌａＩ酵素での消化により、プラスミドから再び切り出し、アガロースゲルで精製する。それは、線状化された構築体に該当する。未消化のクローン番号８から生じたプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋は、「環状」構築体に該当する。前記線状化構築体５μｇまたは前記「環状」構築体４μｇのいずれかで、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２プロトプラストの形質転換を行う。形質転換の正の対照は、ヒグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＣＢ１００３を３μｇ使用して行い、負の対照は、ＤＮＡを使用せずに行う。線状化構築体については６２の形質転換体が得られ、「環状」構築体については２４の形質転換体が得られる。これら８６の形質転換体を、１２０ｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充した完全培地および１２０ｍｇ／Ｌまたは６０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充した最小培地で二次培養した。このタイプの二次培養によって、ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性であり、それ故、最小培地では成長しないｉｌｖ５−を特定することが可能となる。線状化構築体で得られた６２のうち８の形質転換体（１３％）は、栄養要求性であると考えられ、これに対して、「環状」構築体で得られた２４のうち２つの形質転換体（８．３％）が栄養要求性であると考えられた。「環状」構築体と比較して、線状化構築体でのｉｌｖ５−突然変異体の良好な獲得効率は、相同組換えが線状化構築体で促進されることによって説明できる。これらの形質転換体を「米粉」培地で二次培養して、それらを胞子にし、その後、その胞子をＴＮＫＹＥグルコース完全培地にプレーティングし、放置して発芽させて、単一胞子の単離を行う。１２０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充したＴＮＫＹＥグルコース培地で前記単一胞子を二次培養して、前記形質転換体を精製する。栄養要求性形質転換体の特定は、これらの単一胞子由来のこれらのコロニーを、最小培地または０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充した最小培地で、ならびにＴＮＫＹＥグルコース完全培地で二次培養することによって行う。このようにして、遺伝子的に精製された安定な形質転換体を得た。ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性の潜在的形質転換体１０のうち８（８０％）は、有効に栄養要求性であることがわかった。２つの非栄養要求性形質転換体は、単一胞子精製前の非選択培地での形質転換体の成長中に大部分のｉｌｖ５＋に進化した遺伝子的に異なる集団（ｉｌｖ５＋およびｉｌｖ５−）の混合物に該当したはずである。
【実施例３】
【００６５】
ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性のマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ｉｌｖ５−形質転換体の表現型の特性付けならびにそれらの病原性能力の研究
３．１．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）形質転換体の成長および発育に対するＩＬＶ５遺伝子の分解の影響
様々な培地でｉｌｖ５−形質転換体の発育を試験した。例えば、硝酸塩最小培地ではｉｌｖ５−形質転換体を成長させることができず、これに対して、０．３ｍＭのバリン、ロイシンおよびイソロイシンを補充した最小培地ではそれらの成長が可能である。しかし、最小培地＋０．３ｍＭのバリン、ロイシンおよびイソロイシンでのｉｌｖ５−形質転換体の発育は、野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２のものとは異なる。それらの成長は、実際、遅速し、それらの菌糸は、灰色／緑色で、低く、扁平で、胞子形成性であり、野生型株のように気生ではない。０．３ｍＭのイソロイシンおよびバリンを補充した最小培地で得られた結果は、０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充した最小培地で得られたものと同じであるので、ロイシンの存在は、ｉｌｖ５−形質転換体の成長には必要でない。０．３ｍＭのバリンおよびイソロイシンを補充した最小培地でのｉｌｖ５−形質転換体の発育は、最終濃度１ｍＭのバリンおよびイソロイシンをその最小培地に補充することによって改善することができる。完全培地では、ｉｌｖ５−形質転換体は、野生型株に比較的類似した表現型を示し、それらの菌糸は、灰色／白色であり、多少気生（野生型株よりは劣った気生）である。１ｍｇ／Ｌのパントテイン（ロイシンの生合成に必要なパントテン酸塩の酸化形）を最小培地＋０．３ｍＭのバリンおよびイソロイシンに添加しても、ｉｌｖ５−形質転換体の発育は改善されない。ｉｌｖ５−形質転換体の胞子形成は、「米粉」寒天培地では野生型と比較して遅く、１０倍少ない。最終濃度１ｍＭのバリンおよびイソロイシンをその「米粉」寒天培地に添加すると、ｉｌｖ５−形質転換体の胞子形成は、野生型株とほぼ同じである。
【００６６】
３．２．人工的な生残条件下でオオムギの葉を切り刻むことに基づくｉｌｖ５−栄養要求突然変異体の病原性能力についての試験
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力の試験は、試験形質転換体胞子浮遊液のブロックを、切り刻んだオオムギの葉に綿棒で塗布するか、切り刻んだオオムギの葉の上に堆積させることによって行った。ある接種は、湿潤Ｑチップを使用して行われ、この湿潤Ｑチップは、胞子の浮遊液（一般に、胞子数３×１０４／ｍＬ）に浸漬されたもでであり、また、人工的な生残条件（水中に寒天１％の培地、２ｍｇ／カイネチン１Ｌ）下でのオオムギの葉の断片に綿棒で塗布するために用いられるものである。他のタイプの接種は、オオムギの葉の表面の異なる場所３箇所に３０μＬの液滴を堆積させることに存する。２６℃で５日から９日間インキュベートした後、症状が観察される。
【００６７】
これらの突然変異体によって生じる病変は、野生型株についてのものよりサイズが小さく、数が７５％少ない（下の表１参照）。
【００６８】
表１：人工的な生残条件下でのオオムギの葉に対するｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験
接種後５日目（Ｌ４１およびＬ２１）および接種後７日目（Ｌ５７、Ｌ６４、Ｌ７１、Ｌ８５）にオオムギの葉の上のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）によって、または綿棒塗布試験において生じた病変の数。
【００６９】
Ａ）胞子数３×１０４・ｍＬ−１で調製した形質転換体の胞子の浮遊液
【００７０】
【表１】
【００７１】
Ｂ）胞子数１０５・ｍＬ−１で調製した形質転換体の胞子の浮遊液
【００７２】
【表２】
【００７３】
ｉｌｖ５−突然変異体によって生じる病変は、非定型的でもあり、それらは、より遅く現れる。それらは、野生型株での４日から９日に対し、６日から９日間、２６℃でインキュベートした後、現れる（下の表２参照）。
【００７４】
ｉｌｖ５−形質転換体によって生じる幾つかの病変は、オオムギの葉の端に現れる（表２）。葉の端の損傷は、真菌の浸透を促進しうるので、これらの病変を説明することができる。それ故、植物全体の病原性能力についての試験を行って、先ず、ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力の低下の存在を確認し、次に、ｉｌｖ５−突然変異体の病理発生の低下およびｉｌｖ５−真菌の浸透のための損傷の重要性を統計的に予測した。
【００７５】
表２：人工的な生残条件下でオオムギの葉の上のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）形質転換体によって生じた症状の進展
【００７６】
【表３】
【００７７】
３．３．植物全体に対するｉｌｖ５−栄養要求突然変異体の病原性能力についての試験
ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験は、これらの形質転換体の胞子の浮遊液（胞子数１０４および３×１０４・ｍＬ−１）をオオムギの葉に噴霧することによって行った。最終濃度０．５％（重量／容積）のゼラチンをこの胞子浮遊液に添加して、葉の表面へ胞子の良好な付着を可能にする。前記植物を、接種後一晩、多湿チャンバ内に置く。症状は、オオムギにとっての周囲温度で５日から１０日間インキュベートした後、一般に観察される。
【００７８】
ｉｌｖ５＋形質転換体と比較して、オオムギのいもち病の症状の顕著な減少が、ｉｌｖ５−形質転換体において観察される。周囲温度で１０日間インキュベートした後、葉（約１２ｃｍ）１枚あたりの病変の数は、ｉｌｖ５＋形質転換体Ｌ５７では平均３７であるのに対し、ｉｌｖ５−形質転換体（Ｌ８７、Ｌ７４およびＣ２４）では６から９である（表３参照）。従って、ｉｌｖ５−突然変異体によって生じた病変の数は、野生型株で得られるものと比較して、８０％減少される。加えて、病変は、ｉｌｖ５＋形質転換体についてより、ｉｌｖ５−突然変異体についてのほうが２倍小さく（１３ｍｍ２に対して６ｍｍ２）、これらの病変は、二倍遅く現れる。具体的には、病変の数は、実験の５日目と１０日目の間でｉｌｖ５−突然変異体については二倍になり、これに対して、野生型では同じままだった。人工的な生残条件下でｉｌｖ５−形質転換体によって生じるオオムギの葉の端での一定の病変の出現は、真菌の浸透が、この病理発生試験中にオオムギの葉に加えられた損傷によって促進されたことを示唆していた。しかし、ｉｌｖ５−形質転換体を用いて植物全体に対して行った病理発生試験の結果は、人工的な生残条件下で大麦の葉を用いた場合と同じ程度（８０％）のこれらの突然変異体の病原性能力の低下を示している。
【００７９】
表３：植物全体（オオムギ）に対するｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験
その病原性能力を試験したい形質転換体の胞子の浮遊液（胞子数３×１０４・ｍＬ−１）を噴霧することによって、オオムギ植物に対する接種を行った。前記植物を、接種後一晩、多湿チャンバ内に置いた。接種後、１０日間、周囲温度で症状を観察した。形質転換体Ｌ５７（ｉｌｖ５＋）について得られた値を基準にして計算した葉１枚あたりの病変の数の減少率およびサイズの低下率を、カッコ内に示す。
【００８０】
【表４】
【実施例４】
【００８１】
アセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
４．１．植物病原性真菌マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に対するアセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
植物病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートおよびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの殺真菌効果を、様々な濃度の阻害剤の存在下で７日間にわたってこの真菌の成長び進展を追跡することにより、試験した。例えば、所定の培地（硝酸塩最小培地（ＭＭ）；ＭＭ＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン；ＴＮＫＹＥグルコース完全培地（ＭＣ）；ＭＣ＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン）に、胞子数１０５／ｍＬの最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種する。試験生成物、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（ｐＨ５）、の一定の範囲の希釈液を、前記生成物が１００倍濃縮されるように、水で調製する。接種した培地２００μＬを９６ウエルのマイクロプレートに分配し、それらのウエルに１００倍濃縮物２μＬを添加する。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、最終用量３、１、０．３、０．１、ならびに最小培地中０．０３μＭ、ならびに完全倍地中０．３μＭで試験する。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、このマイクロプレートの６３０ｎｍでの光学密度を読みとることによって、これらの様々な培養条件下、時間０（試験開始）の時点ならびに３日目、４日目、５日目、６日目および７日目の前記細菌の成長を追跡することが可能となる。
【００８２】
この試験は、野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を様々な培地に接種することによって行った。第一の実験は、硝酸塩最小培地（ＭＭ）中で行い、様々な濃度の阻害剤を試験した。それは、ＭＭ培地中での成長の有意な阻害の出現が２ｍＭのジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの存在下で観察される前、成長の６日目および７日目であった。阻害剤を含まない対照のものと比較して、実際、成長を５０％低下させる。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．３μＭから１μＭ）の存在下、３日目から、約５０％の真菌成長阻害が、ＭＭ培地では観察される。ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートと比較してＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）成長の阻害が大きかったことから、本発明者らは、阻害剤のさらに徹底した研究を行うこととなった。
【００８３】
真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）についての成長アッセイを、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．０３μＭから３μＭの範囲の濃度で）の存在下、様々な培地（ＭＭ、および０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充したＭＭ）中で、７日間にわたって行った。最小培地では、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を強く阻害する。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．３μＭから）による成長の阻害は、成長の３日目から観察され、その後の日々も同様のままである（図２）。そのため、本発明者らは、成長の５日目に、ＩＤ８０（真菌成長の阻害が８０％になるような阻害剤濃度）およびＩＤ５０（真菌成長の阻害が５０％になるような阻害剤濃度）を計算することを選択した。例えば、真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長は、１μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート濃度（ＩＤ８０）で、未処理の対照と比較して８０％阻害される。０．３μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート濃度（ＩＤ５０）は、真菌成長を５０％阻害する（表４）。
【００８４】
表４：真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長に対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの効果の研究
【００８５】
【表５】
【００８６】
病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの効果は、様々な濃度の阻害剤の存在下、様々な培地中、７日間にわたってこの真菌の成長の進展を追跡することによって、試験した。表に与えた値は、２つの実験から成長５日目に得られた真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の平均成長率に相当する。対照（Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の野生型菌株）は、成長率１００％に相当する。２００μＬの培地、最長培地（ＭＭ）または最小培地＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン（ＭＭ＋ＩＬＶ）、に、胞子数１０５・ｍＬ−１の最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種した。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、６３０ｎｍ（ＯＤ６３０）での光学密度を０、３、４、５、６および７日目（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７）に測定した。
【００８７】
真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長に対するＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの毒性は、使用されるＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの濃度が何であれ、最小培地に０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充することによって上昇する。最小培地にバリン、ロイシンおよびイソロイシンを添加することによるＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート毒性のこの上昇は、この毒性が、そのイソメロレダクターゼを阻害することによるこれらのアミノ酸の生合成経路の特異的な阻害に起因することを示している。
【００８８】
実際、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼに対して特異的に作用するＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、非常に低い濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を強く阻害する。イソメロレダクターゼおよび阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、非常に良いターゲット／殺真菌剤のカップルであることが判明した。
【００８９】
本発明者らは、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートがＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）胞子の発芽に影響を及ぼすかどうかを判定することにも努めた。０日目および２日目、最小培地中、１および３μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの存在下で以前に行った実験中のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）胞子の顕微鏡観察は、胞子の発芽が阻止されないことを示した。高濃度ではＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートが胞子の発芽を阻止できるのかどうかを判定するために、追加試験を行った。例えば、１０ｍＭでのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、２４時間および７２時間の時点で、水においても、最小培地においても、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の胞子の発芽を阻害しない。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長の阻害は、それ自体、発芽後、菌糸の成長中にのみ現れる。従って、胞子中に存在する貯蔵アミノ酸（バリンおよびイソロイシン）の使用によって、最初は、発芽することができると考えられる。貯蔵アミノ酸の限界および多少速いその枯渇は、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を制限する因子としての役割を果たす。
【００９０】
４．２．他の真菌に対するアセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
ピシウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）およびミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｉｎｉｃｏｌａ）などの他の真菌腫に関するＩｐＯＨＡの毒性を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）と同じ条件（９６ウエルのマイクロプレート内、液体最小培地中での培養）下で測定した。ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）の成長は、使用した最高濃度のＩｐＯＨＡ（３０μＭ）による影響を受けず、このことは、この種が、ＩｐＯＨＡに対して耐性であることを示している。ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）およびピシウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）の成長は、１０μＭを始点としてＩｐＯＨＡによって阻害される。ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｉｎｉｃｏｌａ）の成長は、０．３μＭから阻害される（表５）。この最小培地（ＭＭ−ｌｉｑ）にイソロイシン、ロイシンおよびバリン（１ｍＭ）を補充すると、ＩｐＯＨＡの毒性は、すべての感受性真菌種について上昇する。一方、０．３ｍＭの濃度では、阻害は、３０μＭ未満のＩｐＯＨＡ濃度についてのみ、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）において向上する。
【００９１】
表５：様々な真菌種についてのＩｐＯＨＡの毒性
【００９２】
【表６】
【００９３】
ＩＤ５０：真菌成長を５０％阻害する濃度
ＩＤ８０：真菌成長を８０％阻害する濃度
【実施例５】
【００９４】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアセトキシイソメロレダクターゼの生化学的研究
トランジットペプチドを含まない酵母菌ＩＬＶ５遺伝子のコドン配列をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において過発現させて、大量の酵素を得て、それらの生化学的研究、特に、それらの構造研究を可能した。
【００９５】
前記酵母菌イソメロレダクターゼを研究するために利用した戦略は、次のとおりである：最初に、酵母菌イソメロレダクターゼＩＬＶ５遺伝子を、トランジットペプチドをコードしている蛋白質を用いないＰＣＲによって増幅した。次に、そのＰＣＲ反応生成物をＩＰＴＧ誘導性発現ベクターｐＥＴにクローニングした。次に、そのイソメロレダクターゼを大腸菌において過発現させて、精製し、その後、生化学的特性を研究した。
【００９６】
５．１．成熟蛋白質をコードしている酵母菌イソメロレダクターゼＩＬＶ５遺伝子の部分のＰＣＲ増幅およびクローニング
酵母菌イソメロレダクターゼをその細胞区画、ミトコンドリウム、に合わせることができるシグナルペプチドは、その蛋白質がそのミトコンドリウムに浸透した時、切断される。そのため、本発明者らは、トランジットペプチドをコードしている領域を含まないＩＬＶ５遺伝子をクローニングして、Ｅ．コリにおいてその成熟ペプチドに対応する酵母菌イソメロレダクターゼを過発現させることを選択した。
【００９７】
