神経細胞の誘導除去のための方法およびシステム
本発明は、神経細胞、特に、非増殖細胞（例えば、希突起膠細胞およびシュワン細胞）の誘導除去のための方法およびシステムに関する。上記方法およびシステムは、脱髄状態の表現型の形質もしくは特徴を示すように特異的に誘導され得る動物モデルを含む。本明細書で開示される方法およびシステムは、髄鞘再生を促進するもしくは脱髄状態の表現型の形質もしくは特徴の逆転を促進する化合物もしくは薬剤を同定することによって、薬物スクリーニングに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の研究に対する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＳ０２７３３６およびＮＳ０３４９３９の下、政府支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、２００９年９月２日に出願された米国仮特許出願６１／２７５，８３９の利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ニューロンの脱髄は、神経系におけるミエリンの減少によって特徴付けられる有害な状態である。ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）に極めて重要な成分であり、それはニューロンの軸索を覆い、ミエリン鞘として公知の絶縁層を形成する。上記ミエリン鞘の存在は、上記軸索を下って伝達する電位の形態で神経シグナルの速度および完全性を増強する。ミエリン鞘の喪失は、感覚、運動および他のタイプの機能に重大な障害をもたらす。なぜなら、神経シグナルがその標的に余りにも遅く到達するか、非同期的に（例えば、ある神経における一部の軸索が、他のものより早く伝導する場合）到達するか、間欠的に（例えば、伝導が、高周波数においてのみ損なわれる場合）到達するか、もしくは全く到達しないかのいずれかであるからである。
【０００４】
神経組織は、ニューロンおよび支持細胞もしくはグリア細胞を含む。グリア細胞は、哺乳動物の脳において約１０〜１倍だけニューロンより数が勝る。グリア細胞は、４つのタイプに分けられ得る：星状細胞、希突起膠細胞、シュワン細胞およびミクログリア細胞。上記ミエリン鞘は、あるタイプのグリア細胞（すなわち、ＣＮＳにおける希突起膠細胞およびＰＮＳにおけるシュワン細胞）の形質膜もしくは細胞膜によって形成される。髄鞘形成希突起膠細胞は、脱髄病変において同定されてきた。このことは、脱髄した軸索が、新たに合成された髄鞘で修復され得ることを示している。
【０００５】
ニューロンの脱髄は、非常に多くの遺伝性および後天性の上記ＣＮＳおよびＰＮＳの障害において現れている。これら障害としては、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー、副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパチー（ｍｕｌｔｉｆｏｃｕａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＭＭＮ）が挙げられる。これら障害の大多数に関しては、治癒しないかもしくは有効な治療がわずかしかない。
【０００６】
多発性硬化症は、上記中枢神経系の一般的な脱髄疾患である。上記疾患は、代表的には、再発および軽快によって臨床的に特徴付けられ、最終的には、慢性的な障害をもたらす。多発性硬化症のより初期の相は、通常は、ミエリン鞘に対する自己免疫の炎症性の攻撃によって特徴付けられ、麻痺、協調の欠如、感覚障害および視覚障害をもたらす。上記疾患のその後の慢性的な進行相は、代表的には、上記ミエリン鞘の活発な変性および上記脱髄病変の不適切な髄鞘再生（ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）に起因する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００７】
希突起膠細胞は、脱髄障害の主要な標的細胞であり、これら障害からの回復には希突起膠細胞による正常なミエリンの再生が必要であると考えられている。しかし、髄鞘再生は、しばしば、不十分なプロセスであり、このプロセスは、顕著な障害および／もしくは死をもたらす。証拠から、髄鞘再生の主要な細胞機構は、発生的髄鞘形成（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）とは異なり得ることが示唆されている（非特許文献１；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。従って、理解されている髄鞘再生は、ミエリン修復の原因、影響および改善選択肢を同定する重要な局面のうちの１つである。実際に、ＭＳ研究における大きな挑戦は、髄鞘再生失敗の原因を理解すること、およびその結果を改善する方法を考案することである。近年において、いくつかの系統の証拠から、ＭＳにおける脱髄した病変は、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）において欠損しておらず、むしろ、髄鞘再生の失敗は、希突起膠細胞の不十分な再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と関連することが示唆された（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００８】
現在では、髄鞘再生した軸索を同定する能力は、このような軸索のミエリン鞘が、例えば、同定のための電子顕微鏡（ＥＭ）分析の使用を介して、より薄くなる傾向にあるという前提に基づいている。インビボでの髄鞘再生の慣用的な分析には、特に、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ここで上記脱髄および髄鞘再生は、１つの特定の位置に正確に位置させることはできない）のような状況においては、ＥＭ分析は、極端に骨が折れるかつ高価であり得る。
【０００９】
従って、ニューロンの髄鞘再生の分子的基礎の同定および解明を促進するために、神経細胞（例えば、髄鞘形成細胞）の誘導除去（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｂｌａｔｉｏｎ）のための方法およびシステムが未だにかなり必要である。例えば、非免疫ベースの方法を使用して、神経細胞の誘導除去のための方法およびシステムが必要である。動物モデルの使用を介するような方法およびシステムは、髄鞘再生の分子的基礎を解明するために使用され得るのみならず、髄鞘再生を促進するのに有効な生物学的に活性な薬剤を開発するためにも使用され得る。上記動物モデルはまた、脱髄障害の表現型特徴を研究し、これら表現型を逆転する生物学的に活性な薬剤を同定するための大いに必要とされているシステムを提供し得る。本発明は、これら必要性を満たし、関連する利点もまた提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５−７１４（２００２）
【非特許文献２】Ｂｒｕｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献３】Ｃｏｍｐｓｔｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１２２１−１２３１（２００２）
【非特許文献４】Ｂａｌａｂａｎｏｖら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６２−２６４（２００５）
【非特許文献５】Ｆａｒｈａｄｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１０２１４−１０２２３（２００３）
【非特許文献６】Ｒｕｆｆｉｎｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１６７−２１７５（２００４）
【非特許文献７】Ａｒｎｅｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：２１１１−２１１５（２００４）
【非特許文献８】Ｓｔｉｄｗｏｒｈｔｙら，Ｂｒａｉｎ １２７：１９２８−１９４１（２００４）
【非特許文献９】Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６４０４−６４１２（２０００）
【非特許文献１０】Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉら，Ｂｒａｉｎ １２２：２２７９−２２９５（１９９９）
【非特許文献１１】Ｍａｅｄａら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４９：７７６−７８５（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
本発明は、細胞の時間および組織特異的誘導除去のための方法およびシステムを提供する。一局面において、本発明は、第１の異種配列の発現を制御することであり、ここで上記発現は、組織特異的プロモーターによって制御され、発現は、誘導因子の添加によってブロックが解除される（ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ）まで、ブロックされる。このことは、上記組織特異的プロモーターへの転写的接近およびタンパク質（これは、次いで、細胞死を誘導するタンパク質をコードする第２の異種配列の発現を誘導し得る）をコードする第１の異種配列の発現を可能にする。このような協調したシステムは、時間および位置での遺伝子発現の制御を可能にして細胞死をもたらす。一局面において、細胞は、神経細胞（例えば、髄鞘形成細胞）である。非ヒトトランスジェニック動物は、ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで上記第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、上記第１の異種ヌクレオチド配列は、上記動物において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；およびｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで上記第２の異種タンパク質は、上記第１の異種タンパク質の活性化の際に発現され、非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、ここで上記第１の異種タンパク質の初期活性化は、上記動物において上記非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、上記動物において脱髄を生じ、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じ、そして上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質の初期活性化の後に逆転される、第２の異種ヌクレオチド配列を含む、動物である。いくつかの実施形態において、上記動物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される動物）である。例えば、上記動物は、少なくとも約５週齢、約４〜６ヶ月齢、もしくは６ヶ月齢を超えるマウスであり得る。上記非増殖グリア細胞は、上記中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、もしくはその両方に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方の脱髄を生じる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、そのゲノムの中に、グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列（ここで上記第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、上記第１の異種タンパク質の活性は、誘導性である）を含む。上記活性（例えば、組換え）は、外因性薬剤によって誘導され得る。上記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体）であり得る。いくつかの実施形態において、上記改変体は、融合タンパク質（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合物）である。このような実施形態において、上記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログ（例えば、上記融合タンパク質が、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である場合）であり得る。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤は、１回より多く上記動物に投与される。さらに他の実施形態において、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、上記第１の異種タンパク質の活性化の前に、もしくはそれと同時に、もしくはその後に、または上記外因性薬剤の投与後に、上記動物に投与される。上記外因性薬剤、上記ＬＰＳ、もしくはその両方は、例えば、ＣＮＳもしくはＰＮＳに対して、局所にもしくは腹腔内に投与され得る。例えば、上記外因性薬剤、ＬＰＳ、もしくはその両方の局所への投与は、上記脳、視神経、もしくは脊髄に対するものであり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、そのゲノムの中に、グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列を含む。例えば、上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）を含むが、これらに限定されない群より選択される遺伝子のプロモーターであり得る。所望される場合、特定の実施形態において、上記プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰからなる群より選択される遺伝子のプロモーターである。
【００１４】
別の局面において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含み、ここで上記第２の異種タンパク質は、上記第１の異種タンパク質の活性化の際に非増殖グリア細胞の死滅を誘導する。いくつかの実施形態において、上記第２の異種タンパク質は、細胞死を誘導する。上記第２の異種タンパク質は、外毒素（例えば、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット）であり得る。例えば、上記第２の異種タンパク質は、ジフテリア毒素のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）であり得る。上記第２の異種タンパク質は、増殖グリア細胞（例えば、希突起膠細胞前駆細胞もしくは星状細胞）、または非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくは髄鞘形成シュワン細胞）の両方の死滅を誘導し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物における上記非増殖グリア細胞の死滅は、脱髄をもたらし、脱髄状態（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））に特徴的な１種以上の表現型変化を生じる。上記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、もしくはＣＮＳ伝導の低下である。いくつかの実施形態において、上記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイ（例えば、ＤｉｇｉＧａｉｔトレッドミルによる）によって測定され、ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される。
【００１６】
本発明のさらに他の局面において、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化が、上記動物における脱髄（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において）生じた後に逆転される。いくつかの実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質を活性化してから、約３５日間以降に逆転される。さらに他の実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質を活性化してから、約７０日間以降に逆転される。
【００１７】
また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である。上記細胞は、増殖細胞もしくは非増殖細胞であり得る。
【００１８】
本発明はまた、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の逆転を促進する生物学的に活性な薬剤を選択する方法を提供し、上記方法は、ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質を活性化する工程；ｂ）候補薬剤を上記動物に投与する工程；ｃ）上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；およびｄ）上記１種以上の表現型変化が上記候補薬剤を投与しないコントロール動物と比較してより迅速に逆転される場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。脱髄状態（例えば、ＭＳ）に特徴的な１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、もしくはＣＮＳ伝導の低下である。いくつかの実施形態において、上記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって（例えば、ＤｉｇｉＧａｉｔトレッドミルによって）測定され、ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される。
【００１９】
また、髄鞘再生を促進する生物学的に活性な薬剤を選択する方法が本明細書で提供され、上記方法は、：ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質を活性化する工程；ｂ）候補薬剤を上記動物に投与する工程；ｃ）上記動物において髄鞘再生を決定する工程；およびｄ）上記動物が上記候補薬剤を投与しないコントロール非トランスジェニック動物と比較して髄鞘再生の増大を示す場合、上記薬剤を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記髄鞘再生は、髄鞘形成した軸索によって、希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって、もしくはこれらの組み合わせによって特徴付けられる。上記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ対立遺伝子を有するマウスと交配し、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを生じる、ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ対立遺伝子を含むマウスの模式図を示す。ＬｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）領域のＣｒｅ媒介性削除は、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいてタモキシフェンで誘導され、ＤＴＡ発現を生じる。
【図２】図２は、ＰＣＲ結果を図示し、この結果により、図１に示されるプライマーＰ１およびＰ２を使用して、タモキシフェン処置したＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの脳におけるＤＴＡメッセージの発現が確認される。ＤＴＡの誘導発現がない成体ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（コントロール）；およびタモキシフェンによってＤＮＡ発現が誘導された成体ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（それぞれ、ｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１（１回目のタモキシフェン注射（ｄｐｉ）の７日間後、１４日間後、および２１日間後の上記タモキシフェン処置マウスを表す））を示す。
【図３】図３は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスにおける細胞死出現を図示する。（Ａ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞核（矢印）の数の増加が、コントロールと比較して、５ｄｐｉにおいて上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスの脳梁領域において見いだされた。（Ｂ）同じ領域から、カスパーゼ−３の活性型（矢印）について陽性染色された細胞の数の増加が示された。このことは、希突起膠細胞の死滅が、Ｃｒｅ組換えがこれら細胞において生じたすぐあとに起こることを示す。細胞核を、ＤＡＰＩで対比染色した。
【図４】図４は、上記タモキシフェン処置したＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス ２１ｄｐｉのＣＮＳにおける少数の希突起膠細胞を図示する。小脳（上側パネル）および脊髄（下側パネル）におけるＣＣ−１染色は、コントロールマウスと比較して、上記マウス２１ｄｐｉ（ｍｕｔ−Ｄ２１）において低下している。
【図５】図５は、希突起膠細胞の細胞喪失が、２１ｄｐｉまでのタモキシフェン処置マウス ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１（それぞれ、上記タモキシフェン処置マウスの７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、および２１ｄｐｉを示す））の大部分のＣＮＳ領域において最大であることを図示するグラフを示す。
【図６】図６は、コントロールマウスと比較して、７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、もしくは２１ｄｐｉのタモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡにおける希突起膠細胞の細胞喪失より先に起こる（Ａ）Ｐｌｐおよび（Ｂ）ＭｂｐのｍＲＮＡレベルの劇的な低下を図示するグラフを示す。
【図７】図７は、コントロールマウスと比較した、（Ａ）脊髄のトルイジンブルー染色（上側のパネル）および電子顕微鏡検査（ＥＭ，下側のパネル）、ならびに（Ｂ）脳におけるＭＡＧおよびＭＢＰのタンパク質発現によって示されるとおり、ＣＮＳミエリンにおける希突起膠細胞の細胞喪失の影響が、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおいて最小であることを図示する。（Ａ）における矢印は、上記タモキシフェン処置 ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおけるミエリン鞘ラメラの分離によって生成される白質の空胞を指す。
【図８】図８は、７０ｄｐｉまでにタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの（Ａ）脳幹、（Ｂ）小脳、（Ｃ）頚髄灰白質、および（Ｄ）視神経における、ほぼ正常への希突起膠細胞の細胞数が回復したことを図示する。ＣＣ−１陽性細胞の定量化により、希突起膠細胞数が、２１ｄｐｉにおいて、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて有意に低下し、次いで、３５ｄｐｉでは全ての領域において僅かに増加し、７０ｄｐｉでは、いたるところでコントロールに匹敵する値に達したことが示された（ｎ＝４，＊ｐ＜０．０１３，＊＊ｐ＜０．００６，両側ｔ検定）。グラフＡ〜Ｄは、平均値±標準偏差を示す（灰色＝コントロールマウス、黒＝タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス）。
【図９】図９は、図８に図示されるように、希突起膠細胞の細胞数に類似した変化を示す、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（「変異体」）の脳における（Ａ）Ｐｌｐ ｍＲＮＡレベルの発現および（Ｂ）ＭｂｐのｍＲＮＡレベルの発現を図示する。
【図１０】図１０は、コントロールと比較して、ＰＩの２１日間、ＰＩの３５日間、およびＰＩの７０日間においてタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳにおけるミエリン欠損の進行および修復を図示する（ｍｕｔ−Ｄ２１、ｍｕｔ−Ｄ３５、およびｍｕｔ−Ｄ７０（それぞれ、上記タモキシフェン処置マウスの２１、３５、および７０ｄｐｉを表す））。
【図１１】図１１は、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳミエリンにおける損傷が７０ｄｐｉまでに修復されることを図示する。ＤＴＡの誘導発現がないＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（本明細書においてＤＴＡと省略される）（コントロール）；およびタモキシフェンによるＤＴＡ発現が誘導されたＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ＤＴＡ−２１ｄｐｉ、ＤＴＡ−３５ｄｐｉ、およびＤＴＡ−７０ｄｐｉ（それぞれ、１回目のタモキシフェン注射をして２１日間後、３５日間後、および７０日間後の上記タモキシフェン処置マウスを表す））が示される。
【図１２】図１２は、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳにおけるミクログリア活性化の増大を図示する。（Ａ）上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの３５ｄｐｉの小脳（ＣＢ）におけるＣＤ１１ｂマーカーは、脱髄と相関する。（Ｂ〜Ｅ）総ＣＮＳ細胞を、個々の同腹仔コントロールおよび３５ｄｐｉのタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ｎ＝８）の脳および脊髄から単離した。上記細胞を計数し、フローサイトメトリー分析（ＣＤ４５＋細胞の存在について生細胞をゲーティングし、かつＣＤ１１ｂ＋細胞の存在についてＣＤ４５ｌｏ集団に対してＣＤ４５ｈｉをゲーティングする）を介して分析した。代表的同腹仔コントロールマウスからのフロープロット（Ｂ）、およびタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ＤＴＡ）からのフロープロット（Ｃ）を、示す。ＣＤ４５ｈｉ細胞およびＣＤ４５ｌｏ細胞の総数（Ｄ）、ならびにＣＤ４５ｌｏ／ＣＤ１１ｂ＋細胞の総数（Ｅ）を、コントロール 対 ＤＴＡ動物にして示す（データは、１群あたり８匹のマウスの細胞数の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表わした。＊＊ｐ＜０．００１（Ｄ）、＊＊ｐ＜０．００４（Ｅ）。スケールバー：１００μｍ（Ａ））。
【図１３】図１３は、成体希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣｓ）の数が、脳幹および小脳におけるＰＤＧＦＲα陽性細胞によって示されるように、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの３５ｄｐｉにおいて増加することを図示する。
【図１４】図１４は、上記ロータロッド行動アッセイ（これは、上記マウスの運動協調および平衡の評価を提供する）を使用する、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（「変異体」）における運動機能の欠陥およびその後の回復の定量的評価を示す。
【図１５】図１５は、ＣＮＳ伝導特性を測定するために使用される脊髄体性感覚誘発電位（ＳＥＰ）の模式図を示す。ＳＥＰを、足首において脛骨神経を刺激することによって、下部腰椎（Ｌ４−Ｌ５）および中位胸椎（Ｔ５−Ｔ６）の椎骨レベルから記録する。Ｔ５−％６とＬ４−Ｌ５のＳＥＰピーク潜時との間の差異（ΔＬａｔ）を、上記ＣＮＳ伝導性の評価として使用する。
【図１６】図１６は、３５ｄｐｉおよび７０ｄｐｉのコントロールマウスおよびＤＴＡマウスから記録したＳＥＰ波形を図示する。各ＳＥＰ線は、足首における脛骨神経の刺激後に、上記下部腰椎レベルもしくは中位胸椎レベルから記録された２５〜３０の誘発応答の平均を表す。ＳＥＰ誘発は、２１ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて可能でなかった。このことは、上記ＰＮＳおよびＣＮＳの両方に生じているミエリンもしくはニューロンの機能不全におそらく起因する。
【図１７】図１７は、上記ＳＥＰパラメーター（ピーク潜時（Ｌａｔ）およびΔ潜時（ΔＬａｔ，上記Ｔ５〜Ｔ６とＬ４〜Ｌ５のピーク潜時の間の差異）、および振幅（Ａｍｐ））の統計分析を図示する。３５ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて、ピーク潜時は延長し、Δ潜時は増大する一方で、振幅は減少する。このことは、これらマウスのＰＮＳおよびＣＮＳの両方における重度の伝導欠陥を示す。７０〜７７ｄｐｉにおいて、ＤＴＡマウスにおいて観察される振幅は、コントロールに匹敵する値に達するが、３５ｄｐｉの値と比較すると改善したものの、ピーク潜時における軽度の欠陥が残っている。グラフは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。３５ｄｐｉに関しては、ｎ＝７〜８、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００１。７０〜７７ｄｐｉに関しては、ｎ＝６〜７、＊ｐ＜０．０３；＊＊ｐ＜０．００８。
【図１８】図１８は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスの視神経におけるミエリン欠陥および軸索欠陥の定量化を図示する。（Ａ）上記視神経のＥＭ分析から、５６ｄｐｉのＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）において観察可能な広範囲なミエリン喪失は、７０ｄｐｉまでに修復されることが明らかにされ、７０ｄｐｉの時点で、多くの軸索が、薄く髄鞘形成していることが分かった。（Ｂ）髄鞘形成していない軸索の数は、両方の時点で、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）において有意に高かったが、５６ｄｐｉと比較して、７０ｄｐｉにおける髄鞘形成していない軸索は、約７０％低かった（＊＊ｐ＜１．３０×１０−５，ｎ＝３）。（Ｃ）上記視神経における髄鞘形成した軸索のｇ比および軸索直径を比較する線形回帰分析から、コントロール（灰色の点，ｎ＝３）と比較して、７０ｄｐｉのＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）（黒点，ｎ＝３）における軸索の全てのサイズに関して、より薄いミエリンが示された。（Ｄ）ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）の視神経における軸索の総数は、２１ｄｐｉおよび７０ｄｐｉにおけるコントロール値に類似であることが分かった（ｐ＞０．２７，ｎ＝３）。ＢおよびＤのグラフは、平均値±Ｓ．Ｄを示す。スケールバー：２μｍ（Ａ）。
【図１９】図１９は、脱髄状態（例えば、多発性硬化症）および髄鞘再生に特徴的な表現型の進行のタイムラインを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（実施形態の詳細な説明）
本開示全体を通じて、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が、特定している引用によって参照される。これら刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が属する分野の技術分野をさらに記載するために、本開示の中に参考として本明細書によって援用される。
【００２２】
（一般的技術）
本発明の実施は、別段示されなければ、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を使用するが、これら技術は、当該分野の技術範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ら ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）： ＰＣＲ ２： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８） ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（２００３）；Ｂ．Ｃ．Ｃｈｅｎ， ＰＣＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（２０１０）を参照のこと。
【００２３】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が別のことを明らかに示さなければ、複数形への言及を含む。例えば、用語「１つの細胞、ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞（その混合物を含む）を含む。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログ）のポリマー形態に言及する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、任意の機能（既知もしくは未知）を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのコード領域もしくは非コード領域、連鎖分析から規定される複数の遺伝子座（単数の遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。存在する場合、上記ヌクレオチド構造物に対する改変は、上記ポリマーのアセンブリ前もしくはアセンブリ後に付与され得る。上記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に（例えば、標識成分との結合体化によって）さらに改変され得る。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において交換可能に使用され、それは、任意の長さのアミノ酸のポリマーに言及する。上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよいし、改変アミノ酸を含んでいてもよいし、そして非アミノ酸によって中断されていてもよい。上記用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作（例えば、標識成分との結合体化）。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸（グリシン、およびＤ光学異性体もしくはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む）のいずれかに言及する。
【００２６】
用語「異種」とは、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。用語「異種」とは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに適用される場合、それが比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に、上記ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが由来することを意味する。例えば、ヌクレオチド配列もしくはタンパク質に適用される場合、それが比較される実体の残りのものとは遺伝子型的が異なる実体に、上記ヌクレオチド配列もしくはタンパク質が由来することを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセスおよび／または上記転写されたｍＲＮＡ（「転写物」ともいわれる）がその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスに言及する。上記転写物および上記コードされるポリペプチドは、まとめて「遺伝子生成物」といわれる。上記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞における上記ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００２８】
用語「髄鞘再生している」もしくは「髄鞘再生」とは、髄鞘形成を修復するもしくは発生的でない髄鞘形成を修復することに言及する。
【００２９】
「被験体」、「個体」もしくは「患者」は、本明細書において交換可能に使用され、これらは、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに言及する。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用の動物、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。インビボで得られた生物学的実体もしくはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫もまた、包含される。
【００３０】
本明細書に記載される動物モデルもしくは細胞培養アッセイにおいて使用される「生物学的に活性な薬剤」とは、生物学的もしくは化学的な化合物（例えば、単純なもしくは複雑な有機もしくは無機の分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、もしくはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス））からなる群より選択され得る。さらに、複雑な有機もしくは無機の分子を含むこのような薬剤は、化合物の不均質混合物（例えば、粗製のもしくは精製した植物抽出物）を含み得る。
【００３１】
「プロモーターエレメント」とは、このような配列に連結される遺伝子の転写を促進する調節配列である。上記調節配列は、エンハンサー配列もしくはその機能的部分を含み得る。
【００３２】
「コントロール」とは、比較目的で実験に使用される補助的な被験体、細胞もしくはサンプルである。
【００３３】
「ｌｏｘＰに挟まれた」ＤＮＡ領域とは、２個のｌｏｘ部位（改変体ｌｏｘ部位を含む）が隣り合っているＤＮＡの領域に言及し、上記ＤＮＡ領域は、転写終結因子（例えば、停止シグナル）を含む。上記ＤＮＡ領域は、代表的には、遺伝子を含む。例えば、上記「ｌｏｘＰに挟まれた」ＤＮＡは、マーカー（例えば、ｅＧＦＰ）であり得る。
【００３４】
「停止信号構築物（ｓｔｏｐｌｉｇｈｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、ｌｏｘＰに挟まれ、第２の遺伝子にさらに作動可能に連結された第１の遺伝子を含む遺伝子構築物に言及する。上記「停止信号構築物」は、「停止信号カセット」とも言及され得、必要に応じて、プロモーター配列に作動可能に連結され得る。従って、上記第１のｌｏｘＰに挟まれた遺伝子がリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）媒介性組換えを介して除去される場合、上記第２の遺伝子は、発現される。例えば、上記第１のｌｏｘＰに挟まれた遺伝子は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の遺伝子に作動可能に連結された蛍光マーカータンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）であり得る。上記第２の遺伝子（例えば、ＤＴＡ）の発現は、上記第１の領域および停止シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域が原因で阻害される。上記ｌｏｘＰに挟まれたｅＧＦＰおよび停止シグナルが組換えを介して除去される場合、上記第２の遺伝子であるＤＴＡは、転写され発現され得る。
【００３５】
「脱髄状態に特徴的な表現型」とは、軸索の分析も、髄鞘形成細胞の分析も、他の分子の分析や細胞の分析（例えば、軸索の電子顕微鏡検査、免疫組織化学、または神経細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の遺伝子発現もしくはタンパク質発現を決定すること）もなしで確認し得る、脱髄状態に特徴的な表現型に言及する。例えば、脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導における低下であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。
【００３６】
（トランスジェニック動物）
本発明は、神経細胞の誘導除去のための方法およびシステムを提供する。上記モデルシステムは、髄鞘再生の機構の解明、ならびに髄鞘再生を促進するための治療的ストラテジーの開発において有用である。一局面において、上記システムもしくは動物モデルは、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る非ヒトトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態において、非増殖グリア細胞の特異的除去は、上記動物において脱髄を生じる。
【００３７】
脱髄は、神経系（例えば、中枢神経系もしくは末梢神経系）における髄鞘形成された軸索の減少によって、または髄鞘形成細胞のマーカーのレベルの低下によって、特徴付けられ得る。本明細書で使用される場合、髄鞘形成細胞とは、上記神経系において軸索を絶縁するミエリンを生成し得る細胞をいう。例示的な髄鞘形成細胞は、中枢神経系においてミエリンの生成を担う希突起膠細胞、および末梢神経系においてミエリンの生成を担うシュワン細胞である。形態的には、ニューロンの脱髄は、上記中枢神経系における希突起膠細胞もしくは上記末梢神経系におけるシュワン細胞の喪失によって特徴付けられ得る。ニューロンの脱髄はまた、上記神経系における髄鞘形成された軸索の減少によって、または希突起膠細胞もしくはシュワン細胞、ＣＣ１、マーカーのレベルの低下によって決定され得る。希突起膠細胞もしくはシュワン細胞の例示的なマーカータンパク質としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本発明の方法によって同定される候補薬剤は、ニューロンの脱髄の有害な形態的特性を阻害し得る物質を包含する。
【００３８】
脱髄はまた、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示す動物によって特徴付けられ得る。脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導の減少であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型変化としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。
