磁性粒子及び標的化合物の検出方法、及びそれに用いる検出装置
【課題】 洗いの作業を行うことなく、試料溶液中の標的化合物を簡便に且つ迅速に検出する検出方法及び検出装置を提供する。
【解決手段】 磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴とする検出方法（検出装置）である。
【解決手段】 磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴とする検出方法（検出装置）である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子および間接的に標的化合物を検出する検出方法に関し、特に、異なるサイズの磁性粒子が混在する混合溶液中である一定のサイズ以上の磁性粒子、または標的化合物が結合した磁性体ナノ粒子と結合していない磁性体ナノ粒子が混在する混合溶液中の標的化合物が結合した磁性体ナノ粒子のみを検出する検出方法に関する。さらに本発明は、上記検出方法に用いる検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微量の標的化合物を効率よく収集する手段として、数μｍ程度のサイズを有する磁性体微粒子を用いた手段が提案されている。市販品としてはポリスチレンビーズの粒子（粒子径数μｍ程度）中にフェライト粒子が分散したダイナビーズがある。このような磁性体微粒子は外部磁場を使用することによって簡便に且つ効率よく集めることができるため、生体物質などの検出方法に精度よい検出手段として用いられている（例えば、特許文献１、２及び３、非特許文献１参照）。しかし、粒子径が大きいために磁石への応答性は良いが目的物質（標的化合物）の吸着量や分析感度は十分なものとは言えない。一方、粒子径を数十ｎｍ以下に小さくすると強磁性が超常磁性に変化するため磁石による分離が困難になるという問題点を有している。磁性体ナノ粒子を用いて標的化合物を効率よく分離する手段として、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）や上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子を利用した熱刺激応答性磁性体ナノ粒子等が提案されている（例えば、特許文献４、５及び６参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第００／０５３５７号パンフレット
【特許文献２】特開平５−２９２９７１号公報
【特許文献３】特表２００３−５２３１８５号公報
【特許文献４】国際公開第０２／１６５７１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／１６５２８号パンフレット
【特許文献６】特開２００２−６０４３６号公報
【非特許文献１】「バイオインダストリー(Bio Industry)」，2004年、第21巻，第8号，p.39-47
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記熱などの外部刺激応答性磁性体ナノ粒子を用いて標的化合物の検出を効率よく行うためには、磁性体ナノ粒子と結合した標的化合物を磁力によって一旦補足し、それ以外の試料を流して、磁性体ナノ粒子と結合した標識化合物のみを抽出するという、いわゆる「洗い」の作業が必須となっている。
従って、本発明の目的は、洗いの作業を行うことなく、試料溶液中の標的化合物を簡便に且つ迅速に検出する検出方法を提供することである。さらに本発明の目的は、上記検出方法に用いる装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーを用いた電気的特性の変化に着目することによって、磁性体ナノ粒子を補足することなく、簡便にかつ効率よく、混合液中の標的化合物を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明の検出方法は、第１の態様によると、磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することを特徴としている。
【０００７】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液をコイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することが好ましい。
【０００８】
また、磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することが好ましい。
【０００９】
本発明の検出方法は、第２の態様（具体的態様）によると、ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴としている。
【００１０】
前記共存溶液を、コイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体ナノ粒子結合体を検出し、間接的に標的化合物を検出することが好ましい。
【００１１】
また、磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することが好ましい。
【００１２】
前記細管の内径は、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下とすることが好ましい。
前記外部磁場の強さは、７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍであることが好ましい。
前記細管内の溶液の流速としては、０．１〜１００ｍｌ／分であることが好ましい。
前記外部磁場は、永久磁石により形成することができる。
前記磁性体粒子は、酸化鉄又はフェライトからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、磁性体ナノ粒子を補足することなく、簡便にかつ効率よく、混合液中の標的化合物を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の検出方法は、第１の態様では、磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴としている。
【００１５】
本発明の検出方法は、第２の態様では、ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴としている。
本発明の第２の態様では、標的化合物を磁性体ナノ粒子と結合させ磁性体ナノ粒子結合体を形成しこれを検出することにより、間接的に標的化合物を検出することができる。
【００１６】
まず、本発明の検出方法の概略について図面を参照して説明する。図１は、本発明の検出方法を説明するための概略図であり、溶液が流入する細管１２と磁気識別センサー１０とから成る。図２は、本発明の検出方法に用いる磁気識別センサーの要部の概略を示している。図２に示す検出装置１０は、溶液が流入する細管１２と、細管１２内の溶液が流れる方向に対し垂直方向の磁力線を有する外部磁場を形成する永久磁石１４Ａ、１４Ｂと、被検出磁性粒子を検出する検出器１６と、を有する。図１において、溶液が流れる方向は矢印方向であり、図１に模式的に示す被検出磁性粒子１８は検出器１６で検出される。なお、図１においては、着磁部は、細管１２内の外部磁場が形成された領域である。本発明において、図１にブロックで示す検出器１６の具体的形態としては、（１）コイルに生じた誘導起電力や電流を検出する形態、（２）磁束計（磁気抵抗素子）を用いた磁気抵抗の変化を検出する形態が挙げられる。いずれの場合も、検出器１６を通過した磁性粒子たる被検出磁性粒子は、誘導電流や磁気抵抗の変化を測定することによって検出される。以下、（１）、（２）それぞれの検出原理について説明する。
