積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬
【課題】蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させる積層構造のシリカナノ粒子を提供する。
【解決手段】（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【解決手段】（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られた積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照）。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、例えばシリカ粒子の内部もしくは表面に蛍光もしくは発色特性を有する有機色素分子を結合させれば、光学的にその存在を検出することができる標識試薬を得ることができる。
【０００３】
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と反応しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、このようにして得られる色素分子とＡＰＳ分子からなる化合物（以下、単に「色素結合ＡＰＳ」という。）のエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで、結果的にシリカと前記色素分子をペプチド結合によって結合させる方法がある（例えば、特許文献１参照）。しかし前記手法でシリカ粒子を調製する場合、ＴＥＯＳの方が前記色素結合ＡＰＳよりも反応速度が速く、結果として前記色素結合ＡＰＳはシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。
色素の種類によっては前記色素結合ＡＰＳのシリカ粒子への取り込み効率が非常に低いものもある。そのような場合十分な量の色素をシリカ粒子に取り込ませるためには過剰量の前記色素結合ＡＰＳを前記アンモニア水含有溶媒に含有させなければならず、前記色素結合ＡＰＳが高価であるため、コストがかさんでしまう。
また、表面修飾の際などに前記の手法で得られたシリカ粒子をアンモニア水や水酸化ナトリウムなどの塩基性溶液に曝すと、前記シリカ粒子表面のシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）が加水分解され、粒子表面に偏在していた色素結合オルガノシロキサン成分が脱離してしまう問題があった。色素分子をシリカ粒子に取り込んで標識試薬とする場合、シリカ粒子から脱離した色素分子はターゲット物質以外のものと非特異的結合を起こしてシグナル／ノイズ比低下の原因となってしまう。さらに、シリカ粒子表面に存在する色素分子がシリカ粒子の表面修飾処理の際に悪影響を及ぼすという問題もあった。
【特許文献１】ＥＰ１０３６７６３Ｂ１公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させる積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から前記機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有する積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造される積層構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的物質の高感度定量分析が可能な標識試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程、
【０００６】
（２） 前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含んでなることを特徴とする（１）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程、
（３） 前記工程（ｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする（１）又は（２）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（４） 前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（５） 前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子、
【０００７】
（６） 最も外側の前記シリカの層が、前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることを特徴とする（５）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（７） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（８） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、及び
（９） 前記（５）〜（８）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が、１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、機能性分子の前記シリカ粒子への取り込み効率を向上させることができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を形成できる。
【０００９】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子を高濃度に含有させられ、高感度の標識試薬として用いることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有するので、高いアルカリ溶液耐性を持つ。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的物質の高感度定量分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
まず、本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含むことが好ましい。
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換処理し上記調製されたシリカ粒子を再分散させた後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、シリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程。
【００１２】
本発明において、溶媒置換とは、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有する前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で置換することをいい、詳しくはエタノール洗浄、水洗浄等の洗浄操作、減圧蒸留等を行わないこととする。
具体的な溶媒置換処理操作としては、前記工程（ａ）又は工程（ｂ）の終了後、得られた反応液を２００×ｇ〜２，０００×ｇを５〜２０分の弱い遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法や、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行った後、前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法等が挙げられる。
【００１３】
前記工程（ｃ）において、形成されるシリカのシェル層は、前記機能性分子を含有しないことが好ましい。
前記工程（ｃ）において、上記溶媒置換によっても粒子表面等に残存する前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に含有させてもよく、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されてもよく、１５質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されることが好ましい。
前記工程（ｃ）により、本発明の製造方法により調製されるシリカナノ粒子にアルカリ溶液に対する高い耐性を付与することができる。
【００１４】
本発明の製造方法において前記工程（ｂ）を、２回以上繰り返すことにより、得られるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量をさらに増大させることが好ましい。ただし前記工程（ｂ）を何度も繰り返すのは煩雑であり、またそれによって合成されるシリカ粒子の粒度分布が広くなるという弊害もあることから、前記工程（ｂ）の繰り返し回数をいくらでも多くすればよいというわけではない。実際には、前記コアとなる前記シリカ粒子の表面上に１〜６層の前記機能性分子を含有するシリカの層を形成するために、前記工程（ｂ）を１〜６回行うことが好ましい。
本発明に用いる前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
【００１５】
ここで、前記機能性分子の具体例としては、蛍光色素分子（例えば、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、フルオレセイン）、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、ｐＨ感受性色素分子等が挙げられる。
前記活性基を有する前記機能性分子の好ましい具体例として、下記式でそれぞれ表される５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】
