移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法
【課題】移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】α−ガラクトシルセラミド等のＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤が提供される。本発明の予防剤を用いれば、臨床における膵島移植等における移植片喪失を予防することが可能であるので、移植効率の向上に寄与し得る。また、ＮＫＴ細胞の活性化、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生等を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムによる早期移植片喪失の予防・治療薬を創出することができる。
【解決手段】α−ガラクトシルセラミド等のＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤が提供される。本発明の予防剤を用いれば、臨床における膵島移植等における移植片喪失を予防することが可能であるので、移植効率の向上に寄与し得る。また、ＮＫＴ細胞の活性化、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生等を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムによる早期移植片喪失の予防・治療薬を創出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島移植時等における移植片喪失の予防剤に関する。更に、本発明は該移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法等に関する
【背景技術】
【０００２】
膵臓の膵島移植は、インスリン依存性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ）の治療のための非常に有望なアプローチである。しかしながら、その手法は多くの理由、特に、移植された膵島の早期移植片拒絶のためのその低効率により、試験的なものに留まっている。ＩＤＤＭの患者は、早期移植片喪失のために、単独のドナー膵臓からの膵島の移植後には、インスリン非依存性を達成することができない（非特許文献１：Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268／非特許文献２：Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238）。早期膵島喪失は、移植された膵島量の５０％にまで起こると見積もられていて（非特許文献３：Ryan, E. A., et. al., 2002, Diabetes, 51:2148-2157）、現在、２−３ドナー膵臓からの繰り返しの移植が、単独の糖尿病のレシピエントの良好な処置のために必要とされる（非特許文献１：Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268／非特許文献２：Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238）。レシピエント肝臓内への移植に引き続き、膵島移植片は門脈の末梢中で塞栓（ｅｍｂｏｌｉ）として互いにつかえて、対応する領域の虚血性変性を生じる。これが、膵島移植片に対して有害な炎症性サイトカインの放出を生じる自然免疫反応を引き起こし得る。インスリン分泌β細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの様な炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のサイトカインへの暴露に対して、インビトロで影響を受けやすい（非特許文献４：Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240）。
しかしながら、早期移植片喪失の発症メカニズムは十分には理解されておらず、このメカニズムを解明し、それに基づく早期移植片喪失の有効な予防薬を開発し、膵島移植の効率を上昇させることが切望されている。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識することを特徴とする（非特許文献５：Science, 278, p.1626-1629, 1997／非特許文献６：J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998／非特許文献７：Science, 306, p.1786-1789, 2004）。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（非特許文献８：Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986／非特許文献９：Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991／非特許文献１０：J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、自然及び獲得免疫系の橋渡しをするリンパ球の異なるサブセットに属し、急性反応において重要な役割を果たす。ＮＫＴ細胞は、活性化後すぐに大量のＩＮＦ−γを産生し、それが今度は自然免疫系におけるＮＫ細胞及び他の細胞、並びに獲得免疫系におけるＣＤ４Ｔｈ１細胞及びＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞を活性化する（非特許文献１１：Brigl, M., et. al., 2003, Nat. Immunol., 4: 1230-1237／非特許文献１２：Taniguchi, M., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513／非特許文献１３：Taniguchi, M., et al., 2003, Nat. Immunol., 4:1164-1165／非特許文献１４：Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 211-222／非特許文献１５：Cui, J., et. al., 1997, Science, 278: 1623-1626）。即ち、Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、多様なバクテリア、ウイルス、カビ、及び細胞内寄生虫に対する最前線防御として役割を果たしている（非特許文献１２：Taniguchi, M., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513／非特許文献１４：Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 211-222）。
α−ＧａｌＣｅｒ処理によるＮＫＴ細胞の活性化により、ＩＬ−４等のＴｈ２サイトカイン産生が起こり、自己免疫性Ｉ型糖尿病の発症及び再発を防ぎ得ることが報告されている（非特許文献１５：Nature Medicine, vol.7, number 9, 1057-1062, 2001）。また、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ曝露により脾臓Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌レベルが減少することが報告されている（非特許文献１６：Burdin, N., 1999, Eur. J. Immunol, 29: 2014-2025）。
一方、水酸化アルミニウム（アラム）により沈降させた抗原を免疫のために用いたときに、アラムにより誘導されたＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が液性応答におけるＢ細胞抗原プライミングに重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１７：Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810）。
しかし、移植片拒絶へのＮＫＴ細胞やＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の寄与に関しては知られていない。
【非特許文献１】Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268
【非特許文献２】Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238
【非特許文献３】Ryan, E. A., et. al., 2002, Diabetes, 51:2148-2157
【非特許文献４】Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240）。
【非特許文献５】Science, 278, p.1626-1629, 1997
【非特許文献６】J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998
【非特許文献７】Science, 306, p.1786-1789, 2004
【非特許文献８】Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986
【非特許文献９】Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991
【非特許文献１０】J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994
【非特許文献１１】Brigl, M., et. al., 2003, Nat. Immunol., 4: 1230-1237
【非特許文献１２】Taniguchi, M., et al., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513
【非特許文献１３】Taniguchi, M., et al., 2003, Nat. Immunol., 4:1164-1165
【非特許文献１４】Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol., 3: 211-222
【非特許文献１５】Cui, J., et. al., 1997, Science, 278: 1623-1626
【非特許文献１６】Burdin, N., 1999, Eur. J. Immunol, 29: 2014-2025
【非特許文献１７】Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、新たなメカニズムに基づく移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、マウス膵島移植モデルにおいて、Ｖα１４ＮＫＴ細胞によって移植後に創生されるＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が、膵臓膵島移植における早期移植片喪失の、必須の構成要素であり、且つ、主要な原因であることを立証した。Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスは、ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を創生せずに、移植された膵島の早期移植片喪失を生じなかった。Ｖα１４ＮＫＴ細胞のための特異的リガンドであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、早期移植片拒絶は首尾よく予防され、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生の劇的な減少を起こした。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【０００５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤。
［２］ＮＫＴ細胞リガンドはα−ガラクトシルセラミドである、上記［１］記載の剤。
［３］移植片喪失は膵島移植に伴うものである、上記［１］記載の剤。
［４］移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、上記［１］記載の剤。
［５］移植前に２回以上投与されることを特徴とする、上記［１］記載の剤。
［６］ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
［７］ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
［８］以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
［９］移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の予防剤を用いれば、臨床における膵島移植等における移植片喪失を予防することが可能であるので、移植効率の向上に寄与し得る。例えば、膵島移植においては、従来、早期移植片喪失のため、一人のレシピエントに対して２〜３人分のドナー膵島を繰り返し移植しなければ、十分な治療効果を達成することができなかったが、本発明の予防剤を用いれば、より少ない数のドナー膵島により同等の治療効果を挙げることができる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムによる早期移植片喪失の予防・治療薬を創出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（１．移植片喪失の予防剤）
本発明はＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤を提供するものである。理論には束縛されないが、移植に先立って予めレシピエントにＮＫＴ細胞リガンドを投与することにより、レシピエント内のＮＫＴ細胞の機能改変（ＩＦＮ-γ産生能の低下等）が起こり、移植片周囲においてＮＫＴ細胞により誘導され得るＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）等からのＩＦＮ-γ放出が強力に抑制され、ＩＦＮ−γによる移植片の障害が防止される。
【０００８】
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示された下記の「ＮＫＴ細胞リガンド」を認識する。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
【０００９】
「ＮＫＴ細胞リガンド」とは、ＣＤ１分子上に提示されたときに、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体により特異的に認識され、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「ＮＫＴ細胞リガンド」としては、例えば、α−グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（Science, 306, p.1786-1789, 2004）、ＯＣＨ（Nature 413:531, 2001）等を挙げることができる。α−グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、ＷＯ ９３／０５０５５、ＷＯ９４／０２１６８、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／２４１４２、およびＷＯ ９８／４４９２８、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（本明細書中、α−ガラクトシルセラミド又はα−ＧａｌＣｅｒと称する）が好ましい。
【００１０】
本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ＮＫＴ細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００１１】
また、本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その溶媒和物（水和物等）をも含む意味として用いられる。
【００１２】
本明細書中「移植片喪失」とは、移植後に移植片の一部又は全部が機能喪失又は破壊に陥ることをいう。また、本明細書中「移植片喪失」は、特に移植時の組織の侵傷や梗塞による虚血性変性の結果生じる自然免疫反応や炎症による移植片の機能喪失又は破壊、例えば炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β等）による移植片の機能喪失又は破壊をいい、獲得免疫反応による移植片の拒絶を含まない。自然免疫反応とは、個体に生来備わる生態防御反応をいう。獲得免疫反応とは、抗原受容体（T細胞受容体（TCR）、B細胞受容体（BCR）、抗体等）により特異的に認識される抗原を排除する反応をいい、獲得免疫反応による拒絶には、同種異系（allogenic）拒絶、異種異系（xenogenic）拒絶、及び自己免疫疾患における自己組織の拒絶が含まれる。
【００１３】
本明細書における「移植片喪失」は、「早期移植片喪失」であり得る。「早期」とは、移植直後、例えば、移植後約３日以内、好ましくは移植後約２４時間以内の期間のことをいう。
【００１４】
移植片喪失は、任意の組織の移植に伴うものであってよい。該組織としては、例えば、膵島、膵臓、肝臓、心臓、腎臓、骨髄、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、筋肉等を挙げることができる。本発明の予防剤はＮＫＴ細胞やＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を強力に抑制するが、膵島（β細胞等を含む）はＩＦＮ−γに対する感受性が特に高いので、本発明の予防剤は膵島移植に伴う移植片喪失の予防に極めて有効である。
【００１５】
移植に供される組織は、生体から摘出されたままの組織のみならず、該組織を構成し得る細胞、再生医療技術により生体外で幹細胞等から製造された組織（該組織を構成し得る細胞を含む）等をも含み得る。例えば、膵島β細胞はＥＳ細胞等からインビトロで製造され得る（Science , 292, 1389-1394, 2001）。
【００１６】
移植に供される組織の遺伝子型は、特に限定されないが、通常、同種同系、同種異系又は異種異系であり、好ましくは同種同系又は同種異系である。
【００１７】
また、移植片喪失は、生体内の任意の部位への移植に伴うものであってよい。該部位は、移植される組織の種類等を考慮して適宜選択することが可能である。移植片喪失は、例えば、肝臓内、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、動脈内、腎被膜下等への移植に伴うものであり得る。特に、肝臓内にはＮＫＴ細胞が高頻度に存在しているため、本発明の予防剤は肝臓内への移植に伴う移植片喪失の予防に極めて有効であり得る。
【００１８】
本発明の剤は、活性成分としてＮＫＴリガンド単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、本発明の剤は、有効量の活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００１９】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口を挙げることができる。投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
【００２０】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００２１】
本発明の予防剤は、移植に先立ちレシピエントに投与される。レシピエントは、任意の哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００２２】
