筋肉由来前駆体組成物を利用する骨の増大およびその処理
本発明は、体組織の中への移植の後で長期生存を示し、非軟部組織（たとえば骨）の部位の中への（たとえば注射、移植、または移入を介する）導入の後で非軟部組織を増大させることができる筋肉由来前駆細胞を提供する。筋肉由来前駆細胞を単離する方法、および遺伝子移入療法のための細胞を遺伝子改変する方法もまた提供される。本発明は、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む、様々な機能的状態の治療において、ヒトを含む哺乳動物の骨組織の増大および増量のために、筋肉由来前駆細胞を含む組成物を使用する方法をさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権益
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成番号ＤＫ０５５３８７下の政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）、およびＭＤＣの組成物、および体組織、特に骨の増大におけるその使用に関する。特に、本発明は、骨の中への導入の後で長期生存を示す筋肉由来前駆細胞、ＭＤＣを単離する方法、およびヒトまたは動物の骨の増大のためにＭＤＣ含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少などの美容的または機能的状態の治療のための筋肉由来前駆細胞の新規な使用に関する。本発明はまた、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のための、ＭＤＣの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
筋芽細胞という筋繊維の前駆体は、融合して有糸分裂後多核筋管を形成する単核筋細胞であり、これらは、生理活性タンパク質の長期発現および送達をもたらすことができる（Ｔ．Ａ．ＰａｒｔｒｉｄｇｅおよびＫ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ、１９９５年、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１：１２３ １３７頁；Ｊ．Ｄｈａｗａｎら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： １５０９ １２頁；Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、１９９４年、Ｍｙｏｌｏｇｙ Ｅｄ ２、Ａ．Ｇ．ＥｎｇｅｌおよびＣ．Ｆ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．、３０３ ３０４頁；Ｓ．ＪｉａｏおよびＪ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ、１９９２年、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７５：１４３ ７頁；Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ、１９９６年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２１９５ ２２００頁）。
【０００４】
培養筋芽細胞は、幹細胞の自己再生特性のうちのいくつかを示す細胞の亜集団を含有する（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、１９９６年、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０：４７ ５７頁）。そのような細胞は、別々に培養されない限り、融合して筋管を形成せず、分裂しない（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、前掲）。筋芽細胞移植の研究（下記を参照されたい）は、大多数の移植細胞が、速く死滅するが、少数は、生存し、新しい筋肉形成を媒介することを示した（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、１９９９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４４：１１１３ １１２２頁）。この少数の細胞は、組織培養における低増殖および移植の後での急増殖を含む特有な挙動を示し、これらの細胞が、筋芽幹細胞に相当する可能性があることを示唆する（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、前掲）。
【０００５】
筋芽細胞は、様々な筋肉関連障害および非筋肉関連障害の治療における遺伝子療法のために媒体として使用されてきた。たとえば、遺伝子改変筋芽細胞または非遺伝子改変筋芽細胞の移植は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のために使用されてきた（Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ， ３５６：４３５ ８頁；Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９２年、Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ， １５：５５０ ６０頁；Ｇ．Ｋａｒｐａｔｉら、１９９３年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．， ３４：８ １７頁；Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙら、１９９３年、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２：９９ １１２頁；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：９４ ９頁；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３４０ ４６頁）。さらに、筋芽細胞は、１型糖尿病の治療のためのプロインスリン（Ｌ．Ｇｒｏｓら、１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：１２０７ １７頁）；血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子（Ｍ．Ｒｏｍａｎら、１９９２年、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２４７ ５８頁；Ｓ．Ｎ．Ｙａｏら、１９９４年、Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ， １：９９ １０７頁；Ｊ．Ｍ．Ｗａｎｇら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ ９０：１０７５ ８２頁；Ｇ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏら、１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１２８１ ８頁）；アデノシンデアミナーゼ欠損症候群の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（Ｃ．Ｍ．Ｌｙｎｃｈら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８９：１１３８ ４２頁）；慢性貧血の治療のためのエリスロポエチン（Ｅ．Ｒｅｇｕｌｉｅｒら、１９９８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１０１４ ２２頁；Ｂ．Ｄａｌｌｅら、１９９９年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１５７ ６１頁）、および成長遅延の治療のためのヒト成長ホルモン（Ｋ．Ａｎｗｅｒら、１９９８年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：６５９ ７０頁）を産生するように遺伝子操作されてきた。
【０００６】
筋芽細胞はまた、Ｌａｗらに対する特許文献１、Ｂｌａｕらに対する特許文献２、およびＣｈａｎｃｅｌｌｏｒらによって１９９９年４月３０日に提出された米国特許出願第０９／３０２，８９６号において開示されるように、筋組織損傷または筋組織疾患を治療するためにも使用されてきた。さらに、筋芽細胞移植は、心筋機能不全の回復のために用いられてきた（Ｃ．Ｅ．Ｍｕｒｒｙら、１９９６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ， ９８：２５１２ ２３頁；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９年、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４ １２９頁；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９年、Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８；１１７３ ８０頁）。
【０００７】
上記にもかかわらず、ほとんどの場合において、最初の筋芽細胞由来の治療は、移動および／または食作用による、移植の後での、細胞の低生存率と関連してきた。この問題を回避するために、Ａｔａｌａに対する特許文献３は、アルギン酸などの液状ポリマー中に懸濁された筋芽細胞の使用を開示する。このポリマー溶液は、注射の後に筋芽細胞が移動するおよび／または食作用を受けるのを予防するためのマトリックスとして作用する。しかしながら、このポリマー溶液は、上記に論じられるバイオポリマーと同じ問題を起こす。さらに、Ａｔａｌａ特許は、筋組織のみにおける筋芽細胞の使用に限定され、他の組織における使用はない。
【０００８】
したがって、持続性であり、広範囲の宿主組織と適合し、移入部位を取り囲む組織の最小限の炎症、瘢痕、および／または硬化しか引き起こさない、他の、異なる組織増大材料の必要性がある。したがって、本発明の筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）含有組成物は、骨を増大させるための、改善された、新規な材料として提供される。移植の後で長期生存を示す筋肉由来前駆細胞組成物を産生する方法ならびにたとえば、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む、様々な美的および／または機能的異常を治療するために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を利用する方法がさらに提供される。平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法もまた提供される。
【０００９】
筋芽細胞を非筋組織増大のために使用するための先の試みが成功しなかったことは、注目に値する（Ａｔａｌａに対する特許文献３）。そのため、本明細書において開示される発見は、本発明による筋肉由来前駆細胞が、骨組織を含む非筋組織の中へうまく移植され、長期生存を示すことができることを示すので、予想外である。その結果として、ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、骨産生のための一般的な増大材料として使用することができる。そのうえ、本発明の筋肉由来前駆細胞および組成物は、自己の供給源に由来することができるので、それらは、増大材料の再吸収ならびに移入部位を取り囲む組織の炎症および／または瘢痕を含む、宿主における免疫学的合併症の危険性の低下をもたらす。
【００１０】
間葉系幹細胞は、筋肉、骨、軟骨などを含む体の様々な結合組織において見つけることができるが（Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９３年、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９Ａ：７２３ ７３６頁；Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ，ら、１９９５年、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２０２：１３７ １４４頁）、間葉系といった用語は、筋肉からではなく、骨髄から精製された幹細胞の種類に言及するように歴史的に使用されてきた。したがって、間葉系幹細胞は、本発明の筋肉由来前駆細胞と区別される。そのうえ、間葉系細胞は、ＣＤ３４細胞マーカーを発現せず（Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３ １４７頁）、これは、本明細書において記載される筋肉由来前駆細胞によって発現される。
【００１１】
知られている組成物および方法と関連する不利益および問題の本明細書における記載は、本明細書に記載される実施形態の範囲をそれらの排除まで限定するようには決して意図されず、実際に、ある種の実施形態は、そのように注目される不利益または問題を被ることなく、１つまたは複数の知られている組成物、化合物、または方法を含んでいてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，１３０，１４１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，７２２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６６７，７７８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、移植の後で長期生存を示す新規な筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することを目的とする。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、初期前駆筋細胞、つまりデスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する筋肉由来幹細胞を含む。さらに、これらの初期前駆筋細胞は、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔの細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００１４】
本発明は、出発筋細胞集団から筋肉由来前駆細胞を単離し、かつ濃縮する方法を提供することを他の目的とする。これらの方法は、軟部組織の部位の中への移植または導入の後に長期生存性を有するＭＤＣの濃縮をもたらす。本発明によるＭＤＣ集団は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する細胞で特に濃縮される。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔの細胞マーカーをも発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００１５】
本発明は、移植のためのポリマー担体または特殊な培地を必要とすることなく、骨を含む非筋組織の増大のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を使用する方法を提供することを他の目的とする。そのような方法は、骨の中への導入による、たとえば、組織の中へのもしくはその表面上への直接的な注射によるまたは組成物の全身性の分布によるＭＤＣ組成物の投与を含む。
【００１６】
本発明は、裂隙、開口部、くぼみ、創傷などをもたらす傷害、負傷、外科手術、外傷、非外傷、または他の手術の後で、骨を増大させる方法を提供することを他の目的とする。
【００１７】
本発明は、化学物質、増殖培地、および／または遺伝子操作の使用を通して改変されるＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することをさらなる目的とする。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の産生および送達ならびに様々な疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的改変細胞または遺伝子改変細胞を含む。
【００１８】
本発明は、化学物質、増殖培地、および／または遺伝子操作の使用を通して改変されるＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することをさらなる目的とする。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の産生および送達ならびに様々な疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的改変細胞または遺伝子改変細胞を含む。
【００１９】
ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を含む医薬組成物を提供することを本発明の他の実施形態とする。これらの医薬組成物は、単離ＭＤＣを含む。これらのＭＤＣは、次に、単離の後に細胞培養によって増やしてもよい。本実施形態の一態様において、これらのＭＤＣは、医薬組成物を必要とする対象への送達に先立って凍結される。
【００２０】
本発明はまた、組成物および単一平板培養技術を使用するＭＤＣの単離を含む方法をも提供する。ＭＤＣは、骨格筋の生検材料から単離される。一実施形態において、生検材料からの骨格筋は、１〜６日間、保存してもよい。本実施形態の一態様において、生検材料からの骨格筋は、４℃で保存する。細胞を切り刻み、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、他の酵素、または酵素の組み合わせを使用して消化する。細胞から酵素を洗い流した後に、細胞は、約３０から約１２０分間、培地中で、フラスコ中で培養する。この期間の間に、「速やかに接着する細胞」は、フラスコまたは容器の壁に固着するが、「徐々に接着する細胞」またはＭＤＣは、浮遊したままである。「徐々に接着する細胞」は、第２のフラスコまたは容器に移し、１〜３日の期間の間、そこで培養する。この第２の期間の間に、「徐々に接着する細胞」またはＭＤＣは、第２のフラスコまたは容器の壁に固着する。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、これらのＭＤＣは、任意の数の細胞まで増やされる。本実施形態の好ましい態様において、細胞は、約１０から２０日の間、新しい培地中で増やされる。より好ましくは、細胞は、１７日間増やされる。
【００２２】
ＭＤＣは、増やされるまたは増やされないにかかわらず、輸送するために貯蔵してもよく、または使用の前の期間、保存してもよい。一実施形態において、ＭＤＣは、凍結される。好ましくは、ＭＤＣは、約−２０から−９０℃の間で、凍結される。より好ましくは、ＭＤＣは、約−８０℃で凍結される。これらの凍結されたＭＤＣは、医薬組成物として使用される。
【００２３】
ＭＤＣは、医薬組成物として凍結されるもしくは貯蔵されるまたは新鮮な状態で使用されるにかかわらず、多くの骨変性疾患、骨変性異常、および骨変性病態を治療するために使用してもよい。これらの状態は、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む。ＭＤＣはまた、医薬組成物として凍結されるもしくは貯蔵されるまたは新鮮な状態で使用されるにかかわらず、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のために使用してもよい。
【００２４】
さらに、本発明は、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、もしくは病態を治療し、または骨量もしくは骨密度を増大させる方法を提供する。その方法は、哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、１０℃よりも低い温度まで細胞を冷却し、細胞を１〜７日間保存するステップと、３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、培地中の残存細胞を、第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップ、第２の細胞培養容器の壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、細胞を培養してその数を拡大するステップと、−３０℃未満の温度までＭＤＣを凍結するステップと、ＭＤＣを解凍し、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において、骨の異常、骨疾患、または骨病態を治療する。
【００２５】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法をも提供する。その方法は、哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、培地中の残存細胞を、第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、第２の細胞培養容器の壁から、ＭＤＣである細胞を単離するステップと、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する。
【００２６】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において、骨の異常、疾患、もしくは病態を治療し、または骨の疾患、異常、もしくは病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法をも提供する。その方法は、骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、ヒト骨格筋組織の骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、１５〜２０％の細胞が第１の容器に接着した後に行う第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、（ｄ）骨格筋由来ＭＤＣを単離し、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において尿路疾患を治療する。
【００２７】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において骨の異常、疾患、または病態を治療する方法をも提供する。その方法は、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を投与するステップを含む。ＭＤＣを含有する細胞集団は、第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地および第２の細胞集団を移すステップと、第２の細胞集団の細胞を第２の細胞培養容器に付着させるステップと、第２の細胞培養容器に付着した細胞を単離して、ＭＤＣを含有する前記細胞集団を得るステップとを含む工程によって得られる。
【００２８】
本発明によって与えられる、さらなる目的および利点は、下記の詳細な説明および例示から明らかとなる。
【００２９】
特許書類または特許出願書類は、カラーで仕上げられた少なくとも１枚の写真の複写を含む。カラーの写真の（１枚または複数枚の）複写を有するこの特許または特許出願のコピーは、申請および必要な料金の支払いに際して、米国特許商標庁によって規定されるであろう。
【００３０】
添付される図面の図は、本発明をさらに説明するためにおよびその様々な態様の説明を通してその理解を助けるために提示される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｉは、マウス筋細胞およびマウス血管内皮細胞中での、デスミン染色とのＣＤ３４染色またはＢｃｌ−２染色の細胞内共存を示す図である。図１Ａは、抗ＣＤ３４抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）および血管内皮細胞（矢じりを参照されたい）を示す。図１Ｂは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｃは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）を示す。図１Ｆは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｇは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体を用いて染色された衛星細胞を示す（矢印を参照されたい）。細胞は、４０×倍率で観察された。図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤ３４およびデスミンの共存を実証するが、図１Ｅ〜１Ｈは、Ｂｃｌ−２およびデスミンの共存を実証する。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｉは、マウス筋細胞およびマウス血管内皮細胞中での、デスミン染色とのＣＤ３４染色またはＢｃｌ−２染色の細胞内共存を示す図である。図１Ａは、抗ＣＤ３４抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）および血管内皮細胞（矢じりを参照されたい）を示す。図１Ｂは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｃは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）を示す。図１Ｆは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｇは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体を用いて染色された衛星細胞を示す（矢印を参照されたい）。細胞は、４０×倍率で観察された。図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤ３４およびデスミンの共存を実証するが、図１Ｅ〜１Ｈは、Ｂｃｌ−２およびデスミンの共存を実証する。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２へのｍｃ１３細胞の曝露に起因する、形態学的変化およびオステオカルシンの発現を示す図である。ｍｃ１３細胞は、６日間、ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中でインキュベートされた。図２Ａは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下において＞５０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｂは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下において＞５０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下において＞９０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下において＞９０％の培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｅは、オステオカルシン発現（骨芽細胞細胞マーカー；矢印を参照されたい）について染色された細胞を示す。細胞は、１０×倍率で観察された。図２Ａ〜２Ｅは、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２への曝露に際して骨芽細胞に分化することができることを実証する。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応じてデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の百分率に対する効果を示す図である。図３Ａは、新しく単離されたｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図３Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡観察を示す。図３Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ｍｃ１３細胞中のデスミン染色のレベルを示す。図３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ＰＰ１ ４細胞およびｍｃ１３細胞のアルカリリン酸染色のレベルを示す。＊は、統計的に有意な結果を示す（スチューデントのｔ検定）。図３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを実証するが、図３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを実証し、ｒｈＢＭＰ−２の存在下において、細胞の筋原性の特徴を減少させ、骨原性の特徴を増加させることを示唆する。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応じてデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の百分率に対する効果を示す図である。図３Ａは、新しく単離されたｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図３Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡観察を示す。図３Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ｍｃ１３細胞中のデスミン染色のレベルを示す。図３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ＰＰ１ ４細胞およびｍｃ１３細胞のアルカリリン酸染色のレベルを示す。＊は、統計的に有意な結果を示す（スチューデントのｔ検定）。図３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを実証するが、図３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを実証し、ｒｈＢＭＰ−２の存在下において、細胞の筋原性の特徴を減少させ、骨原性の特徴を増加させることを示唆する。
