真菌細胞中の遺伝子発現を上昇させる方法
本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド、ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす、及び銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、及び（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドの産生方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌細胞中のポリペプチドをコードする遺伝子発現を上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌宿主細胞（例えば、酵母又は糸状菌細胞）中の固有の又は外来ポリペプチドの組換え生産は、商業的に適切な量でポリペプチドを生産するためのより好ましい手段を提供する。
【０００３】
固有の又は外来ポリペプチドの組換え生産は一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが制御遺伝子からのプロモーターの発現制御下にある発現カセットを構築することにより行われる。発現カセットは、一般にプラスミド介在形質転換により宿主細胞中に導入される。次に形質転換された宿主細胞の産生を、発現カセット上に含有されるプロモーターの正しい機能に必要な条件を誘導する条件下で培養することにより行われる。
【０００４】
真菌宿主細胞中のポリペプチドの組換え生産のための新しい発現構築体とベクターの開発には、一般に宿主細胞中のポリペプチドの発現を制御するのに適した効率的なプロモーターが利用できることが必要である。しかし最もよく知られたプロモーターでさえ、目的の遺伝子を発現させるのには非効率的なことがある。
【０００５】
多くのプロモーターは調節を受けて、その効率を上昇させることができる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン遺伝子（ＣＵＰ１と呼ぶ）は、ＣＵＰ１転写活性化部位に対して−１０５から−２３０の間に存在すると報告されている特異的プロモーター領域ＵＡＳＣＵＰ１（上流活性化配列）を介して、銅により転写活性化される（Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ， １９８８，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，６：１１５８−１１６３；Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９３，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ ４；１０５−１１５）。サッカロミセス・セレビシエのＡｃｅ１タンパク質（Ａｃｅ１ｐ）は、銅イオン（Ｔｈｉｅｌｅ，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：２７４５−２７５２）又は銀イオン（Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ，，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５：７０５−７１７）の存在下で酵母メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１の誘導を引き起こす。Ａｃｅ１ｐのアミノ末端側の半分は塩基性アミノ酸残基とシステインが豊富であり、Ｃｕ（Ｉ）又はＡｇ（Ｉ）の非存在下ではなく存在下でＣＵＰ１上流のアクチベーター配列に特異的に結合する（Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８，前出）。Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６；１１５８−１１６３は、タンデムに複製された上流制御配列がサッカロミセス・セレビシエの銅−メタロチオネイン遺伝子の銅誘導性転写を仲介し、これらの要素の１つの合成物が２つのタンデムコピー中に存在する時、異種プロモーター上の銅誘導を与えることを開示する。
【０００６】
Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８５５８−８５６２は、Ａｃｅ１ｐが酵母の銅、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の発現を活性化することを開示する。Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３８８−３９３は、Ａｃｅ１ｐがサッカロミセス・セレビシエのサイトゾル性カタラーゼ遺伝子の発現を活性化することを開示する。
【０００７】
Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１９７４７−１９７５３は、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）からのメタロチオネイン遺伝子のクローニングと配列とを記載する。Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：６１１２−６１１６は、カンジダ・グラブラタからの金属活性化転写因子遺伝子の単離を記載する。Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８：１２５１２−１２５１８は、ＡＭＴ１によるカンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子（ＭＴＩ、ＭＴＩＩａ、及びＭＴＩＩｂと呼ぶ）の制御を開示する。
【０００８】
Ｍａｓｃｏｒｒｏ−Ｇａｌｉａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７２：１６９−１７０は、サッカロミセス・セレビシエ中の遺伝子発現を調節するためのＣＵＰ１プロモーターベースのベクターの構築を開示する。Ｍａｃｒｅａｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｓｍｉｄ ２１：１４７−１５０は、サッカロミセス・セレビシエのＣＵＰ１遺伝子を利用する一連の酵母発現ベクターを開示する。Ｈｏｔｔｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｙｅａｓｔ １０：２８３−２９６は、ＣＵＰ１プロモーターの生理学的性状解析と、その転写活性化因子Ａｃｅ１ｐの過剰発現の結果を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、真菌宿主細胞中でポリペプチドを産生するための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド、ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法に関する。ポリペプチドは真菌宿主細胞に対して固有でも外来でもよい。
【００１１】
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む真菌宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明はさらに、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）とを含む、核酸構築体とベクターとに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｐＢｍ１２８ａの制限地図である。
【図２】ｐＭＢ１５３７の制限地図である。
【図３】ｐＢＭ１２６ａの制限地図である。
【図４】ｐＭＢ１５３９の制限地図である。
【図５】ｐＪＬｉｎ１６８の制限地図である。
【図６】ｐＢＭ１４２ｃの制限地図である。
【図７】ｐＢＭ１４３ｂの制限地図である。
【図８】ｐＭＢ１６８２の制限地図である。
【図９】ｐＪＬｉｎ１９５の制限地図である。
【図１０】ｐＢＭ１６３ａの制限地図である。
【図１１】ｐＢＭ１６５ａの制限地図である。
【図１２】ｐＢＭ１６８ａの制限地図である。
【図１３】ｐＢＭ１６９ａの制限地図である。
【図１４】ｐＢＭ１７１ａの制限地図である。
【図１５】ｐＢＭ１７０ａの制限地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法に関する。
【００１５】
本発明の生産法において真菌宿主細胞は、当該技術分野で公知の方法を使用してポリペプチドを産生するのに適した栄養培地中で培養される。例えば細胞は、振盪フラスコ培養により、又は実験室発酵槽又は工業的発酵槽の小規模もしくは大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、供給バッチ発酵、又は固相発酵を含む）により培養される。培養は、炭素、窒素源、無機塩、及び銅イオン（及び／又は銀イオン）を含む適当な栄養培地で当該技術分野で公知の方法を使用して行われる。適当な培地は、販売業者から入手できるか、又は公開された組成（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログ中）に従って調製される。培地中に銅イオンが存在する場合、培地は少なくとも１０μＭの銅イオン、好ましくは少なくとも５０μＭの銅イオン、さらに好ましくは少なくとも１００μＭの銅イオン、さらに好ましくは少なくとも２５０μＭ、最も好ましくは少なくとも５００μＭの銅イオンを含有する。銅イオンはＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、又は任意の他の適切な形で培地に添加される。培地はまた又はあるいは、銀イオンを含有する。培地中に銀イオンが存在する場合、培地は少なくとも１０μＭの銀イオン、好ましくは少なくとも５０μＭの銀イオン、さらに好ましくは少なくとも１００μＭの銀イオン、さらに好ましくは少なくとも２５０μＭ、最も好ましくは少なくとも５００μＭの銀イオンを含有する。銀イオンはＡｇ２ＳＯ４、ＡｇＣｌ、又は任意の他の適切な形で培地に添加される。
【００１６】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当該技術分野で公知の方法を使用して検出される。検出法には、特異抗体、高速液体クロマトグラフィー、毛細管クロマトグラフィー、酵素産物の生成、酵素基質の消失、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用がある。例えばポリペプチドが酵素である場合、酵素の活性を測定するために酵素測定法が使用される。酵素活性を決定するための方法は、多くの酵素について当該技術分野で公知である（例えば、Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍ．Ｓａｉｚｍａｎｎ（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０参照）。
【００１７】
ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、その物質は培地から直接回収される。ポリペプチドが分泌されない場合、これは細胞溶解物から回収することができる。生じるポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を使用して単離される。例えばポリペプチドは、特に限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、及び／又は沈殿を含む従来法により培養培地から単離される。単離されたポリペプチドは次に、特に限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取、等電点電気泳動（ＩＥＦ））、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含む当該技術分野で公知の種々の方法によりさらに精製される（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９参照）。
【００１８】
銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む本発明の真菌宿主細胞は、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチドと、及び／又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドが無い真菌宿主細胞より、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも１００％、さらに最も好ましくは少なくとも２００％多いポリペプチドを産生する。
【００１９】
プロモーター
用語「プロモーター」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの正しい下流の転写開始部位にポリメラーゼを向けて転写を開始させるＤＮＡ配列と定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの組み立てを有効に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始の間）、転写活性化因子のようなシス作用性転写制御要素、及び転写因子と相互作用することができるヌクレオチド配列とを含むと理解される。
【００２０】
用語「銅誘導性プロモーター配列」は、本明細書において、プロモーターの銅誘導性転写を引き起こす転写制御因子の結合部位を有する、プロモーターの成分としてシス作用性要素を介して銅イオンにより誘導されるプロモーターと定義される。
【００２１】
用語「タンデムプロモーター」は、本明細書において、それぞれがコード配列に機能できる形で結合しており、コード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介する２つまたはそれを超えるプロモーターと定義される。タンデムプロモーターの成分は、同じプロモーターであるか又は異なるプロモーターの組合せでもよい。プロモーターは、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。タンデムプロモーターに含有される少なくとも１つのプロモーターは、銅誘導性プロモーターである。好適な態様においてタンデムプロモーターは、銅誘導性プロモーターからなる。
【００２２】
用語「ハイブリッドプロモーター」は、本明細書において、コード配列に機能できる形で結合した２つまたはそれを超えるプロモーターの部分からなり、コード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介するプロモーター配列と定義される。プロモーターは、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。ハイブリッドプロモーターの少なくとも１つの部分は、銅誘導性プロモーターの部分である。好適な態様においてハイブリッドプロモーターは、２つまたはそれを超える銅誘導性プロモーターの部分からなる。
【００２３】
用語「機能できる形で結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、本明細書において、制御配列（例えばプロモーター配列）が、コード配列にコードされるポリペプチドの産生を指令するように、コード配列に対する位置で適切に配置された構成であると定義される。
【００２４】
用語「コード配列」は、本明細書において、適切な制御配列の制御下に置かれると、ポリペプチド（例えば酵素）に翻訳されるｍＲＮＡに転写される核酸配列と定義される。コード配列の境界は一般に読みとり枠で決定され、これは通常ＡＴＧ開始コドン又は代替開始コドン（例えばＧＴＧ及びＴＴＧ）で始まり、停止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ）で終わる。コード配列は、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、及び組換え核酸配列を含む。
【００２５】
本発明の方法の実施において銅誘導性プロモーターは、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）メタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）メタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）メタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）メタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ）メタロチオネイン遺伝子から得られる。
【００２６】
好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０７２１５）から得られる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６：３３３２−３３３６）（ＤＮＡについては配列番号１、推定アミノ酸配列については配列番号２）。
【００２７】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＳＯＤ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ００４４５）から得られる（Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＳＡＳ ＵＳＡ ８８：８５５８−８５６２）（ＤＮＡについては配列番号３、推定アミノ酸配列については配列番号４）。
【００２８】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＴＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０６１１５）から得られる（Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３８８−３９３）（ＤＮＡについては配列番号５、推定アミノ酸配列については配列番号６）。
【００２９】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＲＳ５遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１９０２）から得られる（Ｃｕｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５２９５−２５２３０２）（ＤＮＡについては配列番号７、推定アミノ酸配列については配列番号８）。
【００３０】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ遺伝子から得られる、最も好適な態様において銅誘導性プロモーターは、カンジダ・グラブラタＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９７４７−１９７５３；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ １１４：７５−８０；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ ２６５：６３６９−６３７５）（ＤＮＡについては配列番号９、推定アミノ酸配列については配列番号１０）。別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩ遺伝子（受け入れ番号Ｊ０５３９８）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）（ＤＮＡについては配列番号１１、推定アミノ酸配列については配列番号１２）。
【００３１】
本発明の方法において銅誘導性プロモーターはまた、２つまたはそれを超えるプロモーターを含むタンデムプロモーターでも、又は２つまたはそれを超えるプロモーターの部分を含むハイブリッドプロモーターでもよい（その少なくとも１つは、銅誘導性プロモーター又は銅誘導性プロモーターの部分である）。
【００３２】
銅誘導性プロモーターではないが、銅誘導性プロモーターとのタンデムプロモーター又はハイブリッドプロモーターの構築に有用なプロモーターの例には、特に限定されないが、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ、フザリウム・ベネナツムＤａｒｉａプロモーター、フザリウム・ベネナツムＱｕｉｎｎプロモーター、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイベータキシロシダーゼ、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼ；ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼとアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）の遺伝子から得られるプロモーター、及びこれらの変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターがある。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
【００３３】
本発明の方法においてハイブリッドプロモーター又はタンデムプロモーターは、タンデムプロモーター又はハイブリッドプロモーターの成分として野生型プロモーター又はその部分が核酸配列について固有であっても、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であると理解される。例えば少なくとも２つのプロモーターからなるタンデムプロモーターにおいて１つ又はそれを超える（複数個）のプロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列の野生型プロモーターでもよい。
【００３４】
上流活性化配列（ＵＡＳ）
用語「銅応答性上流活性化配列」は、本明細書において、プロモーターの銅誘導性転写を引き起こす転写制御因子の結合部位として機能する、シス作用性要素と呼ぶＤＮＡ配列を含むプロモーターの領域と定義される。酵母及び真菌遺伝子についてかかるシス作用性要素を含有するプロモーター領域は、上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＵＡＳと略される）と呼ばれる（Ｔｈｉｅｌｅ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１１８３−１１９１）。かかるＵＡＳの同定と単離は、Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，前出；Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９３，前出；及びＴｈｉｅｌｅ，１９９２，前出、により記載された方法に従って行われる。
【００３５】
本発明の方法において、銅誘導性の遺伝子転写を引き起こす任意のシス作用性プロモーター要素を使用することができる。銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の銅誘導性プロモーターから得られる。
【００３６】
好適な態様において、銅応答性上流活性化配列はサッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子のプロモーターから得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０７２１５）のプロモーターから得られる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，前出）。
【００３７】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子のプロモーターから得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＴＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０６１１５）のプロモーターから得られる（Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３， 前出）。
【００３８】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＳＯＤ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ００４４５）のプロモーターから得られる（Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，前出）。
【００３９】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＲＳ５遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１９０２）のプロモーターから得られる（Ｃｕｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，前出）。
【００４０】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ遺伝子から得られる。最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。別の最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩａ遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。別の最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩｂ遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１４）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。
【００４１】
本発明の方法において１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）は、銅誘導性プロモーターの上流に機能できる形で結合している。銅誘導性プロモーターはそれ自体の銅応答性上流活性化配列を含有し、従ってプロモーターに機能できる形で結合した１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列は、プロモーター中に含有されるものと同じＵＡＳ領域でも、プロモーター中に含有されるものと異なるＵＡＳ領域でも、又はこれらの組合せでもよいと理解される。上流活性化配列に関連する銅応答性要素の数（すなわち銅応答性要素の数と銅依存性転写力価との相関）に依存して、２つ以上の上流活性化配列がプロモーターの上流に置かれてもよい。従って上流活性化配列中に含有される銅応答性シス作用性要素の数に依存して、特異的上流活性化配列の複数のコピーを使用することができ、異なる上流活性化配列の組合せを使用することができ、又は前記のそれぞれの組合せを使用することができる。銅応答性シス作用性要素の総数は少なくとも２であり、好ましくは少なくとも３、さらに好ましくは少なくとも４、さらに好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも６である。
【００４２】
好適な態様において追加の銅応答性上流活性化配列の１つは配列番号４６である。別の好適な態様において追加の銅応答性上流活性化配列の１つは配列番号４７である。
【００４３】
トランスアクチベーター遺伝子
用語「銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子」は本明細書において、銅依存性に、銅誘導性プロモーター配列に結合した銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を介して遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする遺伝子と定義される。かかる遺伝子はまた、銅金属制御性転写因子（ＭＲＴＦ）遺伝子とも呼ばれる。本明細書において用語「銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子」には、かかる遺伝子の末端切断型及び／又は変異体が含まれると理解される。
【００４４】
本発明の方法において、銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を介して遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする任意の転写活性化因子遺伝子を使用することができる。転写活性化因子遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択することができる。
【００４５】
好適な態様において転写活性化因子遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５３１５）である（Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１１５８−１１６３）（ＤＮＡについては配列番号１３、推定アミノ酸配列については配列番号１４）。
【００４６】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はカンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１７７２）である（Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：６１１２−６１１６）である（ＤＮＡについては配列番号１５、推定アミノ酸配列については配列番号１６）。
【００４７】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）である（ＤＮＡについては配列番号１７、推定アミノ酸配列については配列番号１８）。
【００４８】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）である（ＤＮＡについては配列番号１９、推定アミノ酸配列については配列番号２０）。
【００４９】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はサッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）である（ＤＮＡについては配列番号２１、推定アミノ酸配列については配列番号２２）。
【００５０】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はアスペルギルス・フミガツス銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）である（ＤＮＡについては配列番号２３、推定アミノ酸配列については配列番号２４）。
【００５１】
本発明の方法において真菌宿主細胞は少なくとも１つの転写活性化因子遺伝子を含む。転写活性化因子遺伝子は宿主細胞に対して固有でも又は外来でもよい。好適な態様において、転写活性化因子遺伝子の複数のコピーが宿主中で存在してもよい。あるいはそれぞれが１つ又はそれを超える（複数個）のコピーで存在する少なくとも２つの異なる転写活性化因子遺伝子の組合せが、真菌宿主細胞中に存在してもよい。遺伝子は宿主細胞に対して固有でも又は外来でも、又はこれらの組合せでもよい。
【００５２】
転写活性化因子遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞中に組み込むことにより、又は転写活性化因子遺伝子に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、従って転写活性化因子遺伝子の追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択物質の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。
【００５３】
転写活性化因子遺伝子は、宿主細胞の染色体中に組み込まれるか、又は染色体外要素として存在するか、又はこれらの組合せでもよい。好適な態様において転写活性化因子遺伝子は、宿主細胞の染色体中に組み込まれる。
【００５４】
ポリペプチド