【００１７】
まず、前記（１）の検出形態について説明する。超常磁性への臨界径以下のサイズの磁性粒子（ナノ粒子）は、たとえ物質としては強磁性であったとしても超常磁性であり、外部磁場がかからなければ磁化しないのでコイル内を通っても誘導起電力を生じることはない。これに対し、臨界径以上の強磁性粒子（微粒子又はナノ粒子結合体）は、外部磁場により磁区が一定方向に揃う。ナノ粒子結合体は結合することで見かけの体積が増え、超常磁性への臨界径を超えたと考えられ、磁化されて強磁性体となりやすい。強磁性粒子が流速ｖでコイル（導体）に近づくと、コイル内の自由電子は磁性粒子がつくる磁場Ｈに相対的に速度ｖで運動し、磁場から力ｆ（＝−ｅｖＨ）を受ける。磁性粒子がコイルを通過するとき電磁誘導により電流が流れ、誘導起電力が発生する（磁性粒子がコイルに入るときと出るときとでは電流、誘導起電力の方向が異なる。）。以上の原理はフレミング右手の法則として知られている。コイルの巻き数を増減することにより感度を調節することができる。
【００１８】
十分な検出感度を確保するため、コイルは細管に直接巻くことが好ましい。コイルの巻き数としては、１〜２５０が好ましく、１〜１００がより好ましい。
【００１９】
また、コイルと磁場との配置は、磁場が溶液の流れに対して上流にあることが好ましい。
【００２０】
次いで、前記（２）の検出形態について説明する。磁気抵抗は、金属や半導体の電気抵抗が磁場Ｈの印加により変化する現象をいう。アンチモン化インジウムのような半導体でできた磁気抵抗素子を設置し磁気抵抗の変化をモニターすることにより、強磁性体となった磁性粒子の通過を検出することができる。磁気抵抗素子に関しては周知の技術なので詳細な説明はここでは省略する。
【００２１】
本発明の別の検出形態として、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石からなる磁気識別センサーを用いることができる。ＴＭＦ素子はキヤノン電子（株）が開発したセンサーで、磁気インピーダンス効果を利用したＴＭＦ−ＭＩ素子、及び直交フラックスゲートを用いたＴＭＦ−ＦＧ素子があり、いずれも本発明に使用することができる。ＴＭＦ素子はグラデーションパターンも検出できるので、被検出磁性粒子１個ずつを検出することも、一定容積中の被検出磁性粒子濃度としても検出することができるので好ましい。ＴＭＦ素子の技術の詳細はキヤノン電子（株）のホームページから参照することができる。
【００２２】
前記細管の内径としては、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下であることが好ましい。細管の内径を当該範囲内とすることにより、検出感度と検出精度が最適に設定することができるので好ましい。細管の内径は、０．０５〜２ｍｍであることがより好ましい。
【００２３】
外部磁場の強さとしては、７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍ（１００〜２００００Ｏｅ）とすることが好ましく、２３．９〜１２７４ｋＡ／ｍ（３００〜１６０００Ｏｅ）とすることがより好ましい。外部磁場は永久磁石を使用して印加することができる。
【００２４】
前記細管内の溶液の流速は、既述のいずれの検出形態であっても、０．１〜１００ｍｌ／分とすることが好ましく、０．２〜１０ｍｌ／分とすることがより好ましい。当該流速であれば、十分な検出感度を得ることができる。
【００２５】
＜磁性体ナノ粒子＞
本発明における磁性体ナノ粒子は、平均粒子径が２〜５０ｎｍの磁性を有するナノ粒子である。平均粒子径が２ｎｍ以上であるので安定に作製可能であり、５０ｎｍ以下であるので、例えば細胞内の物質を標的とした場合であっても細胞内まで侵入して標的物質を捉えることができる。磁性体ナノ粒子の平均粒子径は、安定性および磁力の観点から３〜５０ｎｍが好ましく、５〜４０ｎｍが特に好ましい。
【００２６】
このような磁性体ナノ粒子は、例えば特表２００２−５１７０８５号等に記載された方法に従って製造することができる。例えば鉄（II）化合物、または鉄（II）化合物および金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上の範囲に維持して、酸化鉄またはフェライト磁性体ナノ粒子を形成することができる。また、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）含有の水溶液をアルカリ性条件下で混合することによっても、本発明における磁性体ナノ粒子を得ることができる。さらに、バイオカタリシス（Biocatalysis）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法を用いることもできる。磁性体ナノ粒子としては、ＦｅＰｄ、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔＣｕなどの強磁性規則合金を使用することもできる。
【００２７】
本発明では好ましい磁性体ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）3Ｏ4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。前記式中Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｍｇ2+などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。
このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。
【００２８】
例えばマグネタイトを形成するためには、溶液中に鉄が２種類の異なる酸化状態、Ｆｅ2+およびＦｅ3+で存在することが好ましい。２つの酸化状態は、鉄（II）塩および鉄（II
I）塩の混合物を、好ましくは所望の磁性酸化物の組成に対してＦｅ（II）塩をＦｅ（III）塩より少し多いモル量で添加すること、または鉄（II）塩もしくは鉄（III）塩を添加して、必要に応じてＦｅ2+またはＦｅ3+の一部を他方の酸化状態に、好ましくは酸化または場合により還元によって変換することにより、溶液中に存在できるようになる。
【００２９】
この磁性金属酸化物は、３０℃から３５０℃の温度、好ましくは５０℃から３００℃の間の温度で熟成することが好ましい。この温度範囲においては磁性体ナノ粒子の粒径を温度によって制御することができ、高温にすると粒径が大きくなる傾向にある。
磁性金属酸化物を形成するために各種の金属イオン間の相互作用を起こさせるには溶液のｐＨが７以上である必要がある。ｐＨは、適切なバッファー溶液を最初の金属塩の添加時の水溶液として用いるか、または必要な酸化状態にした後に溶液に塩基を添加することによって所望の範囲に維持される。ひとたびｐＨ値としてその７以上の範囲にある特定の値を選択した後は、最終産物の大きさの分布が実質的に均一となることを確保するために、そのｐＨ値を磁性体ナノ粒子の調製工程の全体にわたって維持することが好ましい。
【００３０】
また磁性体ナノ粒子の粒子サイズを制御する目的で、追加の金属塩を溶液に添加する工程を設けてもよい。この場合、次の２つの異なる操作様式にて行うことができる。１つの操作様式は段階的増加によるもので、以後段階的様式の操作と呼ぶが、その操作様式では各成分（金属塩、酸化剤および塩基）を数回に分けて、好ましくは毎回等量で、定めた順序で溶液に連続的に添加し、それらの工程を所望のナノ粒子のサイズが得られるまで必要な回数繰り返し、その各回の添加量は溶液中（すなわち粒子の表面上以外）での金属イオンの重合を実質的に避けることのできる量とする。