トランジットペプチドの末端と翻訳停止ＳＴＯＰコドンの間に位置する酵母菌ＩＬＶ５遺伝子の領域を、プライマー対（１’−３’）および（２’−３’）で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。プライマー対（１’−３’）および（２’−３’）で増幅したＤＮＡフラグメントのサイズは、それぞれ、１０７９ｂｐおよび１１２４ｂｐである。これらのＤＮＡフラグメントを、電気泳動によって分離した後、精製し、その後、消化し、ＳａｌＩ／ＮｃｏＩにおいてベクターＰＥＴ−２３ｄにクローニングした。酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩでのクローニングベクターとＰＣＲ反応生成物の二重消化によって、酵母菌ＩＬＶ５遺伝子をベクターＰＥＴ−２３ｄに正しい配向でクローニングすることが、実際、可能である。アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＥＴ−２３ｄ（Ｔｅｂｕ）を、Ｅ．コリにおいて大量の酵母菌イソメロレダクターゼを生産するための誘導性発現ベクターとして使用する。このタイプのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼによってではなく、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７ファージプロモータを有する。クローン化蛋白質の生産は、菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ（クロラムフェニコールに対して耐性）のＩＰＴＧ導入後に発生する。この菌株において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモータの支配下にある。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＬＶ５遺伝子を有する、プラスミドｐＥＴ−２３ｄで形質転換された菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳは、ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ−２３ｄ−イソメロレダクターゼと呼ばれる。構築体番号１は、プライマー（１’−３’）で増幅されたフラグメントのクローニングに対応し、構築体番号２は、プライマー（２’−３’）で増幅されたフラグメントのクローニングに対応する。構築体番号１でのＤＨ５細胞の形質転換後に得られた１２のクローンおよび構築体番号２で形質転換された６つのクローンのＳａｌＩ／ＮｃｏＩ二重消化によって、ベクターｐＥＴにクローニングされたフラグメントを再び切り出し、従って、様々なクローンにおいてこれら二つの構築体のうちの一方の存在を証明することが可能となる。これらの細菌クローンについての消化プロフィールの分析は、それらが、対応する構築体をすべて有することを示した。
【００９８】
二つのクローンを選択した：クローンＰＥＴ１−４（構築体番号１）およびクローンＰＥＴ２−１（構築体番号２）。それらを使用してＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ細胞を形質転換して、Ｅ．コリにおいて酵母菌イソメロレダクターゼを過剰生産させた。
【００９９】
５．２．Ｅ．コリにおいて過剰生産された酵母菌イソメロレダクターゼの精製
酵母菌イソメロレダクターゼの「短」形（構築体番号１）および「長」形（構築体番号２）の過発現を、Ｅ．コリにおいてＩＰＴＧで誘導した。トランジットペプチドをコードしている領域を含まない酵母菌ＩＬＶ５遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ ２３−ｄで形質転換し菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳを、約０．６のＯＤ６００と同等の密度が得られるまで、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ培地中で振盪しながら、２８℃で培養する。その後、最終濃度０．４ｍＭでＩＰＴＧを添加し、その細菌を約１５時間振盪しながら２８℃の培地中に放置する。この細菌培養物を遠心分離（３０分、４５００ｒｐｍ）し、細菌のペレットを１５ｍＬのバッファ（１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＤＴおよびプロテーゼ阻害剤：１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ、５ｍＭのアミノカプロン酸）に再び浮遊させ、Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｓｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、１５分間、パワー４、全溶解時間の４０％、で超音波処理する。その細胞抽出物を遠心分離（２０分、１５０００ｒｐｍ）し、その後、可溶性蛋白質を含有する上清を−８０℃で保存する。
【０１００】
アクリルアミドゲルでの全蛋白質画分および可溶性蛋白質画分の分析は、「短」および「長」形の酵母菌イソメロレダクターゼが、可溶性蛋白質画分に存在するし、それらが、これらの蛋白質の約２５％から３０％を代表することを示した。酵母菌イソメロレダクターゼトランジットペプチド分解部位に関して最も有望な位置は、この酵素の蛋白質配列のアミノ酸４７と４８の間である（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．ら，ＮＡＲ １４，２４：９６３１−９６５０，１９８６）ので、本発明者らは、短形の酵母菌イソメロレダクターゼを用いて研究を継続することを選択した。
【０１０１】
従って、短形のイソメロレダクターゼの精製は、可溶性蛋白質画分を使用し、先ず、アニオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）用い、次にパーミエーションカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５）を用いて、二段階で行った。酵母菌イソメロレダクターゼ（粗製抽出物）を含有する可溶性蛋白質抽出物（１５．５ｍＬ；２２７．８ｍｇの蛋白質）を、１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４バッファ／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＤＴで予め平衡させた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムに連結されたアニオン交換カラム、ＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。その酵素を、このバッファ７８ｍＬで溶離する（流量＝１ｍＬ／分、画分サイズ＝３ｍＬ）。酵母菌イソメロレダクターゼを含有するクロマトグラフ画分を、ｍａｃｒｏｓｅｐ−１０ ｕｎｉｔ（ｆｉｌｔｒｏｎ）において５５００ｒｐｍで遠心分離することにより、１．６ｍＬに濃縮する。その後、この抽出物（２７．７ｍｇ）を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨで予め平衡させた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムに連結されたＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｘ ７５ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける。その酵素を、この同じバッファ５８ｍＬで溶離する（流量＝１ｍＬ／分、画分サイズ＝１ｍＬ）。酵母菌イソメロレダクターゼを含有するクロマトグラフ画分（１８．９９ｍｇ）を、ｍｉｃｒｏｓｅｐ（ｆｉｌｔｒｏｎ）において５５００ｒｐｍで遠心分離することにより、９．７ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存する。
【０１０２】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに可溶性蛋白質画分（約２３０ｍｇ）を注入した後、酵母菌イソメロレダクターゼを、１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４バッファ／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＤＴで希釈する。予備実験が、この酵素は前記カラムに保持されないことを示したので、漸増濃度傾斜のリン酸バッファの作用によってこの酵素を溶離する必要は、実際ない。この第一精製段階の後、約３０ｇの蛋白質を回収した。活性に関して、精製からの収率は、５５％である（表６）。
【０１０３】
表６：Ｅ．コリ中で過発現された酵母菌イソメロレダクターゼを精製するための段階
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
活性は、反応培地（５０ｍＭのＨｅｐｅｓナトリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨおよび０．４８ｍＭのＡＨＢ）中で判定した。
【０１０６】
ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）に従って、または２０５ｎｍでの吸収を測定すること（２０５）によって、蛋白質を検定した。ｎ．ｄ．＝判定不能
【０１０７】
アクリルアミドゲルでのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分プールの分析は、この第一精製段階後、その酵素が実質的に純粋であることを示す。そのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分プールをゲル濾過用カラムに注入し、酵母菌イソメロレダクターゼを２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファで溶離する。この第二精製段階後、約２０ｇの純粋な蛋白質が回収される。酵母菌イソメロレダクターゼを精製するためのこれら二つの段階からの最終収率は、約３４％である。
【０１０８】
５．３．Ｅ．コリにおいて過剰生産された酵母菌イソメロレダクターゼの動力学的特性の研究
酵母菌イソメロレダクターゼについての動力学的パラメータは、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよびＡＨＢまたはＡＬ基質についての飽和条件下、分光光電光度計で酵素反応の進展を追跡することによって決定した。すべての酵素活性測定は、２５℃で、最終量１ｍＬのＨｅｐｅｓナトリウムバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２５０μＭのＮＡＤＰＨを収容している、光路１ｃｍの石英キュベットで行った。酵素反応は、０．４８ｍＭのＡＨＢまたはＡＬの添加によって開始した。この反応の進展を３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下によって追跡した。
【０１０９】
５．３．１．精製組換え酵母菌イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨの判定
酵母菌イソメロレダクターゼに関する動力学的測定の実施に最適な条件を決定するために、様々なｐＨのバッファ中で精製酵素の活性を測定することによって、この酵素の活性に最適なｐＨを判定した。複数の研究によって、植物イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、８．２であることが証明されていたが、酵母菌イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、７．５である。イソメロレダクターゼ活性に最適なｐＨに関する植物と酵母菌の間のこの違いは、これら二つの酵素の細胞の位置によって説明される。植物イソメロレダクターゼは、葉緑体（このｐＨは、光を受けて８．２である）に位置し、これに対して、酵母菌イソメロレダクターゼは、ミトコンドリウム（このｐＨは、７．５である）に位置する。従って、イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、それらが見出される細胞環境によく適するものである。
【０１１０】
５．３．２．精製された組換え酵母菌イソメロレダクターゼについての動力学的パラメータの決定
様々なリガンドに対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性を研究した。
【０１１１】
ａ）比活性
ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの比活性は、それぞれ、６および１μｍｏｌの酸化ＮＡＤＰＨ・（分）−１・（蛋白質のｍｇ）−１である。従って、ＡＨＢ基質の存在下での酵素反応の最大速度（Ｖｍ）の、アセト乳酸基質の存在下での酵素反応の最大速度（Ｖｍ）に対する比率は、酵母菌酵素については、植物酵素と比較して変わらない（Ｖｍ ＡＨＢ／Ｖｍ ＡＬ＝６）。さらに、ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する植物イソメロレダクターゼの比活性は、それぞれ、６および１μｍｏｌの酸化ＮＡＤＰＨ・（分）−１・（蛋白質のｍｇ）−１である。
【０１１２】
ｂ）補助因子ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨに対する親和性
ＮＡＤＰＨに対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性は、非常に高い（図３）。実際、このコファクターについて１．６μＭのＫｍが測定された。このＫＭは、植物酵素について測定されたもの（ＫＭ＝５μＭ）に比較的類似している。精製酵母菌イソメロレダクターゼについて得られたＫＭ ＮＡＤＰＨ値は、不完全精製酵母菌酵素について得られた値（ＫＭ＜２．５μＭ；Ｈａｗｋｅｓら，１９８９）と一貫性がある。しかし、非常に低い親和性（ＡＨＢおよびＭｇ２＋の存在下、ＫＭ ＮＡＤＨ＝６４５μＭ；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８：８６５−８７４，１９９２）で、ＮＡＤＨを使用することができる植物酵素とは異なり、酵母菌酵素は、ＮＡＤＨを使用することができないようである。ＡＨＢ基質およびマグネシウムについての飽和条件下、ＮＡＤＨ（３００μＭ）の存在下では、いかなる酵素活性も検出されなかった。植物イソメロレダクターゼのものよりいっそう低い、そのＮＡＤＨに対する親和性のためである。酵母菌イソメロレダクターゼは、植物酵素よりさらにいっそう著しい特異性で水素供与体としてＮＡＤＰＨを使用すると考えられる。
【０１１３】
ｃ）ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する親和性
ＡＨＢ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ラセミ形ではＫＭ＝１０４μＭ）は、植物イソメロレダクターゼのものより約５倍低いのに対し、ＡＬ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ラセミ形ではＫＭ＝２６６μＭ）は、植物イソメロレダクターゼのものより約１０倍低い（図４）。これらのＫＭ値は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の不完全精製酵素について得られたものにかなり近い。具体的には、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼについてのＫＭ ＡＨＢ値およびＫＭ ＡＬ値は、それぞれ、１６０μＭおよび３２０μＭである。
【０１１４】
酵母菌イソメロレダクターゼと植物イソメロレダクターゼの間の生化学的特性の最も注目すべき違いは、マグネシウムに対するこの酵素の親和性である。
【０１１５】
ｄ）マグネシウムに対する親和性
酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ＫＭ＝９６８μＭ）は、植物酵素のもの（ＫＭ＝約５μＭ）より実質的に２００倍低い。図５を参照。マグネシウムに対する酵母菌イソメロレダクターゼのこの低い親和性は、真菌イソメロレダクターゼの特徴である。実際、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼに関して行われた研究により、この酵素がＮＡＤＰＨおよびＡＨＢ基質の存在下で５８０μＭのＫＭマグネシウムを有することが示されている（Ｋｒｉｔａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｉｓｔｒｙ，２４１：２０４７−２０５１，１９６５）。酵母菌、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）および植物イソメロレダクターゼの主配列の比較は、これら三つの酵素の間の主な違いが、植物酵素の二つのモノマー間の相互作用に関わる１４０のアミノ酸配列の真菌蛋白質における不在であることを示した。しかし、植物酵素におけるＭｇ２＋イオンに結合することが知られている二つのドメインが、酵母菌酵素には存在する。前記１４０のアミノ酸二量化領域における７つのアミノ酸を削除することによって得られた植物イソメロレダクターゼの単量体型突然変異体の研究によって、この酵素が、この酵素の野生型形よりずっと低いマグネシウムに対する親和性を示すことが証明された（Ｗｅｓｓｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２７５３−１２７６０，１９９８）。従って、植物イソメロレダクターゼの四次構造は、植物酵素の活性部位およびマグネシウムに対する高親和性部位の安定化に一定の役割を果たすと考えられる。それ故、酵母菌イソメロレダクターゼは、二つのＭｇ２＋イオン結合ドメインを明らかに有するが、酵母菌酵素におけるこの１４０のアミノ酸領域の配列の不在は、植物酵素のものとはおそらく異なるこの酵素の活性部位の空間構成によって、マグネシウムに対する酵母菌イソメロレダクターゼの、より低い親和性を説明することができる。酵母菌イソメロレダクターゼのマグネシウム結合部位は、このカチオンに対してずっと低い親和性を有するが、ＮＡＤＰＨに対する酵母菌酵素の親和性は、植物酵素のものと類似している。従って、酵母菌イソメロレダクターゼの立体配座は、ＮＡＤＰＨの結合に関わるアミノ末端ドメインが、植物酵素のものに比較的類似しているようなものであり、ならびに二つのマグネシウム原子の結合および基質の結合に責任を負うカルボキシ末端ドメインが、植物酵素のものとは異なるようなものであると考えられる。結晶化による酵母イソメロレダクターゼの四次構造の知識によって、Ｍｇ２＋イオンに対するこの低い親和性を説明することが可能となる。
【０１１６】
５．４．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの効果の研究
５．４．１．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論の研究
阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論の研究は、様々な量の酵素（０．１ｎｍｏｌから０．４ｎｍｏｌ）を、最終量１０μＬの２５ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨおよび０．２５μｍｏｌのＭｇＣｌ２を含有する一定量の阻害剤と共に２０分間インキュベートすることによって行った。この反応は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中０．４８ｍＭのＡＨＢを添加することによって、開始させる。
【０１１７】
０．１ｎｍｏｌのジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの存在下、酵素活性は、０．０９ｎｍｏｌより多い酵素量でのみ検出される。同様に、０．１ｎｍｏｌのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート存在下、酵素活性は、０．１ｎｍｏｌより多い酵素量でのみ検出される（図６）。加えて、これら二つの阻害剤ついては、酵素が反応培地中の阻害剤に対して過剰に存在する時、酵素活性が、阻害剤を含有しない対照のものと並行して増加する。従って、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、酵母菌イソメロレダクターゼに対して不可逆的阻害剤として作用すると考えられる。実際、不可逆的阻害の場合、低量の酵素の存在下ですべての酵素が阻害剤と複合する。反応培地中にはもはやいずれの遊離酵素も存在しないので、その時、酵素活性はゼロになる。反応培地中に存在する酵素の量が、阻害剤の量より多い時には、その培地中の過剰な遊離酵素は、阻害剤を含有しない対照のような挙動をとる（対照に対して平行な直線）。さらに、０．１ｎｍｏｌの阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートまたはジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート）が、０．１ｎｍｏｌの酵素を完全に阻害するために必要であり、従って、酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤の結合の化学量論比は、酵素１ｍｏｌあたり阻害剤１ｍｏｌである。
【０１１８】
５．４．２．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合速度の研究
分光光電光度計において３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することにより、酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの効果を経時的に追跡した。各測定は、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびＮＡＤＰＨ（０．２５ｍＭ）についての飽和条件下、６分間、所定濃度の阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート＝１５μＭまたはジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート＝１０μＭ）および酵素（１１０ｎＭ））の存在下で行なう。使用したＡＨＢ基質の濃度は、２５０μＭから２３７５μＭの範囲である。酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論比の研究は、これらの阻害剤が不可逆的阻害剤のような挙動をとることを示した。従って、不可逆的阻害剤に適用することができる下記方程式（１）によって、反応生成物の生成の動態を説明することが可能となる。下記方程式（１）に基づき定義されるパラメータｍ１、ｍ２およびｍ３は、これらのパラメータの決定に付随する誤差に加えてＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムを使用し、実験曲線を調整することにより、直接得られる。
【０１１９】
方程式（１）
ＯＤ３４０＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）・ｅ（−ｍ３・ｔ）
この式中のパラメータは、次のとおりである：
● ＯＤ３４０は、分光光電分光形を使用し、３４０ｎｍ、時間「ｔ」で測定した光学密度である。
● ｍ１は、「ｔ」が無限大に向かっている時の光学密度である。
● ｍ２は、初期光学密度である。
● ｍ３は、ＮＡＤＰＨの見掛けの消滅定数を掛けた阻害剤の濃度の積である。
【０１２０】