ポリペプチドは、目的の真菌宿主細胞に対して固有でも又は異種でもよい。用語「異種ポリペプチド」は本明細書において、宿主細胞に対して固有ではないポリペプチド、又は固有のポリペプチドを改変するように構造が修飾されている固有のポリペプチドと定義される。
【００５５】
ポリペプチドは、目的の生物活性を有する任意のポリペプチドでもよい。本明細書において用語「ポリペプチド」は、特定の長さのコードされた生成物を意味するものではなく、従ってペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語「ポリペプチド」はまたハイブリッドポリペプチド（これは、１つ又はそれを超える（複数個）が真菌細胞に対して異種である少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的及び／又は完全なポリペプチド配列の組合せを含む）を包含する。ポリペプチドはさらに、ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子及び遺伝子操作体を含む。
【００５６】
好適な態様においてポリペプチドは、抗体、抗原、抗菌性ペプチド、酵素、増殖因子、ホルモン、イムノディレーター（ｉｍｍｕｎｏｄｉｌａｔｏｒ）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子である。
【００５７】
より好適な態様においてポリペプチドは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。最も好適な態様においてポリペプチドは、アルファグルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルファグルコシダーゼ、ベータグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ウロキナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００５８】
別の好適な態様においてポリペプチドは、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、又はゼラチンである。
【００５９】
ポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核生物、真核生物、又は他の供給源から得られる。本発明の目的において用語「から得られる」はある供給源に関連して使用される時、ポリペプチドがその供給源により、又はその供給源からの遺伝子が挿入されている細胞により産生されることを意味する。
【００６０】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化する方法は当該技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はこれらの組合せを含む。かかるゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行うことができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。クローニング法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸断片の切断と単離、ベクター分子への断片の挿入、及び真菌細胞への組換えベクターの取り込みがあり、ここで核酸配列の複数のコピーが複製される。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成、合成起源、又はこれらの組合せでもよい。
【００６１】
核酸構築体
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に少なくとも１つの銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む第２のポリヌクレオチドと、制御配列に適合する条件下で適当な宿主細胞中でポリヌクレオチドのコード配列の発現を指令する１つ又はそれを超える（複数個）の制御配列とを含む核酸構築体に関する。発現は、特に限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むと理解される。
【００６２】
本明細書において「核酸構築体」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しないような方法で組合わされ並置された核酸のセグメントを含有するように修飾されている、１本鎖又は２本鎖の核酸分子と定義される。核酸構築体という用語は、核酸構築体が、コード配列とコード配列の発現に必要なすべての制御配列を含む時、発現カセットという用語と同義である。
【００６３】
ポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする単離されたポリヌクレオチドはまた、ポリペプチド又は転写因子の改良された発現を与えるように操作することができる。ベクターへの挿入前の核酸配列の操作は、発現ベクターによっては好ましいか又は必要である。組換えＤＮＡ法を使用して核酸配列を修飾する方法は、当該技術分野で公知である。
【００６４】
本発明の方法においてポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする核酸配列は、宿主細胞中のコード配列の発現を改良するために、１つ又はそれを超える（複数個）の固有の制御配列を含むか、又は１つ又はそれを超える（複数個）の固有の制御配列は、核酸配列に対して外来の１つ又はそれを超える（複数個）の制御配列で置換される。
【００６５】
本明細書において用語「制御配列」は、ポリペプチドの発現に必要な又は有利なすべての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して固有でも又は外来でもよい。本明細書に記載の銅誘導性プロモーター及び銅応答性上流活性化配列以外に、かかる制御配列は、特に限定されないが、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含む。少なくとも制御配列は、銅誘導性プロモーター、銅応答性上流活性化配列、及び転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、コード配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との結合を促進する特異的制限部位を導入するために、リンカーを提供される。
【００６６】
目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーターの操作は、すでに本明細書に記載されている。銅依存性トランス活性化転写因子について、制御配列は適切なプロモーター配列（転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列）でもよい。プロモーター配列は、転写因子の発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択された宿主細胞中の転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり、変異プロモーター、末端切断型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含み、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００６７】
糸状菌宿主細胞中で転写を指令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツムアミログルコシダーゼ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツムＤａｒｉａ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツムＱｕｉｎｎ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイベータキシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼとアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）；及びこれらの変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターがある。
【００６８】
酵母宿主において有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されたように得られる。
【００６９】
制御配列は適当な転写ターミネーター配列（宿主細胞に認識されて転写を停止させる配列）でもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に機能できる形で結合している。選択された真菌宿主細胞で機能する任意のターミネーターが本発明で使用される。
【００７０】
糸状菌宿主細胞のための好適なターミネーターは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーアルファグルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００７１】
酵母宿主細胞のための好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエチトクロームＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシエグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出、に記載されたように得られる。
【００７２】
制御配列はまた適当なリーダー配列（宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞で機能する任意のリーダー配列が本発明で使用される。
【００７３】
糸状菌宿主細胞の好適なリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランストリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・ベネナツムトリプシン、及びフザリウム・ベネナツムグルコアミラーゼの遺伝子から得られる。
【００７４】
酵母宿主細胞の適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子、及びサッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセロアルデヒド−３−リン酸（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００７５】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に機能できる形で結合しており、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデオシン残基を付加させるシグナルとして宿主細胞により認識される配列）でもよい。選択された真菌宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列が本発明で使用される。
【００７６】
糸状菌宿主細胞の好適なポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガーアルファグルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【００７７】
酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００７８】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域でもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は本質的に、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読みとり枠中で天然に結合しているシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。あるいはコード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を自然に含有しない場合に、必要である。あるいは外来のシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を置換してもよい。しかし発現されたポリペプチドを、選択された真菌宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域が本発明で使用される。
【００７９】
糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００８０】
酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子及びサッカロミセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出、に記載されたように得られる。
【００８１】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域でもよい。生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒性又は自己触媒性切断により成熟した活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）ラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）の遺伝子から得られる。
【００８２】
シグナルペプチドとプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００８３】
また宿主細胞の増殖に対して、ポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子の発現の制御を可能にする制御配列を付加することが好ましいこともある。制御系の例は、化学的又は物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現のオン又はオフを引き起こすものがある。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用される。糸状菌では、ＴＡＫＡアルファアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモーター、及びフザリウム・ベネナツムグルコアミラーゼプロモーターが制御配列として使用される。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系ではこれらには、メソトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合にポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に機能できる形で結合している。
【００８４】
発現ベクター
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーターの銅誘導性転写を引き起こす）とを含む組換え発現ベクターに関する。上記の種々の核酸及び制御配列は一緒に連結されて組換え発現ベクターを産生し、これは、１つ又はそれを超える便利な制限部位を含み、かかる部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にする。あるいは核酸配列は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを発現のための適切なベクター中に挿入することにより発現される。発現ベクターの作成においてコード配列は、コード配列が発現のために銅誘導性プロモーター、銅応答性上流活性化配列、及び１つ又はそれを超える適切な制御配列に機能できる形で結合するように、ベクター中に位置する。
【００８５】
組換え発現ベクターは、都合良く組換えＤＮＡ操作を受けて核酸配列の発現を引き起こす任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）である。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは線状でも又は閉鎖環状プラスミドでもよい。
【００８６】
ベクターは自律複製ベクター（すなわち染色体外物質として存在し、その複製は染色体複製に依存しない）でもよく、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有する。あるいはベクターは、宿主細胞に導入された時ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものでもよい。さらに単一のベクター、又は宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを一緒に含む２つまたはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンが使用される。
【００８７】
本発明のベクターは、好ましくは形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ又はそれを超える選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その生成物が殺生物性、ウイルス抵抗性、重金属に対して抵抗性、栄養要求性に対する原栄養性などを与える遺伝子である。酵母宿主細胞の適当なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーには、特に限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物がある。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好適なものは、アスペルギルス・ニーヅランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳとｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。フザリウム細胞での使用に好適なものは、ｂａｒ、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、又はｈｙｇＢ遺伝子である。
【００８８】
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定な組み込み、又はゲノムに非依存性に細胞中のベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。
【００８９】
宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、相同的組換え又は非相同的組換えによりゲノムへ組み込むための、ポリペプチド又はベクターの他の要素をコードするポリヌクレオチド配列に依存する。あるいはベクターは、染色体中の正確な位置で宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組み込みを指令するための追加のヌクレオチド配列を含有してもよい。正確な位置での組み込みの確率を上昇させるために、組み込み要素は好ましくは充分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対を含有し、これは相同的組換えの確率を上昇させるための、対応する標的配列との高度の同一性を有する。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列である。さらに組み込み要素は、非コード性又はコード性ヌクレオチド配列でもよい。一方ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【００９０】
自律複製のためにベクターはさらに、宿主細胞中でベクターが自立的に複製することを可能にする複製開始点を含んでよい。酵母細胞中で有用なプラスミド複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。糸状菌細胞中で有用なプラスミド複製開始点の例は、ＡＭＡ１とＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：９１６３−９１７５；ＷＯ００／２４８８３）。ＡＭＡ１遺伝子の単離と遺伝子を含むプラスミドもしくはベクターの構築は、ＷＯ００／２４８８３号に記載の方法に従って行われる。複製開始点は、宿主細胞中での機能を温度感受性にする変異を有するものでもよい（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１４３３）。
【００９１】
遺伝子産物の産生を上昇させるために、ポリペプチドをコードする核酸配列の２つ以上のコピーを宿主細胞中に挿入してもよい。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組み込むことにより、又は核酸配列とともに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得られる（ここで、検出可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って核酸配列の追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択物質の存在下で細胞を培養することにより選択することができる）。
【００９２】
上記要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出）。
【００９３】
真菌宿主細胞
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む組換え真菌宿主細胞に関する。本明細書において発現ベクター又は核酸構築体は、ベクター又は構築体が、上記したように染色体組み込み物質として又は自己複製性染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起きる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択はほとんど、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその供給源、ならびに銅依存性トランス活性化転写因子をコードするポリヌクレオチドとに依存する。
【００９４】
宿主細胞は本発明の方法で有用な任意の真菌細胞である。本明細書において「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出、１７１頁）、及びすべての不完全菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出）を含む。
【００９５】
好適な態様において真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的において酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅｓｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ．，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されたように定義される。
【００９６】
より好適な態様において酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００９７】
最も好適な態様において酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において酵母宿主細胞はヤローウィア・リポリティカ細胞である。
【００９８】
さらに最も好適な態様において酵母宿主細胞はサッカロミセス・カールスベルゲンシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＪＧ１６９（ＭＡＴ−α、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｐｅｐ４−１１３７、ｈｉｓ３Δ２、ｐｒｂ１：：ｌｅｕ２、Δｐｒｅ１：：ｈｉｓ３）である（米国特許第５，７７０，４０６号）。
【００９９】
別の好適な態様において真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門と卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の糸状型の菌である（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出、により定義されたもの）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖からなる菌糸壁が特徴である。栄養増殖は菌糸の伸長により、炭素異化は偏性好気性である。これに対してサッカロミセス・セレビシエのような酵母の栄養増殖は、単細胞葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性である。
【０１００】
より好適な態様において糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ベルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クロソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、ファサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムロール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリスマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｉｓｍａｓｔｉｘ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。
【０１０１】
最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・フォエチヅス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニーヅランス、アスペルギルス・ニガー、又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンセ（Ｆｕｓａｒｌｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、又はフザリウム・ベネナツム細胞である。別の最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、ベルカンデラ・アヅスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブローサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブフファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｉｍ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスラディクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナーツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコーラ・インソレンス、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｉｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ノイロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラディアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビローサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【０１０２】
真菌細胞は、それ自体公知の方法で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含む方法により形質転換される。アスペルギルス宿主細胞の形質転換の適当な方法は、ＥＰ２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。トリコデルマ・リーセイ宿主細胞の形質転換の適当な方法は、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ６１：１５５−１６４、及びＧｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．１８（１）：７１−６に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するための適当な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６、及びＷＯ９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ．１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３： １６３； ａｎｄ Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１９２０に記載されている方法を使用して形質転換される。
【０１０３】
本発明はさらに、以下の例により記載されるが、これは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例
緩衝液及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬等級の市販品である。
【０１０５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３１３０Ｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して色素ターミネーター化学（Ｇｉｅｓｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３８：４７−６０）を使用して行った。配列は、配列特異的プライマーを用いてｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐ／ｃｏｎｓｅｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して組み立てた。
【０１０６】
菌株
サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９（ＭＡＴ−α、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｐｅｐ４−１１３７、ｈｉｓ３Δ２、ｐｒｂ１：：ｌｅｕ２、Δｐｒｅ１：：ｈｉｓ３）（米国特許第５，７７０，４０６号）を、本明細書の実施例中の宿主株として使用した。
【０１０７】
培養培地
ＹＰＤ培地は、１リットル当たり１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクトペプトン、及び２％のグルコースからなった。
【０１０８】
ＣＵＰマイナスｕｒａ培地（ｐＨ７．０）（オリジナル培地）は、１リットル当たり１ｍｌの１００ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、アミノ酸と硫酸アンモニウムの無い１．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）（ＢＩＯ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、４０ｍｇのアデニンを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ（ＢＩＯ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、５ｇのカサミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）、１００ｍｌの５０％グルコース、５０ｍｌの０．５Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、及び１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンからなった。