他方は、連続した操作様式であり、各成分（金属塩、酸化剤、および塩基を定められた順序で、粒子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一な流速で、連続的に溶液中に添加する。この段階的又は連続的操作様式を用いることに
【００３１】
また磁性体ナノ粒子の磁性表面に、官能基を有する分子（表面修飾剤）を付着させて、後述する連結体を結合可能にすることができる。このような分子は、カルボン酸やアミノ酸のような低分子化合物でも、多糖類、タンパク質、ペプチド、ポリアミンのごときポリマーでもよく、ω−シラン：Ｓｉ（ＯＲ）3（ＣＨ2）nＸ（式中、Ｒはアルキル置換基であり、ｎは１から１８の整数であり（１、１８を含む）、ＸはＮＨ2、ＣＮ、およびＳＨからなる群から選択される官能基である）でもよい。該分子により供給される官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を用いて連結体を結合することが出来る。また、該分子の一端がスクシンイミドエステル等に活性化されていてもよい。官能基を有する化合物で表面修飾された磁性体はコロイド溶液として安定であり、後述の連結体の結合も溶液反応として扱うことができる。
【００３２】
＜連結体＞
本発明における磁性体ナノ粒子と後述する標的化合物を結合させるために、連結体を用いることが好ましい。このような連結体としては、標的化合物に対して結合性（もしくは反応性を有する）を有する分子が好ましい。また、このような分子と外部刺激応答性化合物とが連結されたものであってもよい。
なお、標的化合物が生体関連分子である場合には、連結体も生体関連分子を用いることが出来る。例えば、抗原を標的化合物とした場合抗体を連結体として用いることが出来る。
【００３３】
＜生体関連分子＞
生体関連分子には、核酸及び核酸以外の物質、例えば、抗原及び抗体（モノクローナルやポリクローナル）、ペプチド、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類酵素或いはその基質、更には脂質等の化合物、または、ウィルス若しくは細菌等の生物体若しくはその一部を挙げることができる。
【００３４】
ここで、「核酸」は、狭義には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）であり、広義には、ＰＮＡ（Peptide Ncleic Acid）を含めても良い。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡがある。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ全体のみならず、そのＤＮＡ、ＲＮＡの断片である場合も含む。
【００３５】
このような連結体は、磁性体ナノ粒子の表面の一部として存在してもよく、或いは、磁性体ナノ粒子の表面に直接的又は間接的に設けられたものであってもよい。
【００３６】
＜磁性体微粒子＞
本発明において、磁性体微粒子とは粒子サイズが０．１〜１００μｍ程度の強磁性体粒子をいう。組成などは前記の磁性体ナノ粒子と同じである。
【００３７】
＜標的化合物＞
本発明において、標的化合物とは検出すべき物質であり、標的物質と同義である。標的化合物は、磁性体ナノ粒子に結合した連結体を介して磁性体ナノ粒子に結合し、磁性体ナノ粒子結合体を形成する。標的化合物は特に制約はないが、前記生体関連分子であることが好ましい。
例えば、核酸を用いた場合には、種々のタンパク質の中から、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子を選択的に捕捉したり、相補的な塩基配列を設計することで異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を、迅速且つ容易に検出することができる。
その他、連結体と相互作用を有し、磁性ナノ粒子の凝集体を形成することの出来る標的化合物は容易に検出することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量基準である。
【００３９】
［実施例１］
（磁性体ナノ粒子分散液の調製）
塩化鉄（III）６水和物１０．８ｇおよび塩化鉄（II）４水和物６．４ｇをそれぞれ１ｍｏｌ／ｌ（１Ｎ）−塩酸水溶液８０ｍｌに溶解し混合した。得られた溶液を攪拌しながらその中にアンモニア水（２８質量％）９６ｍｌを２ｍｌ／分の速度で添加した。その後、８０℃で３０分加熱したのち室温に冷却した。得られた凝集物をデカンテーションにより水で精製した。結晶子サイズ約１２ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）の生成をＸ線回折法により確認した。この凝集物にポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸２．３ｇを溶解した水溶液（ＮａＯＨでｐＨを６．８に調整したもの）１００ｍｌを加えて分散し、磁性体ナノ粒子分散液を調製した。
【００４０】
（磁性体微粒子分散液の調製）
市販のマグネタイト微粒子（平均粒子サイズ３μｍ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）１２ｍｇを上記ポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸水溶液１００ｍｌに分散して磁性微粒子分散液を調製した。
【００４１】
（磁性微粒子の検出）
サンプル液としては、前記磁性体ナノ粒子分散液を１００万倍に水で希釈したもの（サンプルＡ）、前記磁性体微粒子分散液を５万倍に水で希釈したもの（サンプルＢ）、および前記磁性体ナノ粒子分散液と前記磁性体微粒子分散液とを５：１の容量比で混合しさらに水で５万倍に希釈したもの（サンプルＣ）を調製した。
次いで、以下の構成の磁気識別センサーを使用して磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子を検出を行った。すなわち、内径１００μｍ、外径２ｍｍのガラス製細管に、上記サンプル液Ａ〜Ｃを流速１ｍｌ／分で流し１２７４ｋＡ／ｍ（１６０００Ｏｅ）の外部磁場をかけ（着磁部）、続いて銅製コイルを通して検流計（検出器）により誘導電流の検出を行なった。その結果、サンプルＡでは検流計の応答はなかったが、サンプルＢおよびＣは、それぞれ、６μＡ、４μＡの誘導電流が検出できた。
【００４２】
［実施例２］
（ビオチン化磁性体ナノ粒子によるアビジン結合リポソームの検出）
ＳＰＤＰを用いリポソーム表面にタンパクを結合させ（Peter Walden, Zoltan A. Nagy, Jan Klein, J. Mol. Immunol.,2,191-197(1986) ）、以下のようにして磁性体ナノ粒子による検出を行った。
【００４３】
１）アビジン結合リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、Ｎ‐スクシミジル３‐（‐２−ピリジル−ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびトリエチルアミンを１：２：２のモル比でメタノール−クロロホルム（９：１）に溶解し、室温で２時間反応させた。反応終了後１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄後、窒素気流下乾燥させ、ジチオピリジン−ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）を得た。ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合し（ＤＰＰＥ：ＤＰＰＣ＝２：８）、メタノール−クロロホルムに溶解し窒素気流下乾燥、薄膜とした後ｐＨ７．２のＰＢＳに懸濁させ、超音波照射、フィルターろ過により平均粒径１２０ｎｍのＤＴＰリポソーム（脂質濃度 ２５μＭ／ｍｌ）を得た。