前記活性基を有する前記オルガノアルコキシシランは、商業的に市販のものを入手することも可能である。
前記反応性基を有するオルガノアルコキシシランの具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン等のメルカプト基を有するオルガノアルコキシシラン等を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。メルカプト基を有するオルガノアルコキシシランを用いる場合は、マレイミド基を持つ機能性分子と結合させることができる。
【００１８】
前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
その場合反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの割合は、モル換算で等量であることが好ましい。ＮＨＳエステル基を有する機能性分子は一般に高価なためできるだけ無駄を少なくしたいが、アミノ基を有するオルガノアルコキシシランの割合が高いと未反応のアミノ基を持つオルガノアルコキシシランがシリカ粒子に取り込まれることになり、シリカ粒子が純水中で凝集傾向を持ってしまうことがある。
【００１９】
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。
【００２０】
前記テトラアルコキシシランのアルコキシ基は前記アンモニア水含有溶媒の中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらにそれらが脱水縮合してシロキサン結合を形成する。
一般にシリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を指すが、ここでは前述のようなオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
【００２１】
本発明における前記工程（ａ）について、テトラアルコキシシランとしてＴＥＯＳを用いた場合を下記スキームに例示する。
【００２２】
【化２】
【００２３】
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記テトラアルコキシシランの前記アンモニア水含有溶媒に含有させる量は、高すぎると粒子同士の融合が発生しやすくなり、逆に低すぎても粒度分布が広がる傾向にある。具体的には０．１〜２．０体積％であることが好ましく、０．２〜１．０体積％であることがより好ましい。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の前記アンモニア水含有溶媒中に含有させる量は、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率として、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
この溶解ないしは含有させておく前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の量により、得られる積層構造のシリカナノ粒子中の前記機能性分子の含有量を制御できる。
【００２４】
前記アンモニア水含有溶媒において、水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒に含有させるアンモニア水の濃度は、目的の積層構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
【００２５】
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）によりアンモニアの濃度を調節することで目的の積層構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、高温で合成を行うとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、反応時間を長くするとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
【００２６】
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合、前記工程（ｂ）において、後述するＦＲＥＴによる自己消光を防止するためには１０ｎｍ以上の厚みの色素分子を多く含まないシェル層を形成させることが望ましい。前記テトラアルコキシシランと比べて反応速度の遅い色素結合ＡＰＳをシリカ粒子に取り込む場合、前記コアとなるシリカ粒子の表面近傍に色素分子が偏在することになり、ここで前記工程（ｂ）を施すとさらに含有された前記テトラアルコキシシランが色素を多く含まない前記シリカの層を形成することになる。さらに時間をかけると新たに形成された層の表面近傍にも色素が多く取り込まれることになるが、前記コアの表面に偏在する色素からは１０ｎｍ以上隔たれていることになり、ＦＲＥＴによる自己消光を効果的に防止することができる。
【００２７】
１０ｎｍ以上の層を形成させるために前記アンモニア水含有溶媒にさらに含有させる前記テトラアルコキシシランの量は、その時点で形成されているシリカ粒子の粒径によって異なる。例えば平均粒径３０ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して１００〜１２０質量部が好ましく、平均粒径１００ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して３０〜３６質量部が好ましい。
前記工程（ｂ）における前記シリカ層の形成温度条件としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
【００２８】
実施例の項において図３を参照して後述するように、前記工程（ｃ）の前に、前記工程（ａ）又は（ｂ）で調製された反応液についてシリカ粒子の洗浄又は精製を行うとアンモニア水含有溶媒中で粒子同士の凝集傾向が生じてしまい、前記工程（ｃ）のシェル形成反応により前記シリカ粒子同士の不可逆的な融合が生じてしまう。
前記工程（ｃ）における前記シリカシェルの形成反応の温度条件としては特に制限はないが、除去しきれずに残留する機能性分子の取り込みを極力抑えたい場合には前記工程（ａ）や（ｂ）の場合とは逆に低い温度、すなわち０〜２０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、上記のような事情の場合には短時間、すなわち１〜３時間にとどめることが好ましい。
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長径と短径の比が１．２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収する手法がある。
【００２９】
次に、本発明の積層構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記工程（ａ）により得られた前記機能性分子含有シリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を１層又は２層以上のシリカの層がシロキサン結合により包囲してなる積層構造のシリカナノ粒子であることを特徴とする。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層数としては、１〜６層であることが好ましい。
前述のように、前記工程（ａ）により得られたコアとなる前記シリカ粒子を調製する場合、テトラアルコキシシランの方が前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物よりも反応速度が速い。そのため、合成初期にはテトラアルコキシシランが反応して形成されるシリカに含有される前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が低く、逆に合成後期には前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が高くなる。結果として、前記コアとなる前記シリカ粒子の内部においては、前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。前記工程（ｂ）により前記シリカの層を形成する場合においても同様に、前記シリカの層の外側に前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が高濃度に偏在することになる。
【００３０】
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合であって、前記工程（ｂ）でシリカの層を２層以上形成する場合、あるシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分と、それに隣接するシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分との距離が近すぎるとＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー遷移）が生じ、前記蛍光色素分子成分間で自己消光を起こして蛍光強度が低下してしまう（例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂ ７３，２４５３０２（２００６）参照。）。
そこで、本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層の厚みは、前記ＦＲＥＴによる自己消光を防止する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シリカの層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには前記ＦＲＥＴによる自己消光が抑制される範囲で前記シリカの層を極力薄くすることが好ましい。