【０１０９】
酵母ｕｒａマイナス最適化培地（最適培地）は、１リットル当たり１ｍｌの１００ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、硫酸アンモニウムの無い６．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、４０ｍｇのアデニンを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ、５．９ｇのコハク酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．ＵＳＡ）、２０ｇのガラクトース、１０ｇのグルコース、及び１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンからなった。
【０１１０】
酵母ｕｒａマイナス選択培地は、１リットル当たり、硫酸アンモニウムの無い６．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、５ｇのカサミノ酸、１００ｍｌの０．５Ｍコハク酸（ｐＨ５）、４０ｍｌの５０％グルコース、及び２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールからなった。
【０１１１】
酵母ｕｒａマイナス選択プレートは、１リットル当たり２０ｇのノーブル寒天を補足した酵母ｕｒａマイナス選択培地からなった。
【０１１２】
ＳＣｕｒａマイナス培地は、１リットル当たり７．５ｇのアミノ酸の無い酵母窒素塩基（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１１．３ｇのコハク酸、６．８ｇの水酸化ナトリウム、５．６ｇのカサミノ酸、及び０．１ｇのＬ−トリプトファン、１００ｍｌの５０％フルクトース無菌溶液、４００μｌの２５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン無菌溶液（いずれもオートクレーブ後に加えた）からなった。
【０１１３】
ＳＣｕｒａマイナスプレートは、ＳＣｕｒａマイナス培地（ただし１００ｍｌの無菌２０％フルクトースを使用した）と２０ｇの寒天（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．ＵＳＡ）からなった。
【０１１４】
ＳＤＭＵＡ培地は、１リットル当たり１．７ｇのアミノ酸の無い酵母窒素塩基、５．０ｇのカサミノ酸、４０ｍｇのＡＤＥを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１０ｍｌの１０ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び１０ｍｌの１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、１００ｍｌの５０％フルクトース無菌溶液、４００μｌの２５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン無菌溶液（いずれもオートクレーブ後に加えた）からなった。
【０１１５】
ＬＢ培地は、１リットル当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、及び５ｇの塩化ナトリウムからなった。
【０１１６】
ＬＢプレートは、ＬＢ培地と１リットル当たり１５ｇのバクト寒天からなった。
【０１１７】
ＳＯＣ培地は、２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ４からなり、オートクレーブにより滅菌し、次にろ過滅菌したグルコースを２０ｍＭになるように加えた。
【０１１８】
２×ＹＴプレートは、１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、及び１５ｇのバクトアガロースからなった。
【０１１９】
実施例１：銅誘導性プロモーター（ＣＵＰ１プロモーター）のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー９９７２４７と９９７２４８（下記）を設計して、プラスミドｐＣｕ４２６（Ｌａｂｂｅ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３０６：１４５−１５３）からサッカロミセス・セレビシエ銅誘導性プロモーター（ＣＵＰ１プロモーター）を増幅した。サッカロミセス・セレビシエ発現プラスミドｐＭＢ１５３７（実施例２参照）へのクローニングのためにプライマー設計に制限酵素部位ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩを取り込んだ。
【０１２０】
プライマー９９７２４７：
５’−ＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２５） （下線部）ＡｇｅＩ
プライマー９９７２４８：
５’−ＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴ−Ｓ’（配列番号２６） （下線部）ＥｃｏＲＩ
【０１２１】
ＣＵＰプロモーター断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を使用して増幅した。ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＣｕ４２６プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー９９７２４７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９７２４８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ， ＵＳＡ）を含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１２２】
２４６ｂｐのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動でＴＡＥ緩衝液（１リットル当たり、４．８４ｇのトリス塩基、１．１４ｍｌの氷酢酸、及び２ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を使用して精製し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してさらに精製した。２４６ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ， ＵＳＡ）と連結した。インキュベーション後、２μｌの混合物を使用してＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピタントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。２μｌ容量の結合混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に加え、氷上で５分間インキュベートした。次に細胞に４２℃で３０分間熱ショックを与え、氷上に２分間置いた。２５０μｌのＳＯＣ培地を細胞に加え、混合物を３７℃で１時間２５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した２×ＹＴプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドを選択した。プレート上に増殖した８つのコロニーを無菌つまようじで取り上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬＢ培地を含有する１５ｍｌのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブで３７℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。ＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドを単離した。
【０１２３】
得られたプラスミドミニプレップの４μｌ容量をＥｃｏＲＩで消化した。消化反応物を、ＰＣＲ反応についてすでに記載したようにアガロースゲルクロマトグラフィーとＵＶ分析により分析した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して水で６μｌにして配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１２８ａと命名した（図１）。
【０１２４】
実施例２：発現ベクターｐＭＢ１５３７の構築
発現ベクターｐＭＢ１５３７は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号２７はＤＮＡ配列であり、配列番号２８は推定アミノ酸配列である；受け入れ番号５９９５２）をコードする野生型遺伝子の発現を駆動する酵母ＴＰＩプロモーター、ＣＹＣ１ターミネーター、及び選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含有する。
【０１２５】
酵母発現プラスミドｐＳＴＥＤ２２６（ＷＯ０５／０４５０１８号）を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鋳型としてのｐＳＴＥＤ２２６と以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１２６】
プライマー３１９１３７：
５’−ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧ−３’（配列番号２９）
プライマー１９１３８：
５’−ＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴ−３’（配列番号３０）
【０１２７】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＳＴＥＤ２２６プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３１９１３７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー１９１３８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。ＰＣＲ操作の終了後、５８２６ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の説明書に従って精製し溶出した。
【０１２８】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子を含有する遺伝子断片を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鋳型としてのｐＥＮＩ１２９８（ＷＯ００／２４８８３号）と以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１２９】
プライマー３４９６９９：
５’−ＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３１）
プライマー３５３０３１：
５’−ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号３２）
【０１３０】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＥＮＩ１２９８プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３４９６９９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３５３０３１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。ＰＣＲ操作の終了後、９２７ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って精製し溶出した。
【０１３１】
得られた２つの断片（５８２６ｂｐと９２７ｂｐ）を、電気穿孔法によりＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して製造業者の説明書に従って、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９中に形質転換した。形質転換反応物は、リガーゼ遺伝子を含有する１００ｎｇのＰＣＲ産物と混合した１００ｎｇのＰＣＲ増幅ベクターＤＮＡを含有した。形質転換反応物を酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１３２】
上記操作からの１つ酵母クローンを再度ＳＣｕｒａマイナスプレートに画線し、１つの酵母コロニーを５０ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。酵母プラスミド調製のために、培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するプラスミド調製で使用した。次にプラスミドを配列決定し、予測されたＤＮＡ配列を証明した。プラスミドをｐＭＢ１５３７と命名した（図２）。
【０１３３】
実施例３：発現ベクターｐＢＭ１２６ａの構築
プラスミドｐＢＭ１２８ａをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＭＢ１５３７をＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで消化し、断片（２６５ｂｐと６６１ｂｐ）をそれぞれ１．８％及び０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。ベクター断片を作成するために、ｐＭＢ１５３７をＡｇｅＩとＮｄｅＩで消化した。生じた５１４８ｂｐ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
【０１３４】
次にすべての３つの断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を使用して連結した。２μｌの反応物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）ウルトラコンピタント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体からＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）を使用して、水で６μｌにして配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１２６ａと命名した（図３）。
【０１３５】
実施例４：発現ベクターｐＭＢ１５３９の構築
ＴＰＩプロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体（配列番号３３はＤＮＡ配列であり、配列番号３４は推定アミノ酸配列である）をコードする遺伝子を含有するように、プラスミドｐＭＢ１５３９を構築した。
【０１３６】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を含有する遺伝子断片をＰＣＲにより、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、鋳型としてサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子（配列番号２７）を含有するｐＥＮＩ１２９８（ＷＯ００／２４８８３号）と、プライマー３４９６９９と３５３０３１（下記）とを用いてＰＣＲにより調製した。
【０１３７】
プライマー３４９６９９：
５’−ＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３５）
プライマー３５３０３１：
５’−ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号３６）
【０１３８】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＥＮＩ１２９８プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３４９６９９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３５３０３１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１３９】
ＰＣＲ増幅後、９９３ｂｐのＤＮＡ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。生じた断片（１００ｎｇ）を実施例２に記載のｐＳＴＥＤ２２６ベクター断片（１００ｎｇ）と混合し、電気穿孔法によりＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して製造業者の説明書に従って、電気コンピタントなサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に形質転換した。次に形質転換細胞を酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１４０】
上記操作からの１つ酵母クローンを再度ＳＣｕｒａマイナスプレートに画線し、１つの酵母コロニーを５０ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。この培養物から培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。次にプラスミドを配列決定し、予測されたＤＮＡ配列を証明した。プラスミドをｐＭＢ１５３９と命名した（図４）。
【０１４１】
実施例５：発現ベクターｐＪＬｉｎ１６８の構築
ｐＢＭ１２６ａ（ＣＵＰ１プロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を含有する）中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を、ｐＭＢ１５３９からのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体遺伝子と交換することにより、ＣＵＰ１プロモーターを使用してサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体発現ベクターを構築した。まずｐＢＭ１２６ａとｐＭＢ１５３９の両方をＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化し、ｐＢＭ１２６ａからの５ｋｂ断片とｐＭＢ１５３９からの１．１ｋｂ断片とをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲル精製した。次に両方の断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：３、及び１：４で連結した。生じたプラスミド（ｐＪＬｉｎ１６８と呼ぶ、図５）は、ＣＵＰ１プロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体遺伝子を含有した。
【０１４２】
実施例６：発現ベクターｐＢＭ１４２ｃとｐＢＭ１４３ｂの構築
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｐＪＬｉｎ１６８中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼのプロペプチド配列から、アミノ酸ＳＰＩＲＲをコードする最後の５つのコドンを除去するために、以下のプライマーを設計した：
【０１４３】
プライマー９９８５７０：
５’−ＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＣ−３’（配列番号３７）
プライマー９９８５７１：
５’−ＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号３８）
【０１４４】
７３ｎｇのｐＪＬｉｎ１６８、１×ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、４μｌのＱＵＩＫＳＯＬＵＴＩＯＮ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、１μｌのＸＬ ｄＮＴＰミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、及び１μｌの２．５Ｕ／μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を最終容量５０μｌ中に含有するＰＣＲ反応物で、１００ピコモルの各プライマーを使用した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を、９５℃で１分を１サイクル；９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、及び６８℃で６分をそれぞれ１８サイクル；そして１０℃に維持にプログラムした。１μｌのＤｐｎＩを増幅反応物に直接加え、３７℃で１時間インキュベートした。２μｌ容量のＤｐｎＩ消化反応物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）ウルトラコンピタント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って形質転換した。ＳＰＩＲＲコード領域に対応する１５ｂｐの無いクローンの１つをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＢＭ１４２ｃと命名した（図６）。
【０１４５】
ｐＢＭ１４２ｃ中にさらなる変異が生成されるのを避けるために、ｐＢＭ１４２ｃからのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ遺伝子の５’領域をｐＪＬｉｎ１６８中にクローン化して戻した。プラスミドｐＢＭ１４２ｃをＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化し、０．６ｋｂ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。プラスミドｐＪＬｉｎ１６８をＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化し、生じた５．５ｋｂ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。次に２つの断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して結合させた。生じた発現プラスミド（ｐＢＭ１４３ｂと呼ぶ、図７）は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ遺伝子の発現を駆動するＣＵＰ１プロモーターを含有した。すなわち最後の５つのアミノ酸（ＳＰＩＲＲ）を除去することにより、２２アミノ酸のシグナル／プロペプチド配列を１７アミノ酸に変化させた。
【０１４６】
実施例７：発現ベクターｐＭＢ１６８２の構築
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＭＢ１５３７を使用して、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼシグナルペプチドのランダム突然変異誘発ライブラリーを構築した。シグナルペプチドコード配列とフランキングＤＮＡ領域のランダム突然変異誘発ＰＣＲ断片を、ＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと以下のプライマー（ＤＮＡ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａａｒｔｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して増幅した。
【０１４７】
プライマー３０９７８７：
５’−ＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３９）
プライマー３７３１７２：
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡ−３’（配列番号４０）
【０１４８】
ここで、配列番号４０の４１、５０、５１、６０、６４、６６、６８、７０、７１、７２、７４、７５、７７、８０、８２、８３、及び８７位のＮは、９９％がＡで１％がＧ、Ｃ、又はＴである；
配列番号４０の４０、４６、４７、５２、５３、５６、６２、６５、６７、７３、７８、８４、８５、８６、及び８８位のＮは、９９％がＧで、１％がＡ、Ｃ、又はＴである；
配列番号４０の４２、４３、４５、４８、４９、５４、５５、５８、５９、６１、６３、６９、７６、７９、８１、８９、９１、及び９２位のＮは、９９％がＣで、１％がＡ、Ｇ、又はＴである；及び
配列番号４０の４４、５７、９０、及び９３位のＮは、９９％がＴで、１％がＡ、Ｃ、又はＧである。
【０１４９】
多様性を導入するプライマーを以下の規則で設計した：ランダム化位置の野生型塩基は絶えず９９％で存在し、他の３つの塩基は１％で存在し、３つすべては等しく出現する。
【０１５０】
シグナルペプチドコード配列の突然変異誘発断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＭＢ１５３７、１μｌのプライマー３０９７８７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３７３１７２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１５１】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子の遺伝子断片をＰＣＲにより、ＰＣＲ反応物中の鋳型としてｐＭＢ１５３７を使用して、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して調製した。ＰＣＲで使用したプライマーは上記のプライマー３０９７８７と３７３１７２である。
【０１５２】
ＰＣＲ増幅後、６００ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者のプロトコールに従って使用して精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中に溶出した。
【０１５３】
プラスミドｐＭＢ１５３７を、シグナルペプチドコード配列内のＤＮＡ位置でＳａｃＩで消化して線状化した。ドナーＤＮＡとしてフランキングＤＮＡ領域（受容体プラスミドの受容体ＤＮＡに１００％相同的）を有するシグナルペプチドコード配列のＰＣＲ断片を使用して、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９の形質転換において、線状化ベクターを受容体ＤＮＡとして使用した。
【０１５４】
具体的には、約３μｇのＳａｃＩ消化ｐＭＢ１５３７を約１μｇの６００ｂｐ ＰＣＲ断片とともに、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して、１００μｌの電気コンピタントなサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に電気穿孔した。電気穿孔後、形質転換細胞に１ｍｌの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間インキュベートし、次に１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＳＣｕｒａマイナスプレートに１．１ｍｌを蒔いた。
【０１５５】
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＳＣｕｒａマイナスプレートから全部で８４００コロニーを取り上げ、９６ウェルのポリスチレンマイクロウェルプレートに移し、取り上げたコロニーを横の列Ｂ〜Ｈと縦の列１〜１２に入れ、列Ａは空のままとし、これにサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９中の野生型プラスミド構築体を野生型対照として接種した。すべてのウェルは、１リットル当たり４０ｍｇのアデニンが添加されたＳＤ培地ＵＲＡを含有した（ＳＤＭＵＡと呼ぶ）（製造業者Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＢｉＯ １０１（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの推奨に従う、ＡＨ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋにより販売）。プレートを３０℃、２５０ｒｐｍで５日間インキュベートした。５日後、プレートを４℃に維持し、次に後述の吉草酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してリパーゼ活性を測定した。
【０１５６】
以下のアッセイで、培養上清のリパーゼ活性を吉草酸ｐ−ニトロフェニルを基質として使用して測定した。培養上清を５０ｍＭトリス（ｐＨ７）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４％トリトンＸ−１００緩衝液（希釈緩衝液）で希釈した。リポラーゼ（ＬＩＰＯＬＡＳＥ）（登録商標）標準物質（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、試料緩衝液で１．０ＬＵ／ｍｌ濃度から出発して０．１２５ＬＵ／ｍｌ濃度で終わる２倍工程で希釈した。ポリスチレンマイクロウェルプレート中で、１０μｌの上清を９０μｌの希釈緩衝液と混合した。１００μｌの吉草酸ｐ−ニトロフェニル基質溶液（１１７μｌの吉草酸ｐ−ニトロフェニルを１０ｍｌのイソプロパノールに溶解した）を各ウェルに加え、短時間混合し、次に４０５ｎｍの吸光度を１２秒毎に３分間測定した。アッセイデータを評価して、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９（Ａ列のウェル中）中のｐＭＢ１５３９より高い活性を有するすべての試料を同定した。
【０１５７】
対照より高い活性を有するすべてのクローンを陽性ヒットとして集め、これを同じ構成で再分析し、まだ対照より高い活性を有するクローンを、マイクロウェルプレート中の新鮮なＳＤＭＵＡ培地への接種物質として使用した。Ａ列を再度対照株用に使用した。プレートを上記したようにインキュベートし、上記したように分析した。
【０１５８】
対照より高い活性を有するすべてのクローンをウェルから取り出し、ＳＣ−寒天プレートに再度画線した。マイクロウェルプレート中の２００μｌのＳＤＭＵＡ培地と、１０ｍｌのＳＤＭＵＡ培地を含有する５０ｍｌチューブとでの再増殖のために、すべてのクローンの単一のコロニーを集め、３０℃で５日間インキュベートし、次に上記の吉草酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用して、収率を対照株の収率と比較した。
【０１５９】
各クローンを３つの隣接マイクロウェルと３つの個々の５０ｍｌチューブ中で増殖させた。活性レベルの比較のために、３つの増殖実験の平均値を使用した。
【０１６０】
最後にマイクロウェルプレートと５０ｍｌチューブ中の両方で最も高いリパーゼ活性を有するクローンを、１０ｍｌのＳＤＭＵＡ培地を含有する振盪フラスコ（２つの邪魔板を有する２５０ｍｌの円錐邪魔板付き振盪フラスコ）に接種し、２５０ｒｐｍで３０℃で５日間インキュベートした。上記したように吉草酸ｐ−ニトロフェニルを使用して、上清をリパーゼ活性について測定した。最も高いリパーゼ活性を有するクローンのＤＮＡを配列決定した。
【０１６１】
最も高い活性を示すクローンをＭＢ１６６５と命名し、これはリパーゼのシグナルペプチド中でＲ２Ｋ置換を有した（シグナルペプチドの２番目のコドンがＡＧＧからＡＡＧに変化した）。
【０１６２】