本発明の予防剤のレシピエントへの投与回数は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、より強力にＮＫＴ細胞の機能改変（ＩＦＮ-γ産生能の低下等）を誘導し、移植片喪失をより確実に防ぐため、本発明の予防剤は移植前に２回以上、例えば２〜１０回、好ましくは２〜５回、レシピエントに投与され得る。本発明の予防剤を移植前に２回以上投与するときの投与間隔は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、例えば１〜３０日間隔、好ましくは１〜１４日間隔、より好ましくは１〜７日間隔である。投与間隔は一定であることが好ましいが、特に限定されない。また、移植直前の投与から移植時までの期間は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、例えば１〜３０日、好ましくは１〜１４日である。
【００２３】
本発明の予防剤の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、移植する組織の種類、もしくは移植部位等により異なるが、通常経口の場合、１回の投与につき、活性成分量として、５μｇ／ｍ２〜１０００ｇ／ｍ２、好ましくは５０μｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２を投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、１回の投与につき、活性成分量として、１μｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２、好ましくは１０μｇ／ｍ２〜１０ｇ／ｍ２を投与する。しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００２４】
（２．移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法）
後述の実施例に示されるように、本発明者らは、移植後にＮＫＴ細胞によって誘導されるＩＦＮ−γ産生ＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が移植片喪失の必須の構成要素であり、且つ、主要な原因であることを立証した。また、移植後に移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数が急増すること等が見出された。これらの知見に基づき、本発明は、以下の移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【００２５】
（スクリーニング方法Ｉ）
後述の実施例に示されるように、移植によりＮＫＴ細胞が活性化し、炎症性サイトカイン等の多様な遺伝子発現が亢進する。また、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスにおいては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。更に、ＮＫＴ細胞リガンドの１つであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、ＮＫＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生のダウンレギュレーションが起こり、移植片喪失が有意に抑制される。以上のような知見から、ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明はＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供するものである。
【００２６】
スクリーニング方法Ｉにおいては、通常、まず被検化合物及びＮＫＴ細胞が提供される。被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００２７】
ＮＫＴ細胞は自体公知の方法によって、ＮＫＴ細胞を含有する上述の哺乳動物の組織（例えば、肝臓、リンパ節、脾臓、末梢血、胸腺、肺等）から、ＮＫＴ細胞の形質に基づいて単離することが可能である。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているので、これらの受容体に対する抗体を用いて、Ｔ細胞受容体とＮＫ受容体の二重陽性細胞をセルソーター、抗体磁気ビーズ法等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる。例えばマウスにおいては、ＮＫＴ細胞はＴＣＲβ＋ＮＫ１．１＋細胞、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋細胞であり得る。また、ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識するので、当該糖脂質がロードされた可溶性のＣＤ１多量体（例えば四量体）が特異的に結合する細胞をセルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる（J Exp Med, 192, p.741-754, 2000; J Exp Med, 191, p.1895-1903, 2000）。更に、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られているので、ＮＫＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体のレパートリーを特異的に認識する抗体を用いて、セルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることもできる。例えば、ヒトにおいては、ＮＫＴ細胞はＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞であり得る。
【００２８】
ＮＫＴ細胞は、生体中の組織から単離された後に、インビトロで増殖された細胞や、株化された細胞をも含む。ＮＫＴ細胞は、自体公知の方法によりインビトロで増殖させることが可能であり、例えば、α−ガラクトシルセラミドがパルスされた樹状細胞の存在下で培養されることにより、ＮＫＴ細胞は増殖する。また、ＮＫＴ細胞の株化は、自体公知の方法（J Exp Med, 191, p.105-114, 2000）を用いて行うことが可能である。また、ＮＫＴ細胞は他の細胞（リンパ球等）と混合された状態（単核球画分など）で培養に供されてもよい。
【００２９】
次に、被検化合物の存在中で、ＮＫＴ細胞が活性化される。ＮＫＴ細胞の活性化は、適切な培養培地中で、ＮＫＴ細胞の活性化を誘導し得るような物質で刺激することにより行われ得る。該物質としては、上述のＮＫＴ細胞リガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を挙げることができる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は約１〜９６時間である。
【００３０】
また、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化する代わりに、予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞を活性化してもよい。被検化合物でＮＫＴ細胞を処理する際の培養培地、培地のｐＨ、培養温度は上述と同様であるが、培養時間は約１〜３０日が好ましい。予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞を活性化させる際の活性化方法、培養培地、培養条件は、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化させる場合と同様である。
【００３１】
被検化合物によるＮＫＴ細胞の処理は、被検化合物の動物への投与により行われてもよい。動物としては、例えば、上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。被検化合物の投与回数は１回であっても複数回であってもよい。次に、被検化合物が投与された動物から単離されたＮＫＴ細胞がインビトロで活性化される。ＮＫＴ細胞を活性化させる際の活性化方法、培養培地、培養条件は、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化させる場合と同様である。
【００３２】
次に、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）が評価される。ＮＫＴ細胞の活性化の程度は、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン産生、活性化に伴い発現量が変動し得る遺伝子の発現、細胞傷害性等を指標に評価することができる。ＩＦＮ−γ等のサイトカイン産生は、サイトカインの転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の産生量は、種々の免疫学的手法により測定され得る。例えば、培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング法などにより測定することが出来る。また、細胞中の翻訳産物をフローサイトメトリー等により直接測定することも出来る。
【００３３】
ＮＫＴ細胞の活性化に伴い発現量が変動し得る遺伝子としては、移植により活性化されたＮＫＴ細胞において発現量が増大する遺伝子を用いることが好ましい。該遺伝子としては、例えば、AIF1, CXCL2, CXCL7, CXCL9, IL-1β, IL-1ra, リンホトキシンα等の分泌タンパク質関連遺伝子、CCR1, CD244, FcγrIIb, IL-13Rα、MGL1, PIR-B等の受容体関連遺伝子、Hck, MARCKS, PTPRO, RASSF4等のシグナル伝達関連遺伝子、IRF-7, MafB, Runx2, ZFHX1B等の転写調節因子関連遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子発現は、上述のサイトカイン産生の評価と同様に、遺伝子の転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。また、複数の遺伝子の発現を網羅的に測定するためにマイクロアレー等を用いることもできる。
【００３４】
そして、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）が、被検化合物の不在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は被検化合物で処理されていないＮＫＴ細胞の活性化の程度）と比較される。活性化の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は被検化合物で処理されていないＮＫＴ細胞の活性化の程度）の値は、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００３５】
最後に、比較結果に基づいて、ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物が選択される。ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、ＮＫＴ細胞における活性化を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００３６】
（スクリーニング方法ＩＩ）
後述の実施例に示されるように、移植部位においてＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が高レベルのＩＦＮ-γを産生しており、かつ主要なＩＦＮ-γ細胞である。また、ＩＦＮ−γマウス−／−においては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。更に、α−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与によりＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生が抑制され、移植片喪失が予防される。以上のような知見から、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明はＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供するものである。
【００３７】
スクリーニング方法ＩＩにおいては、まず被検化合物及びＣＤ１１ｂ＋細胞が提供される。被検化合物は、上述のスクリーニング方法Ｉと同様のものが用いられる。
【００３８】
本発明に用いられるＣＤ１１ｂ＋（ＣＤ１１ｂ陽性）細胞は、更にＧｒ−１＋（Ｇｒ−１陽性）の表現型を有し得る。また、ＣＤ１１ｂ＋細胞は、更に、ＣＤ１１ｃ−（ＣＤ１１ｃ陰性）、ＣＤ８６−（ＣＤ８６陰性）、ＭＨＣクラスＩＩ−（ＭＨＣクラスＩＩ陰性）、Ｆ４／８０＋／−（Ｆ４／８０弱陽性）、及びＣＤ６８＋／−（ＣＤ６８弱陽性）からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは全ての表現型を更に有し得る。ＣＤ１１ｂ＋細胞は好中球であり得る。尚、動物種が生来的に保有していないマーカー分子によりＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型が定義される場合には、当該表現型は解析から除外されるなど、種差が考慮され得る。
【００３９】
本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（細胞表面抗原）発現の有無や強弱で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無や強弱で細胞の表現型が表記される。マーカー分子の発現の有無や強弱による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。このうち「強陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に高い、マーカー分子の発現量の高い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に多いこと等をいう。「弱陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に低い、マーカー分子の発現量の低い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
【００４０】
ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型についてＦ４／８０＋／−、ＣＤ６８＋／−と表される場合、比較対照の細胞としてマクロファージが意図される。
【００４１】
ＣＤ１１ｂ＋細胞は自体公知の方法によって、ＣＤ１１ｂ＋細胞を含有する上述の哺乳動物の組織（例えば、肝臓、脾臓、リンパ節、末梢血、胸腺等）から、ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に基づいて単離することが可能である。例えば、上述のＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に対応する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーター、抗体磁気ビーズ法等により単離することができる。
【００４２】
ＣＤ１１ｂ＋細胞は、生体中の組織から単離された後に、インビトロで増殖された細胞や、株化された細胞をも含む。また、ＣＤ１１ｂ＋細胞は他の細胞（リンパ球、ＮＫＴ細胞等）と混合された状態（単核球画分など）で培養に供されてもよい。
【００４３】
次に被検化合物の存在中で、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が誘導される。ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ-γ産生の誘導は、適切な培養培地中で、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し得るような物質で刺激することにより行われ得る。該物質としては、上述のＮＫＴリガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を挙げることができる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は約１〜９６時間である。
【００４４】
次に、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が定量される。ＩＦＮ−γ産生は、スクリーニング方法Ｉと同様の方法により測定することできる。
【００４５】
そして、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量が、被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量は、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００４６】
最後に、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。上述の様に、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００４７】
尚、本スクリーニング方法はまた、被検化合物の動物への投与により行われ得る。動物としては、例えば、上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、インビボで動物中のＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し、該動物へ被験化合物が投与される。動物への被検化合物の投与は、ＩＦＮ−γ産生誘導の前でも後でもよい。インビボでＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導する方法としては、特に限定されないが、例えば、上述のＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し得るような物質の投与や、任意の移植モデル等を挙げることができる。好ましくは、移植モデルが用いられる。移植モデルとしては、自体公知のモデルのいずれをも使用することが可能であり、所望の組織が、非ヒト哺乳動物レシピエントの生体内の任意の部位へ移植される。本スクリーニング方法において選択される「組織」、「生体内の部位」は上述と同様である。好ましくは、膵島が非ヒト哺乳動物レシピエントの肝臓内へ移植される。ここで、移植に供される「組織」はレシピエントと同種同系であることが好ましい。同種異系又は異種異系の組織を移植すると、移植片喪失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、移植片喪失に対する化合物の効果を評価することが困難となる場合があるからである。
【００４８】
次に被検化合物が投与された動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が測定される。移植モデルにおいては、好ましくは、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が測定される。「移植部位」は、移植された組織自体及びその定着部位を含む。例えば、膵島を肝臓に移植した場合は、「移植部位」は移植された膵島及び肝臓を含む。ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を測定する時期は、特に限定されないが、移植後の早い時期（例えば移植の３０分〜４８時間後）が好ましい。ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生は、例えば、動物から単核球画分を単離し、該単核球画分中に含まれるＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生をフローサイトメーターなどで測定することにより評価することができる。ＩＦＮ−γ産生量は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の数（又は割合）や、ＣＤ１１ｂ＋細胞への抗ＩＦＮ−γ＋抗体の結合量（蛍光強度であり得る）等として決定される。