【図４】図４Ａ〜４Ｇは、筋原性系統および骨原性系統へのｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化を示す図である。ｍｃ１３細胞は、ＬａｃＺおよびジストロフィン遺伝子を含有する構築物を用いて安定して形質移入され、筋肉内注射または静脈内注射によってｍｄｘマウスの後肢に導入された。１５日後に、動物は、屠殺し、後肢筋系は、組織学的検査のために切り離された。図４Ａは、ＬａｃＺについて染色された筋肉内注射部位のｍｃ１３細胞を示す。図４Ｂは、ジストロフィンについて共染色された同じ細胞を示す。図４Ｃは、ＬａｃＺについて染色された静脈内注射の領域におけるｍｃ１３細胞を示す。図４Ｄは、ジストロフィンについて共染色された同じ細胞を示す。個別の実験において、ｍｃ１３細胞は、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入され、０．５ １．０×１０６細胞は、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射された。１４日後に、動物は屠殺し、後肢筋組織は、分析された。図４Ｅは、骨形成を決定するための、後肢の放射線分析を示す。図４Ｆは、ＬａｃＺについて染色された後肢に由来する細胞を示す。図４Ｇは、ジストロフィンについて染色された細胞を示す。図４Ａ〜４Ｄは、ｍｃ１３細胞が、筋肉内送達または静脈内送達を介してジストロフィン発現を取り戻すことができることを実証する。図４Ａ〜４Ｇは、ｍｃ１３細胞が、異所性骨形成に関連することを実証する。細胞は、以下の倍率で観察された：４０×（図４Ａ〜４Ｄ）；１０×（図４Ａ〜４Ｇ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２産生初代筋細胞による骨治癒の増強を示す図である。５ｍｍの頭蓋異常は、歯科用バーを使用して、雌ＳＣＩＤマウスにおいて作り出され、異常部は、ａｄＢＭＰ−２を有するまたは有していないｍｃ１３細胞が接種されたコラーゲンスポンジを用いて埋められた。動物は、１４日目に屠殺し、視察され、骨治癒の徴候について顕微鏡で分析された。図５Ａは、ａｄＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋を示す。図５Ｂは、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋を示す。図５Ｃは、フォン コッサ染色によって分析された、ａｄＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ｄは、フォン コッサ染色によって分析された、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ｅは、注射された細胞（矢印によって示される緑色蛍光）を同定するためにＹ染色体特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって分析され、核（赤色蛍光によって示される）を同定するために臭化エチジウムを用いて染色された、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ａ〜５Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を発現するｍｃ１３細胞が、骨異常の治癒に寄与し得ることを実証する。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＯＳＭ中の、ヒト男性ＭＤＣおよびヒト女性ＭＤＣを含む骨原性ペレット中で長い間にわたって増加する骨容量（図６Ａ）および骨密度（図６Ｂ）を示す棒グラフである。７日目に対して＊Ｐ＜０．０５、１４日目に対して＃Ｐ＜０．０５、および２１日目に対して＋Ｐ＜０．０５。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＯＳＭ中でペレットとして培養されたｈＭＤＣのオステオカルシン（Ｏｃｎ）（図７Ａ）およびコラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）（図７Ｂ）の遺伝子発現を示す棒グラフである。０日目に対して＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ヒトＭＤＣならびに損傷した骨を回復させるためにまたは骨容量および／もしくは骨密度を野生型レベル以上まで増加させるために、骨組織を生成するようにそのような細胞を使用する方法を提供する。本発明は、失調症、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む骨障害を治療する方法をさらに提供する。成人組織からのヒト筋肉由来細胞（ＭＤＣ）の単離により、これらの細胞を投与されたヒト対象内の骨密度および骨容量の増加を達成することができる。
【００３３】
筋肉由来細胞および組成物
本発明は、体組織、好ましくは骨への移植の後で長期生存率を示す初期前駆細胞（本明細書において、筋肉由来前駆細胞または筋肉由来幹細胞とも称される）からなるＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るために、筋肉外植片、好ましくは骨格筋は、動物ドナーから、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物から得られる。この外植片は、筋肉前駆体細胞の「遺残」を含む、構造的および機能的シンシチウムとして役割を果たす（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ ７３：３０６ ８頁；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎら、１９７９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：１２９２４頁）。
【００３４】
初代筋組織から単離される細胞は、線維芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、造血前駆細胞、および筋肉由来前駆細胞の混合物を含有する。筋肉由来集団の前駆細胞は、Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号に記載されるものなど、コラーゲンコーティング組織フラスコ上で、初代筋細胞の特異な接着性の特徴を使用して濃縮することができる。接着するのが遅い細胞は、形態学的に球形の傾向があり、高レベルのデスミンを発現し、融合し、多核筋管に分化するための能力を有する。Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。これらの細胞の亜集団は、レベルが増加したアルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン依存性３’，５’−ｃＡＭＰ、ならびに骨原性系統および筋原性系統を発現することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、組み換えヒト骨形態形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することが示された（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２７：１７５５ １７６６頁）。
【００３５】
本発明の一実施形態において、前平板培養手順は、徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）から速やかに接着する細胞を識別するために使用してもよい。本発明に従って、速やかに接着するＭＤＣ（ＰＰ１−４）の集団および徐々に接着する、球形のＭＤＣ（ＰＰ６）は、単離され、骨格筋外植片から濃縮し、徐々に接着する細胞の中の多能性細胞の存在を決定するために、免疫組織化学的検査を使用して、様々なマーカーの発現について試験された（実施例１；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許出願第０９／３０２，８９６号）。本明細書における表２および実施例３において示されるように、ＰＰ６細胞は、デスミン、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンを含む筋原性のマーカーを発現した。ＰＰ６細胞はまた、ｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦ、筋形成の初期段階で発現される２つの遺伝子をも発現した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１ ２１９頁；表３を参照されたい）。ＰＰ６は、Ｍ−カドヘリン、衛星細胞特異的マーカーを発現する細胞のより低い百分率を示したが（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １９９：３２６ ３３７頁）、Ｂｃｌ−２、筋形成の初期段階の細胞に限られるマーカーを発現する細胞のより高い百分率を示した（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖら、１９９８年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４２：５３７ ５４４頁）。ＰＰ６細胞はまた、ＣＤ３４、骨髄中のヒト造血前駆細胞およびヒト間質細胞前駆体で同定されるマーカーをも発現した（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８６年、Ｂｌｏｏｄ ６７：８４２ ８４５頁；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎら、１９８４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７ １６５頁；Ｌ．Ｆｉｎａら、１９９０年、Ｂｌｏｏｄ ７５：２４１７ ２４２６頁；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７８：２８４８ ２８５３頁；表３を参照されたい）。ＰＰ６細胞はまた、Ｆｌｋ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近、同定された、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウス相同体をも発現した（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５５３ １５５８頁；表３を参照されたい）。同様に、ＰＰ６細胞は、Ｓｃａ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞中に存在するマーカーを発現した（Ｍ．ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６３４ ８頁；Ｍ．Ｏｓａｗａら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７ １４頁；表３を参照されたい）。しかしながら、ＰＰ６細胞は、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの造血幹細胞マーカーを発現しなかった（Ｌ Ｋ．Ａｓｈｍａｎ、１９９９年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７ ５１頁；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ、１９９３年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：４２０ ４２６頁において考察される；表３を参照されたい）。
【００３６】
本発明の一実施形態において、本明細書において記載される特徴を有する筋肉由来前駆細胞のＰＰ６集団がある。これらの筋肉由来前駆細胞は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２の細胞マーカーを発現する。本発明に従って、ＰＰ６細胞は、移植の後で長期生存性を有する筋肉由来前駆細胞の集団を得るために、本明細書において記載される技術によって単離される（実施例１）。ＰＰ６筋肉由来前駆細胞集団は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する、有意な百分率の細胞を含む。さらに、ＰＰ６細胞は、Ｆｌｋ−１およびＳｃａ−１の細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔのマーカーを発現しない。好ましくは、９５％を超えるＰＰ６細胞は、デスミン、Ｓｃａ−１、およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔのマーカーを発現しない。ＰＰ６細胞は、最後の平板培養の後の約１日または約２４時間以内に利用されることが好ましい。
【００３７】
好ましい実施形態において、速やかに接着する細胞および徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）は、単一平板培養技術を使用して互いに分離される。１つのそのような技術は、実施例２において記載される。第１に、細胞は、骨格筋生検材料から提供される。生検材料は、ただ、約１００ｍｇの細胞を含有する必要がある。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇのサイズの範囲の生検材料は、本発明の前平板培養方法および単一平板培養方法の両方によって使用される。５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００、および５００ｍｇのさらなる生検材料は、本発明の前平板培養方法および単一平板培養方法の両方によって使用される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、生検材料からの組織は、次いで、１〜７日間、保存される。この保存は、約室温〜約４℃の温度で行う。この待機期間は、生検骨格筋組織にストレスを受けさせる。このストレスは、この単一平板技術を使用する、ＭＤＣの単離に必要ではないが、待ち期間の使用は、ＭＤＣのより大きな収量をもたらすように思われる。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、生検材料からの組織は、切り刻み、遠心分離する。ペレットを再懸濁し、消化酵素を使用して消化する。使用してもよい酵素は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはこれらの酵素の組み合わせを含む。消化の後に、酵素は、細胞から洗い流される。細胞は、速やかに接着する細胞の単離のために培地中に、フラスコに移される。多くの培地を使用してもよい。特に好ましい培地は、Ｃａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地を含む、内皮細胞の培養のために設計される培地を含む。この培地は、ウシ胎児血清、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、および／またはアスコルビン酸を含む他の構成成分を補充してもよい。単一平板培養技術において使用してもよい他の培地は、ＩｎＣｅｌｌ Ｍ３１０Ｆ培地を含む。この培地は、上記に記載されるように補充してもよく、または補充せずに使用してもよい。
【００４０】
速やかに接着する細胞の単離のためのステップは、約３０〜約１２０分の期間のフラスコ中での培養を必要とし得る。速やかに接着する細胞は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０分で、フラスコに接着する。それらが接着した後に、徐々に接着する細胞は、速やかに接着する細胞が付着するフラスコから培地を取り出すことによって、速やかに接着する細胞から分離される。
【００４１】
次いで、このフラスコから取り出された培地は、第２のフラスコに移される。細胞は、第２のフラスコに移される前に、遠心分離され、培地中に再懸濁してもよい。細胞は、１から３日の間、この第２のフラスコ中で培養される。好ましくは、細胞は、２日間、培養される。この期間の間に、徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）は、フラスコに接着する。ＭＤＣが接着した後に、培地は、取り出され、新しい培地は、ＭＤＣの数を増やすことができるように、追加される。ＭＤＣの数は、約１０〜約２０日間、それらを培養することによって、増やしてもよい。ＭＤＣの数は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間、それらを培養することによって増やしてもよい。好ましくは、ＭＤＣは、１７日間、増大培養にかけられる。
【００４２】
前平板培養方法および単一平板培養方法の代わりとして、本発明のＭＤＣは、ＭＤＣによって発現される、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって単離することができる（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２ ６５頁；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎら、１９９９年、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２２：４３ ５０頁）。たとえば、ＦＡＣＳ分析は、宿主組織の中に導入された場合に、長期生存性を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するために、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／または本明細書において記載される他の細胞表面マーカーに特異的に結合する標識抗体を使用して実行することができる。異なる細胞マーカータンパク質の抗体検出のための１つまたは複数の蛍光検出ラベル、たとえばフルオレセインまたはローダミンの使用もまた本発明によって包含される。
【００４３】
上記に記載されるＭＤＣ単離方法のいずれかを使用して、輸送されることになっているまたはある期間、使用されない予定であるＭＤＣは、当技術分野において知られている方法を使用して貯蔵してもよい。より具体的に、単離ＭＤＣは、約−２５〜約−９０℃の範囲の温度で凍結してもよい。好ましくは、ＭＤＣは、使用の延期または輸送のためにドライアイス上で約−８０℃で凍結される。凍結は、当技術分野において知られている任意の凍結保存培地を用いて行われてもよい。
【００４４】
筋肉由来細胞ベースの治療
本発明の一実施形態において、ＭＤＣは、骨格筋供給源から単離され、対象とする筋肉もしくは非筋軟部組織部位または骨構造の中に導入または移植される。有利には、本発明のＭＤＣは、単離され、移植の後で長期生存を示す多数の前駆細胞を含有するように濃縮される。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの多くの特徴的な細胞マーカーを発現する。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１の細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない（実施例１を参照されたい）。
【００４５】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、骨の増大を通して、様々な美的または機能的状態（たとえば異常）を回復させる、治療する、または寛解させるために使用することができる。特に、そのような組成物は、骨障害の治療のために使用することができる。ＭＤＣの複数回のおよび連続的な投与もまた本発明によって包含される。
【００４６】
ＭＤＣベースの治療については、骨格筋外植片は、自己または異種性のヒトまたは動物の供給源から好ましくは得られる。自己の動物またはヒトの供給源がより好ましい。次いで、本明細書において記載されるように、ＭＤＣ組成物を調製および単離する。ヒトまたは動物のレシピエントに、本発明によるＭＤＣおよび／またはＭＤＣを含む組成物を導入または移植するために、単核筋細胞の懸濁液を調製する。そのような懸濁液は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤中に、ある濃度の本発明の筋肉由来前駆細胞を含有する。たとえば、対象に投与するためのＭＤＣの懸濁液は、ウシ胎児血清の代わりとして対象の血清を含有するように改変された完全培地の滅菌溶液中に１０８〜１０９細胞／ｍｌを含むことができる。その代わりに、ＭＤＣ懸濁液は、凍結保存溶液などの、血清なしの滅菌溶液中のものとすることができる（Ｃｅｌｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎ．）。次いで、ＭＤＣ懸濁液は、たとえば注射を介して、ドナー組織の１つまたは複数の部位の中に導入することができる。
【００４７】
記載される細胞は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含有する薬学的にまたは生理学的に許容できる調製物または組成物として投与することができ、ヒトおよび非ヒト動物を含む対象とするレシピエント生物の組織に投与することができる。ＭＤＣ含有組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理学的に許容できる注射可能な水性液体などの適している液体または溶液中に細胞を再懸濁することによって調製することができる。そのような組成物中で使用される構成成分の量は、当業者らによってルーチン的に決定することができる。
【００４８】
ＭＤＣまたはその組成物は、吸収性材料または接着性材料、つまりコラーゲンスポンジマトリックス上へのＭＤＣ懸濁液の配合および対象とする部位の中へのまたはその部位上へのＭＤＣ含有材料の挿入によって投与することができる。その代わりに、ＭＤＣは、皮下、静脈内、筋肉内、および胸骨内を含む、注射の非経口経路によって投与することができる。投与の他のモードは、鼻内、鞘内、皮内、腸内、経皮、および舌下を含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、ＭＤＣの投与は、内視鏡手術によって実現することができる。
【００４９】
注射可能な投与については、組成物は、滅菌溶液または懸濁液中のものとし、薬学的におよび生理学的に許容できる水性媒体または油性媒体中に再懸濁することができ、これは、防腐剤、安定剤、および溶液または懸濁液をレシピエントの体液（つまり血液）と等張にするための材料を含有していてもよい。使用に適している賦形剤の非限定的な例は、水、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ水性塩化ナトリウム溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノールなどならびにその混合物を含む。例証となる安定剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらは、単独でまたは混合剤として使用してもよい。使用される量または分量および投与の経路は、個体に基づいて決定され、当業者らに知られている類似したタイプの適用または適応において使用される量に相当する。
【００５０】
移植手術結果を最適化するために、ドナーおよびレシピエントの間の可能な限り近い免疫学的適合が所望される。自己の供給源が入手可能ではない場合、ドナーおよびレシピエントのクラス１およびクラスＩＩ組織適合抗原は、入手可能な最も近い適合を決定するために分析することができる。これは、免疫拒絶を最小限にしまたはなくし、免疫抑制療法または免疫調整療法の必要性を低下させる。必要とされる場合、免疫抑制療法または免疫調整療法は、移植手術手順の前に、その間に、および／またはその後に始めることができる。たとえば、シクロスポリンＡまたは他の免疫抑制剤は、移植手術レシピエントに投与することができる。免疫寛容もまた、当技術分野において知られている代替方法によって、移植に先立って誘発してもよい（Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら、１９８４年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９頁；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７０１頁）。
【００５１】
本発明と一致して、ＭＤＣは、骨を含む体組織に投与することができる。ＭＤＣ懸濁液中の細胞の数および投与のモードは、治療されている部位および状態に依存して変化してもよい。約１．０×１０５〜約１×１０８ ＭＤＣは、本発明に従って投与してもよい。非限定的な例として、本発明に従って、約０．５〜１．０×１０６ ＭＤＣを、約５ｍｍの領域の頭蓋異常の治療のためにコラーゲンスポンジマトリックスを介して投与する（実施例３を参照されたい）。さらなるＭＤＣは、ペレット当たり約１００，０００から５００，０００ ＭＤＣを有するペレットベースの培養系を介して投与してもよい。好ましい実施形態において、それぞれのペレットは、約２５０，０００ ＭＤＣを含有する。任意の数のペレットが患者に投与してもよい。好ましくは、２０ ２から１０のペレットが投与される。本明細書において開示される実施例と一致して、当業者は、それぞれの症例について決定される必要条件、制限、および／または最適化に従って、ＭＤＣベースの治療の量および方法を調整することができる。
【００５２】