可逆的阻害剤については、二つのケースがあり得る。一段階で阻害剤が直接酵素に結合するか、可逆的酵素／阻害剤中間複合体を生成して二段階で酵素に結合する。阻害剤濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３によって、不可逆的阻害のタイプを定義することが可能となる。従って、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートが酵母イソメロレダクターゼに一段で結合するか、２段で結合するかを判定するために、この酵素の酵素活性に対するこれらの阻害剤の効果を、所定の酵素濃度（１１０ｎＭ）およびＡＨＢ濃度（０．４８ｍＭ）に対して阻害剤の濃度を変化させることにより、経時的に（６分間）追跡する（図７）。可逆的酵素／阻害剤中間複合体の生成を伴わない単純な不可逆的阻害については、酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度（Ｋｏｂｓまたはｍ３）は、阻害剤の濃度の一次関数である。不可逆的阻害が可逆的中間複合体の存在を伴う場合、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、双曲線である。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、直線であり、これは、これらの生成物による酵母菌イソメロレダクターゼの阻害が、植物イソメロレダクターゼの阻害の場合のように、一段階で発生することを示唆している（図８）。しかし、実験誤差を考慮に入れても、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、これら二つの阻害剤についての起点を通らない。これら二つの阻害剤、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート、は、完全に不可逆的ではない可能性がある。この場合、酵素／阻害剤複合体についての解離定数、Ｋ−０、は、無視できない値を有しうる。阻害剤のメカニズム（競合性または非競合性）は、酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度に対する基質の濃度の影響を研究することによって判定することができる。この判定は、基質の濃度の関数としてグラフ表示１／ｍ３を使用して行う。競合性阻害剤については、基質の濃度の関数としてグラフ表示１／ｍ３は、直線である。非競合性阻害剤については、パラメータｍ３は、基質の濃度に依存する。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、ｍ３の逆数が、ＡＨＢ基質の濃度の関数のごとく直線的に変化する。従って、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、ＡＨＢ基質に対して競合性である酵母イソメロレダクターゼの阻害剤のような挙動をとる（図９）。阻害剤／酵母菌酵素結合定数（ｋ０）は、下記方程式（２）によって計算する。
【０１２１】
【数１】
【０１２２】
ｋｏｂｓ＝ｍ３＝酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度
ｋ０＝阻害剤／酵素結合定数
ｋ−０＝阻害剤／酵素解離定数
ＫＲＳＭ＝ＡＨＢ基質についてのミカエリス−メンテン定数
［Ｉ］＝阻害剤の濃度
［Ｓ］＝基質の濃度
不可逆的阻害剤について、ｋ−０は、無視できると考えられる。そこで、ｋ０は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムを使用して下記方程式（３）により計算する。
【０１２３】
【数２】
【０１２４】
この方程式は、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートに用いることはできるが、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートに用いることはできない。ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、基質の濃度の関数としてのグラフ表示１／ｍ３は直線であるが、起点を通らない。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートについては、基質の濃度の関数としてのグラフ表示１／ｍ３は直線であり、ｙ軸上の起点での値は無視できる。この結果を説明することができる仮説は、「阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、おそらく完全には不可逆的でない」である。そこで、線形回帰線によって、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについてのｋ０の値を得ることが可能となる。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートに対応するｋ０の値は、それぞれ、１２４３３Ｍ−１・ｓ−１および７７２１Ｍ−１・ｓ−１である。従って、植物イソメロレダクターゼ（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートについてのｋ０＝１９００Ｍ−１・ｓ−１およびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについてのｋ０＝２２０００Ｍ−１・ｓ−１）とは異なり、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートより良好な酵母菌酵素阻害剤である。
【０１２５】
５．５．酵母菌イソメロレダクターゼの構造研究
酵母菌イソメロレダクターゼの四次構造を二つの異なるアプローチ（質量分析法およびゲル濾過）に従って研究した。
【０１２６】
二つの異なるオリゴマー化状態の存在を非変性条件下で質量分析法によって示した。この方法は、酵母菌イソメロレダクターゼは、主として二量体系で存在するが、少量の単量体形も存在することを示した。二量体は、電荷状態分布［Ｄ＋１８Ｈ］１８＋から［Ｄ＋２１Ｈ］２１＋によって表される。電荷状態［Ｄ＋１２Ｈ］１２＋から［Ｄ＋１４Ｈ］１４＋によって表される酵母菌イソメロレダクターゼの少量の単量体の存在が、この同じ質量スペクトルで示した。従って、酵母菌イソメロレダクターゼは、単量体形と二量体形の平衡状態にある。第一精製段階後に得られた酵母菌イソメロレダクターゼ画分のプールをゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５）にかけると、このイソメロレダクターゼが、単一ピークで溶離されることおよびその分子量が、６７ｋＤａと概算されることが判明する。そこで、非変性条件下で、この酵素の単量体形の予想分子量は、約４０ｋＤａであり、二量体形については８０ｋＤａである。酵母菌イソメロレダクターゼの単量体形と二量体形の間の中間的な分子量によって、この酵素のこれら二つの形の平衡の存在が確認される。これら二つの形の間の急速な動的平衡によってしか、ゲル濾過において得られる単一の溶離ピークを説明することはできない。具体的には、この平衡が遅かった場合、一方がその酵素の単量体形に対応し、他方がその酵素の二量体系に対応する二つの溶離ピークが、ゲル濾過で観察される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌病罹病性作物を処置するためのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は、様々な植物種の作物の相当な損失を招く破壊的な流行病の原因である。病原性真菌からの酵素の阻害剤を利用する原理およびこれらの真菌に対して有効な新規分子を特定するための試験におけるこれらの酵素を使用する原理は、それ自体知られている。しかし、真菌酵素の単純な特性付けでは、目的−潜在的な殺真菌分子の対象として選択される酵素が、真菌の生存に不可欠なものでもあり、その殺真菌分子による阻害の結果、真菌の死がもたらされねばならない、または真菌の病理発生に不可欠でもあり、その阻害が、真菌にとって致命的ではなく、その発病能力を単に阻害するものでなければならない−を達成するために充分ではない。従って、代謝経路の特定ならびに病理発生および真菌の生存に不可欠な酵素の特定が、新規殺真菌製品の開発には必要である。
【０００３】
ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物ならびに細菌および酵母菌などの微生物においてよく特性付けされている酵素である。この酵素は、分枝鎖アミノ酸についての生合成経路の第二酵素であり、基質２Ｓ−２−アセト乳酸（ＡＬ）または２Ｓ−２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）から、それぞれ、２，３−ジヒドロキシ−３−イソ吉草酸（ＤＨＩＶ）または２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸（ＤＨＩＭ）への転化を触媒する。この反応は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在を必要とし、また、メチルまたはエチル基の異性化、その後のＮＡＤＰＨによる還元という２段階で発生する。除草剤の対象としての植物イソメロリダクターゼ（ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄａｃｔａｓｅ）については膨大な知識が得られており（Ｗｉｔｔｅｎｂａｃｈら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，Ｎｏ．１，Ｓｕｐｐｌ．，９４，１９９１；Ｓｃｈｕｌｚら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３８：３７５−３７８，１９９８）、また、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、除草剤として記載されている（欧州特許第１０６１１４号；米国特許第４，５９４，０９８号、欧州特許第１９６０２６号、欧州特許第４８１４０７号、国際公開公報第９４／２３０６３号、カナダ特許第２００２０２１号）。しかし、これらの化合物は、植物に対して有効な除草作用を示さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第１０６１１４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５９４，０９８号明細書
【特許文献３】欧州特許第１９６０２６号明細書
【特許文献４】欧州特許第４８１４０７号明細書
【特許文献５】国際公開第９４／２３０６３号
【特許文献６】カナダ特許第２００２０２１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｉｔｔｅｎｂａｃｈら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，Ｎｏ．１，Ｓｕｐｐｌ．，９４，１９９１
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｌｚら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３８：３７５−３７８，１９９８
【発明の概要】
【０００６】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を施用することを含む、真菌病に対して作物を処置する方法である。マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（イネいもち病菌）においてケトール酸レダクトイソメラーゼをコードしているＩＬＶ５遺伝子を不活性化することによって、真菌の成長が阻害されるということがわかった。この真菌の成長の阻害は、ケトール酸レダクトイソメラーゼに特異的な阻害剤の存在下、インビボでも観察される。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）は、米などの多くの作物植物種に対して病原性である。
【０００７】
（配列表の説明）
配列番号１ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【０００８】
配列番号２ サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【０００９】
配列番号３ ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【００１０】
配列番号４ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｃＤＮＡ。
【００１１】
配列番号５ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ。
【００１２】
配列番号６ マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子。
【００１３】
配列番号７から１８ ＰＣＲのためのプライマー。
【００１４】
本発明の主題は、有効量のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を施用することによる、真菌病に対して作物を処置するための方法である。
【００１５】
本発明の主題は、有効（耕種学的に有効）且つ非植物毒性量のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を、植物が生育しているまたは生育しそうな土壌に、植物の葉および／もしくは果実に、または植物の種子に施用することを特徴とする、植物病原性真菌罹病性作物を治療的または予防的立場で退治するための方法である。「有効且つ非植物毒性量」という表現は、作物に存在するまたは出現しがちな真菌を防除または駆除するために充分であり、はっきりと感知できるいかなる植物毒性症状も前記作物に生じさせない阻害剤の量を意味するものと解釈する。そうした量は、退治すべき真菌、作物のタイプ、気候条件、および本発明の殺真菌組成物に含まれる化合物に依存して、広範に変化しうる。この量は、当業者の範囲内である系統的な現地試験によって決定することができる。
【００１６】
本発明の方法は、穀類（特に、コムギ、ライムギ、ライコムギおよびオオムギ）、バレイショ、綿、エンドウ、ナタネ、トウモロコシもしくはアマの種子、または他に森林の木の種子、または他にこれらの植物の遺伝修飾を受けた種子の処理に有用である。本発明は、農作植物への塗布、すなわち、該当植物の葉、花、果実および／または幹への経葉塗布にも関する。本発明の方法の対象となる植物の中で、米、トウモロコシ、綿、穀類（コムギ、オオムギまたはライコムギなど）、果樹（特に、リンゴの木、西洋ナシの木、モモの木、ブドウの木、バナナの木、オレンジの木、レモンの木など）、油生産作物、例えば、ナタネまたはヒマワリ、市場向けの農園および野菜作物、トマト、サラダ用野菜、蛋白質生産作物、エンドウ、ナス科植物、例えば、バレイショ、ビートの根、アマ、および森林の木、およびまた、これらの作物の遺伝修飾相同体を挙げることができる。
【００１７】
本発明の方法の対象となる植物の中で、
−次の種子の病気：赤かび病［ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）およびフザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、黒穂病［チルレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チルレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）またはチルレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｉｎｄｉｃａ）］、セプトリア病［セプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）］、裸黒穂病［ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）］、と闘うことに関して、コムギ；
−地上の植物の部分の次の病気：穀物眼紋病［タペシア・ヤルンダ（Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ）、タペシア・アクイフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ ａｃｕｉｆｏｒｍｉｓ）］、立枯病［ガエウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）］、フットブライト病［フザリウム・セルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）］、ヘッドブライト病［フザリウム・セルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ミクロドキウム・ニバル（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）］、黒斑点病［リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）］、うどんこ病［エリシペ・グラミニス；以前種名トリチシ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｉｅ ｔｒｉｔｉｃｉ）］、さび［プッシニア・ストリフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プッシニア・レコンデイタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）］、およびセプトリア病［セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）およびセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）］、と闘うことに関して、コムギ；
−次の種子の病気：網斑病［ピレノホラ・グラミニア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ）、ピレノホラ・トレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）およびコクリオボラス・サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）］、裸黒穂病［ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）］および赤かび病［ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）およびフザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、と戦うことに関して、オオムギ；
−地上の植物の部分の次の病気：穀物眼紋病［タペシア・ヤルンダ（Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ）］、網斑病［ピレノホラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）およびコクリオボラス・サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）］、うどんこ病［エリシペ・グラミニス；以前種名ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｉｅ ｈｏｒｄｅｉ）］、小さび病［プクシニア・ホルデリ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｄｅｉ）］および汚斑病［リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）］、と闘うことに関して、オオムギ；
−塊茎の病気［特に、ヘルミントスポリウム・ソラニ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フォーマ・チューベローサ（Ｐｈｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓａ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）］およびベト病［フィトプソラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］と戦うことに関して、バレイショ；
−次の葉の病気：夏疫病［アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、ベト病［フィトプソラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］、と闘うことに関して、バレイショ；
−種子から成長した若い植物の次の病気：立枯病および頚領腐れ［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）］、黒根病［シエラビオプシス・バシコーラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）］、と闘うことに関して、綿；
−次の種子の病気：炭疽病［アスコチタ・ピシ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｉｓｉ）、ミコスフェレラ・ピノデス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｐｉｎｏｄｅｓ）］、赤かび病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）］、灰色かび病［ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）］、ベト病［ヘロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｉｓｉ）］、と闘うことに関して、蛋白質生産穀物、例えば、エンドウ；
−次の種子の病気：フォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ）、アルテルナリア・ブラッシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）およびスクレロチニア・スクレロイオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）と闘うことに関して、油生産作物、例えば、ナタネ；
−種子の病気：［リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ペネシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギウス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびギビレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）］と闘うことに関して、トウモロコシ；
−種子の病気：アルテルナリア・リニコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｉｎｉｃｏｌａ）と闘うことに関して、アマ；
−立枯病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、と闘うことに関して、森林の木；
−地上部分の次の病気：いもち病［マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）］、黒斑点病［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、と闘うことに関して、米；
−次の実生の病気または種子から成長した若い植物の病気：立枯病および頚領腐れ［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ．）］、と闘うことに関して、作物野菜；