【００４９】
そして、被検化合物が投与された動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が、被検化合物を投与されていない対動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生と比較され、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。動物を用いたスクリーニング方法は、インビボにおいて所望の効果を奏する化合物を得ることが出来る点で優れている。
【００５０】
（スクリーニング方法ＩＩＩ）
後述の実施例に示されるように、移植によりＮＫＴ細胞が活性化し、炎症性サイトカイン等の多様な遺伝子発現が亢進する。また、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウス及びＩＦＮ−γマウス−／−においては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。野生型マウスにおいては、移植部位においてＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が高レベルのＩＦＮ-γを産生しているが、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスにおいては、ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ-γ産生が抑制されている。更に、ＮＫＴ細胞リガンドの１つであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、ＮＫＴ細胞の機能を改変することにより、ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生が抑制され、移植片喪失が予防される。これらの知見から、移植時に活性化されたＮＫＴ細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し、これが移植片喪失の主要な原因であり、この誘導を阻害し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明は、以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ）を提供するものである：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
【００５１】
工程（Ａ）では、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する。被検化合物、ＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞は、上述のスクリーニング方法Ｉ、ＩＩと同様のものが用いられる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃である。
【００５２】
工程（Ｂ）では、まず、共培養物中のＮＫＴ細胞が刺激される。刺激は、上述のＮＫＴリガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を共培養物に添加することにより行われる。この刺激により、ＮＫＴ細胞が活性化し、更に活性化されたＮＫＴ細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導する。刺激後の培養時間は約１〜約９６時間である。
【００５３】
次に、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が定量される。ＩＦＮ−γ産生は、スクリーニング方法Ｉと同様の方法により測定することできる。
【００５４】
そして、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量が、被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量は、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００５５】
最後に、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。活性化されたＮＫＴ細胞により誘導されるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を阻害し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。
【００５６】
（スクリーニング方法ＩＶ）
後述の実施例に示されるように、移植を行った後に、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数が劇的に上昇する。そして、このＣＤ１１ｂ＋細胞が移植部位における主要なＩＦＮ−γ産生である。このような知見から、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数の上昇を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明は、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＶ）を提供するものである。
【００５７】
本スクリーニング方法は、上述の非ヒト哺乳動物を用いた移植モデルを使用して行われる。移植モデルとしては、自体公知のモデルのいずれをも使用することが可能であり、所望の組織が、非ヒト哺乳動物レシピエントの生体内の任意の部位へ移植される。本スクリーニング方法において選択される「組織」、「生体内の部位」は上述と同様である。好ましくは、膵島が非ヒト哺乳動物レシピエントの肝臓内へ移植される。ここで、移植に供される「組織」はレシピエントと同種同系であることが好ましい。同種異系又は異種異系の組織を移植すると、移植片喪失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、移植片喪失に対する化合物の効果を評価することが困難となる場合があるからである。
【００５８】
被検化合物はレシピエント動物へ投与される。投与時期は移植の前後いずれであってもよい。被検化合物は、スクリーニング方法Ｉに記載されたものと同様のものを使用することができる。
【００５９】
次に被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数が測定される。ＣＤ１１ｂ＋細胞数を測定する時期は、特に限定されないが、移植後の早い時期（例えば移植の３０分〜４８時間後）が好ましい。ＣＤ１１ｂ＋細胞数は、例えば、移植部位から単核球画分を単離し、該単核球画分中に含まれるＣＤ１１ｂ＋細胞数（或いは割合）をフローサイトメーター等で測定することにより評価することができる。
【００６０】
そして、被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数が、被検化合物を投与されていない対照レシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数と比較される。細胞数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。対照レシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数は、被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００６１】
最後に、比較結果に基づいて、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物が選択される。上述の様に、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法Ｉ〜ＩＶにより得られた化合物は、移植片喪失を予防・治療し得るので、上記本発明の予防剤と同様に、医薬として製剤化することによって、移植片喪失の予防・治療剤とすることができる。
【００６３】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
実験材料及び方法
（動物）
マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ （神奈川、日本）より購入され、本発明者らの動物施設にて維持された。雄Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス及びＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＶα１４ＮＫＴ細胞欠損（Ｊα２８１−／−）マウス（１０−１５週齢）が使用された。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＩＦＮ−γ欠損マウスは、東京大学医学部のＹ．Ｉｗａｋｕｍａ博士より供与された（Tagawa, Y., et. al., 1997, J. Immunol., 159: 1418-1428）。動物保護は、本発明者らの施設のガイドラインに従った。
【００６５】
（糖尿病誘導）
糖尿病は、ストレプトゾトシンの静脈内注入によってレシピエントマウス中に誘導された（ＳＴＺ、１８０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）（Schein, P. S., et. al., 1968, Diabetes, 17:760-765）。血漿グルコースレベルは、Ｂｅｃｋｍａｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｊａｐａｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により測定された。ＳＴＺ注入後、非絶食血漿グルコースレベルはｄａｙ２までに４００ｍｇ／ｄｌを超え、膵島移植の時にはマウスは高血糖のままであった。
【００６６】
（膵島単離及び移植）
膵島は、静的なコラゲナーゼ消化と、それに引続くＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙグラディエント中での遠心分離により単離され（Sutton, R., 1986, Transplantation, 42:689-691／Ohtsuka, K., et. al., 1997, Transplantation, 64: 633-639）、門脈を介してＳＴＺ誘導糖尿病マウスの肝臓中へ移植された（Kemp, C. B., et. al., 1973, Nature, 244:447）。非絶食時血漿グルコースレベル及び体重が、移植の前後において、週３回モニターされた。正常血糖は、移植後における、２回連続した２００ｍｇ／ｄｌより低い非絶食グルコースレベルとして定義された。
【００６７】
（α−ガラクトシルセラミド処理）
α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、ＲＩＫＥＮ ＲＣＡＩの実験室において合成され、キリンビール株式会社からも供与された（Kawano, T., et. al., 1997, Science, 278: 1626-1629）。マウスへ、α−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）又はビヒクル（１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）を、腹腔内に、１回又は３回（４日インターバルで）注入した。最後の注入から４日後、脾臓細胞がα−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクルの存在中で培養された。３日間培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルがＥＬＩＳＡにより測定された。
【００６８】
（細胞移入）
Ｐｅｒｃｏｌｌグラディエント遠心分離により獲得された肝臓単核球が既述のように調製された（Ohtsuka, K., et. al., 1997, Transplantation, 64: 633-639）。
【００６９】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーのために使用されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、抗マウスＦｃＲγＩＩ／ＩＩＩ（２．４Ｇ２），フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−接合抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２），ＡＰＣ−抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１），ＰｅｒＣＰ−接合抗Ｇｒ−１（Ｒｂ６−８ｃ５），ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−抗Ｇｒ−１（８６−８Ｃ５），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ８６（ＧＬ−１），ＦＩＴＣ−抗Ｉ−Ａｂ（ＡＦ６−１２０．１），ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧ１（Ａ８５−１），フィコエリスリン（ＰＥ）−接合抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），及びそれらのアイソタイプ適合コントロールは、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された。ＦＩＴＣ−抗Ｆ４／８０（Ａ３−１）及びＦＩＴＣ−抗ＣＤ６８（ＦＡ−１１）はＳＥＲＯＴＥＣ（Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）から獲得された。ＰＥ−接合α−ＧａｌＣｅｒロードＣＤ１ｄ（α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ）テトラマーは既述のように調製された（Matsuda, J. L., et. al., 2000, J. Exp. Med. 192:741-753）。細胞内染色のために、細胞は抗ＦｃＲγＩＩ／ＩＩＩ及びｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共にインキュベートされ、そして表面染色された。細胞は固定され、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）中で浸透化され、抗ＩＦＮ−γ及び抗ＩＬ−４ ｍＡｂｓにより、製造者の指示書に従い染色された。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で解析され、データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により処理された。１００００個の生細胞が解析された。
【００７０】
（セルソーティング及び移入）
肝単核球が既述の様に調製された（Transplantation, 64, 633-639, 1997）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞及びＶα１４ＮＫＴ細胞がMofloTM（Dako Cytomation, Glostrup）により、それぞれ、純度≧９９％及び≧９８％でソートされた。脾臓樹状細胞（ＤＣｓ）が、抗ＣＤ１１ｃ結合磁性ビーズ（Myltenyi Biotec）を用いてＭＡＣＳＲにより、純度≧９５％で精製された。
【００７１】
（抗体処理）
Ｇｒ−１又はＣＤ１１ｂに対するモノクローナル抗体が、２００個の膵島を受けたＳＴＺ糖尿病マウス内へ、移植時に、腹腔内注入された。
【００７２】
（組織学）
移植レシピエントからの肝臓及び膵臓がＢｏｕｉｎ’ｓ溶液中で固定され、光学顕微鏡試験のためにパラフィン中へ処理され、包埋された。切片はヘマトキシリン−エオシン及びアルデヒド−フクシンにより染色された。免疫組織化学解析が、ストレプトアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法により行われた（Int. J. Cancer., 83, 732-737, 1999）。
【００７３】
（遺伝子発現解析）
膵島移植後１時間、２時間、６時間の時点での肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるｍＲＮＡ発現がaffimetlix遺伝子チップにより解析された。また、肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡレベルがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された。ＩＬ−１βのための結果は、それぞれのＨＰＲＴ発現により標準化された。
【００７４】
（統計学的解析）
Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｅｓｔが、膵島移植後のストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおける正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）の割合の統計学的有意性を決定するために使用された。
【００７５】
結果及び考察
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞は早期膵島移植片喪失の原因である）
Ｖα１４ＮＫＴ細胞が膵島移植片不全に関わっている可能性を調べるために、本発明者らは膵島移植の試験系を確立することを試みた。本発明者らは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスにおける高血糖を改善するために必要とされるドナー膵島の最低限数を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＳＴＺの静脈内注入の後すぐに高血糖性及び糖尿病性となった（図１Ａ）。ＳＴＺ誘導糖尿病マウスでは、肝臓内に移植された４００個の同種同系膵島が正常血糖を達成するために十分であることが見出された（図１Ｂ、左）一方、正常血糖は、単独のマウス膵臓から単離することのできる膵島の数である、２００個の同種同系膵島の移植では達成することができなかった（図１Ｃ、左）。４００個の膵島（ｎ＝６）又は２００個の膵島（ｎ＝１０）の移植後の糖尿病野生型マウスにおける正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）の割合の差異は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。生化学的データに合致して、４００個の膵島を受けたマウスにおいて，よく顆粒化された（ｗｅｌｌ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有するそのままの膵島が組織学的にみられたが、一方２００個のみの膵島を受けたマウスにおいては、脱顆粒化された（ｄｅ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有する傷害された膵島が観察された（図１Ｂ及びＣ、右）。
【００７６】
本発明者らは、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が早期膵島移植片喪失に関与するかどうか試験した。全ての糖尿病性Ｊα２８１−／−マウスは、２００個又はたった１００個の膵島の移植後１１日までに正常血糖となった（図１Ｄ及びＥ、左）。組織学的試験もまた、よく顆粒化された（ｗｅｌｌ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有するそのままの膵島の存在を明瞭に立証し（図１Ｄ、右）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が移植片拒絶（及び移植された膵島の早期移植片喪失）に重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００７７】