骨障害の骨増大または治療のために、ＭＤＣは、上記に記載されるように調製され、骨密度および／または骨容量の追加をもたらすために、たとえば注射を介して、骨組織上に、その中に、またはそのまわりに投与される。当業者によって十分に理解されるように、導入されるＭＤＣの数は、求められるまたは必要とされるように、骨密度および／または骨容量の量の変化をもたらすために調整される。たとえば、約０．５〜１．５×１０６ ＭＤＣは、骨の増大のために注射する（実施例３を参照されたい）。したがって、本発明はまた、骨障害を治療するまたは骨密度および／もしくは骨容量を増強する際の、本発明のＭＤＣの使用を包含する。骨障害には、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少が含まれる。本発明はまた、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のための、ＭＤＣの新規な使用に関する。
【００５３】
遺伝子操作された筋肉由来細胞
本発明の他の態様において、本発明のＭＤＣは、１つまたは複数の活性生体分子をコードする（１つまたは複数の）核酸配列を含有し、かつタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝物質、薬剤、酵素などを含むこれらの生体分子を発現するように遺伝子操作することができる。そのようなＭＤＣは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性であってもよく（自己）または非組織適合性であってもよい（同種異系）。これらの細胞は、種々様々な治療のための、たとえば、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含むが、これらに限定されない骨疾患および骨病態の治療のための長期局所的送達系として役割を果たすことができる。
【００５４】
レシピエントに対して外来のものとして認識されないであろう自己の筋肉由来前駆細胞は、本発明において好ましい。この点に関して、細胞媒介遺伝子移入または細胞媒介遺伝子送達に使用されるＭＤＣは、主要組織適合遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣまたはＨＬＡ）に関して所望のように適合するであろう。そのようなＭＨＣ適合細胞またはＨＬＡ適合細胞は、自己のものであってもよい。その代わりに、細胞は、同じまたは類似したＭＨＣ抗原プロファイルまたはＨＬＡ抗原プロファイルを有する人からのものであってもよい。患者はまた、同種異系のＭＨＣ抗原に対して寛容化してもよい。本発明はまた、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，５３８，７２２号に記載されるものなど、ＭＨＣクラスＩ抗原および／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原を欠く細胞の使用を包含する。
【００５５】
ＭＤＣは、当業者らに知られている、種々様々な分子的技術および分子的方法、たとえば形質移入、感染、または形質導入によって遺伝子操作してもよい。本明細書において一般に使用されるような形質導入は、細胞の中へのウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの導入を介して外来遺伝子または異種遺伝子を含有するように遺伝子操作される細胞に言及する。形質移入は、プラスミドまたは非ウイルスベクター中に含まれる外来遺伝子を含有するように遺伝子操作された細胞に、より一般に言及する。ＭＤＣは、異なるベクターによって形質移入するまたは形質導入することができ、したがって、筋肉の中に発現産物を移入するための遺伝子送達媒体として役割を果たすことができる。
【００５６】
ウイルスベクターは好ましいが、当業者らは、所望のタンパク質またはポリペプチド、サイトカインなどをコードする核酸配列を含有するための、細胞の遺伝子操作は、たとえば、融合、形質移入、リポソームの使用によって媒介されるリポフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムを用いる沈殿、核酸コーティング粒子（たとえば金の粒子）を用いる粒子衝撃（微粒子銃）、マイクロインジェクションなどを含む、米国特許第５，５３８，７２２号において記載されるような、当技術分野において知られている方法によって実行してもよいことを十分に理解するであろう。
【００５７】
生理活性産物の発現のために筋細胞の中に異種（つまり外来）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するためのベクターは、当技術分野においてよく知られている。そのようなベクターは、プロモーター配列、好ましくは、細胞特異的で、発現される配列の上流に配置されるプロモーターを有する。ベクターはまた、任意選択で、ベクター中に含有される核酸配列の形質移入および発現の成功の指標としての、発現のための１つまたは複数の発現可能なマーカー遺伝子を含有していてもよい。
【００５８】
本発明の筋肉由来細胞の形質移入または感染のための媒体またはベクター構築物の例証となる例は、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどの複製不完全ウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、またはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクターを含む。アデノ随伴ウイルスベクターは、一本鎖であり、細胞の核への、核酸の複数のコピーの効率的な送達を可能にする。アデノウイルスベクターが好ましい。ベクターは、通常、あらゆる原核生物ＤＮＡが実質的にないであろう、また多くの異なる機能的核酸配列を含んでいてもよい。そのような機能的配列の例は、ポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ、筋細胞中で活性であるプロモーター（たとえば強力なプロモーター、誘発性のプロモーターなど）ならびにエンハンサーを含む転写ならびに翻訳の開始調節配列ならびに終了調節配列を含む配列を含む。
【００５９】
対象とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）もまた、機能的配列の一部として含まれ、フランキング配列もまた、部位特異的統合のために含まれていてもよい。いくつかの状況において、５’フランキング配列は、相同組み換えを可能にし、したがって、例として、転写のレベルを増加させるまたは減少させるために、誘発性のまたは非誘発性の転写をもたらすように、転写開始領域の性質を変化させるであろう。
【００６０】
一般に、筋肉由来前駆細胞によって発現される所望の核酸配列は、たとえば、筋肉由来前駆細胞に対して異種性であり、所望のタンパク質産物またはポリペプチド産物をコードする構造遺伝子またはその遺伝子の機能的断片、セグメント、もしくは部分の核酸配列である。コードされ、発現される産物は、細胞内にあってもよい、つまり、細胞の細胞質、核、もしくは細胞小器官中に保持してもよく、または細胞によって分泌してもよい。分泌については、構造遺伝子中に存在する天然のシグナル配列が保持してもよく、または構造遺伝子中に天然に存在しないシグナル配列が使用してもよい。ポリペプチドまたはペプチドが、より大きなタンパク質の断片である場合、シグナル配列は、分泌およびプロセシング部位でのプロセシングに際して、所望のタンパク質が天然の配列を有するように提供してもよい。本発明に従う使用のための対象とする遺伝子の例は、細胞成長因子、細胞分化因子、細胞シグナル伝達因子、およびプログラム細胞死因子をコードする遺伝子を含む。特定の例は、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−１Ｒａ、第ＩＸ因子、およびコネキシン４３をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
上記に述べられるように、マーカーは、ベクター構築物を含有する細胞の選択のために存在してもよい。マーカーは、誘発性遺伝子または非誘発性遺伝子であってもよく、一般に、誘発下のまたは誘発を伴わない正の選択をそれぞれ可能にするであろう。一般に使用されるマーカー遺伝子の例は、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼなどを含む。
【００６２】
用いられるベクターはまた、一般に、複製開始点および当業者らによってルーチン的に用いられるような、宿主細胞中での複製に必要な他の遺伝子をも含むであろう。例として、複製開始点および特定のウイルスによってコードされる、複製と関連する任意のタンパク質を含む複製系は、構築物の一部として含まれていてもよい。複製系は、複製に必要な産物をコードする遺伝子が、最終的に、筋肉由来細胞を形質転換しないように選択されなければならない。そのような複製系は、たとえばＧ．Ａｃｓａｄｉら、１９９４年、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ３：５７９ ５８４頁によって記載されるように構築される複製不完全アデノウイルスおよびエプスタインバーウイルスに代表される。複製不完全なベクター、特に、複製不完全なレトロウイルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４：１５６頁およびＳａｎｅｓら、１９８６年、ＥＭＢＯ Ｊ．， ５：３１３３頁によって記載されるＢＡＧである。最終遺伝子構築物は、対象とする１つまたは複数の遺伝子、たとえば生理活性代謝分子をコードする遺伝子を含有してもよいことが理解されるであろう。さらに、ｃＤＮＡ、合成的産生ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡは、当業者らによって知られており、実施される方法およびプロトコルを利用して、用いられてもよい。
【００６３】
所望の場合、感染複製不完全ウイルスベクターは、細胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射に先立って、細胞を遺伝子操作するために使用してもよい。この点に関して、ベクターは、広宿主性パッケージングのレトロウイルスプロデューサー細胞の中に導入してもよい。隣接領域の中への筋肉由来前駆細胞の天然の増大は、対象とする（１つまたは複数の）部位の中へのまたはその部位での多数の注射を不要にする。
【００６４】
他の態様において、本発明は、所望の遺伝子産物をコードする異種遺伝子を含有するように操作されたアデノウイルスベクターを使用してウイルスで形質導入されたＭＤＣ、たとえば初期前駆筋細胞の使用を通しての、ヒトを含むレシピエント哺乳動物宿主の細胞および組織へのｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達を提供する。そのようなｅｘ ｖｉｖｏアプローチは、直接的な遺伝子移入アプローチに対して優れている、効率的なウイルス遺伝子移入の利点を提供する。ｅｘ ｖｉｖｏ手順は、筋組織の単離細胞からの筋肉由来前駆細胞の使用を含む。筋肉由来前駆細胞の供給源として役割を果たす筋生検材料は、傷害部位または臨床外科医からより容易に得ることができる他の領域から得ることができる。
【００６５】
本発明に従って、クローン単離物は、当技術分野において知られている様々な手順、たとえば組織培地中での限界希釈平板培養を使用する筋肉由来前駆細胞（つまり、ＰＰ６細胞または単一平板手順を使用する「徐々に接着する」細胞）の集団に由来し得ることが十分に理解されるであろう。クローン単離物は、単一の孤立細胞から生じる、遺伝的に同一の細胞を含む。さらに、クローン単離物は、クローン的に単離された細胞株を確立するために、ウェル当たりの単一の細胞を達成するように、上記に記載されるようなＦＡＣＳ分析、その後に続く限界希釈を使用して誘導することができる。ＰＰ６細胞集団に由来するクローン単離物の例は、ｍｃ１３であり、これは、実施例１において記載される。好ましくは、ＭＤＣクローン単離物は、本方法においてだけでなく、１つもしくは複数の生理活性分子を発現させる遺伝子操作のために、または遺伝子置換療法において利用される。
【００６６】
ＭＤＣは、第１に、所望の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含有する操作されたウイルスベクターに感染させ、食塩水またはリン酸緩衝食塩水などの生理学的に許容できる担体または賦形剤中に懸濁し、次いで、宿主における適切な部位に投与される。本発明と一致して、ＭＤＣは、上記に記載されるように、骨を含む体組織に投与することができる。所望の遺伝子産物は、注射された細胞によって発現され、これは、したがって、宿主の中に遺伝子産物を導入する。導入され、発現される遺伝子産物は、それによって、宿主において長期生存を有し、本発明のＭＤＣによって長い期間、それらが発現されることにより、傷害、機能不全、または疾患を治療する、回復させる、または寛解させるために利用することができる。
【００６７】
筋芽細胞媒介遺伝子療法の動物モデル研究において、１００ｍｇ筋肉当たり１０６筋芽細胞の移入が、筋酵素異常の部分的な補正に必要とされた（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら、１９８８年、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７頁；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６頁を参照されたい）。このデータから推測すると、生理学的に適合する培地中に懸濁した約１０１２ＭＤＣが、７０ｋｇヒトの遺伝子療法のために筋組織の中に移入することができる。本発明のＭＤＣのこの数は、ヒト源からの単一１００ｍｇ骨格筋生検材料から産生することができる（下記を参照されたい）。特定の傷害部位の治療のために、傷害の所与の組織または部位の中への遺伝子操作されたＭＤＣの注射は、溶液または懸濁液中に、細胞の治療有効量、好ましくは生理学的に許容できる培地中に、治療される組織ｃｍ３当たり約１０５〜１０６細胞を含む。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
前平板培養方法による、ＭＤＣの濃縮、単離、および分析
ＭＤＣは、記載されるように調製した（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。筋肉外植片は、多数の供給源の、すなわち、３週齢ｍｄｘ（ジストロフィー）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ ｍｄｘ／ｍｄｘ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４〜６週齢正常雌ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、またはＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスの後肢から得た。各動物供給源の筋組織を、骨を取り出すために解剖し、切り刻んでスラリーにした。次いで、スラリーは、３７℃で、０．２％ＸＩ型コラゲナーゼ、ディスパーゼ（等級ＩＩ、２４０ユニット）、および０．１％トリプシンと共に、１時間の連続インキュベーションによって消化した。結果として生じる細胞懸濁液は１８、２０、および２２ゲージ針を通過させ、５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、細胞は、増殖培地（１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物、および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中に懸濁した。次いで、細胞は、コラーゲンコーティングフラスコ中で前平板培養した（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。約１時間後に、上清は、フラスコから取り出し、新鮮なコラーゲンコーティングフラスコの中に再度平板培養した。この１時間のインキュベーション内に速やかに接着した細胞は、ほとんど、線維芽細胞であった（Ｚ．Ｑｕら、前掲；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。上清を取り出し、３０〜４０％の細胞がそれぞれのフラスコに接着した後に再度平板培養した。約５〜６回の連続平板培養の後に、培養物は、ＰＰ６細胞と命名される、小さく、球形の細胞で濃縮し、これらは、出発細胞集団から単離し、さらなる研究において使用した。初期平板培養において単離した接着細胞は、共にプールし、ＰＰ１−４細胞と命名した。
【００６９】
ｍｄｘ ＰＰ１−４細胞集団、ｍｄｘ ＰＰ６細胞集団、正常ＰＰ６細胞集団、および線維芽細胞集団は、細胞マーカーの発現について免疫組織化学分析によって検査した。この分析の結果は表１に示す。
【００７０】
【表１】
ｍｄｘ ＰＰ１−４細胞、ｍｄｘ ＰＰ６細胞、正常ＰＰ６細胞、および線維芽細胞は、前平板培養技術によって誘導し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、２％未満の細胞が発現を示したことを示す；「（−）」；「−／＋」は、５〜５０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋／−」は、４０〜８０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋」は、＞９５％の細胞が発現を示したことを示す；「ｎｏｒ」は正常細胞を示す；「ｎａ」は、免疫組織化学データが入手可能ではないことを示す。
【００７１】
ｍｄｘおよび正常マウスの両方は、このアッセイにおいて試験したすべての細胞マーカーの同一の分布を示したことが注目される。したがって、ｍｄｘ突然変異の存在は、単離ＰＰ６筋細胞由来集団の細胞マーカー発現に影響を及ぼさない。
【００７２】
ＭＤＣは、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１０％ＨＳ（ウマ血清）、０．５％ニワトリ胚抽出物、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を含有する増殖培地または２％ウシ胎児血清および１％抗生物質溶液を補充したＤＭＥＭを含有する融合培地中で増殖させた。培地供給品はすべて、Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を通して購入した。
【００７３】
（実施例２）
単一平板法による、ＭＤＣの濃縮、単離、および分析
速やかにおよび徐々に接着するＭＤＣの集団は、哺乳動物対象の骨格筋から単離した。対象は、ヒト、ラット、イヌ、または他の哺乳動物であってもよい。生検材料サイズは、４２〜２４７ｍｇの範囲であった。
【００７４】
骨格筋生検材料組織は、硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した冷たい低温培地（ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ）中に直ちに配置し、４℃で保存した。３〜７日後に、生検材料組織は、保存場所から取り出し、産生を開始した。あらゆる結合組織または非筋組織を生検材料サンプルから解剖して取り出す。単離に使用される残存筋組織を計量する。組織は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で切り刻み、コニカルチューブに移入し、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。次いで、ペレットは、消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ４（０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁する。２ｍｌの消化酵素溶液は、１００ｍｇの生検材料組織当たりに使用し、回転板上で３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、サンプルは、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、培地中に再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナを通過させる。本実施例において記載される手順に使用される培地は、以下の構成成分を補充したＣａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地ＥＧＭ−２基本培地とした：ｉ．１０％（容量／容量）ウシ胎児血清およびｉｉ．Ｃａｍｂｒｅｘ ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキット、これは、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、およびアスコルビン酸を含有する。次いで、ろ過した細胞溶液は、Ｔ２５培養フラスコに移し、５％ＣＯ２中で３７℃で３０〜１２０分間インキュベートした。このフラスコに付着する細胞は、「速やかに接着する細胞」とする。
【００７５】
インキュベーションの後に、細胞培養上清は、Ｔ２５フラスコから取り出し、１５ｍｌコニカルチューブの中に入れる。Ｔ２５培養フラスコは、２ｍｌの温めた培地を用いてすすぎ、前述の１５ｍｌのコニカルチューブに移す。１５ｍｌのコニカルチューブを遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、培地中に再懸濁し、新しいＴ２５培養フラスコに移入する。フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃で約２日間培養する（このフラスコに付着する細胞は「徐々に接着する細胞」とする）。インキュベーションの後に、細胞培養上清は、吸引し、新しい培地をフラスコに追加する。次いで、フラスコは、増大のためにインキュベーターに戻す。標準的な培養継代は、培養フラスコ中の細胞培養密度を５０％未満に維持するためにここから先、実行する。トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、継代の間にフラスコから接着細胞を剥離させるために使用する。「徐々に接着する細胞」の典型的な増大は、３７００万の細胞の平均全生細胞数を達成するのに平均１７日かかる（産生を開始する日から始めて）。
【００７６】
一旦、所望の細胞数が達成されれば、細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、フラスコから採取し、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、ＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％容量／容量、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を補充したＨＢＳＳ）中に再懸濁し、数えた。次いで、細胞溶液は、再び遠心分離し（２，５００ｘｇ、５分間）、凍結保存培地（ヒト血清アルブミン（２％容量／容量、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））を用いて所望の細胞濃度まで再懸濁し、低温保存場所のために適切なバイアル中でパッケージにする。凍結バイアルは凍結容器の中に入れ、−８０℃フリーザー中に入れる。細胞は、等容量の生理的食塩水を用いて室温で凍結細胞懸濁液を解凍することによって投与し、直接注射する（追加の操作を伴わない）。徐々に接着する細胞集団の系統特徴づけは、筋原性（８７．４％ＣＤ５６＋、８９．２％デスミン＋）、内皮（０．０％ＣＤ３１＋）、造血（０．３％ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）を示す。
【００７７】
骨格筋生検材料組織を切り離した後で、細胞の２つの画分は、培養フラスコへのそれらの速やかなまたは遅い接着に基づいて収集した。次いで、細胞は、増殖培地を用いて培養において増やし、次いで、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の凍結保存培地（１５μｌ中、３×１０５細胞）中で凍結した。コントロール群については、１５μｌの凍結保存培地のみをチューブの中に入れた。これらのチューブは、注射まで−８０℃で保存した。注射の直前に、チューブは、保存場所から取り出し、室温で解凍し、１５μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を用いて再懸濁した。次いで、結果として生じる３０μｌ溶液は、３０ゲージ針を有する０．５ｃｃインスリン注射器の中に吸い込んだ。外科手術および注射を実行する調査者は、チューブの内容物を知らされていなかった。
【００７８】
細胞数および生存率は、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を使用して測定した。ＣＤ５６は、ＰＥ抱合抗ＣＤ５６抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ抱合アイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。デスミンは、モノクローナルデスミン抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）およびアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：２００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、パラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）上でフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。蛍光ラベル化はＣｙ３抱合抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）を使用して実行した。ステップの中間に、細胞は、透過処理緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイについては、１×１０５細胞は、分化誘発培地中で、１２ウェルプレートの中に、ウェル当たりで平板培養した。４〜６日後に、細胞は、トリプシン処理することによって採取し、遠心分離してペレットにした。細胞溶解上清は、ＣＫ Ｌｉｑｕｉ−ＵＶキット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を使用して、ＣＫ活性についてアッセイした。
【００７９】
（実施例３）
骨異常のマウス遺伝子改変ＭＤＣ治療
筋肉由来細胞の単離：
ＭＤＣは、実施例１において記載されるようにｍｄｘマウスから得た。
【００８０】
ＰＰ６筋肉由来前駆細胞のクローン単離：
ＰＰ６細胞集団からクローンを単離するために、ＰＰ６細胞は、ＬａｃＺ遺伝子、ミニジストロフィン遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するプラスミドを用いて形質移入した。手短に言えば、ｐＰＧＫ−ＮＥＯからのネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ断片は、ＬａｃＺ遺伝子を含有するｐＩＥＰｌａｃＺプラスミド中のＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ部位の中に挿入し、ｐＮＥＯｌａｃＺプラスミドを作り出した。短いバージョンのジストロフィン遺伝子を含有するＤｙｓＭ３からのＸｈｏＩ／Ｓａ／Ｉ断片（Ｋ．Ｙｕａｓａら、１９９８年、ＦＥＢＳ Ｌｅｆｔ．４２５：３２９ ３３６頁；Ｄｒ．Ｔａｋｅｄａ、Ｊａｐａｎからの寄贈）は、ｐＮＥＯｌａｃＺ中のＳａ／Ｉ 部位の中に挿入し、ミニジストロフィン遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するプラスミドを生成した。プラスミドは、形質移入に先立って、Ｓａ／Ｉ消化によって直線化した。
【００８１】