【００３９】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し得、ここで上記１種以上の表現型変化が逆転される。例えば、上記非増殖グリア細胞の選択的除去の誘導後に、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し、そして上記動物は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化の逆転を示し得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、ここで上記動物が、野生型動物、もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すようには誘導されない動物が示す表現型を示すように、上記動物は脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化から回復する。他の実施形態において、表現型の逆転とは、上記表現型が改善する場合のことである。例えば、時点Ａにおいて、動物が、振せんを示し始める；時点Ｂにおいて、上記動物は、振せんが増大している；そして時点Ｃにおいて、上記動物は、時点Ａと同様な表現型を示し、時点Ｂと比較すると、表現型が改善している。別の例において、表現型の逆転は、機能（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導）の完全な喪失が存在する場合のことであって、逆転とは機能の獲得（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導の獲得）のことであり得る。上記獲得は、機能におけるわずかな改善であり得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物と同じレベルへの完全な機能の再獲得であり得る。
【００４０】
非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る上記非ヒトトランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質をコードする第１の異種ヌクレオチド配列および第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含む。上記第１の異種タンパク質の活性（例えば、その発現および転写事象の調節）は、誘導性であり得る。上記第１の異種タンパク質の活性のこの誘導はまた、本明細書において、このようなタンパク質の「活性化」といわれる。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼであり、その組換え活性は、誘導性である。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼであり、これは、同族認識配列、ｌｏｘＰ配列（すなわち、ｌｏｘＰ部位）を認識する。認識配列は、当該分野で公知であり、タンパク質分子、ＤＮＡ分子、もしくはＲＮＡ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、もしくはリコンビナーゼ）が、認識および結合する特定のＤＮＡ配列を表す。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接している２個の１３塩基対の逆方向反復（上記リコンビナーゼ結合部位として働く）から構成される３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと）。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２個の９塩基対のコアタイプＩｎｔ結合部位および７塩基対の重複領域を含む約２５塩基対配列である。ａｔｔＰは、コアタイプＩｎｔ結合部位およびアームタイプＩｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質であるＩＨＦ、ＦＩＳ、およびＸｉｓのための部位を含む約２４０塩基対の配列である（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）。このような部位はまた、当該分野で公知の方法および生成物（例えば、Ｈａｒｔｌｅｙら，米国特許出願公開第２００６００３５２６９号による開示で開示される）を利用する組換えを高めるために、本発明に従って操作され得る。
【００４１】
上記Ｃｒｅリコンビナーゼは、野生型であっても上記野生型の改変体であってもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｃｒｅリコンビナーゼの活性は、上記トランスジェニック動物（もしくはトランスジェニック細胞）において誘導性である。改変体Ｃｒｅリコンビナーゼは、組換え部位に対して広い特異性を有する。具体的には、上記改変体は、上記ｌｏｘＰ配列以外の配列と、野生型Ｃｒｅリコンビナーゼが活性である他のｌｏｘ部位配列との間の組換えを媒介する。一般に、上記開示されるＣｒｅ改変体は、野生型Ｃｒｅが作用し得るｌｏｘ部位（野生型ｌｏｘ部位といわれる）の間、野生型Ｃｒｅによっては効率的に利用されない改変体ｌｏｘ部位（改変体ｌｏｘ部位といわれる）の間、および野生型ｌｏｘ部位と改変体ｌｏｘ部位との間での効率的な組換えを媒介する。例えば、上記Ｃｒｅ改変体は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（もしくは他の類似のリコンビナーゼ（例えば、ＦＬＰ））が使用され得る任意の方法もしくは技術において使用され得る。さらに、上記Ｃｒｅ改変体は、異なる代替の組換えが行われることを可能にする。なぜなら、上記Ｃｒｅ改変体は、野生型ｌｏｘ部位と改変体ｌｏｘ部位との間の遙かにより効率的な組換えを可能にするからである。このような代替の組換えの制御は、異なる逐次的組換えを達成して、野生型Ｃｒｅリコンビナーゼで可能ではない結果を達成するために使用され得る。改変体Ｃｒｅリコンビナーゼは、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，８９０，７２６号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）の開示において開示される）。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、外因性薬剤によって誘導される場合に活性であるように操作されるリコンビナーゼをコードする。Ｃｒｅ活性の誘導性は、制御され得る。いくつかの実施形態において、上記Ｃｒｅタンパク質は、上記Ｃｒｅリコンビナーゼと、プロゲステロンレセプター（例えば、Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：１７５−１８２（１９９９））もしくはエストロゲンレセプター（例えば、Ｆｅｉｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０８８７−１０８９０（１９９６）；Ｆｅｉｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７（１９９７））のリガンド結合ドメインの変異したバージョンとの融合物であり得、上記活性は、外因性薬剤によって誘導され得る。例えば、後者の融合物は、上記Ｃｒｅ融合物（ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）を生じ、ここで上記組換え活性は、上記Ｃｒｅタンパク質の局在化を通じてリガンドによって制御される。リガンドの非存在下で、ＣｒｅＥＲＴ（もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、細胞質性である。しかし、合成ステロイドホルモン（タモキシフェンもしくはその改変体またはアナログ（例えば、４−ヒドロキシ（ＯＨ）−タモキシフェン））の投与後に、上記ＣｒｅＥＲＴ（もしくはＣｒｅＥＲＴ２）タンパク質は、該タンパク質が機能する核内に移行する（すなわち、タモキシフェン誘導性）。他の実施形態において、他の誘導性システムが使用され得る（例えば、Ｔｅｔ−ＯｎおよびＴｅｔ−Ｏｆｆシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）発現系（ここで誘導は、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）の添加を介して起こる））。
【００４３】
上記第１の異種配列は、上記非ヒトトランスジェニック動物において安定して発現され得る。例えば、上記第１の異種配列は、上記トランスジェニック動物のゲノムへと（例えば、内因性プロモーターに対する制御下にあることによって）組み込まれるリコンビナーゼをコードする。上記第１の異種配列は、グリア細胞特異的プロモーター（例えば、内因性グリア細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結され得る。上記プロモーターは、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現される遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現される遺伝子に対するものであり得る。上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、増殖希突起膠細胞前駆体に特異的なプロモーター（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα）、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｇｅｎｅ）（ＧＦＡＰ））、またはニューロンに特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）に作動可能に連結され得る。従って、上記第１の異種タンパク質（例えば、リコンビナーゼ）の発現および活性は、細胞特異的であり得る。
【００４４】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物において、上記第１の異種タンパク質の活性は、例えば、停止シグナルを除去し、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素）の発現を可能にするように組換えを誘導することによって、上記第２の異種タンパク質の発現を誘導し得る。次いで、上記第２の異種タンパク質（もしくは毒素）の発現は、細胞死を誘導し得る。上記第１の異種タンパク質（例えば、リコンビナーゼ）の発現および活性は細胞特異的であり得るので、上記第１の異種タンパク質の活性は、細胞特異的様式において上記第２の異種タンパク質の発現を誘導し得る。例えば、上記第２の異種配列は、上記第２の異種タンパク質（これは、細胞死を誘導する）をコードし得、その発現および得られた細胞死は、細胞タイプ特異的であり得る。例えば、上記第２の異種タンパク質の発現は、神経細胞（例えば、グリア細胞）において特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種タンパク質の発現は、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくは星状細胞の上記細胞特異的死滅、もしくは細胞特異的除去を誘導し得る。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、非増殖グリア細胞（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方における）であり、ここで上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において脱髄を生じる。
【００４５】
記載されるように、上記第２の異種配列は、毒素もしくは外毒素をコードし得る。例えば、上記毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット（例えば、そのＡサブユニット）であり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列の発現は、転写に対する終結シグナルもしくは停止シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた上流領域が原因で抑制される。従って、上記停止シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた上流領域が、例えば、組換え（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、上記第１の異種配列によってコードされ、外因性薬剤によって活性化されるＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）によって除去される場合、上記第２の異種配列は、転写され得、上記タンパク質が発現され得る。
【００４６】
別の実施形態において、同じ異種配列が、毒素もしくは外毒素をコードし、細胞特異的プロモーターを含む。例えば、上記毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット（例えば、そのＡサブユニット）であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ｐｄｕａｌ発現ベクター系（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）におけるように、ブロックされているが、誘導因子の添加の後にいったん放出される上流のエンハンサー領域を含み、毒素もしくは外毒素をコードする上記異種配列を発現する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は、１種以上のマーカー（例えば、蛍光タンパク質マーカーもしくは薬物耐性マーカー）を含む。本発明において使用され得るマーカー遺伝子の非網羅的な例としては、造礁サンゴ蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ１、クラゲ蛍光タンパク質（ＦＰ）改変体、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ変異体Ｈ９、ＧＦＰ Ｈ９−４０、ｅＧＦＰ、テトラメチルローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、テキサスレッド、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｋａｅｄｅ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｄｏｒｉ Ｃｙａｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅおよびナフトフルオレセイン、もしくはこれらの増強された機能改変体が挙げられる。蛍光団タンパク質マーカーをコードする多くの遺伝子が、当該分野で公知であり、これらは、本明細書中で使用することができる（例えば、ウェブサイト：＜ｃｇｒ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｈｏｒｎｌａｂ／ｇｆｐｓ．ｈｔｍ＞を参照のこと）。より高い強度の光を発するかもしくは波長シフトを示す蛍光タンパク質の変異バージョンはまた、本発明の組成物および方法において利用され得る；このような改変体は、当該分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，２００５を参照のこと）。
【００４８】
さらに他の実施形態において、上記毒素をコードする上記第２の異種配列は、グリア細胞特異的プロモーター（例えば、内因性グリア細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結される。上記プロモーターは、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現されている遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現されている遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列は、増殖希突起膠細胞前駆体に対して特異的なプロモーター（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα））、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ＧＦＡＰ））、もしくはニューロンに特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）に作動可能に連結される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列は、停止信号カセット（例えば、図１に示される）の成分であり、ここで上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は、ｅＧＦＰを含み、上記第２の異種配列は、ＤＴＡをコードする。上記停止信号カセットは、トランスジェニックマウスのゲノムへと（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座へと）安定に組み込まれ得る（例えば、図１を参照のこと）。第１の異種ヌクレオチド配列および第２の異種ヌクレオチド配列をそのゲノムの中に含むトランスジェニック動物は、上記第１の異種配列を含む第１の動物を上記第２の異種配列（例えば、図１に示される）を含む第２の動物と交配することによって、作製され得る。ＲＯＳＡ２６遺伝子座へと組み込まれたＤＴＡの上流でｌｏｘＰに挟まれたｅＧＦＰを有する停止信号カセットを含む（ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ）トランスジェニック動物を、内因性ＰＬＰプロモーターの制御下にＣｒｅＥＲＴを含むトランスジェニック動物（ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ）と交配する。このことから、上記停止信号カセットおよび上記内因性ＰＬＰプロモーターの制御下にあるＣｒｅＥＲＴを含む動物（ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ）が生じ得る。ＤＴＡは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域としては発現されない。しかし、タモキシフェンで処置されると、ＣｒｅＥＲＴは活性化され、上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は組換えられ、上記転写終結シグナルが除去され、ＤＴＡが、転写および発現され得る。さらに、ＣｒｅＥＲＴ活性は、誘導性であるので、ＤＴＡ発現は、時間制御様式で、ならびに細胞特異的様式でもたらされ得、特異的な細胞タイプの特異的除去、もしくは細胞死を生じる。例えば、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて、上記マウスがタモキシフェンで処置される場合、ＰＬＰ発現細胞の特異的除去が存在する。上記除去のタイミングは、上記タモキシフェンの投与を介して制御され得る。
【００５０】
上記トランスジェニック動物（例えば、上記ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ動物および上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ動物）は、当該分野で公知の遺伝子標的化技術を利用して設計され得る（例えば、Ｉｖａｎｏｖａら，Ｇｅｎｅｓｉｓ，４３：１２９−１３５（２００５）；Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅｓｉｓ ３５：６３−７２（２００３）を参照のこと）。遺伝子標的化は、標的化された内因性配列と相同な外因性ＤＮＡ配列との相同組換えによって、染色体遺伝子座の指向された改変を表す。遺伝子標的化の異なるタイプの間で区別が行われる。従って、遺伝子標的化は、１または数個の内因性遺伝子の発現を改変する（通常は増大させる）か、または外因性遺伝子によって内因性遺伝子を置換するか、または外因性遺伝子を、活性なままである上記特定の内因性遺伝子の遺伝子発現を調節するエレメントの制御下に配置するために、使用され得る。この場合、遺伝子標的化は、「ノックイン」（ＫＩ）といわれる。あるいは、遺伝子標的化は、１または数個の遺伝子の発現を低下もしくは除去するために使用され得、このタイプの遺伝子標的化は、「ノックアウト」（ＫＯ）もしくは「ノックダウン」（ＫＤ）といわれる（例えば、Ｂｏｌｋｅｙら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：１９９−２２５（１９８９）を参照のこと）。
【００５１】
本発明に従うトランスジェニック細胞を生成する方法は、当業者に周知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術が、記載されてきた（Ｇｏｒｄｏｎ．，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９））。例えば、本明細書で開示され、上記トランスジェニック動物を生成するために使用される導入遺伝子は、直線状もしくは非直線状のベクターに、またはベクターフラグメントの形態で含まれ得、標準的な方法（例えば、核へのマイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、リン酸カルシウムを用いた沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））、熱ショック、カチオン性ポリマー（ＰＥＧ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストランなど）での形質転換、ウイルス感染（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，６１４８−６１５２（１９８５））、精子（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９）））によって、宿主細胞へと導入され得る。
【００５２】
トランスジェニック動物は、哺乳動物の接合子の前核（例えば、雄性前核）へ遺伝子構築物を挿入することによって操作され得、これにより、安定なゲノム組み込みが天然に生じることを可能にする。次いで、上記接合子は、受容する子宮へと移され得、満期まで生育が可能となる。マウスが使用され得るものの、他の種（例えば、ラット、ウサギおよび他の非ヒト動物）もまた、前核挿入のための潜在的な候補である。上記接合子をトランスジェニックにする上記遺伝子構築物は、利用されるべき内因性遺伝子（例えば、ＰＤＧＦαレセプター遺伝子）を標的とする遺伝子構築物を含み、この遺伝子は、変異され得、そして／もしくは所望のエレメント（例えば、外因性プロモーター／エンハンサーエレメントおよび／もしくは目的の遺伝子）を含むようにさらに改変され得る。
【００５３】
異種ＤＮＡはまた、同様に、受精した哺乳動物の卵子へと導入され得る。例えば、全能性もしくは多能性幹細胞は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介性沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染もしくは他の手段によって、形質転換され得る。次いで、上記形質転換された細胞は、胚へと導入され、次いで、上記胚は、トランスジェニック動物へと発生する。一実施形態において、発生中の胚は、所望の導入遺伝子を含むウイルスベクターに感染させられ、その結果、上記導入遺伝子を発現する上記トランスジェニック動物が、上記感染した胚から作られ得る。別の実施形態において、所望の導入遺伝子は、好ましくは、単一の細胞ステージにおいて、上記胚の前核もしくは細胞質に同時に注入され、上記胚は、成熟したトランスジェニック動物へと発生することが可能となる。トランスジェニック動物を作るためのこれらおよび他の変形方法は、当該分野で十分に確立されており、よって、本明細書で詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および同第５，１７５，３８４号を参照のこと。
【００５４】
本明細書で開示される発明の１つ以上の局面において、所望の導入遺伝子は、単一コピーとしてもしくはコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）（例えば、ヘッドトゥーヘッドタンデムもしくはヘッドトゥーテールタンデム）で組み込まれ得る。上記所望の導入遺伝子はまた、特定の組織もしくは細胞タイプ（好ましくは、上記中枢神経系内の細胞）へと選択的に導入され得、活性化され得る。このような細胞タイプ特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞タイプに依存し、それは当業者に明らかである。好ましくは、上記標的とされる細胞タイプは、上記神経系（上記中枢神経系および末梢神経系を含む）に位置する。
【００５５】
上記のように、トランスジェニック動物は、２つのタイプに大きく分けられ得る：「ノックアウト」および「ノックイン」。「ノックアウト」は、上記標的遺伝子の機能の低下を生じる導入遺伝子配列の導入を介して、好ましくは、標的遺伝子発現が、微々たるものであるかもしくは検出不能であるように、上記標的遺伝子において改変を有する。「ノックイン」は、例えば、上記標的遺伝子のさらなるコピーの導入によって、もしくは上記標的遺伝子の内因性コピーの発現の増大を提供する調節配列を作動的に挿入することによって、標的遺伝子の発現の増大をもたらす宿主細胞ゲノムにおける改変を有するトランスジェニック動物である。上記ノックイントランスジェニック動物もしくはノックアウトトランスジェニック動物は、上記標的遺伝子に対してヘテロ接合性であってもよいし、ホモ接合性であってもよい。ノックアウトおよびノックインの両方が、「バイジェニック（ｂｉｇｅｎｉｃ）」であり得る。バイジェニック動物は、少なくとも２つの改変されている宿主細胞遺伝子を有する。あるバイジェニック動物は、神経細胞特異的リコンビナーゼをコードする導入遺伝子および神経細胞特異的マーカー遺伝子をコードする別の導入遺伝子配列を有する。本発明のトランスジェニック動物は、大きく、ノックインとして分類され得る。
【００５６】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物としては、哺乳動物（例えば、霊長類および齧歯類）が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例としては、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラマ、およびサルが挙げられる。一実施形態において、上記動物は齧歯類である。さらに別の実施形態において、上記動物はマウス（例えば、若年もしくは老年のマウス）である。例えば、上記マウスは、少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢であり得る。上記マウスは、約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、少なくとも約４〜６週齢のマウスである。いくつかの実施形態において、上記マウスは、成体であり、６ヶ月齢より加齢している。いくつかの実施形態において、上記マウスは、加齢マウスもしくは老齢マウスである。上記マウスは、少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、約５〜７ヶ月例の間、６〜９ヶ月齢の間もしくは９〜１２ヶ月齢の間である。別の実施形態において、上記動物は、サル種に由来する。さらに別の実施形態において、上記動物は、マーモセットのサルであり、これは、神経疾患を試験することにおいて利用され得る（例えば、Ｅｓｌａｍｂｏｉ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６８：１４０−１４９（２００５）；Ｋｉｒｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：２８８４−２８８９（２００４））。本明細書で開示されるトランスジェニック動物としてはまた、非哺乳動物（例えば、魚類、鳥類、および昆虫類）が挙げられ得るが、これらに限定されない。非限定的な例としては、ゼブラフィッシュ、ニワトリおよびハエが挙げられる。
【００５７】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、髄鞘再生をアッセイするにあたって利用され得るシステムを提供する。このようなモデル系は、髄鞘再生の機構の解明への洞察、ならびに髄鞘再生を促進するための治療ストラテジーの開発を提供する。上記のように、上記トランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質（これは、続いて、細胞死を誘導する第２の異種タンパク質の発現を誘導する）の活性化を誘導することによって、細胞特異的様式で細胞を除去するように時間的に制御され得る。上記細胞死は、上記第１の異種タンパク質の発現が、細胞タイプ特異的プロモーターもしくは調節配列（特に、上記中枢神経系もしくは末梢神経系における発現に利用可能であるもの）の制御下にあり得るので、細胞タイプ特異的であり得る。
【００５８】
例えば、上記第１の異種タンパク質の発現は、神経細胞タイプ特異的プロモーターの制御下にあり得る（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号に開示される）；ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞もまた参照のこと。上記転写調節配列としては、以下のタンパク質をコードする遺伝子から選択される転写調節配列が挙げられるが、これらに限定されない：上記ＰＤＧＦＲα、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、上記グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）および微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、Ｔｈｙ１．２、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＢＳＦ１、ドパミン３−ヒドロキシラーゼ、セロトニン２レセプター、コリン・アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ならびにスルファチド。
【００５９】
いくつかの実施形態において、上記調節配列もしくはプロモーターは、グリア細胞（例えば、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）に対して特異的である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現されるかもしくは特異的に発現される遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現されるかもしくは特異的に発現される遺伝子に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターもしくは調節配列は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰに対するものである。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、増殖希突起膠細胞前駆体に対して特異的な遺伝子（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα）に対するもの、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｇｅｎｅ）（ＧＦＡＰ））、もしくはニューロンに対して特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）をコードし、前述のプロモーターもしくは調節配列の制御下にある。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記調節配列は、発現を高める（すなわち、プロモーター強度を増大させる）ように変化させられ得るかもしくは改変され得る。例えば、エンハンサー機能を含むイントロン配列は、プロモーター機能を増大させるために利用され得る。上記ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子は、エンハンサーエレメントとして機能するイントロン配列を包含する。この調節エレメント／領域ＡＳＥ（アンチサイレンサー／エンハンサーの）は、エキソン１ ＤＮＡの約１ｋｂ下流に位置し、ほぼ１００ｂｐを包含する。Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８２：３４６−３５６（２００５）を参照のこと。
【００６２】
よって、上記第１の異種タンパク質（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２））は、特異的細胞タイプにおいて発現および活性化され得、同じ特異的細胞タイプにおいて、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素）の発現を誘導し得る。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、希突起膠細胞特異的プロモーターもしくは調節配列の制御下もしくは調節下にあることによって、希突起膠細胞において発現される。上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂａｉｎｓｅ）が、タモキシフェンによって活性化される場合、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素（例えば、ＤＴＡ））の発現は、希突起膠細胞において誘導される。次いで、上記毒素は、上記希突起膠細胞の細胞死を促進し得る。あるいは、上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、シュワン細胞特異的プロモーターもしくは調節配列の制御下もしくは調節下にあることによって、シュワン細胞において発現され得る。上記Ｃｒｅリコンビナーゼは、タモキシフェンによって活性化され得、これは、シュワン細胞において上記毒素の発現を誘導し、上記シュワン細胞の細胞死を引き起こす。上記髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくはその両方）の細胞死は、上記動物のＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において、脱髄を生じ得る。
【００６３】
上記第１の異種タンパク質はまた、時間的様式で活性化され得、従って、得られた除去もしくは細胞死は、時間的に制御され得る。例えば、上記第１の異種タンパク質は、非増殖細胞（例えば、成熟したもしくは分化した、神経細胞）において活性化され得る。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質の活性化は、成熟した、もしくは増殖していない、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方の細胞にあり、上記第２の異種タンパク質の発現およびその後の、上記成熟したもしくは非増殖細胞の細胞死を生じる。いくつかの実施形態において、上記除去は、非増殖髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の除去である。上記活性化は、外因性薬剤（例えば、上記第１の異種タンパク質を活性化する上記外因性薬剤の投与）によって時間的に制御され得る。上記外因性薬剤は、上記グリア細胞が、増殖ステージもしくは非増殖ステージにある場合に、上記動物へと投与され得る。例えば、上記外因性薬剤は、上記シュワン細胞もしくは希突起膠細胞が、増殖ステージにある場合に、上記動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤は、上記シュワン細胞もしくは希突起膠細胞が、成熟したもしくは増殖していない場合に、上記動物に投与される。例えば、マウスにおいて、上記外因性薬剤は、上記マウスが、少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢である場合に、投与される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが、約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間である場合に、上記外因性薬剤で処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である。さらに他の実施形態において、上記マウスは、少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、約５〜７ヶ月齢の間、６〜９ヶ月齢の間、もしくは９〜１２ヶ月齢の間である。
【００６４】
一局面において、本発明は、第１の異種配列の発現を制御することであり、ここで上記発現は、組織特異的プロモーターによって制御され、発現は、誘導因子の添加によって解除されるまでブロックされており、これにより、上記組織特異的プロモーターへの転写的アクセスが可能となり、そして細胞死を誘導するタンパク質をコードする第２の異種配列の発現を誘導し得るタンパク質をコードする第１の異種配列の発現が可能となる。このような協調したシステムは、細胞死をもたらす遺伝子発現の時間および位置の制御を可能にする。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列を含み、これは、内因性の細胞特異的プロモーターの制御下にある。上記動物は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列をさらに含み、これは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にある。上記動物は、希突起膠細胞においてＣｒｅＥＲＴを発現するが、理論に縛られずに、上記ＣｒｅＥＲＴは、上記核内へ移行すること、および組換えを実行することができない。結果として、上記動物は、ＤＴＡを発現しない。しかし、タモキシフェンで処置すると、ＣｒｅＥＲＴが活性化され、上記転写終結シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は除去され、ＤＴＡが、転写および発現され得、このことから、細胞死が誘導される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、内因性グリア細胞特異的プロモーター（例えば、ＰＬＰ）の制御下にある誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列を含む。上記動物は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列をさらに含み、これは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にある。上記動物は、希突起膠細胞においてＣｒｅＥＲＴを発現するが、理論に縛られずに、上記ＣｒｅＥＲＴは、上記核内へ移行すること、および組換えを実行することができない。結果として、上記動物は、ＤＴＡを発現しない。しかし、タモキシフェンで処置すると、ＣｒｅＥＲＴが活性化され、上記転写終結シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は除去され、ＤＴＡは、転写および発現され得る。これにより、上記ＣｒｅＥＲＴを発現する細胞（例えば、希突起膠細胞）において細胞死が誘導される。
【００６７】
従って、タモキシフェンでの処置は、上記希突起膠細胞の除去のタイミングを調節するために、時間的に制御され得る。上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記動物の発生のそのいずれかのステージにおいて、上記動物に投与され得る。上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、１回もしくは１回より多く、発生の１つ以上のステージにおいて、上記動物に投与され得る。例えば、上記タモキシフェンは、上記グリア細胞が成熟している場合（例えば、上記希突起膠細胞もしくはシュワン細胞が成熟しているかもしくは増殖していない場合）に上記動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記マウスが少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢である場合に、投与される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが少なくとも約６ヶ月齢である場合にタモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。さらに他の実施形態において、上記マウスは、上記マウスが少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが約５〜７ヶ月齢の間、６〜９ヶ月齢の間もしくは９〜１２ヶ月齢の間である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記マウスが成体マウスである場合に投与される。