移植された膵島に対するＶα１４ＮＫＴ細胞の有害な効果を証明するために、ナイーブな野生型、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスから単離された肝臓単核球（５×１０６個）が、２００個の同種同系膵島を受ける糖尿病性のＪα２８１−／−マウスの門脈中に、移植のときに注入された。野生型マウスからの細胞を注入された糖尿病のＪα２８１−／−マウスは、移植後６０日間、高血糖のままであった（図１Ｆ、左）。一方、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスからの細胞を注入された糖尿病のＪα２８１−／−マウスは、正常血糖となった（図１Ｇ及びＨ、左）。組織学的試験もまた、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスからの細胞のレシピエントにおいてそのままの膵島が存在し、野生型マウスからの細胞のレシピエントにおいてそうではないことを証明した（図１Ｆ、Ｇ、Ｈ、右）。該結果から、Ｖα１４ＮＫＴ細胞及びＩＦＮ−γが、早期移植片不全（喪失）のための必須の構成要素であることが示唆された。
【００７８】
（移植により誘導されたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は早期移植片喪失のエフェクター細胞である）
膵島移植片不全に関連した細胞変化を明らかにするために、肝単核球が膵島移植後に定期的に単離され、α−ＧａｌＣｅｒがロードされたＣＤ１ｄ（α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ）テトラマーを用いたＦＡＣＳにより試験された。ＦＡＣＳ解析は、α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー＋Ｖα１４ＮＫＴ細胞のパーセンテージは、はじめ、０ｈｒでの１０．３％から６ｈｒｓでの約５％へ減少したが、しかし膵島移植後２４時間では１９．２％に急上昇したことを示した（図２、左パネル）。この知見は、報告されているように（Int. Immunol., 16, 241-247, 2004：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913-10918, 2003：J. Immunol., 171, 4020-4027, 2003）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の活性化により受容体発現がダウンレギュレートされ、その結果α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマーによってＶα１４ＮＫＴ細胞が検出されなくなったことを示唆する。更に、移植後２〜６時間において採取されたＶα１４ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ-γやＩＬ−１βの様な炎症性サイトカインを産生したことから（図２及び図１０）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が移植により活性化されることが示唆された。Ｖα１４ＮＫＴ細胞の消失に引き続き、Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、既報のように（Int. Immunol., 16, 241-247, 2004：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913-10918, 2003：J. Immunol., 171, 4020-4027, 2003）、図２（２４ｈｒｓ）に示すように、早急に増殖した。興味深いことに、高レベルのＩＦＮ−γを産生するα−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー−細胞の割合が、膵島移植後６時間で０．５％から１４．３％へ著しく増加した（図２、左パネル）。α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー−細胞が更にゲートされ、Ｇｒ−１及びＣＤ１１ｂ発現がＩＦＮ−γ産生と関連して解析され、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞であると決定された（図３）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ８６−、ＭＨＣクラスＩＩ−、Ｆ４／８０＋／−、及びＣＤ６８＋／−であり（図４）、形態学的に好中球であったことから（図５）、これらの細胞は好中球であることが示唆された。移植された膵島の中へ侵入した好中球（図５）は、エフェクター細胞のようであった。なぜなら、Ｇｒ−１又はＣＤ１１ｂに対する抗体の注入により、膵島移植片の拒絶が予防されたからである（図６）。
野生型マウスと著しく対照的に、Ｊα２８１−／−マウスにおいてはＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加がみられず（図２、左パネル）、膵島移植に引続くＶα１４ＮＫＴ細胞の活性化がＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の誘導を引き起こすことが示唆された。Ｖα１４ＮＫＴ細胞の存在又は不在に関わらず、ＩＬ−４産生細胞の有意な増加は認められなかった（図２、右パネル）。
【００７９】
α−ＧａｌＣｅｒの単回注入がＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生を劇的に増進し（図７）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞がＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を活性化し、ＩＦＮ−γを産生させることが示唆された。即ち、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞による増加したＩＦＮ−γ産生は、膵島移植により誘導されたＶα１４ＮＫＴ細胞の直接的な結果であるようであった。
【００８０】
ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と同様に、水酸化アルミニウム（アラム）により沈降させた抗原を免疫のために用いたときに、アラムにより誘導されたＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞がＢ細胞活性化に重要な役割を果たしている（文献１２：Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810）。これらの２つの集団の、抗原非依存性及び免疫反応における重要性に関する類似性にもかかわらず、ＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は免疫後６日ではっきり現れるが、一方ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は移植後すぐ（６ｈｒ）に現れるという事実のような、多くの明らかな差異が言及される。該知見はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の機能的多様性を示唆する。
【００８１】
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞機能の改変による早期移植片喪失の予防）
Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒにより刺激された後すぐに著量のＩＦＮ−γを分泌するが、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激後ではＩＦＮ−γを産生することを停止した（図７）。本発明者らは、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ注入が、Ｖα１４ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を改変し、移植片生存性に影響を与え得る可能性をテストするために、膵島移植に対する繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激の効果を調べた。４００個の膵島を受けたＳＴＺ誘導糖尿病野生型マウスが、移植の際にビヒクルにより１回処理されたときに、全てのマウスは正常血糖となった（図８Ａ）。４００個の膵島を受けた糖尿病野生型マウスが、α−ＧａｌＣｅｒの単回注入（１００μｇ／ｋｇ）により処理されたときに、移植後６０日でも正常血糖になったマウスはいなかった（図８Ｂ）。対照的に、野生型マウスが、膵島移植より前の糖尿病の誘導の前のｄａｙ１５、１１、及び７に、α−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）により３回処理されていたときには、２００個の同種同系膵島のみの移植が、１０日以内に、全てのレシピエントマウスにおいて正常血糖を復活させた（図８Ｄ）。α−ＧａｌＣｅｒの替わりにビヒクルで処理されたマウスは、移植６０日後、高血糖のままであった（図８Ｃ）。これらの結果は、膵島移植より前の繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ注入によりＩＦＮ−γ産生のダウンレギュレーションが起こり、これが膵島移植に陽性に影響を与えたことを立証した。
【００８２】
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞により引き起こされたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ-γ
産生）
そこで、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γの産生への効果を調べた。ＦＡＣＳ解析は、膵島移植後直ちにＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が、非移植対照と比較して、増加したことを明らかとした（図９Ｂ）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の流入はＶα１４ＮＫＴ細胞とは独立であった。なぜなら、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加は、移植後のＪα２８１−／−マウスにおいても検出されたからである（図９Ｃ）。このことは、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞数が移植により上昇したことを示唆する。しかしながら、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生がα−ＧａｌＣｅｒの単回注入によって劇的に増進されたが（図９Ｄ）、α−ＧａｌＣｅｒの繰り返し注入が与えられたときは、ビヒクル処理コントロール（図９Ｅ）と同等のレベルにまで減少した（図９Ｆ）。従って、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ-γ産生は、全体としては、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の活性化状態に依存していることが示唆された。
以上より、インビボでの繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＶα１４ＮＫＴ細胞機能の改変は、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生を操作し、即時の移植片不全及び膵島移植片の早期の喪失を予防し、そして良好な膵島膵臓移植に寄与し得ることが示唆された。
マウスにおけるＶα１４ＮＫＴ細胞と同様に、ヒトＶα２４ＮＫＴ細胞も活性化により大量のＩＦＮ-γを放出する（J. Exp. Med., 186, 109-120, 1997）ことから、ヒトにおける膵島の早期移植片拒絶もＶα２４ＮＫＴ細胞により調節されることが示唆される。従って、ヒトＶα２４ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ-γ産生のダウンレギュレーションを標的とした治療法は、臨床における膵島移植片の早期喪失を予防することを助長し、膵臓膵島移植の効率の向上することを助長し得る。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｖα１４ＮＫＴ細胞が同種同系膵島移植片の早期喪失に重要な役割を果たしていることを示す図である。左パネルにおいて、個々の線は、それぞれの動物の非絶食血漿グルコースレベルを表す。＊重篤な糖尿病のため動物が死亡したことを示す。右パネルは、移植から６０日後において試験された肝臓中の膵島移植片の顕微鏡写真を示す。ＨＥ：ヘマトキシリン−エオシン。ＡＦ：アルデヒド−フクシン。原倍率：×１００。（Ａ）ＳＴＺの静脈内注入後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける高血糖。（Ｂ）４００個の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病マウスにおける正常血糖。（Ｃ）２００個の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病マウスにおける高血糖。（Ｄ，Ｅ）２００個（Ｄ）又は１００個（Ｅ）の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病Ｊα２８１−／−マウスにおける正常血糖。（Ｆ，Ｇ，Ｈ）２００個の膵島が移植されたＳＴＺ誘導糖尿病Ｊα２８１−／−マウスへ野生型（Ｆ）、Ｊα２８１−／−（Ｇ）、ＩＦＮ−γ欠損（Ｈ）マウスからの肝臓単核球細胞（５×１０６個）を門脈内注入した。
【図２】膵島移植後におけるＩＦＮ−γ産生細胞の誘導のためのＶα１４ＮＫＴ細胞の必要性を示す図である。図中の数字は、対応する領域中の細胞のパーセンテージを表す。中央のヒストグラムにおいて、ゲートされたＣＤ３＋ α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄテトラマー陽性細胞のＩＦＮ-γ産生（実線）が、陰性コントロール（点線）と比較される。
【図３】膵臓移植後６時間におけるＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の誘導を示す図である。図中の数字は、対応する領域中の細胞のパーセンテージを表す。
【図４】Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の表面表現型を示す図である。表面発現（実線）がコントロール（点線）と比較された。
【図５】移植後６時間の肝臓から単離されたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の組織学的知見を示す写真である。(i) May-Grunwald-Giemsa染色。原拡大率：×５００。(ii, iii, iv) インシュリン(ii)、Ｇｒ−１(iii)、及びＦ４／８０(iv)の免疫組織学的染色。矢頭は膵島内へ移植した侵入したＧｒ−１＋細胞を示す。原拡大率：×４００。
【図６】２００個の膵島移植及び抗Ｇｒ−１又は抗ＣＤ１１ｂ抗体処理による糖尿病の予防を示す図である。（Ａ）対照抗体（Ｂ）抗Ｇｒ−１抗体（Ｃ）抗体ＣＤ１１ｂ抗体
【図７】繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ処理後のＮＫＴ細胞のサイトカインプロファイルの変化を示す図である。α−ＧａｌＣｅｒ又はビヒクルを単回（黒カラム）、又は３回（白カラム）腹腔内に注入されたマウスから精製された肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞が、α−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクルによりパルスされた樹状細胞とともに培養され、サイトカイン産生がＥＬＩＳＡにより測定された。
【図８】繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ処理による同種同系膵島移植片不全の予防効果を示す図である。個々の線は、それぞれの動物の非絶食血漿グルコースレベルを表す。＊重篤な糖尿病による動物の死。（Ａ、Ｂ）単回α−ＧａｌＣｅｒ刺激による膵島移植片の拒絶。４００個の同種同系膵島が、膵島移植の時にビヒクル（Ａ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｂ）の単回腹腔内注入で処理されたＳＴＺ−誘導糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウス内へ移植された。（Ｃ，Ｄ）繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激による膵島移植片不全の予防。２００個の同種同系膵島が移植されたマウスが、移植の３日前のＳＴＺを注入される前のｄａｙ１５、１１及び７に、ビヒクル（Ｃ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）で３回処理された。
【図９】Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γの産生に対するα−ＧａｌＣｅｒ処理の効果を示す図である。図中の数字は対応する領域中の細胞のパーセントを表す。４００個又は２００個の同種同系膵島の移植６時間後に単離されたナイーブマウス（Ａ）、野生型（Ｂ及びＤ−Ｆ）又はＪα２８１−／−（Ｃ）の移植レシピエントからの肝臓単核球が解析された。４００個の膵島が移植されたマウスへ１回、ビヒクル（Ｂ、Ｃ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｄ）が注入された。同様に、２００個の膵島が移植されたマウスへ、３回、ビヒクル（Ｅ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｆ）が、移植の３日前のＳＴＺを静脈内へ注入する前のｄａｙ１５、１１、及び７に注入された。
【図１０】膵島移植後の肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるｍＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）affimetlix遺伝子チップによるｍＲＮＡ発現解析結果が示される。ナイーブＶα１４ＮＫＴ細胞よりも６倍以上アップレギュレートされた遺伝子が示される。ａ．ｂ．ｃ．は、それぞれ、膵島移植後１時間、２時間、６時間の時点で細胞を単離したことを示す。（Ｂ）肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡレベルがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された。ＩＬ−１βのための結果は、それぞれのＨＰＲＴ発現により標準化されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島移植時等における移植片喪失の予防剤に関する。更に、本発明は該移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法等に関する
【背景技術】
【０００２】