ＰＰ６細胞は、メーカーの指示に従って、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ミニジストロフィン遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有する１０μｇの線状プラスミドを用いて形質移入した。形質移入の７２時間後に、細胞は、分離コロニーが現われるまで、１０日間、３０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて選択した。次いで、コロニーは、単離し、大量の形質移入細胞を得るために増やし、次いで、ＬａｃＺの発現について試験した。これらのＰＰ６由来クローンの１つ、ｍｃ１３は、さらなる研究に使用した。
【００８２】
免疫組織化学的検査：
ＰＰ６、ｍｃ１３、およびマウス線維芽細胞は、６ウェル培養皿中で平板培養し、１分間、冷メタノールを用いて固定した。次いで、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、１時間、室温で、５％ウマ血清を用いてブロックした。一次抗体は、ＰＢＳ中で以下のように希釈した：抗デスミン（１：１００、Ｓｉｇｍａ）、ビオチン化抗マウスＣＤ３４（１：２００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：５００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＭ−カドヘリン（１：５０、Ｄｒ．Ａ．Ｗｅｒｎｉｇからの寄贈）、マウス抗マウスＭｙｏＤ（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ラットミオゲニン（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＦｌｋ−１（１：５０、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびビオチン化Ｓｃａ−１（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。細胞は、一晩、室温で、一次抗体を用いてインキュベートした。次いで、細胞は、洗浄し、室温で、１時間、適切なビオチン化二次抗体と共にインキュベートした。次に、細胞は、ＰＢＳを用いてすすぎ、次いで、１時間、Ｃｙ３蛍光色素と抱合した１／３００ストレプトアビジンと共に室温でインキュベートした。次いで、細胞は、蛍光顕微鏡によって分析した。それぞれのマーカーについて、染色された細胞の百分率は、細胞の１０のランダムに選んだ領域について計算した。
【００８３】
４週齢正常マウス（Ｃ−５７ ＢＬ／６Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の筋肉サンプルの凍結切片は、２分間、冷アセトンを用いて固定し、１時間、ＰＢ中で希釈した５％ウマ血清中でプレインキュベートした。ＣＤ３４、Ｂｃｌ−２、およびコラーゲンＩＶ型については、以下の一次抗体を使用した：ビオチン抗マウスＣＤ３４（ＰＢＳ中１：２００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ型（ＰＢＳ中１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。ジストロフィン染色については、ヒツジ抗ヒトＤＹ１０抗体（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）は、一次抗体として使用し、シグナルは、抗ヒツジビオチン（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）を使用して増幅した。
【００８４】
ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激、オステオカルシン染色、およびアルカリホスファターゼアッセイ：
細胞は、１２ウェルコラーゲンコーティングフラスコ中でウェル当たり１〜２×１０４細胞の密度で３回平板培養した。細胞は、増殖培地への、２００ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）の追加によって刺激した。増殖培地は、初期平板培養の後の１、３、および５日目に交換した。細胞のコントロール群は、追加のｒｈＢＭＰ−２なしで並行して増殖させた。ｒｈＢＭＰ−２刺激なしまたはありの６日後に、細胞は、マイクロサイトメーターを使用して数え、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼの発現について分析した。オステオカルシン染色については、細胞は、ヤギ抗マウスオステオカルシン抗体（ＰＢＳ中、１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共にインキュベートし、その後、Ｃｙ３蛍光色素と抱合した抗ヤギ抗体とのインキュベーションを続けた。アルカリホスファターゼ活性を測定するために、細胞溶解物は、調製し、ｐ−ニトロフェニルリン酸からの無機リン酸の加水分解による、試薬における色の変化を利用する、市販で入手可能なキットを使用して分析した（Ｓｉｇｍａ）。結果として生じる色の変化は、分光光度計上で測定し、データは、１０６細胞に対して標準化した、リットル当たりの国際単位ＡＬＰ活性として表わした。統計的有意差は、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）を使用して分析した。
【００８５】
筋原性系統および骨原性系統におけるｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化−−筋原性：
ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）は、ｍｄｘマウスの後肢筋肉中に筋肉内注射した。動物は、注射１５日後に屠殺し、注射した筋組織は、凍結し、凍結切片を作り、ジストロフィン（上記を参照されたい）およびＬａｃＺの発現についてアッセイした。ＬａｃＺ発現について試験するために、筋肉切片は、１％グルタルアルデヒドを用いて固定し、次いで、１〜３時間、Ｘ−ｇａｌ基質（リン酸緩衝食塩水中、０．４ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモクロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、および５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）と共にインキュベートした。切片は、分析に先立ってエオシンを用いて対比染色した。並行実験において、ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）は、ｍｄｘマウスの尾静脈中に静脈内注射した。動物は、注射７日後に屠殺し、後肢は、記載されるように、切り離し、ジストロフィンおよびβ−ガラクトシダーゼの存在についてアッセイした。
【００８６】
骨原性：
アデノウイルスＢＭＰ−２プラスミド（ａｄＢＭＰ−２）を構築するために、ｒｈＢＭＰ−２コード配列は、ＢＭＰ−２−１２５プラスミド（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）から切り取り、ＨｕＣＭＶプロモーターを含有する複製不完全（Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子欠失）アデノウイルスベクターの中にサブクローニングした。手短に言えば、ＢＭＰ−２−１２５プラスミドは、Ｓａ／Ｉを用いて消化し、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを含有する１２３７塩基対断片がもたらされた。次いで、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡは、ｐＡｄ．ｌｏｘプラスミドのＳａ／Ｉ部位の中に挿入し、これにより、この遺伝子を、ＨｕＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置した。組み換えアデノウイルスは、ＣＲＥＷ細胞の中への、ｐｓｉ−５ウイルスＤＮＡとのｐＡｄ．ｌｏｘの同時形質移入によって得た。結果として生じるａｄＢＭＰ−２プラスミドは、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【００８７】
ｍｃ１３細胞は、トリプシン処理し、感染に先立って、マイクロサイトメーターを使用して数えた。細胞は、数回、ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して洗浄し、５０感染効率ユニットに等価なアデノウイルス粒子は、ＨＢＳＳの中にあらかじめ混合し、次いで、細胞上に層にした。細胞は、４時間、３７℃でインキュベーションし、次いで、等容量の増殖培地と共にインキュベートした。０．５〜１．０×１０６細胞の注射は、ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の露出した下腿三頭筋の中にガスタイトシリンジの３０ゲージ針を使用して実行した。１４〜１５日目に、動物は、メトキシフルランを用いて麻酔をかけ、頚椎脱臼によって屠殺した。後肢は、放射線写真撮影によって分析した。次に、下腿三頭筋は、切り離し、リン酸緩衝食塩水中で緩衝した２−メチルブタン中で急速冷凍し、液体窒素中であらかじめ冷却した。凍結サンプルは、クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ、ＨＭ ５０５ Ｅ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５〜１０μｍ切片に切り、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
【００８８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。逆転写は、メーカーの指示に従って、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標） Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に使用して実行した。手短に言えば、１００ｎｇランダム六量体を、１０分間、７０℃で、１μｇ全ＲＮＡにアニールし、次いで、氷上で冷やした。逆転写は、２μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ、および２００Ｕ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を用いて実行した。反応混合物は、４２℃で、５０分間、インキュベートした。
【００８９】
標的のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、２μｌの逆転写酵素反応産物、１００μｌ（５Ｕ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０μｌ反応混合物中で実行した。ＣＤ３４ ＰＣＲプライマーは、Ｏｌｉｇｏソフトウェアを使用して設計し、以下の配列を有した。
【００９０】
【化１】
他のプライマーは、以前の研究に従って設計し（Ｊ．Ｒｏｈｗｅｄｅｌら、１９９５年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２０：９２ １００頁；Ｄ．Ｄ．Ｃｏｍｅｌｉｓｏｎら、１９９７年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９１：２７０ ２８３頁）、以下の配列を有した。
【００９１】
【化２】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した：１）９４℃、４５秒間；２）５０℃、６０秒間（ＣＤ３４）または６０℃、６０秒間（ミオゲニンおよびｃ−ｍｅｔについて）；ならびに３）７２℃、９０秒間、４０サイクル。ＰＣＲ産物は、アガロース−ＴＢＥ−臭化エチジウムゲルによって確認した。予想されるＰＣＲ産物のサイズは、ＣＤ３４について１４７ｂｐ、ミオゲニンについて８６ｂｐ、およびｃ−ｍｅｔについて３７０ｂｐである。ゲノムＤＮＡコンタミネーションの可能性を排除するために、２つのコントロール反応を済ませた：１）逆転写酵素の不在下における並行する逆転写および２）イントロンをまたぐプライマーセット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用するβ−アクチンの増幅。
【００９２】
頭蓋異常アッセイ：
３匹の６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、コントロール群および実験群において使用した。動物は、メトキシフルランを用いて麻酔をかけ、手術台上に腹臥で配置した。１０号刃を使用して、頭皮を解剖して、頭蓋を露出し、骨膜を取り除いた。約５ｍｍの全層円形頭蓋異常は、硬膜の貫通を最小限にして、歯科用バーを使用して作り出した。コラーゲンスポンジマトリックス（ＨＥＬＩＳＴＡＴ（商標）、Ｃｏｌｌａ−Ｔ ｃ、Ｉｎｃ．）に、ａｄＢＭＰ−２形質導入ありのまたはなしの０．５〜１．０×１０６ＭＤＣを接種し、頭蓋異常の中に配置した。頭皮は、４−０ナイロン縫合糸を使用して閉じ、動物は、えさを与え、活動させた。１４日後に、動物は、屠殺し、頭蓋標本は、顕微鏡で観察し、次いで、分析した。フォン コッサ染色のために、頭蓋標本は、４％ホルムアルデヒド中で固定し、次いで、１５分間、０．１Ｍ ＡｇＮＯ３溶液中に浸漬した。標本は、少なくとも１５分間、光に曝露し、ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、観察のために、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。
【００９３】
Ｙプローブを使用する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
凍結切片は、３：１メタノール／氷酢酸（容量：容量）中で１０分間固定し、風乾した。次いで、切片は、２分間、７０℃で、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸Ｎａ）ｐＨ７．０中で７０％ホルムアミド中で変性させた。次に、スライドは、それぞれの濃度で、２分間、一連のエタノール洗浄剤（７０％、８０％、および９５％）を用いて脱水した。Ｙ染色体特異的プローブ（Ｙ．Ｆａｎら、１９９６年、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９：８５３ ８６０頁）は、メーカーの指示に従って、ＢｉｏＮｉｃｋキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してビオチン化した。次いで、ビオチン化プローブは、Ｇ−５０ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して精製し、精製プローブは、５ｎｇ／ｍｌの超音波処理ニシン精子ＤＮＡと共に凍結乾燥した。ハイブリダイゼーションに先立って、プローブは、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、および１０％硫酸デキストランを含有する溶液中に再懸濁した。１０分間、７５℃での変性の後に、プローブは、変性切片上に配置し、３７℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後に、切片は、５分間、７２℃で、２×ＳＳＣ溶液ｐＨ７．０を用いてすすいだ。次いで、切片は、ＢＭＳ溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）中ですすいだ。ハイブリダイズプローブは、フルオレセインラベルアビジン（ＯＮＣＯＲ， Ｉｎｃ）を用いて検出した。核は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ， Ｉｎｃ）中で１０ｎｇ／ｍｌ臭化エチジウムを用いて対比染色した。
【００９４】
ｍｃ１３細胞のマーカー分析：
ｍｃ１３細胞、ＰＰ６細胞、および線維芽細胞によって発現される生化学的マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学的検査を使用して分析した。表２（下記）は、ｍｃ１３細胞が、Ｆｌｋ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近、同定された、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウス相同体を発現したが（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、前掲）、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかったことを示す。しかしながら、本発明のＰＰ６ ＭＤＣに由来する他のクローン単離物は、ＣＤ３４および他のＰＰ６細胞マーカーを発現した。本明細書において記載される手順は、ＰＰ６筋肉由来前駆細胞集団をクローニングするためにおよび筋肉由来前駆細胞に特徴的な細胞マーカーを発現するクローン単離物を得るために使用することができることが当業者らによって十分に理解されるであろう。そのようなクローン単離物は、本発明の方法に従って使用することができる。たとえば、クローン単離物は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を含む前駆細胞マーカーを発現する。好ましくは、クローン単離物はまた、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１の細胞マーカーをも発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００９５】
【表２】
細胞は、上記に記載されるように単離し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋」は、＞９８％の細胞が発現を示したことを示す；「＋／−は」、４０〜８０％の細胞が発現を示したことを示す；「−／＋」は、５〜３０％の細胞が発現を示したことを示す；および「ｎａ」は、データが入手可能ではないことを示す。
【００９６】
ＣＤ３４＋細胞およびＢｃｌ−２＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏ局在：
ＣＤ３４＋細胞およびＢｃｌ−２＋細胞の場所をｉｎ ｖｉｖｏで同定するために正常マウスの下腿三頭筋からの筋組織切片は、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｂｃｌ−２抗体を使用して染色した。ＣＤ３４陽性細胞はまた、デスミン（図１Ｂ）についても陽性であった、小さな集団の筋肉由来細胞（図１Ａ）を構成した。抗コラーゲンＩＶ型抗体を用いるＣＤ３４＋デスミン＋細胞の共染色により、基底膜内に、それらの場所を突き止めた（図１Ｂおよび１Ｄ）。図１Ａ〜Ｄにおける矢じりによって示されるように、微小血管もまたＣＤ３４およびコラーゲンＩＶ型について陽性であったが、核染色と共存しなかった。血管内皮細胞によるＣＤ３４の発現は、以前の研究において示された（Ｌ．Ｆｉｎａら、前掲）。Ｂｃｌ−２＋デスミン＋細胞は、同様に同定し（図１Ｅ〜１Ｈ）、基底膜内に場所を突き止めた（図１Ｆおよび１Ｈ）。切片はまた、衛星細胞の場所を同定するためにＭ−カドヘリンについても染色した（図１Ｉ）。衛星細胞は、ＣＤ３４＋デスミン＋細胞またはＢｃｌ−２＋デスミン＋細胞と類似した場所で同定した（矢印、図１Ｉ）。しかしながら、Ｍ−カドヘリンとＣＤ３４またはＢｃｌ−２を共存させるための複数の試みは、成功せず、Ｍ−カドヘリンを発現する細胞は、Ｂｃｌ−２またはＣＤ３４のいずれかを同時発現しないことを示唆する。これは、本明細書において開示されるように、高レベルのＣＤ３４およびＢｃｌ−２を発現するが、最小限のレベルのＭ−カドヘリンしか発現しないＰＰ６細胞と一致している。
【００９７】
骨原性系統へのクローン筋肉前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化：
ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激による骨原性分化能について評価した。細胞は、６ウェル培養皿上で平板培養し、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下または不在下においてある培養密度まで増殖させた。３４日以内に、ｒｈＢＭＰ−２に曝露したｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２なしの細胞と比較して、劇的な形態形成変化を示した。ｒｈＢＭＰ−２の不在下において、ｍｃ１３細胞は、融合し始め、多核筋管になった（図２Ａ）。しかしながら、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２に曝露した場合、細胞は、単核のままで、融合しなかった（図２Ｂ）。細胞密度が、＞９０％培養密度に達した場合、未処理培養物は、融合して、複数の筋管を形成したが（図２Ｃ）、処理細胞は、円形肥大型になった（図２Ｄ）。免疫組織化学的検査を使用して、これらの肥大型細胞は、オステオカルシンの発現について分析した。オステオカルシンは、骨芽細胞によって特異的に発現され、骨上に蓄積されるマトリックスタンパク質である。未処理群とは対照的に、ｒｈＢＭＰ−２処理肥大型の細胞は、オステオカルシンの有意な発現を示し（図２Ｅ）、したがって、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２への曝露に際して骨芽細胞に分化することができることを示唆した。
【００９８】
次いで、ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２刺激の後でデスミンの発現について分析した。新しく単離したｍｃ１３細胞は、一様なデスミン染色（図３Ａおよび３Ｂ）を示した。ｒｈＢＭＰ−２への曝露の６日内に、３０〜４０％のｍｃ１３細胞のみがデスミン染色を示した。ｒｈＢＭＰ−２刺激の不在下において、ｍｃ１３細胞の約９０〜１００％がデスミン染色（図３Ｃ）を示した。この結果は、ｒｈＢＭＰ−２を用いるｍｃ１３細胞の刺激がこれらの細胞についての筋原能の損失をもたらすことを示唆する。
【００９９】
さらに、ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２刺激の後でアルカリホスファターゼの発現について分析した。アルカリホスファターゼは、骨芽細胞分化の生化学的マーカーとして使用されてきた（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：１７５５ １７６６頁）。図３Ｄにおいて示されるように、ｍｃ１３細胞のアルカリホスファターゼ発現は、ｒｈＢＭＰ−２に応じて、６００倍を超えて増加した。コントロールとして使用したＰＰ１ ４細胞は、ｒｈＢＭＰ−２に応じての、アルカリホスファターゼ活性の増加を示さなかった（図３Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰＰ６クローン単離物の細胞、たとえばｍｃ１３細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒｈＢＭＰ−２曝露に応じて、それらの筋原性マーカーを失い、骨原性系統を通して分化することを実証する。
【０１００】
筋原性系統および骨原性系統へのｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化：
ｍｃ１３細胞が、筋原性系統を通してｉｎ ｖｉｖｏで分化することができるかどうかを決定するために、細胞は、ｍｄｘマウスの後肢筋組織に注射した。動物は、注射の１５日後に屠殺し、それらの後肢は、組織学的分析および免疫組織化学分析のために採取した。いくつかの筋線維は、注射部位を取り囲む領域において、ＬａｃＺ染色およびジストロフィン染色を示し（図４Ａおよび４Ｂ）、ｍｃ１３細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、筋原性系統を通して分化することができ、筋肉再生を増強することができ、ジストロフィー筋においてジストロフィンを回復させることができることを示した。
【０１０１】
並行実験において、ｍｃ１３細胞は、ｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物は、注射７日後に屠殺し、後肢筋肉は、組織学的分析および免疫組織化学分析のために採取した。いくつかの後肢筋細胞は、ＬａｃＺ染色およびジストロフィン染色を示し（図４Ｃおよび４Ｄ；「＊」もまた参照されたい）、ジストロフィン発現を取り戻すために標的組織にｍｃ１３細胞を全身的に送達することができることを示唆した。
【０１０２】
ｍｃ１３細胞の多能性の特徴をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、細胞は、ｒｈＢＭＰ−２（ａｄＢＭＰ−２）をコードするアデノウイルスベクターを用いて形質導入した。次いで、ａｄＢＭＰ−２を有するｍｃ１３細胞は、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。動物は、注射１４日後に屠殺し、後肢は、組織化学的分析および免疫化学的分析のために取り出した。ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入したｍｃ１３細胞の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析は、感染細胞がｒｈＢＭＰ−２を産生することができることを示した。注射したＳＣＩＤマウスの後肢の放射線分析は、注射の１４日以内に強い異所性骨形成を示した（図４Ｅ）。異所性の骨のＬａｃＺ染色を使用する組織学的分析は、ＬａｃＺ陽性ｍｃ１３細胞が、骨芽細胞および骨細胞が見つけられる典型的な場所である石灰化マトリックスまたは骨小腔内に一様に位置することを示す（図４Ｆ）。
【０１０３】
異所性の骨の形成におけるｍｃ１３の役割をさらに確認するために、筋肉切片はまた、ジストロフィンの存在についても染色した。図４Ｇにおいて示されるように、異所性の骨は、ジストロフィンについて高度に陽性の細胞を含有し、ｍｃ１３細胞が骨形成において密接に関係していることを示唆した。コントロールとして、類似した実験を、線維芽細胞を用いて実行した。線維芽細胞は強い異所性骨形成を支持することが分かったが、注射した細胞は、骨の外側に一様に見つけられ、どれも、石灰化マトリックス内に位置し得なかった。これは、線維芽細胞が、異所性の骨を形成するために、ｒｈＢＭＰ−２を送達することができるが、骨芽細胞に分化することができないことを示唆する。この場合、異所性の骨の石灰化に関係する細胞は、宿主組織に由来する可能性が高い。したがって、これらの結果は、ｍｃ１３細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で骨芽細胞に分化することができることを実証する。
【０１０４】
遺伝子操作された筋肉由来細胞による骨治癒の増強：
頭蓋異常（約５ｍｍ）は、上記に記載されるように、歯科用バーを使用して、骨格成熟（６〜８週齢）雌ＳＣＩＤマウスにおいて作り出した。以前の実験は、５ｍｍの頭蓋異常が「非治癒性である」ことを実証した（Ｐ．Ｈ．Ｋｒｅｂｓｂａｃｈら、１９９８年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６６：１２７２〜１２７８頁）。頭蓋異常は、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入したまたは形質導入していないｍｃ１３細胞を接種したコラーゲンスポンジマトリックスを用いて埋めた。これらのマウスは、１４日目に屠殺し、頭蓋異常の治癒を分析した。図５Ａにおいて示されるように、ｒｈＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療したコントロール群は、異常の治癒の証拠を示さなかった。対照的に、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞を用いて治療した実験群は、２週目に頭蓋異常の十分な閉鎖をほぼ示した（図５Ｂ）。石灰化骨を目立たせるフォン コッサ染色は、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞を用いて治療した群における強い骨形成を示した（図５Ｄ）が、最小限の骨形成が、コントロール群において観察された（図５Ｃ）。