−地上部分の次の病気：灰色かび病［ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐ．）］、うどんこ病［特に、エリシフェ・シコラセアラム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、スフェロセカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、レベイルラ・タウリカ（Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｔａｕｒｉｃａ）］、赤かび病［フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］、斑点病［クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）］、アルテルナリア斑点病［アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．）］、炭疽病［コレトトリチューム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）］、セプトリア斑点病［セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ．）］、黒斑点病［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）］、べと病［例えばブレミア・ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）、ペロノスポラ属種（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、シュードペロノスポラ属名（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、フィトソラ属名（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｓｐ．）］、と闘うことに関して、作物野菜；
−地上部分の病気：モニリア病［モニリア・フルクティガーナ（Ｍｏｎｉｌｉａ ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａｅ）、モニリア・ラクサ（Ｍ．ｌａｘａ）］、黒星病［ベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）］、うどんこ病［ポドスフェラ・リューコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）］、に関して、果樹；
−葉の病気：特に、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）］、うどんこ病［ウンシヌラ・ネカトール（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）］、黒腐病［グイニャーディア・ビウェリ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｖｉｗｅｌｌｉ）］、べと病［プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）］、に関して、ブドウの木；
−地上部分の次の病気：サーコスポラ葉枯病［サーコスポラ・ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、うどんこ病［エリシフェ・ベチコラ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、斑点病［ラムラリア・ベチコラ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）］、に関して、ビートの根
を挙げることができる。
【００１８】
ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物および微生物（細菌、酵母菌、真菌）において見出される、よく特性付けされた酵素である。本発明の方法は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用する。本実施形態において、本発明は、真菌病罹病性作物を処置するための、真菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤の使用、さらに好ましくは、植物病原性真菌のケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤の使用に関する。本発明の特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および／またはニユーロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のケトール酸レダクトイソメラーゼを阻害する。もう一つの特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性の阻害剤である。
【００１９】
あらゆるケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を本発明の方法において使用することができる。ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、当業者によく知られており、これらの阻害剤は、特に、欧州特許第１０６１１４号、米国特許第４，５９４，０９８号、欧州特許第１９６０２６号、欧州特許第４８１４０７号、国際公開公報第９４／２３０６３号、カナダ特許第２００２０２１号および国際公開公報第９７／３７６６０号に記載されている。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性部位に結合している反応中間類似体である。
【００２１】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートである。
【００２２】
さらに好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、殺真菌組成物の形態である。本発明は、有効量の少なくとも一つのケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を含む殺真菌組成物にも関する。本発明の殺真菌組成物は、前記阻害剤に加えて、農業上許容可能な固体もしくは液体担体および／または界面活性剤（これも、農業上許容可能なものである）を含む。詳細には、通常の不活性担体および通常の界面活性剤を使用することができる。本発明のこれらの殺真菌組成物は、例えば、保護コロイド、粘着剤、増粘剤、チキソトロープ剤、浸透剤、安定剤、金属イオン封鎖剤などの、あらゆるタイプの他の成分も含有することができる。さらに一般的には、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤は、通常の調合法に対応するすべての固体または液体添加剤と併用することができる。
【００２４】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤および別の殺真菌化合物を含む殺真菌組成物でもある。他の殺真菌剤との混合物、詳細には、アシベンゾラ−Ｓ−メチル；アゾキシストロビン；ベナラキシル；ベノミル；ブラスチシジン−Ｓ、ブロムコナゾール；カプタホール；カプタン；カルベンダジム；カルボキシン；カルプロパミド；クロロサロニル；銅、または水酸化銅もしくはオキシ塩化銅などの銅誘導体をベースにした殺真菌組成物；シアゾファミド；シモキサニル；シクプロコナゾール；シプロジニル；ジクロラン；ジクロシメット；ジクロラン；ジエトフェンカルブ；ジフェノコナゾール；ジフルメトリム；ジメトモルフ；ジニコナゾール；ジスコストロビン；ドデモルフ；ドジン；エジフェンフォス；エポキシコナゾール；エタボキサム；エチリモール；ファモキサドン；フェナミドン；フェナリモール；フェンブコナゾール；フェンヘキサミド；フェンピクロニル；フェンプロピジン；フェンプロピモルフ；フェリムゾン；フルアジナム；フルジオキソニル；フルメトーバー；フルキノコナゾール；フルシラゾール；フルスルファミド；フルトラニル；フルトリアホール；ホルペット；フララキシル；フラメトピル；グアザチン；ヘキサコナゾール；ヒメキサゾール；イマザリル；イプロベンホス；イプロジオン；イソプロチオラン；カスガマイシン；クレゾキシム−メチル；マンコゼブ；マネブ；メフェノキサム；メパニピリム；メタラキシル、およびメタラキシル−Ｍなどのその誘導体；メタコナゾール；メチラム−亜鉛；メトミノストロビン；オキサジキシル；ペフラゾエート；ペンコナゾール；ペンシクロン；リン酸およびホセチル−Ａｌなどのその誘導体；フタリド、ピコオキシストロビン；プロベナゾール；プロクロラズ；プロシミドン；プロパモカルブ；プロピコナゾール；ピラクロストロビン；ピリメタニル；ピロキロン；キノキシフェン；シルチオファム；シメコナゾール；スピロキサミン；テブコナゾール；テトラコナゾール；チアベンダゾール；チフルザミド；チオファナート、例えば、チオファナート−メチル；チラム；トリジメホン；トリアジメノール；トリシクラゾール；トリデモルフ；トリフロキシストロビン；トリチコナゾール；例えば、イプロバリカルブなどのバリンアミド誘導体；ビンクロゾリン；ジネブおよびゾキサミドとの混合物は、特に有利である。こうして得られた混合物は、より広い活性範囲を有する。本発明の組成物は、一つ以上の殺虫剤、殺菌剤または殺ダニ剤またはフェロモンまたは生物活性を有する他の化合物も含むことができる。
【００２５】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用する殺真菌組成物の製造法でもある。
【００２６】
本発明の主題は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定することを含む殺真菌化合物の調製法でもある。
【００２７】
そのケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性の阻害を測定するために、試験化合物の存在下で酵素反応を行う。ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を測定するための、従って、この酵素活性を阻害する化合物を特定するためのすべての生化学的アッセイを、本発明の方法に使用することができる。前記生化学的アッセイは、当業者によく知られている（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８：８６５−８７４，１９９２；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：８１３−８２０，１９９４；Ｄｕｍａｓら，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０８：１５６−１６０，１９９７；Ｈａｌｇａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：４７７３−４７８１，１９９８；Ｗｅｓｓｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１２７５３−１２７６０，１９９８；Ｈａｌｇａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：６０２５−６０３４，１９９９）。
【００２８】
その酵素反応は、適するバッファ中の溶液中で行うと有利である。このタイプの反応媒体の使用によって、多数の反応を並行して行うことが可能となり、従って、例えば、マイクロプレートフォーマットで多数の化合物を試験することが可能となる。
【００２９】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定するための方法は、これらの化合物を、マグネシウムの存在下、基質中のＮＡＤＰＨの存在下で、ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させるし、この酵素活性を測定することを含む。
【００３０】
有利には、本発明の方法における酵素活性の測定は，３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することを含み、その酵素反応に使用される基質は、２−アセト酪酸（ＡＬまたは２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）である。当業者には公知の他の酵素活性測定法を本発明の方法に使用できることは理解される。
【００３１】
あらゆるケトール酸レダクトイソメラーゼを本発明の方法において使用することができる。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、植物、細菌、酵母菌および真菌などの一部の微生物において特性付けされている。対応する遺伝子をクローン化することによって、この酵素の蛋白質の配列を決定することが可能となる（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：６９−４７５，１９９１；Ｃｕｒｉｅｎら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７１７−７２２，１９９３；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４：８２１−８２８，１９９３；Ｂｉｏｕら，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３４０５−３４１５，１９９７；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６０２６−６０３６，１９９５；Ｄｕｍａｓら，Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：３９９−４０８，２００１；Ｓｉｓｔａら，Ｇｅｎｅ，１２０：１１５−１１８，１９９２；Ｚｅｌｅｎａｙａ−Ｔｒｏｉｔｓｋａｙａら，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３２６８−３２７６，１９９５）。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるケトール酸レダクトイソメラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５で表される。
【００３３】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、その自然環境から単離され、精製または不完全精製される。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、様々な方法を利用して調製することができる。これらの方法は、詳細には、これらのポリペプチドを自然発現する細胞などの天然供給源からの精製；適切な宿主細胞による組換えポリペプチドの生産およびその後のそれらの精製；化学合成による製造であり、または最終的にはこれらの様々なアプローチの組合せである。これらの様々な製造法は、当業者によく知られている。
【００３４】
本発明の第一の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、例えば、Ｅ．コリ菌などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母菌、またはＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）もしくはＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）などの真菌のようなこの酵素を自然生産する生物から精製される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼは、組換え宿主生物において過発現される。ＤＮＡフラグメントを設計するための方法および宿主細胞内でポリペプチドを発現させるための方法は、当業者によく知られており、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版（１９８９）された「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」の１巻および２巻、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら著、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）に記載されている。
【００３６】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定するための方法は、宿主生物においてケトール酸レダクトイソメラーゼを発現させること、その宿主生物によって生産されたケトール酸レダクトイソメラーゼを精製すること、これらの化合物と精製されたケトール酸レダクトイソメラーゼとをマグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で接触させること、ならびに酵素活性を測定することを含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、これらの方法はすべて、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する前記化合物が真菌の成長および／または病理発生を阻害するかどうかを判定する追加段階を含む。
【００３８】
従って、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害することによって真菌の成長および／または病理発生を阻害する化合物を特定するための方法に関する。これらの方法は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害化合物の特定に適するアッセイに化合物または化合物の混合物を付すし、前記アッセイに対して正に反応する化合物を選択すること、適切な場合にはそれらを単離するし、その後、それらを特定することに存する。
【００３９】
好ましくは、前記の適するアッセイとは、上で定義したようなケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性についてのアッセイである。
【００４０】
好ましくは、これらの方法に従って特定した化合物を、その後、当業者には公知の方法に従って、その抗真菌特性について、ならびに植物に対する真菌の病理発生および／または成長を阻害するその能力について試験する。好ましくは、葉または植物全体に対する病理発生分析を利用して化合物を評価する。
【００４１】
本発明によると、用語「化合物」は、ペプチドおよび蛋白質を含むあらゆる化学化合物または化学化合物の混合物を意味するものと解釈される。
【００４２】
本発明によると、用語「化合物の混合物」は、例えば、分子の立体異性体（ジアステレオ異性体）、生物材料（植物、植物組織、細菌培養物、酵母菌培養物もしくは真菌培養物、昆虫、動物組織など）の抽出物由来の天然起源の混合物、または未精製、完全精製もしくは不完全精製反応混合物、または他にコンビナトリアルケミストリーによって誘導された生成物の混合物などの、少なくとも二つの異なる化合物を意味するものと理解される。
【００４３】
最後に、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する新規真菌病発生阻害化合物、詳細には、本発明の方法によって特定された化合物および／または本発明の方法によって特定された化合物から誘導された化合物に関する。
【００４４】
好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する真菌病発生阻害化合物は、一般的な酵素阻害剤ではない。また、好ましくは、本発明の化合物は、殺真菌活性および／または真菌の病理発生に対して活性を有することが既に知られている化合物ではない。
【００４５】
本発明の主題は、植物病原性真菌に備えて植物を処理する方法でもあり、この方法は、本発明の方法によって特定された化合物で前記植物を処理することを含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明は、本発明の特定法によって、ケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する真菌病発生阻害化合物を特定することに存する段階、およびその後、通常の化学合成法、酵素的合成法および／または生物材料の抽出法によって前記特定化合物を調製することに存する段階を含む、真菌病発生阻害化合物を調製するための方法にも関する。化合物を調製する段階を進めて、適切な場合には、本発明の特定法により特定された化合物から誘導された化合物を特定し、その後、前記誘導化合物を通常の方法により調製する「最適化」段階を行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較を示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．４）ソフトウェアを使用して配列したもの。 ．：類似のアミノ酸 ＊：同じアミノ酸
【図２】Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（ＩｐＯＨＡ）の存在下、様々な培養条件下でのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）についての成長アッセイを示す図である。 病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤ＩｐＯＨＡの効果を、様々な濃度の阻害剤の存在下、様々な培地中で７日間にわたってこの真菌の成長変化を追跡することによって、試験する。２００μＬの培地、最小培地（ＭＮ）、または最小培地＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン（ＭＮ＋ＩＬＶ）、に胞子数１０５／ｍＬの最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種する。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、０、３、４、５、６および７日（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７）目に、６３０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６３０）を測定する。この光学密度によって、菌糸の成長寸法が提供される。
【図３】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対するＮＡＤＰＨの濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０〜１７５μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。ＮＡＤＰＨについてのＫＭは、１．６μＭである。
【図４】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対する基質ＡＨＢ［Ａ］およびＡＬ［Ｂ］の濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰ）、および１ｍＬの５０ｍＭナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、ＡＨＢ［Ａ］およびＡＬ［Ｂ］の存在下、２５℃で行う。曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。Ａ：ＡＨＢのＫＭは、１．０４μＭである。Ｂ：ＡＬのＫＭは、２６６μＭである。
【図５】酵母菌イソメロレクターゼの酵素活性に対するマグネシウムの濃度の影響を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（０〜４０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。 曲線は、メカエリス−メンテンモデルで調整する。Ｍｇ２＋についてのＫＭは、９６８μＭである。
【図６】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートおよびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの結合についての化学量論比を示す図である。阻害剤Ｈｏｅ ７０４［Ａ］およびＩｐＯＨＡ［Ｂ］（０．１ｎｍｏｌ）を、酵素の量を変化させて（０〜０．４ｎｍｏｌ）２０分間２５℃で１０μＬ量のＮＡＤＰＨ（２５ｎｍｏｌ）およびＭｇ２＋（０．２５μｍｏｌ）と共にインキュベートする。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で行う。