【００３１】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子に、前述のようにアルカリ溶液耐性を付与する観点から、最も外側のシリカの層が、前記工程（ｃ）により形成された前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることが好ましい。
ただし、前記機能性分子を含有しない純粋なシリカのシェル層でもゆっくりではあるがアルカリ溶液によって溶かされていく。そのため、前記シェル層が厚いほど長時間、もしくは強いアルカリ溶液に耐えることができる。最も外側の前記機能性分子を含有しないシェル層の厚みは、前述のアルカリ溶液耐性を付与する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シェル層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには必要なアルカリ溶液耐性が得られる範囲で前記シェル層を極力薄くすることが好ましい。
【００３２】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の長径と短径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
【００３３】
また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ１５％以下の粒子群をいう。
前述の通り、例えばＡＰＳなどのオルガノアルコキシシランと結合させてテトラアルコキシシランと共に反応させることで、前記機能性分子をシリカ粒子に取り込むことができる。ただしその取り込み効率は結合させる機能性分子の種類によって異なり、例えば蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン色素をＡＰＳと結合させたオルガノアルコキシシラン化合物は取り込み効率が低い。取り込み効率の低い機能性物質をシリカ粒子に十分取り込ませるためには合成の際に多くのオルガノアルコキシシラン化合物を投入する必要があり、その場合投入した大部分のオルガノアルコキシシラン化合物が取り込まれずに廃棄されることになるため、コスト増大の要因となる。
【００３４】
これに対して、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことにより、前記機能性分子を高い効率で取り込むことができる。前記機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率の低さは、その反応速度の遅さに起因している。反応速度の遅いオルガノアルコキシシラン化合物はテトラアルコキシシランによってシリカ粒子が合成された後で粒子表面に徐々に結合していくが、その密度が高くなると取り込まれにくくなり、ついにはオルガノアルコキシシラン化合物の取り込まれる量と脱離する量が同じになって平衡状態に達し、オルガノアルコキシシラン化合物はそれ以上取り込まれなくなる。この状態で前記工程（ｂ）を施せばシリカ粒子の表面に新たなシリカの層が形成され、その表面にも同様にオルガノアルコキシシラン化合物が高密度に結合することで、一粒子あたりのオルガノアルコキシシラン化合物の結合量を増大させることができる。
一般的には前記機能性分子の取り込み量は多いほど好ましいが、蛍光色素に関しては濃度消光による蛍光強度の低下があるため最適な取り込み量が存在する。その量は１ｍｌあたり３×１０１７分子程度であり、これは粒径１００ｎｍのシリカ粒子に換算すると約１３，０００分子に相当する。本発明の積層構造のシリカナノ粒子では、シリカ粒子への取り込み効率の低いカルボキシフルオレセイン色素分子でも少ない投入量でこのシリカ粒子内密度を達成することができる。
【００３５】
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明の積層構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記積層構造のシリカナノ粒子が、前記機能性分子として蛍光色素分子もしくは吸光色素分子を含有する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記積層構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
【００３６】
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
【００３７】
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記積層構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
【００３８】
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明の積層構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記積層構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明の積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【００４０】
【化３】
【００４１】
撹拌１時間ほどでシリカコロイドの生成はほぼ完了したが、蛍光強度を測定すると極めて弱く、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが粒子に取り込まれるにはなお２〜３時間を要した。
蛍光強度の測定の結果から、反応開始から４〜５時間経過すると前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの取り込み速度が減少してきた。ここまでの操作を工程（ａ）とする。
前記工程（ａ）により得られたシェル層無しのシリカナノ粒子の蛍光強度を後述する図１において対照とした。
なお、前記シリカ粒子の蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、４９０ｎｍの励起光における５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００４２】
２．工程（ｂ）
工程（ａ）で得られたシリカ粒子に、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳを取り込む余地の豊富なシリカを提供するため、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。
ＴＥＯＳの追加投入量は、工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
さらに、この工程（ｂ）のシェル形成操作を繰り返して積層構造とした粒子も調製した。すなわち、この工程（ｂ）をさらに１回繰り返して２層のシェル層を有するシリカナノ粒子、この工程（ｂ）をさらに２回繰り返して３層のシェル層を有するシリカナノ粒子を、それぞれ、調製した。２回目以降のＴＥＯＳの追加投入量も工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
上記得られた各シリカナノ粒子を、それぞれ、洗浄し、平均粒径及び蛍光強度を測定した。
具体的な洗浄操作としては、反応終了後、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。
【００４３】
３．平均粒径測定
上記得られた各シリカナノ粒子の平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として算出した。
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子の平均粒径は、変動係数９．０％の粒度分布で平均粒径１９０ｎｍであった。
前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層を有するシリカナノ粒子の平均粒径は、それぞれ、シェル層分だけ平均粒径が増加し、１９８ｎｍ（変動係数８．６％）、２０４ｎｍ（変動係数７．８％）、２０９ｎｍ（変動係数６．１％）であった。
４．蛍光強度測定
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子、前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層有するシリカナノ粒子、それぞれの蛍光強度を前述と同様な装置、測定条件で測定した。図１に得られた結果を示す。
【００４４】
図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層をそれぞれ形成してなるシリカナノ粒子の蛍光強度を示す図である。
図１において、一定量である工程（ａ）において添加したカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの添加量で規格化（ノーマライズ）したシリカナノ粒子の蛍光強度（前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ添加量当りの蛍光強度）、及び測定対象となったシリカコロイドの質量濃度で規格化した蛍光強度（シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度）の２通りで示した。いずれも単位はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
【００４５】
図１から明らかなように、シリカナノ粒子の層数を１層、２層、３層と増加するごとに前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ投入量当りのシリカナノ粒子の蛍光強度は直線的に増加している。これにより、前記工程（ｂ）を行うごとに、アンモニア水含有溶媒に残存するカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが取り込まれていることがわかる。