【０１０５】
実験群における新しい骨のエリアは、移植細胞を同定するためのＹ染色体特異的プローブを用いて、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。図５Ｅにおいて示されるように、Ｙ染色体陽性細胞は、新しく形成された骨内に同定され、ｒｈＢＭＰ−２の影響下での骨形成における移植細胞の能動的な関係を示した。Ｙ染色体陰性細胞もまた、新しく形成された頭蓋内に同定され、したがって、同様に宿主由来細胞の能動的な関係を示した。これらの結果は、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激に際して、「非治癒性の」骨異常の治癒を媒介することができることを実証し、本発明のＭＤＣが、骨の異常、傷害、または外傷の治療において使用することができることを示す。
【０１０６】
（実施例４）
ＭＤＣの投与を通しての、ヒト組織における骨密度および骨容量の増加
本研究において、軟骨形成を受けるように前駆細胞を誘発するために一般に使用される細胞ペレットを含む三次元（３Ｄ）培養系（Ｙｏｏら、ＪＢＪＳ、１９９８年、８０（１２）：１７４５〜１７５７頁）は、ｈＭＤＣが石灰化を受ける能力を評価するために使用した。マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）分析を使用すると、発明者らは、長い間にわたって同じペレットを観察することができ、試験したそれぞれの細胞集団について石灰化の速度を決定することができた。下記のデータは、本研究におけるすべてのｈＭＤＣが、石灰化することができ、ほぼ、培養の７日目までに石灰化することができたことを示す。さらに、ｈＭＤＣは、コラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）のそれらの発現を増加し、主なコラーゲンは骨中に見つかり、骨原性の分化を示唆した。マウス筋細胞とは異なり、ｈＭＤＣは、石灰化を受けるためにＢＭＰ刺激を必要とせず、骨原性の刺激に先立って、アルカリホスファターゼについて陽性であった。細胞は、ドナーの間で、ＣＤ５６発現において変化した（ＣＤ５６＋の範囲、４匹の雌集団＝４２％〜８２％および４匹の雄集団＝５５％〜９０％）。そのうえ、この骨原性アッセイは、ＣＤ５６発現が低いｈＭＤＣが、より高いレベルを発現するｈＭＤＣほど速く石灰化しなかったことを示し、ＣＤ５６が、ｈＭＤＣの骨原能についてのマーカーである可能性があることを示した。
【０１０７】
４人のヒト女性（年齢２２、２４、２４、２５）および４人のヒト男性（年齢２０、２６、２８、３０）から採取した小さな骨格筋生検材料において、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）集団（「徐々に接着する細胞」）は、実施例２において記載される単一平板法に従って、後期の前平板培養物から収集した。刺激に先立って、細胞は、実施例２において記載されるように培養した。次いで、細胞は、２８日間、骨原性培地（ＯＳＭ）（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸−２−リン酸、および１０−２Ｍ β−グリセロリン酸を補充したＤＭＥＭ）（集団当たりｎ＝６ペレット）中でペレット（２５０，０００細胞／ペレット）として誘発した。ペレットの骨容量および骨密度は、骨容量（ＢＶ）および骨密度（ＢＤ）について７、１４、２１、および２８日目にμＣＴ分析によって測定した。コラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）についての遺伝子発現は、ペレットを作製した日（０日目）およびＯＳＭ中での２８日後（２８日目）に単離したＲＮＡについての定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。統計分析は、それぞれの性別内で、０から２８日目の間で、ＢＶおよびＢＤについては二元配置ＡＮＯＶＡならびに遺伝子発現についてはｔ検定を使用して実行した。Ｐ値＜０．０５は有意であると見なした。このデータは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６集団／性別）を示す図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂにおいて示す。
【０１０８】
ｈＭＤＣはすべて、ペレットを形成し、石灰化は、早くも７日目にほとんどの集団において明らかであった。ＣＤ５６の最低の百分率を有する女性および男性の細胞集団は、培養の１４日後にようやく石灰化組織を示し始めた。試験したすべての細胞集団における長い間にわたる平均のＢＶおよびＢＤは、それぞれ、図６Ａおよび６Ｂにおいて示す。ＢＶの有意な増加は、男性ｈＭＤＣにおいて７から２８日の間に観察された。女性ｈＭＤＣの場合において、ペレットのＢＶは、１４から２１日の間に有意に増加した。女性および男性のｈＭＤＣ集団におけるＢＤは、７日ごとに増加した。２１および２８日目にスキャンしたペレットは、７および１４日目にスキャンしたペレットよりも密な石灰化を有した。性別に関する差異は、ＢＶおよびＢＤの両方について試験したすべての時点で観察されなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの発見は、ｈＭＤＣが石灰化骨組織を産生することができることを示唆する。
【０１０９】
骨芽細胞遺伝子マーカーであり、骨中に見つけられるコラーゲンであるコラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）は、骨原性ペレット培養系を使用する場合にｈＭＤＣが骨芽細胞に分化するかどうかを決定するために測定した。ＣｏｌＩ遺伝子発現は、ＯＳＭ中での２８日間の培養の後に男性および女性のｈＭＤＣの両方において有意に増加した（図７）。したがって、このデータは、骨芽細胞に分化した可能性のあるＭＤＣと一致している遺伝子発現を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３−１Ａ】
【図３−１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
政府の権益
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成番号ＤＫ０５５３８７下の政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）、およびＭＤＣの組成物、および体組織、特に骨の増大におけるその使用に関する。特に、本発明は、骨の中への導入の後で長期生存を示す筋肉由来前駆細胞、ＭＤＣを単離する方法、およびヒトまたは動物の骨の増大のためにＭＤＣ含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少などの美容的または機能的状態の治療のための筋肉由来前駆細胞の新規な使用に関する。本発明はまた、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のための、ＭＤＣの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
筋芽細胞という筋繊維の前駆体は、融合して有糸分裂後多核筋管を形成する単核筋細胞であり、これらは、生理活性タンパク質の長期発現および送達をもたらすことができる（Ｔ．Ａ．ＰａｒｔｒｉｄｇｅおよびＫ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ、１９９５年、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１：１２３ １３７頁；Ｊ．Ｄｈａｗａｎら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： １５０９ １２頁；Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、１９９４年、Ｍｙｏｌｏｇｙ Ｅｄ ２、Ａ．Ｇ．ＥｎｇｅｌおよびＣ．Ｆ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．、３０３ ３０４頁；Ｓ．ＪｉａｏおよびＪ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ、１９９２年、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７５：１４３ ７頁；Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ、１９９６年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２１９５ ２２００頁）。
【０００４】
培養筋芽細胞は、幹細胞の自己再生特性のうちのいくつかを示す細胞の亜集団を含有する（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、１９９６年、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０：４７ ５７頁）。そのような細胞は、別々に培養されない限り、融合して筋管を形成せず、分裂しない（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、前掲）。筋芽細胞移植の研究（下記を参照されたい）は、大多数の移植細胞が、速く死滅するが、少数は、生存し、新しい筋肉形成を媒介することを示した（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、１９９９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４４：１１１３ １１２２頁）。この少数の細胞は、組織培養における低増殖および移植の後での急増殖を含む特有な挙動を示し、これらの細胞が、筋芽幹細胞に相当する可能性があることを示唆する（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、前掲）。
【０００５】
筋芽細胞は、様々な筋肉関連障害および非筋肉関連障害の治療における遺伝子療法のために媒体として使用されてきた。たとえば、遺伝子改変筋芽細胞または非遺伝子改変筋芽細胞の移植は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のために使用されてきた（Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ， ３５６：４３５ ８頁；Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９２年、Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ， １５：５５０ ６０頁；Ｇ．Ｋａｒｐａｔｉら、１９９３年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．， ３４：８ １７頁；Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙら、１９９３年、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２：９９ １１２頁；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：９４ ９頁；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３４０ ４６頁）。さらに、筋芽細胞は、１型糖尿病の治療のためのプロインスリン（Ｌ．Ｇｒｏｓら、１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：１２０７ １７頁）；血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子（Ｍ．Ｒｏｍａｎら、１９９２年、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２４７ ５８頁；Ｓ．Ｎ．Ｙａｏら、１９９４年、Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ， １：９９ １０７頁；Ｊ．Ｍ．Ｗａｎｇら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ ９０：１０７５ ８２頁；Ｇ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏら、１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１２８１ ８頁）；アデノシンデアミナーゼ欠損症候群の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（Ｃ．Ｍ．Ｌｙｎｃｈら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８９：１１３８ ４２頁）；慢性貧血の治療のためのエリスロポエチン（Ｅ．Ｒｅｇｕｌｉｅｒら、１９９８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１０１４ ２２頁；Ｂ．Ｄａｌｌｅら、１９９９年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１５７ ６１頁）、および成長遅延の治療のためのヒト成長ホルモン（Ｋ．Ａｎｗｅｒら、１９９８年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：６５９ ７０頁）を産生するように遺伝子操作されてきた。
【０００６】
筋芽細胞はまた、Ｌａｗらに対する特許文献１、Ｂｌａｕらに対する特許文献２、およびＣｈａｎｃｅｌｌｏｒらによって１９９９年４月３０日に提出された米国特許出願第０９／３０２，８９６号において開示されるように、筋組織損傷または筋組織疾患を治療するためにも使用されてきた。さらに、筋芽細胞移植は、心筋機能不全の回復のために用いられてきた（Ｃ．Ｅ．Ｍｕｒｒｙら、１９９６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ， ９８：２５１２ ２３頁；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９年、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４ １２９頁；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９年、Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８；１１７３ ８０頁）。
【０００７】
上記にもかかわらず、ほとんどの場合において、最初の筋芽細胞由来の治療は、移動および／または食作用による、移植の後での、細胞の低生存率と関連してきた。この問題を回避するために、Ａｔａｌａに対する特許文献３は、アルギン酸などの液状ポリマー中に懸濁された筋芽細胞の使用を開示する。このポリマー溶液は、注射の後に筋芽細胞が移動するおよび／または食作用を受けるのを予防するためのマトリックスとして作用する。しかしながら、このポリマー溶液は、上記に論じられるバイオポリマーと同じ問題を起こす。さらに、Ａｔａｌａ特許は、筋組織のみにおける筋芽細胞の使用に限定され、他の組織における使用はない。
【０００８】
したがって、持続性であり、広範囲の宿主組織と適合し、移入部位を取り囲む組織の最小限の炎症、瘢痕、および／または硬化しか引き起こさない、他の、異なる組織増大材料の必要性がある。したがって、本発明の筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）含有組成物は、骨を増大させるための、改善された、新規な材料として提供される。移植の後で長期生存を示す筋肉由来前駆細胞組成物を産生する方法ならびにたとえば、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む、様々な美的および／または機能的異常を治療するために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を利用する方法がさらに提供される。平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法もまた提供される。
【０００９】
筋芽細胞を非筋組織増大のために使用するための先の試みが成功しなかったことは、注目に値する（Ａｔａｌａに対する特許文献３）。そのため、本明細書において開示される発見は、本発明による筋肉由来前駆細胞が、骨組織を含む非筋組織の中へうまく移植され、長期生存を示すことができることを示すので、予想外である。その結果として、ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、骨産生のための一般的な増大材料として使用することができる。そのうえ、本発明の筋肉由来前駆細胞および組成物は、自己の供給源に由来することができるので、それらは、増大材料の再吸収ならびに移入部位を取り囲む組織の炎症および／または瘢痕を含む、宿主における免疫学的合併症の危険性の低下をもたらす。
【００１０】
間葉系幹細胞は、筋肉、骨、軟骨などを含む体の様々な結合組織において見つけることができるが（Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９３年、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９Ａ：７２３ ７３６頁；Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ，ら、１９９５年、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２０２：１３７ １４４頁）、間葉系といった用語は、筋肉からではなく、骨髄から精製された幹細胞の種類に言及するように歴史的に使用されてきた。したがって、間葉系幹細胞は、本発明の筋肉由来前駆細胞と区別される。そのうえ、間葉系細胞は、ＣＤ３４細胞マーカーを発現せず（Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３ １４７頁）、これは、本明細書において記載される筋肉由来前駆細胞によって発現される。
【００１１】
知られている組成物および方法と関連する不利益および問題の本明細書における記載は、本明細書に記載される実施形態の範囲をそれらの排除まで限定するようには決して意図されず、実際に、ある種の実施形態は、そのように注目される不利益または問題を被ることなく、１つまたは複数の知られている組成物、化合物、または方法を含んでいてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，１３０，１４１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，７２２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６６７，７７８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、移植の後で長期生存を示す新規な筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することを目的とする。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、初期前駆筋細胞、つまりデスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する筋肉由来幹細胞を含む。さらに、これらの初期前駆筋細胞は、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔの細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００１４】
本発明は、出発筋細胞集団から筋肉由来前駆細胞を単離し、かつ濃縮する方法を提供することを他の目的とする。これらの方法は、軟部組織の部位の中への移植または導入の後に長期生存性を有するＭＤＣの濃縮をもたらす。本発明によるＭＤＣ集団は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する細胞で特に濃縮される。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔの細胞マーカーをも発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００１５】
本発明は、移植のためのポリマー担体または特殊な培地を必要とすることなく、骨を含む非筋組織の増大のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を使用する方法を提供することを他の目的とする。そのような方法は、骨の中への導入による、たとえば、組織の中へのもしくはその表面上への直接的な注射によるまたは組成物の全身性の分布によるＭＤＣ組成物の投与を含む。
【００１６】
本発明は、裂隙、開口部、くぼみ、創傷などをもたらす傷害、負傷、外科手術、外傷、非外傷、または他の手術の後で、骨を増大させる方法を提供することを他の目的とする。
【００１７】
本発明は、化学物質、増殖培地、および／または遺伝子操作の使用を通して改変されるＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することをさらなる目的とする。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の産生および送達ならびに様々な疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的改変細胞または遺伝子改変細胞を含む。
【００１８】
本発明は、化学物質、増殖培地、および／または遺伝子操作の使用を通して改変されるＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することをさらなる目的とする。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の産生および送達ならびに様々な疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的改変細胞または遺伝子改変細胞を含む。
【００１９】
ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を含む医薬組成物を提供することを本発明の他の実施形態とする。これらの医薬組成物は、単離ＭＤＣを含む。これらのＭＤＣは、次に、単離の後に細胞培養によって増やしてもよい。本実施形態の一態様において、これらのＭＤＣは、医薬組成物を必要とする対象への送達に先立って凍結される。
【００２０】
本発明はまた、組成物および単一平板培養技術を使用するＭＤＣの単離を含む方法をも提供する。ＭＤＣは、骨格筋の生検材料から単離される。一実施形態において、生検材料からの骨格筋は、１〜６日間、保存してもよい。本実施形態の一態様において、生検材料からの骨格筋は、４℃で保存する。細胞を切り刻み、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、他の酵素、または酵素の組み合わせを使用して消化する。細胞から酵素を洗い流した後に、細胞は、約３０から約１２０分間、培地中で、フラスコ中で培養する。この期間の間に、「速やかに接着する細胞」は、フラスコまたは容器の壁に固着するが、「徐々に接着する細胞」またはＭＤＣは、浮遊したままである。「徐々に接着する細胞」は、第２のフラスコまたは容器に移し、１〜３日の期間の間、そこで培養する。この第２の期間の間に、「徐々に接着する細胞」またはＭＤＣは、第２のフラスコまたは容器の壁に固着する。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、これらのＭＤＣは、任意の数の細胞まで増やされる。本実施形態の好ましい態様において、細胞は、約１０から２０日の間、新しい培地中で増やされる。より好ましくは、細胞は、１７日間増やされる。
【００２２】
ＭＤＣは、増やされるまたは増やされないにかかわらず、輸送するために貯蔵してもよく、または使用の前の期間、保存してもよい。一実施形態において、ＭＤＣは、凍結される。好ましくは、ＭＤＣは、約−２０から−９０℃の間で、凍結される。より好ましくは、ＭＤＣは、約−８０℃で凍結される。これらの凍結されたＭＤＣは、医薬組成物として使用される。
【００２３】
ＭＤＣは、医薬組成物として凍結されるもしくは貯蔵されるまたは新鮮な状態で使用されるにかかわらず、多くの骨変性疾患、骨変性異常、および骨変性病態を治療するために使用してもよい。これらの状態は、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む。ＭＤＣはまた、医薬組成物として凍結されるもしくは貯蔵されるまたは新鮮な状態で使用されるにかかわらず、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のために使用してもよい。
【００２４】
さらに、本発明は、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、もしくは病態を治療し、または骨量もしくは骨密度を増大させる方法を提供する。その方法は、哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、１０℃よりも低い温度まで細胞を冷却し、細胞を１〜７日間保存するステップと、３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、培地中の残存細胞を、第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップ、第２の細胞培養容器の壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、細胞を培養してその数を拡大するステップと、−３０℃未満の温度までＭＤＣを凍結するステップと、ＭＤＣを解凍し、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において、骨の異常、骨疾患、または骨病態を治療する。
【００２５】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法をも提供する。その方法は、哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、培地中の残存細胞を、第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、第２の細胞培養容器の壁から、ＭＤＣである細胞を単離するステップと、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する。
【００２６】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において、骨の異常、疾患、もしくは病態を治療し、または骨の疾患、異常、もしくは病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法をも提供する。その方法は、骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、ヒト骨格筋組織の骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、１５〜２０％の細胞が第１の容器に接着した後に行う第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、（ｄ）骨格筋由来ＭＤＣを単離し、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨にＭＤＣを投与するステップとを含み、それによって、その必要のある哺乳動物対象において尿路疾患を治療する。