【００６８】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物におけるグリア細胞（例えば、非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞））の除去もしくは細胞死は、上記動物において脱髄を生じ得る。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、生きたままである。いくつかの実施形態において、上記脱髄は、上記動物において脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じる。いくつかの実施形態において、上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化は、逆転される。本明細書に記載されるように、脱髄状態に特徴的な表現型は、軸索の分析も、髄鞘形成細胞の分析も、他の分子分析もしくは細胞分析（例えば、軸索の電子顕微鏡検査または神経細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の遺伝子発現の決定）もなく確認され得る、脱髄状態に特徴的な表現型に言及する。例えば、脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導の低下であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、死滅、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。上記表現型は、以下からなる群より選択される脱髄障害に特徴的であり得る：進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｎｔｉｎｅ ｍｙｅｌｏｌｙｓｉｓ）（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー：副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパチー（ｍｕｌｔｉｆｏｃｕａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＭＭＮ）、アルツハイマー病もしくは進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される動物（例えば、マウス）は、マウスのグリア細胞（好ましくは、成熟したもしくは非増殖グリア細胞（例えば、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくはその両方）において特異的に発現されている上記誘導性Ｃｒｅが最初に活性化された後に、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示す。いくつかの実施形態において、上記動物は、上記最初の活性化および上記１種以上の表現型変化を示した後に、これら表現型変化のうちの１種以上の逆転をさらに示す。例えば、髄鞘形成細胞において誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しかつＤＴＡをコードする異種配列をさらに含み、ｌｏｘＰに挟まれた終結シグナルがＤＴＡをコードする上記配列の上流にある動物において、上記動物は、タモキシフェンで処置され、このタモキシフェンは、上記髄鞘形成細胞が細胞死を受けるように誘導する。上記動物は、脱髄（例えば、ミエリン鞘変性および識別可能な白質に富む領域における空砲形成）を示す。さらに、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化（例えば、運動制御の低下、平衡の低下、ＣＮＳ伝導の低下、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせ）を示し、これら変化は、コントロール動物（例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、タモキシフェンの投与もタモキシフェンでの処置もされていない動物）と比較され得る。所定の期間の後に、上記動物は、上記１種以上の表現型の逆転（例えば、運動制御の増大、平衡の増大、ＣＮＳ伝導の改善、不安定歩行の低下、後肢麻痺の低下、振せんの低下、体重増加、失調の低下、もしくはその任意の組み合わせ）を示す。
【００７０】
いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、ここで上記動物は、上記動物が、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物）が示す表現型を示すように、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化から回復する。他の実施形態において、表現型の逆転は、上記表現型が改善する場合のことである。例えば、時点Ａにおいて、動物は振せんを示し始める；時点Ｂにおいて、上記動物は、振せんが増大している；そして時点Ｃにおいて、上記動物は、時点Ａのときの表現型と類似の表現型を示すが、時点Ａのときの表現型は、時点Ｃと比較すると、より良好な表現型である。別の例において、表現型の逆転は、機能（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導）の完全な喪失がある場合のことであり得、逆転とは機能の獲得（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導の獲得）のことである。上記獲得は、機能における僅かな改善であり得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な機能を（例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物と同じレベルの機能へと）再獲得することであり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、上記動物は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約１４日間以降、約２１日間以降、約３５日間以降、約４０日間以降、約４２日間以降、約４５日間以降、約４８日間以降、約５０日間以降、約５５日間以降、約６０日間以降、約６５日間以降、約７０日間以降、約７５日間以降、約８０日間以降、もしくは約９０日間以降に、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転を示す。いくつかの実施形態において、上記動物は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してから）約３５日間以降、もしくは約７０日間以降に、脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す。他の実施形態において、上記逆転は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）の約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後に始まる。他の実施形態において、上記逆転は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化後（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後もしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤の投与後）の約２〜１２週間の間、約３〜１２週間の間、約４〜１２週間の間、約５〜１２週間の間、約５〜１１週間の間、もしくは約６〜１１週間の間に始まる。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、上記動物は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化から回復し、その結果、上記動物が、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すようには誘導されない動物が示す表現型を示す。他の実施形態において、表現型の逆転は、上記表現型が改善する場合のことである。
【００７２】
一実施形態において、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型（例えば、ロータロッドアッセイに基づく平衡の低下もしくは運動制御の低下）を示すマウスは、タモキシフェンの投与後約４２日間で上記表現型における逆転を示す（例えば、図１４を参照のこと）。ここで上記逆転は、コントロール動物の運動制御までの改善とはいかずとも、運動制御の改善が本質的になしから、運動制御の一部獲得までの改善のことである。さらに別の実施形態において、上記マウスは、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型（例えば、感覚誘発電位によって決定される場合のＣＮＳ伝導の低下）を示し、このマウスはタモキシフェンの投与後約７７日間で上記表現型において逆転を示す（例えば、図１６を参照のこと）。ここで上記逆転は、コントロール動物のＣＮＳ伝導に等しくないにしても、ＣＮＳ伝導を本質的に有さないから、ＣＮＳ伝導を有するまでへの改善のことである。
【００７３】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物は、上記第１の異種タンパク質を活性化する外因性薬剤で１回より多く処置され得る。例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列および毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列を含み、上記第２の異種配列は、転写終結シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にあるトランスジェニック動物（好ましくは、マウス）は、タモキシフェンもしくはそのアナログの第１の処置が与えられ、続いて、１回、２回、３回、４回、５回以上のさらなるタモキシフェンでの処置が与えられる。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤のその後の投与は、上記脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転の後である。例えば、タモキシフェンでの最初の処置後に脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型を示すマウスは、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転後に、タモキシフェンでの２回目の処置が施される。
【００７４】
上記異種タンパク質を活性化するために上記外因性薬剤を投与する複数回のサイクルが想定され得る。ここでｉ）外因性薬剤の投与、ｉｉ）脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、およびｉｉｉ）上記１種以上の表現型の逆転の１回のサイクルが、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）の別の完全なサイクルまたはこれらの部分的なサイクル（例えば、ｉ）とｉｉ）、もしくはｉ）のみ）に続くことができる。例えば、外因性薬剤の投与の１回のサイクルの後に、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、上記１種以上の表現型の逆転、第２回の外因性薬剤の投与、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、および上記１種以上の表現型の逆転、第３回の上記外因性薬剤の投与が、行われ得る。上記最初の投与後の上記外因性薬剤の引き続く投与（例えば、２回目、３回目、４回目、５回目、もしくはこれを超える投与）は、上記外因性薬剤の最初の、以前の、もしくはその後の量と比較して、より多量の、等しい、もしくはより低量の上記外因性薬剤の投与であり得る。
【００７５】
上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の引き続く投与は、上記外因性薬剤の最初に投与してからもしくは上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を最初に活性化してから約１４日間以降、約２１日間以降、約３５日間以降、約４０日間以降、約４２日間以降、約４５日間以降、約４８日間以降、約５０日間以降、約５５日間以降、約６０日間以降、約６５日間以降、約７０日間以降、約７５日間以降、約８０日間以降、もしくは約９０日間以降である。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の上記ひき続く投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してから）約７０日間後である。他の実施形態において、上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の上記ひき続く投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後である。
【００７６】
さらに他の実施形態において、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）の活性化を誘導する外因性薬剤で処置され得、免疫応答誘導因子、もしくは炎症誘導因子（例えば、内毒素）がさらに投与され得る。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、異種タンパク質の活性化を誘導する外因性薬剤および内毒素（例えば、リポポリサッカリド（ＬＰＳ））が投与される。上記ＬＰＳは、上記異種タンパク質を活性化する上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与の前に、同時に、もしくは後に、投与され得る。ＬＰＳの１回より多くの投与はまた、本明細書で企図される。例えば、タモキシフェンの各投与に対して、ＬＰＳの投与もまた、上記非ヒトトランスジェニック動物に与えられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列および毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列を含み、上記第２の異種配列が転写終結シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にあるトランスジェニック動物（好ましくは、マウス）は、タモキシフェンもしくはそのアナログの第１の処置、続いて、ＬＰＳの投与が与えられ得る。いくつかの実施形態において、上記ＬＰＳでのその後の投与は、動物が脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型を示すより前である。例えば、上記ＬＰＳは、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化後（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後もしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与後）約７日かそれ未満、約１４日かそれ未満、約２１日かそれ未満、約３５日かそれ未満、約４０日かそれ未満、約４２日かそれ未満、約４５日かそれ未満、約４８日かそれ未満、約５０日かそれ未満、約５５日かそれ未満、約６０日かそれ未満、約６５日かそれ未満、約７０日かそれ未満、約７５日かそれ未満、約８０日かそれ未満、もしくは約９０日かそれ未満に投与され得る。他の実施形態において、上記ＬＰＳの投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後である。
【００７８】
非ヒトトランスジェニック動物において第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得る。これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の１用量より多くの用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与される。上記１用量以上の用量は、同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。
【００７９】
第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の投与に加えて、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量以上の用量が投与され得る。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得、これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の投与は、第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与と同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量を超える用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。上記１用量以上の用量は、ＬＰＳの他の用量を投与するために使用される同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。上記外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）は、単一組成物において上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）と一緒に、非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。あるいは、それらは、実質的に同時に、逐次的に、その日中にもしくは処置期間中に所定の間隔で、異なる頻度で、または同じもしくは異なる投与経路を使用して、投与され得る。上記外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）、および上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）は、同じ手段もしくは異なる手段によって、上記非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。
【００８１】
非ヒトトランスジェニック動物において第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）は、局所にもしくは全身に投与され得る。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）はまた、局所にもしくは全身に投与され得る。局所投与は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、または上記ＣＮＳもしくはＰＮＳの特定の領域に対するものであり得る。例えば、上記投与は、具体的には、脳、脊髄、もしくは視神経に対するものであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）が投与される上記動物はまた、炎症マーカー（例えば、顆粒球／好中球抗原４／７、Ｔ細胞抗原ＣＤ３、ＩＢＡ１、および測定されるＣＤ１１ｂが挙げられるが、これらに限定されない）の発現を有し得る。
【００８３】
（スクリーニングアッセイ）
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物および方法は、具体的な有用性を提供する。本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物および方法は、髄鞘再生の機構を解明するために、ならびに髄鞘再生を促進するための治療ストラテジーの開発に有用である。これは、脱髄状態に関連するヒト疾患（例えば、先に記載されたもの）の研究に対する現実世界での適用を提供する。また、他の多発性硬化症動物モデルと比較すると、本明細書に記載されるマウスは、薬物開発の間の標的バリデーションに一層の適用性がある。なぜなら、上記脱髄および髄鞘再生事象は、再現性が高く、それらは別個の位置において異なる時点で起こり、両者とも定量的行動表示と明らかに関連するからである。さらに、このモデル系は、髄鞘再生電位における加齢に関連する低下に寄与する要素（ｆａｃｔｏｒ）であって、これが、被験体が脱髄状態に罹患している先に列挙された疾患に存在する要素の調査を可能にするはずである。最後に、髄鞘形成を調節する薬剤をスクリーニングするための本明細書に記載される方法は、髄鞘形成のエンハンサーおよびインヒビターの両方の同定に適用され得る。なぜなら両方とも、髄鞘形成障害のための治療剤を開発するために価値のある標的であり得るからである。
【００８４】
一局面において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、髄鞘再生を促進するかもしくは脱髄を阻害する薬剤もしくは生物学的に活性な薬剤の候補薬剤をスクリーニングするために使用される。いくつかの実施形態において、薬剤を選択するための方法は、上記非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）活性化する工程、上記動物に候補薬剤を投与する工程、上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；および上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、上記１種以上の表現型変化がより迅速に逆転される場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。他の実施形態において、髄鞘再生を促進する薬剤を選択する方法は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する工程、上記動物に候補薬剤を投与する工程、上記動物において髄鞘再生を決定する工程；および上記候補薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、上記動物が髄鞘再生の増大を示す場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。
【００８５】
一局面において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、非増殖グリア細胞もしくは増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上記動物は、非増殖グリア細胞を特異的に除去するように誘導される。上記グリア細胞除去の誘導は、上記動物において脱髄を生じ、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し得、ここで上記１種以上の表現型変化は、上記最初の誘導の後に逆転される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記マウスは、そのゲノム内に、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）をコードし、神経細胞に特異的なプロモーターもしくは調節領域（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に特異的なプロモーター）に作動可能に連結された第１の異種配列を含む。上記マウスはまた、ＤＴＡをコードする第２の異種配列を含み、ここでＤＴＡは、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼが外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）によって活性化される場合に発現される。次いで、上記ＤＴＡの発現は、細胞死を誘導し得る。ＤＴＡの発現は、神経細胞において特異的な上記Ｃｒｅリコンビナーゼの発現に起因して、細胞特異的（例えば、神経細胞（例えば、グリア細胞）において特異的）であり得る。従って、ＤＴＡの発現は、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくは星状細胞の上記細胞特異的死滅、もしくは細胞特異的除去を誘導し得る。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、非増殖グリア細胞（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方にある）であり、ここで上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において脱髄を生じる。いくつかの実施形態において、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導は、成熟した希突起膠細胞の細胞死を生じる。
【００８７】
候補薬剤の投与は、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２の活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与のような上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導の前、誘導と同時もしくは誘導の後であり得る。いくつかの実施形態において、上記候補薬剤は、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導後（例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２の活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与後）に、上記動物に投与される。
【００８８】
上記候補薬剤は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得、これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記候補薬剤の１用量を超える用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与される。他の実施形態において、１種以上の候補薬剤が投与され得る。上記１用量以上の用量、もしくは１種以上の候補薬剤は、同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。さらに、上記動物はまた、上記外因性薬剤の１用量以上の用量が投与され得る。第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の１用量以上の用量の投与に加えて、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量以上の用量はまた、上記候補薬剤の投与の前に、投与と同時に、もしくは投与の後に、上記動物に投与され得る。上記候補薬剤は、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）、および必要に応じて、上記免疫応答誘導因子（すなわち、ＬＰＳ）と一緒に、単一組成物において非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。あるいは、上記候補薬剤は、実質的に同時に、逐次的に、その日中もしくは処置期間の間の所定の間隔で、異なる頻度で、または誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤、および必要に応じて、ＬＰＳと同じもしくは異なる投与経路を使用することによって投与され得る。上記候補薬剤、ならびに上記外因性薬剤、および必要に応じてＬＰＳは、局所にもしくは全身に投与され得る。局所投与は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、または上記ＣＮＳもしくはＰＮＳの特定の領域に対するものであり得る。例えば、上記投与は、具体的には、上記脳、脊髄、もしくは視神経に対するものであり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、候補薬剤（例えば、単一用量もしくは複数用量）の投与は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化（例えば、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、運動制御の低下、平衡の低下、ＣＮＳ伝導の低下、もしくはその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）の提示の前に、提示と同時に、もしくは提示の後に行われ得る。次いで、薬剤は、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、上記１種以上の表現型変化がより迅速に逆転される場合に選択され得る。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する外因性薬剤を投与してから約３５日間以降に上記脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転を示す動物において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した動物が、約３５日間未満で脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す場合に選択され得る。
【００９０】
他の実施形態において、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する外因性薬剤を投与してから約７０日間以降に脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す動物において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した動物が脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を約７０日間未満で示す場合に選択され得る。例えば、成熟した希突起膠細胞において発現される上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化するためにタモキシフェンを投与したマウスは、ロータロッドアッセイで潜時の低下を示し（例えば、図１４を参照のこと）、タモキシフェン投与後の４２日目後に回復し始める。比較すると、候補薬剤を投与したマウスは、タモキシフェン投与後の約４２日かそれ未満に回復を始める。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、上記薬剤を投与した動物において脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転が、上記薬剤を投与していない動物における脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転のための時間の約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１４、１／２１、１／２８、１／３５、１／４２、１／４９、１／５６、１／６３、１／７０、もしくは１／７７以下である場合に選択される。いくつかの実施形態において、検出および分析（例えば、ビデオテープ収録、体重測定、ロータロッドアッセイ、ＳＥＰアッセイ、視覚的観察が挙げられるが、これらに限定されない）は、種々の時点で行われ、試験薬剤の投与は、上記アッセイの過程の間に、ならびに異なる投与レジメンを使用して、反復され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、動物における脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転が、上記薬剤を投与していない動物におけるものより早いもしくは迅速であることで選択される。上記候補薬剤を投与していない上記コントロール動物は、代表的には、上記候補薬剤を投与した上記動物と同じ遺伝的バックグラウンドを有し、その第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）が活性化されている。他の実施形態において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した上記動物が、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、より低い程度まで（例えば、より低い重篤度、より低い程度、もしくは示さない）脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化を示す場合に選択され、ここで両方の動物は、活性化された誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを有する。他の実施形態において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した上記動物が、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の提示において遅延を有する場合に選択される。
【００９２】
さらに他の実施形態において、薬剤は、上記薬剤を投与した上記動物が、上記薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、髄鞘再生の増大を示す場合に選択される。例えば、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物における非増殖髄鞘形成細胞における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後に、上記動物は、上記細胞においてＤＴＡを発現し、これは、細胞死を誘導し、上記動物において脱髄を生じる。上記脱髄状態は、上記神経系（例えば、上記中枢神経系もしくは末梢神経系）における髄鞘形成した軸索の減少によって、または髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞およびシュワン細胞）のマーカーのレベルの低下によって、特徴付けられ得る。形態的には、ニューロンの脱髄は、上記中枢神経系における希突起膠細胞もしくは上記末梢神経系におけるシュワン細胞の喪失によって特徴付けられ得る。上記ニューロンの脱髄はまた、上記神経系における髄鞘形成した軸索の減少によって、もしくは希突起膠細胞マーカーもしくはシュワン細胞マーカーのレベルの低下によって、決定され得る。希突起膠細胞もしくはシュワン細胞の例示的マーカータンパク質としては、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本発明の方法によって同定される上記候補薬剤は、ニューロンの脱髄の有害な形態的特性を阻害し得る物質を包含する。
【００９３】
従って、いくつかの実施形態において、上記髄鞘再生は、髄鞘形成した軸索によって特徴付けられる。例えば、髄鞘形成した軸索は、当該分野で公知の任意の手段を使用して（例えば、電子顕微鏡検査によって）、検出され得る。他の実施形態において、髄鞘再生は、星状細胞もしくはミクログリア細胞のマーカーの発現によって特徴付けられ得る（例えば、ミクログリア細胞マーカーの発現の低下は、ミクログリア細胞の低下を表す）。いくつかの実施形態において、髄鞘再生は、１種以上の希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって特徴付けられる。例えば、候補薬剤で処置された動物の１種以上の髄鞘再生特異的マーカータンパク質の発現は、コントロール動物もしくは参照動物に対して比較され得る。タンパク質レベルを検出するのに適した多種多様な標識は、当該分野で公知である。非限定的な例としては、放射性同位体、酵素、コロイド性金属、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物が挙げられる。他の実施形態において、上記マーカーのＲＮＡレベルもしくはｍＲＮＡレベルは、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、もしくは当該分野で公知の他の手段によって検出される。上記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００９４】
さらに他の実施形態において、髄鞘再生特異的マーカータンパク質の発現（例えば、タンパク質レベルもしくはｍＲＮＡレベルを測定する）は、上記試験動物およびコントロール動物もしくは参照動物において、候補薬剤が髄鞘再生阻害活性もしくは髄鞘再生低下活性を有するか否かを決定することで、測定される。このような薬剤は、髄鞘再生インヒビターもしくは髄鞘再生毒素として分類され得る。
【００９５】
本明細書で開示される場合、髄鞘再生は、マーカー遺伝子／遺伝子生成物（例えば、上記中枢神経系もしくは末梢神経系において）の上記細胞特異的発現において増大を観察することによって、確認され得る。上記マーカータンパク質の蛍光は、小動物において蛍光を検出するための当該分野で公知のインビトロ方法もしくはインビボ方法を使用して、検出され得る。インビボ蛍光は、関連分野において入手可能なデバイスを利用して、検出および／もしくは定量化され得る。視覚化、画像化もしくは検出は、侵襲性の技術、最小限に侵襲性の技術もしくは非侵襲性の技術を介して行われ得る。代表的には、顕微鏡検査技術は、上記トランスジェニック動物から、生細胞から、もしくはインビボ画像化技術を介して得られる細胞／組織からの蛍光を検出もしくは画像化するために利用される。
【００９６】
発光、蛍光もしくは生体発光シグナルは、種々の自動化および／もしくはハイスループット機器システム（蛍光マルチウェルプレートリーダー、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および上記シグナルの空間的分解を提供する自動化された細胞ベースの画像化システムが挙げられる）のうちのいずれかで容易に検出され定量化される。種々の機器システムが、ＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＴＴＰ、Ｑ３ＤＭ、Ｅｖｏｔｅｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＩｍａｇｉｎｇおよびＺｅｉｓｓによって開発された自動化蛍光画像化システムおよび自動化顕微鏡検査システムが挙げられる）を自動化するために開発されてきた。蛍光退色後蛍光回復法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡検査法（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）はまた、生細胞におけるタンパク質移行性を研究するために使用されてきた。
【００９７】
蛍光の可視化（例えば、蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子）は、動物から得られる細胞／組織サンプルを（例えば、切片化および共焦点顕微鏡を使用した画像化を介して）検査すること、生細胞を検査することもしくはインビボで蛍光を検出することのいずれかを介して、顕微鏡検査技術を用いて行われ得る。可視化技術としては、当該分野で公知の共焦点顕微鏡法もしくは光学スキャニング技術（ｐｈｏｔｏ−ｏｐｔｉｃａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の利用が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、近赤外線での発光波長を有する蛍光標識は、散乱および自己蛍光の両方（これらは、バックグラウンドノイズを増加させる）が、波長が長くなるにつれて低下するので、深部組織画像化がより容易にできる。インビボ画像化の例は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１０：４１２０７（２００５）；Ｚｈａｎｇら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．３１：１０５４−１０６４（２００３）；Ｆｌｕｓｂｅｒｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．２：９４１−９５０（２００５）；Ｍｅｈｔａら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４：６１７−６２８（２００４）；Ｊｕｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２：３１２１−３１３３（２００４）；米国特許第６９７７７３３号および同第６８３９５８６号（これらの各開示は、本明細書に参考として援用される）に開示される）。
【００９８】
さらに、脱髄／髄鞘再生現象は、当該分野で公知の免疫組織化学的手段もしくはタンパク質分析によって観察され得る。例えば、上記試験動物の脳の切片は、希突起膠細胞マーカーを特異的に認識する抗体で染色され得る。別の局面において、希突起膠細胞マーカーの発現レベルは、イムノブロッティング、ハイブリダイゼーション手段、および増幅手順、ならびに当該分野で十分確立されている任意の他の方法によって定量化され得る（例えば、Ｍｕｋｏｕｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１５５１−１５５６（２００６）；Ｚｈａｎｇら，前出；Ｇｉｒａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：７９２４−７９３３（２００５）；ならびに米国特許第６，９０９，０３１号；同第６，８９１，０８１号；同第６，９０３，２４４号；同第６，９０５，８２３号；同第６，７８１，０２９号；および同第６，７５３，４５６号（これら各々の開示は、本明細書に参考として援用される））。
【００９９】
別の局面において、上記中枢神経系もしくは末梢神経系に由来する細胞／組織は、摘出され得、タンパク質に関して加工処理され得、例えば、組織は、ホモジナイズされ、タンパク質は、ＳＤＳ−１０％ ポリアクリルアミドゲル上で分離され、次いで、ニトロセルロース膜に転写されて、マーカータンパク質を検出する。蛍光タンパク質レベルは、一次抗体／抗血清（例えば、特定のマーカータンパク質に対して得られたヤギポリクローナル；ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ，Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）およびペルオキシダーゼ結合体化２次抗体ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して、検出され得る。化学発光は、組織サンプル中の蛍光マーカータンパク質のレベルを検出および決定するために、当該分野で入手可能な標準試薬を使用して検出される。
【０１００】
本発明の別の局面において、本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、細胞／組織培養物の供給源であり得る。例えば、本明細書で開示される動物の細胞は、遺伝子もしくは遺伝子生成物の発現の比較、またはコントロール細胞（コントロール動物から得られた細胞）に対して試験神経細胞（例えば、トランスジェニックの希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）における上記遺伝子生成物の活性を提供するための、細胞ベースのアッセイのために使用され得る。上記細胞は、増殖細胞もしくは非増殖細胞（例えば、成熟したもしくは分化した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）であり得る。上記試験神経細胞は、上記ＣＮＳもしくはＰＮＳ、または上記トランスジェニック動物の細胞から得られる細胞培養物、その子孫、および上記供給源から調製される切片もしくはスメア、あるいは例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞またはそれらの前駆体を含む脳の任意の他のサンプルから単離され得る。所望される場合、他の神経細胞タイプ（例えば、ニューロン、ミクログリア細胞、および星状細胞）を実質的に含まない富化された細胞培養物を使用することが選択され得る。成熟した希突起膠細胞およびシュワン細胞を単離、生成もしくは維持するための種々の方法が、当該分野で公知であり（Ｂａｅｒｗａｌｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２：２３０−２３９（１９９８）；Ｌｅｖｉら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．６８：２１−２６（１９９８））、それらは本明細書で例示される。
【０１０１】
また、選択される候補薬剤、もしくは生物学的に活性な薬剤が本明細書において提供され、これらとしては、生物学的もしくは化学的な化合物（例えば、単純なもしくは複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）が挙げられ得るが、これらに限定されない。非常に多くの整理された化合物が、合成され得（例えば、ポリマー（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）、および種々のコア構造物に基づく合成有機化合物）、これらはまた、本明細書で企図される。さらに、種々の天然の供給源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る（例えば、植物もしくは動物の抽出物など）。常に明示的に示されている訳ではないが、上記活性な薬剤が単独で、または本発明のスクリーニング方法によって同定される薬剤と同じ生物学的活性もしくは異なる生物学的活性を有する別の調節因子と組み合わせて使用され得ることは、理解されるべきである。