一方、シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度については、シェルを１層形成することでシェル無しの対照の場合より１３％増大し、シェルを２層形成するとシェル無しの対照の場合より４３％増大した。しかしシェルを３層形成すると、その増大量は２９％に低下した。これは、シェルを形成することによってシリカナノ粒子の質量が増大し、その結果蛍光強度の増大率がシリカコロイドの質量濃度の増大率を下回ったからである。このことから、２層のシェルを形成することが最も機能性分子の取り込み効率が高い結果となった。
しかし、シェル形成のために追加するＴＥＯＳの量を適宜減じることにより、シリカナノ粒子の質量の増加率を抑えられるため、上記結果よりもさらにシリカコロイドの質量濃度当りの蛍光強度、すなわち機能性分子の取り込み効率を高めることができる。
【００４６】
実施例２（本発明の積層構造の吸光型シリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【００４７】
【化４】
【００４８】
室温下、撹拌３時間ほどでシリカ粒子のコロイドが生成したが、この場合前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの投入量が多いため、シリカ粒子内部に取り込まれずに溶液中に残留する前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの比率が高かった。
溶液中の遊離色素による蛍光強度の測定の結果から、反応開始から７〜８時間経過すると前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの取り込み速度が減少し、反応終了とした。得られた粒子は、カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に偏在していた。
【００４９】
２．工程（ｂ）
実施例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を実施例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
【００５０】
実施例３（本発明の機能性分子脱離防止用シェル層を有するシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ｃ）
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、工程（ｂ）を行うことなく、アルカリ水溶液耐性を付与するための前記ＴＡＭＲＡを含有しないシェル層を形成するため、以下の工程（ｃ）に供した。
工程（ａ）終了後、得られたシリカ粒子を前記洗浄操作に供することなく、前記ＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳを含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で溶媒置換処理を行った。具体的には、１，０００×ｇ、１０分の条件で遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去後、得られた沈殿物を２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈して得た新たなアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに再分散させ溶媒置換した。
【００５１】
次に、工程（ａ）における投入量と等量のＴＥＯＳを投入し室温２時間反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素をほとんど含有しない１層のシリカのシェル層を有するシリカナノ粒子を得た（収量１７０ｍｇ分；コロイド乾燥重量、収率６３％）。得られたシリカ粒子を実施例３のシリカナノ粒子とする。
図３に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図１中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られた積層構造のシリカナノ粒子である。粒子同士が融合するような不具合が生じていないことがわかる。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２００個以上）の直径を測定し、その粒度分布を算出したところ、変動係数１４．７％で平均粒径８８ｎｍであった。
【００５２】
２．比較試験
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、アルカリ水溶液耐性を付与するシェル層を形成するための前記工程（ｃ）に供する前に、実施例１と同様な洗浄操作を行った後、工程（ｃ）を行うことを試みた。
工程（ａ）終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行ったシリカ粒子を再度シリカ粒子合成液に分散させて新たにＴＥＯＳを投入したところ、反応に供したシリカ粒子同士が融合してしまった。
図４に得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図４中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える物質が、得られたシリカ粒子である。図４から明らかなように、粒子の多くがいびつな形状をしており、反応に供したシリカ粒子同士の融合が頻繁に発生したことがわかる。
【００５３】
３．アンモニア水溶液によるエッチング試験
前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子を、それぞれ、２．８質量％のアンモニア水溶液中に分散させ、アンモニア水溶液によるエッチング試験を行い、アルカリ水溶液に対する耐性を評価した。
色素の脱離量は、遠心分離によって前記アンモニア水溶液からシリカ粒子を除去した残りの溶媒を回収し、その中に遊離している色素がシリカ粒子から脱離した色素とみなし、その蛍光強度を測定することで、その評価を行った。
【００５４】
図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離カルボキシＴＡＭＲＡ色素による蛍光強度のグラフを示す図である。
図４から明らかなように、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子については、１時間後には、蛍光強度にして４０００ａｕ以上の大量の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子から脱離してしまったことがわかる。２時間後にも同様に約１８０００ａｕの蛍光強度が検出され、大量の脱離が起こっていることがわかる。
【００５５】
一方、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子については、１時間後の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素の脱離量は、蛍光強度にして５００ａｕ未満の僅かな量にとどまったことがわかる。
実施例２のシリカナノ粒子の結果との比較から、実施例３のシリカナノ粒子についてはアルカリ溶液に対して耐性があるといえる。
２時間後についてはアンモニア水溶液中に約１４０００ａｕの蛍光強度が検出されたが、前記シェル層を越えてエッチングが進行したため、工程（ａ）で得られた粒子のコア部分から脱離したといえる。
【００５６】
実施例４
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
【００５７】
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層を形成してなるシリカナノ粒子それぞれの蛍光強度を示す図である。
【図２】図２は、実施例３で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図３】図３は、比較試験で得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離色素の蛍光強度のグラフを示す図である。
【図５】図５は、実施例４の分子認識試験に用いたストリップの平面図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られた積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照）。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、例えばシリカ粒子の内部もしくは表面に蛍光もしくは発色特性を有する有機色素分子を結合させれば、光学的にその存在を検出することができる標識試薬を得ることができる。
【０００３】
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と反応しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、このようにして得られる色素分子とＡＰＳ分子からなる化合物（以下、単に「色素結合ＡＰＳ」という。）のエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで、結果的にシリカと前記色素分子をペプチド結合によって結合させる方法がある（例えば、特許文献１参照）。しかし前記手法でシリカ粒子を調製する場合、ＴＥＯＳの方が前記色素結合ＡＰＳよりも反応速度が速く、結果として前記色素結合ＡＰＳはシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。
