神経細胞死抑制剤
【課題】 体内で産生される過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）またはグルタミン酸によって誘起される神経細胞の細胞死を抑制することができ、かつ、日常的な摂取に際しても安全性が高い神経細胞死抑制剤を提供する。また、これを含有する、脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防等のための製剤または健康機能性食品を提供する。
【解決手段】木クレオソートの主要成分であり、長年使用されたクレオソート製剤に含まれる、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールのいずれか、またはこれらの組み合わせを用いる。
【解決手段】木クレオソートの主要成分であり、長年使用されたクレオソート製剤に含まれる、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールのいずれか、またはこれらの組み合わせを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の細胞死抑制剤に関する。また、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、または、その他の脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤、または健康機能性食品に関する。ここで、健康機能性食品は、健康維持や健康増進の機能を有する飲食物であり、栄養改善法による特定保健用食品、及び、財団法人 日本健康・栄養食品協会の認定による健康補助食品を含む。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、物理的・化学的要因などで不慮に起こるネクローシスと、その他の要因によるアポトーシスに大別されるが、遺伝子によって制御されているアポトーシスによる細胞死の過程が先天的または後天的に障害されると、細胞死が過剰に誘発または抑制され、種々の機能障害を引き起こして病気に至る。
【０００３】
近年、種々の疾患の発症または進展に、このような細胞死が深く関与していることが明らかとなってきている。細胞死の増加に起因する疾患としては、神経変性疾患を挙げることができ、これには、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性などが含まれる。
【０００４】
そして、種々の細胞の細胞死を抑制するための細胞死抑制剤またはそのスクリーニング方法の探索が試みられている（特許文献１〜２）。一方、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経系疾患を改善する薬剤や化合物としては、あまり決定的なものがない中で、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が注目されている（例えば特許文献３）。これは、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解したり伝達をさまたげる酵素（アセチルコリンエステラーゼ）を阻害する働きがあり、この作用によってアルツハイマー病等の症状を改善しようと期待されている。また、ある程度の成果が得られている。他方、アルツハイマー病の治療または予防を他の機構によって行う試みも行われている（特許文献４）。
【特許文献１】特開２００４−３３７０２５
【特許文献２】特開２００４−２４０４
【特許文献３】特開平９−２６８１７６
【特許文献４】特開２００５−１０４８５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経細胞の細胞死を抑制する薬剤や化合物として上記特許文献１〜２に記載されたものは、体内で産生される過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）またはグルタミン酸によって誘起される神経細胞の細胞死を抑制する上で不充分であるか、または、日常的に服用するための安全性が充分に確かめられていない等のいずれかの問題があった。
【０００６】
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、神経細胞死抑制剤において、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）またはグルタミン酸によって誘起される神経細胞の細胞死を充分に抑制するとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧のないものを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の神経細胞死抑制剤は、下記の一般式（Ｉ-1〜Ｉ-4）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化２】
【０００８】
但し、上記一般式（Ｉ-1〜Ｉ-4）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【発明の効果】
【０００９】
上記神経変性疾患等の神経系疾患を治療、改善あるいは予防することができ、また別のメカニズムを持つ他の薬剤等（例えば、上述したアセチルコリンエステラーゼ阻害剤）と併用することにより、より一層効果的に神経系疾患を予防あるいは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記一般式（Ｉ(Ｉ-1〜Ｉ-4)）の化合物について、以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる
上記一般式（Ｉ）の化合物の中でも、Ｒ2が炭素数１〜３であることが、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。
【００１１】
また、Ｒ2は３または４の位置に結合していることが、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましく、中でも、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でもグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
【００１２】
これら２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N., Baba T. Analysis of beechwood creosote by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography. Res Commun Chem Pathol Pharmacol ６６，４１１−４２３（１９８９）,ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、木クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７th ed.（１９７３）、第３５５頁にも、木クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【００１３】
＜塩の形態＞