膵臓の膵島移植は、インスリン依存性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ）の治療のための非常に有望なアプローチである。しかしながら、その手法は多くの理由、特に、移植された膵島の早期移植片拒絶のためのその低効率により、試験的なものに留まっている。ＩＤＤＭの患者は、早期移植片喪失のために、単独のドナー膵臓からの膵島の移植後には、インスリン非依存性を達成することができない（非特許文献１：Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268／非特許文献２：Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238）。早期膵島喪失は、移植された膵島量の５０％にまで起こると見積もられていて（非特許文献３：Ryan, E. A., et. al., 2002, Diabetes, 51:2148-2157）、現在、２−３ドナー膵臓からの繰り返しの移植が、単独の糖尿病のレシピエントの良好な処置のために必要とされる（非特許文献１：Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268／非特許文献２：Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238）。レシピエント肝臓内への移植に引き続き、膵島移植片は門脈の末梢中で塞栓（ｅｍｂｏｌｉ）として互いにつかえて、対応する領域の虚血性変性を生じる。これが、膵島移植片に対して有害な炎症性サイトカインの放出を生じる自然免疫反応を引き起こし得る。インスリン分泌β細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの様な炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のサイトカインへの暴露に対して、インビトロで影響を受けやすい（非特許文献４：Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240）。
しかしながら、早期移植片喪失の発症メカニズムは十分には理解されておらず、このメカニズムを解明し、それに基づく早期移植片喪失の有効な予防薬を開発し、膵島移植の効率を上昇させることが切望されている。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識することを特徴とする（非特許文献５：Science, 278, p.1626-1629, 1997／非特許文献６：J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998／非特許文献７：Science, 306, p.1786-1789, 2004）。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（非特許文献８：Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986／非特許文献９：Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991／非特許文献１０：J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、自然及び獲得免疫系の橋渡しをするリンパ球の異なるサブセットに属し、急性反応において重要な役割を果たす。ＮＫＴ細胞は、活性化後すぐに大量のＩＮＦ−γを産生し、それが今度は自然免疫系におけるＮＫ細胞及び他の細胞、並びに獲得免疫系におけるＣＤ４Ｔｈ１細胞及びＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞を活性化する（非特許文献１１：Brigl, M., et. al., 2003, Nat. Immunol., 4: 1230-1237／非特許文献１２：Taniguchi, M., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513／非特許文献１３：Taniguchi, M., et al., 2003, Nat. Immunol., 4:1164-1165／非特許文献１４：Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 211-222／非特許文献１５：Cui, J., et. al., 1997, Science, 278: 1623-1626）。即ち、Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、多様なバクテリア、ウイルス、カビ、及び細胞内寄生虫に対する最前線防御として役割を果たしている（非特許文献１２：Taniguchi, M., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513／非特許文献１４：Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 211-222）。
α−ＧａｌＣｅｒ処理によるＮＫＴ細胞の活性化により、ＩＬ−４等のＴｈ２サイトカイン産生が起こり、自己免疫性Ｉ型糖尿病の発症及び再発を防ぎ得ることが報告されている（非特許文献１５：Nature Medicine, vol.7, number 9, 1057-1062, 2001）。また、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ曝露により脾臓Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌レベルが減少することが報告されている（非特許文献１６：Burdin, N., 1999, Eur. J. Immunol, 29: 2014-2025）。
一方、水酸化アルミニウム（アラム）により沈降させた抗原を免疫のために用いたときに、アラムにより誘導されたＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が液性応答におけるＢ細胞抗原プライミングに重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１７：Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810）。
しかし、移植片拒絶へのＮＫＴ細胞やＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の寄与に関しては知られていない。
【非特許文献１】Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268
【非特許文献２】Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238
【非特許文献３】Ryan, E. A., et. al., 2002, Diabetes, 51:2148-2157
【非特許文献４】Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240）。
【非特許文献５】Science, 278, p.1626-1629, 1997
【非特許文献６】J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998
【非特許文献７】Science, 306, p.1786-1789, 2004
【非特許文献８】Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986
【非特許文献９】Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991
【非特許文献１０】J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994
【非特許文献１１】Brigl, M., et. al., 2003, Nat. Immunol., 4: 1230-1237
【非特許文献１２】Taniguchi, M., et al., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513
【非特許文献１３】Taniguchi, M., et al., 2003, Nat. Immunol., 4:1164-1165
【非特許文献１４】Wilson, S. B., et. al., 2003, Nat. Rev. Immunol., 3: 211-222
【非特許文献１５】Cui, J., et. al., 1997, Science, 278: 1623-1626
【非特許文献１６】Burdin, N., 1999, Eur. J. Immunol, 29: 2014-2025
【非特許文献１７】Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、新たなメカニズムに基づく移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、マウス膵島移植モデルにおいて、Ｖα１４ＮＫＴ細胞によって移植後に創生されるＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が、膵臓膵島移植における早期移植片喪失の、必須の構成要素であり、且つ、主要な原因であることを立証した。Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスは、ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を創生せずに、移植された膵島の早期移植片喪失を生じなかった。Ｖα１４ＮＫＴ細胞のための特異的リガンドであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、早期移植片拒絶は首尾よく予防され、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生の劇的な減少を起こした。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【０００５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤。
［２］ＮＫＴ細胞リガンドはα−ガラクトシルセラミドである、上記［１］記載の剤。
［３］移植片喪失は膵島移植に伴うものである、上記［１］記載の剤。
［４］移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、上記［１］記載の剤。
［５］移植前に２回以上投与されることを特徴とする、上記［１］記載の剤。
［６］ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
［７］ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
［８］以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
［９］移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の予防剤を用いれば、臨床における膵島移植等における移植片喪失を予防することが可能であるので、移植効率の向上に寄与し得る。例えば、膵島移植においては、従来、早期移植片喪失のため、一人のレシピエントに対して２〜３人分のドナー膵島を繰り返し移植しなければ、十分な治療効果を達成することができなかったが、本発明の予防剤を用いれば、より少ない数のドナー膵島により同等の治療効果を挙げることができる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムによる早期移植片喪失の予防・治療薬を創出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（１．移植片喪失の予防剤）
本発明はＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤を提供するものである。理論には束縛されないが、移植に先立って予めレシピエントにＮＫＴ細胞リガンドを投与することにより、レシピエント内のＮＫＴ細胞の機能改変（ＩＦＮ-γ産生能の低下等）が起こり、移植片周囲においてＮＫＴ細胞により誘導され得るＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）等からのＩＦＮ-γ放出が強力に抑制され、ＩＦＮ−γによる移植片の障害が防止される。
【０００８】
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示された下記の「ＮＫＴ細胞リガンド」を認識する。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
【０００９】
「ＮＫＴ細胞リガンド」とは、ＣＤ１分子上に提示されたときに、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体により特異的に認識され、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「ＮＫＴ細胞リガンド」としては、例えば、α−グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（Science, 306, p.1786-1789, 2004）、ＯＣＨ（Nature 413:531, 2001）等を挙げることができる。α−グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、ＷＯ ９３／０５０５５、ＷＯ９４／０２１６８、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／２４１４２、およびＷＯ ９８／４４９２８、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（本明細書中、α−ガラクトシルセラミド又はα−ＧａｌＣｅｒと称する）が好ましい。
【００１０】
本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ＮＫＴ細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００１１】
また、本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その溶媒和物（水和物等）をも含む意味として用いられる。
【００１２】
本明細書中「移植片喪失」とは、移植後に移植片の一部又は全部が機能喪失又は破壊に陥ることをいう。また、本明細書中「移植片喪失」は、特に移植時の組織の侵傷や梗塞による虚血性変性の結果生じる自然免疫反応や炎症による移植片の機能喪失又は破壊、例えば炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β等）による移植片の機能喪失又は破壊をいい、獲得免疫反応による移植片の拒絶を含まない。自然免疫反応とは、個体に生来備わる生態防御反応をいう。獲得免疫反応とは、抗原受容体（T細胞受容体（TCR）、B細胞受容体（BCR）、抗体等）により特異的に認識される抗原を排除する反応をいい、獲得免疫反応による拒絶には、同種異系（allogenic）拒絶、異種異系（xenogenic）拒絶、及び自己免疫疾患における自己組織の拒絶が含まれる。
【００１３】
本明細書における「移植片喪失」は、「早期移植片喪失」であり得る。「早期」とは、移植直後、例えば、移植後約３日以内、好ましくは移植後約２４時間以内の期間のことをいう。
【００１４】
移植片喪失は、任意の組織の移植に伴うものであってよい。該組織としては、例えば、膵島、膵臓、肝臓、心臓、腎臓、骨髄、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、筋肉等を挙げることができる。本発明の予防剤はＮＫＴ細胞やＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を強力に抑制するが、膵島（β細胞等を含む）はＩＦＮ−γに対する感受性が特に高いので、本発明の予防剤は膵島移植に伴う移植片喪失の予防に極めて有効である。
【００１５】
移植に供される組織は、生体から摘出されたままの組織のみならず、該組織を構成し得る細胞、再生医療技術により生体外で幹細胞等から製造された組織（該組織を構成し得る細胞を含む）等をも含み得る。例えば、膵島β細胞はＥＳ細胞等からインビトロで製造され得る（Science , 292, 1389-1394, 2001）。
【００１６】
移植に供される組織の遺伝子型は、特に限定されないが、通常、同種同系、同種異系又は異種異系であり、好ましくは同種同系又は同種異系である。
【００１７】
また、移植片喪失は、生体内の任意の部位への移植に伴うものであってよい。該部位は、移植される組織の種類等を考慮して適宜選択することが可能である。移植片喪失は、例えば、肝臓内、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、動脈内、腎被膜下等への移植に伴うものであり得る。特に、肝臓内にはＮＫＴ細胞が高頻度に存在しているため、本発明の予防剤は肝臓内への移植に伴う移植片喪失の予防に極めて有効であり得る。
【００１８】
本発明の剤は、活性成分としてＮＫＴリガンド単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、本発明の剤は、有効量の活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００１９】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口を挙げることができる。投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
【００２０】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００２１】
本発明の予防剤は、移植に先立ちレシピエントに投与される。レシピエントは、任意の哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００２２】
本発明の予防剤のレシピエントへの投与回数は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、より強力にＮＫＴ細胞の機能改変（ＩＦＮ-γ産生能の低下等）を誘導し、移植片喪失をより確実に防ぐため、本発明の予防剤は移植前に２回以上、例えば２〜１０回、好ましくは２〜５回、レシピエントに投与され得る。本発明の予防剤を移植前に２回以上投与するときの投与間隔は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、例えば１〜３０日間隔、好ましくは１〜１４日間隔、より好ましくは１〜７日間隔である。投与間隔は一定であることが好ましいが、特に限定されない。また、移植直前の投与から移植時までの期間は、移植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、例えば１〜３０日、好ましくは１〜１４日である。
【００２３】
本発明の予防剤の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、移植する組織の種類、もしくは移植部位等により異なるが、通常経口の場合、１回の投与につき、活性成分量として、５μｇ／ｍ２〜１０００ｇ／ｍ２、好ましくは５０μｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２を投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、１回の投与につき、活性成分量として、１μｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２、好ましくは１０μｇ／ｍ２〜１０ｇ／ｍ２を投与する。しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００２４】
（２．移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法）
後述の実施例に示されるように、本発明者らは、移植後にＮＫＴ細胞によって誘導されるＩＦＮ−γ産生ＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が移植片喪失の必須の構成要素であり、且つ、主要な原因であることを立証した。また、移植後に移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数が急増すること等が見出された。これらの知見に基づき、本発明は、以下の移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【００２５】