【００４４】
１５０ｍＭのＮａＣｌ含有１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、アビジンとＳＰＤＰをモル比１：１で１時間反応させジチオスレイトール（ＤＴＴ５ｍＭ）添加して、ジスルフィドを還元した後セファデックスＧ−２５で精製し、ＤＴＰリポソーム溶液に加えた。ショ糖濃度勾配遠心分離により分離して１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）再分散させアビジン結合リポソーム溶液を得た。
【００４５】
２）ビオチン化磁性体ナノ粒子の調製
実施例１で用いた磁性体ナノ粒子分散液２．５ｍｌに０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）７．５ｍｌを加え、ＷＳＣ １９ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）１８ｍｇを添加し室温で３０分攪拌した。これにＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）２８ｍｇを加え一晩沸騰した。１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μｌを加えて反応停止後、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製し、ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液を得た。
【００４６】
３）ビオチン化磁性体ナノ粒子によるアビジン結合リポソームの検出
１０万倍に希釈したビオチン化磁性体ナノ粒子溶液１０ｍｌにビジン結合リポソーム溶液の１００倍希釈液を０ｍｌ（サンプルＤ）、０．１ｍｌ（サンプルＥ）、０．５ｍｌ（サンプルＦ）、１．０ｍｌ（サンプルＧ）それぞれ添加し１０分間室温で振とうした後、実施例１と同じ条件で誘導電流の検出を行った。その結果、サンプルＤでは検流計の応答はなかったが、サンプルＥ、Ｆ、Ｇはアビジン結合リポソーム溶液添加量に対応した検流計の応答が得られ、それぞれ、２μＡ、５μＡ、９μＡの誘導電流が検出できた。なお、ビオチン化磁性体ナノ粒子に結合したアビジン結合リポソームの平均粒子サイズは２６０ｎｍであった。
【００４７】
［実施例３］
実施例１及び２において、検流計による誘導電流の検出に代えて磁気抵抗素子による検出を行ったところ、サンプルＢ、Ｃ、並びにサンプルＥ、Ｆ、Ｇでは抵抗の変化を検出できたが、サンプルＡおよびサンプルＤは検出できなかった。
【００４８】
［実施例４］
特開２００５−４６６５２号実施例に記載のマイクロミキサーを用い、１０倍に希釈した前記ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液（Ｌ１）を５ｍL／分の流速で流体供給路２６から連続的に流した。この中に上記アビジン結合リポソーム溶液（Ｌ２）を５倍に希釈した液（サンプルＤ）または１０倍に希釈した液（サンプルＥ）をそれぞれ１ｍL／分の流速で５秒間流体供給路２８から注入（注入量８３μL）した。反応流路２２（断面積は約７×１０５μｍ２）を通る際に混合され、その混合液（ＬＭ）を吐出路３２（断面積は約８×１０５μｍ２）からマイクロ流路（断面積は約８×１０５μｍ２）に導入して磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子を内蔵した磁気識別センサーを用いて出力電圧を測定した。アビジン結合リポソームの濃度にほぼ比例した出力電圧が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の検出方法を説明するための概略図である。
【図２】本発明の検出方法に用いる磁気識別センサーの要部を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５０】
１０ 磁気識別センサー
１２ 細管
１４Ａ １４Ｂ 永久磁石
１６ 検出器
１８ 磁性粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子および間接的に標的化合物を検出する検出方法に関し、特に、異なるサイズの磁性粒子が混在する混合溶液中である一定のサイズ以上の磁性粒子、または標的化合物が結合した磁性体ナノ粒子と結合していない磁性体ナノ粒子が混在する混合溶液中の標的化合物が結合した磁性体ナノ粒子のみを検出する検出方法に関する。さらに本発明は、上記検出方法に用いる検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微量の標的化合物を効率よく収集する手段として、数μｍ程度のサイズを有する磁性体微粒子を用いた手段が提案されている。市販品としてはポリスチレンビーズの粒子（粒子径数μｍ程度）中にフェライト粒子が分散したダイナビーズがある。このような磁性体微粒子は外部磁場を使用することによって簡便に且つ効率よく集めることができるため、生体物質などの検出方法に精度よい検出手段として用いられている（例えば、特許文献１、２及び３、非特許文献１参照）。しかし、粒子径が大きいために磁石への応答性は良いが目的物質（標的化合物）の吸着量や分析感度は十分なものとは言えない。一方、粒子径を数十ｎｍ以下に小さくすると強磁性が超常磁性に変化するため磁石による分離が困難になるという問題点を有している。磁性体ナノ粒子を用いて標的化合物を効率よく分離する手段として、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）や上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子を利用した熱刺激応答性磁性体ナノ粒子等が提案されている（例えば、特許文献４、５及び６参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第００／０５３５７号パンフレット
【特許文献２】特開平５−２９２９７１号公報
【特許文献３】特表２００３−５２３１８５号公報
【特許文献４】国際公開第０２／１６５７１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／１６５２８号パンフレット
【特許文献６】特開２００２−６０４３６号公報
【非特許文献１】「バイオインダストリー(Bio Industry)」，2004年、第21巻，第8号，p.39-47
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記熱などの外部刺激応答性磁性体ナノ粒子を用いて標的化合物の検出を効率よく行うためには、磁性体ナノ粒子と結合した標的化合物を磁力によって一旦補足し、それ以外の試料を流して、磁性体ナノ粒子と結合した標識化合物のみを抽出するという、いわゆる「洗い」の作業が必須となっている。
従って、本発明の目的は、洗いの作業を行うことなく、試料溶液中の標的化合物を簡便に且つ迅速に検出する検出方法を提供することである。さらに本発明の目的は、上記検出方法に用いる装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーを用いた電気的特性の変化に着目することによって、磁性体ナノ粒子を補足することなく、簡便にかつ効率よく、混合液中の標的化合物を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明の検出方法は、第１の態様によると、磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することを特徴としている。