【０１０２】
本明細書で開示される１つ以上の方法においてアッセイされる候補薬剤（例えば、治療剤／薬物）は、異なる時点で比較して、ならびに参照もしくはコントロールと比較して、上記薬物に応じた全体的な差異があるか否かを決定するために、上記モデル系（例えば、本明細書で開示されるトランスジェニック動物）において使用され得る。マーカーの発現を検出および定量化することによって、上記トランスジェニック動物は、候補薬剤が髄鞘再生を調節するか否か、およびそれがどの程度までかを決定するために使用され得る。当然のことながら、当業者は、前述が、本明細書で開示されるモデル系を利用するための一例に過ぎないことを認識する。
【０１０３】
従って、候補治療剤／薬物が、本発明の１つ以上の方法においてアッセイされている場合、上記候補治療剤／薬物は、異なる時点で比較して、ならびに参照もしくはコントロールと比較して、上記薬物に応じて全体的に差異があるか否かが決定され得る。まとめると、グリア細胞（例えば、前駆体希突起膠細胞）の単一の亜集団において差次的に発現されるマーカーの発現を検出および定量化することによって、前述の例における上記トランスジェニック動物は、種々のデータを得るために使用される。上記データとしては、髄鞘再生が傷害後に起こっているか否か、および候補薬剤がこのような髄鞘再生を調整するか否か、およびそれがどの程度までかということ、が挙げられる。当然のことながら、当業者は、前述が、本発明の髄鞘再生モデル系を利用するための一例に過ぎないことを認識する。
【０１０４】
（薬学的組成物）
本明細書で開示される１つ以上の方法は、脱髄を阻害するかもしくは髄鞘再生を促進することによって、脱髄の処置においてその後実施され得る生物学的に活性な薬剤を選択するために利用され得る。髄鞘再生を調節するに有効な上記選択された生物学的に活性な薬剤は、ニューロンの脱髄障害を処置するための医薬の調製のために使用され得る。特定の実施形態において、本明細書で言及される脱髄障害は、多発性硬化症である。他の実施形態において、上記脱髄障害は、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー：副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）からなる群より選択される。
【０１０５】
一局面において、同定され／選択される生物学的に活性な本発明の薬剤は、病原体（例えば、細菌およびウイルス）に罹患したニューロンの脱髄を処置するために投与され得る。別の局面において、上記選択された薬剤は、例えば、橋中央ミエリン溶解およびビタミン欠乏症における場合のように、毒性物質によってもしくは毒性の代謝生成物の身体への蓄積によって引き起こされるニューロンの脱髄を処置するために使用され得る。なお別の局面において、上記薬剤は、物理的傷害（例えば、脊髄損傷）によって引き起こされる脱髄を処置するために使用され得る。さらになお別の局面において、上記薬剤は、遺伝的特性を有する障害において現れる脱髄、遺伝的障害（白質ジストロフィー、副腎脳白質ジストロフィー、変性性多系統萎縮症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）、ビンスワンガー脳症、上記中枢神経系における腫瘍、および多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために投与され得る。
【０１０６】
同定され／選択される生物学的に活性な本発明の薬剤はまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない目的の他の生成物とともに、それより前に、もしくはその後に送達され得る：増殖因子、サイトカイン、神経増殖因子、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗遊走剤、抗線維症剤、抗アポトーシス剤、抗体、抗血栓剤、抗血小板剤、ＩＩｂＩＩＩＩａ因子（ＩＩｂＩＩＩＩａ ａｇｅｎｔ）、脈管形成因子、抗脈管形成因子、抗ウイルス剤、神経増殖因子、ＮＧＦファミリーのタンパク質、ＮＧＦ、β−ＮＧＦ、ニューロトロフィン−３前駆物質（ＮＴ−３）、ＨＤＮＦ、神経増殖因子２（ＮＧＦ−２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、もしくはこれらの前駆体および組み合わせ。
【０１０７】
種々の送達系は公知であり、生物学的に活性な薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソームへの被包化、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスベクターもしくは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築など）。送達法としては、動脈内経路、筋肉内経路、静脈内経路、鼻内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。具体的実施形態において、処置の必要な領域に局所的に本発明の薬学的組成物を投与することは望ましいことであり得る；このことは、例示であって、限定ではなく、手術の間の局所的注入によって、注射によって、もしくはカテーテルの手段によって達成され得る。特定の実施形態において、上記薬剤は、被験体の神経系（好ましくは、上記中枢神経系）に送達される。別の実施形態において、上記薬剤は、髄鞘再生を受けている神経組織に投与される。
【０１０８】
上記選択される薬剤の投与は、１用量において、処置の過程全体を通じて連続して、もしくは間欠的に、行われ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定するための方法は、当業者に周知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、処置されている標的細胞、および処置されている被験体とともに変動する。単回投与もしくは複数回投与は、処置している医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行われ得る。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物の調製は、薬学的調製物を調製するために一般に受容された手順に従って行われる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ＰＡを参照のこと。意図された使用および投与様式に依存して、薬学的組成物の調製において上記活性成分をさらに加工処理することは、望ましいことであり得る。適切な加工処理は、適切な無毒性の妨害しない成分と混合する工程、滅菌する工程、用量単位に分割する工程、および送達デバイスに封入する工程を包含し得る。
【０１１０】
経口投与、鼻内投与もしくは局所投与のための薬学的組成物は、固体形態、半固体形態もしくは液体形態で供給されうる（錠、カプセル、粉末、液体、および懸濁物が挙げられる）。注射用の組成物は、液体溶液もしくは懸濁物として、エマルジョンとして、または注射前に液体中に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態として、供給されうる。気道を介した投与のために、一部の組成物は、適切なエアロゾル生成デバイス（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）とともに使用される場合、固体、粉末、もしくはエアロゾルを提供するものである。
【０１１１】
液体の薬学的に受容可能な組成物は、例えば、液体賦形剤（例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、もしくはエタノール）中に、本明細書で具現化されたポリペプチドを溶解もしくは分散させることによって調製されうる。上記組成物はまた、他の医療用薬剤、薬学的作用物質、アジュバント、キャリア、および補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤）、およびｐＨ緩衝化剤を含み得る。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの生成およびＣｒｅリコンビナーゼ活性の誘導）
ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ対立遺伝子（Ｉｖａｎｏｖａら，Ｇｅｎｅｓｉｓ ４３：１２９−１３５（２００５））を含み、ｅＧＦＰ遺伝子およびＮｅｏ遺伝子を含む上流のｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列領域の存在に起因して、機能的に不活性な形態にあるジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）の遺伝子を有するマウスを、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ対立遺伝子（Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅｓｉｓ，３５：６３−７２（２００３））を有し、希突起膠細胞において上記Ｃｒｅリコンビナーゼのタモキシフェン関連バージョンを発現するマウスと交配した。上記交配から、複合ヘテロ接合性ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを生じ、ここで上記ｌｏｘＰに挟まれた領域のＣｒｅ媒介性除去は、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいてタモキシフェンで誘導され、その結果、ＤＴＡ発現を生じる（図１）。
【０１１３】
５〜７週齢において、上記マウスに、１日あたり１ｍｇのタモキシフェンを５〜７日間にわたって、腹腔内に（ＩＰ）投与した。上記タモキシフェン処置マウスの脳におけるＤＴＡの発現を、ＰＣＲによって確認した。そのＰ１プライマー（５’−ＡＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＣ−３’）およびＰ２プライマー（５’−ＣＴＴＡＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＴＣ’３’）を使用し、その結合部位を図１に示す。組換えを行なうと、上記Ｐ１およびＰ２プライマーは、図２に示されるように、約６５０ｂｐ（ＤＴＡ）生成物を増幅する。そのコントロールレーンは、ＤＴＡの誘導発現がない上記ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスからのＰＣＲ結果および１回目のタモキシフェンを注射してから（ｄｐｉ）７日間の後、１４日間の後および２１日間の後に処置された上記タモキシフェン処置マウスの結果（それぞれ、レーンｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１に示される）を示す。理論に拘束されないが、ＤＴＡ発現の最終的な減少は、細胞死および細胞の欠如に起因し得る。
【０１１４】
（実施例２：タモキシフェン処置マウスの脱髄および表現型の特徴）
上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを、希突起膠細胞の喪失を検出するために特徴付けた。上記希突起膠細胞の細胞喪失を決定するために、その脳幹、小脳、脳梁、皮質、頸髄（灰白質および白質）におけるＣＣ−１染色を行い、上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの７ｄｐｉ、１４ｄｐｉおよび２１ｄｐｉにおいて定量した（図５）。希突起膠細胞の細胞喪失は、２１ｄｐｉまでに上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの大部分のＣＮＳ領域において最大であった（例えば、図４、図５を参照のこと）。
【０１１５】
以下のプライマーでのＲＴ−ＰＣＲを行った：
マウスＰＬＰセンスプライマー： ＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＣＴ
マウスＰＬＰアンチセンスプライマー： ＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡ
マウスＰＬＰプローブ： ＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡ
マウスＭＢＰセンスプライマー： ＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴ
マウスＭＢＰアンチセンスプライマー： ＴＧＴＣＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧ
マウスＭＢＰプローブ： ＡＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＡＧＡＴＧ
マウスＧＡＰＤＨセンスプライマー： ＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡ
マウスＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー： ＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ
マウスＧＡＰＤＨプローブ： ＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧ。
【０１１６】
上記結果から、コントロールマウスと比較して、７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、もしくは２１ｄｐｉの上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて希突起膠細胞の細胞喪失より先に、Ｐｌｐ ｍＲＮＡレベルおよびＭｂｐ ｍＲＮＡレベルの劇的な低下が示された（図６）。
【０１１７】
ＣＮＳ髄鞘形成を、脊髄の電子顕微鏡検査（ＥＭ）およびトルイジンブルー染色、ならびに脳におけるＭＡＧおよびＭＢＰのタンパク質発現のウェスタンブロッティングによって、決定した。希突起膠細胞の細胞喪失の影響は、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおいて最小であった（図７）。しかし、１４ｄｐｉにおいて、上記マウスは、脱髄状態に特徴的な表現型を示した。上記マウスは、振せんおよび失調性の非協調歩行を示した。２１ｄｐｉまでに、一部のマウスは、非常に虚弱になり、死に至った。
【０１１８】
生き残った上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉは、ＳＥＰ応答を何ら示さなかった。ＳＥＰ記録は、３５ｄｐｉおよび７０〜７７ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて可能であった（図１６および図１７）。上記ＳＥＰ応答を決定するために、コントロールマウスおよびタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを、Ａｖｅｒｔｉｎ（登録商標）の腹腔内注射で麻酔し、刺激電極を、３種の異なる坐骨神経レベルのうちの１つの皮下に導入した：（１）足首、（２）膝窩、もしくは（３）根部に直接。アース電極を、上記神経の刺激の際には尾部にあてがい、記録を、下部腰椎もしくは中位胸椎レベルから行った。上記２種のレベルから記録した感覚誘発電位（ＳＥＰ）の開始潜時の差異（ΔＬ）を、上記ＣＮＳにおける伝導の概算値として計算した。
【０１１９】
３５ｄｐｉおよびさらに４２日間のＰＩにおいて、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、ロータロッド上で動作することができなかった（図１４）。上記マウスは、加速モード（５ｒｐｍから６５ｒｐｍまで）で回転している上記ロッド上で５分間の試験期間の間、該マウスが自身を維持する時間（潜時）に関して試験された。上記潜時を、各マウスに関して、１日４回のセッションを、１週間に１回、連続７週間にわたって行うことによってモニターした。
【０１２０】
また、３５ｄｐｉにおいて、上記マウスは、失調の増大および振せんの増大を示し、上記マウスの小脳、脳幹、脊髄、および視神経のトルイジンブルー染色から、上記ＣＮＳ全体にわたって大量の希突起膠細胞の喪失が明らかになり、別個の白質に富む領域においてミエリン鞘変性および空砲形成を生じた（図１０）。３５ｄｐｉにおける頸髄−腹側白質のＥＭから、脱髄もまた実証された（図１１）。ミクログリア活性化（上記小脳におけるミクログリアのＣＤ１１ｂ染色によって示されるように）はまた、３５ｄｐｉにおいて脱髄と相関した（図１２）。
【０１２１】
（実施例３：髄鞘再生および脱髄に特徴的な表現型の逆転）
驚くべきことに、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、髄鞘再生することができ、髄鞘再生に特徴的な上記表現型の逆転を示した。上記動物は、顕著な表現型回復を示した。実施例２に記載されるように、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、３５ｄｐｉおよびさらには４２ｄｐｉにおいて上記ロータロッド上で動作することができなかった。しかし、上記マウスは、４２ｄｐｉ後および７７ｄｐｉまでに彼らの運動機能を再獲得しはじめ、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの潜時は、最終的には、上記コントロールマウスの潜時にほぼ近づいた（図１４）。上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、２１ｄｐｉにおいてＳＥＰ応答を何ら有さず、Δ潜時（ΔＬａｔ（上記Ｔ５〜Ｔ６ピーク潜時とＬ４〜Ｌ５ピーク潜時の間の差異））が、コントロールより僅かに低くかつ振幅（Ａｍｐ）が正常である場合、７０ｄｐｉまでにＳＥＰ応答を有した（図１７）。
【０１２２】
予測外なことには、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて、希突起膠細胞が除去された領域が再び補充され、修復されていた。上記希突起膠細胞の細胞数は、ＣＣ１免疫染色によって示されるように、３５ｄｐｉまでに増加しており、７０ｄｐｉまでにさらに増加した（図８）。Ｍｂｐ ｍＲＮＡ発現およびＰｌｐ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は、類似の傾向を示し、ここで７０ｄｐｉまでに、上記レベルは、コントロールマウスよりさらに高かった（図９）。上記マウスの小脳、脳幹、脊髄、および視神経のトルイジンブルー染色から、７０ｄｐｉにおいて髄鞘再生もまた明らかになり（図１０）、同様に、頸髄−腹側白質のＥＭもまた、髄鞘再生を示した（図１１）。ミクログリア活性化はまた、減少し、それは髄鞘再生と相関した（図１２）。さらに、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）はまた、上記脳幹および小脳においてＰＤＧＦＲα陽性細胞によって測定される場合、上記コントロールマウスと比較して、増加していた（図１３）。
【０１２３】
上記脱髄および脱髄障害に特徴的な表現型の提示、ならびに上記予測外の髄鞘再生および上記表現型の逆転のまとめを、図１９に示す。
【０１２４】
（実施例４：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおけるタモキシフェンの滴定）
ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスに、種々のレジメンの種々の量のタモキシフェンもしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を投与して、脱髄の範囲および脱髄障害に特徴的な表現型変化を評価する。約１〜７ｍｇの範囲に及ぶ４−ＯＨＴの用量を、異なるマウス群にＩＰ投与する。３〜７連続日にわたる１日約１回の投与レジメンをまた、異なるマウス群に対して様々にする。上記異なるマウス群はまた、若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）を含む。
【０１２５】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐ遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた行う。表現型変化の程度（例えば、臨床症状の重篤度がより低いこと、臨床症状を示すのにより長い時間がかかること、もしくは回復時間がより早いこと）は、実施例１に記載されるレジメンと比較して、より低い投与量もしくはより短い投与時間で予測される。より低い投与量を上記マウスに用いると、マウスの死亡のパーセンテージもより低くなり得る。老齢マウスに対する若年マウスの上記効果および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１２６】
（実施例５：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスへのタモキシフェンの脳内注射）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて局所化した脱髄を誘導するために、タモキシフェンを、定位注入によって上記マウスへと注射する。定位装置を、上記タモキシフェン溶液を、カニューレを通して前もって選択した位置に送達するための注射プローブを移植するために使用する。この位置は、マウスの脳地図からの座標によって規定される。約１０〜１００μｇ／日を、１〜３日間にわたって、上記マウスに継続して投与する。
【０１２７】
上記脳内注射を、若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）において行う。上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた行う。老齢マウスに対する若年マウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）を分析する。
【０１２８】
（実施例６：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの反復した脱髄および髄鞘再生）
上記マウスの髄鞘再生能力および表現型逆転能力を決定するために、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）を回復させた（実施例３に記載されるように）か、もしくは回復させた後に、実施例４において決定されるような量もしくは用量のタモキシフェンをＩＰにより投与した。１つのマウス群において、タモキシフェンの２回目の注射は、ＰＩの１２０日間後である。
【０１２９】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学染色もまた、行う。上記結果をまた、タモキシフェンで１回だけ処置したマウスと比較して、回復時間がより長いか否か、回復がそれほど強くないのか否か、もしくは脱髄および表現型が、１回処置したマウスと比較してより重篤であるのか否かを決定する。上記老齢マウスに対する若年マウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１３０】
同じ実験を反復する。ここでＬＰＳと同様にタモキシフェンを局所に投与（実施例５を参照のことのこと）する。
【０１３１】
（実施例７：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスへのＬＰＳおよびタモキシフェンの投与）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）に、タモキシフェン（実施例１に記載されるか、または実施例４において決定されるような量もしくは用量）をＩＰで投与する。単一用量のＬＰＳ、２００μｇを、７ｄｐｉおよび１４ｄｐｉにおいて、または上記動物が脱髄障害に特徴的な表現型を示す前に７ｄｐｉもしくは１４ｄｐｉで開始して、７連続日にわたって１日用量１０μｇを注射することによって、ＩＰ投与する。
【０１３２】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた、行う。上記脳への免疫細胞のインフラックスもまた、以下のマーカーを検査することによって決定する：顆粒球／好中球抗原４／７、Ｔ細胞抗原ＣＤ３、およびＩＢＡ１。ＬＰＳで処置したマウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）を、タモキシフェンを投与したが、ＬＰＳで処置しなかったマウスのそれと比較する。ＬＰＳで処置したマウスは、より早い回復時間を有し得る。老齢マウスに対して若年マウスへの上記作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１３３】
同じ実験を反復する。ここでＬＰＳと同様にタモキシフェンを局所に投与（実施例５を参照のことのこと）する。同じ実験をまた行う。ここでタモキシフェンを複数回投与し（実施例６を参照のことのこと）、ここでＬＰＳも、タモキシフェンの各投与に対して投与する。
【０１３４】
（実施例８：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおける血液脳関門の完全性）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）に、タモキシフェン（実施例１に記載されるかもしくは実施例４において決定されるような量もしくは用量）をＩＰで投与する。血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を試験するために、エバンブルー色素を、屠殺する４８時間前に、マウスにＩＰ注射する（２％，４ｍｌ／ｋｇ体重）。上記青色色素の分布を、脳実質において分析して、上記ＢＢＢの完全性を決定する。
【０１３５】
（実施例９：生物学的に活性な薬剤のスクリーニング）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスに、タモキシフェン（実施例１に記載されるように、または実施例４において決定されるような量もしくは投与量）をＩＰで投与する。候補薬剤を、上記動物が脱髄障害の表現型の特徴を示す前に、ＰＩの１４日後に上記マウスにＩＰで投与する。
【０１３６】
上記マウスを、種々の時点でのロータロッドアッセイおよび上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析によって特徴付ける。上記薬剤は、上記マウスが、タモキシフェンを投与するが上記候補薬剤を投与しないＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスより早くその運動制御を回復する場合に、治療剤としてのさらなる開発のために選択される。
【０１３７】
本発明は、上記の実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲の範囲内での改変が可能である。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的実施形態の多くの等価物を認識するかあるいは確認し得る。多くのバリエーション、変化、および置換は、いまや本発明から逸脱することなく当業者に想起される。本明細書に記載される実施形態に対する種々の代替物は、本発明を実施するにあたって使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、発明の範囲を規定し、これら請求項の範囲内の方法および構造物、ならびにこれらの等価物が、特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
政府支援の研究に対する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＳ０２７３３６およびＮＳ０３４９３９の下、政府支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、２００９年９月２日に出願された米国仮特許出願６１／２７５，８３９の利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ニューロンの脱髄は、神経系におけるミエリンの減少によって特徴付けられる有害な状態である。ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）に極めて重要な成分であり、それはニューロンの軸索を覆い、ミエリン鞘として公知の絶縁層を形成する。上記ミエリン鞘の存在は、上記軸索を下って伝達する電位の形態で神経シグナルの速度および完全性を増強する。ミエリン鞘の喪失は、感覚、運動および他のタイプの機能に重大な障害をもたらす。なぜなら、神経シグナルがその標的に余りにも遅く到達するか、非同期的に（例えば、ある神経における一部の軸索が、他のものより早く伝導する場合）到達するか、間欠的に（例えば、伝導が、高周波数においてのみ損なわれる場合）到達するか、もしくは全く到達しないかのいずれかであるからである。
【０００４】
神経組織は、ニューロンおよび支持細胞もしくはグリア細胞を含む。グリア細胞は、哺乳動物の脳において約１０〜１倍だけニューロンより数が勝る。グリア細胞は、４つのタイプに分けられ得る：星状細胞、希突起膠細胞、シュワン細胞およびミクログリア細胞。上記ミエリン鞘は、あるタイプのグリア細胞（すなわち、ＣＮＳにおける希突起膠細胞およびＰＮＳにおけるシュワン細胞）の形質膜もしくは細胞膜によって形成される。髄鞘形成希突起膠細胞は、脱髄病変において同定されてきた。このことは、脱髄した軸索が、新たに合成された髄鞘で修復され得ることを示している。
【０００５】
ニューロンの脱髄は、非常に多くの遺伝性および後天性の上記ＣＮＳおよびＰＮＳの障害において現れている。これら障害としては、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー、副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパチー（ｍｕｌｔｉｆｏｃｕａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＭＭＮ）が挙げられる。これら障害の大多数に関しては、治癒しないかもしくは有効な治療がわずかしかない。
【０００６】
多発性硬化症は、上記中枢神経系の一般的な脱髄疾患である。上記疾患は、代表的には、再発および軽快によって臨床的に特徴付けられ、最終的には、慢性的な障害をもたらす。多発性硬化症のより初期の相は、通常は、ミエリン鞘に対する自己免疫の炎症性の攻撃によって特徴付けられ、麻痺、協調の欠如、感覚障害および視覚障害をもたらす。上記疾患のその後の慢性的な進行相は、代表的には、上記ミエリン鞘の活発な変性および上記脱髄病変の不適切な髄鞘再生（ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）に起因する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００７】
希突起膠細胞は、脱髄障害の主要な標的細胞であり、これら障害からの回復には希突起膠細胞による正常なミエリンの再生が必要であると考えられている。しかし、髄鞘再生は、しばしば、不十分なプロセスであり、このプロセスは、顕著な障害および／もしくは死をもたらす。証拠から、髄鞘再生の主要な細胞機構は、発生的髄鞘形成（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）とは異なり得ることが示唆されている（非特許文献１；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。従って、理解されている髄鞘再生は、ミエリン修復の原因、影響および改善選択肢を同定する重要な局面のうちの１つである。実際に、ＭＳ研究における大きな挑戦は、髄鞘再生失敗の原因を理解すること、およびその結果を改善する方法を考案することである。近年において、いくつかの系統の証拠から、ＭＳにおける脱髄した病変は、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）において欠損しておらず、むしろ、髄鞘再生の失敗は、希突起膠細胞の不十分な再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と関連することが示唆された（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００８】
現在では、髄鞘再生した軸索を同定する能力は、このような軸索のミエリン鞘が、例えば、同定のための電子顕微鏡（ＥＭ）分析の使用を介して、より薄くなる傾向にあるという前提に基づいている。インビボでの髄鞘再生の慣用的な分析には、特に、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ここで上記脱髄および髄鞘再生は、１つの特定の位置に正確に位置させることはできない）のような状況においては、ＥＭ分析は、極端に骨が折れるかつ高価であり得る。
【０００９】
従って、ニューロンの髄鞘再生の分子的基礎の同定および解明を促進するために、神経細胞（例えば、髄鞘形成細胞）の誘導除去（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｂｌａｔｉｏｎ）のための方法およびシステムが未だにかなり必要である。例えば、非免疫ベースの方法を使用して、神経細胞の誘導除去のための方法およびシステムが必要である。動物モデルの使用を介するような方法およびシステムは、髄鞘再生の分子的基礎を解明するために使用され得るのみならず、髄鞘再生を促進するのに有効な生物学的に活性な薬剤を開発するためにも使用され得る。上記動物モデルはまた、脱髄障害の表現型特徴を研究し、これら表現型を逆転する生物学的に活性な薬剤を同定するための大いに必要とされているシステムを提供し得る。本発明は、これら必要性を満たし、関連する利点もまた提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５−７１４（２００２）
【非特許文献２】Ｂｒｕｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献３】Ｃｏｍｐｓｔｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１２２１−１２３１（２００２）
【非特許文献４】Ｂａｌａｂａｎｏｖら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６２−２６４（２００５）
【非特許文献５】Ｆａｒｈａｄｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１０２１４−１０２２３（２００３）
【非特許文献６】Ｒｕｆｆｉｎｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１６７−２１７５（２００４）
【非特許文献７】Ａｒｎｅｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：２１１１−２１１５（２００４）
【非特許文献８】Ｓｔｉｄｗｏｒｈｔｙら，Ｂｒａｉｎ １２７：１９２８−１９４１（２００４）
【非特許文献９】Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６４０４−６４１２（２０００）
【非特許文献１０】Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉら，Ｂｒａｉｎ １２２：２２７９−２２９５（１９９９）
【非特許文献１１】Ｍａｅｄａら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４９：７７６−７８５（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
本発明は、細胞の時間および組織特異的誘導除去のための方法およびシステムを提供する。一局面において、本発明は、第１の異種配列の発現を制御することであり、ここで上記発現は、組織特異的プロモーターによって制御され、発現は、誘導因子の添加によってブロックが解除される（ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ）まで、ブロックされる。このことは、上記組織特異的プロモーターへの転写的接近およびタンパク質（これは、次いで、細胞死を誘導するタンパク質をコードする第２の異種配列の発現を誘導し得る）をコードする第１の異種配列の発現を可能にする。このような協調したシステムは、時間および位置での遺伝子発現の制御を可能にして細胞死をもたらす。一局面において、細胞は、神経細胞（例えば、髄鞘形成細胞）である。非ヒトトランスジェニック動物は、ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで上記第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、上記第１の異種ヌクレオチド配列は、上記動物において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；およびｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで上記第２の異種タンパク質は、上記第１の異種タンパク質の活性化の際に発現され、非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、ここで上記第１の異種タンパク質の初期活性化は、上記動物において上記非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、上記動物において脱髄を生じ、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じ、そして上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質の初期活性化の後に逆転される、第２の異種ヌクレオチド配列を含む、動物である。いくつかの実施形態において、上記動物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される動物）である。例えば、上記動物は、少なくとも約５週齢、約４〜６ヶ月齢、もしくは６ヶ月齢を超えるマウスであり得る。上記非増殖グリア細胞は、上記中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、もしくはその両方に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方の脱髄を生じる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、そのゲノムの中に、グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列（ここで上記第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、上記第１の異種タンパク質の活性は、誘導性である）を含む。上記活性（例えば、組換え）は、外因性薬剤によって誘導され得る。上記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体）であり得る。いくつかの実施形態において、上記改変体は、融合タンパク質（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合物）である。このような実施形態において、上記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログ（例えば、上記融合タンパク質が、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である場合）であり得る。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤は、１回より多く上記動物に投与される。さらに他の実施形態において、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、上記第１の異種タンパク質の活性化の前に、もしくはそれと同時に、もしくはその後に、または上記外因性薬剤の投与後に、上記動物に投与される。上記外因性薬剤、上記ＬＰＳ、もしくはその両方は、例えば、ＣＮＳもしくはＰＮＳに対して、局所にもしくは腹腔内に投与され得る。例えば、上記外因性薬剤、ＬＰＳ、もしくはその両方の局所への投与は、上記脳、視神経、もしくは脊髄に対するものであり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、そのゲノムの中に、グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列を含む。例えば、上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）を含むが、これらに限定されない群より選択される遺伝子のプロモーターであり得る。所望される場合、特定の実施形態において、上記プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰからなる群より選択される遺伝子のプロモーターである。
【００１４】
別の局面において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含み、ここで上記第２の異種タンパク質は、上記第１の異種タンパク質の活性化の際に非増殖グリア細胞の死滅を誘導する。いくつかの実施形態において、上記第２の異種タンパク質は、細胞死を誘導する。上記第２の異種タンパク質は、外毒素（例えば、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット）であり得る。例えば、上記第２の異種タンパク質は、ジフテリア毒素のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）であり得る。上記第２の異種タンパク質は、増殖グリア細胞（例えば、希突起膠細胞前駆細胞もしくは星状細胞）、または非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくは髄鞘形成シュワン細胞）の両方の死滅を誘導し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物における上記非増殖グリア細胞の死滅は、脱髄をもたらし、脱髄状態（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））に特徴的な１種以上の表現型変化を生じる。上記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、もしくはＣＮＳ伝導の低下である。いくつかの実施形態において、上記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイ（例えば、ＤｉｇｉＧａｉｔトレッドミルによる）によって測定され、ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される。
【００１６】
本発明のさらに他の局面において、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化が、上記動物における脱髄（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において）生じた後に逆転される。いくつかの実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質を活性化してから、約３５日間以降に逆転される。さらに他の実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、上記第１の異種タンパク質を活性化してから、約７０日間以降に逆転される。