【図７】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の存在下での酵母菌イソメロレダクターゼの阻害の動態を示す図である。酵素活性の測定は、５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中の反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）１ｍＬ中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。 反応は、様々な量の阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］（２μＭ〜３０μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。方程式（１）に従って曲線をプロットし、それによって、Ｋｏｂｓ（酵素−阻害剤複合体の生成の見掛けの速度）の値を決定することが可能となる。
【図８】阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の存在下での酵母菌イソメロレダクターゼの阻害の動態を示す図である。酵素活性の測定は、５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中の反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、０．４８ｍＭのＡＨＢ）１ｍＬ中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。 反応は、様々な量の阻害剤［Ａ］および［Ｂ］（２μＭ〜５０μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。
【図９】基質ＡＨＢの濃度の関数としての式１／Ｋｏｂｓの使用による、酵母イソメロレダクターゼに対するジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート［Ａ］およびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート［Ｂ］の結合定数ｋ０の決定を示す図である。酵素活性の測定は、１ｍＬの反応培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨ、１２５μＭ〜２．３７５ｍＭのＡＨＢ）、および５０ｍＭのナトリウムＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）中、１１０ｎＭの酵素の存在下、２５℃で行う。前記反応は、様々な量の基質ＡＨＢ（１２５μＭ〜２．３７５ｍＭ）および阻害剤［Ａ］（１０μＭ）および［Ｂ］（１５μＭ）を前記反応培地に同時に添加することによって開始する。 方程式（３）に従って曲線をプロットし、それによって、Ｋ０（阻害と酵素の結合速度）の値を決定することが可能となる。
【００４８】
（実施例）
【実施例１】
【００４９】
マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（イネいもち病菌）ＩＬＶ５遺伝子のクローニング
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントを、真菌イソメロレダクターゼ間に保存されている蛋白質ドメインに対応する対の縮重プライマーを使用して、この真菌のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ生成物を、その後、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、配列して、新たな対のプライマーでＰＣＲにより増幅した。後者のＰＣＲ生成物を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドＤＮＡライブラリをスクリーニングするための相同プローブとして使用した。その後、正のクローンのうちの一つと、既に得られているＰＣＲ生成物の配列から誘導したオリゴヌクレオチドとを使用して、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列を製作した。
【００５０】
１．１．縮重オリゴヌクレオチドを使用する増幅によるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの分離
１．１．１．縮重オリゴヌクレオチドの選択
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの増幅は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって行った。これらの縮重オリゴヌクレオチドは、Ｎ．クラツサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較に基づいて選択した。この比較によって、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のイソメロレダクターゼ中に存在するはずである、これら二つの真菌イソメロレダクターゼ配列間に保存されている４つのドメインを示すことができた。これら４つの保存ドメインは、連続した少なくとも７つの保存アミノ酸から成る。縮重オリゴヌクレオチドのこの配列は、遺伝子コードに従って翻訳された保存ドメインのアミノ酸のものから決定した。縮重度（所定のアミノ酸についてのコドンの数）をできるだけ低くするために、アルギニン、ロイシンまたはセリンなどのアミノ酸は、６つのコドンがそれらに対応するので、避けなければならない。そうしたものとしては、アミノ酸メチオニンおよびトリプトファンが望ましい。たった一つのコドンがそれらに対応するからである。縮重度は、増幅の特異性を増すために、そのオリゴヌクレオチドの３’末端では低くあらねばならない。本発明者らは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＤＮＡの（＋）鎖上のオリゴヌクレオチド１（＋）および３（＋）ならびに（−）鎖上のオリゴヌクレオチド２（−）および４（−）という４つのオリゴヌクレオチドを規定することができた。従って、ＰＣＲ増幅は、１（＋）と２（−）、１（＋）と４（−）、３（＋）と２（−）、３（＋）と４（−）という縮重オリゴヌクレオチドの４つの異なる対を使用して行うことができる。
【００５１】
１．１．２．縮重オリゴヌクレオチドを使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの増幅
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のの増幅に最適な条件は、プライマーの対およびそれらのハイブリダイゼーション温度を変化させることによって決定した。最初の３増幅サイクルは、可変的なハイブリダイゼーション温度（４２℃、５０℃または５５℃）で行ったのに対して、他のサイクルのハイブリダイゼーション温度は、５５℃である。正の対照は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡを用い、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のゲノムＤＮＡについてのものと同じ条件下で行った。ハイブリダイゼーション温度４２℃で、プライマー対（１−４）、（１−２）、（３−４）および（３−２）をそれぞれ用いてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡフラグメントを期待サイズ、すなわち５９０ｂｐ、６１０ｂｐ、４４０ｂｐおよび４７０ｂｐ、で増幅した。しかし、プライマー対（１−４）および（３−２）でのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールは、複合している。ハイブリダイゼーション温度５０℃については、プライマー対（１−４）、（１−２）、（３−４）および（３−２）をそれぞれ使用してＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＤＮＡフラグメントを期待サイズ、すなわち６６０ｂｐ、６８５ｂｐ、５２３ｂｐおよび５４４ｂｐ、で増幅したが、プライマー対（１−４）および（３−４）での増幅プロフィールは、複合している。様々な縮重オリゴヌクレオチド対によって、酵母菌ゲノムＤＮＡおよびＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ゲノムＤＮＡから期待サイズのフラグメントを増幅することができた。そのため、これらの縮重オリゴヌクレオチドを、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を増幅するために、使用することができた。ハイブリダイゼーション温度４２℃で試験した、オリゴヌクレオチドの使用量は、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅に対してなんらかの影響を及ぼすようには見えない。最初のＰＣＲでのハイブリダイゼーション温度４２℃で、様々なプライマー対を用いて得られたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールは、かなり複合している。ハイブリダイゼーション温度５０℃で、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡの増幅プロフィールの単純化が、殆どのプライマー対について、特に、プライマー対（１−２）（期待サイズ（６８５ｂｐ）での単一のＤＮＡフラグメントの増幅を可能にする）について観察された。最初のＰＣＲサイクルでのハイブリダイゼーション温度が５５℃では、プライマー対（１−２）および（３−２）での増幅の特異性を上昇させることおよびその収率を低下させることが可能とならない。従って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡからの増幅についての最良の条件は、オリゴヌクレオチド対（１−２）を使用して、最初のＰＣＲサイクルでのプライマーハイブリダイゼーション温度５０℃で得られた。
【００５２】
１．１．３．プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにおける、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のＰＣＲ増幅内部フラグメントのクローニング
プライマー対（１−２）を使用し、３サイクルはプライマーハイブリダイゼーション温度５０℃、その後、他の増幅サイクルは５５℃でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントを増幅した。約６８０ｐｂのこのＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動のよって分離した後、精製し、その後、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングする。形質転換後、ホワイト／ブルー選択システム（Ｘ−Ｇａｌ）を使用して得られた細菌コロニーは、ホワイト、ブルー、およびコロニーの中心がブルーであるホワイト（ホワイト／ブルーコロニーと呼ばれる）という３つの異なる表現型を示した。プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙのクローニング部位のいずれかの側にハイブリダイズする万能プライマーＳｐ６およびＴ７を使用するＰＣＲによって、様々な表現型の３０のコロニーを分析した。２０のホワイトコロニーおよび１０のホワイト／ブルーコロニーが正である。実際、これらのコロニーから、挿入体のサイズ（６８０ｂｐ）＋プライマーＳｐ６およびＴ７各々と挿入体とを分かつ距離（１２０ｂｐ）に対応する期待サイズ（８１０ｂｐ）で、ＤＮＡフラグメントを増幅した。その後、異なる表現型の二つのクローン、ホワイトおよびホワイト／ブルー、を選択して、配列した。これらが、クローン番号４（ホワイト）および番号２０（ホワイト／ブルー）である。
【００５３】
１．１．４．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のクローン化内部フラグメントの配列の分析
二つのクローン、番号４および番号２０、のヌクレオチド配列の比較は、それらが、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙに異なる配向でクローニングした同じＤＮＡフラグメントに対応することを示し、それによって、それらの表現型の違い（ホワイトおよびホワイト／ブルー）を説明することができた。このクローン化フラグメントの二本鎖ヌクレオチド配列は、このようにして得られた。既知蛋白質をコードしているものとこのヌクレオチド配列との相同性を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：（米国）バイオテクノロジー情報センター）からのＢｌａｓｔｘプログラムを使用して探索した。このプログラムは、ヌクレオチド配列の６つのリーディングフレームの翻訳配列を、そのデータベースに収容されているすべてのたんぱく質配列と比較する。前記クローン化フラグメントのヌクレオチド配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列（ｅ−１０２のエラー）の間に有意な相同性が確認された。これら２つの配列と比較するために前記ソフトウェアにより規定された領域内でのアミノ酸の同一度は、９４％である。従って、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングしたフラグメントは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントに対応する。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＩＬＶ５遺伝子のものは、強い相同性を示すが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列の中心に違いが存在する。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ではこの位置に７７ｂｐのイントロンが存在するので、この違いは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）配列内のイントロンの存在に対応しうる。このイントロンの配列中での位置を探索した。５’スプライシングコンセンサスモチーフと共に、３’スプライシングコンセンサスモチーフおよび投げ縄型配列を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントのヌクレオチド配列において特定した。従って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの推定イントロン（８６ｂｐ）を特定した。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの配列のイントロンのスプライシングによって、「理論上の」ｃＤＮＡフラグメントを得ることが可能となる。その後、この「理論上の」ｃＤＮＡから理論的に導き出したＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列のフラグメントをＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼのものと比較すると、それは、これら二つの酵素の主配列の間の非常に強い同一性を示した（図１）。
【００５４】
１．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用のプローブでのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリのスクリーニング
１．２．１Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブの構築
プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングしたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列に基づき規定したプライマー１３Ｕおよび５４９Ｌを使用して、クローン番号４からＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントをＰＣＲにより増幅した。アガロースゲルで精製した後、このフラグメントを、ＩＬＶ５遺伝子用の標識プローブを作成するためのマトリックスとして使用した。
【００５５】
１．２．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子に特異的なプライマーを使用するＰＣＲによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｇｕｙ１１コスミドライブラリのスクリーニング
Ｇｕｙ１１コスミドライブラリは、９６ウエルプレート内に存在する９６の異なるコスミドに対応する９６のＤＮＡミニ作成体の２８のプール（２６８８クローン）の形で表される。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の既知配列に基づいて規定したプライマー３００Ｕおよび５４９Ｌを使用し、これらのＤＮＡミニ作成体プールに対してＰＣＲ増幅を行うことによって、このコスミドライブラリにおいて、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を探索した。プール番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９から、期待サイズ（２４９ｂｐ）のフラグメントを増幅した。前記ＩＬＶ５遺伝子についての検索は、前記ＩＬＶ５遺伝子用のプローブと、前記プレート番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９からのコスミドをハイブリダイズさせることにより継続した。
【００５６】
１．２．３．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブでのハイブリダイゼーションによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）Ｇｕｙ１１コスミドライブラリのスクリーニング
プレート番号１７、１９、２０、２１、２７、２８および２９由来の細菌コロニーをナイロン膜上に複製し、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用のプローブでハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションによって、プレート番号２０および２７からそれぞれコスミドＧ６およびＧ７を、ならびにプレート２９からコスミドＢ５およびＢ６を選択することができた。
【００５７】
１．２．４．コスミド２０／Ｇ６を使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の特性付け
ａ）コスミド２０／Ｇ６を使用するＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列
前記ＩＬＶ５遺伝子の配列を段階的に行った。第一の配列反応は、ＰＣＲによって得られたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の内部フラグメントの既知配列から選択した分岐プライマーを使用して行った。この新たなＩＬＶ遺伝子配列に基づき、さらなるプライマーを規定して、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子が完全に配列されるまで、他の配列反応を行った。６つのリーディングフレームのＩＬＶ５遺伝子の全ヌクレオチド配列から翻訳された配列をＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列と比較して、翻訳開始ＡＴＧ、翻訳停止の停止コドン、および様々な可能なイントロンの位置を確認した。このようにして、翻訳開始ＡＴＧをＩＬＶ５遺伝子のヌクレオチド配列上で特定した。これは、前記配列の他の要素を位置決めするリフェレンス（＋１）として役立つ。３つの推定イントロンが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のヌクレオチド配列内にあった。第一のイントロンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の位置１９９と２８０（単位：ｂｐ）の間、第二のイントロンは、位置３１４〜３９０にあると考えられ、第三のイントロンは、位置６７０と７５５の間にあると考えられる。翻訳停止の停止コドンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の配列の位置１４４９にあると考えられる。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡの単離を行って、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）およびＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の蛋白質配列の比較により、推測イントロンの位置を確認した。
【００５８】
ｂ）Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡの単離およびＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のイントロンについての検索
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡは、ＩＬＶ５遺伝子配列に基づき規定したオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２２Ｕおよび１０６３Ｌ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリから分離体Ｐ１．２（完全培地中で培養した菌糸のＲＮＡ）のＰＣＲ増幅を行うことによって単離した。オリゴヌクレオチド２２Ｕは、翻訳開始ＡＴＧの前にあり、オリゴヌクレオチド１６０３Ｌは、翻訳停止ＳＴＯＰコドンの後、９３ｂｐにある。二つのフラグメント（サイズ５００ｂｐ未満のフラグメントおよび期待サイズ、すなわち１．６ｋｂ、で増幅したフラグメント）をこのプライマー対で増幅する。期待サイズで増幅したフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離した後、精製し、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにクローニングする。形質転換後に得られた２４の細菌クローンを、プライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析する。ＤＮＡフラグメントが、期待サイズ（１．６ｋｂ）で実際に増幅されたので、これら２４のクローンは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡを有する。クローン番号１８を選択して、万能プライマーＳｐ６およびＴ７を使用して配列した。ＩＬＶ５遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較によって、イントロンの正確な位置を決定することができた。３つのイントロンは、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列とＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の翻訳体の蛋白質配列の比較によって予測される位置にある。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）では、前記ＩＬＶ５遺伝子は、４つのイントロンを有し、それらは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子と比較して異なる位置にあり、長さが異なる。
【００５９】
ｃ）Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を使用して得られたすべてのデータから導き出されたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの蛋白質配列