色素の種類によっては前記色素結合ＡＰＳのシリカ粒子への取り込み効率が非常に低いものもある。そのような場合十分な量の色素をシリカ粒子に取り込ませるためには過剰量の前記色素結合ＡＰＳを前記アンモニア水含有溶媒に含有させなければならず、前記色素結合ＡＰＳが高価であるため、コストがかさんでしまう。
また、表面修飾の際などに前記の手法で得られたシリカ粒子をアンモニア水や水酸化ナトリウムなどの塩基性溶液に曝すと、前記シリカ粒子表面のシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）が加水分解され、粒子表面に偏在していた色素結合オルガノシロキサン成分が脱離してしまう問題があった。色素分子をシリカ粒子に取り込んで標識試薬とする場合、シリカ粒子から脱離した色素分子はターゲット物質以外のものと非特異的結合を起こしてシグナル／ノイズ比低下の原因となってしまう。さらに、シリカ粒子表面に存在する色素分子がシリカ粒子の表面修飾処理の際に悪影響を及ぼすという問題もあった。
【特許文献１】ＥＰ１０３６７６３Ｂ１公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させる積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から前記機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有する積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造される積層構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的物質の高感度定量分析が可能な標識試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程、
【０００６】
（２） 前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含んでなることを特徴とする（１）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程、
（３） 前記工程（ｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする（１）又は（２）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（４） 前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（５） 前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子、
【０００７】
（６） 最も外側の前記シリカの層が、前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることを特徴とする（５）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（７） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（８） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、及び
（９） 前記（５）〜（８）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が、１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、機能性分子の前記シリカ粒子への取り込み効率を向上させることができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を形成できる。
【０００９】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子を高濃度に含有させられ、高感度の標識試薬として用いることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有するので、高いアルカリ溶液耐性を持つ。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的物質の高感度定量分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
まず、本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含むことが好ましい。
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換処理し上記調製されたシリカ粒子を再分散させた後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、シリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程。
【００１２】
本発明において、溶媒置換とは、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有する前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で置換することをいい、詳しくはエタノール洗浄、水洗浄等の洗浄操作、減圧蒸留等を行わないこととする。
具体的な溶媒置換処理操作としては、前記工程（ａ）又は工程（ｂ）の終了後、得られた反応液を２００×ｇ〜２，０００×ｇを５〜２０分の弱い遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法や、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行った後、前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法等が挙げられる。
【００１３】
前記工程（ｃ）において、形成されるシリカのシェル層は、前記機能性分子を含有しないことが好ましい。
前記工程（ｃ）において、上記溶媒置換によっても粒子表面等に残存する前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に含有させてもよく、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されてもよく、１５質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されることが好ましい。
前記工程（ｃ）により、本発明の製造方法により調製されるシリカナノ粒子にアルカリ溶液に対する高い耐性を付与することができる。
【００１４】
本発明の製造方法において前記工程（ｂ）を、２回以上繰り返すことにより、得られるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量をさらに増大させることが好ましい。ただし前記工程（ｂ）を何度も繰り返すのは煩雑であり、またそれによって合成されるシリカ粒子の粒度分布が広くなるという弊害もあることから、前記工程（ｂ）の繰り返し回数をいくらでも多くすればよいというわけではない。実際には、前記コアとなる前記シリカ粒子の表面上に１〜６層の前記機能性分子を含有するシリカの層を形成するために、前記工程（ｂ）を１〜６回行うことが好ましい。
本発明に用いる前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
【００１５】
ここで、前記機能性分子の具体例としては、蛍光色素分子（例えば、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、フルオレセイン）、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、ｐＨ感受性色素分子等が挙げられる。
前記活性基を有する前記機能性分子の好ましい具体例として、下記式でそれぞれ表される５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】
前記活性基を有する前記オルガノアルコキシシランは、商業的に市販のものを入手することも可能である。
前記反応性基を有するオルガノアルコキシシランの具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン等のメルカプト基を有するオルガノアルコキシシラン等を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。メルカプト基を有するオルガノアルコキシシランを用いる場合は、マレイミド基を持つ機能性分子と結合させることができる。
【００１８】
前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
その場合反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの割合は、モル換算で等量であることが好ましい。ＮＨＳエステル基を有する機能性分子は一般に高価なためできるだけ無駄を少なくしたいが、アミノ基を有するオルガノアルコキシシランの割合が高いと未反応のアミノ基を持つオルガノアルコキシシランがシリカ粒子に取り込まれることになり、シリカ粒子が純水中で凝集傾向を持ってしまうことがある。
【００１９】
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。
【００２０】
前記テトラアルコキシシランのアルコキシ基は前記アンモニア水含有溶媒の中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらにそれらが脱水縮合してシロキサン結合を形成する。