また、本発明の神経細胞死抑制剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩あるいはアンモニウム塩などが挙げられる。
【００１４】
＜神経系疾患＞
本発明の神経細胞死抑制剤の対象疾患名としては、例えばアルツハイマー病などの痴呆症、パーキンソン病やうつ病などが挙げられる。さらに、脳血管障害や脳虚血後の機能改善やリハビリテーション効果向上（促進）用などへの適応が期待できる。
【００１５】
＜使用量＞
本発明の神経細胞死抑制剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１６】
＜剤型・摂取形態＞
本発明の神経死抑制剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
【００１７】
このような医薬品としての剤型のみならず、本発明の神経細胞死抑制剤は一般の飲食物として摂取することもできる。すなわち、菓子類（クッキー、ビスケット、ケーキ、饅頭、スナック菓子、ガム、キャンデーなど）や飲料水（栄養ドリンク、炭酸飲料水、乳酸飲料水、清涼飲料水など）、インスタント食品（即席麺、即席カレーやシチューなど）、練り食品（ハム、ソーセージ、かまぼこなど）、油脂加工品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなど）、調味料（ソース、しょう油、塩、コショウなど）、乳製品（ヨーグルト、加工乳など）に含ませて本発明の神経細胞の細胞死抑制剤の摂取を図ることもできる。
【実施例】
【００１８】
＜神経細胞の採取から播種まで（図１)＞
(1) Wistarラットの１８日齢胎児より脳を摘出し、海馬を取り出した。
(2) 取り出した海馬を、フタ付き遠心管中のベルセン液に12分間、室温にて浸漬した。なお、ベルセン液は、リン酸緩衝液（PBS)中にエチレンジアミン4酢酸(EDTA)を0.2重量％含むものであり、細胞間の接着に必要なカルシウムをキレートすることで、細胞を分散しやすくする。
(3) パスツールピペットを用いて、ベルセン液を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含有するダルベッコ改変ＭＥＭ（ＦＣＳ１０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２；Dulbecco's modified Eagle's 培地、Sigma社製）に置き換え、また、当該培地中に海馬を分散した。
(4) フタをしてから、1500rpmにて4分間遠心分離操作を行った。
(5) 上澄みを捨て、遠心管の底にある沈殿（pellet）を、再度、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に分散した。
(6) 培地の単位体積あたりの細胞数を計測する。詳しくは、ピペッターにより一定量を細胞計数板にとり、染色後、光学顕微鏡にて計測した。
(7) 330,000個／ｃｍ2となるように海馬の細胞を２４穴マイクロプレートに播種した。
【００１９】
＜神経細胞の培養（図２)＞
(1)ＦＣＳ１０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２を培養液として、インキュベーターに設置し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃に保った。細胞を播いた時点から数えて０〜２４ｈｒを培養１日目とし、培養３日目（播種時から48〜72hrの期間）には、培養液に１０μＭとなるようにシトシンアラビノシド（Ara-C）を添加した条件で培養を行った。このシトシンアラビノシドによる処理により、グリア細胞の増殖を抑制する。
(2) 培養４〜９日目までは、下記ホルモンミックスを含むＤＭＥＭ中にて培養を行った。ホルモンミックス：0.5μg/mlインスリン、50μg/mlトランスフェリン、20ｎＭプロゲステロン、１ｐＭ β−エストラジオール、３ｎＭトリヨードチロニン、１００μＭプトレッシン、８ng/mlセレン２ナトリウム。なお、培養６日目の経過後に、培養液を、同一組成の新しいものに置き換えた。
(3) 培養９日目を経過した上記の細胞培地を、下記の２種類の細胞毒による細胞死とその抑制の評価に用いた。
【００２０】
＜過酸化水素による神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記の細胞培地に対して、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を１００μＭとなるように各ウェルに添加した。また、同時に、各ウェルに、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のいずれかを、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭのいずれかの濃度となるように添加した。ここで、各フェノール化合物には、東京化成工業（株）の一級試薬を用いた。そして、添加後６時間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図２）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は１２とした。
【００２１】
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物を添加せずに、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）のみ、０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、及び１ｍＭ加えた。そして、０μＭのものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３左）。この際のｎ数は４であるが、いずれかの添加量でも、細胞生存率に対する有意な影響が見られた。
【００２２】
＜グルタミン酸による神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記のような培養９日目を経過した細胞培地に、１００μＭとなるようにグルタミン酸を添加し、上記インキュベーター中、このようなグルタミン酸刺激培地中にて１時間処置した。この時、各種フェノール化合物（グアヤコール、２Ｍ４ＭＰおよび２Ｍ４ＥＰ）を１〜１０００μＭの濃度範囲で同時に添加した。この後、各ウェルの培養液を、上記のホルモンミックスを含有するＤＭＥＭに置換した。そして、グルタミン酸の添加から４８時間の経過後、すなわち培養１１日目に相当する期間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図２）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は１０とした。
【００２３】
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物を添加せずに、グルタミン酸のみ、０μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭ加えた。そして、０μＭのものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３右）。この際のｎ数は１２であるが、いずれかの添加量でも、細胞生存率に対する有意な影響が見られた。
【００２４】
＜細胞生存率の評価（ＭＴＴアッセイ）＞