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の蛋白質配列をこの遺伝子のｃＤＮＡ配列から導き出した。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）、アカバンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソメロレダクターゼの蛋白質配列の比較は、これら３種のイソメロレダクターゼの非常に強い同一性を示す。実際、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの配列とＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼの配列の間の同一度は、８６％である。Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼと酵母菌イソメロレダクターゼの間の同一度は、７０％であり、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼと酵母菌イソメロレダクターゼの間の同一度は、７２％である（図１）。Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）とＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）は、非常に類似した真菌種（核菌類）であり、そのことによってこれら二つの種のイソメロレダクターゼの間の高い同一度が説明できる。
【００６０】
ｄ）様々なストレス条件に付したＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼの発現の研究
様々なストレス条件に付した菌糸から発生させたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）全ＲＮＡを抽出して、膜に転移させ、その後、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子用の相同プローブとハイブリダイズさせた。ＩＬＶ５遺伝子は、構成的に発現される。それ故、ｃＡＭＰによる導入のための高浸透ストレスもしくは窒素系栄養欠乏、熱ショックまたは酸化ストレス中に同じレベルで発現される。しかし、炭素系栄養欠乏中には発現されない。
【実施例２】
【００６１】
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の分解
ＩＬＶ５遺伝子の単離および特性付けに次ぐ目的は、病原性能力を試験するためにＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子の突然変異体を得ることであった。ＩＬＶ５遺伝子を分解するために使用した手法は、インビトロでの転置による挿入突然変異誘発である。
【００６２】
２．１．プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋におけるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のサブクローニング
前記ＩＬＶ５遺伝子のサブクローニングをプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋において行い、その後、トランスポゾンに基づく挿入突然変異誘発を行う。ＩＬＶ５遺伝子を含むコスミド２０／Ｇ６は、アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子を有し、そのため、この挿入突然変異誘発のターゲットとして直接使用することはできない。実際、カナマイシンとアンプリシンの二重選択は、トランスポゾン供与プラスミド（ｐＧＰＳ３ Ｈｙｇｒｏ（登録商標））もカナマイシンおよびアンピシリンに対して耐性であるので、トランスポゾンが組み込まれたターゲットプラスミドに対して充分に選択的ではない。そのため、クロラムフェニコールに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミド、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋、にＩＬＶ５遺伝子をサブクローニングした。ターゲットプラスミドにトランスポゾンが組み込まれたクローン（ＩＬＶ５遺伝子を有するｐＢＣ ＳＫ＋）は、カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する二重の耐性のために、選択することができる。加えて、コスミド挿入体のサイズが、あまりにも大きい（４０ｋｂ）。プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋にサブクローニングした、ＩＬＶ５遺伝子を含む約１５ｋｂのフラグメントを選択した。実際、トランスポゾンがＩＬＶ５遺伝子に組み込まれる確立は、ＩＬＶ５遺伝子を有するフラグメントのサイズを低下させると大きくなる。ＩＬＶ５遺伝子は、長さ約３ｋｂであり、トランスポゾンがコスミド（４６ｋｂ）中に存在する遺伝子に組み込まれる確立は、６．５％であるのに対し、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋（１８ｋｂ）にサブクローンニングしたＩＬＶ５遺伝子にトランスポゾンが組み込まれる確立は、約３倍高い、すなわち、約１７％である。ＩＬＶ５遺伝子を有するゲノムＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、挿入体の中心にこの遺伝子を配置することによって行った。このタイプの構築体は、相同組換えによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ゲノムへの突然変異ＩＬＶ５遺伝子の組み込みを促進する。ＩＬＶ５を有するコスミド２０／Ｇ６の領域をマッピングすることによって、ＩＬＶ５遺伝子が比較的よく中心に配置されている１５ｋｂのＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントを選択することが可能になる。実際、ＩＬＶ５遺伝子は、前記ゲノム配列の５ｋｂによって５’位に、および５．５ｋｂによって３’位に配列される。ＣｌａＩでコスミド２０／Ｇ６を消化した後、ＩＬＶ５遺伝子を含む１５ｋｂのフラグメントをアガロースゲルで分離し、その後、精製して、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋にサブクローニングした。形質転換後に得られた２４のコロニーを、ＩＬＶ５遺伝子に特異的なプライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析した。５つのクローンが、ＩＬＶ５遺伝子を有する期待サイズ（１．６ｋｂ）のフラグメントを増幅する。ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転置に基づく挿入突然変異誘発を行うために、クローン番号１９を選択した。
【００６３】
２．２．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転位に基づく挿入突然変異誘発
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のインビトロでの転置に基づく挿入突然変異誘発は、クローン番号１９を使用して、ＧＰＳ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で行った。プラスミドｐＧＰＳ３ Ｈｙｇｒｏ（登録商標）（このトランスプライマー中にカナマイシンおよびヒグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子を有する）をトランスポゾン供与体として使用する。ＩＬＶ５遺伝子およびクロラムフェニコールに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋は、ターゲットプラスミドに相当する。挿入突然変異誘発を行ったら、熱反応性細菌ＤＨ５αまたは電気反応性細菌ＤＨ１０Ｂを「突然変異誘発混合物」で形質転換する。形質転換後、ターゲットプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋へのトランスポゾンの組み込みがある細菌クローンを、カナマイシンとクロラムフェニコールの両方に対する耐性によって選択する。この二重耐性は、ターゲットプラスミドと無損傷の供与体プラスミドを両方有する細菌クローンに対しても付与されている可能性がある。Ｐ１−ＳｃｅＩでの消化による供与体プラスミドの分解によって、この問題を克服することが可能となる。トランスポゾンがＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子に組み込まれているかどうか判定するために、選択した細菌クローンを、ＩＬＶ５遺伝子のコード領域の両側に位置するプライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対を使用するＰＣＲによって分析する。具体的には、トランスポゾンＴｎ７がＩＬＶ５遺伝子に挿入されると、プライマー２２Ｕと１６０３Ｌの対での増幅はない。これら二つのプライマーの間にあるＤＮＡフラグメントのサイズが大きすぎて（４．３ｋｂ）、増幅できないからである。このサイズは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子（１．６ｋｂ）のコード領域のサイズと２．７ｋｂのＴｎ７トランスポゾンのコード領域のサイズの合計に相当する。熱反応性細胞ＤＨ５の形質転換後、試験した３２のコロニーのうち、４つのコロニー（クローン番号３、４、８および１８）について、増幅の不在が観察された（１２．５％）。従って、これらの細菌クローンには、ＩＬＶ５遺伝子への前記トランスプライマーの挿入がある。電気反応性細胞ＤＨ１０Ｂの形質転換後、ＰＣＲによって試験した３８のコロニーのうち、１つだけ（２．６％）が、増幅の不在を示す（クローン番号２９）。トランスポゾンの各末端に位置する縮重プライマーＴｎ７ＬおよびＴｎ７Ｒを使用して細菌クローン番号３、８、１８および２９を配列して、ＩＬＶ５遺伝子の配列内のＴｎ７トランスポゾンの挿入部位の正確な位置を確認した。トランスポゾンは、クローン番号１８についてはＡＴＧの前２１ｂｐ、クローン番号８についてはＡＴＧの後９ｂｐ、クローン番号３についてはＡＴＧの後８０９ｂｐおよびクローン番号２９についてはＡＴＧの後１１７６ｂｐに組み込まれることとなった。本発明者らは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の形質転換のためにクローン番号８を選択した。実際、このクローンでは、トランスポゾンが、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子のコード領域の開始点（ＡＴＧの後＋９ｂｐ）に組み込まれ、その結果、ＩＬＶ５遺伝子の不活性化が生じた。
【００６４】
２．３．そのコード領域において分解されたＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子でのＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の形質転換
そのコード領域（ＡＴＧの後９ｂｐ）において分解されたネいもち病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ＩＬＶ５遺伝子を有するクローン番号８の挿入体を、ＣｌａＩ酵素での消化により、プラスミドから再び切り出し、アガロースゲルで精製する。それは、線状化された構築体に該当する。未消化のクローン番号８から生じたプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋は、「環状」構築体に該当する。前記線状化構築体５μｇまたは前記「環状」構築体４μｇのいずれかで、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２プロトプラストの形質転換を行う。形質転換の正の対照は、ヒグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＣＢ１００３を３μｇ使用して行い、負の対照は、ＤＮＡを使用せずに行う。線状化構築体については６２の形質転換体が得られ、「環状」構築体については２４の形質転換体が得られる。これら８６の形質転換体を、１２０ｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充した完全培地および１２０ｍｇ／Ｌまたは６０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充した最小培地で二次培養した。このタイプの二次培養によって、ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性であり、それ故、最小培地では成長しないｉｌｖ５−を特定することが可能となる。線状化構築体で得られた６２のうち８の形質転換体（１３％）は、栄養要求性であると考えられ、これに対して、「環状」構築体で得られた２４のうち２つの形質転換体（８．３％）が栄養要求性であると考えられた。「環状」構築体と比較して、線状化構築体でのｉｌｖ５−突然変異体の良好な獲得効率は、相同組換えが線状化構築体で促進されることによって説明できる。これらの形質転換体を「米粉」培地で二次培養して、それらを胞子にし、その後、その胞子をＴＮＫＹＥグルコース完全培地にプレーティングし、放置して発芽させて、単一胞子の単離を行う。１２０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを補充したＴＮＫＹＥグルコース培地で前記単一胞子を二次培養して、前記形質転換体を精製する。栄養要求性形質転換体の特定は、これらの単一胞子由来のこれらのコロニーを、最小培地または０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充した最小培地で、ならびにＴＮＫＹＥグルコース完全培地で二次培養することによって行う。このようにして、遺伝子的に精製された安定な形質転換体を得た。ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性の潜在的形質転換体１０のうち８（８０％）は、有効に栄養要求性であることがわかった。２つの非栄養要求性形質転換体は、単一胞子精製前の非選択培地での形質転換体の成長中に大部分のｉｌｖ５＋に進化した遺伝子的に異なる集団（ｉｌｖ５＋およびｉｌｖ５−）の混合物に該当したはずである。
【実施例３】
【００６５】
ロイシン、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性のマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ｉｌｖ５−形質転換体の表現型の特性付けならびにそれらの病原性能力の研究
３．１．Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）形質転換体の成長および発育に対するＩＬＶ５遺伝子の分解の影響
様々な培地でｉｌｖ５−形質転換体の発育を試験した。例えば、硝酸塩最小培地ではｉｌｖ５−形質転換体を成長させることができず、これに対して、０．３ｍＭのバリン、ロイシンおよびイソロイシンを補充した最小培地ではそれらの成長が可能である。しかし、最小培地＋０．３ｍＭのバリン、ロイシンおよびイソロイシンでのｉｌｖ５−形質転換体の発育は、野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２のものとは異なる。それらの成長は、実際、遅速し、それらの菌糸は、灰色／緑色で、低く、扁平で、胞子形成性であり、野生型株のように気生ではない。０．３ｍＭのイソロイシンおよびバリンを補充した最小培地で得られた結果は、０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充した最小培地で得られたものと同じであるので、ロイシンの存在は、ｉｌｖ５−形質転換体の成長には必要でない。０．３ｍＭのバリンおよびイソロイシンを補充した最小培地でのｉｌｖ５−形質転換体の発育は、最終濃度１ｍＭのバリンおよびイソロイシンをその最小培地に補充することによって改善することができる。完全培地では、ｉｌｖ５−形質転換体は、野生型株に比較的類似した表現型を示し、それらの菌糸は、灰色／白色であり、多少気生（野生型株よりは劣った気生）である。１ｍｇ／Ｌのパントテイン（ロイシンの生合成に必要なパントテン酸塩の酸化形）を最小培地＋０．３ｍＭのバリンおよびイソロイシンに添加しても、ｉｌｖ５−形質転換体の発育は改善されない。ｉｌｖ５−形質転換体の胞子形成は、「米粉」寒天培地では野生型と比較して遅く、１０倍少ない。最終濃度１ｍＭのバリンおよびイソロイシンをその「米粉」寒天培地に添加すると、ｉｌｖ５−形質転換体の胞子形成は、野生型株とほぼ同じである。
【００６６】
３．２．人工的な生残条件下でオオムギの葉を切り刻むことに基づくｉｌｖ５−栄養要求突然変異体の病原性能力についての試験
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力の試験は、試験形質転換体胞子浮遊液のブロックを、切り刻んだオオムギの葉に綿棒で塗布するか、切り刻んだオオムギの葉の上に堆積させることによって行った。ある接種は、湿潤Ｑチップを使用して行われ、この湿潤Ｑチップは、胞子の浮遊液（一般に、胞子数３×１０４／ｍＬ）に浸漬されたもでであり、また、人工的な生残条件（水中に寒天１％の培地、２ｍｇ／カイネチン１Ｌ）下でのオオムギの葉の断片に綿棒で塗布するために用いられるものである。他のタイプの接種は、オオムギの葉の表面の異なる場所３箇所に３０μＬの液滴を堆積させることに存する。２６℃で５日から９日間インキュベートした後、症状が観察される。
【００６７】
これらの突然変異体によって生じる病変は、野生型株についてのものよりサイズが小さく、数が７５％少ない（下の表１参照）。
【００６８】
表１：人工的な生残条件下でのオオムギの葉に対するｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験
接種後５日目（Ｌ４１およびＬ２１）および接種後７日目（Ｌ５７、Ｌ６４、Ｌ７１、Ｌ８５）にオオムギの葉の上のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）によって、または綿棒塗布試験において生じた病変の数。
【００６９】
Ａ）胞子数３×１０４・ｍＬ−１で調製した形質転換体の胞子の浮遊液
【００７０】
【表１】
【００７１】
Ｂ）胞子数１０５・ｍＬ−１で調製した形質転換体の胞子の浮遊液
【００７２】
【表２】
【００７３】
ｉｌｖ５−突然変異体によって生じる病変は、非定型的でもあり、それらは、より遅く現れる。それらは、野生型株での４日から９日に対し、６日から９日間、２６℃でインキュベートした後、現れる（下の表２参照）。
【００７４】
ｉｌｖ５−形質転換体によって生じる幾つかの病変は、オオムギの葉の端に現れる（表２）。葉の端の損傷は、真菌の浸透を促進しうるので、これらの病変を説明することができる。それ故、植物全体の病原性能力についての試験を行って、先ず、ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力の低下の存在を確認し、次に、ｉｌｖ５−突然変異体の病理発生の低下およびｉｌｖ５−真菌の浸透のための損傷の重要性を統計的に予測した。
【００７５】
表２：人工的な生残条件下でオオムギの葉の上のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）形質転換体によって生じた症状の進展
【００７６】
【表３】
【００７７】
３．３．植物全体に対するｉｌｖ５−栄養要求突然変異体の病原性能力についての試験
ｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験は、これらの形質転換体の胞子の浮遊液（胞子数１０４および３×１０４・ｍＬ−１）をオオムギの葉に噴霧することによって行った。最終濃度０．５％（重量／容積）のゼラチンをこの胞子浮遊液に添加して、葉の表面へ胞子の良好な付着を可能にする。前記植物を、接種後一晩、多湿チャンバ内に置く。症状は、オオムギにとっての周囲温度で５日から１０日間インキュベートした後、一般に観察される。
【００７８】
ｉｌｖ５＋形質転換体と比較して、オオムギのいもち病の症状の顕著な減少が、ｉｌｖ５−形質転換体において観察される。周囲温度で１０日間インキュベートした後、葉（約１２ｃｍ）１枚あたりの病変の数は、ｉｌｖ５＋形質転換体Ｌ５７では平均３７であるのに対し、ｉｌｖ５−形質転換体（Ｌ８７、Ｌ７４およびＣ２４）では６から９である（表３参照）。従って、ｉｌｖ５−突然変異体によって生じた病変の数は、野生型株で得られるものと比較して、８０％減少される。加えて、病変は、ｉｌｖ５＋形質転換体についてより、ｉｌｖ５−突然変異体についてのほうが２倍小さく（１３ｍｍ２に対して６ｍｍ２）、これらの病変は、二倍遅く現れる。具体的には、病変の数は、実験の５日目と１０日目の間でｉｌｖ５−突然変異体については二倍になり、これに対して、野生型では同じままだった。人工的な生残条件下でｉｌｖ５−形質転換体によって生じるオオムギの葉の端での一定の病変の出現は、真菌の浸透が、この病理発生試験中にオオムギの葉に加えられた損傷によって促進されたことを示唆していた。しかし、ｉｌｖ５−形質転換体を用いて植物全体に対して行った病理発生試験の結果は、人工的な生残条件下で大麦の葉を用いた場合と同じ程度（８０％）のこれらの突然変異体の病原性能力の低下を示している。
【００７９】
表３：植物全体（オオムギ）に対するｉｌｖ５−形質転換体の病原性能力についての試験
その病原性能力を試験したい形質転換体の胞子の浮遊液（胞子数３×１０４・ｍＬ−１）を噴霧することによって、オオムギ植物に対する接種を行った。前記植物を、接種後一晩、多湿チャンバ内に置いた。接種後、１０日間、周囲温度で症状を観察した。形質転換体Ｌ５７（ｉｌｖ５＋）について得られた値を基準にして計算した葉１枚あたりの病変の数の減少率およびサイズの低下率を、カッコ内に示す。
【００８０】
【表４】
【実施例４】
【００８１】
アセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
４．１．植物病原性真菌マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に対するアセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
植物病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートおよびＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの殺真菌効果を、様々な濃度の阻害剤の存在下で７日間にわたってこの真菌の成長び進展を追跡することにより、試験した。例えば、所定の培地（硝酸塩最小培地（ＭＭ）；ＭＭ＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン；ＴＮＫＹＥグルコース完全培地（ＭＣ）；ＭＣ＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン）に、胞子数１０５／ｍＬの最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種する。試験生成物、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（ｐＨ５）、の一定の範囲の希釈液を、前記生成物が１００倍濃縮されるように、水で調製する。接種した培地２００μＬを９６ウエルのマイクロプレートに分配し、それらのウエルに１００倍濃縮物２μＬを添加する。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、最終用量３、１、０．３、０．１、ならびに最小培地中０．０３μＭ、ならびに完全倍地中０．３μＭで試験する。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、このマイクロプレートの６３０ｎｍでの光学密度を読みとることによって、これらの様々な培養条件下、時間０（試験開始）の時点ならびに３日目、４日目、５日目、６日目および７日目の前記細菌の成長を追跡することが可能となる。
【００８２】