【００１７】
また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である。上記細胞は、増殖細胞もしくは非増殖細胞であり得る。
【００１８】
本発明はまた、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の逆転を促進する生物学的に活性な薬剤を選択する方法を提供し、上記方法は、ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質を活性化する工程；ｂ）候補薬剤を上記動物に投与する工程；ｃ）上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；およびｄ）上記１種以上の表現型変化が上記候補薬剤を投与しないコントロール動物と比較してより迅速に逆転される場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。脱髄状態（例えば、ＭＳ）に特徴的な１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、上記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、もしくはＣＮＳ伝導の低下である。いくつかの実施形態において、上記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって（例えば、ＤｉｇｉＧａｉｔトレッドミルによって）測定され、ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される。
【００１９】
また、髄鞘再生を促進する生物学的に活性な薬剤を選択する方法が本明細書で提供され、上記方法は、：ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質を活性化する工程；ｂ）候補薬剤を上記動物に投与する工程；ｃ）上記動物において髄鞘再生を決定する工程；およびｄ）上記動物が上記候補薬剤を投与しないコントロール非トランスジェニック動物と比較して髄鞘再生の増大を示す場合、上記薬剤を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記髄鞘再生は、髄鞘形成した軸索によって、希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって、もしくはこれらの組み合わせによって特徴付けられる。上記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ対立遺伝子を有するマウスと交配し、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを生じる、ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ対立遺伝子を含むマウスの模式図を示す。ＬｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）領域のＣｒｅ媒介性削除は、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいてタモキシフェンで誘導され、ＤＴＡ発現を生じる。
【図２】図２は、ＰＣＲ結果を図示し、この結果により、図１に示されるプライマーＰ１およびＰ２を使用して、タモキシフェン処置したＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの脳におけるＤＴＡメッセージの発現が確認される。ＤＴＡの誘導発現がない成体ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（コントロール）；およびタモキシフェンによってＤＮＡ発現が誘導された成体ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（それぞれ、ｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１（１回目のタモキシフェン注射（ｄｐｉ）の７日間後、１４日間後、および２１日間後の上記タモキシフェン処置マウスを表す））を示す。
【図３】図３は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスにおける細胞死出現を図示する。（Ａ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞核（矢印）の数の増加が、コントロールと比較して、５ｄｐｉにおいて上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスの脳梁領域において見いだされた。（Ｂ）同じ領域から、カスパーゼ−３の活性型（矢印）について陽性染色された細胞の数の増加が示された。このことは、希突起膠細胞の死滅が、Ｃｒｅ組換えがこれら細胞において生じたすぐあとに起こることを示す。細胞核を、ＤＡＰＩで対比染色した。
【図４】図４は、上記タモキシフェン処置したＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス ２１ｄｐｉのＣＮＳにおける少数の希突起膠細胞を図示する。小脳（上側パネル）および脊髄（下側パネル）におけるＣＣ−１染色は、コントロールマウスと比較して、上記マウス２１ｄｐｉ（ｍｕｔ−Ｄ２１）において低下している。
【図５】図５は、希突起膠細胞の細胞喪失が、２１ｄｐｉまでのタモキシフェン処置マウス ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１（それぞれ、上記タモキシフェン処置マウスの７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、および２１ｄｐｉを示す））の大部分のＣＮＳ領域において最大であることを図示するグラフを示す。
【図６】図６は、コントロールマウスと比較して、７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、もしくは２１ｄｐｉのタモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡにおける希突起膠細胞の細胞喪失より先に起こる（Ａ）Ｐｌｐおよび（Ｂ）ＭｂｐのｍＲＮＡレベルの劇的な低下を図示するグラフを示す。
【図７】図７は、コントロールマウスと比較した、（Ａ）脊髄のトルイジンブルー染色（上側のパネル）および電子顕微鏡検査（ＥＭ，下側のパネル）、ならびに（Ｂ）脳におけるＭＡＧおよびＭＢＰのタンパク質発現によって示されるとおり、ＣＮＳミエリンにおける希突起膠細胞の細胞喪失の影響が、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおいて最小であることを図示する。（Ａ）における矢印は、上記タモキシフェン処置 ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおけるミエリン鞘ラメラの分離によって生成される白質の空胞を指す。
【図８】図８は、７０ｄｐｉまでにタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの（Ａ）脳幹、（Ｂ）小脳、（Ｃ）頚髄灰白質、および（Ｄ）視神経における、ほぼ正常への希突起膠細胞の細胞数が回復したことを図示する。ＣＣ−１陽性細胞の定量化により、希突起膠細胞数が、２１ｄｐｉにおいて、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて有意に低下し、次いで、３５ｄｐｉでは全ての領域において僅かに増加し、７０ｄｐｉでは、いたるところでコントロールに匹敵する値に達したことが示された（ｎ＝４，＊ｐ＜０．０１３，＊＊ｐ＜０．００６，両側ｔ検定）。グラフＡ〜Ｄは、平均値±標準偏差を示す（灰色＝コントロールマウス、黒＝タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス）。
【図９】図９は、図８に図示されるように、希突起膠細胞の細胞数に類似した変化を示す、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（「変異体」）の脳における（Ａ）Ｐｌｐ ｍＲＮＡレベルの発現および（Ｂ）ＭｂｐのｍＲＮＡレベルの発現を図示する。
【図１０】図１０は、コントロールと比較して、ＰＩの２１日間、ＰＩの３５日間、およびＰＩの７０日間においてタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳにおけるミエリン欠損の進行および修復を図示する（ｍｕｔ−Ｄ２１、ｍｕｔ−Ｄ３５、およびｍｕｔ−Ｄ７０（それぞれ、上記タモキシフェン処置マウスの２１、３５、および７０ｄｐｉを表す））。
【図１１】図１１は、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳミエリンにおける損傷が７０ｄｐｉまでに修復されることを図示する。ＤＴＡの誘導発現がないＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（本明細書においてＤＴＡと省略される）（コントロール）；およびタモキシフェンによるＤＴＡ発現が誘導されたＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ＤＴＡ−２１ｄｐｉ、ＤＴＡ−３５ｄｐｉ、およびＤＴＡ−７０ｄｐｉ（それぞれ、１回目のタモキシフェン注射をして２１日間後、３５日間後、および７０日間後の上記タモキシフェン処置マウスを表す））が示される。
【図１２】図１２は、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスのＣＮＳにおけるミクログリア活性化の増大を図示する。（Ａ）上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの３５ｄｐｉの小脳（ＣＢ）におけるＣＤ１１ｂマーカーは、脱髄と相関する。（Ｂ〜Ｅ）総ＣＮＳ細胞を、個々の同腹仔コントロールおよび３５ｄｐｉのタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ｎ＝８）の脳および脊髄から単離した。上記細胞を計数し、フローサイトメトリー分析（ＣＤ４５＋細胞の存在について生細胞をゲーティングし、かつＣＤ１１ｂ＋細胞の存在についてＣＤ４５ｌｏ集団に対してＣＤ４５ｈｉをゲーティングする）を介して分析した。代表的同腹仔コントロールマウスからのフロープロット（Ｂ）、およびタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（ＤＴＡ）からのフロープロット（Ｃ）を、示す。ＣＤ４５ｈｉ細胞およびＣＤ４５ｌｏ細胞の総数（Ｄ）、ならびにＣＤ４５ｌｏ／ＣＤ１１ｂ＋細胞の総数（Ｅ）を、コントロール 対 ＤＴＡ動物にして示す（データは、１群あたり８匹のマウスの細胞数の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表わした。＊＊ｐ＜０．００１（Ｄ）、＊＊ｐ＜０．００４（Ｅ）。スケールバー：１００μｍ（Ａ））。
【図１３】図１３は、成体希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣｓ）の数が、脳幹および小脳におけるＰＤＧＦＲα陽性細胞によって示されるように、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの３５ｄｐｉにおいて増加することを図示する。
【図１４】図１４は、上記ロータロッド行動アッセイ（これは、上記マウスの運動協調および平衡の評価を提供する）を使用する、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウス（「変異体」）における運動機能の欠陥およびその後の回復の定量的評価を示す。
【図１５】図１５は、ＣＮＳ伝導特性を測定するために使用される脊髄体性感覚誘発電位（ＳＥＰ）の模式図を示す。ＳＥＰを、足首において脛骨神経を刺激することによって、下部腰椎（Ｌ４−Ｌ５）および中位胸椎（Ｔ５−Ｔ６）の椎骨レベルから記録する。Ｔ５−％６とＬ４−Ｌ５のＳＥＰピーク潜時との間の差異（ΔＬａｔ）を、上記ＣＮＳ伝導性の評価として使用する。
【図１６】図１６は、３５ｄｐｉおよび７０ｄｐｉのコントロールマウスおよびＤＴＡマウスから記録したＳＥＰ波形を図示する。各ＳＥＰ線は、足首における脛骨神経の刺激後に、上記下部腰椎レベルもしくは中位胸椎レベルから記録された２５〜３０の誘発応答の平均を表す。ＳＥＰ誘発は、２１ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて可能でなかった。このことは、上記ＰＮＳおよびＣＮＳの両方に生じているミエリンもしくはニューロンの機能不全におそらく起因する。
【図１７】図１７は、上記ＳＥＰパラメーター（ピーク潜時（Ｌａｔ）およびΔ潜時（ΔＬａｔ，上記Ｔ５〜Ｔ６とＬ４〜Ｌ５のピーク潜時の間の差異）、および振幅（Ａｍｐ））の統計分析を図示する。３５ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて、ピーク潜時は延長し、Δ潜時は増大する一方で、振幅は減少する。このことは、これらマウスのＰＮＳおよびＣＮＳの両方における重度の伝導欠陥を示す。７０〜７７ｄｐｉにおいて、ＤＴＡマウスにおいて観察される振幅は、コントロールに匹敵する値に達するが、３５ｄｐｉの値と比較すると改善したものの、ピーク潜時における軽度の欠陥が残っている。グラフは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。３５ｄｐｉに関しては、ｎ＝７〜８、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０００１。７０〜７７ｄｐｉに関しては、ｎ＝６〜７、＊ｐ＜０．０３；＊＊ｐ＜０．００８。
【図１８】図１８は、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウスの視神経におけるミエリン欠陥および軸索欠陥の定量化を図示する。（Ａ）上記視神経のＥＭ分析から、５６ｄｐｉのＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）において観察可能な広範囲なミエリン喪失は、７０ｄｐｉまでに修復されることが明らかにされ、７０ｄｐｉの時点で、多くの軸索が、薄く髄鞘形成していることが分かった。（Ｂ）髄鞘形成していない軸索の数は、両方の時点で、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）において有意に高かったが、５６ｄｐｉと比較して、７０ｄｐｉにおける髄鞘形成していない軸索は、約７０％低かった（＊＊ｐ＜１．３０×１０−５，ｎ＝３）。（Ｃ）上記視神経における髄鞘形成した軸索のｇ比および軸索直径を比較する線形回帰分析から、コントロール（灰色の点，ｎ＝３）と比較して、７０ｄｐｉのＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）（黒点，ｎ＝３）における軸索の全てのサイズに関して、より薄いミエリンが示された。（Ｄ）ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡタモキシフェン処置マウス（「ＤＴＡ」）の視神経における軸索の総数は、２１ｄｐｉおよび７０ｄｐｉにおけるコントロール値に類似であることが分かった（ｐ＞０．２７，ｎ＝３）。ＢおよびＤのグラフは、平均値±Ｓ．Ｄを示す。スケールバー：２μｍ（Ａ）。
【図１９】図１９は、脱髄状態（例えば、多発性硬化症）および髄鞘再生に特徴的な表現型の進行のタイムラインを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（実施形態の詳細な説明）
本開示全体を通じて、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が、特定している引用によって参照される。これら刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が属する分野の技術分野をさらに記載するために、本開示の中に参考として本明細書によって援用される。
【００２２】
（一般的技術）
本発明の実施は、別段示されなければ、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を使用するが、これら技術は、当該分野の技術範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ら ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）： ＰＣＲ ２： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８） ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（２００３）；Ｂ．Ｃ．Ｃｈｅｎ， ＰＣＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（２０１０）を参照のこと。
【００２３】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が別のことを明らかに示さなければ、複数形への言及を含む。例えば、用語「１つの細胞、ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞（その混合物を含む）を含む。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログ）のポリマー形態に言及する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、任意の機能（既知もしくは未知）を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのコード領域もしくは非コード領域、連鎖分析から規定される複数の遺伝子座（単数の遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。存在する場合、上記ヌクレオチド構造物に対する改変は、上記ポリマーのアセンブリ前もしくはアセンブリ後に付与され得る。上記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に（例えば、標識成分との結合体化によって）さらに改変され得る。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において交換可能に使用され、それは、任意の長さのアミノ酸のポリマーに言及する。上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよいし、改変アミノ酸を含んでいてもよいし、そして非アミノ酸によって中断されていてもよい。上記用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作（例えば、標識成分との結合体化）。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸（グリシン、およびＤ光学異性体もしくはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む）のいずれかに言及する。
【００２６】
用語「異種」とは、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。用語「異種」とは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに適用される場合、それが比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に、上記ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが由来することを意味する。例えば、ヌクレオチド配列もしくはタンパク質に適用される場合、それが比較される実体の残りのものとは遺伝子型的が異なる実体に、上記ヌクレオチド配列もしくはタンパク質が由来することを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセスおよび／または上記転写されたｍＲＮＡ（「転写物」ともいわれる）がその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスに言及する。上記転写物および上記コードされるポリペプチドは、まとめて「遺伝子生成物」といわれる。上記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞における上記ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００２８】
用語「髄鞘再生している」もしくは「髄鞘再生」とは、髄鞘形成を修復するもしくは発生的でない髄鞘形成を修復することに言及する。
【００２９】
「被験体」、「個体」もしくは「患者」は、本明細書において交換可能に使用され、これらは、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに言及する。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用の動物、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。インビボで得られた生物学的実体もしくはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫もまた、包含される。
【００３０】
本明細書に記載される動物モデルもしくは細胞培養アッセイにおいて使用される「生物学的に活性な薬剤」とは、生物学的もしくは化学的な化合物（例えば、単純なもしくは複雑な有機もしくは無機の分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、もしくはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス））からなる群より選択され得る。さらに、複雑な有機もしくは無機の分子を含むこのような薬剤は、化合物の不均質混合物（例えば、粗製のもしくは精製した植物抽出物）を含み得る。
【００３１】
「プロモーターエレメント」とは、このような配列に連結される遺伝子の転写を促進する調節配列である。上記調節配列は、エンハンサー配列もしくはその機能的部分を含み得る。
【００３２】
「コントロール」とは、比較目的で実験に使用される補助的な被験体、細胞もしくはサンプルである。
【００３３】
「ｌｏｘＰに挟まれた」ＤＮＡ領域とは、２個のｌｏｘ部位（改変体ｌｏｘ部位を含む）が隣り合っているＤＮＡの領域に言及し、上記ＤＮＡ領域は、転写終結因子（例えば、停止シグナル）を含む。上記ＤＮＡ領域は、代表的には、遺伝子を含む。例えば、上記「ｌｏｘＰに挟まれた」ＤＮＡは、マーカー（例えば、ｅＧＦＰ）であり得る。
【００３４】
「停止信号構築物（ｓｔｏｐｌｉｇｈｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、ｌｏｘＰに挟まれ、第２の遺伝子にさらに作動可能に連結された第１の遺伝子を含む遺伝子構築物に言及する。上記「停止信号構築物」は、「停止信号カセット」とも言及され得、必要に応じて、プロモーター配列に作動可能に連結され得る。従って、上記第１のｌｏｘＰに挟まれた遺伝子がリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）媒介性組換えを介して除去される場合、上記第２の遺伝子は、発現される。例えば、上記第１のｌｏｘＰに挟まれた遺伝子は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の遺伝子に作動可能に連結された蛍光マーカータンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）であり得る。上記第２の遺伝子（例えば、ＤＴＡ）の発現は、上記第１の領域および停止シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域が原因で阻害される。上記ｌｏｘＰに挟まれたｅＧＦＰおよび停止シグナルが組換えを介して除去される場合、上記第２の遺伝子であるＤＴＡは、転写され発現され得る。
【００３５】
「脱髄状態に特徴的な表現型」とは、軸索の分析も、髄鞘形成細胞の分析も、他の分子の分析や細胞の分析（例えば、軸索の電子顕微鏡検査、免疫組織化学、または神経細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の遺伝子発現もしくはタンパク質発現を決定すること）もなしで確認し得る、脱髄状態に特徴的な表現型に言及する。例えば、脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導における低下であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。
【００３６】
（トランスジェニック動物）
本発明は、神経細胞の誘導除去のための方法およびシステムを提供する。上記モデルシステムは、髄鞘再生の機構の解明、ならびに髄鞘再生を促進するための治療的ストラテジーの開発において有用である。一局面において、上記システムもしくは動物モデルは、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る非ヒトトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態において、非増殖グリア細胞の特異的除去は、上記動物において脱髄を生じる。
【００３７】
脱髄は、神経系（例えば、中枢神経系もしくは末梢神経系）における髄鞘形成された軸索の減少によって、または髄鞘形成細胞のマーカーのレベルの低下によって、特徴付けられ得る。本明細書で使用される場合、髄鞘形成細胞とは、上記神経系において軸索を絶縁するミエリンを生成し得る細胞をいう。例示的な髄鞘形成細胞は、中枢神経系においてミエリンの生成を担う希突起膠細胞、および末梢神経系においてミエリンの生成を担うシュワン細胞である。形態的には、ニューロンの脱髄は、上記中枢神経系における希突起膠細胞もしくは上記末梢神経系におけるシュワン細胞の喪失によって特徴付けられ得る。ニューロンの脱髄はまた、上記神経系における髄鞘形成された軸索の減少によって、または希突起膠細胞もしくはシュワン細胞、ＣＣ１、マーカーのレベルの低下によって決定され得る。希突起膠細胞もしくはシュワン細胞の例示的なマーカータンパク質としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本発明の方法によって同定される候補薬剤は、ニューロンの脱髄の有害な形態的特性を阻害し得る物質を包含する。
【００３８】
脱髄はまた、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示す動物によって特徴付けられ得る。脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導の減少であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型変化としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。
【００３９】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し得、ここで上記１種以上の表現型変化が逆転される。例えば、上記非増殖グリア細胞の選択的除去の誘導後に、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し、そして上記動物は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化の逆転を示し得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、ここで上記動物が、野生型動物、もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すようには誘導されない動物が示す表現型を示すように、上記動物は脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化から回復する。他の実施形態において、表現型の逆転とは、上記表現型が改善する場合のことである。例えば、時点Ａにおいて、動物が、振せんを示し始める；時点Ｂにおいて、上記動物は、振せんが増大している；そして時点Ｃにおいて、上記動物は、時点Ａと同様な表現型を示し、時点Ｂと比較すると、表現型が改善している。別の例において、表現型の逆転は、機能（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導）の完全な喪失が存在する場合のことであって、逆転とは機能の獲得（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導の獲得）のことであり得る。上記獲得は、機能におけるわずかな改善であり得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物と同じレベルへの完全な機能の再獲得であり得る。
【００４０】
非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る上記非ヒトトランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質をコードする第１の異種ヌクレオチド配列および第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含む。上記第１の異種タンパク質の活性（例えば、その発現および転写事象の調節）は、誘導性であり得る。上記第１の異種タンパク質の活性のこの誘導はまた、本明細書において、このようなタンパク質の「活性化」といわれる。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼであり、その組換え活性は、誘導性である。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼであり、これは、同族認識配列、ｌｏｘＰ配列（すなわち、ｌｏｘＰ部位）を認識する。認識配列は、当該分野で公知であり、タンパク質分子、ＤＮＡ分子、もしくはＲＮＡ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、もしくはリコンビナーゼ）が、認識および結合する特定のＤＮＡ配列を表す。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接している２個の１３塩基対の逆方向反復（上記リコンビナーゼ結合部位として働く）から構成される３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと）。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２個の９塩基対のコアタイプＩｎｔ結合部位および７塩基対の重複領域を含む約２５塩基対配列である。ａｔｔＰは、コアタイプＩｎｔ結合部位およびアームタイプＩｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質であるＩＨＦ、ＦＩＳ、およびＸｉｓのための部位を含む約２４０塩基対の配列である（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）。このような部位はまた、当該分野で公知の方法および生成物（例えば、Ｈａｒｔｌｅｙら，米国特許出願公開第２００６００３５２６９号による開示で開示される）を利用する組換えを高めるために、本発明に従って操作され得る。
【００４１】
上記Ｃｒｅリコンビナーゼは、野生型であっても上記野生型の改変体であってもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｃｒｅリコンビナーゼの活性は、上記トランスジェニック動物（もしくはトランスジェニック細胞）において誘導性である。改変体Ｃｒｅリコンビナーゼは、組換え部位に対して広い特異性を有する。具体的には、上記改変体は、上記ｌｏｘＰ配列以外の配列と、野生型Ｃｒｅリコンビナーゼが活性である他のｌｏｘ部位配列との間の組換えを媒介する。一般に、上記開示されるＣｒｅ改変体は、野生型Ｃｒｅが作用し得るｌｏｘ部位（野生型ｌｏｘ部位といわれる）の間、野生型Ｃｒｅによっては効率的に利用されない改変体ｌｏｘ部位（改変体ｌｏｘ部位といわれる）の間、および野生型ｌｏｘ部位と改変体ｌｏｘ部位との間での効率的な組換えを媒介する。例えば、上記Ｃｒｅ改変体は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（もしくは他の類似のリコンビナーゼ（例えば、ＦＬＰ））が使用され得る任意の方法もしくは技術において使用され得る。さらに、上記Ｃｒｅ改変体は、異なる代替の組換えが行われることを可能にする。なぜなら、上記Ｃｒｅ改変体は、野生型ｌｏｘ部位と改変体ｌｏｘ部位との間の遙かにより効率的な組換えを可能にするからである。このような代替の組換えの制御は、異なる逐次的組換えを達成して、野生型Ｃｒｅリコンビナーゼで可能ではない結果を達成するために使用され得る。改変体Ｃｒｅリコンビナーゼは、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，８９０，７２６号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）の開示において開示される）。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、外因性薬剤によって誘導される場合に活性であるように操作されるリコンビナーゼをコードする。Ｃｒｅ活性の誘導性は、制御され得る。いくつかの実施形態において、上記Ｃｒｅタンパク質は、上記Ｃｒｅリコンビナーゼと、プロゲステロンレセプター（例えば、Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：１７５−１８２（１９９９））もしくはエストロゲンレセプター（例えば、Ｆｅｉｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０８８７−１０８９０（１９９６）；Ｆｅｉｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７（１９９７））のリガンド結合ドメインの変異したバージョンとの融合物であり得、上記活性は、外因性薬剤によって誘導され得る。例えば、後者の融合物は、上記Ｃｒｅ融合物（ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）を生じ、ここで上記組換え活性は、上記Ｃｒｅタンパク質の局在化を通じてリガンドによって制御される。リガンドの非存在下で、ＣｒｅＥＲＴ（もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、細胞質性である。しかし、合成ステロイドホルモン（タモキシフェンもしくはその改変体またはアナログ（例えば、４−ヒドロキシ（ＯＨ）−タモキシフェン））の投与後に、上記ＣｒｅＥＲＴ（もしくはＣｒｅＥＲＴ２）タンパク質は、該タンパク質が機能する核内に移行する（すなわち、タモキシフェン誘導性）。他の実施形態において、他の誘導性システムが使用され得る（例えば、Ｔｅｔ−ＯｎおよびＴｅｔ−Ｏｆｆシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）発現系（ここで誘導は、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）の添加を介して起こる））。
【００４３】
上記第１の異種配列は、上記非ヒトトランスジェニック動物において安定して発現され得る。例えば、上記第１の異種配列は、上記トランスジェニック動物のゲノムへと（例えば、内因性プロモーターに対する制御下にあることによって）組み込まれるリコンビナーゼをコードする。上記第１の異種配列は、グリア細胞特異的プロモーター（例えば、内因性グリア細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結され得る。上記プロモーターは、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現される遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現される遺伝子に対するものであり得る。上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、増殖希突起膠細胞前駆体に特異的なプロモーター（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα）、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｇｅｎｅ）（ＧＦＡＰ））、またはニューロンに特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）に作動可能に連結され得る。従って、上記第１の異種タンパク質（例えば、リコンビナーゼ）の発現および活性は、細胞特異的であり得る。
【００４４】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物において、上記第１の異種タンパク質の活性は、例えば、停止シグナルを除去し、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素）の発現を可能にするように組換えを誘導することによって、上記第２の異種タンパク質の発現を誘導し得る。次いで、上記第２の異種タンパク質（もしくは毒素）の発現は、細胞死を誘導し得る。上記第１の異種タンパク質（例えば、リコンビナーゼ）の発現および活性は細胞特異的であり得るので、上記第１の異種タンパク質の活性は、細胞特異的様式において上記第２の異種タンパク質の発現を誘導し得る。例えば、上記第２の異種配列は、上記第２の異種タンパク質（これは、細胞死を誘導する）をコードし得、その発現および得られた細胞死は、細胞タイプ特異的であり得る。例えば、上記第２の異種タンパク質の発現は、神経細胞（例えば、グリア細胞）において特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種タンパク質の発現は、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくは星状細胞の上記細胞特異的死滅、もしくは細胞特異的除去を誘導し得る。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、非増殖グリア細胞（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方における）であり、ここで上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において脱髄を生じる。
【００４５】
記載されるように、上記第２の異種配列は、毒素もしくは外毒素をコードし得る。例えば、上記毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット（例えば、そのＡサブユニット）であり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列の発現は、転写に対する終結シグナルもしくは停止シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた上流領域が原因で抑制される。従って、上記停止シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた上流領域が、例えば、組換え（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、上記第１の異種配列によってコードされ、外因性薬剤によって活性化されるＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）によって除去される場合、上記第２の異種配列は、転写され得、上記タンパク質が発現され得る。
【００４６】
別の実施形態において、同じ異種配列が、毒素もしくは外毒素をコードし、細胞特異的プロモーターを含む。例えば、上記毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニット（例えば、そのＡサブユニット）であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ｐｄｕａｌ発現ベクター系（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）におけるように、ブロックされているが、誘導因子の添加の後にいったん放出される上流のエンハンサー領域を含み、毒素もしくは外毒素をコードする上記異種配列を発現する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は、１種以上のマーカー（例えば、蛍光タンパク質マーカーもしくは薬物耐性マーカー）を含む。本発明において使用され得るマーカー遺伝子の非網羅的な例としては、造礁サンゴ蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ１、クラゲ蛍光タンパク質（ＦＰ）改変体、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ変異体Ｈ９、ＧＦＰ Ｈ９−４０、ｅＧＦＰ、テトラメチルローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、テキサスレッド、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｋａｅｄｅ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｄｏｒｉ Ｃｙａｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅおよびナフトフルオレセイン、もしくはこれらの増強された機能改変体が挙げられる。蛍光団タンパク質マーカーをコードする多くの遺伝子が、当該分野で公知であり、これらは、本明細書中で使用することができる（例えば、ウェブサイト：＜ｃｇｒ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｈｏｒｎｌａｂ／ｇｆｐｓ．ｈｔｍ＞を参照のこと）。より高い強度の光を発するかもしくは波長シフトを示す蛍光タンパク質の変異バージョンはまた、本発明の組成物および方法において利用され得る；このような改変体は、当該分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，２００５を参照のこと）。
【００４８】