一般にシリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を指すが、ここでは前述のようなオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
【００２１】
本発明における前記工程（ａ）について、テトラアルコキシシランとしてＴＥＯＳを用いた場合を下記スキームに例示する。
【００２２】
【化２】
【００２３】
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記テトラアルコキシシランの前記アンモニア水含有溶媒に含有させる量は、高すぎると粒子同士の融合が発生しやすくなり、逆に低すぎても粒度分布が広がる傾向にある。具体的には０．１〜２．０体積％であることが好ましく、０．２〜１．０体積％であることがより好ましい。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の前記アンモニア水含有溶媒中に含有させる量は、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率として、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
この溶解ないしは含有させておく前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の量により、得られる積層構造のシリカナノ粒子中の前記機能性分子の含有量を制御できる。
【００２４】
前記アンモニア水含有溶媒において、水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒に含有させるアンモニア水の濃度は、目的の積層構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
【００２５】
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）によりアンモニアの濃度を調節することで目的の積層構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、高温で合成を行うとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、反応時間を長くするとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
【００２６】
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合、前記工程（ｂ）において、後述するＦＲＥＴによる自己消光を防止するためには１０ｎｍ以上の厚みの色素分子を多く含まないシェル層を形成させることが望ましい。前記テトラアルコキシシランと比べて反応速度の遅い色素結合ＡＰＳをシリカ粒子に取り込む場合、前記コアとなるシリカ粒子の表面近傍に色素分子が偏在することになり、ここで前記工程（ｂ）を施すとさらに含有された前記テトラアルコキシシランが色素を多く含まない前記シリカの層を形成することになる。さらに時間をかけると新たに形成された層の表面近傍にも色素が多く取り込まれることになるが、前記コアの表面に偏在する色素からは１０ｎｍ以上隔たれていることになり、ＦＲＥＴによる自己消光を効果的に防止することができる。
【００２７】
１０ｎｍ以上の層を形成させるために前記アンモニア水含有溶媒にさらに含有させる前記テトラアルコキシシランの量は、その時点で形成されているシリカ粒子の粒径によって異なる。例えば平均粒径３０ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して１００〜１２０質量部が好ましく、平均粒径１００ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して３０〜３６質量部が好ましい。
前記工程（ｂ）における前記シリカ層の形成温度条件としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
【００２８】
実施例の項において図３を参照して後述するように、前記工程（ｃ）の前に、前記工程（ａ）又は（ｂ）で調製された反応液についてシリカ粒子の洗浄又は精製を行うとアンモニア水含有溶媒中で粒子同士の凝集傾向が生じてしまい、前記工程（ｃ）のシェル形成反応により前記シリカ粒子同士の不可逆的な融合が生じてしまう。
前記工程（ｃ）における前記シリカシェルの形成反応の温度条件としては特に制限はないが、除去しきれずに残留する機能性分子の取り込みを極力抑えたい場合には前記工程（ａ）や（ｂ）の場合とは逆に低い温度、すなわち０〜２０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、上記のような事情の場合には短時間、すなわち１〜３時間にとどめることが好ましい。
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長径と短径の比が１．２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収する手法がある。
【００２９】
次に、本発明の積層構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記工程（ａ）により得られた前記機能性分子含有シリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を１層又は２層以上のシリカの層がシロキサン結合により包囲してなる積層構造のシリカナノ粒子であることを特徴とする。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層数としては、１〜６層であることが好ましい。
前述のように、前記工程（ａ）により得られたコアとなる前記シリカ粒子を調製する場合、テトラアルコキシシランの方が前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物よりも反応速度が速い。そのため、合成初期にはテトラアルコキシシランが反応して形成されるシリカに含有される前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が低く、逆に合成後期には前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が高くなる。結果として、前記コアとなる前記シリカ粒子の内部においては、前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。前記工程（ｂ）により前記シリカの層を形成する場合においても同様に、前記シリカの層の外側に前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が高濃度に偏在することになる。
【００３０】
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合であって、前記工程（ｂ）でシリカの層を２層以上形成する場合、あるシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分と、それに隣接するシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分との距離が近すぎるとＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー遷移）が生じ、前記蛍光色素分子成分間で自己消光を起こして蛍光強度が低下してしまう（例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂ ７３，２４５３０２（２００６）参照。）。
そこで、本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層の厚みは、前記ＦＲＥＴによる自己消光を防止する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シリカの層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには前記ＦＲＥＴによる自己消光が抑制される範囲で前記シリカの層を極力薄くすることが好ましい。
【００３１】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子に、前述のようにアルカリ溶液耐性を付与する観点から、最も外側のシリカの層が、前記工程（ｃ）により形成された前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることが好ましい。
ただし、前記機能性分子を含有しない純粋なシリカのシェル層でもゆっくりではあるがアルカリ溶液によって溶かされていく。そのため、前記シェル層が厚いほど長時間、もしくは強いアルカリ溶液に耐えることができる。最も外側の前記機能性分子を含有しないシェル層の厚みは、前述のアルカリ溶液耐性を付与する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シェル層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには必要なアルカリ溶液耐性が得られる範囲で前記シェル層を極力薄くすることが好ましい。
【００３２】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の長径と短径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
【００３３】
また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ１５％以下の粒子群をいう。