実施例４に記載したものと同じ原理を使用して、このシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体をコードするｐＭＢ１５３９構築体に移した。この場合、実施例４と同じ方法を使用してより小さいＰＣＲ断片を作成した。しかし、実施例４に従って、しかし鋳型としてＭＢ１５３９からプラスミドＤＮＡを使用して、より大きい断片も作成した。サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９のＧＡＰ修復と形質転換を上記したように行った。このクローニングにより、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体のより高い発現を有するクローンを得た。このクローンをサッカロミセス・セレビシエＭＢ１６８１と命名した。
【０１６３】
ＳＣ−寒天プレートからのサッカロミセス・セレビシエＭＢ１６８１細胞物質（３０℃で５日間増殖）を使用して、５０ｍｌ振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。この培養物から、酵母プラスミド調製のために、培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。精製したプラスミドを製造業者の説明書に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に形質転換した。形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢプレートに蒔いた。単一のコロニーを単離し、再画線し、ＬＢ培地中に接種し、３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物の１ｍｌを、ＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。最後に単離されたプラスミドをＤＮＡ配列決定の鋳型として使用し、変異体シグナル配列の配列（配列番号４１）とサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体コード領域（配列番号３３、推定アミノ酸配列は配列番号３４）を証明した。生じたプラスミドをｐＭＢ１６８２と命名した（図８）。プラスミドｐＭＢ１６８２はＴＰＩプロモーターとサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体コード領域（Ｒ２Ｋ変化を有するＳＰＩＲＲが無い）を含んだ。
【０１６４】
実施例８：発現ベクターｐＪＬｉｎ１９５の構築
サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１プロモーターを使用して、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体（Ｒ２Ｋ変化を含有するシグナル配列を有し、ＳＰＩＲＲが無い）発現ベクターを含有するプラスミドｐＪＬｉｎ１９５を構築した。
【０１６５】
ｐＭＢ１６８２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化したｐＢＭ１４３ｂ中にクローン化し、第２のアミノ酸Ａｒｇ（ＡＧＧ）をＬｙｓ（ＡＡＧ）のコード配列で置換した。ｐＭＢ１６８２とｐＢＭ１４３ｂの両方をＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩの両方で消化し、ｐＭＢ１６８２からの１ｋｂ断片とｐＢＭ１４３ｂからの５ｋｂ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出した。断片を製造業者の説明書に従ってＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：１、及び３：１で連結した。生じたプラスミド（ＤＮＡ配列決定により確認した）をｐＪＬｉｎ１９５と命名した（図９）。
【０１６６】
実施例９：発現ベクターｐＢＭ１６５ａの構築
以下のプライマーを使用して、４つのサッカロミセス・セレビシエ上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む発現ベクターを構築するためのＰＣＲ断片を作成した：
【０１６７】
プライマー９９９００３：
５’−ＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴ−３’（配列番号４２） （下線部）ＳｐｈＩ
プライマー９９９００５：
５’−ＡＣＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号４３） （下線部）ＡｇｅＩ
【０１６８】
断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ＰＣＲ混合物は、０．５μｌの約２５ｎｇのｐＢＭ１４３ｂ ＤＮＡ、１μｌのプライマー９９９００３（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９９００５（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックスを含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１６９】
生じた１４７ｂｐのＰＣＲ断片を１．８％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、１４７ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）と連結した。１μｌ容量の新鮮なＰＣＲ産物、３μｌの２回蒸留水、及び１μｌのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターをピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。
【０１７０】
インキュベーション後、２μｌの混合物を使用してＯＮＥＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピタント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。２μｌ容量の結合混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に加え、氷上で５分間インキュベートした。次に細胞に４２℃で３０分間熱ショックを与え、氷上に２分間置いた。２５０μｌのＳＯＣ培地を細胞に加え、混合物を３７℃で１時間２５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した２×ＹＴプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドを選択した。プレート上に増殖した８つのコロニーを無菌つまようじで取り上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬＢ培地を含有する１５ｍｌのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブで３７℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。ＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００を使用してプラスミドを単離した。
【０１７１】
得られたプラスミドミニプレップの４μｌ容量をＥｃｏＲＩで消化した。消化反応物を、ＰＣＲ反応についてすでに記載したようにアガロースゲルクロマトグラフィーにより分析した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）、及び水で６μｌを使用して配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１６３ａと命名した（図１０）。
【０１７２】
４つのＵＡＳ配列を含有する最終的発現構築体を作成するために、ｐＢＭ１６３ａをＳｐｈＩとＡｇｅＩで消化し、ｐＪＬｉｎ１６８をＡｇｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。１３２ｂｐのＳｐｈＩ−ＡｇｅＩと３４０ｂｐのＡｇｅＩ−ＨＩｎｄＩＩＩ断片をサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現ベクターｐＢＭ１４３ｂ（これはあらかじめＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化させた）中にクローン化した。生じたプラスミドをｐＢＭ１６５ａと命名した（図１１）。
【０１７３】
実施例１０：ＡＣＥ１過剰産生発現ベクターの構築
サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ２０４５８）のゲノムＤＮＡからＡＣＥ１遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲプライマーを設計した。発現プラスミドｐＢＭ１４３ｂとｐＪＬｉｎ１９５へのクローニングのために、ＢｓｐＨＩ制限部位を取り込んだ。
【０１７４】
プライマー９９９２６２：
５’−ＴＣＡＴＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴ−３’（配列番号４４） （下線部）ＢｓｐＨＩ
プライマー９９９２６３：
５’−ＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４５） （下線部）ＢｓｐＨＩ
【０１７５】
ＡＣＥ１遺伝子断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ゲノムＤＮＡをサッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株から、ＹＥＡＳＴＥＲ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ．ＵＳＡ）を使用して製造業者の説明書に従って単離した。ＰＣＲ反応物は、０．１μｇのサッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ ゲノムＤＮＡ、１μｌのプライマー９９９２６２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９９２６３（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックスを最終容量５０μｌ中に含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分４５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分４５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１７６】
生じた１５８９ｂｐのＰＣＲ断片を１．８％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。１５８９ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）と連結した。生じたプラスミド（ｐＢＭ１６８ａと命名、図１２）をヌクレオチド配列決定により確認した。
【０１７７】
ＢｓｐＨＩとＡＣＥ１遺伝子分節（１５８３ｂｐ）で消化したプラスミドｐＢＭ１６８ａを、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１６５ａ中にクローン化した。断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより抽出した。断片を製造業者の説明書に従ってＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：１、及び３：１で連結した。生じたプラスミドをｐＢＭ１６９ａ（図１３）、ｐＢＭ１７１ａ（図１４）、ｐＢＭ１７０ａ（図１５）と命名した。
【０１７８】
実施例１１：ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１７１ａを用いる酵母形質転換
プラスミドｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１７１ａをそれぞれ、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に、ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造業者の説明書に従って形質転換した。簡単に説明するとサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９の１つのコロニーを使用して５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、オービタルシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３０℃で一晩インキュベートした。
【０１７９】
細胞が６００ｎｍで０．４〜０．５の吸光度に達した時、細胞を７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを３０ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｄ遠心分離機で７００×ｇで５分間遠心分離後、細胞ペレットを１．５ｍｌの１．１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液（１１０ｍＭ酢酸リチウム、１１ｍＭトリス（ｐＨ８）、１．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１５秒間遠心分離後、細胞ペレットを６００μｌの１．１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液に再懸濁した。約０．５μｇのｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１７０ａ、又はｐＢＭ１７１ａ、２５０μｌのＰＥＧ／酢酸リチウム溶液（４０％ ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、及び５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ変性Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｔｅｓｔｅｓ Ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡを、５０μｌのコンピタントな細胞にを添加後、混合物を５５０ｒｐｍで３０℃で３０分間振盪し、細胞を反転して１０分毎に混合した。各形質転換混合物に総量２０μｌのＤＭＳＯを加え、４２℃で１５分インキュベートし、混合物を５分毎に反転した。形質転換混合物を微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１５秒間遠心分離し、細胞を１ｍｌのＹＰＤ ＰＬＵＳ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に再懸濁し、５５０ｒｐｍで３０℃で９０分間振盪した。遠心分離後、細胞を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、１５％グリセロールの存在下で１ｍｌの酵母ｕｒａマイナス選択培地に再懸濁した。５０μｌの各形質転換反応物を二重測定で酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートした。
【０１８０】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９形質転換体を使用して、９６ウェルプレート中の１８０μｌのｕｒａマイナス選択培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次に一晩培養物を１８０μｌの銅誘導性「オリジナル」培地又は「最適」培地で１００倍希釈し、３０℃で５日間増殖させた。
【０１８１】
培養上清のリパーゼ活性を酪酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＢ）を基質として以下のアッセイで測定した：まず培養上清を０．１Ｍ ＭＯＰＳ、４ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％トリトンＸ−１００緩衝液（ｐＨ７．５）（試料緩衝液）で１／１５希釈し、次に希釈試料を０倍、１／３倍、１／９倍と連続希釈した。ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）標準物質（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、試料緩衝液で１．０ＬＵ／ｍｌ濃度から出発して０．１２５ＬＵ／ｍｌ濃度で終わる２倍工程で希釈した。全部で２０μｌの各希釈物（標準物質を含む）を９６ウェルの平底プレートに入れた。２００μｌの酪酸ｐ−ニトロフェニル基質溶液（酪酸ｐ−ニトロフェニル：ＤＭＳＯ：０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）の比率は１：９９：４００）を各ウェルに加え、次に２５℃で１５分インキュベートした。インキュベーションの終了後、９６ウェルプレートについて４０５ｎｍの吸光度を測定した。作成した標準曲線から外挿して試料濃度を決定した。振盪フラスコ分析のために、代表的形質転換体を２ｍｌのｕｒａマイナス選択培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物を１２５ｍｌガラス振盪フラスコ中の２５ｍｌのＣＵＰマイナスｕｒａ培地で２００倍希釈し、３０℃で６日間増殖させた。試料を採取し、微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１０秒間遠心分離し、上清を上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してリパーゼ活性について試験した。
【０１８２】
１０μｌの培養上清をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）と１：２の比率で混合した。２分間沸騰させた後、試料を１５μｌのＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＰＬＵＳ ＰＲＯＴＥＩＮ（登録商標）標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にのせた。ゲルを１×トリス−グリシン−ＳＤＳランニングバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２００Ｖで１時間流した。次にゲルを水でそれぞれ５分間の洗浄を３回行い、ＢＩＯ−ＳＡＦＥ（登録商標）クマシー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１時間染色し、次に水で少なくとも３０分間脱色した。
【０１８３】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９形質転換体（各プラスミドについて２４個）を、９６ウェルプレート中の「オリジナル」銅含有培地で５日間増殖させた。培養ブロス試料中のリパーゼ活性を、上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として使用して測定した。ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、又はｐＢＭ１７１ａ形質転換体について平均相対的リパーゼ活性は、表１に示すようにそれぞれ１００、２０２、１９６、及び５０６であった。
【０１８４】
【表１】
【０１８５】
表に示した結果は、高コピープラスミドを有するＡｃｅ１ｐ転写活性化因子を過剰産生することにより、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現レベルが倍増することを示した。
【０１８６】
酵母形質転換体中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性は、コハク酸を緩衝液として含有し、ガラクトースと配合物を一次炭素源として含有する「最適」培地で増殖させた形質転換体について、改良されていることが証明された。
【０１８７】
Ａｃｅ１ｐ過剰産生形質転換体中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現レベルが「最適」培地中でさらに増強されるかどうかを試験するために、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性を、９６ウェルプレート中で「オリジナル」又は「最適」銅含有培地中で増殖させたｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９株形質転換体から測定した。すべての４つの発現プラスミドは上記したように評価した。
【０１８８】
「オリジナル」培地中のｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１７１ａ形質転換体についての平均相対的リパーゼ活性は、それぞれ１００、１９０、１７０、及び４０２であった。表ＩＩに示すように、「最適」培地中のｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１７１ａ形質転換体についての平均相対的リパーゼ活性は、それぞれ２４０、３１８、２８５、及び２６６であった。「最適」培地で増殖させた形質転換体から、すべてのプラスミドについてより高い全体的発現が観察された。サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ産生に対するＡｃｅ１ｐ過剰発現の影響は、プラスミドｐＢＭ１４３ｂをプラスミドｐＢＭ１６９ａと比較すると約３０％高かった。しかし「最適」培地中のｐＪＬｉｎ１９５と比較したｐＢＭ１７１ａからのＡＣＥ１遺伝子の過剰発現は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現のわずかな低下を引き起こした。
【０１８９】
【表２】
【０１９０】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａからのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼの発現を振盪フラスコで評価した。各プラスミドについて２つの代表的形質転換体を、「オリジナル」又は「最適」銅含有培地を使用して二重測定で２５ｍｌの振盪フラスコ培養で増殖させた。振盪フラスコ試料を４、５、及び６日目に採取した。５日目の試料の上清を、上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性について測定した。
【０１９１】
振盪フラスコでは、ＡＣＥ１遺伝子の過剰発現作用のためにサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現は、「最適培地」中のｐＢＭ１４３ｂとｐＢＭ１６９ａを比較すると約１．１倍高く、「オリジナル」培地では約１．６倍高かった。さらに表ＩＩＩに示すように、「オリジナル」培地中のｐＪＬｉｎ１９５と比較してｐＢＭ１７１ａからのＡＣＥ１遺伝子の過剰発現は約３．５倍の発現上昇を与え、「最適」培地では発現が１．６倍低下した。両方の培地でｐＢＭ１７１形質転換体の相対的発現レベルは同じであったが、ｐＪＬｉｎ１９５形質転換体中のリパーゼ発現レベルは「最適」培地で有意に高かった。培養濁度（ＯＤ６００）を上昇させ、寒天培地に蒔いて総ＣＦＵ／ｍｌを測定することにより増殖を追跡した。一般に「オリジナル」培地中の細胞は「最適」培地中で増殖させた細胞より少なくとも２倍速く増殖し、これはおそらく炭素源としてのグルコースに対する選択性によると考えられる。微視的には「オリジナル」培地中で増殖させた酵母細胞と比較して、「最適」培地中で増殖させた酵母細胞は、少なくとも３倍のサイズになった大きな液胞を有して膨れているようであった。
【０１９２】
【表３】
【０１９３】
上記したように、代表的振盪フラスコからの上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼバンドの強度は、酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイの結果と一致した。
【０１９４】
プラスミドｐＢＭ１６５ａとｐＢＭ１７０ａを、上記したようにサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に形質転換させた。形質転換体（各プラスミドについて２４個）を選択し、上記したように９６ウェルプレート中の「オリジナル」培地中で増殖させた。表ＩＶに示すように結果は、「オリジナル」培地中のｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１６９ａの平均相対的リパーゼ活性が、それぞれ１００、２７７、及び１７３であることを示した。
【０１９５】
【表４】
【０１９６】
Ａｃｅ１ｐ転写因子について一次結合部位を複製し、複数コピープラスミドからのＡＣＥ１遺伝子の発現を上昇させることにより、９６ウェルプレートでサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現の１．６倍の上昇が観察された。
【０１９７】
本明細書に開示した具体例は本発明のいくつかの態様を例示する目的であり、本明細書に記載し特許請求した発明は、本明細書に開示した具体例に限定されるものではない。同等の実施態様は本発明の範囲内にあると考えられる。実際、前記説明から当業者には、本明細書で証明し記載したもの以外に本発明の種々の修飾が明らかであろう。そのような修飾態様は添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。矛盾する可能性がある場合は、定義を含む本開示が優先する。
【０１９８】
受け入れ番号を含む種々の文献が本明細書に引用されたが、その開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌細胞中のポリペプチドをコードする遺伝子発現を上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌宿主細胞（例えば、酵母又は糸状菌細胞）中の固有の又は外来ポリペプチドの組換え生産は、商業的に適切な量でポリペプチドを生産するためのより好ましい手段を提供する。
【０００３】
固有の又は外来ポリペプチドの組換え生産は一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが制御遺伝子からのプロモーターの発現制御下にある発現カセットを構築することにより行われる。発現カセットは、一般にプラスミド介在形質転換により宿主細胞中に導入される。次に形質転換された宿主細胞の産生を、発現カセット上に含有されるプロモーターの正しい機能に必要な条件を誘導する条件下で培養することにより行われる。
【０００４】
真菌宿主細胞中のポリペプチドの組換え生産のための新しい発現構築体とベクターの開発には、一般に宿主細胞中のポリペプチドの発現を制御するのに適した効率的なプロモーターが利用できることが必要である。しかし最もよく知られたプロモーターでさえ、目的の遺伝子を発現させるのには非効率的なことがある。
【０００５】
多くのプロモーターは調節を受けて、その効率を上昇させることができる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン遺伝子（ＣＵＰ１と呼ぶ）は、ＣＵＰ１転写活性化部位に対して−１０５から−２３０の間に存在すると報告されている特異的プロモーター領域ＵＡＳＣＵＰ１（上流活性化配列）を介して、銅により転写活性化される（Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ， １９８８，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，６：１１５８−１１６３；Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９３，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ ４；１０５−１１５）。サッカロミセス・セレビシエのＡｃｅ１タンパク質（Ａｃｅ１ｐ）は、銅イオン（Ｔｈｉｅｌｅ，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：２７４５−２７５２）又は銀イオン（Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ，，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５：７０５−７１７）の存在下で酵母メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１の誘導を引き起こす。Ａｃｅ１ｐのアミノ末端側の半分は塩基性アミノ酸残基とシステインが豊富であり、Ｃｕ（Ｉ）又はＡｇ（Ｉ）の非存在下ではなく存在下でＣＵＰ１上流のアクチベーター配列に特異的に結合する（Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８，前出）。Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６；１１５８−１１６３は、タンデムに複製された上流制御配列がサッカロミセス・セレビシエの銅−メタロチオネイン遺伝子の銅誘導性転写を仲介し、これらの要素の１つの合成物が２つのタンデムコピー中に存在する時、異種プロモーター上の銅誘導を与えることを開示する。
【０００６】
Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８５５８−８５６２は、Ａｃｅ１ｐが酵母の銅、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の発現を活性化することを開示する。Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３８８−３９３は、Ａｃｅ１ｐがサッカロミセス・セレビシエのサイトゾル性カタラーゼ遺伝子の発現を活性化することを開示する。
【０００７】
Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１９７４７−１９７５３は、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）からのメタロチオネイン遺伝子のクローニングと配列とを記載する。Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：６１１２−６１１６は、カンジダ・グラブラタからの金属活性化転写因子遺伝子の単離を記載する。Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８：１２５１２−１２５１８は、ＡＭＴ１によるカンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子（ＭＴＩ、ＭＴＩＩａ、及びＭＴＩＩｂと呼ぶ）の制御を開示する。
【０００８】
Ｍａｓｃｏｒｒｏ−Ｇａｌｉａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７２：１６９−１７０は、サッカロミセス・セレビシエ中の遺伝子発現を調節するためのＣＵＰ１プロモーターベースのベクターの構築を開示する。Ｍａｃｒｅａｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｓｍｉｄ ２１：１４７−１５０は、サッカロミセス・セレビシエのＣＵＰ１遺伝子を利用する一連の酵母発現ベクターを開示する。Ｈｏｔｔｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｙｅａｓｔ １０：２８３−２９６は、ＣＵＰ１プロモーターの生理学的性状解析と、その転写活性化因子Ａｃｅ１ｐの過剰発現の結果を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、真菌宿主細胞中でポリペプチドを産生するための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド、ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法に関する。ポリペプチドは真菌宿主細胞に対して固有でも外来でもよい。
【００１１】