【００２７】
本発明はまた、その必要のある哺乳動物対象において骨の異常、疾患、または病態を治療する方法をも提供する。その方法は、哺乳動物対象の骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を投与するステップを含む。ＭＤＣを含有する細胞集団は、第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地および第２の細胞集団を移すステップと、第２の細胞集団の細胞を第２の細胞培養容器に付着させるステップと、第２の細胞培養容器に付着した細胞を単離して、ＭＤＣを含有する前記細胞集団を得るステップとを含む工程によって得られる。
【００２８】
本発明によって与えられる、さらなる目的および利点は、下記の詳細な説明および例示から明らかとなる。
【００２９】
特許書類または特許出願書類は、カラーで仕上げられた少なくとも１枚の写真の複写を含む。カラーの写真の（１枚または複数枚の）複写を有するこの特許または特許出願のコピーは、申請および必要な料金の支払いに際して、米国特許商標庁によって規定されるであろう。
【００３０】
添付される図面の図は、本発明をさらに説明するためにおよびその様々な態様の説明を通してその理解を助けるために提示される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｉは、マウス筋細胞およびマウス血管内皮細胞中での、デスミン染色とのＣＤ３４染色またはＢｃｌ−２染色の細胞内共存を示す図である。図１Ａは、抗ＣＤ３４抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）および血管内皮細胞（矢じりを参照されたい）を示す。図１Ｂは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｃは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）を示す。図１Ｆは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｇは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体を用いて染色された衛星細胞を示す（矢印を参照されたい）。細胞は、４０×倍率で観察された。図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤ３４およびデスミンの共存を実証するが、図１Ｅ〜１Ｈは、Ｂｃｌ−２およびデスミンの共存を実証する。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｉは、マウス筋細胞およびマウス血管内皮細胞中での、デスミン染色とのＣＤ３４染色またはＢｃｌ−２染色の細胞内共存を示す図である。図１Ａは、抗ＣＤ３４抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）および血管内皮細胞（矢じりを参照されたい）を示す。図１Ｂは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｃは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色され、蛍光顕微鏡によって視覚化された正常マウス筋細胞（矢印を参照されたい）を示す。図１Ｆは、デスミンおよびコラーゲンＩＶ型抗体を用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｇは、核を示すためにヘキストを用いて共染色された同じ細胞を示す。図１Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型、およびヘキストについて共染色された細胞の複合物を示す。図１Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体を用いて染色された衛星細胞を示す（矢印を参照されたい）。細胞は、４０×倍率で観察された。図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤ３４およびデスミンの共存を実証するが、図１Ｅ〜１Ｈは、Ｂｃｌ−２およびデスミンの共存を実証する。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２へのｍｃ１３細胞の曝露に起因する、形態学的変化およびオステオカルシンの発現を示す図である。ｍｃ１３細胞は、６日間、ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中でインキュベートされた。図２Ａは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下において＞５０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｂは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下において＞５０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下において＞９０％の細胞培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下において＞９０％の培養密度まで増殖させた細胞を示す。図２Ｅは、オステオカルシン発現（骨芽細胞細胞マーカー；矢印を参照されたい）について染色された細胞を示す。細胞は、１０×倍率で観察された。図２Ａ〜２Ｅは、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２への曝露に際して骨芽細胞に分化することができることを実証する。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応じてデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の百分率に対する効果を示す図である。図３Ａは、新しく単離されたｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図３Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡観察を示す。図３Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ｍｃ１３細胞中のデスミン染色のレベルを示す。図３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ＰＰ１ ４細胞およびｍｃ１３細胞のアルカリリン酸染色のレベルを示す。＊は、統計的に有意な結果を示す（スチューデントのｔ検定）。図３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを実証するが、図３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを実証し、ｒｈＢＭＰ−２の存在下において、細胞の筋原性の特徴を減少させ、骨原性の特徴を増加させることを示唆する。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応じてデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の百分率に対する効果を示す図である。図３Ａは、新しく単離されたｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図３Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡観察を示す。図３Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ｍｃ１３細胞中のデスミン染色のレベルを示す。図３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を有するまたは有していない増殖培地中での６日間のインキュベーションの後での、ＰＰ１ ４細胞およびｍｃ１３細胞のアルカリリン酸染色のレベルを示す。＊は、統計的に有意な結果を示す（スチューデントのｔ検定）。図３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを実証するが、図３Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下においてアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを実証し、ｒｈＢＭＰ−２の存在下において、細胞の筋原性の特徴を減少させ、骨原性の特徴を増加させることを示唆する。
【図４】図４Ａ〜４Ｇは、筋原性系統および骨原性系統へのｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化を示す図である。ｍｃ１３細胞は、ＬａｃＺおよびジストロフィン遺伝子を含有する構築物を用いて安定して形質移入され、筋肉内注射または静脈内注射によってｍｄｘマウスの後肢に導入された。１５日後に、動物は、屠殺し、後肢筋系は、組織学的検査のために切り離された。図４Ａは、ＬａｃＺについて染色された筋肉内注射部位のｍｃ１３細胞を示す。図４Ｂは、ジストロフィンについて共染色された同じ細胞を示す。図４Ｃは、ＬａｃＺについて染色された静脈内注射の領域におけるｍｃ１３細胞を示す。図４Ｄは、ジストロフィンについて共染色された同じ細胞を示す。個別の実験において、ｍｃ１３細胞は、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入され、０．５ １．０×１０６細胞は、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射された。１４日後に、動物は屠殺し、後肢筋組織は、分析された。図４Ｅは、骨形成を決定するための、後肢の放射線分析を示す。図４Ｆは、ＬａｃＺについて染色された後肢に由来する細胞を示す。図４Ｇは、ジストロフィンについて染色された細胞を示す。図４Ａ〜４Ｄは、ｍｃ１３細胞が、筋肉内送達または静脈内送達を介してジストロフィン発現を取り戻すことができることを実証する。図４Ａ〜４Ｇは、ｍｃ１３細胞が、異所性骨形成に関連することを実証する。細胞は、以下の倍率で観察された：４０×（図４Ａ〜４Ｄ）；１０×（図４Ａ〜４Ｇ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２産生初代筋細胞による骨治癒の増強を示す図である。５ｍｍの頭蓋異常は、歯科用バーを使用して、雌ＳＣＩＤマウスにおいて作り出され、異常部は、ａｄＢＭＰ−２を有するまたは有していないｍｃ１３細胞が接種されたコラーゲンスポンジを用いて埋められた。動物は、１４日目に屠殺し、視察され、骨治癒の徴候について顕微鏡で分析された。図５Ａは、ａｄＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋を示す。図５Ｂは、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋を示す。図５Ｃは、フォン コッサ染色によって分析された、ａｄＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ｄは、フォン コッサ染色によって分析された、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ｅは、注射された細胞（矢印によって示される緑色蛍光）を同定するためにＹ染色体特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって分析され、核（赤色蛍光によって示される）を同定するために臭化エチジウムを用いて染色された、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入されたｍｃ１３細胞を用いて治療された頭蓋の組織学的サンプルを示す。図５Ａ〜５Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を発現するｍｃ１３細胞が、骨異常の治癒に寄与し得ることを実証する。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＯＳＭ中の、ヒト男性ＭＤＣおよびヒト女性ＭＤＣを含む骨原性ペレット中で長い間にわたって増加する骨容量（図６Ａ）および骨密度（図６Ｂ）を示す棒グラフである。７日目に対して＊Ｐ＜０．０５、１４日目に対して＃Ｐ＜０．０５、および２１日目に対して＋Ｐ＜０．０５。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＯＳＭ中でペレットとして培養されたｈＭＤＣのオステオカルシン（Ｏｃｎ）（図７Ａ）およびコラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）（図７Ｂ）の遺伝子発現を示す棒グラフである。０日目に対して＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ヒトＭＤＣならびに損傷した骨を回復させるためにまたは骨容量および／もしくは骨密度を野生型レベル以上まで増加させるために、骨組織を生成するようにそのような細胞を使用する方法を提供する。本発明は、失調症、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含む骨障害を治療する方法をさらに提供する。成人組織からのヒト筋肉由来細胞（ＭＤＣ）の単離により、これらの細胞を投与されたヒト対象内の骨密度および骨容量の増加を達成することができる。
【００３３】
筋肉由来細胞および組成物
本発明は、体組織、好ましくは骨への移植の後で長期生存率を示す初期前駆細胞（本明細書において、筋肉由来前駆細胞または筋肉由来幹細胞とも称される）からなるＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るために、筋肉外植片、好ましくは骨格筋は、動物ドナーから、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物から得られる。この外植片は、筋肉前駆体細胞の「遺残」を含む、構造的および機能的シンシチウムとして役割を果たす（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ ７３：３０６ ８頁；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎら、１９７９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：１２９２４頁）。
【００３４】
初代筋組織から単離される細胞は、線維芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、造血前駆細胞、および筋肉由来前駆細胞の混合物を含有する。筋肉由来集団の前駆細胞は、Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号に記載されるものなど、コラーゲンコーティング組織フラスコ上で、初代筋細胞の特異な接着性の特徴を使用して濃縮することができる。接着するのが遅い細胞は、形態学的に球形の傾向があり、高レベルのデスミンを発現し、融合し、多核筋管に分化するための能力を有する。Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。これらの細胞の亜集団は、レベルが増加したアルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン依存性３’，５’−ｃＡＭＰ、ならびに骨原性系統および筋原性系統を発現することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、組み換えヒト骨形態形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することが示された（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２７：１７５５ １７６６頁）。
【００３５】
本発明の一実施形態において、前平板培養手順は、徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）から速やかに接着する細胞を識別するために使用してもよい。本発明に従って、速やかに接着するＭＤＣ（ＰＰ１−４）の集団および徐々に接着する、球形のＭＤＣ（ＰＰ６）は、単離され、骨格筋外植片から濃縮し、徐々に接着する細胞の中の多能性細胞の存在を決定するために、免疫組織化学的検査を使用して、様々なマーカーの発現について試験された（実施例１；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許出願第０９／３０２，８９６号）。本明細書における表２および実施例３において示されるように、ＰＰ６細胞は、デスミン、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンを含む筋原性のマーカーを発現した。ＰＰ６細胞はまた、ｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦ、筋形成の初期段階で発現される２つの遺伝子をも発現した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１ ２１９頁；表３を参照されたい）。ＰＰ６は、Ｍ−カドヘリン、衛星細胞特異的マーカーを発現する細胞のより低い百分率を示したが（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １９９：３２６ ３３７頁）、Ｂｃｌ−２、筋形成の初期段階の細胞に限られるマーカーを発現する細胞のより高い百分率を示した（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖら、１９９８年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４２：５３７ ５４４頁）。ＰＰ６細胞はまた、ＣＤ３４、骨髄中のヒト造血前駆細胞およびヒト間質細胞前駆体で同定されるマーカーをも発現した（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８６年、Ｂｌｏｏｄ ６７：８４２ ８４５頁；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎら、１９８４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７ １６５頁；Ｌ．Ｆｉｎａら、１９９０年、Ｂｌｏｏｄ ７５：２４１７ ２４２６頁；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７８：２８４８ ２８５３頁；表３を参照されたい）。ＰＰ６細胞はまた、Ｆｌｋ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近、同定された、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウス相同体をも発現した（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５５３ １５５８頁；表３を参照されたい）。同様に、ＰＰ６細胞は、Ｓｃａ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞中に存在するマーカーを発現した（Ｍ．ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６３４ ８頁；Ｍ．Ｏｓａｗａら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７ １４頁；表３を参照されたい）。しかしながら、ＰＰ６細胞は、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの造血幹細胞マーカーを発現しなかった（Ｌ Ｋ．Ａｓｈｍａｎ、１９９９年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７ ５１頁；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ、１９９３年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：４２０ ４２６頁において考察される；表３を参照されたい）。
【００３６】
本発明の一実施形態において、本明細書において記載される特徴を有する筋肉由来前駆細胞のＰＰ６集団がある。これらの筋肉由来前駆細胞は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２の細胞マーカーを発現する。本発明に従って、ＰＰ６細胞は、移植の後で長期生存性を有する筋肉由来前駆細胞の集団を得るために、本明細書において記載される技術によって単離される（実施例１）。ＰＰ６筋肉由来前駆細胞集団は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの前駆細胞マーカーを発現する、有意な百分率の細胞を含む。さらに、ＰＰ６細胞は、Ｆｌｋ−１およびＳｃａ−１の細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔのマーカーを発現しない。好ましくは、９５％を超えるＰＰ６細胞は、デスミン、Ｓｃａ−１、およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔのマーカーを発現しない。ＰＰ６細胞は、最後の平板培養の後の約１日または約２４時間以内に利用されることが好ましい。
【００３７】
好ましい実施形態において、速やかに接着する細胞および徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）は、単一平板培養技術を使用して互いに分離される。１つのそのような技術は、実施例２において記載される。第１に、細胞は、骨格筋生検材料から提供される。生検材料は、ただ、約１００ｍｇの細胞を含有する必要がある。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇのサイズの範囲の生検材料は、本発明の前平板培養方法および単一平板培養方法の両方によって使用される。５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００、および５００ｍｇのさらなる生検材料は、本発明の前平板培養方法および単一平板培養方法の両方によって使用される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、生検材料からの組織は、次いで、１〜７日間、保存される。この保存は、約室温〜約４℃の温度で行う。この待機期間は、生検骨格筋組織にストレスを受けさせる。このストレスは、この単一平板技術を使用する、ＭＤＣの単離に必要ではないが、待ち期間の使用は、ＭＤＣのより大きな収量をもたらすように思われる。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、生検材料からの組織は、切り刻み、遠心分離する。ペレットを再懸濁し、消化酵素を使用して消化する。使用してもよい酵素は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはこれらの酵素の組み合わせを含む。消化の後に、酵素は、細胞から洗い流される。細胞は、速やかに接着する細胞の単離のために培地中に、フラスコに移される。多くの培地を使用してもよい。特に好ましい培地は、Ｃａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地を含む、内皮細胞の培養のために設計される培地を含む。この培地は、ウシ胎児血清、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、および／またはアスコルビン酸を含む他の構成成分を補充してもよい。単一平板培養技術において使用してもよい他の培地は、ＩｎＣｅｌｌ Ｍ３１０Ｆ培地を含む。この培地は、上記に記載されるように補充してもよく、または補充せずに使用してもよい。
【００４０】
速やかに接着する細胞の単離のためのステップは、約３０〜約１２０分の期間のフラスコ中での培養を必要とし得る。速やかに接着する細胞は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０分で、フラスコに接着する。それらが接着した後に、徐々に接着する細胞は、速やかに接着する細胞が付着するフラスコから培地を取り出すことによって、速やかに接着する細胞から分離される。
【００４１】
次いで、このフラスコから取り出された培地は、第２のフラスコに移される。細胞は、第２のフラスコに移される前に、遠心分離され、培地中に再懸濁してもよい。細胞は、１から３日の間、この第２のフラスコ中で培養される。好ましくは、細胞は、２日間、培養される。この期間の間に、徐々に接着する細胞（ＭＤＣ）は、フラスコに接着する。ＭＤＣが接着した後に、培地は、取り出され、新しい培地は、ＭＤＣの数を増やすことができるように、追加される。ＭＤＣの数は、約１０〜約２０日間、それらを培養することによって、増やしてもよい。ＭＤＣの数は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間、それらを培養することによって増やしてもよい。好ましくは、ＭＤＣは、１７日間、増大培養にかけられる。
【００４２】
前平板培養方法および単一平板培養方法の代わりとして、本発明のＭＤＣは、ＭＤＣによって発現される、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって単離することができる（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２ ６５頁；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎら、１９９９年、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２２：４３ ５０頁）。たとえば、ＦＡＣＳ分析は、宿主組織の中に導入された場合に、長期生存性を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するために、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／または本明細書において記載される他の細胞表面マーカーに特異的に結合する標識抗体を使用して実行することができる。異なる細胞マーカータンパク質の抗体検出のための１つまたは複数の蛍光検出ラベル、たとえばフルオレセインまたはローダミンの使用もまた本発明によって包含される。
【００４３】
上記に記載されるＭＤＣ単離方法のいずれかを使用して、輸送されることになっているまたはある期間、使用されない予定であるＭＤＣは、当技術分野において知られている方法を使用して貯蔵してもよい。より具体的に、単離ＭＤＣは、約−２５〜約−９０℃の範囲の温度で凍結してもよい。好ましくは、ＭＤＣは、使用の延期または輸送のためにドライアイス上で約−８０℃で凍結される。凍結は、当技術分野において知られている任意の凍結保存培地を用いて行われてもよい。
【００４４】
筋肉由来細胞ベースの治療
本発明の一実施形態において、ＭＤＣは、骨格筋供給源から単離され、対象とする筋肉もしくは非筋軟部組織部位または骨構造の中に導入または移植される。有利には、本発明のＭＤＣは、単離され、移植の後で長期生存を示す多数の前駆細胞を含有するように濃縮される。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２などの多くの特徴的な細胞マーカーを発現する。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１の細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない（実施例１を参照されたい）。