上記のようにして神経細胞死を誘起させた後、培養液を、0.5mg/mlの3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromaide（ＭＴＴ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換し、３７℃の上記炭酸ガスインキュベーターにて１時間、呈色反応を行わせた。続いて、0.04N HClを含むイソプロパノール（isopropanol）を加えて、細胞を溶解させた。この後、マイクロプレートリーダーを用いて５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＭＴＴの還元反応の活性を求めた。
【００２５】
＜過酸化水素による細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図４の棒グラフに、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図４から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の比較的高い濃度の条件にて、過酸化水素による細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。また、１００μＭの添加濃度条件における細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）で小さく、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）で多少大きくなり、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）で一層大きくなった。１０μＭの添加濃度条件でも、ある程度同様の傾向が見られた。
【００２６】
図４中に示すように、有意差検定の結果、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）では、１μＭの添加濃度条件でも９５％以上の確率で有意な効果が見られたのに対し、２−メトキシフェノール（グアヤコール）では、１００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件で初めて有意な効果が得られた。また、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）では、１０μＭの添加濃度条件でも９９％以上の確率で有意な効果が見られたのに対し、２−メトキシフェノール（グアヤコール）では、１０００μＭの添加濃度条件で初めて９９％以上の確率での有意な効果が得られた。
【００２７】
なお、図６には、上記３種のフェノール化合物のいずれも、１０００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件では、９９％以上の確率で有意な効果が得られたことを、再度まとめて示す。
【００２８】
＜グルタミン酸による神経細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図５の棒グラフに、グルタミン酸による神経細胞死に対する、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図５から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の比較的高い濃度の条件にて、過酸化水素による細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。１０００μＭの添加濃度条件における細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の順で、顕著に大きくなった。また、１００μＭの添加濃度条件でも同様の傾向が見られたが、１０００μＭの場合に比べて細胞死抑制効果は格段に小さくなり、９５％以上の確率で有意な効果が得られたのは、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のみであった。
【００２９】
なお、図７には、上記３種のフェノール化合物のいずれも、１０００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件では、９９％以上の確率で有意な効果が得られたことを、再度まとめて示す。
【００３０】
＜剤型の例＞
下記に、各剤型による製剤例を示す。
・製剤例１（丸剤）
（処方１）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ５ｍｇ
カンゾウ ２５ｍｇ
グリセリン １０ｍｇ
常水 ５０ｍｇ
上記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。
【００３１】
・製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
デンプン ２５０ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。
【００３２】
・製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
オリーブ油 ２００ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。
【００３３】
・製剤例４（錠剤）
（処方４）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ２０ｍｇ
乳糖 ２５０ｍｇ
メチルセルロース ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース １０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】神経細胞の採取から播種までの手順を示した略示説明図である。
【図２】神経細胞を培養し、細胞死を誘起する手順を示した略示説明図である。
【図３】過酸化水素及びグルタミン酸により誘起される細胞死と、これらの添加濃度との関係を示す棒グラフである。
【図４】過酸化水素による細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果、及びその添加濃度依存性を示す棒グラフである。
【図５】グルタミン酸による細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果、及びその添加濃度依存性を示す棒グラフである。
【図６】図４の細胞死抑制効果について有意差検定を行った結果を説明するための棒グラフによる説明図である。
【図７】図５の細胞死抑制効果について有意差検定を行った結果を説明するための棒グラフによる説明図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の細胞死抑制剤に関する。また、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、または、その他の脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤、または健康機能性食品に関する。ここで、健康機能性食品は、健康維持や健康増進の機能を有する飲食物であり、栄養改善法による特定保健用食品、及び、財団法人 日本健康・栄養食品協会の認定による健康補助食品を含む。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、物理的・化学的要因などで不慮に起こるネクローシスと、その他の要因によるアポトーシスに大別されるが、遺伝子によって制御されているアポトーシスによる細胞死の過程が先天的または後天的に障害されると、細胞死が過剰に誘発または抑制され、種々の機能障害を引き起こして病気に至る。