（スクリーニング方法Ｉ）
後述の実施例に示されるように、移植によりＮＫＴ細胞が活性化し、炎症性サイトカイン等の多様な遺伝子発現が亢進する。また、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスにおいては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。更に、ＮＫＴ細胞リガンドの１つであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、ＮＫＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生のダウンレギュレーションが起こり、移植片喪失が有意に抑制される。以上のような知見から、ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明はＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供するものである。
【００２６】
スクリーニング方法Ｉにおいては、通常、まず被検化合物及びＮＫＴ細胞が提供される。被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００２７】
ＮＫＴ細胞は自体公知の方法によって、ＮＫＴ細胞を含有する上述の哺乳動物の組織（例えば、肝臓、リンパ節、脾臓、末梢血、胸腺、肺等）から、ＮＫＴ細胞の形質に基づいて単離することが可能である。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているので、これらの受容体に対する抗体を用いて、Ｔ細胞受容体とＮＫ受容体の二重陽性細胞をセルソーター、抗体磁気ビーズ法等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる。例えばマウスにおいては、ＮＫＴ細胞はＴＣＲβ＋ＮＫ１．１＋細胞、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋細胞であり得る。また、ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識するので、当該糖脂質がロードされた可溶性のＣＤ１多量体（例えば四量体）が特異的に結合する細胞をセルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる（J Exp Med, 192, p.741-754, 2000; J Exp Med, 191, p.1895-1903, 2000）。更に、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られているので、ＮＫＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体のレパートリーを特異的に認識する抗体を用いて、セルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることもできる。例えば、ヒトにおいては、ＮＫＴ細胞はＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞であり得る。
【００２８】
ＮＫＴ細胞は、生体中の組織から単離された後に、インビトロで増殖された細胞や、株化された細胞をも含む。ＮＫＴ細胞は、自体公知の方法によりインビトロで増殖させることが可能であり、例えば、α−ガラクトシルセラミドがパルスされた樹状細胞の存在下で培養されることにより、ＮＫＴ細胞は増殖する。また、ＮＫＴ細胞の株化は、自体公知の方法（J Exp Med, 191, p.105-114, 2000）を用いて行うことが可能である。また、ＮＫＴ細胞は他の細胞（リンパ球等）と混合された状態（単核球画分など）で培養に供されてもよい。
【００２９】
次に、被検化合物の存在中で、ＮＫＴ細胞が活性化される。ＮＫＴ細胞の活性化は、適切な培養培地中で、ＮＫＴ細胞の活性化を誘導し得るような物質で刺激することにより行われ得る。該物質としては、上述のＮＫＴ細胞リガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を挙げることができる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は約１〜９６時間である。
【００３０】
また、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化する代わりに、予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞を活性化してもよい。被検化合物でＮＫＴ細胞を処理する際の培養培地、培地のｐＨ、培養温度は上述と同様であるが、培養時間は約１〜３０日が好ましい。予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞を活性化させる際の活性化方法、培養培地、培養条件は、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化させる場合と同様である。
【００３１】
被検化合物によるＮＫＴ細胞の処理は、被検化合物の動物への投与により行われてもよい。動物としては、例えば、上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。被検化合物の投与回数は１回であっても複数回であってもよい。次に、被検化合物が投与された動物から単離されたＮＫＴ細胞がインビトロで活性化される。ＮＫＴ細胞を活性化させる際の活性化方法、培養培地、培養条件は、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞を活性化させる場合と同様である。
【００３２】
次に、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）が評価される。ＮＫＴ細胞の活性化の程度は、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン産生、活性化に伴い発現量が変動し得る遺伝子の発現、細胞傷害性等を指標に評価することができる。ＩＦＮ−γ等のサイトカイン産生は、サイトカインの転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の産生量は、種々の免疫学的手法により測定され得る。例えば、培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング法などにより測定することが出来る。また、細胞中の翻訳産物をフローサイトメトリー等により直接測定することも出来る。
【００３３】
ＮＫＴ細胞の活性化に伴い発現量が変動し得る遺伝子としては、移植により活性化されたＮＫＴ細胞において発現量が増大する遺伝子を用いることが好ましい。該遺伝子としては、例えば、AIF1, CXCL2, CXCL7, CXCL9, IL-1β, IL-1ra, リンホトキシンα等の分泌タンパク質関連遺伝子、CCR1, CD244, FcγrIIb, IL-13Rα、MGL1, PIR-B等の受容体関連遺伝子、Hck, MARCKS, PTPRO, RASSF4等のシグナル伝達関連遺伝子、IRF-7, MafB, Runx2, ZFHX1B等の転写調節因子関連遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子発現は、上述のサイトカイン産生の評価と同様に、遺伝子の転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。また、複数の遺伝子の発現を網羅的に測定するためにマイクロアレー等を用いることもできる。
【００３４】
そして、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）が、被検化合物の不在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は被検化合物で処理されていないＮＫＴ細胞の活性化の程度）と比較される。活性化の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は被検化合物で処理されていないＮＫＴ細胞の活性化の程度）の値は、被検化合物の存在中でのＮＫＴ細胞の活性化の程度（又は予め被検化合物で処理されたＮＫＴ細胞の活性化の程度）の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００３５】
最後に、比較結果に基づいて、ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物が選択される。ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、ＮＫＴ細胞における活性化を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００３６】
（スクリーニング方法ＩＩ）
後述の実施例に示されるように、移植部位においてＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が高レベルのＩＦＮ-γを産生しており、かつ主要なＩＦＮ-γ細胞である。また、ＩＦＮ−γマウス−／−においては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。更に、α−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与によりＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生が抑制され、移植片喪失が予防される。以上のような知見から、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明はＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供するものである。
【００３７】
スクリーニング方法ＩＩにおいては、まず被検化合物及びＣＤ１１ｂ＋細胞が提供される。被検化合物は、上述のスクリーニング方法Ｉと同様のものが用いられる。
【００３８】
本発明に用いられるＣＤ１１ｂ＋（ＣＤ１１ｂ陽性）細胞は、更にＧｒ−１＋（Ｇｒ−１陽性）の表現型を有し得る。また、ＣＤ１１ｂ＋細胞は、更に、ＣＤ１１ｃ−（ＣＤ１１ｃ陰性）、ＣＤ８６−（ＣＤ８６陰性）、ＭＨＣクラスＩＩ−（ＭＨＣクラスＩＩ陰性）、Ｆ４／８０＋／−（Ｆ４／８０弱陽性）、及びＣＤ６８＋／−（ＣＤ６８弱陽性）からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは全ての表現型を更に有し得る。ＣＤ１１ｂ＋細胞は好中球であり得る。尚、動物種が生来的に保有していないマーカー分子によりＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型が定義される場合には、当該表現型は解析から除外されるなど、種差が考慮され得る。
【００３９】
本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（細胞表面抗原）発現の有無や強弱で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無や強弱で細胞の表現型が表記される。マーカー分子の発現の有無や強弱による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。このうち「強陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に高い、マーカー分子の発現量の高い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に多いこと等をいう。「弱陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に低い、マーカー分子の発現量の低い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
【００４０】
ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型についてＦ４／８０＋／−、ＣＤ６８＋／−と表される場合、比較対照の細胞としてマクロファージが意図される。
【００４１】
ＣＤ１１ｂ＋細胞は自体公知の方法によって、ＣＤ１１ｂ＋細胞を含有する上述の哺乳動物の組織（例えば、肝臓、脾臓、リンパ節、末梢血、胸腺等）から、ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に基づいて単離することが可能である。例えば、上述のＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に対応する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーター、抗体磁気ビーズ法等により単離することができる。
【００４２】
ＣＤ１１ｂ＋細胞は、生体中の組織から単離された後に、インビトロで増殖された細胞や、株化された細胞をも含む。また、ＣＤ１１ｂ＋細胞は他の細胞（リンパ球、ＮＫＴ細胞等）と混合された状態（単核球画分など）で培養に供されてもよい。
【００４３】
次に被検化合物の存在中で、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が誘導される。ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ-γ産生の誘導は、適切な培養培地中で、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し得るような物質で刺激することにより行われ得る。該物質としては、上述のＮＫＴリガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を挙げることができる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は約１〜９６時間である。
【００４４】
次に、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が定量される。ＩＦＮ−γ産生は、スクリーニング方法Ｉと同様の方法により測定することできる。
【００４５】
そして、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量が、被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量は、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００４６】
最後に、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。上述の様に、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００４７】
尚、本スクリーニング方法はまた、被検化合物の動物への投与により行われ得る。動物としては、例えば、上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、インビボで動物中のＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し、該動物へ被験化合物が投与される。動物への被検化合物の投与は、ＩＦＮ−γ産生誘導の前でも後でもよい。インビボでＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導する方法としては、特に限定されないが、例えば、上述のＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し得るような物質の投与や、任意の移植モデル等を挙げることができる。好ましくは、移植モデルが用いられる。移植モデルとしては、自体公知のモデルのいずれをも使用することが可能であり、所望の組織が、非ヒト哺乳動物レシピエントの生体内の任意の部位へ移植される。本スクリーニング方法において選択される「組織」、「生体内の部位」は上述と同様である。好ましくは、膵島が非ヒト哺乳動物レシピエントの肝臓内へ移植される。ここで、移植に供される「組織」はレシピエントと同種同系であることが好ましい。同種異系又は異種異系の組織を移植すると、移植片喪失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、移植片喪失に対する化合物の効果を評価することが困難となる場合があるからである。
【００４８】
次に被検化合物が投与された動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が測定される。移植モデルにおいては、好ましくは、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が測定される。「移植部位」は、移植された組織自体及びその定着部位を含む。例えば、膵島を肝臓に移植した場合は、「移植部位」は移植された膵島及び肝臓を含む。ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を測定する時期は、特に限定されないが、移植後の早い時期（例えば移植の３０分〜４８時間後）が好ましい。ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生は、例えば、動物から単核球画分を単離し、該単核球画分中に含まれるＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生をフローサイトメーターなどで測定することにより評価することができる。ＩＦＮ−γ産生量は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の数（又は割合）や、ＣＤ１１ｂ＋細胞への抗ＩＦＮ−γ＋抗体の結合量（蛍光強度であり得る）等として決定される。
【００４９】
そして、被検化合物が投与された動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が、被検化合物を投与されていない対動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生と比較され、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。動物を用いたスクリーニング方法は、インビボにおいて所望の効果を奏する化合物を得ることが出来る点で優れている。
【００５０】
（スクリーニング方法ＩＩＩ）
後述の実施例に示されるように、移植によりＮＫＴ細胞が活性化し、炎症性サイトカイン等の多様な遺伝子発現が亢進する。また、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウス及びＩＦＮ−γマウス−／−においては、野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑制されている。野生型マウスにおいては、移植部位においてＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞等）が高レベルのＩＦＮ-γを産生しているが、Ｖα１４ＮＫＴ欠損（Ｊα２８１−／−）マウスにおいては、ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ-γ産生が抑制されている。更に、ＮＫＴ細胞リガンドの１つであるα−ＧａｌＣｅｒの繰り返し投与により、ＮＫＴ細胞の機能を改変することにより、ＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生が抑制され、移植片喪失が予防される。これらの知見から、移植時に活性化されたＮＫＴ細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導し、これが移植片喪失の主要な原因であり、この誘導を阻害し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明は、以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ）を提供するものである：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