【０００７】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液をコイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することが好ましい。
【０００８】
また、磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することが好ましい。
【０００９】
本発明の検出方法は、第２の態様（具体的態様）によると、ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴としている。
【００１０】
前記共存溶液を、コイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体ナノ粒子結合体を検出し、間接的に標的化合物を検出することが好ましい。
【００１１】
また、磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することが好ましい。
【００１２】
前記細管の内径は、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下とすることが好ましい。
前記外部磁場の強さは、７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍであることが好ましい。
前記細管内の溶液の流速としては、０．１〜１００ｍｌ／分であることが好ましい。
前記外部磁場は、永久磁石により形成することができる。
前記磁性体粒子は、酸化鉄又はフェライトからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、磁性体ナノ粒子を補足することなく、簡便にかつ効率よく、混合液中の標的化合物を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の検出方法は、第１の態様では、磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴としている。
【００１５】
本発明の検出方法は、第２の態様では、ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴としている。
本発明の第２の態様では、標的化合物を磁性体ナノ粒子と結合させ磁性体ナノ粒子結合体を形成しこれを検出することにより、間接的に標的化合物を検出することができる。
【００１６】
まず、本発明の検出方法の概略について図面を参照して説明する。図１は、本発明の検出方法を説明するための概略図であり、溶液が流入する細管１２と磁気識別センサー１０とから成る。図２は、本発明の検出方法に用いる磁気識別センサーの要部の概略を示している。図２に示す検出装置１０は、溶液が流入する細管１２と、細管１２内の溶液が流れる方向に対し垂直方向の磁力線を有する外部磁場を形成する永久磁石１４Ａ、１４Ｂと、被検出磁性粒子を検出する検出器１６と、を有する。図１において、溶液が流れる方向は矢印方向であり、図１に模式的に示す被検出磁性粒子１８は検出器１６で検出される。なお、図１においては、着磁部は、細管１２内の外部磁場が形成された領域である。本発明において、図１にブロックで示す検出器１６の具体的形態としては、（１）コイルに生じた誘導起電力や電流を検出する形態、（２）磁束計（磁気抵抗素子）を用いた磁気抵抗の変化を検出する形態が挙げられる。いずれの場合も、検出器１６を通過した磁性粒子たる被検出磁性粒子は、誘導電流や磁気抵抗の変化を測定することによって検出される。以下、（１）、（２）それぞれの検出原理について説明する。
【００１７】
まず、前記（１）の検出形態について説明する。超常磁性への臨界径以下のサイズの磁性粒子（ナノ粒子）は、たとえ物質としては強磁性であったとしても超常磁性であり、外部磁場がかからなければ磁化しないのでコイル内を通っても誘導起電力を生じることはない。これに対し、臨界径以上の強磁性粒子（微粒子又はナノ粒子結合体）は、外部磁場により磁区が一定方向に揃う。ナノ粒子結合体は結合することで見かけの体積が増え、超常磁性への臨界径を超えたと考えられ、磁化されて強磁性体となりやすい。強磁性粒子が流速ｖでコイル（導体）に近づくと、コイル内の自由電子は磁性粒子がつくる磁場Ｈに相対的に速度ｖで運動し、磁場から力ｆ（＝−ｅｖＨ）を受ける。磁性粒子がコイルを通過するとき電磁誘導により電流が流れ、誘導起電力が発生する（磁性粒子がコイルに入るときと出るときとでは電流、誘導起電力の方向が異なる。）。以上の原理はフレミング右手の法則として知られている。コイルの巻き数を増減することにより感度を調節することができる。
【００１８】
十分な検出感度を確保するため、コイルは細管に直接巻くことが好ましい。コイルの巻き数としては、１〜２５０が好ましく、１〜１００がより好ましい。
【００１９】
また、コイルと磁場との配置は、磁場が溶液の流れに対して上流にあることが好ましい。
【００２０】
次いで、前記（２）の検出形態について説明する。磁気抵抗は、金属や半導体の電気抵抗が磁場Ｈの印加により変化する現象をいう。アンチモン化インジウムのような半導体でできた磁気抵抗素子を設置し磁気抵抗の変化をモニターすることにより、強磁性体となった磁性粒子の通過を検出することができる。磁気抵抗素子に関しては周知の技術なので詳細な説明はここでは省略する。
【００２１】
本発明の別の検出形態として、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石からなる磁気識別センサーを用いることができる。ＴＭＦ素子はキヤノン電子（株）が開発したセンサーで、磁気インピーダンス効果を利用したＴＭＦ−ＭＩ素子、及び直交フラックスゲートを用いたＴＭＦ−ＦＧ素子があり、いずれも本発明に使用することができる。ＴＭＦ素子はグラデーションパターンも検出できるので、被検出磁性粒子１個ずつを検出することも、一定容積中の被検出磁性粒子濃度としても検出することができるので好ましい。ＴＭＦ素子の技術の詳細はキヤノン電子（株）のホームページから参照することができる。
【００２２】
前記細管の内径としては、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下であることが好ましい。細管の内径を当該範囲内とすることにより、検出感度と検出精度が最適に設定することができるので好ましい。細管の内径は、０．０５〜２ｍｍであることがより好ましい。
【００２３】
外部磁場の強さとしては、７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍ（１００〜２００００Ｏｅ）とすることが好ましく、２３．９〜１２７４ｋＡ／ｍ（３００〜１６０００Ｏｅ）とすることがより好ましい。外部磁場は永久磁石を使用して印加することができる。
【００２４】
前記細管内の溶液の流速は、既述のいずれの検出形態であっても、０．１〜１００ｍｌ／分とすることが好ましく、０．２〜１０ｍｌ／分とすることがより好ましい。当該流速であれば、十分な検出感度を得ることができる。
【００２５】
＜磁性体ナノ粒子＞
本発明における磁性体ナノ粒子は、平均粒子径が２〜５０ｎｍの磁性を有するナノ粒子である。平均粒子径が２ｎｍ以上であるので安定に作製可能であり、５０ｎｍ以下であるので、例えば細胞内の物質を標的とした場合であっても細胞内まで侵入して標的物質を捉えることができる。磁性体ナノ粒子の平均粒子径は、安定性および磁力の観点から３〜５０ｎｍが好ましく、５〜４０ｎｍが特に好ましい。