前述の通り、例えばＡＰＳなどのオルガノアルコキシシランと結合させてテトラアルコキシシランと共に反応させることで、前記機能性分子をシリカ粒子に取り込むことができる。ただしその取り込み効率は結合させる機能性分子の種類によって異なり、例えば蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン色素をＡＰＳと結合させたオルガノアルコキシシラン化合物は取り込み効率が低い。取り込み効率の低い機能性物質をシリカ粒子に十分取り込ませるためには合成の際に多くのオルガノアルコキシシラン化合物を投入する必要があり、その場合投入した大部分のオルガノアルコキシシラン化合物が取り込まれずに廃棄されることになるため、コスト増大の要因となる。
【００３４】
これに対して、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことにより、前記機能性分子を高い効率で取り込むことができる。前記機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率の低さは、その反応速度の遅さに起因している。反応速度の遅いオルガノアルコキシシラン化合物はテトラアルコキシシランによってシリカ粒子が合成された後で粒子表面に徐々に結合していくが、その密度が高くなると取り込まれにくくなり、ついにはオルガノアルコキシシラン化合物の取り込まれる量と脱離する量が同じになって平衡状態に達し、オルガノアルコキシシラン化合物はそれ以上取り込まれなくなる。この状態で前記工程（ｂ）を施せばシリカ粒子の表面に新たなシリカの層が形成され、その表面にも同様にオルガノアルコキシシラン化合物が高密度に結合することで、一粒子あたりのオルガノアルコキシシラン化合物の結合量を増大させることができる。
一般的には前記機能性分子の取り込み量は多いほど好ましいが、蛍光色素に関しては濃度消光による蛍光強度の低下があるため最適な取り込み量が存在する。その量は１ｍｌあたり３×１０１７分子程度であり、これは粒径１００ｎｍのシリカ粒子に換算すると約１３，０００分子に相当する。本発明の積層構造のシリカナノ粒子では、シリカ粒子への取り込み効率の低いカルボキシフルオレセイン色素分子でも少ない投入量でこのシリカ粒子内密度を達成することができる。
【００３５】
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明の積層構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記積層構造のシリカナノ粒子が、前記機能性分子として蛍光色素分子もしくは吸光色素分子を含有する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記積層構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
【００３６】
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
【００３７】
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記積層構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
【００３８】
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明の積層構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記積層構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明の積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【００４０】
【化３】
【００４１】
撹拌１時間ほどでシリカコロイドの生成はほぼ完了したが、蛍光強度を測定すると極めて弱く、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが粒子に取り込まれるにはなお２〜３時間を要した。
蛍光強度の測定の結果から、反応開始から４〜５時間経過すると前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの取り込み速度が減少してきた。ここまでの操作を工程（ａ）とする。
前記工程（ａ）により得られたシェル層無しのシリカナノ粒子の蛍光強度を後述する図１において対照とした。
なお、前記シリカ粒子の蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、４９０ｎｍの励起光における５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００４２】
２．工程（ｂ）
工程（ａ）で得られたシリカ粒子に、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳを取り込む余地の豊富なシリカを提供するため、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。
ＴＥＯＳの追加投入量は、工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
さらに、この工程（ｂ）のシェル形成操作を繰り返して積層構造とした粒子も調製した。すなわち、この工程（ｂ）をさらに１回繰り返して２層のシェル層を有するシリカナノ粒子、この工程（ｂ）をさらに２回繰り返して３層のシェル層を有するシリカナノ粒子を、それぞれ、調製した。２回目以降のＴＥＯＳの追加投入量も工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
上記得られた各シリカナノ粒子を、それぞれ、洗浄し、平均粒径及び蛍光強度を測定した。
具体的な洗浄操作としては、反応終了後、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。
【００４３】
３．平均粒径測定
上記得られた各シリカナノ粒子の平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として算出した。
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子の平均粒径は、変動係数９．０％の粒度分布で平均粒径１９０ｎｍであった。
前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層を有するシリカナノ粒子の平均粒径は、それぞれ、シェル層分だけ平均粒径が増加し、１９８ｎｍ（変動係数８．６％）、２０４ｎｍ（変動係数７．８％）、２０９ｎｍ（変動係数６．１％）であった。
４．蛍光強度測定
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子、前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層有するシリカナノ粒子、それぞれの蛍光強度を前述と同様な装置、測定条件で測定した。図１に得られた結果を示す。
【００４４】
図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層をそれぞれ形成してなるシリカナノ粒子の蛍光強度を示す図である。
図１において、一定量である工程（ａ）において添加したカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの添加量で規格化（ノーマライズ）したシリカナノ粒子の蛍光強度（前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ添加量当りの蛍光強度）、及び測定対象となったシリカコロイドの質量濃度で規格化した蛍光強度（シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度）の２通りで示した。いずれも単位はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
【００４５】
図１から明らかなように、シリカナノ粒子の層数を１層、２層、３層と増加するごとに前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ投入量当りのシリカナノ粒子の蛍光強度は直線的に増加している。これにより、前記工程（ｂ）を行うごとに、アンモニア水含有溶媒に残存するカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが取り込まれていることがわかる。
一方、シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度については、シェルを１層形成することでシェル無しの対照の場合より１３％増大し、シェルを２層形成するとシェル無しの対照の場合より４３％増大した。しかしシェルを３層形成すると、その増大量は２９％に低下した。これは、シェルを形成することによってシリカナノ粒子の質量が増大し、その結果蛍光強度の増大率がシリカコロイドの質量濃度の増大率を下回ったからである。このことから、２層のシェルを形成することが最も機能性分子の取り込み効率が高い結果となった。
しかし、シェル形成のために追加するＴＥＯＳの量を適宜減じることにより、シリカナノ粒子の質量の増加率を抑えられるため、上記結果よりもさらにシリカコロイドの質量濃度当りの蛍光強度、すなわち機能性分子の取り込み効率を高めることができる。
【００４６】
実施例２（本発明の積層構造の吸光型シリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【００４７】
【化４】
【００４８】
室温下、撹拌３時間ほどでシリカ粒子のコロイドが生成したが、この場合前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの投入量が多いため、シリカ粒子内部に取り込まれずに溶液中に残留する前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの比率が高かった。