【０００３】
近年、種々の疾患の発症または進展に、このような細胞死が深く関与していることが明らかとなってきている。細胞死の増加に起因する疾患としては、神経変性疾患を挙げることができ、これには、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性などが含まれる。
【０００４】
そして、種々の細胞の細胞死を抑制するための細胞死抑制剤またはそのスクリーニング方法の探索が試みられている（特許文献１〜２）。一方、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経系疾患を改善する薬剤や化合物としては、あまり決定的なものがない中で、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が注目されている（例えば特許文献３）。これは、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解したり伝達をさまたげる酵素（アセチルコリンエステラーゼ）を阻害する働きがあり、この作用によってアルツハイマー病等の症状を改善しようと期待されている。また、ある程度の成果が得られている。他方、アルツハイマー病の治療または予防を他の機構によって行う試みも行われている（特許文献４）。
【特許文献１】特開２００４−３３７０２５
【特許文献２】特開２００４−２４０４
【特許文献３】特開平９−２６８１７６
【特許文献４】特開２００５−１０４８５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経細胞の細胞死を抑制する薬剤や化合物として上記特許文献１〜２に記載されたものは、体内で産生される過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）またはグルタミン酸によって誘起される神経細胞の細胞死を抑制する上で不充分であるか、または、日常的に服用するための安全性が充分に確かめられていない等のいずれかの問題があった。
【０００６】
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、神経細胞死抑制剤において、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）またはグルタミン酸によって誘起される神経細胞の細胞死を充分に抑制するとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧のないものを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の神経細胞死抑制剤は、下記の一般式（Ｉ-1〜Ｉ-4）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化２】
【０００８】
但し、上記一般式（Ｉ-1〜Ｉ-4）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【発明の効果】
【０００９】
上記神経変性疾患等の神経系疾患を治療、改善あるいは予防することができ、また別のメカニズムを持つ他の薬剤等（例えば、上述したアセチルコリンエステラーゼ阻害剤）と併用することにより、より一層効果的に神経系疾患を予防あるいは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記一般式（Ｉ(Ｉ-1〜Ｉ-4)）の化合物について、以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる
上記一般式（Ｉ）の化合物の中でも、Ｒ2が炭素数１〜３であることが、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。
【００１１】
また、Ｒ2は３または４の位置に結合していることが、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましく、中でも、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でもグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
【００１２】
これら２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N., Baba T. Analysis of beechwood creosote by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography. Res Commun Chem Pathol Pharmacol ６６，４１１−４２３（１９８９）,ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、木クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７th ed.（１９７３）、第３５５頁にも、木クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【００１３】
＜塩の形態＞
また、本発明の神経細胞死抑制剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩あるいはアンモニウム塩などが挙げられる。
【００１４】
＜神経系疾患＞
本発明の神経細胞死抑制剤の対象疾患名としては、例えばアルツハイマー病などの痴呆症、パーキンソン病やうつ病などが挙げられる。さらに、脳血管障害や脳虚血後の機能改善やリハビリテーション効果向上（促進）用などへの適応が期待できる。
【００１５】
＜使用量＞
本発明の神経細胞死抑制剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１６】
＜剤型・摂取形態＞
本発明の神経死抑制剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
【００１７】
このような医薬品としての剤型のみならず、本発明の神経細胞死抑制剤は一般の飲食物として摂取することもできる。すなわち、菓子類（クッキー、ビスケット、ケーキ、饅頭、スナック菓子、ガム、キャンデーなど）や飲料水（栄養ドリンク、炭酸飲料水、乳酸飲料水、清涼飲料水など）、インスタント食品（即席麺、即席カレーやシチューなど）、練り食品（ハム、ソーセージ、かまぼこなど）、油脂加工品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなど）、調味料（ソース、しょう油、塩、コショウなど）、乳製品（ヨーグルト、加工乳など）に含ませて本発明の神経細胞の細胞死抑制剤の摂取を図ることもできる。
【実施例】
【００１８】
＜神経細胞の採取から播種まで（図１)＞
(1) Wistarラットの１８日齢胎児より脳を摘出し、海馬を取り出した。