さらに他の実施形態において、上記毒素をコードする上記第２の異種配列は、グリア細胞特異的プロモーター（例えば、内因性グリア細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結される。上記プロモーターは、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現されている遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現されている遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列は、増殖希突起膠細胞前駆体に対して特異的なプロモーター（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα））、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ＧＦＡＰ））、もしくはニューロンに特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）に作動可能に連結される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、上記第２の異種配列は、停止信号カセット（例えば、図１に示される）の成分であり、ここで上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は、ｅＧＦＰを含み、上記第２の異種配列は、ＤＴＡをコードする。上記停止信号カセットは、トランスジェニックマウスのゲノムへと（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座へと）安定に組み込まれ得る（例えば、図１を参照のこと）。第１の異種ヌクレオチド配列および第２の異種ヌクレオチド配列をそのゲノムの中に含むトランスジェニック動物は、上記第１の異種配列を含む第１の動物を上記第２の異種配列（例えば、図１に示される）を含む第２の動物と交配することによって、作製され得る。ＲＯＳＡ２６遺伝子座へと組み込まれたＤＴＡの上流でｌｏｘＰに挟まれたｅＧＦＰを有する停止信号カセットを含む（ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ）トランスジェニック動物を、内因性ＰＬＰプロモーターの制御下にＣｒｅＥＲＴを含むトランスジェニック動物（ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ）と交配する。このことから、上記停止信号カセットおよび上記内因性ＰＬＰプロモーターの制御下にあるＣｒｅＥＲＴを含む動物（ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ）が生じ得る。ＤＴＡは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域としては発現されない。しかし、タモキシフェンで処置されると、ＣｒｅＥＲＴは活性化され、上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は組換えられ、上記転写終結シグナルが除去され、ＤＴＡが、転写および発現され得る。さらに、ＣｒｅＥＲＴ活性は、誘導性であるので、ＤＴＡ発現は、時間制御様式で、ならびに細胞特異的様式でもたらされ得、特異的な細胞タイプの特異的除去、もしくは細胞死を生じる。例えば、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて、上記マウスがタモキシフェンで処置される場合、ＰＬＰ発現細胞の特異的除去が存在する。上記除去のタイミングは、上記タモキシフェンの投与を介して制御され得る。
【００５０】
上記トランスジェニック動物（例えば、上記ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ動物および上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ動物）は、当該分野で公知の遺伝子標的化技術を利用して設計され得る（例えば、Ｉｖａｎｏｖａら，Ｇｅｎｅｓｉｓ，４３：１２９−１３５（２００５）；Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅｓｉｓ ３５：６３−７２（２００３）を参照のこと）。遺伝子標的化は、標的化された内因性配列と相同な外因性ＤＮＡ配列との相同組換えによって、染色体遺伝子座の指向された改変を表す。遺伝子標的化の異なるタイプの間で区別が行われる。従って、遺伝子標的化は、１または数個の内因性遺伝子の発現を改変する（通常は増大させる）か、または外因性遺伝子によって内因性遺伝子を置換するか、または外因性遺伝子を、活性なままである上記特定の内因性遺伝子の遺伝子発現を調節するエレメントの制御下に配置するために、使用され得る。この場合、遺伝子標的化は、「ノックイン」（ＫＩ）といわれる。あるいは、遺伝子標的化は、１または数個の遺伝子の発現を低下もしくは除去するために使用され得、このタイプの遺伝子標的化は、「ノックアウト」（ＫＯ）もしくは「ノックダウン」（ＫＤ）といわれる（例えば、Ｂｏｌｋｅｙら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：１９９−２２５（１９８９）を参照のこと）。
【００５１】
本発明に従うトランスジェニック細胞を生成する方法は、当業者に周知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術が、記載されてきた（Ｇｏｒｄｏｎ．，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９））。例えば、本明細書で開示され、上記トランスジェニック動物を生成するために使用される導入遺伝子は、直線状もしくは非直線状のベクターに、またはベクターフラグメントの形態で含まれ得、標準的な方法（例えば、核へのマイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、リン酸カルシウムを用いた沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））、熱ショック、カチオン性ポリマー（ＰＥＧ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストランなど）での形質転換、ウイルス感染（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，６１４８−６１５２（１９８５））、精子（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９）））によって、宿主細胞へと導入され得る。
【００５２】
トランスジェニック動物は、哺乳動物の接合子の前核（例えば、雄性前核）へ遺伝子構築物を挿入することによって操作され得、これにより、安定なゲノム組み込みが天然に生じることを可能にする。次いで、上記接合子は、受容する子宮へと移され得、満期まで生育が可能となる。マウスが使用され得るものの、他の種（例えば、ラット、ウサギおよび他の非ヒト動物）もまた、前核挿入のための潜在的な候補である。上記接合子をトランスジェニックにする上記遺伝子構築物は、利用されるべき内因性遺伝子（例えば、ＰＤＧＦαレセプター遺伝子）を標的とする遺伝子構築物を含み、この遺伝子は、変異され得、そして／もしくは所望のエレメント（例えば、外因性プロモーター／エンハンサーエレメントおよび／もしくは目的の遺伝子）を含むようにさらに改変され得る。
【００５３】
異種ＤＮＡはまた、同様に、受精した哺乳動物の卵子へと導入され得る。例えば、全能性もしくは多能性幹細胞は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介性沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染もしくは他の手段によって、形質転換され得る。次いで、上記形質転換された細胞は、胚へと導入され、次いで、上記胚は、トランスジェニック動物へと発生する。一実施形態において、発生中の胚は、所望の導入遺伝子を含むウイルスベクターに感染させられ、その結果、上記導入遺伝子を発現する上記トランスジェニック動物が、上記感染した胚から作られ得る。別の実施形態において、所望の導入遺伝子は、好ましくは、単一の細胞ステージにおいて、上記胚の前核もしくは細胞質に同時に注入され、上記胚は、成熟したトランスジェニック動物へと発生することが可能となる。トランスジェニック動物を作るためのこれらおよび他の変形方法は、当該分野で十分に確立されており、よって、本明細書で詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および同第５，１７５，３８４号を参照のこと。
【００５４】
本明細書で開示される発明の１つ以上の局面において、所望の導入遺伝子は、単一コピーとしてもしくはコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）（例えば、ヘッドトゥーヘッドタンデムもしくはヘッドトゥーテールタンデム）で組み込まれ得る。上記所望の導入遺伝子はまた、特定の組織もしくは細胞タイプ（好ましくは、上記中枢神経系内の細胞）へと選択的に導入され得、活性化され得る。このような細胞タイプ特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞タイプに依存し、それは当業者に明らかである。好ましくは、上記標的とされる細胞タイプは、上記神経系（上記中枢神経系および末梢神経系を含む）に位置する。
【００５５】
上記のように、トランスジェニック動物は、２つのタイプに大きく分けられ得る：「ノックアウト」および「ノックイン」。「ノックアウト」は、上記標的遺伝子の機能の低下を生じる導入遺伝子配列の導入を介して、好ましくは、標的遺伝子発現が、微々たるものであるかもしくは検出不能であるように、上記標的遺伝子において改変を有する。「ノックイン」は、例えば、上記標的遺伝子のさらなるコピーの導入によって、もしくは上記標的遺伝子の内因性コピーの発現の増大を提供する調節配列を作動的に挿入することによって、標的遺伝子の発現の増大をもたらす宿主細胞ゲノムにおける改変を有するトランスジェニック動物である。上記ノックイントランスジェニック動物もしくはノックアウトトランスジェニック動物は、上記標的遺伝子に対してヘテロ接合性であってもよいし、ホモ接合性であってもよい。ノックアウトおよびノックインの両方が、「バイジェニック（ｂｉｇｅｎｉｃ）」であり得る。バイジェニック動物は、少なくとも２つの改変されている宿主細胞遺伝子を有する。あるバイジェニック動物は、神経細胞特異的リコンビナーゼをコードする導入遺伝子および神経細胞特異的マーカー遺伝子をコードする別の導入遺伝子配列を有する。本発明のトランスジェニック動物は、大きく、ノックインとして分類され得る。
【００５６】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物としては、哺乳動物（例えば、霊長類および齧歯類）が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例としては、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラマ、およびサルが挙げられる。一実施形態において、上記動物は齧歯類である。さらに別の実施形態において、上記動物はマウス（例えば、若年もしくは老年のマウス）である。例えば、上記マウスは、少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢であり得る。上記マウスは、約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、少なくとも約４〜６週齢のマウスである。いくつかの実施形態において、上記マウスは、成体であり、６ヶ月齢より加齢している。いくつかの実施形態において、上記マウスは、加齢マウスもしくは老齢マウスである。上記マウスは、少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、約５〜７ヶ月例の間、６〜９ヶ月齢の間もしくは９〜１２ヶ月齢の間である。別の実施形態において、上記動物は、サル種に由来する。さらに別の実施形態において、上記動物は、マーモセットのサルであり、これは、神経疾患を試験することにおいて利用され得る（例えば、Ｅｓｌａｍｂｏｉ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６８：１４０−１４９（２００５）；Ｋｉｒｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：２８８４−２８８９（２００４））。本明細書で開示されるトランスジェニック動物としてはまた、非哺乳動物（例えば、魚類、鳥類、および昆虫類）が挙げられ得るが、これらに限定されない。非限定的な例としては、ゼブラフィッシュ、ニワトリおよびハエが挙げられる。
【００５７】
本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、髄鞘再生をアッセイするにあたって利用され得るシステムを提供する。このようなモデル系は、髄鞘再生の機構の解明への洞察、ならびに髄鞘再生を促進するための治療ストラテジーの開発を提供する。上記のように、上記トランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質（これは、続いて、細胞死を誘導する第２の異種タンパク質の発現を誘導する）の活性化を誘導することによって、細胞特異的様式で細胞を除去するように時間的に制御され得る。上記細胞死は、上記第１の異種タンパク質の発現が、細胞タイプ特異的プロモーターもしくは調節配列（特に、上記中枢神経系もしくは末梢神経系における発現に利用可能であるもの）の制御下にあり得るので、細胞タイプ特異的であり得る。
【００５８】
例えば、上記第１の異種タンパク質の発現は、神経細胞タイプ特異的プロモーターの制御下にあり得る（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号に開示される）；ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞もまた参照のこと。上記転写調節配列としては、以下のタンパク質をコードする遺伝子から選択される転写調節配列が挙げられるが、これらに限定されない：上記ＰＤＧＦＲα、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、上記グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）および微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、Ｔｈｙ１．２、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＢＳＦ１、ドパミン３−ヒドロキシラーゼ、セロトニン２レセプター、コリン・アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ならびにスルファチド。
【００５９】
いくつかの実施形態において、上記調節配列もしくはプロモーターは、グリア細胞（例えば、星状膠細胞、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）に対して特異的である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、成熟した、分化している、もしくは非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）において高度に発現されるかもしくは特異的に発現される遺伝子に対するものである。上記プロモーターは、髄鞘形成細胞において高度に発現されるかもしくは特異的に発現される遺伝子に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターもしくは調節配列は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰに対するものである。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、増殖希突起膠細胞前駆体に対して特異的な遺伝子（例えば、血小板由来増殖因子αレセプター（ＰＤＧＦＲα）に対するもの、星状細胞に特異的なプロモーター（例えば、グリア線維酸性タンパク質遺伝子（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｇｅｎｅ）（ＧＦＡＰ））、もしくはニューロンに対して特異的なプロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＢＳＦ１）である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記第１の異種配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）をコードし、前述のプロモーターもしくは調節配列の制御下にある。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記調節配列は、発現を高める（すなわち、プロモーター強度を増大させる）ように変化させられ得るかもしくは改変され得る。例えば、エンハンサー機能を含むイントロン配列は、プロモーター機能を増大させるために利用され得る。上記ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子は、エンハンサーエレメントとして機能するイントロン配列を包含する。この調節エレメント／領域ＡＳＥ（アンチサイレンサー／エンハンサーの）は、エキソン１ ＤＮＡの約１ｋｂ下流に位置し、ほぼ１００ｂｐを包含する。Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８２：３４６−３５６（２００５）を参照のこと。
【００６２】
よって、上記第１の異種タンパク質（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２））は、特異的細胞タイプにおいて発現および活性化され得、同じ特異的細胞タイプにおいて、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素）の発現を誘導し得る。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、希突起膠細胞特異的プロモーターもしくは調節配列の制御下もしくは調節下にあることによって、希突起膠細胞において発現される。上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂａｉｎｓｅ）が、タモキシフェンによって活性化される場合、上記第２の異種タンパク質（例えば、毒素（例えば、ＤＴＡ））の発現は、希突起膠細胞において誘導される。次いで、上記毒素は、上記希突起膠細胞の細胞死を促進し得る。あるいは、上記Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２もしくはＣｒｅＥＲＴ２）は、シュワン細胞特異的プロモーターもしくは調節配列の制御下もしくは調節下にあることによって、シュワン細胞において発現され得る。上記Ｃｒｅリコンビナーゼは、タモキシフェンによって活性化され得、これは、シュワン細胞において上記毒素の発現を誘導し、上記シュワン細胞の細胞死を引き起こす。上記髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくはその両方）の細胞死は、上記動物のＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において、脱髄を生じ得る。
【００６３】
上記第１の異種タンパク質はまた、時間的様式で活性化され得、従って、得られた除去もしくは細胞死は、時間的に制御され得る。例えば、上記第１の異種タンパク質は、非増殖細胞（例えば、成熟したもしくは分化した、神経細胞）において活性化され得る。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質の活性化は、成熟した、もしくは増殖していない、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方の細胞にあり、上記第２の異種タンパク質の発現およびその後の、上記成熟したもしくは非増殖細胞の細胞死を生じる。いくつかの実施形態において、上記除去は、非増殖髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の除去である。上記活性化は、外因性薬剤（例えば、上記第１の異種タンパク質を活性化する上記外因性薬剤の投与）によって時間的に制御され得る。上記外因性薬剤は、上記グリア細胞が、増殖ステージもしくは非増殖ステージにある場合に、上記動物へと投与され得る。例えば、上記外因性薬剤は、上記シュワン細胞もしくは希突起膠細胞が、増殖ステージにある場合に、上記動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤は、上記シュワン細胞もしくは希突起膠細胞が、成熟したもしくは増殖していない場合に、上記動物に投与される。例えば、マウスにおいて、上記外因性薬剤は、上記マウスが、少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢である場合に、投与される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが、約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間である場合に、上記外因性薬剤で処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である。さらに他の実施形態において、上記マウスは、少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢であり得る。いくつかの実施形態において、上記マウスは、約５〜７ヶ月齢の間、６〜９ヶ月齢の間、もしくは９〜１２ヶ月齢の間である。
【００６４】
一局面において、本発明は、第１の異種配列の発現を制御することであり、ここで上記発現は、組織特異的プロモーターによって制御され、発現は、誘導因子の添加によって解除されるまでブロックされており、これにより、上記組織特異的プロモーターへの転写的アクセスが可能となり、そして細胞死を誘導するタンパク質をコードする第２の異種配列の発現を誘導し得るタンパク質をコードする第１の異種配列の発現が可能となる。このような協調したシステムは、細胞死をもたらす遺伝子発現の時間および位置の制御を可能にする。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列を含み、これは、内因性の細胞特異的プロモーターの制御下にある。上記動物は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列をさらに含み、これは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にある。上記動物は、希突起膠細胞においてＣｒｅＥＲＴを発現するが、理論に縛られずに、上記ＣｒｅＥＲＴは、上記核内へ移行すること、および組換えを実行することができない。結果として、上記動物は、ＤＴＡを発現しない。しかし、タモキシフェンで処置すると、ＣｒｅＥＲＴが活性化され、上記転写終結シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は除去され、ＤＴＡが、転写および発現され得、このことから、細胞死が誘導される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、内因性グリア細胞特異的プロモーター（例えば、ＰＬＰ）の制御下にある誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列を含む。上記動物は、毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列をさらに含み、これは、転写終結シグナル（例えば、停止コドン）を含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にある。上記動物は、希突起膠細胞においてＣｒｅＥＲＴを発現するが、理論に縛られずに、上記ＣｒｅＥＲＴは、上記核内へ移行すること、および組換えを実行することができない。結果として、上記動物は、ＤＴＡを発現しない。しかし、タモキシフェンで処置すると、ＣｒｅＥＲＴが活性化され、上記転写終結シグナルを含む上記ｌｏｘＰに挟まれた領域は除去され、ＤＴＡは、転写および発現され得る。これにより、上記ＣｒｅＥＲＴを発現する細胞（例えば、希突起膠細胞）において細胞死が誘導される。
【００６７】
従って、タモキシフェンでの処置は、上記希突起膠細胞の除去のタイミングを調節するために、時間的に制御され得る。上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記動物の発生のそのいずれかのステージにおいて、上記動物に投与され得る。上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、１回もしくは１回より多く、発生の１つ以上のステージにおいて、上記動物に投与され得る。例えば、上記タモキシフェンは、上記グリア細胞が成熟している場合（例えば、上記希突起膠細胞もしくはシュワン細胞が成熟しているかもしくは増殖していない場合）に上記動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記マウスが少なくとも約５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、もしくは１２週齢である場合に、投与される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが約３〜８週齢の間、約５〜７週齢の間、もしくは約６〜８週齢の間である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが少なくとも約６ヶ月齢である場合にタモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。さらに他の実施形態において、上記マウスは、上記マウスが少なくとも約７ヶ月齢、８ヶ月齢、９ヶ月齢、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１２ヶ月齢、１５ヶ月齢、１８ヶ月齢、２１ヶ月齢、もしくは２４ヶ月齢である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスが約５〜７ヶ月齢の間、６〜９ヶ月齢の間もしくは９〜１２ヶ月齢の間である場合に、タモキシフェンもしくはそのアナログで処置される。いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記タモキシフェンもしくはそのアナログは、上記マウスが成体マウスである場合に投与される。
【００６８】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物におけるグリア細胞（例えば、非増殖グリア細胞（例えば、成熟した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞））の除去もしくは細胞死は、上記動物において脱髄を生じ得る。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、生きたままである。いくつかの実施形態において、上記脱髄は、上記動物において脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じる。いくつかの実施形態において、上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化は、逆転される。本明細書に記載されるように、脱髄状態に特徴的な表現型は、軸索の分析も、髄鞘形成細胞の分析も、他の分子分析もしくは細胞分析（例えば、軸索の電子顕微鏡検査または神経細胞（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）の遺伝子発現の決定）もなく確認され得る、脱髄状態に特徴的な表現型に言及する。例えば、脱髄状態に特徴的な表現型変化は、運動制御、平衡、もしくはＣＮＳ伝導の低下であり得、これらは、ロータロッド行動アッセイもしくは脊髄体性感覚誘発電位のような手段によって測定され得る。脱髄状態に特徴的な他の表現型としては、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、死滅、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせのような表現型が挙げられる。上記表現型は、以下からなる群より選択される脱髄障害に特徴的であり得る：進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｎｔｉｎｅ ｍｙｅｌｏｌｙｓｉｓ）（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー：副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパチー（ｍｕｌｔｉｆｏｃｕａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＭＭＮ）、アルツハイマー病もしくは進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される動物（例えば、マウス）は、マウスのグリア細胞（好ましくは、成熟したもしくは非増殖グリア細胞（例えば、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくはその両方）において特異的に発現されている上記誘導性Ｃｒｅが最初に活性化された後に、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示す。いくつかの実施形態において、上記動物は、上記最初の活性化および上記１種以上の表現型変化を示した後に、これら表現型変化のうちの１種以上の逆転をさらに示す。例えば、髄鞘形成細胞において誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しかつＤＴＡをコードする異種配列をさらに含み、ｌｏｘＰに挟まれた終結シグナルがＤＴＡをコードする上記配列の上流にある動物において、上記動物は、タモキシフェンで処置され、このタモキシフェンは、上記髄鞘形成細胞が細胞死を受けるように誘導する。上記動物は、脱髄（例えば、ミエリン鞘変性および識別可能な白質に富む領域における空砲形成）を示す。さらに、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化（例えば、運動制御の低下、平衡の低下、ＣＮＳ伝導の低下、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、もしくはその任意の組み合わせ）を示し、これら変化は、コントロール動物（例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、タモキシフェンの投与もタモキシフェンでの処置もされていない動物）と比較され得る。所定の期間の後に、上記動物は、上記１種以上の表現型の逆転（例えば、運動制御の増大、平衡の増大、ＣＮＳ伝導の改善、不安定歩行の低下、後肢麻痺の低下、振せんの低下、体重増加、失調の低下、もしくはその任意の組み合わせ）を示す。
【００７０】
いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、ここで上記動物は、上記動物が、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物）が示す表現型を示すように、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化から回復する。他の実施形態において、表現型の逆転は、上記表現型が改善する場合のことである。例えば、時点Ａにおいて、動物は振せんを示し始める；時点Ｂにおいて、上記動物は、振せんが増大している；そして時点Ｃにおいて、上記動物は、時点Ａのときの表現型と類似の表現型を示すが、時点Ａのときの表現型は、時点Ｃと比較すると、より良好な表現型である。別の例において、表現型の逆転は、機能（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導）の完全な喪失がある場合のことであり得、逆転とは機能の獲得（例えば、運動機能もしくはＣＮＳ伝導の獲得）のことである。上記獲得は、機能における僅かな改善であり得る。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な機能を（例えば、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが非増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導されない動物と同じレベルの機能へと）再獲得することであり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、上記動物は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約１４日間以降、約２１日間以降、約３５日間以降、約４０日間以降、約４２日間以降、約４５日間以降、約４８日間以降、約５０日間以降、約５５日間以降、約６０日間以降、約６５日間以降、約７０日間以降、約７５日間以降、約８０日間以降、もしくは約９０日間以降に、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転を示す。いくつかの実施形態において、上記動物は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してから）約３５日間以降、もしくは約７０日間以降に、脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す。他の実施形態において、上記逆転は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）の約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後に始まる。他の実施形態において、上記逆転は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化後（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後もしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤の投与後）の約２〜１２週間の間、約３〜１２週間の間、約４〜１２週間の間、約５〜１２週間の間、約５〜１１週間の間、もしくは約６〜１１週間の間に始まる。いくつかの実施形態において、上記逆転は、完全な逆転であり得、上記動物は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化から回復し、その結果、上記動物が、野生型動物もしくは同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、非増殖グリア細胞の選択的除去を示すようには誘導されない動物が示す表現型を示す。他の実施形態において、表現型の逆転は、上記表現型が改善する場合のことである。
【００７２】
一実施形態において、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型（例えば、ロータロッドアッセイに基づく平衡の低下もしくは運動制御の低下）を示すマウスは、タモキシフェンの投与後約４２日間で上記表現型における逆転を示す（例えば、図１４を参照のこと）。ここで上記逆転は、コントロール動物の運動制御までの改善とはいかずとも、運動制御の改善が本質的になしから、運動制御の一部獲得までの改善のことである。さらに別の実施形態において、上記マウスは、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型（例えば、感覚誘発電位によって決定される場合のＣＮＳ伝導の低下）を示し、このマウスはタモキシフェンの投与後約７７日間で上記表現型において逆転を示す（例えば、図１６を参照のこと）。ここで上記逆転は、コントロール動物のＣＮＳ伝導に等しくないにしても、ＣＮＳ伝導を本質的に有さないから、ＣＮＳ伝導を有するまでへの改善のことである。
【００７３】
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物は、上記第１の異種タンパク質を活性化する外因性薬剤で１回より多く処置され得る。例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列および毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列を含み、上記第２の異種配列は、転写終結シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にあるトランスジェニック動物（好ましくは、マウス）は、タモキシフェンもしくはそのアナログの第１の処置が与えられ、続いて、１回、２回、３回、４回、５回以上のさらなるタモキシフェンでの処置が与えられる。いくつかの実施形態において、上記外因性薬剤のその後の投与は、上記脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転の後である。例えば、タモキシフェンでの最初の処置後に脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型を示すマウスは、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転後に、タモキシフェンでの２回目の処置が施される。
【００７４】
上記異種タンパク質を活性化するために上記外因性薬剤を投与する複数回のサイクルが想定され得る。ここでｉ）外因性薬剤の投与、ｉｉ）脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、およびｉｉｉ）上記１種以上の表現型の逆転の１回のサイクルが、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）の別の完全なサイクルまたはこれらの部分的なサイクル（例えば、ｉ）とｉｉ）、もしくはｉ）のみ）に続くことができる。例えば、外因性薬剤の投与の１回のサイクルの後に、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、上記１種以上の表現型の逆転、第２回の外因性薬剤の投与、脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の提示、および上記１種以上の表現型の逆転、第３回の上記外因性薬剤の投与が、行われ得る。上記最初の投与後の上記外因性薬剤の引き続く投与（例えば、２回目、３回目、４回目、５回目、もしくはこれを超える投与）は、上記外因性薬剤の最初の、以前の、もしくはその後の量と比較して、より多量の、等しい、もしくはより低量の上記外因性薬剤の投与であり得る。
【００７５】
上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の引き続く投与は、上記外因性薬剤の最初に投与してからもしくは上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を最初に活性化してから約１４日間以降、約２１日間以降、約３５日間以降、約４０日間以降、約４２日間以降、約４５日間以降、約４８日間以降、約５０日間以降、約５５日間以降、約６０日間以降、約６５日間以降、約７０日間以降、約７５日間以降、約８０日間以降、もしくは約９０日間以降である。いくつかの実施形態において、上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の上記ひき続く投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してから）約７０日間後である。他の実施形態において、上記第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する上記外因性薬剤の上記ひき続く投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後である。
【００７６】
さらに他の実施形態において、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物は、第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）の活性化を誘導する外因性薬剤で処置され得、免疫応答誘導因子、もしくは炎症誘導因子（例えば、内毒素）がさらに投与され得る。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、異種タンパク質の活性化を誘導する外因性薬剤および内毒素（例えば、リポポリサッカリド（ＬＰＳ））が投与される。上記ＬＰＳは、上記異種タンパク質を活性化する上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与の前に、同時に、もしくは後に、投与され得る。ＬＰＳの１回より多くの投与はまた、本明細書で企図される。例えば、タモキシフェンの各投与に対して、ＬＰＳの投与もまた、上記非ヒトトランスジェニック動物に与えられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴ）をコードする第１の異種配列および毒素（例えば、ＤＴＡ）をコードする第２の異種配列を含み、上記第２の異種配列が転写終結シグナルを含むｌｏｘＰに挟まれた領域の下流にあるトランスジェニック動物（好ましくは、マウス）は、タモキシフェンもしくはそのアナログの第１の処置、続いて、ＬＰＳの投与が与えられ得る。いくつかの実施形態において、上記ＬＰＳでのその後の投与は、動物が脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型を示すより前である。例えば、上記ＬＰＳは、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化後（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後もしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与後）約７日かそれ未満、約１４日かそれ未満、約２１日かそれ未満、約３５日かそれ未満、約４０日かそれ未満、約４２日かそれ未満、約４５日かそれ未満、約４８日かそれ未満、約５０日かそれ未満、約５５日かそれ未満、約６０日かそれ未満、約６５日かそれ未満、約７０日かそれ未満、約７５日かそれ未満、約８０日かそれ未満、もしくは約９０日かそれ未満に投与され得る。他の実施形態において、上記ＬＰＳの投与は、上記第１の異種タンパク質の最初の活性化から（例えば、上記動物における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤を投与してから）約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、もしくは１６週間後である。
【００７８】
非ヒトトランスジェニック動物において第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得る。これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の１用量より多くの用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与される。上記１用量以上の用量は、同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。
【００７９】