【００４５】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、骨の増大を通して、様々な美的または機能的状態（たとえば異常）を回復させる、治療する、または寛解させるために使用することができる。特に、そのような組成物は、骨障害の治療のために使用することができる。ＭＤＣの複数回のおよび連続的な投与もまた本発明によって包含される。
【００４６】
ＭＤＣベースの治療については、骨格筋外植片は、自己または異種性のヒトまたは動物の供給源から好ましくは得られる。自己の動物またはヒトの供給源がより好ましい。次いで、本明細書において記載されるように、ＭＤＣ組成物を調製および単離する。ヒトまたは動物のレシピエントに、本発明によるＭＤＣおよび／またはＭＤＣを含む組成物を導入または移植するために、単核筋細胞の懸濁液を調製する。そのような懸濁液は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤中に、ある濃度の本発明の筋肉由来前駆細胞を含有する。たとえば、対象に投与するためのＭＤＣの懸濁液は、ウシ胎児血清の代わりとして対象の血清を含有するように改変された完全培地の滅菌溶液中に１０８〜１０９細胞／ｍｌを含むことができる。その代わりに、ＭＤＣ懸濁液は、凍結保存溶液などの、血清なしの滅菌溶液中のものとすることができる（Ｃｅｌｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎ．）。次いで、ＭＤＣ懸濁液は、たとえば注射を介して、ドナー組織の１つまたは複数の部位の中に導入することができる。
【００４７】
記載される細胞は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含有する薬学的にまたは生理学的に許容できる調製物または組成物として投与することができ、ヒトおよび非ヒト動物を含む対象とするレシピエント生物の組織に投与することができる。ＭＤＣ含有組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理学的に許容できる注射可能な水性液体などの適している液体または溶液中に細胞を再懸濁することによって調製することができる。そのような組成物中で使用される構成成分の量は、当業者らによってルーチン的に決定することができる。
【００４８】
ＭＤＣまたはその組成物は、吸収性材料または接着性材料、つまりコラーゲンスポンジマトリックス上へのＭＤＣ懸濁液の配合および対象とする部位の中へのまたはその部位上へのＭＤＣ含有材料の挿入によって投与することができる。その代わりに、ＭＤＣは、皮下、静脈内、筋肉内、および胸骨内を含む、注射の非経口経路によって投与することができる。投与の他のモードは、鼻内、鞘内、皮内、腸内、経皮、および舌下を含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、ＭＤＣの投与は、内視鏡手術によって実現することができる。
【００４９】
注射可能な投与については、組成物は、滅菌溶液または懸濁液中のものとし、薬学的におよび生理学的に許容できる水性媒体または油性媒体中に再懸濁することができ、これは、防腐剤、安定剤、および溶液または懸濁液をレシピエントの体液（つまり血液）と等張にするための材料を含有していてもよい。使用に適している賦形剤の非限定的な例は、水、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ水性塩化ナトリウム溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノールなどならびにその混合物を含む。例証となる安定剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらは、単独でまたは混合剤として使用してもよい。使用される量または分量および投与の経路は、個体に基づいて決定され、当業者らに知られている類似したタイプの適用または適応において使用される量に相当する。
【００５０】
移植手術結果を最適化するために、ドナーおよびレシピエントの間の可能な限り近い免疫学的適合が所望される。自己の供給源が入手可能ではない場合、ドナーおよびレシピエントのクラス１およびクラスＩＩ組織適合抗原は、入手可能な最も近い適合を決定するために分析することができる。これは、免疫拒絶を最小限にしまたはなくし、免疫抑制療法または免疫調整療法の必要性を低下させる。必要とされる場合、免疫抑制療法または免疫調整療法は、移植手術手順の前に、その間に、および／またはその後に始めることができる。たとえば、シクロスポリンＡまたは他の免疫抑制剤は、移植手術レシピエントに投与することができる。免疫寛容もまた、当技術分野において知られている代替方法によって、移植に先立って誘発してもよい（Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら、１９８４年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９頁；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７０１頁）。
【００５１】
本発明と一致して、ＭＤＣは、骨を含む体組織に投与することができる。ＭＤＣ懸濁液中の細胞の数および投与のモードは、治療されている部位および状態に依存して変化してもよい。約１．０×１０５〜約１×１０８ ＭＤＣは、本発明に従って投与してもよい。非限定的な例として、本発明に従って、約０．５〜１．０×１０６ ＭＤＣを、約５ｍｍの領域の頭蓋異常の治療のためにコラーゲンスポンジマトリックスを介して投与する（実施例３を参照されたい）。さらなるＭＤＣは、ペレット当たり約１００，０００から５００，０００ ＭＤＣを有するペレットベースの培養系を介して投与してもよい。好ましい実施形態において、それぞれのペレットは、約２５０，０００ ＭＤＣを含有する。任意の数のペレットが患者に投与してもよい。好ましくは、２０ ２から１０のペレットが投与される。本明細書において開示される実施例と一致して、当業者は、それぞれの症例について決定される必要条件、制限、および／または最適化に従って、ＭＤＣベースの治療の量および方法を調整することができる。
【００５２】
骨障害の骨増大または治療のために、ＭＤＣは、上記に記載されるように調製され、骨密度および／または骨容量の追加をもたらすために、たとえば注射を介して、骨組織上に、その中に、またはそのまわりに投与される。当業者によって十分に理解されるように、導入されるＭＤＣの数は、求められるまたは必要とされるように、骨密度および／または骨容量の量の変化をもたらすために調整される。たとえば、約０．５〜１．５×１０６ ＭＤＣは、骨の増大のために注射する（実施例３を参照されたい）。したがって、本発明はまた、骨障害を治療するまたは骨密度および／もしくは骨容量を増強する際の、本発明のＭＤＣの使用を包含する。骨障害には、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少が含まれる。本発明はまた、平均を超える骨量を必要とする運動選手または他の生物における骨量の増加のための、ＭＤＣの新規な使用に関する。
【００５３】
遺伝子操作された筋肉由来細胞
本発明の他の態様において、本発明のＭＤＣは、１つまたは複数の活性生体分子をコードする（１つまたは複数の）核酸配列を含有し、かつタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝物質、薬剤、酵素などを含むこれらの生体分子を発現するように遺伝子操作することができる。そのようなＭＤＣは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性であってもよく（自己）または非組織適合性であってもよい（同種異系）。これらの細胞は、種々様々な治療のための、たとえば、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、骨折、骨軟化症、骨梁の強度の減少、骨皮質強度の減少、および老齢に伴う骨密度の減少を含むが、これらに限定されない骨疾患および骨病態の治療のための長期局所的送達系として役割を果たすことができる。
【００５４】
レシピエントに対して外来のものとして認識されないであろう自己の筋肉由来前駆細胞は、本発明において好ましい。この点に関して、細胞媒介遺伝子移入または細胞媒介遺伝子送達に使用されるＭＤＣは、主要組織適合遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣまたはＨＬＡ）に関して所望のように適合するであろう。そのようなＭＨＣ適合細胞またはＨＬＡ適合細胞は、自己のものであってもよい。その代わりに、細胞は、同じまたは類似したＭＨＣ抗原プロファイルまたはＨＬＡ抗原プロファイルを有する人からのものであってもよい。患者はまた、同種異系のＭＨＣ抗原に対して寛容化してもよい。本発明はまた、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，５３８，７２２号に記載されるものなど、ＭＨＣクラスＩ抗原および／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原を欠く細胞の使用を包含する。
【００５５】
ＭＤＣは、当業者らに知られている、種々様々な分子的技術および分子的方法、たとえば形質移入、感染、または形質導入によって遺伝子操作してもよい。本明細書において一般に使用されるような形質導入は、細胞の中へのウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの導入を介して外来遺伝子または異種遺伝子を含有するように遺伝子操作される細胞に言及する。形質移入は、プラスミドまたは非ウイルスベクター中に含まれる外来遺伝子を含有するように遺伝子操作された細胞に、より一般に言及する。ＭＤＣは、異なるベクターによって形質移入するまたは形質導入することができ、したがって、筋肉の中に発現産物を移入するための遺伝子送達媒体として役割を果たすことができる。
【００５６】
ウイルスベクターは好ましいが、当業者らは、所望のタンパク質またはポリペプチド、サイトカインなどをコードする核酸配列を含有するための、細胞の遺伝子操作は、たとえば、融合、形質移入、リポソームの使用によって媒介されるリポフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムを用いる沈殿、核酸コーティング粒子（たとえば金の粒子）を用いる粒子衝撃（微粒子銃）、マイクロインジェクションなどを含む、米国特許第５，５３８，７２２号において記載されるような、当技術分野において知られている方法によって実行してもよいことを十分に理解するであろう。
【００５７】
生理活性産物の発現のために筋細胞の中に異種（つまり外来）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するためのベクターは、当技術分野においてよく知られている。そのようなベクターは、プロモーター配列、好ましくは、細胞特異的で、発現される配列の上流に配置されるプロモーターを有する。ベクターはまた、任意選択で、ベクター中に含有される核酸配列の形質移入および発現の成功の指標としての、発現のための１つまたは複数の発現可能なマーカー遺伝子を含有していてもよい。
【００５８】
本発明の筋肉由来細胞の形質移入または感染のための媒体またはベクター構築物の例証となる例は、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどの複製不完全ウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、またはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクターを含む。アデノ随伴ウイルスベクターは、一本鎖であり、細胞の核への、核酸の複数のコピーの効率的な送達を可能にする。アデノウイルスベクターが好ましい。ベクターは、通常、あらゆる原核生物ＤＮＡが実質的にないであろう、また多くの異なる機能的核酸配列を含んでいてもよい。そのような機能的配列の例は、ポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ、筋細胞中で活性であるプロモーター（たとえば強力なプロモーター、誘発性のプロモーターなど）ならびにエンハンサーを含む転写ならびに翻訳の開始調節配列ならびに終了調節配列を含む配列を含む。
【００５９】
対象とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）もまた、機能的配列の一部として含まれ、フランキング配列もまた、部位特異的統合のために含まれていてもよい。いくつかの状況において、５’フランキング配列は、相同組み換えを可能にし、したがって、例として、転写のレベルを増加させるまたは減少させるために、誘発性のまたは非誘発性の転写をもたらすように、転写開始領域の性質を変化させるであろう。
【００６０】
一般に、筋肉由来前駆細胞によって発現される所望の核酸配列は、たとえば、筋肉由来前駆細胞に対して異種性であり、所望のタンパク質産物またはポリペプチド産物をコードする構造遺伝子またはその遺伝子の機能的断片、セグメント、もしくは部分の核酸配列である。コードされ、発現される産物は、細胞内にあってもよい、つまり、細胞の細胞質、核、もしくは細胞小器官中に保持してもよく、または細胞によって分泌してもよい。分泌については、構造遺伝子中に存在する天然のシグナル配列が保持してもよく、または構造遺伝子中に天然に存在しないシグナル配列が使用してもよい。ポリペプチドまたはペプチドが、より大きなタンパク質の断片である場合、シグナル配列は、分泌およびプロセシング部位でのプロセシングに際して、所望のタンパク質が天然の配列を有するように提供してもよい。本発明に従う使用のための対象とする遺伝子の例は、細胞成長因子、細胞分化因子、細胞シグナル伝達因子、およびプログラム細胞死因子をコードする遺伝子を含む。特定の例は、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−１Ｒａ、第ＩＸ因子、およびコネキシン４３をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
上記に述べられるように、マーカーは、ベクター構築物を含有する細胞の選択のために存在してもよい。マーカーは、誘発性遺伝子または非誘発性遺伝子であってもよく、一般に、誘発下のまたは誘発を伴わない正の選択をそれぞれ可能にするであろう。一般に使用されるマーカー遺伝子の例は、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼなどを含む。
【００６２】
用いられるベクターはまた、一般に、複製開始点および当業者らによってルーチン的に用いられるような、宿主細胞中での複製に必要な他の遺伝子をも含むであろう。例として、複製開始点および特定のウイルスによってコードされる、複製と関連する任意のタンパク質を含む複製系は、構築物の一部として含まれていてもよい。複製系は、複製に必要な産物をコードする遺伝子が、最終的に、筋肉由来細胞を形質転換しないように選択されなければならない。そのような複製系は、たとえばＧ．Ａｃｓａｄｉら、１９９４年、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ３：５７９ ５８４頁によって記載されるように構築される複製不完全アデノウイルスおよびエプスタインバーウイルスに代表される。複製不完全なベクター、特に、複製不完全なレトロウイルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４：１５６頁およびＳａｎｅｓら、１９８６年、ＥＭＢＯ Ｊ．， ５：３１３３頁によって記載されるＢＡＧである。最終遺伝子構築物は、対象とする１つまたは複数の遺伝子、たとえば生理活性代謝分子をコードする遺伝子を含有してもよいことが理解されるであろう。さらに、ｃＤＮＡ、合成的産生ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡは、当業者らによって知られており、実施される方法およびプロトコルを利用して、用いられてもよい。
【００６３】
所望の場合、感染複製不完全ウイルスベクターは、細胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射に先立って、細胞を遺伝子操作するために使用してもよい。この点に関して、ベクターは、広宿主性パッケージングのレトロウイルスプロデューサー細胞の中に導入してもよい。隣接領域の中への筋肉由来前駆細胞の天然の増大は、対象とする（１つまたは複数の）部位の中へのまたはその部位での多数の注射を不要にする。
【００６４】
他の態様において、本発明は、所望の遺伝子産物をコードする異種遺伝子を含有するように操作されたアデノウイルスベクターを使用してウイルスで形質導入されたＭＤＣ、たとえば初期前駆筋細胞の使用を通しての、ヒトを含むレシピエント哺乳動物宿主の細胞および組織へのｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達を提供する。そのようなｅｘ ｖｉｖｏアプローチは、直接的な遺伝子移入アプローチに対して優れている、効率的なウイルス遺伝子移入の利点を提供する。ｅｘ ｖｉｖｏ手順は、筋組織の単離細胞からの筋肉由来前駆細胞の使用を含む。筋肉由来前駆細胞の供給源として役割を果たす筋生検材料は、傷害部位または臨床外科医からより容易に得ることができる他の領域から得ることができる。
【００６５】
本発明に従って、クローン単離物は、当技術分野において知られている様々な手順、たとえば組織培地中での限界希釈平板培養を使用する筋肉由来前駆細胞（つまり、ＰＰ６細胞または単一平板手順を使用する「徐々に接着する」細胞）の集団に由来し得ることが十分に理解されるであろう。クローン単離物は、単一の孤立細胞から生じる、遺伝的に同一の細胞を含む。さらに、クローン単離物は、クローン的に単離された細胞株を確立するために、ウェル当たりの単一の細胞を達成するように、上記に記載されるようなＦＡＣＳ分析、その後に続く限界希釈を使用して誘導することができる。ＰＰ６細胞集団に由来するクローン単離物の例は、ｍｃ１３であり、これは、実施例１において記載される。好ましくは、ＭＤＣクローン単離物は、本方法においてだけでなく、１つもしくは複数の生理活性分子を発現させる遺伝子操作のために、または遺伝子置換療法において利用される。
【００６６】
ＭＤＣは、第１に、所望の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含有する操作されたウイルスベクターに感染させ、食塩水またはリン酸緩衝食塩水などの生理学的に許容できる担体または賦形剤中に懸濁し、次いで、宿主における適切な部位に投与される。本発明と一致して、ＭＤＣは、上記に記載されるように、骨を含む体組織に投与することができる。所望の遺伝子産物は、注射された細胞によって発現され、これは、したがって、宿主の中に遺伝子産物を導入する。導入され、発現される遺伝子産物は、それによって、宿主において長期生存を有し、本発明のＭＤＣによって長い期間、それらが発現されることにより、傷害、機能不全、または疾患を治療する、回復させる、または寛解させるために利用することができる。
【００６７】
筋芽細胞媒介遺伝子療法の動物モデル研究において、１００ｍｇ筋肉当たり１０６筋芽細胞の移入が、筋酵素異常の部分的な補正に必要とされた（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら、１９８８年、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７頁；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６頁を参照されたい）。このデータから推測すると、生理学的に適合する培地中に懸濁した約１０１２ＭＤＣが、７０ｋｇヒトの遺伝子療法のために筋組織の中に移入することができる。本発明のＭＤＣのこの数は、ヒト源からの単一１００ｍｇ骨格筋生検材料から産生することができる（下記を参照されたい）。特定の傷害部位の治療のために、傷害の所与の組織または部位の中への遺伝子操作されたＭＤＣの注射は、溶液または懸濁液中に、細胞の治療有効量、好ましくは生理学的に許容できる培地中に、治療される組織ｃｍ３当たり約１０５〜１０６細胞を含む。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
前平板培養方法による、ＭＤＣの濃縮、単離、および分析
ＭＤＣは、記載されるように調製した（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。筋肉外植片は、多数の供給源の、すなわち、３週齢ｍｄｘ（ジストロフィー）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ ｍｄｘ／ｍｄｘ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４〜６週齢正常雌ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、またはＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスの後肢から得た。各動物供給源の筋組織を、骨を取り出すために解剖し、切り刻んでスラリーにした。次いで、スラリーは、３７℃で、０．２％ＸＩ型コラゲナーゼ、ディスパーゼ（等級ＩＩ、２４０ユニット）、および０．１％トリプシンと共に、１時間の連続インキュベーションによって消化した。結果として生じる細胞懸濁液は１８、２０、および２２ゲージ針を通過させ、５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、細胞は、増殖培地（１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物、および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中に懸濁した。次いで、細胞は、コラーゲンコーティングフラスコ中で前平板培養した（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。約１時間後に、上清は、フラスコから取り出し、新鮮なコラーゲンコーティングフラスコの中に再度平板培養した。この１時間のインキュベーション内に速やかに接着した細胞は、ほとんど、線維芽細胞であった（Ｚ．Ｑｕら、前掲；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。上清を取り出し、３０〜４０％の細胞がそれぞれのフラスコに接着した後に再度平板培養した。約５〜６回の連続平板培養の後に、培養物は、ＰＰ６細胞と命名される、小さく、球形の細胞で濃縮し、これらは、出発細胞集団から単離し、さらなる研究において使用した。初期平板培養において単離した接着細胞は、共にプールし、ＰＰ１−４細胞と命名した。
【００６９】
ｍｄｘ ＰＰ１−４細胞集団、ｍｄｘ ＰＰ６細胞集団、正常ＰＰ６細胞集団、および線維芽細胞集団は、細胞マーカーの発現について免疫組織化学分析によって検査した。この分析の結果は表１に示す。
【００７０】
【表１】
ｍｄｘ ＰＰ１−４細胞、ｍｄｘ ＰＰ６細胞、正常ＰＰ６細胞、および線維芽細胞は、前平板培養技術によって誘導し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、２％未満の細胞が発現を示したことを示す；「（−）」；「−／＋」は、５〜５０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋／−」は、４０〜８０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋」は、＞９５％の細胞が発現を示したことを示す；「ｎｏｒ」は正常細胞を示す；「ｎａ」は、免疫組織化学データが入手可能ではないことを示す。
【００７１】
ｍｄｘおよび正常マウスの両方は、このアッセイにおいて試験したすべての細胞マーカーの同一の分布を示したことが注目される。したがって、ｍｄｘ突然変異の存在は、単離ＰＰ６筋細胞由来集団の細胞マーカー発現に影響を及ぼさない。
【００７２】
ＭＤＣは、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１０％ＨＳ（ウマ血清）、０．５％ニワトリ胚抽出物、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を含有する増殖培地または２％ウシ胎児血清および１％抗生物質溶液を補充したＤＭＥＭを含有する融合培地中で増殖させた。培地供給品はすべて、Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を通して購入した。
【００７３】
（実施例２）
単一平板法による、ＭＤＣの濃縮、単離、および分析
速やかにおよび徐々に接着するＭＤＣの集団は、哺乳動物対象の骨格筋から単離した。対象は、ヒト、ラット、イヌ、または他の哺乳動物であってもよい。生検材料サイズは、４２〜２４７ｍｇの範囲であった。
【００７４】
骨格筋生検材料組織は、硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した冷たい低温培地（ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ）中に直ちに配置し、４℃で保存した。３〜７日後に、生検材料組織は、保存場所から取り出し、産生を開始した。あらゆる結合組織または非筋組織を生検材料サンプルから解剖して取り出す。単離に使用される残存筋組織を計量する。組織は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で切り刻み、コニカルチューブに移入し、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。次いで、ペレットは、消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ４（０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁する。２ｍｌの消化酵素溶液は、１００ｍｇの生検材料組織当たりに使用し、回転板上で３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、サンプルは、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、培地中に再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナを通過させる。本実施例において記載される手順に使用される培地は、以下の構成成分を補充したＣａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地ＥＧＭ−２基本培地とした：ｉ．１０％（容量／容量）ウシ胎児血清およびｉｉ．Ｃａｍｂｒｅｘ ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキット、これは、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、およびアスコルビン酸を含有する。次いで、ろ過した細胞溶液は、Ｔ２５培養フラスコに移し、５％ＣＯ２中で３７℃で３０〜１２０分間インキュベートした。このフラスコに付着する細胞は、「速やかに接着する細胞」とする。
【００７５】
インキュベーションの後に、細胞培養上清は、Ｔ２５フラスコから取り出し、１５ｍｌコニカルチューブの中に入れる。Ｔ２５培養フラスコは、２ｍｌの温めた培地を用いてすすぎ、前述の１５ｍｌのコニカルチューブに移す。１５ｍｌのコニカルチューブを遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、培地中に再懸濁し、新しいＴ２５培養フラスコに移入する。フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃で約２日間培養する（このフラスコに付着する細胞は「徐々に接着する細胞」とする）。インキュベーションの後に、細胞培養上清は、吸引し、新しい培地をフラスコに追加する。次いで、フラスコは、増大のためにインキュベーターに戻す。標準的な培養継代は、培養フラスコ中の細胞培養密度を５０％未満に維持するためにここから先、実行する。トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、継代の間にフラスコから接着細胞を剥離させるために使用する。「徐々に接着する細胞」の典型的な増大は、３７００万の細胞の平均全生細胞数を達成するのに平均１７日かかる（産生を開始する日から始めて）。