(2) 取り出した海馬を、フタ付き遠心管中のベルセン液に12分間、室温にて浸漬した。なお、ベルセン液は、リン酸緩衝液（PBS)中にエチレンジアミン4酢酸(EDTA)を0.2重量％含むものであり、細胞間の接着に必要なカルシウムをキレートすることで、細胞を分散しやすくする。
(3) パスツールピペットを用いて、ベルセン液を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含有するダルベッコ改変ＭＥＭ（ＦＣＳ１０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２；Dulbecco's modified Eagle's 培地、Sigma社製）に置き換え、また、当該培地中に海馬を分散した。
(4) フタをしてから、1500rpmにて4分間遠心分離操作を行った。
(5) 上澄みを捨て、遠心管の底にある沈殿（pellet）を、再度、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に分散した。
(6) 培地の単位体積あたりの細胞数を計測する。詳しくは、ピペッターにより一定量を細胞計数板にとり、染色後、光学顕微鏡にて計測した。
(7) 330,000個／ｃｍ2となるように海馬の細胞を２４穴マイクロプレートに播種した。
【００１９】
＜神経細胞の培養（図２)＞
(1)ＦＣＳ１０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２を培養液として、インキュベーターに設置し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃に保った。細胞を播いた時点から数えて０〜２４ｈｒを培養１日目とし、培養３日目（播種時から48〜72hrの期間）には、培養液に１０μＭとなるようにシトシンアラビノシド（Ara-C）を添加した条件で培養を行った。このシトシンアラビノシドによる処理により、グリア細胞の増殖を抑制する。
(2) 培養４〜９日目までは、下記ホルモンミックスを含むＤＭＥＭ中にて培養を行った。ホルモンミックス：0.5μg/mlインスリン、50μg/mlトランスフェリン、20ｎＭプロゲステロン、１ｐＭ β−エストラジオール、３ｎＭトリヨードチロニン、１００μＭプトレッシン、８ng/mlセレン２ナトリウム。なお、培養６日目の経過後に、培養液を、同一組成の新しいものに置き換えた。
(3) 培養９日目を経過した上記の細胞培地を、下記の２種類の細胞毒による細胞死とその抑制の評価に用いた。
【００２０】
＜過酸化水素による神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記の細胞培地に対して、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を１００μＭとなるように各ウェルに添加した。また、同時に、各ウェルに、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のいずれかを、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭのいずれかの濃度となるように添加した。ここで、各フェノール化合物には、東京化成工業（株）の一級試薬を用いた。そして、添加後６時間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図２）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は１２とした。
【００２１】
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物を添加せずに、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）のみ、０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、及び１ｍＭ加えた。そして、０μＭのものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３左）。この際のｎ数は４であるが、いずれかの添加量でも、細胞生存率に対する有意な影響が見られた。
【００２２】
＜グルタミン酸による神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記のような培養９日目を経過した細胞培地に、１００μＭとなるようにグルタミン酸を添加し、上記インキュベーター中、このようなグルタミン酸刺激培地中にて１時間処置した。この時、各種フェノール化合物（グアヤコール、２Ｍ４ＭＰおよび２Ｍ４ＥＰ）を１〜１０００μＭの濃度範囲で同時に添加した。この後、各ウェルの培養液を、上記のホルモンミックスを含有するＤＭＥＭに置換した。そして、グルタミン酸の添加から４８時間の経過後、すなわち培養１１日目に相当する期間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図２）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は１０とした。
【００２３】
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物を添加せずに、グルタミン酸のみ、０μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭ加えた。そして、０μＭのものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３右）。この際のｎ数は１２であるが、いずれかの添加量でも、細胞生存率に対する有意な影響が見られた。
【００２４】
＜細胞生存率の評価（ＭＴＴアッセイ）＞
上記のようにして神経細胞死を誘起させた後、培養液を、0.5mg/mlの3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromaide（ＭＴＴ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換し、３７℃の上記炭酸ガスインキュベーターにて１時間、呈色反応を行わせた。続いて、0.04N HClを含むイソプロパノール（isopropanol）を加えて、細胞を溶解させた。この後、マイクロプレートリーダーを用いて５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＭＴＴの還元反応の活性を求めた。
【００２５】
＜過酸化水素による細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図４の棒グラフに、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図４から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の比較的高い濃度の条件にて、過酸化水素による細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。また、１００μＭの添加濃度条件における細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）で小さく、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）で多少大きくなり、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）で一層大きくなった。１０μＭの添加濃度条件でも、ある程度同様の傾向が見られた。