溶液中の遊離色素による蛍光強度の測定の結果から、反応開始から７〜８時間経過すると前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの取り込み速度が減少し、反応終了とした。得られた粒子は、カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に偏在していた。
【００４９】
２．工程（ｂ）
実施例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を実施例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
【００５０】
実施例３（本発明の機能性分子脱離防止用シェル層を有するシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ｃ）
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、工程（ｂ）を行うことなく、アルカリ水溶液耐性を付与するための前記ＴＡＭＲＡを含有しないシェル層を形成するため、以下の工程（ｃ）に供した。
工程（ａ）終了後、得られたシリカ粒子を前記洗浄操作に供することなく、前記ＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳを含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で溶媒置換処理を行った。具体的には、１，０００×ｇ、１０分の条件で遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去後、得られた沈殿物を２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈して得た新たなアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに再分散させ溶媒置換した。
【００５１】
次に、工程（ａ）における投入量と等量のＴＥＯＳを投入し室温２時間反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素をほとんど含有しない１層のシリカのシェル層を有するシリカナノ粒子を得た（収量１７０ｍｇ分；コロイド乾燥重量、収率６３％）。得られたシリカ粒子を実施例３のシリカナノ粒子とする。
図３に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図１中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られた積層構造のシリカナノ粒子である。粒子同士が融合するような不具合が生じていないことがわかる。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２００個以上）の直径を測定し、その粒度分布を算出したところ、変動係数１４．７％で平均粒径８８ｎｍであった。
【００５２】
２．比較試験
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、アルカリ水溶液耐性を付与するシェル層を形成するための前記工程（ｃ）に供する前に、実施例１と同様な洗浄操作を行った後、工程（ｃ）を行うことを試みた。
工程（ａ）終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行ったシリカ粒子を再度シリカ粒子合成液に分散させて新たにＴＥＯＳを投入したところ、反応に供したシリカ粒子同士が融合してしまった。
図４に得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図４中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える物質が、得られたシリカ粒子である。図４から明らかなように、粒子の多くがいびつな形状をしており、反応に供したシリカ粒子同士の融合が頻繁に発生したことがわかる。
【００５３】
３．アンモニア水溶液によるエッチング試験
前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子を、それぞれ、２．８質量％のアンモニア水溶液中に分散させ、アンモニア水溶液によるエッチング試験を行い、アルカリ水溶液に対する耐性を評価した。
色素の脱離量は、遠心分離によって前記アンモニア水溶液からシリカ粒子を除去した残りの溶媒を回収し、その中に遊離している色素がシリカ粒子から脱離した色素とみなし、その蛍光強度を測定することで、その評価を行った。
【００５４】
図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離カルボキシＴＡＭＲＡ色素による蛍光強度のグラフを示す図である。
図４から明らかなように、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子については、１時間後には、蛍光強度にして４０００ａｕ以上の大量の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子から脱離してしまったことがわかる。２時間後にも同様に約１８０００ａｕの蛍光強度が検出され、大量の脱離が起こっていることがわかる。
【００５５】
一方、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子については、１時間後の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素の脱離量は、蛍光強度にして５００ａｕ未満の僅かな量にとどまったことがわかる。
実施例２のシリカナノ粒子の結果との比較から、実施例３のシリカナノ粒子についてはアルカリ溶液に対して耐性があるといえる。
２時間後についてはアンモニア水溶液中に約１４０００ａｕの蛍光強度が検出されたが、前記シェル層を越えてエッチングが進行したため、工程（ａ）で得られた粒子のコア部分から脱離したといえる。
【００５６】
実施例４
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
【００５７】
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層を形成してなるシリカナノ粒子それぞれの蛍光強度を示す図である。
【図２】図２は、実施例３で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図３】図３は、比較試験で得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離色素の蛍光強度のグラフを示す図である。
【図５】図５は、実施例４の分子認識試験に用いたストリップの平面図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記機能性分子含有シリカ粒子の表面上に形成する工程。
【請求項３】
前記工程（ｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１又は２に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項６】
最も外側の前記シリカの層が、前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることを特徴とする請求項５に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項７】
平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項５又は６に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項８】
平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする請求項５又は６に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬。
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記機能性分子含有シリカ粒子の表面上に形成する工程。
【請求項３】
前記工程（ｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１又は２に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項６】
最も外側の前記シリカの層が、前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることを特徴とする請求項５に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項７】
平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項５又は６に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項８】
平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする請求項５又は６に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬。
【図１】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２２１０５９（Ｐ２００９−２２１０５９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６８５９４（Ｐ２００８−６８５９４）
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
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