第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の投与に加えて、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量以上の用量が投与され得る。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得、これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の投与は、第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与と同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量を超える用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。上記１用量以上の用量は、ＬＰＳの他の用量を投与するために使用される同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。上記外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）は、単一組成物において上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）と一緒に、非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。あるいは、それらは、実質的に同時に、逐次的に、その日中にもしくは処置期間中に所定の間隔で、異なる頻度で、または同じもしくは異なる投与経路を使用して、投与され得る。上記外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）、および上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）は、同じ手段もしくは異なる手段によって、上記非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。
【００８１】
非ヒトトランスジェニック動物において第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）は、局所にもしくは全身に投与され得る。上記免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）はまた、局所にもしくは全身に投与され得る。局所投与は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、または上記ＣＮＳもしくはＰＮＳの特定の領域に対するものであり得る。例えば、上記投与は、具体的には、脳、脊髄、もしくは視神経に対するものであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）が投与される上記動物はまた、炎症マーカー（例えば、顆粒球／好中球抗原４／７、Ｔ細胞抗原ＣＤ３、ＩＢＡ１、および測定されるＣＤ１１ｂが挙げられるが、これらに限定されない）の発現を有し得る。
【００８３】
（スクリーニングアッセイ）
本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物および方法は、具体的な有用性を提供する。本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物および方法は、髄鞘再生の機構を解明するために、ならびに髄鞘再生を促進するための治療ストラテジーの開発に有用である。これは、脱髄状態に関連するヒト疾患（例えば、先に記載されたもの）の研究に対する現実世界での適用を提供する。また、他の多発性硬化症動物モデルと比較すると、本明細書に記載されるマウスは、薬物開発の間の標的バリデーションに一層の適用性がある。なぜなら、上記脱髄および髄鞘再生事象は、再現性が高く、それらは別個の位置において異なる時点で起こり、両者とも定量的行動表示と明らかに関連するからである。さらに、このモデル系は、髄鞘再生電位における加齢に関連する低下に寄与する要素（ｆａｃｔｏｒ）であって、これが、被験体が脱髄状態に罹患している先に列挙された疾患に存在する要素の調査を可能にするはずである。最後に、髄鞘形成を調節する薬剤をスクリーニングするための本明細書に記載される方法は、髄鞘形成のエンハンサーおよびインヒビターの両方の同定に適用され得る。なぜなら両方とも、髄鞘形成障害のための治療剤を開発するために価値のある標的であり得るからである。
【００８４】
一局面において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、髄鞘再生を促進するかもしくは脱髄を阻害する薬剤もしくは生物学的に活性な薬剤の候補薬剤をスクリーニングするために使用される。いくつかの実施形態において、薬剤を選択するための方法は、上記非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）活性化する工程、上記動物に候補薬剤を投与する工程、上記動物における脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；および上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、上記１種以上の表現型変化がより迅速に逆転される場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。他の実施形態において、髄鞘再生を促進する薬剤を選択する方法は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物において上記第１の異種タンパク質（例えば、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）を活性化する工程、上記動物に候補薬剤を投与する工程、上記動物において髄鞘再生を決定する工程；および上記候補薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、上記動物が髄鞘再生の増大を示す場合に、上記薬剤を選択する工程を包含する。
【００８５】
一局面において、上記非ヒトトランスジェニック動物は、非増殖グリア細胞もしくは増殖グリア細胞の選択的除去を示すように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上記動物は、非増殖グリア細胞を特異的に除去するように誘導される。上記グリア細胞除去の誘導は、上記動物において脱髄を生じ、上記動物は、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を示し得、ここで上記１種以上の表現型変化は、上記最初の誘導の後に逆転される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、上記動物はマウスであり、上記マウスは、そのゲノム内に、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２）をコードし、神経細胞に特異的なプロモーターもしくは調節領域（例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞に特異的なプロモーター）に作動可能に連結された第１の異種配列を含む。上記マウスはまた、ＤＴＡをコードする第２の異種配列を含み、ここでＤＴＡは、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼが外因性薬剤（例えば、タモキシフェンもしくはそのアナログ）によって活性化される場合に発現される。次いで、上記ＤＴＡの発現は、細胞死を誘導し得る。ＤＴＡの発現は、神経細胞において特異的な上記Ｃｒｅリコンビナーゼの発現に起因して、細胞特異的（例えば、神経細胞（例えば、グリア細胞）において特異的）であり得る。従って、ＤＴＡの発現は、希突起膠細胞、シュワン細胞、もしくは星状細胞の上記細胞特異的死滅、もしくは細胞特異的除去を誘導し得る。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、非増殖グリア細胞（例えば、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方にある）であり、ここで上記非増殖グリア細胞の死滅は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、もしくはその両方において脱髄を生じる。いくつかの実施形態において、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導は、成熟した希突起膠細胞の細胞死を生じる。
【００８７】
候補薬剤の投与は、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２の活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与のような上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導の前、誘導と同時もしくは誘導の後であり得る。いくつかの実施形態において、上記候補薬剤は、上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導後（例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２の活性化のためのタモキシフェンもしくはそのアナログ）の投与後）に、上記動物に投与される。
【００８８】
上記候補薬剤は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得、これら手段としては、経口経路もしくは非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記候補薬剤の１用量を超える用量は、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与される。他の実施形態において、１種以上の候補薬剤が投与され得る。上記１用量以上の用量、もしくは１種以上の候補薬剤は、同じ手段もしくは異なる手段によって投与され得る。さらに、上記動物はまた、上記外因性薬剤の１用量以上の用量が投与され得る。第１の異種タンパク質の活性化を誘導するための上記外因性薬剤の１用量以上の用量の投与に加えて、免疫応答誘導因子（例えば、ＬＰＳ）の１用量以上の用量はまた、上記候補薬剤の投与の前に、投与と同時に、もしくは投与の後に、上記動物に投与され得る。上記候補薬剤は、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤（すなわち、タモキシフェンもしくはそのアナログ）、および必要に応じて、上記免疫応答誘導因子（すなわち、ＬＰＳ）と一緒に、単一組成物において非ヒトトランスジェニック動物に投与され得る。あるいは、上記候補薬剤は、実質的に同時に、逐次的に、その日中もしくは処置期間の間の所定の間隔で、異なる頻度で、または誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する上記外因性薬剤、および必要に応じて、ＬＰＳと同じもしくは異なる投与経路を使用することによって投与され得る。上記候補薬剤、ならびに上記外因性薬剤、および必要に応じてＬＰＳは、局所にもしくは全身に投与され得る。局所投与は、上記ＣＮＳ、ＰＮＳ、または上記ＣＮＳもしくはＰＮＳの特定の領域に対するものであり得る。例えば、上記投与は、具体的には、上記脳、脊髄、もしくは視神経に対するものであり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、候補薬剤（例えば、単一用量もしくは複数用量）の投与は、脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化（例えば、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、運動制御の低下、平衡の低下、ＣＮＳ伝導の低下、もしくはその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）の提示の前に、提示と同時に、もしくは提示の後に行われ得る。次いで、薬剤は、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、上記１種以上の表現型変化がより迅速に逆転される場合に選択され得る。例えば、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する外因性薬剤を投与してから約３５日間以降に上記脱髄障害に特徴的な１種以上の表現型の逆転を示す動物において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した動物が、約３５日間未満で脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す場合に選択され得る。
【００９０】
他の実施形態において、上記Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化してからもしくは上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化する外因性薬剤を投与してから約７０日間以降に脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を示す動物において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した動物が脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転を約７０日間未満で示す場合に選択され得る。例えば、成熟した希突起膠細胞において発現される上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを活性化するためにタモキシフェンを投与したマウスは、ロータロッドアッセイで潜時の低下を示し（例えば、図１４を参照のこと）、タモキシフェン投与後の４２日目後に回復し始める。比較すると、候補薬剤を投与したマウスは、タモキシフェン投与後の約４２日かそれ未満に回復を始める。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、上記薬剤を投与した動物において脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転が、上記薬剤を投与していない動物における脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転のための時間の約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１４、１／２１、１／２８、１／３５、１／４２、１／４９、１／５６、１／６３、１／７０、もしくは１／７７以下である場合に選択される。いくつかの実施形態において、検出および分析（例えば、ビデオテープ収録、体重測定、ロータロッドアッセイ、ＳＥＰアッセイ、視覚的観察が挙げられるが、これらに限定されない）は、種々の時点で行われ、試験薬剤の投与は、上記アッセイの過程の間に、ならびに異なる投与レジメンを使用して、反復され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、動物における脱髄障害に特徴的な上記１種以上の表現型の逆転が、上記薬剤を投与していない動物におけるものより早いもしくは迅速であることで選択される。上記候補薬剤を投与していない上記コントロール動物は、代表的には、上記候補薬剤を投与した上記動物と同じ遺伝的バックグラウンドを有し、その第１の異種タンパク質（すなわち、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ）が活性化されている。他の実施形態において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した上記動物が、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、より低い程度まで（例えば、より低い重篤度、より低い程度、もしくは示さない）脱髄状態に特徴的な上記１種以上の表現型変化を示す場合に選択され、ここで両方の動物は、活性化された誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを有する。他の実施形態において、薬剤は、上記候補薬剤を投与した上記動物が、上記候補薬剤を投与していないコントロール動物と比較して、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の提示において遅延を有する場合に選択される。
【００９２】
さらに他の実施形態において、薬剤は、上記薬剤を投与した上記動物が、上記薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、髄鞘再生の増大を示す場合に選択される。例えば、本明細書で開示される非ヒトトランスジェニック動物における非増殖髄鞘形成細胞における上記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼの活性化後に、上記動物は、上記細胞においてＤＴＡを発現し、これは、細胞死を誘導し、上記動物において脱髄を生じる。上記脱髄状態は、上記神経系（例えば、上記中枢神経系もしくは末梢神経系）における髄鞘形成した軸索の減少によって、または髄鞘形成細胞（例えば、希突起膠細胞およびシュワン細胞）のマーカーのレベルの低下によって、特徴付けられ得る。形態的には、ニューロンの脱髄は、上記中枢神経系における希突起膠細胞もしくは上記末梢神経系におけるシュワン細胞の喪失によって特徴付けられ得る。上記ニューロンの脱髄はまた、上記神経系における髄鞘形成した軸索の減少によって、もしくは希突起膠細胞マーカーもしくはシュワン細胞マーカーのレベルの低下によって、決定され得る。希突起膠細胞もしくはシュワン細胞の例示的マーカータンパク質としては、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本発明の方法によって同定される上記候補薬剤は、ニューロンの脱髄の有害な形態的特性を阻害し得る物質を包含する。
【００９３】
従って、いくつかの実施形態において、上記髄鞘再生は、髄鞘形成した軸索によって特徴付けられる。例えば、髄鞘形成した軸索は、当該分野で公知の任意の手段を使用して（例えば、電子顕微鏡検査によって）、検出され得る。他の実施形態において、髄鞘再生は、星状細胞もしくはミクログリア細胞のマーカーの発現によって特徴付けられ得る（例えば、ミクログリア細胞マーカーの発現の低下は、ミクログリア細胞の低下を表す）。いくつかの実施形態において、髄鞘再生は、１種以上の希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって特徴付けられる。例えば、候補薬剤で処置された動物の１種以上の髄鞘再生特異的マーカータンパク質の発現は、コントロール動物もしくは参照動物に対して比較され得る。タンパク質レベルを検出するのに適した多種多様な標識は、当該分野で公知である。非限定的な例としては、放射性同位体、酵素、コロイド性金属、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物が挙げられる。他の実施形態において、上記マーカーのＲＮＡレベルもしくはｍＲＮＡレベルは、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、もしくは当該分野で公知の他の手段によって検出される。上記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００９４】
さらに他の実施形態において、髄鞘再生特異的マーカータンパク質の発現（例えば、タンパク質レベルもしくはｍＲＮＡレベルを測定する）は、上記試験動物およびコントロール動物もしくは参照動物において、候補薬剤が髄鞘再生阻害活性もしくは髄鞘再生低下活性を有するか否かを決定することで、測定される。このような薬剤は、髄鞘再生インヒビターもしくは髄鞘再生毒素として分類され得る。
【００９５】
本明細書で開示される場合、髄鞘再生は、マーカー遺伝子／遺伝子生成物（例えば、上記中枢神経系もしくは末梢神経系において）の上記細胞特異的発現において増大を観察することによって、確認され得る。上記マーカータンパク質の蛍光は、小動物において蛍光を検出するための当該分野で公知のインビトロ方法もしくはインビボ方法を使用して、検出され得る。インビボ蛍光は、関連分野において入手可能なデバイスを利用して、検出および／もしくは定量化され得る。視覚化、画像化もしくは検出は、侵襲性の技術、最小限に侵襲性の技術もしくは非侵襲性の技術を介して行われ得る。代表的には、顕微鏡検査技術は、上記トランスジェニック動物から、生細胞から、もしくはインビボ画像化技術を介して得られる細胞／組織からの蛍光を検出もしくは画像化するために利用される。
【００９６】
発光、蛍光もしくは生体発光シグナルは、種々の自動化および／もしくはハイスループット機器システム（蛍光マルチウェルプレートリーダー、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および上記シグナルの空間的分解を提供する自動化された細胞ベースの画像化システムが挙げられる）のうちのいずれかで容易に検出され定量化される。種々の機器システムが、ＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＴＴＰ、Ｑ３ＤＭ、Ｅｖｏｔｅｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＩｍａｇｉｎｇおよびＺｅｉｓｓによって開発された自動化蛍光画像化システムおよび自動化顕微鏡検査システムが挙げられる）を自動化するために開発されてきた。蛍光退色後蛍光回復法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡検査法（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）はまた、生細胞におけるタンパク質移行性を研究するために使用されてきた。
【００９７】
蛍光の可視化（例えば、蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子）は、動物から得られる細胞／組織サンプルを（例えば、切片化および共焦点顕微鏡を使用した画像化を介して）検査すること、生細胞を検査することもしくはインビボで蛍光を検出することのいずれかを介して、顕微鏡検査技術を用いて行われ得る。可視化技術としては、当該分野で公知の共焦点顕微鏡法もしくは光学スキャニング技術（ｐｈｏｔｏ−ｏｐｔｉｃａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の利用が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、近赤外線での発光波長を有する蛍光標識は、散乱および自己蛍光の両方（これらは、バックグラウンドノイズを増加させる）が、波長が長くなるにつれて低下するので、深部組織画像化がより容易にできる。インビボ画像化の例は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１０：４１２０７（２００５）；Ｚｈａｎｇら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．３１：１０５４−１０６４（２００３）；Ｆｌｕｓｂｅｒｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．２：９４１−９５０（２００５）；Ｍｅｈｔａら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４：６１７−６２８（２００４）；Ｊｕｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２：３１２１−３１３３（２００４）；米国特許第６９７７７３３号および同第６８３９５８６号（これらの各開示は、本明細書に参考として援用される）に開示される）。
【００９８】
さらに、脱髄／髄鞘再生現象は、当該分野で公知の免疫組織化学的手段もしくはタンパク質分析によって観察され得る。例えば、上記試験動物の脳の切片は、希突起膠細胞マーカーを特異的に認識する抗体で染色され得る。別の局面において、希突起膠細胞マーカーの発現レベルは、イムノブロッティング、ハイブリダイゼーション手段、および増幅手順、ならびに当該分野で十分確立されている任意の他の方法によって定量化され得る（例えば、Ｍｕｋｏｕｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１５５１−１５５６（２００６）；Ｚｈａｎｇら，前出；Ｇｉｒａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：７９２４−７９３３（２００５）；ならびに米国特許第６，９０９，０３１号；同第６，８９１，０８１号；同第６，９０３，２４４号；同第６，９０５，８２３号；同第６，７８１，０２９号；および同第６，７５３，４５６号（これら各々の開示は、本明細書に参考として援用される））。
【００９９】
別の局面において、上記中枢神経系もしくは末梢神経系に由来する細胞／組織は、摘出され得、タンパク質に関して加工処理され得、例えば、組織は、ホモジナイズされ、タンパク質は、ＳＤＳ−１０％ ポリアクリルアミドゲル上で分離され、次いで、ニトロセルロース膜に転写されて、マーカータンパク質を検出する。蛍光タンパク質レベルは、一次抗体／抗血清（例えば、特定のマーカータンパク質に対して得られたヤギポリクローナル；ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ，Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）およびペルオキシダーゼ結合体化２次抗体ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して、検出され得る。化学発光は、組織サンプル中の蛍光マーカータンパク質のレベルを検出および決定するために、当該分野で入手可能な標準試薬を使用して検出される。
【０１００】
本発明の別の局面において、本明細書で開示されるトランスジェニック動物は、細胞／組織培養物の供給源であり得る。例えば、本明細書で開示される動物の細胞は、遺伝子もしくは遺伝子生成物の発現の比較、またはコントロール細胞（コントロール動物から得られた細胞）に対して試験神経細胞（例えば、トランスジェニックの希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）における上記遺伝子生成物の活性を提供するための、細胞ベースのアッセイのために使用され得る。上記細胞は、増殖細胞もしくは非増殖細胞（例えば、成熟したもしくは分化した希突起膠細胞もしくはシュワン細胞）であり得る。上記試験神経細胞は、上記ＣＮＳもしくはＰＮＳ、または上記トランスジェニック動物の細胞から得られる細胞培養物、その子孫、および上記供給源から調製される切片もしくはスメア、あるいは例えば、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞またはそれらの前駆体を含む脳の任意の他のサンプルから単離され得る。所望される場合、他の神経細胞タイプ（例えば、ニューロン、ミクログリア細胞、および星状細胞）を実質的に含まない富化された細胞培養物を使用することが選択され得る。成熟した希突起膠細胞およびシュワン細胞を単離、生成もしくは維持するための種々の方法が、当該分野で公知であり（Ｂａｅｒｗａｌｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２：２３０−２３９（１９９８）；Ｌｅｖｉら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．６８：２１−２６（１９９８））、それらは本明細書で例示される。
【０１０１】
また、選択される候補薬剤、もしくは生物学的に活性な薬剤が本明細書において提供され、これらとしては、生物学的もしくは化学的な化合物（例えば、単純なもしくは複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）が挙げられ得るが、これらに限定されない。非常に多くの整理された化合物が、合成され得（例えば、ポリマー（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）、および種々のコア構造物に基づく合成有機化合物）、これらはまた、本明細書で企図される。さらに、種々の天然の供給源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る（例えば、植物もしくは動物の抽出物など）。常に明示的に示されている訳ではないが、上記活性な薬剤が単独で、または本発明のスクリーニング方法によって同定される薬剤と同じ生物学的活性もしくは異なる生物学的活性を有する別の調節因子と組み合わせて使用され得ることは、理解されるべきである。
【０１０２】
本明細書で開示される１つ以上の方法においてアッセイされる候補薬剤（例えば、治療剤／薬物）は、異なる時点で比較して、ならびに参照もしくはコントロールと比較して、上記薬物に応じた全体的な差異があるか否かを決定するために、上記モデル系（例えば、本明細書で開示されるトランスジェニック動物）において使用され得る。マーカーの発現を検出および定量化することによって、上記トランスジェニック動物は、候補薬剤が髄鞘再生を調節するか否か、およびそれがどの程度までかを決定するために使用され得る。当然のことながら、当業者は、前述が、本明細書で開示されるモデル系を利用するための一例に過ぎないことを認識する。
【０１０３】
従って、候補治療剤／薬物が、本発明の１つ以上の方法においてアッセイされている場合、上記候補治療剤／薬物は、異なる時点で比較して、ならびに参照もしくはコントロールと比較して、上記薬物に応じて全体的に差異があるか否かが決定され得る。まとめると、グリア細胞（例えば、前駆体希突起膠細胞）の単一の亜集団において差次的に発現されるマーカーの発現を検出および定量化することによって、前述の例における上記トランスジェニック動物は、種々のデータを得るために使用される。上記データとしては、髄鞘再生が傷害後に起こっているか否か、および候補薬剤がこのような髄鞘再生を調整するか否か、およびそれがどの程度までかということ、が挙げられる。当然のことながら、当業者は、前述が、本発明の髄鞘再生モデル系を利用するための一例に過ぎないことを認識する。
【０１０４】
（薬学的組成物）
本明細書で開示される１つ以上の方法は、脱髄を阻害するかもしくは髄鞘再生を促進することによって、脱髄の処置においてその後実施され得る生物学的に活性な薬剤を選択するために利用され得る。髄鞘再生を調節するに有効な上記選択された生物学的に活性な薬剤は、ニューロンの脱髄障害を処置するための医薬の調製のために使用され得る。特定の実施形態において、本明細書で言及される脱髄障害は、多発性硬化症である。他の実施形態において、上記脱髄障害は、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー：副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、キャナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルヴェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）からなる群より選択される。
【０１０５】
一局面において、同定され／選択される生物学的に活性な本発明の薬剤は、病原体（例えば、細菌およびウイルス）に罹患したニューロンの脱髄を処置するために投与され得る。別の局面において、上記選択された薬剤は、例えば、橋中央ミエリン溶解およびビタミン欠乏症における場合のように、毒性物質によってもしくは毒性の代謝生成物の身体への蓄積によって引き起こされるニューロンの脱髄を処置するために使用され得る。なお別の局面において、上記薬剤は、物理的傷害（例えば、脊髄損傷）によって引き起こされる脱髄を処置するために使用され得る。さらになお別の局面において、上記薬剤は、遺伝的特性を有する障害において現れる脱髄、遺伝的障害（白質ジストロフィー、副腎脳白質ジストロフィー、変性性多系統萎縮症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）、ビンスワンガー脳症、上記中枢神経系における腫瘍、および多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために投与され得る。
【０１０６】
同定され／選択される生物学的に活性な本発明の薬剤はまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない目的の他の生成物とともに、それより前に、もしくはその後に送達され得る：増殖因子、サイトカイン、神経増殖因子、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗遊走剤、抗線維症剤、抗アポトーシス剤、抗体、抗血栓剤、抗血小板剤、ＩＩｂＩＩＩＩａ因子（ＩＩｂＩＩＩＩａ ａｇｅｎｔ）、脈管形成因子、抗脈管形成因子、抗ウイルス剤、神経増殖因子、ＮＧＦファミリーのタンパク質、ＮＧＦ、β−ＮＧＦ、ニューロトロフィン−３前駆物質（ＮＴ−３）、ＨＤＮＦ、神経増殖因子２（ＮＧＦ−２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、もしくはこれらの前駆体および組み合わせ。
【０１０７】
種々の送達系は公知であり、生物学的に活性な薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソームへの被包化、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスベクターもしくは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築など）。送達法としては、動脈内経路、筋肉内経路、静脈内経路、鼻内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。具体的実施形態において、処置の必要な領域に局所的に本発明の薬学的組成物を投与することは望ましいことであり得る；このことは、例示であって、限定ではなく、手術の間の局所的注入によって、注射によって、もしくはカテーテルの手段によって達成され得る。特定の実施形態において、上記薬剤は、被験体の神経系（好ましくは、上記中枢神経系）に送達される。別の実施形態において、上記薬剤は、髄鞘再生を受けている神経組織に投与される。
【０１０８】
上記選択される薬剤の投与は、１用量において、処置の過程全体を通じて連続して、もしくは間欠的に、行われ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定するための方法は、当業者に周知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、処置されている標的細胞、および処置されている被験体とともに変動する。単回投与もしくは複数回投与は、処置している医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行われ得る。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物の調製は、薬学的調製物を調製するために一般に受容された手順に従って行われる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ＰＡを参照のこと。意図された使用および投与様式に依存して、薬学的組成物の調製において上記活性成分をさらに加工処理することは、望ましいことであり得る。適切な加工処理は、適切な無毒性の妨害しない成分と混合する工程、滅菌する工程、用量単位に分割する工程、および送達デバイスに封入する工程を包含し得る。
【０１１０】
経口投与、鼻内投与もしくは局所投与のための薬学的組成物は、固体形態、半固体形態もしくは液体形態で供給されうる（錠、カプセル、粉末、液体、および懸濁物が挙げられる）。注射用の組成物は、液体溶液もしくは懸濁物として、エマルジョンとして、または注射前に液体中に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態として、供給されうる。気道を介した投与のために、一部の組成物は、適切なエアロゾル生成デバイス（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）とともに使用される場合、固体、粉末、もしくはエアロゾルを提供するものである。
【０１１１】
液体の薬学的に受容可能な組成物は、例えば、液体賦形剤（例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、もしくはエタノール）中に、本明細書で具現化されたポリペプチドを溶解もしくは分散させることによって調製されうる。上記組成物はまた、他の医療用薬剤、薬学的作用物質、アジュバント、キャリア、および補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤）、およびｐＨ緩衝化剤を含み得る。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの生成およびＣｒｅリコンビナーゼ活性の誘導）
ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡ対立遺伝子（Ｉｖａｎｏｖａら，Ｇｅｎｅｓｉｓ ４３：１２９−１３５（２００５））を含み、ｅＧＦＰ遺伝子およびＮｅｏ遺伝子を含む上流のｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列領域の存在に起因して、機能的に不活性な形態にあるジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）の遺伝子を有するマウスを、ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ対立遺伝子（Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅｓｉｓ，３５：６３−７２（２００３））を有し、希突起膠細胞において上記Ｃｒｅリコンビナーゼのタモキシフェン関連バージョンを発現するマウスと交配した。上記交配から、複合ヘテロ接合性ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを生じ、ここで上記ｌｏｘＰに挟まれた領域のＣｒｅ媒介性除去は、上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいてタモキシフェンで誘導され、その結果、ＤＴＡ発現を生じる（図１）。
【０１１３】
５〜７週齢において、上記マウスに、１日あたり１ｍｇのタモキシフェンを５〜７日間にわたって、腹腔内に（ＩＰ）投与した。上記タモキシフェン処置マウスの脳におけるＤＴＡの発現を、ＰＣＲによって確認した。そのＰ１プライマー（５’−ＡＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＣ−３’）およびＰ２プライマー（５’−ＣＴＴＡＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＴＣ’３’）を使用し、その結合部位を図１に示す。組換えを行なうと、上記Ｐ１およびＰ２プライマーは、図２に示されるように、約６５０ｂｐ（ＤＴＡ）生成物を増幅する。そのコントロールレーンは、ＤＴＡの誘導発現がない上記ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスからのＰＣＲ結果および１回目のタモキシフェンを注射してから（ｄｐｉ）７日間の後、１４日間の後および２１日間の後に処置された上記タモキシフェン処置マウスの結果（それぞれ、レーンｍｕｔ−Ｄ７、ｍｕｔ−Ｄ１４、およびｍｕｔ−Ｄ２１に示される）を示す。理論に拘束されないが、ＤＴＡ発現の最終的な減少は、細胞死および細胞の欠如に起因し得る。
【０１１４】
（実施例２：タモキシフェン処置マウスの脱髄および表現型の特徴）
上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを、希突起膠細胞の喪失を検出するために特徴付けた。上記希突起膠細胞の細胞喪失を決定するために、その脳幹、小脳、脳梁、皮質、頸髄（灰白質および白質）におけるＣＣ−１染色を行い、上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの７ｄｐｉ、１４ｄｐｉおよび２１ｄｐｉにおいて定量した（図５）。希突起膠細胞の細胞喪失は、２１ｄｐｉまでに上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの大部分のＣＮＳ領域において最大であった（例えば、図４、図５を参照のこと）。
【０１１５】
以下のプライマーでのＲＴ−ＰＣＲを行った：
マウスＰＬＰセンスプライマー： ＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＣＴ
マウスＰＬＰアンチセンスプライマー： ＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡ
マウスＰＬＰプローブ： ＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡ
マウスＭＢＰセンスプライマー： ＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴ
マウスＭＢＰアンチセンスプライマー： ＴＧＴＣＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧ
マウスＭＢＰプローブ： ＡＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＡＧＡＴＧ
マウスＧＡＰＤＨセンスプライマー： ＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡ
マウスＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー： ＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ
マウスＧＡＰＤＨプローブ： ＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧ。
【０１１６】
上記結果から、コントロールマウスと比較して、７ｄｐｉ、１４ｄｐｉ、もしくは２１ｄｐｉの上記タモキシフェン処置マウスＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて希突起膠細胞の細胞喪失より先に、Ｐｌｐ ｍＲＮＡレベルおよびＭｂｐ ｍＲＮＡレベルの劇的な低下が示された（図６）。
【０１１７】
ＣＮＳ髄鞘形成を、脊髄の電子顕微鏡検査（ＥＭ）およびトルイジンブルー染色、ならびに脳におけるＭＡＧおよびＭＢＰのタンパク質発現のウェスタンブロッティングによって、決定した。希突起膠細胞の細胞喪失の影響は、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉにおいて最小であった（図７）。しかし、１４ｄｐｉにおいて、上記マウスは、脱髄状態に特徴的な表現型を示した。上記マウスは、振せんおよび失調性の非協調歩行を示した。２１ｄｐｉまでに、一部のマウスは、非常に虚弱になり、死に至った。
【０１１８】
生き残った上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの２１ｄｐｉは、ＳＥＰ応答を何ら示さなかった。ＳＥＰ記録は、３５ｄｐｉおよび７０〜７７ｄｐｉのＤＴＡマウスにおいて可能であった（図１６および図１７）。上記ＳＥＰ応答を決定するために、コントロールマウスおよびタモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスを、Ａｖｅｒｔｉｎ（登録商標）の腹腔内注射で麻酔し、刺激電極を、３種の異なる坐骨神経レベルのうちの１つの皮下に導入した：（１）足首、（２）膝窩、もしくは（３）根部に直接。アース電極を、上記神経の刺激の際には尾部にあてがい、記録を、下部腰椎もしくは中位胸椎レベルから行った。上記２種のレベルから記録した感覚誘発電位（ＳＥＰ）の開始潜時の差異（ΔＬ）を、上記ＣＮＳにおける伝導の概算値として計算した。