【００５１】
工程（Ａ）では、被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する。被検化合物、ＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞は、上述のスクリーニング方法Ｉ、ＩＩと同様のものが用いられる。培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などを挙げることが出来る。培養条件としては、培地のｐＨは約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃である。
【００５２】
工程（Ｂ）では、まず、共培養物中のＮＫＴ細胞が刺激される。刺激は、上述のＮＫＴリガンド、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ペプチドグリカン、マイコバクテリウムボビス、二本鎖ＲＮＡ、βグルカン等）等を共培養物に添加することにより行われる。この刺激により、ＮＫＴ細胞が活性化し、更に活性化されたＮＫＴ細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導する。刺激後の培養時間は約１〜約９６時間である。
【００５３】
次に、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生が定量される。ＩＦＮ−γ産生は、スクリーニング方法Ｉと同様の方法により測定することできる。
【００５４】
そして、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量が、被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物の不在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量は、被検化合物の存在中でのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００５５】
最後に、比較結果に基づいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物が選択される。活性化されたＮＫＴ細胞により誘導されるＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を阻害し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。
【００５６】
（スクリーニング方法ＩＶ）
後述の実施例に示されるように、移植を行った後に、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数が劇的に上昇する。そして、このＣＤ１１ｂ＋細胞が移植部位における主要なＩＦＮ−γ産生である。このような知見から、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞の数の上昇を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用であることが理解される。従って、本発明は、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＶ）を提供するものである。
【００５７】
本スクリーニング方法は、上述の非ヒト哺乳動物を用いた移植モデルを使用して行われる。移植モデルとしては、自体公知のモデルのいずれをも使用することが可能であり、所望の組織が、非ヒト哺乳動物レシピエントの生体内の任意の部位へ移植される。本スクリーニング方法において選択される「組織」、「生体内の部位」は上述と同様である。好ましくは、膵島が非ヒト哺乳動物レシピエントの肝臓内へ移植される。ここで、移植に供される「組織」はレシピエントと同種同系であることが好ましい。同種異系又は異種異系の組織を移植すると、移植片喪失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、移植片喪失に対する化合物の効果を評価することが困難となる場合があるからである。
【００５８】
被検化合物はレシピエント動物へ投与される。投与時期は移植の前後いずれであってもよい。被検化合物は、スクリーニング方法Ｉに記載されたものと同様のものを使用することができる。
【００５９】
次に被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数が測定される。ＣＤ１１ｂ＋細胞数を測定する時期は、特に限定されないが、移植後の早い時期（例えば移植の３０分〜４８時間後）が好ましい。ＣＤ１１ｂ＋細胞数は、例えば、移植部位から単核球画分を単離し、該単核球画分中に含まれるＣＤ１１ｂ＋細胞数（或いは割合）をフローサイトメーター等で測定することにより評価することができる。
【００６０】
そして、被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数が、被検化合物を投与されていない対照レシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数と比較される。細胞数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。対照レシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数は、被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００６１】
最後に、比較結果に基づいて、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物が選択される。上述の様に、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物は、移植片喪失の予防・治療用化合物として有用である。従って、移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数を指標として、移植片喪失の予防・治療用の医薬、又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが可能となる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法Ｉ〜ＩＶにより得られた化合物は、移植片喪失を予防・治療し得るので、上記本発明の予防剤と同様に、医薬として製剤化することによって、移植片喪失の予防・治療剤とすることができる。
【００６３】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
実験材料及び方法
（動物）
マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ （神奈川、日本）より購入され、本発明者らの動物施設にて維持された。雄Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス及びＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＶα１４ＮＫＴ細胞欠損（Ｊα２８１−／−）マウス（１０−１５週齢）が使用された。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＩＦＮ−γ欠損マウスは、東京大学医学部のＹ．Ｉｗａｋｕｍａ博士より供与された（Tagawa, Y., et. al., 1997, J. Immunol., 159: 1418-1428）。動物保護は、本発明者らの施設のガイドラインに従った。
【００６５】
（糖尿病誘導）
糖尿病は、ストレプトゾトシンの静脈内注入によってレシピエントマウス中に誘導された（ＳＴＺ、１８０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）（Schein, P. S., et. al., 1968, Diabetes, 17:760-765）。血漿グルコースレベルは、Ｂｅｃｋｍａｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｊａｐａｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により測定された。ＳＴＺ注入後、非絶食血漿グルコースレベルはｄａｙ２までに４００ｍｇ／ｄｌを超え、膵島移植の時にはマウスは高血糖のままであった。
【００６６】
（膵島単離及び移植）
膵島は、静的なコラゲナーゼ消化と、それに引続くＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙグラディエント中での遠心分離により単離され（Sutton, R., 1986, Transplantation, 42:689-691／Ohtsuka, K., et. al., 1997, Transplantation, 64: 633-639）、門脈を介してＳＴＺ誘導糖尿病マウスの肝臓中へ移植された（Kemp, C. B., et. al., 1973, Nature, 244:447）。非絶食時血漿グルコースレベル及び体重が、移植の前後において、週３回モニターされた。正常血糖は、移植後における、２回連続した２００ｍｇ／ｄｌより低い非絶食グルコースレベルとして定義された。
【００６７】
（α−ガラクトシルセラミド処理）
α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、ＲＩＫＥＮ ＲＣＡＩの実験室において合成され、キリンビール株式会社からも供与された（Kawano, T., et. al., 1997, Science, 278: 1626-1629）。マウスへ、α−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）又はビヒクル（１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）を、腹腔内に、１回又は３回（４日インターバルで）注入した。最後の注入から４日後、脾臓細胞がα−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクルの存在中で培養された。３日間培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルがＥＬＩＳＡにより測定された。
【００６８】
（細胞移入）
Ｐｅｒｃｏｌｌグラディエント遠心分離により獲得された肝臓単核球が既述のように調製された（Ohtsuka, K., et. al., 1997, Transplantation, 64: 633-639）。
【００６９】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーのために使用されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、抗マウスＦｃＲγＩＩ／ＩＩＩ（２．４Ｇ２），フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−接合抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２），ＡＰＣ−抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１），ＰｅｒＣＰ−接合抗Ｇｒ−１（Ｒｂ６−８ｃ５），ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−抗Ｇｒ−１（８６−８Ｃ５），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３），ＦＩＴＣ−抗ＣＤ８６（ＧＬ−１），ＦＩＴＣ−抗Ｉ−Ａｂ（ＡＦ６−１２０．１），ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧ１（Ａ８５−１），フィコエリスリン（ＰＥ）−接合抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０），及びそれらのアイソタイプ適合コントロールは、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された。ＦＩＴＣ−抗Ｆ４／８０（Ａ３−１）及びＦＩＴＣ−抗ＣＤ６８（ＦＡ−１１）はＳＥＲＯＴＥＣ（Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）から獲得された。ＰＥ−接合α−ＧａｌＣｅｒロードＣＤ１ｄ（α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ）テトラマーは既述のように調製された（Matsuda, J. L., et. al., 2000, J. Exp. Med. 192:741-753）。細胞内染色のために、細胞は抗ＦｃＲγＩＩ／ＩＩＩ及びｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共にインキュベートされ、そして表面染色された。細胞は固定され、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）中で浸透化され、抗ＩＦＮ−γ及び抗ＩＬ−４ ｍＡｂｓにより、製造者の指示書に従い染色された。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で解析され、データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により処理された。１００００個の生細胞が解析された。
【００７０】
（セルソーティング及び移入）
肝単核球が既述の様に調製された（Transplantation, 64, 633-639, 1997）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞及びＶα１４ＮＫＴ細胞がMofloTM（Dako Cytomation, Glostrup）により、それぞれ、純度≧９９％及び≧９８％でソートされた。脾臓樹状細胞（ＤＣｓ）が、抗ＣＤ１１ｃ結合磁性ビーズ（Myltenyi Biotec）を用いてＭＡＣＳＲにより、純度≧９５％で精製された。
【００７１】
（抗体処理）
Ｇｒ−１又はＣＤ１１ｂに対するモノクローナル抗体が、２００個の膵島を受けたＳＴＺ糖尿病マウス内へ、移植時に、腹腔内注入された。
【００７２】
（組織学）
移植レシピエントからの肝臓及び膵臓がＢｏｕｉｎ’ｓ溶液中で固定され、光学顕微鏡試験のためにパラフィン中へ処理され、包埋された。切片はヘマトキシリン−エオシン及びアルデヒド−フクシンにより染色された。免疫組織化学解析が、ストレプトアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法により行われた（Int. J. Cancer., 83, 732-737, 1999）。
【００７３】
（遺伝子発現解析）
膵島移植後１時間、２時間、６時間の時点での肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるｍＲＮＡ発現がaffimetlix遺伝子チップにより解析された。また、肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡレベルがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された。ＩＬ−１βのための結果は、それぞれのＨＰＲＴ発現により標準化された。
【００７４】
（統計学的解析）
Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｅｓｔが、膵島移植後のストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおける正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）の割合の統計学的有意性を決定するために使用された。
【００７５】
結果及び考察
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞は早期膵島移植片喪失の原因である）
Ｖα１４ＮＫＴ細胞が膵島移植片不全に関わっている可能性を調べるために、本発明者らは膵島移植の試験系を確立することを試みた。本発明者らは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスにおける高血糖を改善するために必要とされるドナー膵島の最低限数を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＳＴＺの静脈内注入の後すぐに高血糖性及び糖尿病性となった（図１Ａ）。ＳＴＺ誘導糖尿病マウスでは、肝臓内に移植された４００個の同種同系膵島が正常血糖を達成するために十分であることが見出された（図１Ｂ、左）一方、正常血糖は、単独のマウス膵臓から単離することのできる膵島の数である、２００個の同種同系膵島の移植では達成することができなかった（図１Ｃ、左）。４００個の膵島（ｎ＝６）又は２００個の膵島（ｎ＝１０）の移植後の糖尿病野生型マウスにおける正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）の割合の差異は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。生化学的データに合致して、４００個の膵島を受けたマウスにおいて，よく顆粒化された（ｗｅｌｌ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有するそのままの膵島が組織学的にみられたが、一方２００個のみの膵島を受けたマウスにおいては、脱顆粒化された（ｄｅ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有する傷害された膵島が観察された（図１Ｂ及びＣ、右）。
【００７６】
本発明者らは、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が早期膵島移植片喪失に関与するかどうか試験した。全ての糖尿病性Ｊα２８１−／−マウスは、２００個又はたった１００個の膵島の移植後１１日までに正常血糖となった（図１Ｄ及びＥ、左）。組織学的試験もまた、よく顆粒化された（ｗｅｌｌ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）β細胞を有するそのままの膵島の存在を明瞭に立証し（図１Ｄ、右）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が移植片拒絶（及び移植された膵島の早期移植片喪失）に重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００７７】
移植された膵島に対するＶα１４ＮＫＴ細胞の有害な効果を証明するために、ナイーブな野生型、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスから単離された肝臓単核球（５×１０６個）が、２００個の同種同系膵島を受ける糖尿病性のＪα２８１−／−マウスの門脈中に、移植のときに注入された。野生型マウスからの細胞を注入された糖尿病のＪα２８１−／−マウスは、移植後６０日間、高血糖のままであった（図１Ｆ、左）。一方、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスからの細胞を注入された糖尿病のＪα２８１−／−マウスは、正常血糖となった（図１Ｇ及びＨ、左）。組織学的試験もまた、Ｊα２８１−／−、又はＩＦＮ−γ欠損マウスからの細胞のレシピエントにおいてそのままの膵島が存在し、野生型マウスからの細胞のレシピエントにおいてそうではないことを証明した（図１Ｆ、Ｇ、Ｈ、右）。該結果から、Ｖα１４ＮＫＴ細胞及びＩＦＮ−γが、早期移植片不全（喪失）のための必須の構成要素であることが示唆された。
【００７８】