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む真菌宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明はさらに、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）とを含む、核酸構築体とベクターとに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｐＢｍ１２８ａの制限地図である。
【図２】ｐＭＢ１５３７の制限地図である。
【図３】ｐＢＭ１２６ａの制限地図である。
【図４】ｐＭＢ１５３９の制限地図である。
【図５】ｐＪＬｉｎ１６８の制限地図である。
【図６】ｐＢＭ１４２ｃの制限地図である。
【図７】ｐＢＭ１４３ｂの制限地図である。
【図８】ｐＭＢ１６８２の制限地図である。
【図９】ｐＪＬｉｎ１９５の制限地図である。
【図１０】ｐＢＭ１６３ａの制限地図である。
【図１１】ｐＢＭ１６５ａの制限地図である。
【図１２】ｐＢＭ１６８ａの制限地図である。
【図１３】ｐＢＭ１６９ａの制限地図である。
【図１４】ｐＢＭ１７１ａの制限地図である。
【図１５】ｐＢＭ１７０ａの制限地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法に関する。
【００１５】
本発明の生産法において真菌宿主細胞は、当該技術分野で公知の方法を使用してポリペプチドを産生するのに適した栄養培地中で培養される。例えば細胞は、振盪フラスコ培養により、又は実験室発酵槽又は工業的発酵槽の小規模もしくは大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、供給バッチ発酵、又は固相発酵を含む）により培養される。培養は、炭素、窒素源、無機塩、及び銅イオン（及び／又は銀イオン）を含む適当な栄養培地で当該技術分野で公知の方法を使用して行われる。適当な培地は、販売業者から入手できるか、又は公開された組成（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログ中）に従って調製される。培地中に銅イオンが存在する場合、培地は少なくとも１０μＭの銅イオン、好ましくは少なくとも５０μＭの銅イオン、さらに好ましくは少なくとも１００μＭの銅イオン、さらに好ましくは少なくとも２５０μＭ、最も好ましくは少なくとも５００μＭの銅イオンを含有する。銅イオンはＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、又は任意の他の適切な形で培地に添加される。培地はまた又はあるいは、銀イオンを含有する。培地中に銀イオンが存在する場合、培地は少なくとも１０μＭの銀イオン、好ましくは少なくとも５０μＭの銀イオン、さらに好ましくは少なくとも１００μＭの銀イオン、さらに好ましくは少なくとも２５０μＭ、最も好ましくは少なくとも５００μＭの銀イオンを含有する。銀イオンはＡｇ２ＳＯ４、ＡｇＣｌ、又は任意の他の適切な形で培地に添加される。
【００１６】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当該技術分野で公知の方法を使用して検出される。検出法には、特異抗体、高速液体クロマトグラフィー、毛細管クロマトグラフィー、酵素産物の生成、酵素基質の消失、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用がある。例えばポリペプチドが酵素である場合、酵素の活性を測定するために酵素測定法が使用される。酵素活性を決定するための方法は、多くの酵素について当該技術分野で公知である（例えば、Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍ．Ｓａｉｚｍａｎｎ（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０参照）。
【００１７】
ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、その物質は培地から直接回収される。ポリペプチドが分泌されない場合、これは細胞溶解物から回収することができる。生じるポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を使用して単離される。例えばポリペプチドは、特に限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、及び／又は沈殿を含む従来法により培養培地から単離される。単離されたポリペプチドは次に、特に限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取、等電点電気泳動（ＩＥＦ））、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含む当該技術分野で公知の種々の方法によりさらに精製される（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９参照）。
【００１８】
銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む本発明の真菌宿主細胞は、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチドと、及び／又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドが無い真菌宿主細胞より、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも１００％、さらに最も好ましくは少なくとも２００％多いポリペプチドを産生する。
【００１９】
プロモーター
用語「プロモーター」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの正しい下流の転写開始部位にポリメラーゼを向けて転写を開始させるＤＮＡ配列と定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの組み立てを有効に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始の間）、転写活性化因子のようなシス作用性転写制御要素、及び転写因子と相互作用することができるヌクレオチド配列とを含むと理解される。
【００２０】
用語「銅誘導性プロモーター配列」は、本明細書において、プロモーターの銅誘導性転写を引き起こす転写制御因子の結合部位を有する、プロモーターの成分としてシス作用性要素を介して銅イオンにより誘導されるプロモーターと定義される。
【００２１】
用語「タンデムプロモーター」は、本明細書において、それぞれがコード配列に機能できる形で結合しており、コード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介する２つまたはそれを超えるプロモーターと定義される。タンデムプロモーターの成分は、同じプロモーターであるか又は異なるプロモーターの組合せでもよい。プロモーターは、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。タンデムプロモーターに含有される少なくとも１つのプロモーターは、銅誘導性プロモーターである。好適な態様においてタンデムプロモーターは、銅誘導性プロモーターからなる。
【００２２】
用語「ハイブリッドプロモーター」は、本明細書において、コード配列に機能できる形で結合した２つまたはそれを超えるプロモーターの部分からなり、コード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介するプロモーター配列と定義される。プロモーターは、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。ハイブリッドプロモーターの少なくとも１つの部分は、銅誘導性プロモーターの部分である。好適な態様においてハイブリッドプロモーターは、２つまたはそれを超える銅誘導性プロモーターの部分からなる。
【００２３】
用語「機能できる形で結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、本明細書において、制御配列（例えばプロモーター配列）が、コード配列にコードされるポリペプチドの産生を指令するように、コード配列に対する位置で適切に配置された構成であると定義される。
【００２４】
用語「コード配列」は、本明細書において、適切な制御配列の制御下に置かれると、ポリペプチド（例えば酵素）に翻訳されるｍＲＮＡに転写される核酸配列と定義される。コード配列の境界は一般に読みとり枠で決定され、これは通常ＡＴＧ開始コドン又は代替開始コドン（例えばＧＴＧ及びＴＴＧ）で始まり、停止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ）で終わる。コード配列は、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、及び組換え核酸配列を含む。
【００２５】
本発明の方法の実施において銅誘導性プロモーターは、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）メタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）メタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）メタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）メタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ）メタロチオネイン遺伝子から得られる。
【００２６】
好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０７２１５）から得られる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６：３３３２−３３３６）（ＤＮＡについては配列番号１、推定アミノ酸配列については配列番号２）。
【００２７】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＳＯＤ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ００４４５）から得られる（Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＳＡＳ ＵＳＡ ８８：８５５８−８５６２）（ＤＮＡについては配列番号３、推定アミノ酸配列については配列番号４）。
【００２８】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＴＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０６１１５）から得られる（Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３８８−３９３）（ＤＮＡについては配列番号５、推定アミノ酸配列については配列番号６）。
【００２９】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＲＳ５遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１９０２）から得られる（Ｃｕｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５２９５−２５２３０２）（ＤＮＡについては配列番号７、推定アミノ酸配列については配列番号８）。
【００３０】
別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子から得られる。より好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ遺伝子から得られる、最も好適な態様において銅誘導性プロモーターは、カンジダ・グラブラタＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９７４７−１９７５３；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ １１４：７５−８０；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ ２６５：６３６９−６３７５）（ＤＮＡについては配列番号９、推定アミノ酸配列については配列番号１０）。別の好適な態様において銅誘導性プロモーター配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩ遺伝子（受け入れ番号Ｊ０５３９８）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）（ＤＮＡについては配列番号１１、推定アミノ酸配列については配列番号１２）。
【００３１】
本発明の方法において銅誘導性プロモーターはまた、２つまたはそれを超えるプロモーターを含むタンデムプロモーターでも、又は２つまたはそれを超えるプロモーターの部分を含むハイブリッドプロモーターでもよい（その少なくとも１つは、銅誘導性プロモーター又は銅誘導性プロモーターの部分である）。
【００３２】
銅誘導性プロモーターではないが、銅誘導性プロモーターとのタンデムプロモーター又はハイブリッドプロモーターの構築に有用なプロモーターの例には、特に限定されないが、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ、フザリウム・ベネナツムＤａｒｉａプロモーター、フザリウム・ベネナツムＱｕｉｎｎプロモーター、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイベータキシロシダーゼ、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼ；ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼとアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）の遺伝子から得られるプロモーター、及びこれらの変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターがある。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
【００３３】
本発明の方法においてハイブリッドプロモーター又はタンデムプロモーターは、タンデムプロモーター又はハイブリッドプロモーターの成分として野生型プロモーター又はその部分が核酸配列について固有であっても、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であると理解される。例えば少なくとも２つのプロモーターからなるタンデムプロモーターにおいて１つ又はそれを超える（複数個）のプロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列の野生型プロモーターでもよい。
【００３４】
上流活性化配列（ＵＡＳ）
用語「銅応答性上流活性化配列」は、本明細書において、プロモーターの銅誘導性転写を引き起こす転写制御因子の結合部位として機能する、シス作用性要素と呼ぶＤＮＡ配列を含むプロモーターの領域と定義される。酵母及び真菌遺伝子についてかかるシス作用性要素を含有するプロモーター領域は、上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＵＡＳと略される）と呼ばれる（Ｔｈｉｅｌｅ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１１８３−１１９１）。かかるＵＡＳの同定と単離は、Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，前出；Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９３，前出；及びＴｈｉｅｌｅ，１９９２，前出、により記載された方法に従って行われる。
【００３５】
本発明の方法において、銅誘導性の遺伝子転写を引き起こす任意のシス作用性プロモーター要素を使用することができる。銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の銅誘導性プロモーターから得られる。
【００３６】
好適な態様において、銅応答性上流活性化配列はサッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子のプロモーターから得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０７２１５）のプロモーターから得られる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，前出）。
【００３７】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子のプロモーターから得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＴＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ０６１１５）のプロモーターから得られる（Ｌａｐｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３， 前出）。
【００３８】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＳＯＤ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ００４４５）のプロモーターから得られる（Ｇｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，前出）。
【００３９】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、サッカロミセス・セレビシエＣＲＳ５遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１９０２）のプロモーターから得られる（Ｃｕｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，前出）。
【００４０】
別の好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子から得られる。さらに好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ遺伝子から得られる。最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。別の最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩａ遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１３）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。別の最も好適な態様において銅応答性上流活性化配列は、カンジダ・グラブラタＭＴＩＩｂ遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５１１４）から得られる（Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出；Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，前出）。
【００４１】
本発明の方法において１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）は、銅誘導性プロモーターの上流に機能できる形で結合している。銅誘導性プロモーターはそれ自体の銅応答性上流活性化配列を含有し、従ってプロモーターに機能できる形で結合した１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列は、プロモーター中に含有されるものと同じＵＡＳ領域でも、プロモーター中に含有されるものと異なるＵＡＳ領域でも、又はこれらの組合せでもよいと理解される。上流活性化配列に関連する銅応答性要素の数（すなわち銅応答性要素の数と銅依存性転写力価との相関）に依存して、２つ以上の上流活性化配列がプロモーターの上流に置かれてもよい。従って上流活性化配列中に含有される銅応答性シス作用性要素の数に依存して、特異的上流活性化配列の複数のコピーを使用することができ、異なる上流活性化配列の組合せを使用することができ、又は前記のそれぞれの組合せを使用することができる。銅応答性シス作用性要素の総数は少なくとも２であり、好ましくは少なくとも３、さらに好ましくは少なくとも４、さらに好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも６である。
【００４２】
好適な態様において追加の銅応答性上流活性化配列の１つは配列番号４６である。別の好適な態様において追加の銅応答性上流活性化配列の１つは配列番号４７である。
【００４３】
トランスアクチベーター遺伝子
用語「銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子」は本明細書において、銅依存性に、銅誘導性プロモーター配列に結合した銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を介して遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする遺伝子と定義される。かかる遺伝子はまた、銅金属制御性転写因子（ＭＲＴＦ）遺伝子とも呼ばれる。本明細書において用語「銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子」には、かかる遺伝子の末端切断型及び／又は変異体が含まれると理解される。
【００４４】
本発明の方法において、銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を介して遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする任意の転写活性化因子遺伝子を使用することができる。転写活性化因子遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択することができる。
【００４５】
好適な態様において転写活性化因子遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ１５３１５）である（Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｍｅｒ，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１１５８−１１６３）（ＤＮＡについては配列番号１３、推定アミノ酸配列については配列番号１４）。
【００４６】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はカンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４１７７２）である（Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：６１１２−６１１６）である（ＤＮＡについては配列番号１５、推定アミノ酸配列については配列番号１６）。
【００４７】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）である（ＤＮＡについては配列番号１７、推定アミノ酸配列については配列番号１８）。
【００４８】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）である（ＤＮＡについては配列番号１９、推定アミノ酸配列については配列番号２０）。
【００４９】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はサッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）である（ＤＮＡについては配列番号２１、推定アミノ酸配列については配列番号２２）。
【００５０】
別の好適な態様において転写活性化因子遺伝子はアスペルギルス・フミガツス銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）である（ＤＮＡについては配列番号２３、推定アミノ酸配列については配列番号２４）。
【００５１】
本発明の方法において真菌宿主細胞は少なくとも１つの転写活性化因子遺伝子を含む。転写活性化因子遺伝子は宿主細胞に対して固有でも又は外来でもよい。好適な態様において、転写活性化因子遺伝子の複数のコピーが宿主中で存在してもよい。あるいはそれぞれが１つ又はそれを超える（複数個）のコピーで存在する少なくとも２つの異なる転写活性化因子遺伝子の組合せが、真菌宿主細胞中に存在してもよい。遺伝子は宿主細胞に対して固有でも又は外来でも、又はこれらの組合せでもよい。
【００５２】
転写活性化因子遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞中に組み込むことにより、又は転写活性化因子遺伝子に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、従って転写活性化因子遺伝子の追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択物質の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。
【００５３】
転写活性化因子遺伝子は、宿主細胞の染色体中に組み込まれるか、又は染色体外要素として存在するか、又はこれらの組合せでもよい。好適な態様において転写活性化因子遺伝子は、宿主細胞の染色体中に組み込まれる。
【００５４】
ポリペプチド
ポリペプチドは、目的の真菌宿主細胞に対して固有でも又は異種でもよい。用語「異種ポリペプチド」は本明細書において、宿主細胞に対して固有ではないポリペプチド、又は固有のポリペプチドを改変するように構造が修飾されている固有のポリペプチドと定義される。
【００５５】
ポリペプチドは、目的の生物活性を有する任意のポリペプチドでもよい。本明細書において用語「ポリペプチド」は、特定の長さのコードされた生成物を意味するものではなく、従ってペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語「ポリペプチド」はまたハイブリッドポリペプチド（これは、１つ又はそれを超える（複数個）が真菌細胞に対して異種である少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的及び／又は完全なポリペプチド配列の組合せを含む）を包含する。ポリペプチドはさらに、ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子及び遺伝子操作体を含む。
【００５６】
好適な態様においてポリペプチドは、抗体、抗原、抗菌性ペプチド、酵素、増殖因子、ホルモン、イムノディレーター（ｉｍｍｕｎｏｄｉｌａｔｏｒ）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子である。
【００５７】
より好適な態様においてポリペプチドは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。最も好適な態様においてポリペプチドは、アルファグルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルファグルコシダーゼ、ベータグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ウロキナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００５８】
別の好適な態様においてポリペプチドは、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、又はゼラチンである。
【００５９】
ポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核生物、真核生物、又は他の供給源から得られる。本発明の目的において用語「から得られる」はある供給源に関連して使用される時、ポリペプチドがその供給源により、又はその供給源からの遺伝子が挿入されている細胞により産生されることを意味する。
【００６０】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化する方法は当該技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はこれらの組合せを含む。かかるゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行うことができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。クローニング法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸断片の切断と単離、ベクター分子への断片の挿入、及び真菌細胞への組換えベクターの取り込みがあり、ここで核酸配列の複数のコピーが複製される。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成、合成起源、又はこれらの組合せでもよい。
【００６１】
核酸構築体
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に少なくとも１つの銅応答性上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む第２のポリヌクレオチドと、制御配列に適合する条件下で適当な宿主細胞中でポリヌクレオチドのコード配列の発現を指令する１つ又はそれを超える（複数個）の制御配列とを含む核酸構築体に関する。発現は、特に限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むと理解される。
【００６２】
本明細書において「核酸構築体」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しないような方法で組合わされ並置された核酸のセグメントを含有するように修飾されている、１本鎖又は２本鎖の核酸分子と定義される。核酸構築体という用語は、核酸構築体が、コード配列とコード配列の発現に必要なすべての制御配列を含む時、発現カセットという用語と同義である。
【００６３】
ポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする単離されたポリヌクレオチドはまた、ポリペプチド又は転写因子の改良された発現を与えるように操作することができる。ベクターへの挿入前の核酸配列の操作は、発現ベクターによっては好ましいか又は必要である。組換えＤＮＡ法を使用して核酸配列を修飾する方法は、当該技術分野で公知である。
【００６４】
本発明の方法においてポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子をコードする核酸配列は、宿主細胞中のコード配列の発現を改良するために、１つ又はそれを超える（複数個）の固有の制御配列を含むか、又は１つ又はそれを超える（複数個）の固有の制御配列は、核酸配列に対して外来の１つ又はそれを超える（複数個）の制御配列で置換される。
【００６５】
本明細書において用語「制御配列」は、ポリペプチドの発現に必要な又は有利なすべての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して固有でも又は外来でもよい。本明細書に記載の銅誘導性プロモーター及び銅応答性上流活性化配列以外に、かかる制御配列は、特に限定されないが、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含む。少なくとも制御配列は、銅誘導性プロモーター、銅応答性上流活性化配列、及び転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、コード配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との結合を促進する特異的制限部位を導入するために、リンカーを提供される。
【００６６】