【００２６】
このような磁性体ナノ粒子は、例えば特表２００２−５１７０８５号等に記載された方法に従って製造することができる。例えば鉄（II）化合物、または鉄（II）化合物および金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上の範囲に維持して、酸化鉄またはフェライト磁性体ナノ粒子を形成することができる。また、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）含有の水溶液をアルカリ性条件下で混合することによっても、本発明における磁性体ナノ粒子を得ることができる。さらに、バイオカタリシス（Biocatalysis）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法を用いることもできる。磁性体ナノ粒子としては、ＦｅＰｄ、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔＣｕなどの強磁性規則合金を使用することもできる。
【００２７】
本発明では好ましい磁性体ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）3Ｏ4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。前記式中Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｍｇ2+などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。
このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。
【００２８】
例えばマグネタイトを形成するためには、溶液中に鉄が２種類の異なる酸化状態、Ｆｅ2+およびＦｅ3+で存在することが好ましい。２つの酸化状態は、鉄（II）塩および鉄（II
I）塩の混合物を、好ましくは所望の磁性酸化物の組成に対してＦｅ（II）塩をＦｅ（III）塩より少し多いモル量で添加すること、または鉄（II）塩もしくは鉄（III）塩を添加して、必要に応じてＦｅ2+またはＦｅ3+の一部を他方の酸化状態に、好ましくは酸化または場合により還元によって変換することにより、溶液中に存在できるようになる。
【００２９】
この磁性金属酸化物は、３０℃から３５０℃の温度、好ましくは５０℃から３００℃の間の温度で熟成することが好ましい。この温度範囲においては磁性体ナノ粒子の粒径を温度によって制御することができ、高温にすると粒径が大きくなる傾向にある。
磁性金属酸化物を形成するために各種の金属イオン間の相互作用を起こさせるには溶液のｐＨが７以上である必要がある。ｐＨは、適切なバッファー溶液を最初の金属塩の添加時の水溶液として用いるか、または必要な酸化状態にした後に溶液に塩基を添加することによって所望の範囲に維持される。ひとたびｐＨ値としてその７以上の範囲にある特定の値を選択した後は、最終産物の大きさの分布が実質的に均一となることを確保するために、そのｐＨ値を磁性体ナノ粒子の調製工程の全体にわたって維持することが好ましい。
【００３０】
また磁性体ナノ粒子の粒子サイズを制御する目的で、追加の金属塩を溶液に添加する工程を設けてもよい。この場合、次の２つの異なる操作様式にて行うことができる。１つの操作様式は段階的増加によるもので、以後段階的様式の操作と呼ぶが、その操作様式では各成分（金属塩、酸化剤および塩基）を数回に分けて、好ましくは毎回等量で、定めた順序で溶液に連続的に添加し、それらの工程を所望のナノ粒子のサイズが得られるまで必要な回数繰り返し、その各回の添加量は溶液中（すなわち粒子の表面上以外）での金属イオンの重合を実質的に避けることのできる量とする。
他方は、連続した操作様式であり、各成分（金属塩、酸化剤、および塩基を定められた順序で、粒子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一な流速で、連続的に溶液中に添加する。この段階的又は連続的操作様式を用いることに
【００３１】
また磁性体ナノ粒子の磁性表面に、官能基を有する分子（表面修飾剤）を付着させて、後述する連結体を結合可能にすることができる。このような分子は、カルボン酸やアミノ酸のような低分子化合物でも、多糖類、タンパク質、ペプチド、ポリアミンのごときポリマーでもよく、ω−シラン：Ｓｉ（ＯＲ）3（ＣＨ2）nＸ（式中、Ｒはアルキル置換基であり、ｎは１から１８の整数であり（１、１８を含む）、ＸはＮＨ2、ＣＮ、およびＳＨからなる群から選択される官能基である）でもよい。該分子により供給される官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を用いて連結体を結合することが出来る。また、該分子の一端がスクシンイミドエステル等に活性化されていてもよい。官能基を有する化合物で表面修飾された磁性体はコロイド溶液として安定であり、後述の連結体の結合も溶液反応として扱うことができる。
【００３２】
＜連結体＞
本発明における磁性体ナノ粒子と後述する標的化合物を結合させるために、連結体を用いることが好ましい。このような連結体としては、標的化合物に対して結合性（もしくは反応性を有する）を有する分子が好ましい。また、このような分子と外部刺激応答性化合物とが連結されたものであってもよい。
なお、標的化合物が生体関連分子である場合には、連結体も生体関連分子を用いることが出来る。例えば、抗原を標的化合物とした場合抗体を連結体として用いることが出来る。
【００３３】
＜生体関連分子＞
生体関連分子には、核酸及び核酸以外の物質、例えば、抗原及び抗体（モノクローナルやポリクローナル）、ペプチド、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類酵素或いはその基質、更には脂質等の化合物、または、ウィルス若しくは細菌等の生物体若しくはその一部を挙げることができる。
【００３４】
ここで、「核酸」は、狭義には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）であり、広義には、ＰＮＡ（Peptide Ncleic Acid）を含めても良い。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡがある。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ全体のみならず、そのＤＮＡ、ＲＮＡの断片である場合も含む。
【００３５】
このような連結体は、磁性体ナノ粒子の表面の一部として存在してもよく、或いは、磁性体ナノ粒子の表面に直接的又は間接的に設けられたものであってもよい。
【００３６】
＜磁性体微粒子＞
本発明において、磁性体微粒子とは粒子サイズが０．１〜１００μｍ程度の強磁性体粒子をいう。組成などは前記の磁性体ナノ粒子と同じである。
【００３７】
＜標的化合物＞
本発明において、標的化合物とは検出すべき物質であり、標的物質と同義である。標的化合物は、磁性体ナノ粒子に結合した連結体を介して磁性体ナノ粒子に結合し、磁性体ナノ粒子結合体を形成する。標的化合物は特に制約はないが、前記生体関連分子であることが好ましい。
例えば、核酸を用いた場合には、種々のタンパク質の中から、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子を選択的に捕捉したり、相補的な塩基配列を設計することで異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を、迅速且つ容易に検出することができる。