【０１１９】
３５ｄｐｉおよびさらに４２日間のＰＩにおいて、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、ロータロッド上で動作することができなかった（図１４）。上記マウスは、加速モード（５ｒｐｍから６５ｒｐｍまで）で回転している上記ロッド上で５分間の試験期間の間、該マウスが自身を維持する時間（潜時）に関して試験された。上記潜時を、各マウスに関して、１日４回のセッションを、１週間に１回、連続７週間にわたって行うことによってモニターした。
【０１２０】
また、３５ｄｐｉにおいて、上記マウスは、失調の増大および振せんの増大を示し、上記マウスの小脳、脳幹、脊髄、および視神経のトルイジンブルー染色から、上記ＣＮＳ全体にわたって大量の希突起膠細胞の喪失が明らかになり、別個の白質に富む領域においてミエリン鞘変性および空砲形成を生じた（図１０）。３５ｄｐｉにおける頸髄−腹側白質のＥＭから、脱髄もまた実証された（図１１）。ミクログリア活性化（上記小脳におけるミクログリアのＣＤ１１ｂ染色によって示されるように）はまた、３５ｄｐｉにおいて脱髄と相関した（図１２）。
【０１２１】
（実施例３：髄鞘再生および脱髄に特徴的な表現型の逆転）
驚くべきことに、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、髄鞘再生することができ、髄鞘再生に特徴的な上記表現型の逆転を示した。上記動物は、顕著な表現型回復を示した。実施例２に記載されるように、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、３５ｄｐｉおよびさらには４２ｄｐｉにおいて上記ロータロッド上で動作することができなかった。しかし、上記マウスは、４２ｄｐｉ後および７７ｄｐｉまでに彼らの運動機能を再獲得しはじめ、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの潜時は、最終的には、上記コントロールマウスの潜時にほぼ近づいた（図１４）。上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスは、２１ｄｐｉにおいてＳＥＰ応答を何ら有さず、Δ潜時（ΔＬａｔ（上記Ｔ５〜Ｔ６ピーク潜時とＬ４〜Ｌ５ピーク潜時の間の差異））が、コントロールより僅かに低くかつ振幅（Ａｍｐ）が正常である場合、７０ｄｐｉまでにＳＥＰ応答を有した（図１７）。
【０１２２】
予測外なことには、上記タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて、希突起膠細胞が除去された領域が再び補充され、修復されていた。上記希突起膠細胞の細胞数は、ＣＣ１免疫染色によって示されるように、３５ｄｐｉまでに増加しており、７０ｄｐｉまでにさらに増加した（図８）。Ｍｂｐ ｍＲＮＡ発現およびＰｌｐ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は、類似の傾向を示し、ここで７０ｄｐｉまでに、上記レベルは、コントロールマウスよりさらに高かった（図９）。上記マウスの小脳、脳幹、脊髄、および視神経のトルイジンブルー染色から、７０ｄｐｉにおいて髄鞘再生もまた明らかになり（図１０）、同様に、頸髄−腹側白質のＥＭもまた、髄鞘再生を示した（図１１）。ミクログリア活性化はまた、減少し、それは髄鞘再生と相関した（図１２）。さらに、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）はまた、上記脳幹および小脳においてＰＤＧＦＲα陽性細胞によって測定される場合、上記コントロールマウスと比較して、増加していた（図１３）。
【０１２３】
上記脱髄および脱髄障害に特徴的な表現型の提示、ならびに上記予測外の髄鞘再生および上記表現型の逆転のまとめを、図１９に示す。
【０１２４】
（実施例４：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおけるタモキシフェンの滴定）
ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスに、種々のレジメンの種々の量のタモキシフェンもしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を投与して、脱髄の範囲および脱髄障害に特徴的な表現型変化を評価する。約１〜７ｍｇの範囲に及ぶ４−ＯＨＴの用量を、異なるマウス群にＩＰ投与する。３〜７連続日にわたる１日約１回の投与レジメンをまた、異なるマウス群に対して様々にする。上記異なるマウス群はまた、若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）を含む。
【０１２５】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐ遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた行う。表現型変化の程度（例えば、臨床症状の重篤度がより低いこと、臨床症状を示すのにより長い時間がかかること、もしくは回復時間がより早いこと）は、実施例１に記載されるレジメンと比較して、より低い投与量もしくはより短い投与時間で予測される。より低い投与量を上記マウスに用いると、マウスの死亡のパーセンテージもより低くなり得る。老齢マウスに対する若年マウスの上記効果および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１２６】
（実施例５：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスへのタモキシフェンの脳内注射）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおいて局所化した脱髄を誘導するために、タモキシフェンを、定位注入によって上記マウスへと注射する。定位装置を、上記タモキシフェン溶液を、カニューレを通して前もって選択した位置に送達するための注射プローブを移植するために使用する。この位置は、マウスの脳地図からの座標によって規定される。約１０〜１００μｇ／日を、１〜３日間にわたって、上記マウスに継続して投与する。
【０１２７】
上記脳内注射を、若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）において行う。上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた行う。老齢マウスに対する若年マウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）を分析する。
【０１２８】
（実施例６：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスの反復した脱髄および髄鞘再生）
上記マウスの髄鞘再生能力および表現型逆転能力を決定するために、タモキシフェン処置ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）を回復させた（実施例３に記載されるように）か、もしくは回復させた後に、実施例４において決定されるような量もしくは用量のタモキシフェンをＩＰにより投与した。１つのマウス群において、タモキシフェンの２回目の注射は、ＰＩの１２０日間後である。
【０１２９】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学染色もまた、行う。上記結果をまた、タモキシフェンで１回だけ処置したマウスと比較して、回復時間がより長いか否か、回復がそれほど強くないのか否か、もしくは脱髄および表現型が、１回処置したマウスと比較してより重篤であるのか否かを決定する。上記老齢マウスに対する若年マウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１３０】
同じ実験を反復する。ここでＬＰＳと同様にタモキシフェンを局所に投与（実施例５を参照のことのこと）する。
【０１３１】
（実施例７：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスへのＬＰＳおよびタモキシフェンの投与）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）に、タモキシフェン（実施例１に記載されるか、または実施例４において決定されるような量もしくは用量）をＩＰで投与する。単一用量のＬＰＳ、２００μｇを、７ｄｐｉおよび１４ｄｐｉにおいて、または上記動物が脱髄障害に特徴的な表現型を示す前に７ｄｐｉもしくは１４ｄｐｉで開始して、７連続日にわたって１日用量１０μｇを注射することによって、ＩＰ投与する。
【０１３２】
上記マウスを、ＣＣ１免疫染色、ＣＤ１１ｂ染色、ＥＭ、トルイジンブルー染色、ＭｂｐおよびＰｌｐの遺伝子発現、ロータロッドアッセイ、上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析、ならびにＳＥＰアッセイによって特徴付ける。免疫組織化学もまた、行う。上記脳への免疫細胞のインフラックスもまた、以下のマーカーを検査することによって決定する：顆粒球／好中球抗原４／７、Ｔ細胞抗原ＣＤ３、およびＩＢＡ１。ＬＰＳで処置したマウスへの作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）を、タモキシフェンを投与したが、ＬＰＳで処置しなかったマウスのそれと比較する。ＬＰＳで処置したマウスは、より早い回復時間を有し得る。老齢マウスに対して若年マウスへの上記作用および任意の差異（例えば、回復の時間もしくは回復の程度）もまた、分析する。
【０１３３】
同じ実験を反復する。ここでＬＰＳと同様にタモキシフェンを局所に投与（実施例５を参照のことのこと）する。同じ実験をまた行う。ここでタモキシフェンを複数回投与し（実施例６を参照のことのこと）、ここでＬＰＳも、タモキシフェンの各投与に対して投与する。
【０１３４】
（実施例８：ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスにおける血液脳関門の完全性）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡの若年マウス（５〜６週齢）および老齢マウス（６〜９ヶ月齢）に、タモキシフェン（実施例１に記載されるかもしくは実施例４において決定されるような量もしくは用量）をＩＰで投与する。血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を試験するために、エバンブルー色素を、屠殺する４８時間前に、マウスにＩＰ注射する（２％，４ｍｌ／ｋｇ体重）。上記青色色素の分布を、脳実質において分析して、上記ＢＢＢの完全性を決定する。
【０１３５】
（実施例９：生物学的に活性な薬剤のスクリーニング）
上記ＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスに、タモキシフェン（実施例１に記載されるように、または実施例４において決定されるような量もしくは投与量）をＩＰで投与する。候補薬剤を、上記動物が脱髄障害の表現型の特徴を示す前に、ＰＩの１４日後に上記マウスにＩＰで投与する。
【０１３６】
上記マウスを、種々の時点でのロータロッドアッセイおよび上記トレッドミルＤｉｇｉＧａｉｔアッセイによる歩行の分析によって特徴付ける。上記薬剤は、上記マウスが、タモキシフェンを投与するが上記候補薬剤を投与しないＰＬＰ／ＣｒｅＥＲＴ；ＲＯＳＡ２６−ｅＧＦＰ−ＤＴＡマウスより早くその運動制御を回復する場合に、治療剤としてのさらなる開発のために選択される。
【０１３７】
本発明は、上記の実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲の範囲内での改変が可能である。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的実施形態の多くの等価物を認識するかあるいは確認し得る。多くのバリエーション、変化、および置換は、いまや本発明から逸脱することなく当業者に想起される。本明細書に記載される実施形態に対する種々の代替物は、本発明を実施するにあたって使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、発明の範囲を規定し、これら請求項の範囲内の方法および構造物、ならびにこれらの等価物が、特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物は、
ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで
該第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、該第１の異種ヌクレオチド配列は、該動物において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；
ｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで
該第２の異種タンパク質は、該第１の異種タンパク質の活性化に際して発現され、非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、
該第１の異種タンパク質の最初の活性化は、該動物において該非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、該動物において脱髄を生じ、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じ；そして
該１種以上の表現型変化は、該第１の異種タンパク質の最初の活性化後に逆転される、第２の異種ヌクレオチド配列；
を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記動物は、哺乳動物である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される、請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記動物は、マウスである、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記マウスは、少なくとも約５週齢である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記マウスは、成体である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記非増殖グリア細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）に存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記非増殖グリア細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）に存在する、請求項１〜８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記第１の異種タンパク質の活性化は、誘導性である、請求項１〜９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記活性化は、外因性薬剤によって誘導される、請求項１〜１０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記活性化は、組換えである、請求項１〜１１のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼである、請求項１〜１２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体である、請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記改変体は、融合タンパク質である、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合タンパク質である、請求項１５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログである、請求項１１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である、請求項１５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記グリア細胞特異的プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１〜１８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記グリア細胞特異的プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰからなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１〜１８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記第２の異種タンパク質は、細胞死を誘導する、請求項１〜２０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記第２の異種タンパク質は、外毒素である、請求項１〜２０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２３】
前記外毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニットである、請求項２２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記ジフテリア毒素サブユニットは、Ａサブユニットである、請求項２３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記非増殖グリア細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である、請求項１〜２４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２６】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、およびＣＮＳ伝導の低下からなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２８】
前記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって測定される、請求項２７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２９】
前記ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される、請求項２７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
前記１種以上の表現型変化は、前記第１の異種タンパク質の前記活性化の約３５日間以降に逆転される、請求項１〜２９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
前記１種以上の表現型変化は、前記第１の異種タンパク質の前記活性化の約７０日間以降に逆転される、請求項１〜２９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
請求項１の記載の非ヒトトランスジェニック動物の細胞であって、ここで該細胞は、
ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで該第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、該第１の異種核酸は、該細胞において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；および
ｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで該第２の異種タンパク質は、該第１の異種タンパク質の活性化の際に発現され、該第１の異種タンパク質の活性化の際に該細胞の死滅を誘導する、第２の異種ヌクレオチド配列、
を含む、細胞。
【請求項３３】
前記細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記細胞は、増殖細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞は、非増殖細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３６】
脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の逆転を促進する薬剤を選択する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物において前記第１の異種タンパク質を活性化する工程；
ｂ）候補薬剤を該動物に投与する工程；
ｃ）該動物において脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；および
ｄ）該１種以上の表現型変化が、該候補薬剤を投与しないコントロール動物と比較してより迅速に逆転される場合に、該薬剤を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、およびＣＮＳ伝導の低下からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤は、前記１種以上の表現型変化が前記第１の異種タンパク質の活性化後の約７０日間未満に逆転される場合に選択される、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤は、前記１種以上の表現型変化が前記第１の異種タンパク質の活性化後の約３５日間未満の逆転される場合に選択される、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
髄鞘再生を促進する薬剤を選択する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物において前記第１の異種タンパク質を活性化する工程；
ｂ）候補薬剤を該動物に投与する工程；
ｃ）該動物において髄鞘再生を決定する工程；および
ｄ）該動物が該候補薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、髄鞘再生の増大を示す場合に該薬剤を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
髄鞘再生は、有髄軸索によって特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
髄鞘再生は、希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記動物は、哺乳動物である、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記動物は、マウスである、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記マウスは、少なくとも約５週齢である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記マウスは、成体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記工程ａ）における活性化する工程は、外因性薬剤によるものである、請求項３６または４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記外因性薬剤は、１回より多く前記動物に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記外因性薬剤は、注射によってもしくは経口的に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記外因性薬剤は、局所に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼである、請求項３６〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記改変体は、融合タンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記融合タンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合タンパク質である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記融合タンパク質は、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、前記動物に投与される、請求項３６〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記ＬＰＳは、前記第１の異種タンパク質の活性化の前にもしくは活性化と同時に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＬＰＳは、前記第１の異種タンパク質の活性化の後に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＬＰＳは、局所にもしくは腹腔内に投与される、請求項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記局所投与は、ＣＮＳもしくはＰＮＳに対するものである、請求項５６または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記局所投与は、脳に対するものである、請求項５６または６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記局所投与は、脊髄に対するものである、請求項５６または６６のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記局所投与は、視神経に対するものである、請求項５６または６６に記載の方法。
【請求項１】
非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物は、
ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで
該第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、該第１の異種ヌクレオチド配列は、該動物において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；
ｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで
該第２の異種タンパク質は、該第１の異種タンパク質の活性化に際して発現され、非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、
該第１の異種タンパク質の最初の活性化は、該動物において該非増殖グリア細胞の死滅を誘導し、該動物において脱髄を生じ、脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を生じ；そして
該１種以上の表現型変化は、該第１の異種タンパク質の最初の活性化後に逆転される、第２の異種ヌクレオチド配列；
を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記動物は、哺乳動物である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される、請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記動物は、マウスである、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記マウスは、少なくとも約５週齢である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記マウスは、成体である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記非増殖グリア細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）に存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記非増殖グリア細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）に存在する、請求項１〜８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記第１の異種タンパク質の活性化は、誘導性である、請求項１〜９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記活性化は、外因性薬剤によって誘導される、請求項１〜１０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記活性化は、組換えである、請求項１〜１１のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼである、請求項１〜１２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体である、請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記改変体は、融合タンパク質である、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合タンパク質である、請求項１５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログである、請求項１１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である、請求項１５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記グリア細胞特異的プロモーターは、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、もしくはプロテイン２（Ｐ２）からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１〜１８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記グリア細胞特異的プロモーターは、ＰＬＰ、ＭＢＰ、およびＣＮＰからなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１〜１８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記第２の異種タンパク質は、細胞死を誘導する、請求項１〜２０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記第２の異種タンパク質は、外毒素である、請求項１〜２０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２３】
前記外毒素は、ジフテリア毒素もしくはそのサブユニットである、請求項２２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記ジフテリア毒素サブユニットは、Ａサブユニットである、請求項２３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記非増殖グリア細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である、請求項１〜２４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２６】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、体重減少、失調、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、およびＣＮＳ伝導の低下からなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２８】
前記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって測定される、請求項２７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２９】
前記ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される、請求項２７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
前記１種以上の表現型変化は、前記第１の異種タンパク質の前記活性化の約３５日間以降に逆転される、請求項１〜２９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
前記１種以上の表現型変化は、前記第１の異種タンパク質の前記活性化の約７０日間以降に逆転される、請求項１〜２９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
請求項１の記載の非ヒトトランスジェニック動物の細胞であって、ここで該細胞は、
ａ）グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１の異種ヌクレオチド配列であって、ここで該第１の異種ヌクレオチド配列は、第１の異種タンパク質をコードし、該第１の異種核酸は、該細胞において安定して発現される、第１の異種ヌクレオチド配列；および
ｂ）第２の異種タンパク質をコードする第２の異種ヌクレオチド配列であって、ここで該第２の異種タンパク質は、該第１の異種タンパク質の活性化の際に発現され、該第１の異種タンパク質の活性化の際に該細胞の死滅を誘導する、第２の異種ヌクレオチド配列、
を含む、細胞。
【請求項３３】
前記細胞は、希突起膠細胞もしくはシュワン細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記細胞は、増殖細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞は、非増殖細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３６】
脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化の逆転を促進する薬剤を選択する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物において前記第１の異種タンパク質を活性化する工程；
ｂ）候補薬剤を該動物に投与する工程；
ｃ）該動物において脱髄状態に特徴的な１種以上の表現型変化を決定する工程；および
ｄ）該１種以上の表現型変化が、該候補薬剤を投与しないコントロール動物と比較してより迅速に逆転される場合に、該薬剤を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、不安定歩行、後肢麻痺、振せん、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
脱髄状態に特徴的な前記１種以上の表現型変化は、運動制御の低下、平衡の低下、およびＣＮＳ伝導の低下からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記運動制御もしくは平衡は、ロータロッド行動アッセイ、もしくは姿勢および歩行力学の空間的および時間的指標を提供する任意の他のアッセイによって測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＮＳ伝導は、脊髄体性感覚誘発電位によって測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤は、前記１種以上の表現型変化が前記第１の異種タンパク質の活性化後の約７０日間未満に逆転される場合に選択される、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤は、前記１種以上の表現型変化が前記第１の異種タンパク質の活性化後の約３５日間未満の逆転される場合に選択される、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
髄鞘再生を促進する薬剤を選択する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物において前記第１の異種タンパク質を活性化する工程；
ｂ）候補薬剤を該動物に投与する工程；
ｃ）該動物において髄鞘再生を決定する工程；および
ｄ）該動物が該候補薬剤を投与していないコントロール非トランスジェニック動物と比較して、髄鞘再生の増大を示す場合に該薬剤を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
髄鞘再生は、有髄軸索によって特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
髄鞘再生は、希突起膠細胞の細胞マーカーの発現によって特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記希突起膠細胞の細胞マーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、プロテイン２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記動物は、哺乳動物である、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルからなる群より選択される、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記動物は、マウスである、請求項３６〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記マウスは、少なくとも約５週齢である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記マウスは、少なくとも約４〜６ヶ月齢である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記マウスは、成体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記工程ａ）における活性化する工程は、外因性薬剤によるものである、請求項３６または４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記外因性薬剤は、１回より多く前記動物に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記外因性薬剤は、注射によってもしくは経口的に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記外因性薬剤は、局所に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記外因性薬剤は、タモキシフェンもしくはそのアナログである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１の異種タンパク質は、リコンビナーゼである、請求項３６〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼもしくはその改変体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記改変体は、融合タンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記融合タンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメインの融合タンパク質である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記融合タンパク質は、ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｒｅＥＲＴ２である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、前記動物に投与される、請求項３６〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記ＬＰＳは、前記第１の異種タンパク質の活性化の前にもしくは活性化と同時に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＬＰＳは、前記第１の異種タンパク質の活性化の後に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＬＰＳは、局所にもしくは腹腔内に投与される、請求項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記局所投与は、ＣＮＳもしくはＰＮＳに対するものである、請求項５６または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記局所投与は、脳に対するものである、請求項５６または６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記局所投与は、脊髄に対するものである、請求項５６または６６のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記局所投与は、視神経に対するものである、請求項５６または６６に記載の方法。
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１３−５０３６４５（Ｐ２０１３−５０３６４５Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８０７３（Ｐ２０１２−５２８０７３）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７７６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８９６９
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（３９９０１９８９２）ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ (9)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＣＡＧＯ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７７６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８９６９
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（３９９０１９８９２）ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ (9)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＣＡＧＯ
【Ｆターム（参考）】
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