目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーターの操作は、すでに本明細書に記載されている。銅依存性トランス活性化転写因子について、制御配列は適切なプロモーター配列（転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列）でもよい。プロモーター配列は、転写因子の発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択された宿主細胞中の転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり、変異プロモーター、末端切断型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含み、宿主細胞に対して固有であるか又は外来である細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００６７】
糸状菌宿主細胞中で転写を指令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツムアミログルコシダーゼ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツムＤａｒｉａ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・ベネナツムＱｕｉｎｎ（ＷＯ００／５６９００）、フザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイベータキシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー中性アルファアミラーゼとアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）；及びこれらの変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターがある。
【００６８】
酵母宿主において有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されたように得られる。
【００６９】
制御配列は適当な転写ターミネーター配列（宿主細胞に認識されて転写を停止させる配列）でもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に機能できる形で結合している。選択された真菌宿主細胞で機能する任意のターミネーターが本発明で使用される。
【００７０】
糸状菌宿主細胞のための好適なターミネーターは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーアルファグルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００７１】
酵母宿主細胞のための好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエチトクロームＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシエグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出、に記載されたように得られる。
【００７２】
制御配列はまた適当なリーダー配列（宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞で機能する任意のリーダー配列が本発明で使用される。
【００７３】
糸状菌宿主細胞の好適なリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランストリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・ベネナツムトリプシン、及びフザリウム・ベネナツムグルコアミラーゼの遺伝子から得られる。
【００７４】
酵母宿主細胞の適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子、及びサッカロミセス・セレビシエアルコール脱水素酵素／グリセロアルデヒド−３−リン酸（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００７５】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に機能できる形で結合しており、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデオシン残基を付加させるシグナルとして宿主細胞により認識される配列）でもよい。選択された真菌宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列が本発明で使用される。
【００７６】
糸状菌宿主細胞の好適なポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーヅランスアントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガーアルファグルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【００７７】
酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００７８】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域でもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は本質的に、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読みとり枠中で天然に結合しているシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。あるいはコード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を自然に含有しない場合に、必要である。あるいは外来のシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を置換してもよい。しかし発現されたポリペプチドを、選択された真菌宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域が本発明で使用される。
【００７９】
糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００８０】
酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子及びサッカロミセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，前出、に記載されたように得られる。
【００８１】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域でもよい。生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒性又は自己触媒性切断により成熟した活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）ラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）の遺伝子から得られる。
【００８２】
シグナルペプチドとプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００８３】
また宿主細胞の増殖に対して、ポリペプチド又は銅依存性トランス活性化転写因子の発現の制御を可能にする制御配列を付加することが好ましいこともある。制御系の例は、化学的又は物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現のオン又はオフを引き起こすものがある。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用される。糸状菌では、ＴＡＫＡアルファアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモーター、及びフザリウム・ベネナツムグルコアミラーゼプロモーターが制御配列として使用される。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系ではこれらには、メソトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合にポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に機能できる形で結合している。
【００８４】
発現ベクター
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーターの銅誘導性転写を引き起こす）とを含む組換え発現ベクターに関する。上記の種々の核酸及び制御配列は一緒に連結されて組換え発現ベクターを産生し、これは、１つ又はそれを超える便利な制限部位を含み、かかる部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にする。あるいは核酸配列は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを発現のための適切なベクター中に挿入することにより発現される。発現ベクターの作成においてコード配列は、コード配列が発現のために銅誘導性プロモーター、銅応答性上流活性化配列、及び１つ又はそれを超える適切な制御配列に機能できる形で結合するように、ベクター中に位置する。
【００８５】
組換え発現ベクターは、都合良く組換えＤＮＡ操作を受けて核酸配列の発現を引き起こす任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）である。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは線状でも又は閉鎖環状プラスミドでもよい。
【００８６】
ベクターは自律複製ベクター（すなわち染色体外物質として存在し、その複製は染色体複製に依存しない）でもよく、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有する。あるいはベクターは、宿主細胞に導入された時ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものでもよい。さらに単一のベクター、又は宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを一緒に含む２つまたはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンが使用される。
【００８７】
本発明のベクターは、好ましくは形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ又はそれを超える選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その生成物が殺生物性、ウイルス抵抗性、重金属に対して抵抗性、栄養要求性に対する原栄養性などを与える遺伝子である。酵母宿主細胞の適当なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーには、特に限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物がある。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好適なものは、アスペルギルス・ニーヅランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳとｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。フザリウム細胞での使用に好適なものは、ｂａｒ、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、又はｈｙｇＢ遺伝子である。
【００８８】
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定な組み込み、又はゲノムに非依存性に細胞中のベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。
【００８９】
宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、相同的組換え又は非相同的組換えによりゲノムへ組み込むための、ポリペプチド又はベクターの他の要素をコードするポリヌクレオチド配列に依存する。あるいはベクターは、染色体中の正確な位置で宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組み込みを指令するための追加のヌクレオチド配列を含有してもよい。正確な位置での組み込みの確率を上昇させるために、組み込み要素は好ましくは充分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対を含有し、これは相同的組換えの確率を上昇させるための、対応する標的配列との高度の同一性を有する。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列である。さらに組み込み要素は、非コード性又はコード性ヌクレオチド配列でもよい。一方ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【００９０】
自律複製のためにベクターはさらに、宿主細胞中でベクターが自立的に複製することを可能にする複製開始点を含んでよい。酵母細胞中で有用なプラスミド複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。糸状菌細胞中で有用なプラスミド複製開始点の例は、ＡＭＡ１とＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：９１６３−９１７５；ＷＯ００／２４８８３）。ＡＭＡ１遺伝子の単離と遺伝子を含むプラスミドもしくはベクターの構築は、ＷＯ００／２４８８３号に記載の方法に従って行われる。複製開始点は、宿主細胞中での機能を温度感受性にする変異を有するものでもよい（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１４３３）。
【００９１】
遺伝子産物の産生を上昇させるために、ポリペプチドをコードする核酸配列の２つ以上のコピーを宿主細胞中に挿入してもよい。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組み込むことにより、又は核酸配列とともに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得られる（ここで、検出可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って核酸配列の追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択物質の存在下で細胞を培養することにより選択することができる）。
【００９２】
上記要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前出）。
【００９３】
真菌宿主細胞
本発明はまた、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす）と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む組換え真菌宿主細胞に関する。本明細書において発現ベクター又は核酸構築体は、ベクター又は構築体が、上記したように染色体組み込み物質として又は自己複製性染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起きる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択はほとんど、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその供給源、ならびに銅依存性トランス活性化転写因子をコードするポリヌクレオチドとに依存する。
【００９４】
宿主細胞は本発明の方法で有用な任意の真菌細胞である。本明細書において「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出、１７１頁）、及びすべての不完全菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出）を含む。
【００９５】
好適な態様において真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的において酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅｓｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ．，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されたように定義される。
【００９６】
より好適な態様において酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００９７】
最も好適な態様において酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において酵母宿主細胞はヤローウィア・リポリティカ細胞である。
【００９８】
さらに最も好適な態様において酵母宿主細胞はサッカロミセス・カールスベルゲンシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＪＧ１６９（ＭＡＴ−α、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｐｅｐ４−１１３７、ｈｉｓ３Δ２、ｐｒｂ１：：ｌｅｕ２、Δｐｒｅ１：：ｈｉｓ３）である（米国特許第５，７７０，４０６号）。
【００９９】
別の好適な態様において真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門と卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の糸状型の菌である（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，前出、により定義されたもの）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖からなる菌糸壁が特徴である。栄養増殖は菌糸の伸長により、炭素異化は偏性好気性である。これに対してサッカロミセス・セレビシエのような酵母の栄養増殖は、単細胞葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性である。
【０１００】
より好適な態様において糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ベルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クロソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、ファサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムロール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリスマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｉｓｍａｓｔｉｘ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。
【０１０１】
最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・フォエチヅス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニーヅランス、アスペルギルス・ニガー、又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンセ（Ｆｕｓａｒｌｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、又はフザリウム・ベネナツム細胞である。別の最も好適な態様において糸状菌宿主細胞は、ベルカンデラ・アヅスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブローサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブフファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｉｍ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスラディクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナーツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコーラ・インソレンス、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｉｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ノイロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラディアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビローサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【０１０２】
真菌細胞は、それ自体公知の方法で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含む方法により形質転換される。アスペルギルス宿主細胞の形質転換の適当な方法は、ＥＰ２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。トリコデルマ・リーセイ宿主細胞の形質転換の適当な方法は、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ６１：１５５−１６４、及びＧｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．１８（１）：７１−６に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するための適当な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６、及びＷＯ９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ．１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３： １６３； ａｎｄ Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１９２０に記載されている方法を使用して形質転換される。
【０１０３】
本発明はさらに、以下の例により記載されるが、これは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例
緩衝液及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬等級の市販品である。
【０１０５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３１３０Ｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して色素ターミネーター化学（Ｇｉｅｓｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３８：４７−６０）を使用して行った。配列は、配列特異的プライマーを用いてｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐ／ｃｏｎｓｅｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して組み立てた。
【０１０６】
菌株
サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９（ＭＡＴ−α、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｐｅｐ４−１１３７、ｈｉｓ３Δ２、ｐｒｂ１：：ｌｅｕ２、Δｐｒｅ１：：ｈｉｓ３）（米国特許第５，７７０，４０６号）を、本明細書の実施例中の宿主株として使用した。
【０１０７】
培養培地
ＹＰＤ培地は、１リットル当たり１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクトペプトン、及び２％のグルコースからなった。
【０１０８】
ＣＵＰマイナスｕｒａ培地（ｐＨ７．０）（オリジナル培地）は、１リットル当たり１ｍｌの１００ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、アミノ酸と硫酸アンモニウムの無い１．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）（ＢＩＯ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、４０ｍｇのアデニンを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ（ＢＩＯ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、５ｇのカサミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）、１００ｍｌの５０％グルコース、５０ｍｌの０．５Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、及び１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンからなった。
【０１０９】
酵母ｕｒａマイナス最適化培地（最適培地）は、１リットル当たり１ｍｌの１００ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、硫酸アンモニウムの無い６．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、４０ｍｇのアデニンを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ、５．９ｇのコハク酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．ＵＳＡ）、２０ｇのガラクトース、１０ｇのグルコース、及び１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンからなった。
【０１１０】
酵母ｕｒａマイナス選択培地は、１リットル当たり、硫酸アンモニウムの無い６．７ｇの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、５ｇのカサミノ酸、１００ｍｌの０．５Ｍコハク酸（ｐＨ５）、４０ｍｌの５０％グルコース、及び２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールからなった。
【０１１１】
酵母ｕｒａマイナス選択プレートは、１リットル当たり２０ｇのノーブル寒天を補足した酵母ｕｒａマイナス選択培地からなった。
【０１１２】
ＳＣｕｒａマイナス培地は、１リットル当たり７．５ｇのアミノ酸の無い酵母窒素塩基（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１１．３ｇのコハク酸、６．８ｇの水酸化ナトリウム、５．６ｇのカサミノ酸、及び０．１ｇのＬ−トリプトファン、１００ｍｌの５０％フルクトース無菌溶液、４００μｌの２５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン無菌溶液（いずれもオートクレーブ後に加えた）からなった。
【０１１３】
ＳＣｕｒａマイナスプレートは、ＳＣｕｒａマイナス培地（ただし１００ｍｌの無菌２０％フルクトースを使用した）と２０ｇの寒天（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．ＵＳＡ）からなった。
【０１１４】
ＳＤＭＵＡ培地は、１リットル当たり１．７ｇのアミノ酸の無い酵母窒素塩基、５．０ｇのカサミノ酸、４０ｍｇのＡＤＥを有する０．８ｇのＣＳＭ−ｕｒａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１０ｍｌの１０ｍＭ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び１０ｍｌの１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、１００ｍｌの５０％フルクトース無菌溶液、４００μｌの２５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン無菌溶液（いずれもオートクレーブ後に加えた）からなった。
【０１１５】
ＬＢ培地は、１リットル当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、及び５ｇの塩化ナトリウムからなった。
【０１１６】
ＬＢプレートは、ＬＢ培地と１リットル当たり１５ｇのバクト寒天からなった。
【０１１７】
ＳＯＣ培地は、２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ４からなり、オートクレーブにより滅菌し、次にろ過滅菌したグルコースを２０ｍＭになるように加えた。
【０１１８】
２×ＹＴプレートは、１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、及び１５ｇのバクトアガロースからなった。
【０１１９】
実施例１：銅誘導性プロモーター（ＣＵＰ１プロモーター）のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー９９７２４７と９９７２４８（下記）を設計して、プラスミドｐＣｕ４２６（Ｌａｂｂｅ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３０６：１４５−１５３）からサッカロミセス・セレビシエ銅誘導性プロモーター（ＣＵＰ１プロモーター）を増幅した。サッカロミセス・セレビシエ発現プラスミドｐＭＢ１５３７（実施例２参照）へのクローニングのためにプライマー設計に制限酵素部位ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩを取り込んだ。
【０１２０】
プライマー９９７２４７：
５’−ＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２５） （下線部）ＡｇｅＩ
プライマー９９７２４８：
５’−ＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴ−Ｓ’（配列番号２６） （下線部）ＥｃｏＲＩ
【０１２１】
ＣＵＰプロモーター断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を使用して増幅した。ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＣｕ４２６プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー９９７２４７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９７２４８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ， ＵＳＡ）を含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１２２】