この試験は、野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を様々な培地に接種することによって行った。第一の実験は、硝酸塩最小培地（ＭＭ）中で行い、様々な濃度の阻害剤を試験した。それは、ＭＭ培地中での成長の有意な阻害の出現が２ｍＭのジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの存在下で観察される前、成長の６日目および７日目であった。阻害剤を含まない対照のものと比較して、実際、成長を５０％低下させる。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．３μＭから１μＭ）の存在下、３日目から、約５０％の真菌成長阻害が、ＭＭ培地では観察される。ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートと比較してＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）成長の阻害が大きかったことから、本発明者らは、阻害剤のさらに徹底した研究を行うこととなった。
【００８３】
真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）についての成長アッセイを、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．０３μＭから３μＭの範囲の濃度で）の存在下、様々な培地（ＭＭ、および０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充したＭＭ）中で、７日間にわたって行った。最小培地では、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を強く阻害する。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート（０．３μＭから）による成長の阻害は、成長の３日目から観察され、その後の日々も同様のままである（図２）。そのため、本発明者らは、成長の５日目に、ＩＤ８０（真菌成長の阻害が８０％になるような阻害剤濃度）およびＩＤ５０（真菌成長の阻害が５０％になるような阻害剤濃度）を計算することを選択した。例えば、真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長は、１μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート濃度（ＩＤ８０）で、未処理の対照と比較して８０％阻害される。０．３μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート濃度（ＩＤ５０）は、真菌成長を５０％阻害する（表４）。
【００８４】
表４：真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長に対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの効果の研究
【００８５】
【表５】
【００８６】
病原性真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの効果は、様々な濃度の阻害剤の存在下、様々な培地中、７日間にわたってこの真菌の成長の進展を追跡することによって、試験した。表に与えた値は、２つの実験から成長５日目に得られた真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の平均成長率に相当する。対照（Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の野生型菌株）は、成長率１００％に相当する。２００μＬの培地、最長培地（ＭＭ）または最小培地＋０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシン（ＭＭ＋ＩＬＶ）、に、胞子数１０５・ｍＬ−１の最終濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）株Ｐ１．２の胞子の浮遊液を接種した。そのマイクロプレートを周囲温度でインキュベートし、６３０ｎｍ（ＯＤ６３０）での光学密度を０、３、４、５、６および７日目（Ｄ０、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７）に測定した。
【００８７】
真菌Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長に対するＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの毒性は、使用されるＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの濃度が何であれ、最小培地に０．３ｍＭのロイシン、バリンおよびイソロイシンを補充することによって上昇する。最小培地にバリン、ロイシンおよびイソロイシンを添加することによるＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート毒性のこの上昇は、この毒性が、そのイソメロレダクターゼを阻害することによるこれらのアミノ酸の生合成経路の特異的な阻害に起因することを示している。
【００８８】
実際、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）イソメロレダクターゼに対して特異的に作用するＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、非常に低い濃度でＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を強く阻害する。イソメロレダクターゼおよび阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、非常に良いターゲット／殺真菌剤のカップルであることが判明した。
【００８９】
本発明者らは、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートがＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）胞子の発芽に影響を及ぼすかどうかを判定することにも努めた。０日目および２日目、最小培地中、１および３μＭのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートの存在下で以前に行った実験中のＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）胞子の顕微鏡観察は、胞子の発芽が阻止されないことを示した。高濃度ではＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートが胞子の発芽を阻止できるのかどうかを判定するために、追加試験を行った。例えば、１０ｍＭでのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、２４時間および７２時間の時点で、水においても、最小培地においても、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の胞子の発芽を阻害しない。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートによるＭ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長の阻害は、それ自体、発芽後、菌糸の成長中にのみ現れる。従って、胞子中に存在する貯蔵アミノ酸（バリンおよびイソロイシン）の使用によって、最初は、発芽することができると考えられる。貯蔵アミノ酸の限界および多少速いその枯渇は、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の成長を制限する因子としての役割を果たす。
【００９０】
４．２．他の真菌に対するアセトヒドロキシイソメロレダクターゼ阻害剤の殺真菌効果
ピシウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）およびミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｉｎｉｃｏｌａ）などの他の真菌腫に関するＩｐＯＨＡの毒性を、Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）と同じ条件（９６ウエルのマイクロプレート内、液体最小培地中での培養）下で測定した。ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）の成長は、使用した最高濃度のＩｐＯＨＡ（３０μＭ）による影響を受けず、このことは、この種が、ＩｐＯＨＡに対して耐性であることを示している。ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）およびピシウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）の成長は、１０μＭを始点としてＩｐＯＨＡによって阻害される。ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｉｎｉｃｏｌａ）の成長は、０．３μＭから阻害される（表５）。この最小培地（ＭＭ−ｌｉｑ）にイソロイシン、ロイシンおよびバリン（１ｍＭ）を補充すると、ＩｐＯＨＡの毒性は、すべての感受性真菌種について上昇する。一方、０．３ｍＭの濃度では、阻害は、３０μＭ未満のＩｐＯＨＡ濃度についてのみ、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）において向上する。
【００９１】
表５：様々な真菌種についてのＩｐＯＨＡの毒性
【００９２】
【表６】
【００９３】
ＩＤ５０：真菌成長を５０％阻害する濃度
ＩＤ８０：真菌成長を８０％阻害する濃度
【実施例５】
【００９４】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアセトキシイソメロレダクターゼの生化学的研究
トランジットペプチドを含まない酵母菌ＩＬＶ５遺伝子のコドン配列をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において過発現させて、大量の酵素を得て、それらの生化学的研究、特に、それらの構造研究を可能した。
【００９５】
前記酵母菌イソメロレダクターゼを研究するために利用した戦略は、次のとおりである：最初に、酵母菌イソメロレダクターゼＩＬＶ５遺伝子を、トランジットペプチドをコードしている蛋白質を用いないＰＣＲによって増幅した。次に、そのＰＣＲ反応生成物をＩＰＴＧ誘導性発現ベクターｐＥＴにクローニングした。次に、そのイソメロレダクターゼを大腸菌において過発現させて、精製し、その後、生化学的特性を研究した。
【００９６】
５．１．成熟蛋白質をコードしている酵母菌イソメロレダクターゼＩＬＶ５遺伝子の部分のＰＣＲ増幅およびクローニング
酵母菌イソメロレダクターゼをその細胞区画、ミトコンドリウム、に合わせることができるシグナルペプチドは、その蛋白質がそのミトコンドリウムに浸透した時、切断される。そのため、本発明者らは、トランジットペプチドをコードしている領域を含まないＩＬＶ５遺伝子をクローニングして、Ｅ．コリにおいてその成熟ペプチドに対応する酵母菌イソメロレダクターゼを過発現させることを選択した。
【００９７】
トランジットペプチドの末端と翻訳停止ＳＴＯＰコドンの間に位置する酵母菌ＩＬＶ５遺伝子の領域を、プライマー対（１’−３’）および（２’−３’）で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。プライマー対（１’−３’）および（２’−３’）で増幅したＤＮＡフラグメントのサイズは、それぞれ、１０７９ｂｐおよび１１２４ｂｐである。これらのＤＮＡフラグメントを、電気泳動によって分離した後、精製し、その後、消化し、ＳａｌＩ／ＮｃｏＩにおいてベクターＰＥＴ−２３ｄにクローニングした。酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩでのクローニングベクターとＰＣＲ反応生成物の二重消化によって、酵母菌ＩＬＶ５遺伝子をベクターＰＥＴ−２３ｄに正しい配向でクローニングすることが、実際、可能である。アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミドｐＥＴ−２３ｄ（Ｔｅｂｕ）を、Ｅ．コリにおいて大量の酵母菌イソメロレダクターゼを生産するための誘導性発現ベクターとして使用する。このタイプのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼによってではなく、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７ファージプロモータを有する。クローン化蛋白質の生産は、菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ（クロラムフェニコールに対して耐性）のＩＰＴＧ導入後に発生する。この菌株において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモータの支配下にある。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＬＶ５遺伝子を有する、プラスミドｐＥＴ−２３ｄで形質転換された菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳは、ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ−２３ｄ−イソメロレダクターゼと呼ばれる。構築体番号１は、プライマー（１’−３’）で増幅されたフラグメントのクローニングに対応し、構築体番号２は、プライマー（２’−３’）で増幅されたフラグメントのクローニングに対応する。構築体番号１でのＤＨ５細胞の形質転換後に得られた１２のクローンおよび構築体番号２で形質転換された６つのクローンのＳａｌＩ／ＮｃｏＩ二重消化によって、ベクターｐＥＴにクローニングされたフラグメントを再び切り出し、従って、様々なクローンにおいてこれら二つの構築体のうちの一方の存在を証明することが可能となる。これらの細菌クローンについての消化プロフィールの分析は、それらが、対応する構築体をすべて有することを示した。
【００９８】
二つのクローンを選択した：クローンＰＥＴ１−４（構築体番号１）およびクローンＰＥＴ２−１（構築体番号２）。それらを使用してＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ細胞を形質転換して、Ｅ．コリにおいて酵母菌イソメロレダクターゼを過剰生産させた。
【００９９】
５．２．Ｅ．コリにおいて過剰生産された酵母菌イソメロレダクターゼの精製
酵母菌イソメロレダクターゼの「短」形（構築体番号１）および「長」形（構築体番号２）の過発現を、Ｅ．コリにおいてＩＰＴＧで誘導した。トランジットペプチドをコードしている領域を含まない酵母菌ＩＬＶ５遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ ２３−ｄで形質転換し菌株ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳを、約０．６のＯＤ６００と同等の密度が得られるまで、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ培地中で振盪しながら、２８℃で培養する。その後、最終濃度０．４ｍＭでＩＰＴＧを添加し、その細菌を約１５時間振盪しながら２８℃の培地中に放置する。この細菌培養物を遠心分離（３０分、４５００ｒｐｍ）し、細菌のペレットを１５ｍＬのバッファ（１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＤＴおよびプロテーゼ阻害剤：１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ、５ｍＭのアミノカプロン酸）に再び浮遊させ、Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｓｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、１５分間、パワー４、全溶解時間の４０％、で超音波処理する。その細胞抽出物を遠心分離（２０分、１５０００ｒｐｍ）し、その後、可溶性蛋白質を含有する上清を−８０℃で保存する。
【０１００】
アクリルアミドゲルでの全蛋白質画分および可溶性蛋白質画分の分析は、「短」および「長」形の酵母菌イソメロレダクターゼが、可溶性蛋白質画分に存在するし、それらが、これらの蛋白質の約２５％から３０％を代表することを示した。酵母菌イソメロレダクターゼトランジットペプチド分解部位に関して最も有望な位置は、この酵素の蛋白質配列のアミノ酸４７と４８の間である（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．ら，ＮＡＲ １４，２４：９６３１−９６５０，１９８６）ので、本発明者らは、短形の酵母菌イソメロレダクターゼを用いて研究を継続することを選択した。
【０１０１】
従って、短形のイソメロレダクターゼの精製は、可溶性蛋白質画分を使用し、先ず、アニオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）用い、次にパーミエーションカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５）を用いて、二段階で行った。酵母菌イソメロレダクターゼ（粗製抽出物）を含有する可溶性蛋白質抽出物（１５．５ｍＬ；２２７．８ｍｇの蛋白質）を、１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４バッファ／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＤＴで予め平衡させた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムに連結されたアニオン交換カラム、ＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。その酵素を、このバッファ７８ｍＬで溶離する（流量＝１ｍＬ／分、画分サイズ＝３ｍＬ）。酵母菌イソメロレダクターゼを含有するクロマトグラフ画分を、ｍａｃｒｏｓｅｐ−１０ ｕｎｉｔ（ｆｉｌｔｒｏｎ）において５５００ｒｐｍで遠心分離することにより、１．６ｍＬに濃縮する。その後、この抽出物（２７．７ｍｇ）を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨで予め平衡させた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムに連結されたＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｘ ７５ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける。その酵素を、この同じバッファ５８ｍＬで溶離する（流量＝１ｍＬ／分、画分サイズ＝１ｍＬ）。酵母菌イソメロレダクターゼを含有するクロマトグラフ画分（１８．９９ｍｇ）を、ｍｉｃｒｏｓｅｐ（ｆｉｌｔｒｏｎ）において５５００ｒｐｍで遠心分離することにより、９．７ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存する。
【０１０２】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに可溶性蛋白質画分（約２３０ｍｇ）を注入した後、酵母菌イソメロレダクターゼを、１０ｍＭのＫＨ２−Ｋ２ＰＯ４バッファ／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＤＴで希釈する。予備実験が、この酵素は前記カラムに保持されないことを示したので、漸増濃度傾斜のリン酸バッファの作用によってこの酵素を溶離する必要は、実際ない。この第一精製段階の後、約３０ｇの蛋白質を回収した。活性に関して、精製からの収率は、５５％である（表６）。
【０１０３】
表６：Ｅ．コリ中で過発現された酵母菌イソメロレダクターゼを精製するための段階
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
活性は、反応培地（５０ｍＭのＨｅｐｅｓナトリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭのＮＡＤＰＨおよび０．４８ｍＭのＡＨＢ）中で判定した。
【０１０６】
ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）に従って、または２０５ｎｍでの吸収を測定すること（２０５）によって、蛋白質を検定した。ｎ．ｄ．＝判定不能
【０１０７】
アクリルアミドゲルでのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分プールの分析は、この第一精製段階後、その酵素が実質的に純粋であることを示す。そのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分プールをゲル濾過用カラムに注入し、酵母菌イソメロレダクターゼを２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファで溶離する。この第二精製段階後、約２０ｇの純粋な蛋白質が回収される。酵母菌イソメロレダクターゼを精製するためのこれら二つの段階からの最終収率は、約３４％である。
【０１０８】
５．３．Ｅ．コリにおいて過剰生産された酵母菌イソメロレダクターゼの動力学的特性の研究
酵母菌イソメロレダクターゼについての動力学的パラメータは、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよびＡＨＢまたはＡＬ基質についての飽和条件下、分光光電光度計で酵素反応の進展を追跡することによって決定した。すべての酵素活性測定は、２５℃で、最終量１ｍＬのＨｅｐｅｓナトリウムバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２５０μＭのＮＡＤＰＨを収容している、光路１ｃｍの石英キュベットで行った。酵素反応は、０．４８ｍＭのＡＨＢまたはＡＬの添加によって開始した。この反応の進展を３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下によって追跡した。
【０１０９】
５．３．１．精製組換え酵母菌イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨの判定
酵母菌イソメロレダクターゼに関する動力学的測定の実施に最適な条件を決定するために、様々なｐＨのバッファ中で精製酵素の活性を測定することによって、この酵素の活性に最適なｐＨを判定した。複数の研究によって、植物イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、８．２であることが証明されていたが、酵母菌イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、７．５である。イソメロレダクターゼ活性に最適なｐＨに関する植物と酵母菌の間のこの違いは、これら二つの酵素の細胞の位置によって説明される。植物イソメロレダクターゼは、葉緑体（このｐＨは、光を受けて８．２である）に位置し、これに対して、酵母菌イソメロレダクターゼは、ミトコンドリウム（このｐＨは、７．５である）に位置する。従って、イソメロレダクターゼの活性に最適なｐＨは、それらが見出される細胞環境によく適するものである。
【０１１０】
５．３．２．精製された組換え酵母菌イソメロレダクターゼについての動力学的パラメータの決定
様々なリガンドに対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性を研究した。
【０１１１】
ａ）比活性
ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの比活性は、それぞれ、６および１μｍｏｌの酸化ＮＡＤＰＨ・（分）−１・（蛋白質のｍｇ）−１である。従って、ＡＨＢ基質の存在下での酵素反応の最大速度（Ｖｍ）の、アセト乳酸基質の存在下での酵素反応の最大速度（Ｖｍ）に対する比率は、酵母菌酵素については、植物酵素と比較して変わらない（Ｖｍ ＡＨＢ／Ｖｍ ＡＬ＝６）。さらに、ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する植物イソメロレダクターゼの比活性は、それぞれ、６および１μｍｏｌの酸化ＮＡＤＰＨ・（分）−１・（蛋白質のｍｇ）−１である。
【０１１２】