【００２６】
図４中に示すように、有意差検定の結果、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）では、１μＭの添加濃度条件でも９５％以上の確率で有意な効果が見られたのに対し、２−メトキシフェノール（グアヤコール）では、１００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件で初めて有意な効果が得られた。また、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）では、１０μＭの添加濃度条件でも９９％以上の確率で有意な効果が見られたのに対し、２−メトキシフェノール（グアヤコール）では、１０００μＭの添加濃度条件で初めて９９％以上の確率での有意な効果が得られた。
【００２７】
なお、図６には、上記３種のフェノール化合物のいずれも、１０００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件では、９９％以上の確率で有意な効果が得られたことを、再度まとめて示す。
【００２８】
＜グルタミン酸による神経細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図５の棒グラフに、グルタミン酸による神経細胞死に対する、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図５から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の比較的高い濃度の条件にて、過酸化水素による細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。１０００μＭの添加濃度条件における細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の順で、顕著に大きくなった。また、１００μＭの添加濃度条件でも同様の傾向が見られたが、１０００μＭの場合に比べて細胞死抑制効果は格段に小さくなり、９５％以上の確率で有意な効果が得られたのは、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のみであった。
【００２９】
なお、図７には、上記３種のフェノール化合物のいずれも、１０００μＭ（１ｍＭ）の添加濃度条件では、９９％以上の確率で有意な効果が得られたことを、再度まとめて示す。
【００３０】
＜剤型の例＞
下記に、各剤型による製剤例を示す。
・製剤例１（丸剤）
（処方１）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ５ｍｇ
カンゾウ ２５ｍｇ
グリセリン １０ｍｇ
常水 ５０ｍｇ
上記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。
【００３１】
・製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
デンプン ２５０ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。
【００３２】
・製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
オリーブ油 ２００ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。
【００３３】
・製剤例４（錠剤）
（処方４）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ２０ｍｇ
乳糖 ２５０ｍｇ
メチルセルロース ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース １０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】神経細胞の採取から播種までの手順を示した略示説明図である。
【図２】神経細胞を培養し、細胞死を誘起する手順を示した略示説明図である。
【図３】過酸化水素及びグルタミン酸により誘起される細胞死と、これらの添加濃度との関係を示す棒グラフである。
【図４】過酸化水素による細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果、及びその添加濃度依存性を示す棒グラフである。
【図５】グルタミン酸による細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果、及びその添加濃度依存性を示す棒グラフである。
【図６】図４の細胞死抑制効果について有意差検定を行った結果を説明するための棒グラフによる説明図である。
【図７】図５の細胞死抑制効果について有意差検定を行った結果を説明するための棒グラフによる説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする神経細胞死抑制剤。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【請求項２】
前記化合物が、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、または、その他の脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤であることを特徴とする請求項１または２の神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２の神経細胞死抑制剤を含有することを特徴とする健康機能性食品。
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする神経細胞死抑制剤。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【請求項２】
前記化合物が、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、または、その他の脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤であることを特徴とする請求項１または２の神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２の神経細胞死抑制剤を含有することを特徴とする健康機能性食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−３１５９９６（Ｐ２００６−３１５９９６Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４００７０（Ｐ２００５−１４００７０）
【出願日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９１００３３９２）大幸薬品株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９１００３３９２）大幸薬品株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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