２４６ｂｐのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動でＴＡＥ緩衝液（１リットル当たり、４．８４ｇのトリス塩基、１．１４ｍｌの氷酢酸、及び２ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を使用して精製し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してさらに精製した。２４６ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ， ＵＳＡ）と連結した。インキュベーション後、２μｌの混合物を使用してＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピタントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。２μｌ容量の結合混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に加え、氷上で５分間インキュベートした。次に細胞に４２℃で３０分間熱ショックを与え、氷上に２分間置いた。２５０μｌのＳＯＣ培地を細胞に加え、混合物を３７℃で１時間２５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した２×ＹＴプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドを選択した。プレート上に増殖した８つのコロニーを無菌つまようじで取り上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬＢ培地を含有する１５ｍｌのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブで３７℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。ＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドを単離した。
【０１２３】
得られたプラスミドミニプレップの４μｌ容量をＥｃｏＲＩで消化した。消化反応物を、ＰＣＲ反応についてすでに記載したようにアガロースゲルクロマトグラフィーとＵＶ分析により分析した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して水で６μｌにして配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１２８ａと命名した（図１）。
【０１２４】
実施例２：発現ベクターｐＭＢ１５３７の構築
発現ベクターｐＭＢ１５３７は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号２７はＤＮＡ配列であり、配列番号２８は推定アミノ酸配列である；受け入れ番号５９９５２）をコードする野生型遺伝子の発現を駆動する酵母ＴＰＩプロモーター、ＣＹＣ１ターミネーター、及び選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含有する。
【０１２５】
酵母発現プラスミドｐＳＴＥＤ２２６（ＷＯ０５／０４５０１８号）を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鋳型としてのｐＳＴＥＤ２２６と以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１２６】
プライマー３１９１３７：
５’−ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧ−３’（配列番号２９）
プライマー１９１３８：
５’−ＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴ−３’（配列番号３０）
【０１２７】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＳＴＥＤ２２６プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３１９１３７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー１９１３８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。ＰＣＲ操作の終了後、５８２６ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の説明書に従って精製し溶出した。
【０１２８】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子を含有する遺伝子断片を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、鋳型としてのｐＥＮＩ１２９８（ＷＯ００／２４８８３号）と以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１２９】
プライマー３４９６９９：
５’−ＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３１）
プライマー３５３０３１：
５’−ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号３２）
【０１３０】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＥＮＩ１２９８プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３４９６９９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３５３０３１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。ＰＣＲ操作の終了後、９２７ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って精製し溶出した。
【０１３１】
得られた２つの断片（５８２６ｂｐと９２７ｂｐ）を、電気穿孔法によりＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して製造業者の説明書に従って、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９中に形質転換した。形質転換反応物は、リガーゼ遺伝子を含有する１００ｎｇのＰＣＲ産物と混合した１００ｎｇのＰＣＲ増幅ベクターＤＮＡを含有した。形質転換反応物を酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１３２】
上記操作からの１つ酵母クローンを再度ＳＣｕｒａマイナスプレートに画線し、１つの酵母コロニーを５０ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。酵母プラスミド調製のために、培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するプラスミド調製で使用した。次にプラスミドを配列決定し、予測されたＤＮＡ配列を証明した。プラスミドをｐＭＢ１５３７と命名した（図２）。
【０１３３】
実施例３：発現ベクターｐＢＭ１２６ａの構築
プラスミドｐＢＭ１２８ａをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＭＢ１５３７をＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで消化し、断片（２６５ｂｐと６６１ｂｐ）をそれぞれ１．８％及び０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。ベクター断片を作成するために、ｐＭＢ１５３７をＡｇｅＩとＮｄｅＩで消化した。生じた５１４８ｂｐ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
【０１３４】
次にすべての３つの断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を使用して連結した。２μｌの反応物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）ウルトラコンピタント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体からＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）を使用して、水で６μｌにして配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１２６ａと命名した（図３）。
【０１３５】
実施例４：発現ベクターｐＭＢ１５３９の構築
ＴＰＩプロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体（配列番号３３はＤＮＡ配列であり、配列番号３４は推定アミノ酸配列である）をコードする遺伝子を含有するように、プラスミドｐＭＢ１５３９を構築した。
【０１３６】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を含有する遺伝子断片をＰＣＲにより、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、鋳型としてサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子（配列番号２７）を含有するｐＥＮＩ１２９８（ＷＯ００／２４８８３号）と、プライマー３４９６９９と３５３０３１（下記）とを用いてＰＣＲにより調製した。
【０１３７】
プライマー３４９６９９：
５’−ＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３５）
プライマー３５３０３１：
５’−ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号３６）
【０１３８】
ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＥＮＩ１２９８プラスミドＤＮＡ、１μｌのプライマー３４９６９９（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３５３０３１（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１３９】
ＰＣＲ増幅後、９９３ｂｐのＤＮＡ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。生じた断片（１００ｎｇ）を実施例２に記載のｐＳＴＥＤ２２６ベクター断片（１００ｎｇ）と混合し、電気穿孔法によりＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して製造業者の説明書に従って、電気コンピタントなサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に形質転換した。次に形質転換細胞を酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１４０】
上記操作からの１つ酵母クローンを再度ＳＣｕｒａマイナスプレートに画線し、１つの酵母コロニーを５０ｍｌの振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。この培養物から培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。次にプラスミドを配列決定し、予測されたＤＮＡ配列を証明した。プラスミドをｐＭＢ１５３９と命名した（図４）。
【０１４１】
実施例５：発現ベクターｐＪＬｉｎ１６８の構築
ｐＢＭ１２６ａ（ＣＵＰ１プロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を含有する）中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を、ｐＭＢ１５３９からのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体遺伝子と交換することにより、ＣＵＰ１プロモーターを使用してサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体発現ベクターを構築した。まずｐＢＭ１２６ａとｐＭＢ１５３９の両方をＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化し、ｐＢＭ１２６ａからの５ｋｂ断片とｐＭＢ１５３９からの１．１ｋｂ断片とをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲル精製した。次に両方の断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：３、及び１：４で連結した。生じたプラスミド（ｐＪＬｉｎ１６８と呼ぶ、図５）は、ＣＵＰ１プロモーターの制御下でサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体遺伝子を含有した。
【０１４２】
実施例６：発現ベクターｐＢＭ１４２ｃとｐＢＭ１４３ｂの構築
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｐＪＬｉｎ１６８中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼのプロペプチド配列から、アミノ酸ＳＰＩＲＲをコードする最後の５つのコドンを除去するために、以下のプライマーを設計した：
【０１４３】
プライマー９９８５７０：
５’−ＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＣ−３’（配列番号３７）
プライマー９９８５７１：
５’−ＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号３８）
【０１４４】
７３ｎｇのｐＪＬｉｎ１６８、１×ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、４μｌのＱＵＩＫＳＯＬＵＴＩＯＮ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、１μｌのＸＬ ｄＮＴＰミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）、及び１μｌの２．５Ｕ／μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を最終容量５０μｌ中に含有するＰＣＲ反応物で、１００ピコモルの各プライマーを使用した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を、９５℃で１分を１サイクル；９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、及び６８℃で６分をそれぞれ１８サイクル；そして１０℃に維持にプログラムした。１μｌのＤｐｎＩを増幅反応物に直接加え、３７℃で１時間インキュベートした。２μｌ容量のＤｐｎＩ消化反応物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）ウルトラコンピタント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って形質転換した。ＳＰＩＲＲコード領域に対応する１５ｂｐの無いクローンの１つをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＢＭ１４２ｃと命名した（図６）。
【０１４５】
ｐＢＭ１４２ｃ中にさらなる変異が生成されるのを避けるために、ｐＢＭ１４２ｃからのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ遺伝子の５’領域をｐＪＬｉｎ１６８中にクローン化して戻した。プラスミドｐＢＭ１４２ｃをＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化し、０．６ｋｂ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。プラスミドｐＪＬｉｎ１６８をＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化し、生じた５．５ｋｂ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。次に２つの断片をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して結合させた。生じた発現プラスミド（ｐＢＭ１４３ｂと呼ぶ、図７）は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ遺伝子の発現を駆動するＣＵＰ１プロモーターを含有した。すなわち最後の５つのアミノ酸（ＳＰＩＲＲ）を除去することにより、２２アミノ酸のシグナル／プロペプチド配列を１７アミノ酸に変化させた。
【０１４６】
実施例７：発現ベクターｐＭＢ１６８２の構築
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＭＢ１５３７を使用して、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼシグナルペプチドのランダム突然変異誘発ライブラリーを構築した。シグナルペプチドコード配列とフランキングＤＮＡ領域のランダム突然変異誘発ＰＣＲ断片を、ＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと以下のプライマー（ＤＮＡ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａａｒｔｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して増幅した。
【０１４７】
プライマー３０９７８７：
５’−ＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３９）
プライマー３７３１７２：
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡ−３’（配列番号４０）
【０１４８】
ここで、配列番号４０の４１、５０、５１、６０、６４、６６、６８、７０、７１、７２、７４、７５、７７、８０、８２、８３、及び８７位のＮは、９９％がＡで１％がＧ、Ｃ、又はＴである；
配列番号４０の４０、４６、４７、５２、５３、５６、６２、６５、６７、７３、７８、８４、８５、８６、及び８８位のＮは、９９％がＧで、１％がＡ、Ｃ、又はＴである；
配列番号４０の４２、４３、４５、４８、４９、５４、５５、５８、５９、６１、６３、６９、７６、７９、８１、８９、９１、及び９２位のＮは、９９％がＣで、１％がＡ、Ｇ、又はＴである；及び
配列番号４０の４４、５７、９０、及び９３位のＮは、９９％がＴで、１％がＡ、Ｃ、又はＧである。
【０１４９】
多様性を導入するプライマーを以下の規則で設計した：ランダム化位置の野生型塩基は絶えず９９％で存在し、他の３つの塩基は１％で存在し、３つすべては等しく出現する。
【０１５０】
シグナルペプチドコード配列の突然変異誘発断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ＰＣＲ増幅反応混合物は、約５０ｎｇのｐＭＢ１５３７、１μｌのプライマー３０９７８７（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー３７３１７２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含有した。ＰＴＣ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１５１】
サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）野生型リパーゼ遺伝子の遺伝子断片をＰＣＲにより、ＰＣＲ反応物中の鋳型としてｐＭＢ１５３７を使用して、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して調製した。ＰＣＲで使用したプライマーは上記のプライマー３０９７８７と３７３１７２である。
【０１５２】
ＰＣＲ増幅後、６００ｂｐのＰＣＲ断片を、ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ ＤＮＡとＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者のプロトコールに従って使用して精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中に溶出した。
【０１５３】
プラスミドｐＭＢ１５３７を、シグナルペプチドコード配列内のＤＮＡ位置でＳａｃＩで消化して線状化した。ドナーＤＮＡとしてフランキングＤＮＡ領域（受容体プラスミドの受容体ＤＮＡに１００％相同的）を有するシグナルペプチドコード配列のＰＣＲ断片を使用して、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９の形質転換において、線状化ベクターを受容体ＤＮＡとして使用した。
【０１５４】
具体的には、約３μｇのＳａｃＩ消化ｐＭＢ１５３７を約１μｇの６００ｂｐ ＰＣＲ断片とともに、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）とＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを１．５キロボルトで２ｍｍのギャップキュベットを使用して、１００μｌの電気コンピタントなサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に電気穿孔した。電気穿孔後、形質転換細胞に１ｍｌの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間インキュベートし、次に１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＳＣｕｒａマイナスプレートに１．１ｍｌを蒔いた。
【０１５５】
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＳＣｕｒａマイナスプレートから全部で８４００コロニーを取り上げ、９６ウェルのポリスチレンマイクロウェルプレートに移し、取り上げたコロニーを横の列Ｂ〜Ｈと縦の列１〜１２に入れ、列Ａは空のままとし、これにサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９中の野生型プラスミド構築体を野生型対照として接種した。すべてのウェルは、１リットル当たり４０ｍｇのアデニンが添加されたＳＤ培地ＵＲＡを含有した（ＳＤＭＵＡと呼ぶ）（製造業者Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＢｉＯ １０１（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの推奨に従う、ＡＨ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋにより販売）。プレートを３０℃、２５０ｒｐｍで５日間インキュベートした。５日後、プレートを４℃に維持し、次に後述の吉草酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してリパーゼ活性を測定した。
【０１５６】
以下のアッセイで、培養上清のリパーゼ活性を吉草酸ｐ−ニトロフェニルを基質として使用して測定した。培養上清を５０ｍＭトリス（ｐＨ７）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４％トリトンＸ−１００緩衝液（希釈緩衝液）で希釈した。リポラーゼ（ＬＩＰＯＬＡＳＥ）（登録商標）標準物質（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、試料緩衝液で１．０ＬＵ／ｍｌ濃度から出発して０．１２５ＬＵ／ｍｌ濃度で終わる２倍工程で希釈した。ポリスチレンマイクロウェルプレート中で、１０μｌの上清を９０μｌの希釈緩衝液と混合した。１００μｌの吉草酸ｐ−ニトロフェニル基質溶液（１１７μｌの吉草酸ｐ−ニトロフェニルを１０ｍｌのイソプロパノールに溶解した）を各ウェルに加え、短時間混合し、次に４０５ｎｍの吸光度を１２秒毎に３分間測定した。アッセイデータを評価して、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９（Ａ列のウェル中）中のｐＭＢ１５３９より高い活性を有するすべての試料を同定した。
【０１５７】
対照より高い活性を有するすべてのクローンを陽性ヒットとして集め、これを同じ構成で再分析し、まだ対照より高い活性を有するクローンを、マイクロウェルプレート中の新鮮なＳＤＭＵＡ培地への接種物質として使用した。Ａ列を再度対照株用に使用した。プレートを上記したようにインキュベートし、上記したように分析した。
【０１５８】
対照より高い活性を有するすべてのクローンをウェルから取り出し、ＳＣ−寒天プレートに再度画線した。マイクロウェルプレート中の２００μｌのＳＤＭＵＡ培地と、１０ｍｌのＳＤＭＵＡ培地を含有する５０ｍｌチューブとでの再増殖のために、すべてのクローンの単一のコロニーを集め、３０℃で５日間インキュベートし、次に上記の吉草酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用して、収率を対照株の収率と比較した。
【０１５９】
各クローンを３つの隣接マイクロウェルと３つの個々の５０ｍｌチューブ中で増殖させた。活性レベルの比較のために、３つの増殖実験の平均値を使用した。
【０１６０】
最後にマイクロウェルプレートと５０ｍｌチューブ中の両方で最も高いリパーゼ活性を有するクローンを、１０ｍｌのＳＤＭＵＡ培地を含有する振盪フラスコ（２つの邪魔板を有する２５０ｍｌの円錐邪魔板付き振盪フラスコ）に接種し、２５０ｒｐｍで３０℃で５日間インキュベートした。上記したように吉草酸ｐ−ニトロフェニルを使用して、上清をリパーゼ活性について測定した。最も高いリパーゼ活性を有するクローンのＤＮＡを配列決定した。
【０１６１】
最も高い活性を示すクローンをＭＢ１６６５と命名し、これはリパーゼのシグナルペプチド中でＲ２Ｋ置換を有した（シグナルペプチドの２番目のコドンがＡＧＧからＡＡＧに変化した）。
【０１６２】
実施例４に記載したものと同じ原理を使用して、このシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体をコードするｐＭＢ１５３９構築体に移した。この場合、実施例４と同じ方法を使用してより小さいＰＣＲ断片を作成した。しかし、実施例４に従って、しかし鋳型としてＭＢ１５３９からプラスミドＤＮＡを使用して、より大きい断片も作成した。サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９のＧＡＰ修復と形質転換を上記したように行った。このクローニングにより、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体のより高い発現を有するクローンを得た。このクローンをサッカロミセス・セレビシエＭＢ１６８１と命名した。
【０１６３】
ＳＣ−寒天プレートからのサッカロミセス・セレビシエＭＢ１６８１細胞物質（３０℃で５日間増殖）を使用して、５０ｍｌ振盪フラスコ中の１０ｍｌのＳＣｕｒａマイナス培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。この培養物から、酵母プラスミド調製のために、培養ブロス２ｍｌをＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。精製したプラスミドを製造業者の説明書に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に形質転換した。形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢプレートに蒔いた。単一のコロニーを単離し、再画線し、ＬＢ培地中に接種し、３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物の１ｍｌを、ＱＩＡＰＲＥＰ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用するプラスミド調製で使用した。最後に単離されたプラスミドをＤＮＡ配列決定の鋳型として使用し、変異体シグナル配列の配列（配列番号４１）とサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体コード領域（配列番号３３、推定アミノ酸配列は配列番号３４）を証明した。生じたプラスミドをｐＭＢ１６８２と命名した（図８）。プラスミドｐＭＢ１６８２はＴＰＩプロモーターとサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体コード領域（Ｒ２Ｋ変化を有するＳＰＩＲＲが無い）を含んだ。
【０１６４】
実施例８：発現ベクターｐＪＬｉｎ１９５の構築
サッカロミセス・セレビシエＣＵＰ１プロモーターを使用して、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体（Ｒ２Ｋ変化を含有するシグナル配列を有し、ＳＰＩＲＲが無い）発現ベクターを含有するプラスミドｐＪＬｉｎ１９５を構築した。
【０１６５】
ｐＭＢ１６８２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩで消化したｐＢＭ１４３ｂ中にクローン化し、第２のアミノ酸Ａｒｇ（ＡＧＧ）をＬｙｓ（ＡＡＧ）のコード配列で置換した。ｐＭＢ１６８２とｐＢＭ１４３ｂの両方をＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩの両方で消化し、ｐＭＢ１６８２からの１ｋｂ断片とｐＢＭ１４３ｂからの５ｋｂ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出した。断片を製造業者の説明書に従ってＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：１、及び３：１で連結した。生じたプラスミド（ＤＮＡ配列決定により確認した）をｐＪＬｉｎ１９５と命名した（図９）。
【０１６６】
実施例９：発現ベクターｐＢＭ１６５ａの構築
以下のプライマーを使用して、４つのサッカロミセス・セレビシエ上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む発現ベクターを構築するためのＰＣＲ断片を作成した：
【０１６７】
プライマー９９９００３：
５’−ＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴ−３’（配列番号４２） （下線部）ＳｐｈＩ
プライマー９９９００５：
５’−ＡＣＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号４３） （下線部）ＡｇｅＩ
【０１６８】
断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ＰＣＲ混合物は、０．５μｌの約２５ｎｇのｐＢＭ１４３ｂ ＤＮＡ、１μｌのプライマー９９９００３（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９９００５（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックスを含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１６９】
生じた１４７ｂｐのＰＣＲ断片を１．８％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、１４７ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）と連結した。１μｌ容量の新鮮なＰＣＲ産物、３μｌの２回蒸留水、及び１μｌのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターをピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。
【０１７０】