その他、連結体と相互作用を有し、磁性ナノ粒子の凝集体を形成することの出来る標的化合物は容易に検出することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量基準である。
【００３９】
［実施例１］
（磁性体ナノ粒子分散液の調製）
塩化鉄（III）６水和物１０．８ｇおよび塩化鉄（II）４水和物６．４ｇをそれぞれ１ｍｏｌ／ｌ（１Ｎ）−塩酸水溶液８０ｍｌに溶解し混合した。得られた溶液を攪拌しながらその中にアンモニア水（２８質量％）９６ｍｌを２ｍｌ／分の速度で添加した。その後、８０℃で３０分加熱したのち室温に冷却した。得られた凝集物をデカンテーションにより水で精製した。結晶子サイズ約１２ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）の生成をＸ線回折法により確認した。この凝集物にポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸２．３ｇを溶解した水溶液（ＮａＯＨでｐＨを６．８に調整したもの）１００ｍｌを加えて分散し、磁性体ナノ粒子分散液を調製した。
【００４０】
（磁性体微粒子分散液の調製）
市販のマグネタイト微粒子（平均粒子サイズ３μｍ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）１２ｍｇを上記ポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸水溶液１００ｍｌに分散して磁性微粒子分散液を調製した。
【００４１】
（磁性微粒子の検出）
サンプル液としては、前記磁性体ナノ粒子分散液を１００万倍に水で希釈したもの（サンプルＡ）、前記磁性体微粒子分散液を５万倍に水で希釈したもの（サンプルＢ）、および前記磁性体ナノ粒子分散液と前記磁性体微粒子分散液とを５：１の容量比で混合しさらに水で５万倍に希釈したもの（サンプルＣ）を調製した。
次いで、以下の構成の磁気識別センサーを使用して磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子を検出を行った。すなわち、内径１００μｍ、外径２ｍｍのガラス製細管に、上記サンプル液Ａ〜Ｃを流速１ｍｌ／分で流し１２７４ｋＡ／ｍ（１６０００Ｏｅ）の外部磁場をかけ（着磁部）、続いて銅製コイルを通して検流計（検出器）により誘導電流の検出を行なった。その結果、サンプルＡでは検流計の応答はなかったが、サンプルＢおよびＣは、それぞれ、６μＡ、４μＡの誘導電流が検出できた。
【００４２】
［実施例２］
（ビオチン化磁性体ナノ粒子によるアビジン結合リポソームの検出）
ＳＰＤＰを用いリポソーム表面にタンパクを結合させ（Peter Walden, Zoltan A. Nagy, Jan Klein, J. Mol. Immunol.,2,191-197(1986) ）、以下のようにして磁性体ナノ粒子による検出を行った。
【００４３】
１）アビジン結合リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、Ｎ‐スクシミジル３‐（‐２−ピリジル−ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびトリエチルアミンを１：２：２のモル比でメタノール−クロロホルム（９：１）に溶解し、室温で２時間反応させた。反応終了後１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄後、窒素気流下乾燥させ、ジチオピリジン−ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）を得た。ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合し（ＤＰＰＥ：ＤＰＰＣ＝２：８）、メタノール−クロロホルムに溶解し窒素気流下乾燥、薄膜とした後ｐＨ７．２のＰＢＳに懸濁させ、超音波照射、フィルターろ過により平均粒径１２０ｎｍのＤＴＰリポソーム（脂質濃度 ２５μＭ／ｍｌ）を得た。
【００４４】
１５０ｍＭのＮａＣｌ含有１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、アビジンとＳＰＤＰをモル比１：１で１時間反応させジチオスレイトール（ＤＴＴ５ｍＭ）添加して、ジスルフィドを還元した後セファデックスＧ−２５で精製し、ＤＴＰリポソーム溶液に加えた。ショ糖濃度勾配遠心分離により分離して１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）再分散させアビジン結合リポソーム溶液を得た。
【００４５】
２）ビオチン化磁性体ナノ粒子の調製
実施例１で用いた磁性体ナノ粒子分散液２．５ｍｌに０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）７．５ｍｌを加え、ＷＳＣ １９ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）１８ｍｇを添加し室温で３０分攪拌した。これにＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）２８ｍｇを加え一晩沸騰した。１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μｌを加えて反応停止後、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製し、ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液を得た。
【００４６】
３）ビオチン化磁性体ナノ粒子によるアビジン結合リポソームの検出
１０万倍に希釈したビオチン化磁性体ナノ粒子溶液１０ｍｌにビジン結合リポソーム溶液の１００倍希釈液を０ｍｌ（サンプルＤ）、０．１ｍｌ（サンプルＥ）、０．５ｍｌ（サンプルＦ）、１．０ｍｌ（サンプルＧ）それぞれ添加し１０分間室温で振とうした後、実施例１と同じ条件で誘導電流の検出を行った。その結果、サンプルＤでは検流計の応答はなかったが、サンプルＥ、Ｆ、Ｇはアビジン結合リポソーム溶液添加量に対応した検流計の応答が得られ、それぞれ、２μＡ、５μＡ、９μＡの誘導電流が検出できた。なお、ビオチン化磁性体ナノ粒子に結合したアビジン結合リポソームの平均粒子サイズは２６０ｎｍであった。
【００４７】
［実施例３］
実施例１及び２において、検流計による誘導電流の検出に代えて磁気抵抗素子による検出を行ったところ、サンプルＢ、Ｃ、並びにサンプルＥ、Ｆ、Ｇでは抵抗の変化を検出できたが、サンプルＡおよびサンプルＤは検出できなかった。
【００４８】
［実施例４］
特開２００５−４６６５２号実施例に記載のマイクロミキサーを用い、１０倍に希釈した前記ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液（Ｌ１）を５ｍL／分の流速で流体供給路２６から連続的に流した。この中に上記アビジン結合リポソーム溶液（Ｌ２）を５倍に希釈した液（サンプルＤ）または１０倍に希釈した液（サンプルＥ）をそれぞれ１ｍL／分の流速で５秒間流体供給路２８から注入（注入量８３μL）した。反応流路２２（断面積は約７×１０５μｍ２）を通る際に混合され、その混合液（ＬＭ）を吐出路３２（断面積は約８×１０５μｍ２）からマイクロ流路（断面積は約８×１０５μｍ２）に導入して磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子を内蔵した磁気識別センサーを用いて出力電圧を測定した。アビジン結合リポソームの濃度にほぼ比例した出力電圧が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の検出方法を説明するための概略図である。