ｂ）補助因子ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨに対する親和性
ＮＡＤＰＨに対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性は、非常に高い（図３）。実際、このコファクターについて１．６μＭのＫｍが測定された。このＫＭは、植物酵素について測定されたもの（ＫＭ＝５μＭ）に比較的類似している。精製酵母菌イソメロレダクターゼについて得られたＫＭ ＮＡＤＰＨ値は、不完全精製酵母菌酵素について得られた値（ＫＭ＜２．５μＭ；Ｈａｗｋｅｓら，１９８９）と一貫性がある。しかし、非常に低い親和性（ＡＨＢおよびＭｇ２＋の存在下、ＫＭ ＮＡＤＨ＝６４５μＭ；Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８：８６５−８７４，１９９２）で、ＮＡＤＨを使用することができる植物酵素とは異なり、酵母菌酵素は、ＮＡＤＨを使用することができないようである。ＡＨＢ基質およびマグネシウムについての飽和条件下、ＮＡＤＨ（３００μＭ）の存在下では、いかなる酵素活性も検出されなかった。植物イソメロレダクターゼのものよりいっそう低い、そのＮＡＤＨに対する親和性のためである。酵母菌イソメロレダクターゼは、植物酵素よりさらにいっそう著しい特異性で水素供与体としてＮＡＤＰＨを使用すると考えられる。
【０１１３】
ｃ）ＡＨＢおよびＡＬ基質に対する親和性
ＡＨＢ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ラセミ形ではＫＭ＝１０４μＭ）は、植物イソメロレダクターゼのものより約５倍低いのに対し、ＡＬ基質に対する酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ラセミ形ではＫＭ＝２６６μＭ）は、植物イソメロレダクターゼのものより約１０倍低い（図４）。これらのＫＭ値は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の不完全精製酵素について得られたものにかなり近い。具体的には、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼについてのＫＭ ＡＨＢ値およびＫＭ ＡＬ値は、それぞれ、１６０μＭおよび３２０μＭである。
【０１１４】
酵母菌イソメロレダクターゼと植物イソメロレダクターゼの間の生化学的特性の最も注目すべき違いは、マグネシウムに対するこの酵素の親和性である。
【０１１５】
ｄ）マグネシウムに対する親和性
酵母菌イソメロレダクターゼの親和性（ＫＭ＝９６８μＭ）は、植物酵素のもの（ＫＭ＝約５μＭ）より実質的に２００倍低い。図５を参照。マグネシウムに対する酵母菌イソメロレダクターゼのこの低い親和性は、真菌イソメロレダクターゼの特徴である。実際、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）イソメロレダクターゼに関して行われた研究により、この酵素がＮＡＤＰＨおよびＡＨＢ基質の存在下で５８０μＭのＫＭマグネシウムを有することが示されている（Ｋｒｉｔａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｉｓｔｒｙ，２４１：２０４７−２０５１，１９６５）。酵母菌、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）および植物イソメロレダクターゼの主配列の比較は、これら三つの酵素の間の主な違いが、植物酵素の二つのモノマー間の相互作用に関わる１４０のアミノ酸配列の真菌蛋白質における不在であることを示した。しかし、植物酵素におけるＭｇ２＋イオンに結合することが知られている二つのドメインが、酵母菌酵素には存在する。前記１４０のアミノ酸二量化領域における７つのアミノ酸を削除することによって得られた植物イソメロレダクターゼの単量体型突然変異体の研究によって、この酵素が、この酵素の野生型形よりずっと低いマグネシウムに対する親和性を示すことが証明された（Ｗｅｓｓｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２７５３−１２７６０，１９９８）。従って、植物イソメロレダクターゼの四次構造は、植物酵素の活性部位およびマグネシウムに対する高親和性部位の安定化に一定の役割を果たすと考えられる。それ故、酵母菌イソメロレダクターゼは、二つのＭｇ２＋イオン結合ドメインを明らかに有するが、酵母菌酵素におけるこの１４０のアミノ酸領域の配列の不在は、植物酵素のものとはおそらく異なるこの酵素の活性部位の空間構成によって、マグネシウムに対する酵母菌イソメロレダクターゼの、より低い親和性を説明することができる。酵母菌イソメロレダクターゼのマグネシウム結合部位は、このカチオンに対してずっと低い親和性を有するが、ＮＡＤＰＨに対する酵母菌酵素の親和性は、植物酵素のものと類似している。従って、酵母菌イソメロレダクターゼの立体配座は、ＮＡＤＰＨの結合に関わるアミノ末端ドメインが、植物酵素のものに比較的類似しているようなものであり、ならびに二つのマグネシウム原子の結合および基質の結合に責任を負うカルボキシ末端ドメインが、植物酵素のものとは異なるようなものであると考えられる。結晶化による酵母イソメロレダクターゼの四次構造の知識によって、Ｍｇ２＋イオンに対するこの低い親和性を説明することが可能となる。
【０１１６】
５．４．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの効果の研究
５．４．１．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論の研究
阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論の研究は、様々な量の酵素（０．１ｎｍｏｌから０．４ｎｍｏｌ）を、最終量１０μＬの２５ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨおよび０．２５μｍｏｌのＭｇＣｌ２を含有する一定量の阻害剤と共に２０分間インキュベートすることによって行った。この反応は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中０．４８ｍＭのＡＨＢを添加することによって、開始させる。
【０１１７】
０．１ｎｍｏｌのジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの存在下、酵素活性は、０．０９ｎｍｏｌより多い酵素量でのみ検出される。同様に、０．１ｎｍｏｌのＮ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート存在下、酵素活性は、０．１ｎｍｏｌより多い酵素量でのみ検出される（図６）。加えて、これら二つの阻害剤ついては、酵素が反応培地中の阻害剤に対して過剰に存在する時、酵素活性が、阻害剤を含有しない対照のものと並行して増加する。従って、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、酵母菌イソメロレダクターゼに対して不可逆的阻害剤として作用すると考えられる。実際、不可逆的阻害の場合、低量の酵素の存在下ですべての酵素が阻害剤と複合する。反応培地中にはもはやいずれの遊離酵素も存在しないので、その時、酵素活性はゼロになる。反応培地中に存在する酵素の量が、阻害剤の量より多い時には、その培地中の過剰な遊離酵素は、阻害剤を含有しない対照のような挙動をとる（対照に対して平行な直線）。さらに、０．１ｎｍｏｌの阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートまたはジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート）が、０．１ｎｍｏｌの酵素を完全に阻害するために必要であり、従って、酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤の結合の化学量論比は、酵素１ｍｏｌあたり阻害剤１ｍｏｌである。
【０１１８】
５．４．２．酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合速度の研究
分光光電光度計において３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することにより、酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの効果を経時的に追跡した。各測定は、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびＮＡＤＰＨ（０．２５ｍＭ）についての飽和条件下、６分間、所定濃度の阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート＝１５μＭまたはジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート＝１０μＭ）および酵素（１１０ｎＭ））の存在下で行なう。使用したＡＨＢ基質の濃度は、２５０μＭから２３７５μＭの範囲である。酵母菌イソメロレダクターゼに対する阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートの結合の化学量論比の研究は、これらの阻害剤が不可逆的阻害剤のような挙動をとることを示した。従って、不可逆的阻害剤に適用することができる下記方程式（１）によって、反応生成物の生成の動態を説明することが可能となる。下記方程式（１）に基づき定義されるパラメータｍ１、ｍ２およびｍ３は、これらのパラメータの決定に付随する誤差に加えてＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムを使用し、実験曲線を調整することにより、直接得られる。
【０１１９】
方程式（１）
ＯＤ３４０＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）・ｅ（−ｍ３・ｔ）
この式中のパラメータは、次のとおりである：
● ＯＤ３４０は、分光光電分光形を使用し、３４０ｎｍ、時間「ｔ」で測定した光学密度である。
● ｍ１は、「ｔ」が無限大に向かっている時の光学密度である。
● ｍ２は、初期光学密度である。
● ｍ３は、ＮＡＤＰＨの見掛けの消滅定数を掛けた阻害剤の濃度の積である。
【０１２０】
可逆的阻害剤については、二つのケースがあり得る。一段階で阻害剤が直接酵素に結合するか、可逆的酵素／阻害剤中間複合体を生成して二段階で酵素に結合する。阻害剤濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３によって、不可逆的阻害のタイプを定義することが可能となる。従って、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートが酵母イソメロレダクターゼに一段で結合するか、２段で結合するかを判定するために、この酵素の酵素活性に対するこれらの阻害剤の効果を、所定の酵素濃度（１１０ｎＭ）およびＡＨＢ濃度（０．４８ｍＭ）に対して阻害剤の濃度を変化させることにより、経時的に（６分間）追跡する（図７）。可逆的酵素／阻害剤中間複合体の生成を伴わない単純な不可逆的阻害については、酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度（Ｋｏｂｓまたはｍ３）は、阻害剤の濃度の一次関数である。不可逆的阻害が可逆的中間複合体の存在を伴う場合、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、双曲線である。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、直線であり、これは、これらの生成物による酵母菌イソメロレダクターゼの阻害が、植物イソメロレダクターゼの阻害の場合のように、一段階で発生することを示唆している（図８）。しかし、実験誤差を考慮に入れても、阻害剤の濃度の関数としてのグラフ表示ｍ３は、これら二つの阻害剤についての起点を通らない。これら二つの阻害剤、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテート、は、完全に不可逆的ではない可能性がある。この場合、酵素／阻害剤複合体についての解離定数、Ｋ−０、は、無視できない値を有しうる。阻害剤のメカニズム（競合性または非競合性）は、酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度に対する基質の濃度の影響を研究することによって判定することができる。この判定は、基質の濃度の関数としてグラフ表示１／ｍ３を使用して行う。競合性阻害剤については、基質の濃度の関数としてグラフ表示１／ｍ３は、直線である。非競合性阻害剤については、パラメータｍ３は、基質の濃度に依存する。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、ｍ３の逆数が、ＡＨＢ基質の濃度の関数のごとく直線的に変化する。従って、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、ＡＨＢ基質に対して競合性である酵母イソメロレダクターゼの阻害剤のような挙動をとる（図９）。阻害剤／酵母菌酵素結合定数（ｋ０）は、下記方程式（２）によって計算する。
【０１２１】
【数１】
【０１２２】
ｋｏｂｓ＝ｍ３＝酵素／阻害剤複合体の見掛けの生成速度
ｋ０＝阻害剤／酵素結合定数
ｋ−０＝阻害剤／酵素解離定数
ＫＲＳＭ＝ＡＨＢ基質についてのミカエリス−メンテン定数
［Ｉ］＝阻害剤の濃度
［Ｓ］＝基質の濃度
不可逆的阻害剤について、ｋ−０は、無視できると考えられる。そこで、ｋ０は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムを使用して下記方程式（３）により計算する。
【０１２３】
【数２】
【０１２４】
この方程式は、阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートに用いることはできるが、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートに用いることはできない。ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについては、基質の濃度の関数としてのグラフ表示１／ｍ３は直線であるが、起点を通らない。Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートについては、基質の濃度の関数としてのグラフ表示１／ｍ３は直線であり、ｙ軸上の起点での値は無視できる。この結果を説明することができる仮説は、「阻害剤ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートは、おそらく完全には不可逆的でない」である。そこで、線形回帰線によって、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについてのｋ０の値を得ることが可能となる。阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートおよびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートに対応するｋ０の値は、それぞれ、１２４３３Ｍ−１・ｓ−１および７７２１Ｍ−１・ｓ−１である。従って、植物イソメロレダクターゼ（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートについてのｋ０＝１９００Ｍ−１・ｓ−１およびジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートについてのｋ０＝２２０００Ｍ−１・ｓ−１）とは異なり、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートは、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートより良好な酵母菌酵素阻害剤である。
【０１２５】
５．５．酵母菌イソメロレダクターゼの構造研究
酵母菌イソメロレダクターゼの四次構造を二つの異なるアプローチ（質量分析法およびゲル濾過）に従って研究した。
【０１２６】
二つの異なるオリゴマー化状態の存在を非変性条件下で質量分析法によって示した。この方法は、酵母菌イソメロレダクターゼは、主として二量体系で存在するが、少量の単量体形も存在することを示した。二量体は、電荷状態分布［Ｄ＋１８Ｈ］１８＋から［Ｄ＋２１Ｈ］２１＋によって表される。電荷状態［Ｄ＋１２Ｈ］１２＋から［Ｄ＋１４Ｈ］１４＋によって表される酵母菌イソメロレダクターゼの少量の単量体の存在が、この同じ質量スペクトルで示した。従って、酵母菌イソメロレダクターゼは、単量体形と二量体形の平衡状態にある。第一精製段階後に得られた酵母菌イソメロレダクターゼ画分のプールをゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５）にかけると、このイソメロレダクターゼが、単一ピークで溶離されることおよびその分子量が、６７ｋＤａと概算されることが判明する。そこで、非変性条件下で、この酵素の単量体形の予想分子量は、約４０ｋＤａであり、二量体形については８０ｋＤａである。酵母菌イソメロレダクターゼの単量体形と二量体形の間の中間的な分子量によって、この酵素のこれら二つの形の平衡の存在が確認される。これら二つの形の間の急速な動的平衡によってしか、ゲル濾過において得られる単一の溶離ピークを説明することはできない。具体的には、この平衡が遅かった場合、一方がその酵素の単量体形に対応し、他方がその酵素の二量体系に対応する二つの溶離ピークが、ゲル濾過で観察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の有効量を含む殺真菌組成物を施用することを特徴とする、真菌病に対して作物を処置する方法。
【請求項２】
前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤および他の殺真菌化合物を含むことを特徴とする、殺真菌組成物。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用することを特徴とする、殺真菌組成物を製造するための方法。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定することを含む、殺真菌化合物を特定するための方法。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する前記化合物が真菌の成長および病理発生を阻害するかどうかを判定する追加段階を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物の前記特定が、
ａ）前記化合物を、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で、ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させる段階、および
ｂ）前記酵素の活性を測定する段階
を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物の前記特定が、
ａ）宿主生物においてケトール酸レダクトイソメラーゼを発現させる段階、
ｂ）前記宿主生物によって生産されたケトール酸レダクトイソメラーゼを精製する段階、
ｃ）前記化合物を、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で、前記精製ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させる段階、および
ｄ）前記酵素の活性を測定する段階
を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素活性の測定が、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が、２−アセト乳酸（ＡＬ）または２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）である、請求項８から１０のうち一項に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の有効量を含む殺真菌組成物を施用することを特徴とする、真菌病に対して作物を処置する方法。
【請求項２】
前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が、ジメチルホスフィノイル−２−ヒドロキシアセテートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤および他の殺真菌化合物を含むことを特徴とする、殺真菌組成物。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤を使用することを特徴とする、殺真菌組成物を製造するための方法。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物を特定することを含む、殺真菌化合物を特定するための方法。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する前記化合物が真菌の成長および病理発生を阻害するかどうかを判定する追加段階を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物の前記特定が、
ａ）前記化合物を、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で、ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させる段階、および
ｂ）前記酵素の活性を測定する段階
を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のケトール酸レダクトイソメラーゼの酵素活性を阻害する化合物の前記特定が、
ａ）宿主生物においてケトール酸レダクトイソメラーゼを発現させる段階、
ｂ）前記宿主生物によって生産されたケトール酸レダクトイソメラーゼを精製する段階、
ｃ）前記化合物を、マグネシウム、ＮＡＤＰＨおよび基質の存在下で、前記精製ケトール酸レダクトイソメラーゼと接触させる段階、および
ｄ）前記酵素の活性を測定する段階
を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素活性の測定が、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸収の低下を測定することを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が、２−アセト乳酸（ＡＬ）または２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）である、請求項８から１０のうち一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−９３９０９（Ｐ２０１１−９３９０９Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２７０１３５（Ｐ２０１０−２７０１３５）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【分割の表示】特願２００３−５２６１９８（Ｐ２００３−５２６１９８）の分割
【原出願日】平成１４年９月１０日（２００２．９．１０）
【出願人】（５０３３２５５３８）バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー (73)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７０１３５（Ｐ２０１０−２７０１３５）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【分割の表示】特願２００３−５２６１９８（Ｐ２００３−５２６１９８）の分割
【原出願日】平成１４年９月１０日（２００２．９．１０）
【出願人】（５０３３２５５３８）バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー (73)
【Ｆターム（参考）】
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