インキュベーション後、２μｌの混合物を使用してＯＮＥＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピタント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。２μｌ容量の結合混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に加え、氷上で５分間インキュベートした。次に細胞に４２℃で３０分間熱ショックを与え、氷上に２分間置いた。２５０μｌのＳＯＣ培地を細胞に加え、混合物を３７℃で１時間２５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した２×ＹＴプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドを選択した。プレート上に増殖した８つのコロニーを無菌つまようじで取り上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬＢ培地を含有する１５ｍｌのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブで３７℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。ＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００を使用してプラスミドを単離した。
【０１７１】
得られたプラスミドミニプレップの４μｌ容量をＥｃｏＲＩで消化した。消化反応物を、ＰＣＲ反応についてすでに記載したようにアガロースゲルクロマトグラフィーにより分析した。挿入体を含有する単離されたプラスミドを、１μｌのプラスミド鋳型、１．６ｎｇのＭ１３プライマー（前進プライマー又は逆進プライマー）、及び水で６μｌを使用して配列決定した。正しい配列を有する生じたプラスミドをｐＢＭ１６３ａと命名した（図１０）。
【０１７２】
４つのＵＡＳ配列を含有する最終的発現構築体を作成するために、ｐＢＭ１６３ａをＳｐｈＩとＡｇｅＩで消化し、ｐＪＬｉｎ１６８をＡｇｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。１３２ｂｐのＳｐｈＩ−ＡｇｅＩと３４０ｂｐのＡｇｅＩ−ＨＩｎｄＩＩＩ断片をサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現ベクターｐＢＭ１４３ｂ（これはあらかじめＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化させた）中にクローン化した。生じたプラスミドをｐＢＭ１６５ａと命名した（図１１）。
【０１７３】
実施例１０：ＡＣＥ１過剰産生発現ベクターの構築
サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ２０４５８）のゲノムＤＮＡからＡＣＥ１遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲプライマーを設計した。発現プラスミドｐＢＭ１４３ｂとｐＪＬｉｎ１９５へのクローニングのために、ＢｓｐＨＩ制限部位を取り込んだ。
【０１７４】
プライマー９９９２６２：
５’−ＴＣＡＴＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴ−３’（配列番号４４） （下線部）ＢｓｐＨＩ
プライマー９９９２６３：
５’−ＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４５） （下線部）ＢｓｐＨＩ
【０１７５】
ＡＣＥ１遺伝子断片をＰＣＲによりＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して増幅した。ゲノムＤＮＡをサッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株から、ＹＥＡＳＴＥＲ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ．ＵＳＡ）を使用して製造業者の説明書に従って単離した。ＰＣＲ反応物は、０．１μｇのサッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ ゲノムＤＮＡ、１μｌのプライマー９９９２６２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマー９９９２６３（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、４０．２５μｌの水、及び０．７５μｌ（３．５Ｕ／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼミックスを最終容量５０μｌ中に含有した。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分４５秒をそれぞれ１０サイクル；９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分４５秒をそれぞれ１５サイクルで、さらに各サイクル後に５秒の伸長；７２℃で７分を１サイクル；そして１０℃で維持、にプログラムして、断片を増幅した。
【０１７６】
生じた１５８９ｂｐのＰＣＲ断片を１．８％アガロースゲル電気泳動によりＴＡＥ緩衝液を使用してＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。１５８９ｂｐのＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）と連結した。生じたプラスミド（ｐＢＭ１６８ａと命名、図１２）をヌクレオチド配列決定により確認した。
【０１７７】
ＢｓｐＨＩとＡＣＥ１遺伝子分節（１５８３ｂｐ）で消化したプラスミドｐＢＭ１６８ａを、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１６５ａ中にクローン化した。断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより抽出した。断片を製造業者の説明書に従ってＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ベクター量を５０ｎｇに設定してベクター：挿入体のモル比を１：２、１：１、及び３：１で連結した。生じたプラスミドをｐＢＭ１６９ａ（図１３）、ｐＢＭ１７１ａ（図１４）、ｐＢＭ１７０ａ（図１５）と命名した。
【０１７８】
実施例１１：ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１７１ａを用いる酵母形質転換
プラスミドｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１７１ａをそれぞれ、サッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に、ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造業者の説明書に従って形質転換した。簡単に説明するとサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９の１つのコロニーを使用して５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、オービタルシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３０℃で一晩インキュベートした。
【０１７９】
細胞が６００ｎｍで０．４〜０．５の吸光度に達した時、細胞を７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを３０ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｄ遠心分離機で７００×ｇで５分間遠心分離後、細胞ペレットを１．５ｍｌの１．１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液（１１０ｍＭ酢酸リチウム、１１ｍＭトリス（ｐＨ８）、１．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１５秒間遠心分離後、細胞ペレットを６００μｌの１．１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液に再懸濁した。約０．５μｇのｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１７０ａ、又はｐＢＭ１７１ａ、２５０μｌのＰＥＧ／酢酸リチウム溶液（４０％ ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、及び５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ変性Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｔｅｓｔｅｓ Ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡを、５０μｌのコンピタントな細胞にを添加後、混合物を５５０ｒｐｍで３０℃で３０分間振盪し、細胞を反転して１０分毎に混合した。各形質転換混合物に総量２０μｌのＤＭＳＯを加え、４２℃で１５分インキュベートし、混合物を５分毎に反転した。形質転換混合物を微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１５秒間遠心分離し、細胞を１ｍｌのＹＰＤ ＰＬＵＳ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に再懸濁し、５５０ｒｐｍで３０℃で９０分間振盪した。遠心分離後、細胞を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、１５％グリセロールの存在下で１ｍｌの酵母ｕｒａマイナス選択培地に再懸濁した。５０μｌの各形質転換反応物を二重測定で酵母ｕｒａマイナス選択プレートに蒔き、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートした。
【０１８０】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＢＭ１７０ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９形質転換体を使用して、９６ウェルプレート中の１８０μｌのｕｒａマイナス選択培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次に一晩培養物を１８０μｌの銅誘導性「オリジナル」培地又は「最適」培地で１００倍希釈し、３０℃で５日間増殖させた。
【０１８１】
培養上清のリパーゼ活性を酪酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＢ）を基質として以下のアッセイで測定した：まず培養上清を０．１Ｍ ＭＯＰＳ、４ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％トリトンＸ−１００緩衝液（ｐＨ７．５）（試料緩衝液）で１／１５希釈し、次に希釈試料を０倍、１／３倍、１／９倍と連続希釈した。ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）標準物質（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、試料緩衝液で１．０ＬＵ／ｍｌ濃度から出発して０．１２５ＬＵ／ｍｌ濃度で終わる２倍工程で希釈した。全部で２０μｌの各希釈物（標準物質を含む）を９６ウェルの平底プレートに入れた。２００μｌの酪酸ｐ−ニトロフェニル基質溶液（酪酸ｐ−ニトロフェニル：ＤＭＳＯ：０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）の比率は１：９９：４００）を各ウェルに加え、次に２５℃で１５分インキュベートした。インキュベーションの終了後、９６ウェルプレートについて４０５ｎｍの吸光度を測定した。作成した標準曲線から外挿して試料濃度を決定した。振盪フラスコ分析のために、代表的形質転換体を２ｍｌのｕｒａマイナス選択培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物を１２５ｍｌガラス振盪フラスコ中の２５ｍｌのＣＵＰマイナスｕｒａ培地で２００倍希釈し、３０℃で６日間増殖させた。試料を採取し、微量遠心分離機で１２，０００×ｇで１０秒間遠心分離し、上清を上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してリパーゼ活性について試験した。
【０１８２】
１０μｌの培養上清をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）と１：２の比率で混合した。２分間沸騰させた後、試料を１５μｌのＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＰＬＵＳ ＰＲＯＴＥＩＮ（登録商標）標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にのせた。ゲルを１×トリス−グリシン−ＳＤＳランニングバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２００Ｖで１時間流した。次にゲルを水でそれぞれ５分間の洗浄を３回行い、ＢＩＯ−ＳＡＦＥ（登録商標）クマシー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１時間染色し、次に水で少なくとも３０分間脱色した。
【０１８３】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９形質転換体（各プラスミドについて２４個）を、９６ウェルプレート中の「オリジナル」銅含有培地で５日間増殖させた。培養ブロス試料中のリパーゼ活性を、上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として使用して測定した。ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、又はｐＢＭ１７１ａ形質転換体について平均相対的リパーゼ活性は、表１に示すようにそれぞれ１００、２０２、１９６、及び５０６であった。
【０１８４】
【表１】
【０１８５】
表に示した結果は、高コピープラスミドを有するＡｃｅ１ｐ転写活性化因子を過剰産生することにより、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現レベルが倍増することを示した。
【０１８６】
酵母形質転換体中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性は、コハク酸を緩衝液として含有し、ガラクトースと配合物を一次炭素源として含有する「最適」培地で増殖させた形質転換体について、改良されていることが証明された。
【０１８７】
Ａｃｅ１ｐ過剰産生形質転換体中のサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現レベルが「最適」培地中でさらに増強されるかどうかを試験するために、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性を、９６ウェルプレート中で「オリジナル」又は「最適」銅含有培地中で増殖させたｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａを含有するサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９株形質転換体から測定した。すべての４つの発現プラスミドは上記したように評価した。
【０１８８】
「オリジナル」培地中のｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１７１ａ形質転換体についての平均相対的リパーゼ活性は、それぞれ１００、１９０、１７０、及び４０２であった。表ＩＩに示すように、「最適」培地中のｐＢＭ１４３ｂ、ｐＢＭ１６９ａ、ｐＪＬｉｎ１９５、及びｐＢＭ１７１ａ形質転換体についての平均相対的リパーゼ活性は、それぞれ２４０、３１８、２８５、及び２６６であった。「最適」培地で増殖させた形質転換体から、すべてのプラスミドについてより高い全体的発現が観察された。サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ産生に対するＡｃｅ１ｐ過剰発現の影響は、プラスミドｐＢＭ１４３ｂをプラスミドｐＢＭ１６９ａと比較すると約３０％高かった。しかし「最適」培地中のｐＪＬｉｎ１９５と比較したｐＢＭ１７１ａからのＡＣＥ１遺伝子の過剰発現は、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現のわずかな低下を引き起こした。
【０１８９】
【表２】
【０１９０】
ｐＢＭ１４３ｂ、ｐＪＬｉｎ１９５、ｐＢＭ１６９ａ、又はｐＢＭ１７１ａからのサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼの発現を振盪フラスコで評価した。各プラスミドについて２つの代表的形質転換体を、「オリジナル」又は「最適」銅含有培地を使用して二重測定で２５ｍｌの振盪フラスコ培養で増殖させた。振盪フラスコ試料を４、５、及び６日目に採取した。５日目の試料の上清を、上記したように酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイを使用してサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ活性について測定した。
【０１９１】
振盪フラスコでは、ＡＣＥ１遺伝子の過剰発現作用のためにサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現は、「最適培地」中のｐＢＭ１４３ｂとｐＢＭ１６９ａを比較すると約１．１倍高く、「オリジナル」培地では約１．６倍高かった。さらに表ＩＩＩに示すように、「オリジナル」培地中のｐＪＬｉｎ１９５と比較してｐＢＭ１７１ａからのＡＣＥ１遺伝子の過剰発現は約３．５倍の発現上昇を与え、「最適」培地では発現が１．６倍低下した。両方の培地でｐＢＭ１７１形質転換体の相対的発現レベルは同じであったが、ｐＪＬｉｎ１９５形質転換体中のリパーゼ発現レベルは「最適」培地で有意に高かった。培養濁度（ＯＤ６００）を上昇させ、寒天培地に蒔いて総ＣＦＵ／ｍｌを測定することにより増殖を追跡した。一般に「オリジナル」培地中の細胞は「最適」培地中で増殖させた細胞より少なくとも２倍速く増殖し、これはおそらく炭素源としてのグルコースに対する選択性によると考えられる。微視的には「オリジナル」培地中で増殖させた酵母細胞と比較して、「最適」培地中で増殖させた酵母細胞は、少なくとも３倍のサイズになった大きな液胞を有して膨れているようであった。
【０１９２】
【表３】
【０１９３】
上記したように、代表的振盪フラスコからの上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼバンドの強度は、酪酸ｐ−ニトロフェニルアッセイの結果と一致した。
【０１９４】
プラスミドｐＢＭ１６５ａとｐＢＭ１７０ａを、上記したようにサッカロミセス・セレビシエＪＧ１６９細胞中に形質転換させた。形質転換体（各プラスミドについて２４個）を選択し、上記したように９６ウェルプレート中の「オリジナル」培地中で増殖させた。表ＩＶに示すように結果は、「オリジナル」培地中のｐＢＭ１６５ａ、ｐＢＭ１７０ａ、及びｐＢＭ１６９ａの平均相対的リパーゼ活性が、それぞれ１００、２７７、及び１７３であることを示した。
【０１９５】
【表４】
【０１９６】
Ａｃｅ１ｐ転写因子について一次結合部位を複製し、複数コピープラスミドからのＡＣＥ１遺伝子の発現を上昇させることにより、９６ウェルプレートでサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）変異体リパーゼ発現の１．６倍の上昇が観察された。
【０１９７】
本明細書に開示した具体例は本発明のいくつかの態様を例示する目的であり、本明細書に記載し特許請求した発明は、本明細書に開示した具体例に限定されるものではない。同等の実施態様は本発明の範囲内にあると考えられる。実際、前記説明から当業者には、本明細書で証明し記載したもの以外に本発明の種々の修飾が明らかであろう。そのような修飾態様は添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。矛盾する可能性がある場合は、定義を含む本開示が優先する。
【０１９８】
受け入れ番号を含む種々の文献が本明細書に引用されたが、その開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド、ここで、前記プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす、及び銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、及び
（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
銅誘導性プロモーター配列が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）メタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）メタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）メタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）メタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）メタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ）メタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子、又はこれらの組合せから得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、配列番号４６及び／又は配列番号４７であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
真菌宿主細胞が、第１のポリヌクレオチドの１つ又はそれを超える（複数個）のコピーを含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、抗原、酵素、増殖因子、ホルモン、イムノディレーター（ｉｍｍｕｎｏｄｉｌａｔｏｒ）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、又はゼラチンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、真菌宿主細胞に対して固有であるか又は外来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１及び第２のポリヌクレオチドが、真菌宿主細胞の染色体又は染色体外要素中に含有されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第３のポリヌクレオチドが、真菌宿主細胞の染色体又は染色体外要素中に含有されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
真菌宿主細胞は糸状菌又は酵母細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項１４】
銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす、核酸構築体。
【請求項１５】
銅誘導性プロモーター配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１６】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子、及びこれらの組合せ、よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１７】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、配列番号４６及び／又は配列番号４７であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸構築体を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸構築体と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む組換え真菌宿主細胞。
【請求項２０】
銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１】
ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する培地中で真菌宿主細胞を培養し、ここで、真菌宿主細胞は、銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチド、ここで、前記プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす、及び銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含み、及び
（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
銅誘導性プロモーター配列が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）メタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）メタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）メタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）メタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）メタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ）メタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子、又はこれらの組合せから得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、配列番号４６及び／又は配列番号４７であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
真菌宿主細胞が、第１のポリヌクレオチドの１つ又はそれを超える（複数個）のコピーを含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、抗原、酵素、増殖因子、ホルモン、イムノディレーター（ｉｍｍｕｎｏｄｉｌａｔｏｒ）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、又はゼラチンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、真菌宿主細胞に対して固有であるか又は外来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１及び第２のポリヌクレオチドが、真菌宿主細胞の染色体又は染色体外要素中に含有されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第３のポリヌクレオチドが、真菌宿主細胞の染色体又は染色体外要素中に含有されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
真菌宿主細胞は糸状菌又は酵母細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項１４】
銅依存性トランス活性化転写因子により活性化される銅応答性上流活性化配列を含む銅誘導性プロモーター配列に機能できる形で結合したポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター配列の上流に機能できる形で結合した１つまたはそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来であり、銅応答性上流活性化配列はプロモーター配列の銅誘導性転写を引き起こす、核酸構築体。
【請求項１５】
銅誘導性プロモーター配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１６】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン遺伝子、サッカロミセス・セレビシエスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエサイトゾル性カタラーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ銅抵抗性サプレッサー遺伝子、カンジダ・グラブラタメタロチオネイン遺伝子、ノイロスポラ・クラッサメタロチオネイン遺伝子、ヤローウィア・リポリティカメタロチオネイン遺伝子、アガリクス・ビスポルスメタロチオネイン遺伝子、マグナポルテ・グリセアメタロチオネイン遺伝子、及びポドスポラ・アンセリナメタロチオネイン遺伝子、及びこれらの組合せ、よりなる群から選択される遺伝子から得られることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１７】
１つ又はそれを超える（複数個）の追加の銅応答性上流活性化配列が、配列番号４６及び／又は配列番号４７であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸構築体。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸構築体を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸構築体と、銅依存性トランス活性化転写因子をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む第３のポリヌクレオチドとを含む組換え真菌宿主細胞。
【請求項２０】
銅依存性トランス活性化転写因子遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエＡＣＥ１遺伝子、カンジダ・グラブラタＡＭＴ１遺伝子、ヤローウィア・リポリティカＣＲＦ１遺伝子（受け入れ番号Ｐ４５８１５）、シゾサッカロミセス・ポンベＣＵＦ２遺伝子（受け入れ番号Ｏ９４５８８）、サッカロミセス・セレビシエＨＡＡ１遺伝子（受け入れ番号Ｑ１２７５３）、及びアスペルギルス・フミガツス銅フィストＤＮＡ結合ドメインタンパク質遺伝子（受け入れ番号Ｑ４ＷＮ３３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組換え真菌宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５４３５６０（Ｐ２００９−５４３５６０Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１９７０９（Ｐ２００９−５１９７０９）
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３４８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００８９６７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５００１７５６０２）ノボザイムス，インコーポレイティド (26)
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３４８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００８９６７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５００１７５６０２）ノボザイムス，インコーポレイティド (26)
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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