【図２】本発明の検出方法に用いる磁気識別センサーの要部を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５０】
１０ 磁気識別センサー
１２ 細管
１４Ａ １４Ｂ 永久磁石
１６ 検出器
１８ 磁性粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、
前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴とする被検出磁性粒子の検出方法。
【請求項２】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、
前記溶液をコイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することを特徴とする請求項１に記載の被検出磁性粒子の検出方法。
【請求項３】
前記磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することを特徴とする請求項１に記載の検出磁性粒子の検出方法。
【請求項４】
ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴とする標的化合物の検出方法。
【請求項５】
ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、コイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体ナノ粒子結合体を検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴とする請求項４に記載の標的化合物の検出方法。
【請求項６】
磁気識別センサーが磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することを特徴とする請求項４に記載の標的化合物の検出方法。
【請求項７】
前記細管の内径が前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記細管内の溶液の流速が０．１〜１００ｍｌ／分であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
前記外部磁場の強さが７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍであることを特徴とする請求項２または５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記外部磁場が永久磁石により形成されることを特徴とする請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記磁性体粒子が酸化鉄又はフェライトからなることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の検出方法に用いる検出装置。
【請求項１】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、
前記溶液を細管内の一方向に流し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出することを特徴とする被検出磁性粒子の検出方法。
【請求項２】
磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子凝集体と、それらより少なくとも５倍大きいサイズを有する磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体とが共存する溶液中において、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出する被検出磁性粒子の検出方法であって、
前記溶液をコイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体のみを検出することを特徴とする請求項１に記載の被検出磁性粒子の検出方法。
【請求項３】
前記磁気識別センサーが、磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することを特徴とする請求項１に記載の検出磁性粒子の検出方法。
【請求項４】
ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、細管内の一方向に流し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過したことを、着磁部と検出器とを有する磁気識別センサーで検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴とする標的化合物の検出方法。
【請求項５】
ａ）独立分散している平均粒子サイズ５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、及び／又は平均５０ｎｍ以下のサイズに凝集している磁性体ナノ粒子凝集体と、ｂ）標的化合物と結合して前記ａ）より少なくとも５倍大きい平均サイズを有する磁性体ナノ粒子結合体と、が共存する溶液を、コイルが巻回された細管内の一方向に流し、溶液の流れの方向に対し少なくとも垂直方向の成分を含む磁力線を有する外部磁場を印加し、前記ｂ）の磁性体ナノ粒子結合体が通過するときに前記コイルに生じる誘導電流又は誘導起電力を測定することにより、又は磁気抵抗（ＭＲ）素子の磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体ナノ粒子結合体を検出し、間接的に標的化合物を検出することを特徴とする請求項４に記載の標的化合物の検出方法。
【請求項６】
磁気識別センサーが磁性薄膜を用いた高周波駆動型の磁気センサー素子（ＴＭＦ素子）及び永久磁石を有することを特徴とする請求項４に記載の標的化合物の検出方法。
【請求項７】
前記細管の内径が前記磁性体微粒子又は磁性体ナノ粒子結合体の平均サイズの２倍以上で、かつ１０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記細管内の溶液の流速が０．１〜１００ｍｌ／分であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
前記外部磁場の強さが７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍであることを特徴とする請求項２または５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記外部磁場が永久磁石により形成されることを特徴とする請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記磁性体粒子が酸化鉄又はフェライトからなることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の検出方法に用いる検出装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２０８３６８（Ｐ２００６−２０８３６８Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７５８８４（Ｐ２００５−３７５８８４）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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