（移植により誘導されたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は早期移植片喪失のエフェクター細胞である）
膵島移植片不全に関連した細胞変化を明らかにするために、肝単核球が膵島移植後に定期的に単離され、α−ＧａｌＣｅｒがロードされたＣＤ１ｄ（α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ）テトラマーを用いたＦＡＣＳにより試験された。ＦＡＣＳ解析は、α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー＋Ｖα１４ＮＫＴ細胞のパーセンテージは、はじめ、０ｈｒでの１０．３％から６ｈｒｓでの約５％へ減少したが、しかし膵島移植後２４時間では１９．２％に急上昇したことを示した（図２、左パネル）。この知見は、報告されているように（Int. Immunol., 16, 241-247, 2004：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913-10918, 2003：J. Immunol., 171, 4020-4027, 2003）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の活性化により受容体発現がダウンレギュレートされ、その結果α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマーによってＶα１４ＮＫＴ細胞が検出されなくなったことを示唆する。更に、移植後２〜６時間において採取されたＶα１４ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ-γやＩＬ−１βの様な炎症性サイトカインを産生したことから（図２及び図１０）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が移植により活性化されることが示唆された。Ｖα１４ＮＫＴ細胞の消失に引き続き、Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、既報のように（Int. Immunol., 16, 241-247, 2004：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913-10918, 2003：J. Immunol., 171, 4020-4027, 2003）、図２（２４ｈｒｓ）に示すように、早急に増殖した。興味深いことに、高レベルのＩＦＮ−γを産生するα−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー−細胞の割合が、膵島移植後６時間で０．５％から１４．３％へ著しく増加した（図２、左パネル）。α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ テトラマー−細胞が更にゲートされ、Ｇｒ−１及びＣＤ１１ｂ発現がＩＦＮ−γ産生と関連して解析され、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞であると決定された（図３）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ８６−、ＭＨＣクラスＩＩ−、Ｆ４／８０＋／−、及びＣＤ６８＋／−であり（図４）、形態学的に好中球であったことから（図５）、これらの細胞は好中球であることが示唆された。移植された膵島の中へ侵入した好中球（図５）は、エフェクター細胞のようであった。なぜなら、Ｇｒ−１又はＣＤ１１ｂに対する抗体の注入により、膵島移植片の拒絶が予防されたからである（図６）。
野生型マウスと著しく対照的に、Ｊα２８１−／−マウスにおいてはＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加がみられず（図２、左パネル）、膵島移植に引続くＶα１４ＮＫＴ細胞の活性化がＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の誘導を引き起こすことが示唆された。Ｖα１４ＮＫＴ細胞の存在又は不在に関わらず、ＩＬ−４産生細胞の有意な増加は認められなかった（図２、右パネル）。
【００７９】
α−ＧａｌＣｅｒの単回注入がＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＦＮ−γ産生を劇的に増進し（図７）、Ｖα１４ＮＫＴ細胞がＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を活性化し、ＩＦＮ−γを産生させることが示唆された。即ち、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞による増加したＩＦＮ−γ産生は、膵島移植により誘導されたＶα１４ＮＫＴ細胞の直接的な結果であるようであった。
【００８０】
ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と同様に、水酸化アルミニウム（アラム）により沈降させた抗原を免疫のために用いたときに、アラムにより誘導されたＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞がＢ細胞活性化に重要な役割を果たしている（文献１２：Jordan, M. B., 2004, Science, 304: 1808-1810）。これらの２つの集団の、抗原非依存性及び免疫反応における重要性に関する類似性にもかかわらず、ＩＬ−４産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は免疫後６日ではっきり現れるが、一方ＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は移植後すぐ（６ｈｒ）に現れるという事実のような、多くの明らかな差異が言及される。該知見はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の機能的多様性を示唆する。
【００８１】
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞機能の改変による早期移植片喪失の予防）
Ｖα１４ＮＫＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒにより刺激された後すぐに著量のＩＦＮ−γを分泌するが、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激後ではＩＦＮ−γを産生することを停止した（図７）。本発明者らは、繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ注入が、Ｖα１４ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を改変し、移植片生存性に影響を与え得る可能性をテストするために、膵島移植に対する繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激の効果を調べた。４００個の膵島を受けたＳＴＺ誘導糖尿病野生型マウスが、移植の際にビヒクルにより１回処理されたときに、全てのマウスは正常血糖となった（図８Ａ）。４００個の膵島を受けた糖尿病野生型マウスが、α−ＧａｌＣｅｒの単回注入（１００μｇ／ｋｇ）により処理されたときに、移植後６０日でも正常血糖になったマウスはいなかった（図８Ｂ）。対照的に、野生型マウスが、膵島移植より前の糖尿病の誘導の前のｄａｙ１５、１１、及び７に、α−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）により３回処理されていたときには、２００個の同種同系膵島のみの移植が、１０日以内に、全てのレシピエントマウスにおいて正常血糖を復活させた（図８Ｄ）。α−ＧａｌＣｅｒの替わりにビヒクルで処理されたマウスは、移植６０日後、高血糖のままであった（図８Ｃ）。これらの結果は、膵島移植より前の繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ注入によりＩＦＮ−γ産生のダウンレギュレーションが起こり、これが膵島移植に陽性に影響を与えたことを立証した。
【００８２】
（Ｖα１４ＮＫＴ細胞により引き起こされたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ-γ
産生）
そこで、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γの産生への効果を調べた。ＦＡＣＳ解析は、膵島移植後直ちにＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が、非移植対照と比較して、増加したことを明らかとした（図９Ｂ）。Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の流入はＶα１４ＮＫＴ細胞とは独立であった。なぜなら、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加は、移植後のＪα２８１−／−マウスにおいても検出されたからである（図９Ｃ）。このことは、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞数が移植により上昇したことを示唆する。しかしながら、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生がα−ＧａｌＣｅｒの単回注入によって劇的に増進されたが（図９Ｄ）、α−ＧａｌＣｅｒの繰り返し注入が与えられたときは、ビヒクル処理コントロール（図９Ｅ）と同等のレベルにまで減少した（図９Ｆ）。従って、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ-γ産生は、全体としては、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の活性化状態に依存していることが示唆された。
以上より、インビボでの繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＶα１４ＮＫＴ細胞機能の改変は、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γ産生を操作し、即時の移植片不全及び膵島移植片の早期の喪失を予防し、そして良好な膵島膵臓移植に寄与し得ることが示唆された。
マウスにおけるＶα１４ＮＫＴ細胞と同様に、ヒトＶα２４ＮＫＴ細胞も活性化により大量のＩＦＮ-γを放出する（J. Exp. Med., 186, 109-120, 1997）ことから、ヒトにおける膵島の早期移植片拒絶もＶα２４ＮＫＴ細胞により調節されることが示唆される。従って、ヒトＶα２４ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ-γ産生のダウンレギュレーションを標的とした治療法は、臨床における膵島移植片の早期喪失を予防することを助長し、膵臓膵島移植の効率の向上することを助長し得る。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｖα１４ＮＫＴ細胞が同種同系膵島移植片の早期喪失に重要な役割を果たしていることを示す図である。左パネルにおいて、個々の線は、それぞれの動物の非絶食血漿グルコースレベルを表す。＊重篤な糖尿病のため動物が死亡したことを示す。右パネルは、移植から６０日後において試験された肝臓中の膵島移植片の顕微鏡写真を示す。ＨＥ：ヘマトキシリン−エオシン。ＡＦ：アルデヒド−フクシン。原倍率：×１００。（Ａ）ＳＴＺの静脈内注入後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける高血糖。（Ｂ）４００個の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病マウスにおける正常血糖。（Ｃ）２００個の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病マウスにおける高血糖。（Ｄ，Ｅ）２００個（Ｄ）又は１００個（Ｅ）の膵島を移植されたＳＴＺ誘導糖尿病Ｊα２８１−／−マウスにおける正常血糖。（Ｆ，Ｇ，Ｈ）２００個の膵島が移植されたＳＴＺ誘導糖尿病Ｊα２８１−／−マウスへ野生型（Ｆ）、Ｊα２８１−／−（Ｇ）、ＩＦＮ−γ欠損（Ｈ）マウスからの肝臓単核球細胞（５×１０６個）を門脈内注入した。
【図２】膵島移植後におけるＩＦＮ−γ産生細胞の誘導のためのＶα１４ＮＫＴ細胞の必要性を示す図である。図中の数字は、対応する領域中の細胞のパーセンテージを表す。中央のヒストグラムにおいて、ゲートされたＣＤ３＋ α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄテトラマー陽性細胞のＩＦＮ-γ産生（実線）が、陰性コントロール（点線）と比較される。
【図３】膵臓移植後６時間におけるＩＦＮ−γ産生Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の誘導を示す図である。図中の数字は、対応する領域中の細胞のパーセンテージを表す。
【図４】Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の表面表現型を示す図である。表面発現（実線）がコントロール（点線）と比較された。
【図５】移植後６時間の肝臓から単離されたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の組織学的知見を示す写真である。(i) May-Grunwald-Giemsa染色。原拡大率：×５００。(ii, iii, iv) インシュリン(ii)、Ｇｒ−１(iii)、及びＦ４／８０(iv)の免疫組織学的染色。矢頭は膵島内へ移植した侵入したＧｒ−１＋細胞を示す。原拡大率：×４００。
【図６】２００個の膵島移植及び抗Ｇｒ−１又は抗ＣＤ１１ｂ抗体処理による糖尿病の予防を示す図である。（Ａ）対照抗体（Ｂ）抗Ｇｒ−１抗体（Ｃ）抗体ＣＤ１１ｂ抗体
【図７】繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ処理後のＮＫＴ細胞のサイトカインプロファイルの変化を示す図である。α−ＧａｌＣｅｒ又はビヒクルを単回（黒カラム）、又は３回（白カラム）腹腔内に注入されたマウスから精製された肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞が、α−ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクルによりパルスされた樹状細胞とともに培養され、サイトカイン産生がＥＬＩＳＡにより測定された。
【図８】繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ処理による同種同系膵島移植片不全の予防効果を示す図である。個々の線は、それぞれの動物の非絶食血漿グルコースレベルを表す。＊重篤な糖尿病による動物の死。（Ａ、Ｂ）単回α−ＧａｌＣｅｒ刺激による膵島移植片の拒絶。４００個の同種同系膵島が、膵島移植の時にビヒクル（Ａ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｂ）の単回腹腔内注入で処理されたＳＴＺ−誘導糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウス内へ移植された。（Ｃ，Ｄ）繰り返しのα−ＧａｌＣｅｒ刺激による膵島移植片不全の予防。２００個の同種同系膵島が移植されたマウスが、移植の３日前のＳＴＺを注入される前のｄａｙ１５、１１及び７に、ビヒクル（Ｃ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）で３回処理された。
【図９】Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によるＩＦＮ−γの産生に対するα−ＧａｌＣｅｒ処理の効果を示す図である。図中の数字は対応する領域中の細胞のパーセントを表す。４００個又は２００個の同種同系膵島の移植６時間後に単離されたナイーブマウス（Ａ）、野生型（Ｂ及びＤ−Ｆ）又はＪα２８１−／−（Ｃ）の移植レシピエントからの肝臓単核球が解析された。４００個の膵島が移植されたマウスへ１回、ビヒクル（Ｂ、Ｃ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｄ）が注入された。同様に、２００個の膵島が移植されたマウスへ、３回、ビヒクル（Ｅ）又はα−ＧａｌＣｅｒ（１００μｇ／ｋｇ）（Ｆ）が、移植の３日前のＳＴＺを静脈内へ注入する前のｄａｙ１５、１１、及び７に注入された。
【図１０】膵島移植後の肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるｍＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）affimetlix遺伝子チップによるｍＲＮＡ発現解析結果が示される。ナイーブＶα１４ＮＫＴ細胞よりも６倍以上アップレギュレートされた遺伝子が示される。ａ．ｂ．ｃ．は、それぞれ、膵島移植後１時間、２時間、６時間の時点で細胞を単離したことを示す。（Ｂ）肝臓Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡレベルがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された。ＩＬ−１βのための結果は、それぞれのＨＰＲＴ発現により標準化されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤。
【請求項２】
ＮＫＴ細胞リガンドはα−ガラクトシルセラミドである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
移植片喪失は膵島移植に伴うものである、請求項１記載の剤。
【請求項４】
移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、請求項１記載の剤。
【請求項５】
移植前に２回以上投与されることを特徴とする、請求項１記載の剤。
【請求項６】
ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
【請求項９】
移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤。
【請求項２】
ＮＫＴ細胞リガンドはα−ガラクトシルセラミドである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
移植片喪失は膵島移植に伴うものである、請求項１記載の剤。
【請求項４】
移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、請求項１記載の剤。
【請求項５】
移植前に２回以上投与されることを特徴とする、請求項１記載の剤。
【請求項６】
ＮＫＴ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法：
（Ａ）被検化合物の存在中でＮＫＴ細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞を共培養する工程；
（Ｂ）共培養物中のＮＫＴ細胞を刺激したときのＣＤ１１ｂ＋細胞からのＩＦＮ−γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
【請求項９】
移植部位におけるＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図５】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２７３８４２（Ｐ２００８−２７３８４２Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３３２５０（Ｐ２００５−２３３２５０）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
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