【００７６】
一旦、所望の細胞数が達成されれば、細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、フラスコから採取し、遠心分離する（２，５００ｘｇ、５分間）。ペレットは、ＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％容量／容量、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を補充したＨＢＳＳ）中に再懸濁し、数えた。次いで、細胞溶液は、再び遠心分離し（２，５００ｘｇ、５分間）、凍結保存培地（ヒト血清アルブミン（２％容量／容量、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））を用いて所望の細胞濃度まで再懸濁し、低温保存場所のために適切なバイアル中でパッケージにする。凍結バイアルは凍結容器の中に入れ、−８０℃フリーザー中に入れる。細胞は、等容量の生理的食塩水を用いて室温で凍結細胞懸濁液を解凍することによって投与し、直接注射する（追加の操作を伴わない）。徐々に接着する細胞集団の系統特徴づけは、筋原性（８７．４％ＣＤ５６＋、８９．２％デスミン＋）、内皮（０．０％ＣＤ３１＋）、造血（０．３％ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）を示す。
【００７７】
骨格筋生検材料組織を切り離した後で、細胞の２つの画分は、培養フラスコへのそれらの速やかなまたは遅い接着に基づいて収集した。次いで、細胞は、増殖培地を用いて培養において増やし、次いで、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の凍結保存培地（１５μｌ中、３×１０５細胞）中で凍結した。コントロール群については、１５μｌの凍結保存培地のみをチューブの中に入れた。これらのチューブは、注射まで−８０℃で保存した。注射の直前に、チューブは、保存場所から取り出し、室温で解凍し、１５μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を用いて再懸濁した。次いで、結果として生じる３０μｌ溶液は、３０ゲージ針を有する０．５ｃｃインスリン注射器の中に吸い込んだ。外科手術および注射を実行する調査者は、チューブの内容物を知らされていなかった。
【００７８】
細胞数および生存率は、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を使用して測定した。ＣＤ５６は、ＰＥ抱合抗ＣＤ５６抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ抱合アイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。デスミンは、モノクローナルデスミン抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）およびアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：２００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、パラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）上でフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。蛍光ラベル化はＣｙ３抱合抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）を使用して実行した。ステップの中間に、細胞は、透過処理緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイについては、１×１０５細胞は、分化誘発培地中で、１２ウェルプレートの中に、ウェル当たりで平板培養した。４〜６日後に、細胞は、トリプシン処理することによって採取し、遠心分離してペレットにした。細胞溶解上清は、ＣＫ Ｌｉｑｕｉ−ＵＶキット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を使用して、ＣＫ活性についてアッセイした。
【００７９】
（実施例３）
骨異常のマウス遺伝子改変ＭＤＣ治療
筋肉由来細胞の単離：
ＭＤＣは、実施例１において記載されるようにｍｄｘマウスから得た。
【００８０】
ＰＰ６筋肉由来前駆細胞のクローン単離：
ＰＰ６細胞集団からクローンを単離するために、ＰＰ６細胞は、ＬａｃＺ遺伝子、ミニジストロフィン遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するプラスミドを用いて形質移入した。手短に言えば、ｐＰＧＫ−ＮＥＯからのネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ断片は、ＬａｃＺ遺伝子を含有するｐＩＥＰｌａｃＺプラスミド中のＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ部位の中に挿入し、ｐＮＥＯｌａｃＺプラスミドを作り出した。短いバージョンのジストロフィン遺伝子を含有するＤｙｓＭ３からのＸｈｏＩ／Ｓａ／Ｉ断片（Ｋ．Ｙｕａｓａら、１９９８年、ＦＥＢＳ Ｌｅｆｔ．４２５：３２９ ３３６頁；Ｄｒ．Ｔａｋｅｄａ、Ｊａｐａｎからの寄贈）は、ｐＮＥＯｌａｃＺ中のＳａ／Ｉ 部位の中に挿入し、ミニジストロフィン遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有するプラスミドを生成した。プラスミドは、形質移入に先立って、Ｓａ／Ｉ消化によって直線化した。
【００８１】
ＰＰ６細胞は、メーカーの指示に従って、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ミニジストロフィン遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含有する１０μｇの線状プラスミドを用いて形質移入した。形質移入の７２時間後に、細胞は、分離コロニーが現われるまで、１０日間、３０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて選択した。次いで、コロニーは、単離し、大量の形質移入細胞を得るために増やし、次いで、ＬａｃＺの発現について試験した。これらのＰＰ６由来クローンの１つ、ｍｃ１３は、さらなる研究に使用した。
【００８２】
免疫組織化学的検査：
ＰＰ６、ｍｃ１３、およびマウス線維芽細胞は、６ウェル培養皿中で平板培養し、１分間、冷メタノールを用いて固定した。次いで、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、１時間、室温で、５％ウマ血清を用いてブロックした。一次抗体は、ＰＢＳ中で以下のように希釈した：抗デスミン（１：１００、Ｓｉｇｍａ）、ビオチン化抗マウスＣＤ３４（１：２００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：５００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＭ−カドヘリン（１：５０、Ｄｒ．Ａ．Ｗｅｒｎｉｇからの寄贈）、マウス抗マウスＭｙｏＤ（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ラットミオゲニン（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＦｌｋ−１（１：５０、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびビオチン化Ｓｃａ−１（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。細胞は、一晩、室温で、一次抗体を用いてインキュベートした。次いで、細胞は、洗浄し、室温で、１時間、適切なビオチン化二次抗体と共にインキュベートした。次に、細胞は、ＰＢＳを用いてすすぎ、次いで、１時間、Ｃｙ３蛍光色素と抱合した１／３００ストレプトアビジンと共に室温でインキュベートした。次いで、細胞は、蛍光顕微鏡によって分析した。それぞれのマーカーについて、染色された細胞の百分率は、細胞の１０のランダムに選んだ領域について計算した。
【００８３】
４週齢正常マウス（Ｃ−５７ ＢＬ／６Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の筋肉サンプルの凍結切片は、２分間、冷アセトンを用いて固定し、１時間、ＰＢ中で希釈した５％ウマ血清中でプレインキュベートした。ＣＤ３４、Ｂｃｌ−２、およびコラーゲンＩＶ型については、以下の一次抗体を使用した：ビオチン抗マウスＣＤ３４（ＰＢＳ中１：２００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ型（ＰＢＳ中１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。ジストロフィン染色については、ヒツジ抗ヒトＤＹ１０抗体（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）は、一次抗体として使用し、シグナルは、抗ヒツジビオチン（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ＰＢＳ中、１：２５０希釈）を使用して増幅した。
【００８４】
ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激、オステオカルシン染色、およびアルカリホスファターゼアッセイ：
細胞は、１２ウェルコラーゲンコーティングフラスコ中でウェル当たり１〜２×１０４細胞の密度で３回平板培養した。細胞は、増殖培地への、２００ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）の追加によって刺激した。増殖培地は、初期平板培養の後の１、３、および５日目に交換した。細胞のコントロール群は、追加のｒｈＢＭＰ−２なしで並行して増殖させた。ｒｈＢＭＰ−２刺激なしまたはありの６日後に、細胞は、マイクロサイトメーターを使用して数え、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼの発現について分析した。オステオカルシン染色については、細胞は、ヤギ抗マウスオステオカルシン抗体（ＰＢＳ中、１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共にインキュベートし、その後、Ｃｙ３蛍光色素と抱合した抗ヤギ抗体とのインキュベーションを続けた。アルカリホスファターゼ活性を測定するために、細胞溶解物は、調製し、ｐ−ニトロフェニルリン酸からの無機リン酸の加水分解による、試薬における色の変化を利用する、市販で入手可能なキットを使用して分析した（Ｓｉｇｍａ）。結果として生じる色の変化は、分光光度計上で測定し、データは、１０６細胞に対して標準化した、リットル当たりの国際単位ＡＬＰ活性として表わした。統計的有意差は、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）を使用して分析した。
【００８５】
筋原性系統および骨原性系統におけるｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化−−筋原性：
ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）は、ｍｄｘマウスの後肢筋肉中に筋肉内注射した。動物は、注射１５日後に屠殺し、注射した筋組織は、凍結し、凍結切片を作り、ジストロフィン（上記を参照されたい）およびＬａｃＺの発現についてアッセイした。ＬａｃＺ発現について試験するために、筋肉切片は、１％グルタルアルデヒドを用いて固定し、次いで、１〜３時間、Ｘ−ｇａｌ基質（リン酸緩衝食塩水中、０．４ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモクロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、および５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）と共にインキュベートした。切片は、分析に先立ってエオシンを用いて対比染色した。並行実験において、ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）は、ｍｄｘマウスの尾静脈中に静脈内注射した。動物は、注射７日後に屠殺し、後肢は、記載されるように、切り離し、ジストロフィンおよびβ−ガラクトシダーゼの存在についてアッセイした。
【００８６】
骨原性：
アデノウイルスＢＭＰ−２プラスミド（ａｄＢＭＰ−２）を構築するために、ｒｈＢＭＰ−２コード配列は、ＢＭＰ−２−１２５プラスミド（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）から切り取り、ＨｕＣＭＶプロモーターを含有する複製不完全（Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子欠失）アデノウイルスベクターの中にサブクローニングした。手短に言えば、ＢＭＰ−２−１２５プラスミドは、Ｓａ／Ｉを用いて消化し、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを含有する１２３７塩基対断片がもたらされた。次いで、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡは、ｐＡｄ．ｌｏｘプラスミドのＳａ／Ｉ部位の中に挿入し、これにより、この遺伝子を、ＨｕＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置した。組み換えアデノウイルスは、ＣＲＥＷ細胞の中への、ｐｓｉ−５ウイルスＤＮＡとのｐＡｄ．ｌｏｘの同時形質移入によって得た。結果として生じるａｄＢＭＰ−２プラスミドは、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【００８７】
ｍｃ１３細胞は、トリプシン処理し、感染に先立って、マイクロサイトメーターを使用して数えた。細胞は、数回、ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して洗浄し、５０感染効率ユニットに等価なアデノウイルス粒子は、ＨＢＳＳの中にあらかじめ混合し、次いで、細胞上に層にした。細胞は、４時間、３７℃でインキュベーションし、次いで、等容量の増殖培地と共にインキュベートした。０．５〜１．０×１０６細胞の注射は、ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の露出した下腿三頭筋の中にガスタイトシリンジの３０ゲージ針を使用して実行した。１４〜１５日目に、動物は、メトキシフルランを用いて麻酔をかけ、頚椎脱臼によって屠殺した。後肢は、放射線写真撮影によって分析した。次に、下腿三頭筋は、切り離し、リン酸緩衝食塩水中で緩衝した２−メチルブタン中で急速冷凍し、液体窒素中であらかじめ冷却した。凍結サンプルは、クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ、ＨＭ ５０５ Ｅ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５〜１０μｍ切片に切り、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
【００８８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。逆転写は、メーカーの指示に従って、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標） Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に使用して実行した。手短に言えば、１００ｎｇランダム六量体を、１０分間、７０℃で、１μｇ全ＲＮＡにアニールし、次いで、氷上で冷やした。逆転写は、２μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ、および２００Ｕ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を用いて実行した。反応混合物は、４２℃で、５０分間、インキュベートした。
【００８９】
標的のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、２μｌの逆転写酵素反応産物、１００μｌ（５Ｕ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０μｌ反応混合物中で実行した。ＣＤ３４ ＰＣＲプライマーは、Ｏｌｉｇｏソフトウェアを使用して設計し、以下の配列を有した。
【００９０】
【化１】
他のプライマーは、以前の研究に従って設計し（Ｊ．Ｒｏｈｗｅｄｅｌら、１９９５年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２０：９２ １００頁；Ｄ．Ｄ．Ｃｏｍｅｌｉｓｏｎら、１９９７年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９１：２７０ ２８３頁）、以下の配列を有した。
【００９１】
【化２】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した：１）９４℃、４５秒間；２）５０℃、６０秒間（ＣＤ３４）または６０℃、６０秒間（ミオゲニンおよびｃ−ｍｅｔについて）；ならびに３）７２℃、９０秒間、４０サイクル。ＰＣＲ産物は、アガロース−ＴＢＥ−臭化エチジウムゲルによって確認した。予想されるＰＣＲ産物のサイズは、ＣＤ３４について１４７ｂｐ、ミオゲニンについて８６ｂｐ、およびｃ−ｍｅｔについて３７０ｂｐである。ゲノムＤＮＡコンタミネーションの可能性を排除するために、２つのコントロール反応を済ませた：１）逆転写酵素の不在下における並行する逆転写および２）イントロンをまたぐプライマーセット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用するβ−アクチンの増幅。
【００９２】
頭蓋異常アッセイ：
３匹の６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、コントロール群および実験群において使用した。動物は、メトキシフルランを用いて麻酔をかけ、手術台上に腹臥で配置した。１０号刃を使用して、頭皮を解剖して、頭蓋を露出し、骨膜を取り除いた。約５ｍｍの全層円形頭蓋異常は、硬膜の貫通を最小限にして、歯科用バーを使用して作り出した。コラーゲンスポンジマトリックス（ＨＥＬＩＳＴＡＴ（商標）、Ｃｏｌｌａ−Ｔ ｃ、Ｉｎｃ．）に、ａｄＢＭＰ−２形質導入ありのまたはなしの０．５〜１．０×１０６ＭＤＣを接種し、頭蓋異常の中に配置した。頭皮は、４−０ナイロン縫合糸を使用して閉じ、動物は、えさを与え、活動させた。１４日後に、動物は、屠殺し、頭蓋標本は、顕微鏡で観察し、次いで、分析した。フォン コッサ染色のために、頭蓋標本は、４％ホルムアルデヒド中で固定し、次いで、１５分間、０．１Ｍ ＡｇＮＯ３溶液中に浸漬した。標本は、少なくとも１５分間、光に曝露し、ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、観察のために、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。
【００９３】
Ｙプローブを使用する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
凍結切片は、３：１メタノール／氷酢酸（容量：容量）中で１０分間固定し、風乾した。次いで、切片は、２分間、７０℃で、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸Ｎａ）ｐＨ７．０中で７０％ホルムアミド中で変性させた。次に、スライドは、それぞれの濃度で、２分間、一連のエタノール洗浄剤（７０％、８０％、および９５％）を用いて脱水した。Ｙ染色体特異的プローブ（Ｙ．Ｆａｎら、１９９６年、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９：８５３ ８６０頁）は、メーカーの指示に従って、ＢｉｏＮｉｃｋキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してビオチン化した。次いで、ビオチン化プローブは、Ｇ−５０ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して精製し、精製プローブは、５ｎｇ／ｍｌの超音波処理ニシン精子ＤＮＡと共に凍結乾燥した。ハイブリダイゼーションに先立って、プローブは、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、および１０％硫酸デキストランを含有する溶液中に再懸濁した。１０分間、７５℃での変性の後に、プローブは、変性切片上に配置し、３７℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後に、切片は、５分間、７２℃で、２×ＳＳＣ溶液ｐＨ７．０を用いてすすいだ。次いで、切片は、ＢＭＳ溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）中ですすいだ。ハイブリダイズプローブは、フルオレセインラベルアビジン（ＯＮＣＯＲ， Ｉｎｃ）を用いて検出した。核は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ， Ｉｎｃ）中で１０ｎｇ／ｍｌ臭化エチジウムを用いて対比染色した。
【００９４】
ｍｃ１３細胞のマーカー分析：
ｍｃ１３細胞、ＰＰ６細胞、および線維芽細胞によって発現される生化学的マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学的検査を使用して分析した。表２（下記）は、ｍｃ１３細胞が、Ｆｌｋ−１、幹細胞様の特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近、同定された、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウス相同体を発現したが（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、前掲）、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかったことを示す。しかしながら、本発明のＰＰ６ ＭＤＣに由来する他のクローン単離物は、ＣＤ３４および他のＰＰ６細胞マーカーを発現した。本明細書において記載される手順は、ＰＰ６筋肉由来前駆細胞集団をクローニングするためにおよび筋肉由来前駆細胞に特徴的な細胞マーカーを発現するクローン単離物を得るために使用することができることが当業者らによって十分に理解されるであろう。そのようなクローン単離物は、本発明の方法に従って使用することができる。たとえば、クローン単離物は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を含む前駆細胞マーカーを発現する。好ましくは、クローン単離物はまた、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１の細胞マーカーをも発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔの細胞マーカーを発現しない。
【００９５】
【表２】
細胞は、上記に記載されるように単離し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、０％の細胞が発現を示したことを示す；「＋」は、＞９８％の細胞が発現を示したことを示す；「＋／−は」、４０〜８０％の細胞が発現を示したことを示す；「−／＋」は、５〜３０％の細胞が発現を示したことを示す；および「ｎａ」は、データが入手可能ではないことを示す。
【００９６】
ＣＤ３４＋細胞およびＢｃｌ−２＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏ局在：
ＣＤ３４＋細胞およびＢｃｌ−２＋細胞の場所をｉｎ ｖｉｖｏで同定するために正常マウスの下腿三頭筋からの筋組織切片は、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｂｃｌ−２抗体を使用して染色した。ＣＤ３４陽性細胞はまた、デスミン（図１Ｂ）についても陽性であった、小さな集団の筋肉由来細胞（図１Ａ）を構成した。抗コラーゲンＩＶ型抗体を用いるＣＤ３４＋デスミン＋細胞の共染色により、基底膜内に、それらの場所を突き止めた（図１Ｂおよび１Ｄ）。図１Ａ〜Ｄにおける矢じりによって示されるように、微小血管もまたＣＤ３４およびコラーゲンＩＶ型について陽性であったが、核染色と共存しなかった。血管内皮細胞によるＣＤ３４の発現は、以前の研究において示された（Ｌ．Ｆｉｎａら、前掲）。Ｂｃｌ−２＋デスミン＋細胞は、同様に同定し（図１Ｅ〜１Ｈ）、基底膜内に場所を突き止めた（図１Ｆおよび１Ｈ）。切片はまた、衛星細胞の場所を同定するためにＭ−カドヘリンについても染色した（図１Ｉ）。衛星細胞は、ＣＤ３４＋デスミン＋細胞またはＢｃｌ−２＋デスミン＋細胞と類似した場所で同定した（矢印、図１Ｉ）。しかしながら、Ｍ−カドヘリンとＣＤ３４またはＢｃｌ−２を共存させるための複数の試みは、成功せず、Ｍ−カドヘリンを発現する細胞は、Ｂｃｌ−２またはＣＤ３４のいずれかを同時発現しないことを示唆する。これは、本明細書において開示されるように、高レベルのＣＤ３４およびＢｃｌ−２を発現するが、最小限のレベルのＭ−カドヘリンしか発現しないＰＰ６細胞と一致している。
【００９７】
骨原性系統へのクローン筋肉前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化：
ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激による骨原性分化能について評価した。細胞は、６ウェル培養皿上で平板培養し、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下または不在下においてある培養密度まで増殖させた。３４日以内に、ｒｈＢＭＰ−２に曝露したｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２なしの細胞と比較して、劇的な形態形成変化を示した。ｒｈＢＭＰ−２の不在下において、ｍｃ１３細胞は、融合し始め、多核筋管になった（図２Ａ）。しかしながら、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２に曝露した場合、細胞は、単核のままで、融合しなかった（図２Ｂ）。細胞密度が、＞９０％培養密度に達した場合、未処理培養物は、融合して、複数の筋管を形成したが（図２Ｃ）、処理細胞は、円形肥大型になった（図２Ｄ）。免疫組織化学的検査を使用して、これらの肥大型細胞は、オステオカルシンの発現について分析した。オステオカルシンは、骨芽細胞によって特異的に発現され、骨上に蓄積されるマトリックスタンパク質である。未処理群とは対照的に、ｒｈＢＭＰ−２処理肥大型の細胞は、オステオカルシンの有意な発現を示し（図２Ｅ）、したがって、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２への曝露に際して骨芽細胞に分化することができることを示唆した。
【００９８】
次いで、ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２刺激の後でデスミンの発現について分析した。新しく単離したｍｃ１３細胞は、一様なデスミン染色（図３Ａおよび３Ｂ）を示した。ｒｈＢＭＰ−２への曝露の６日内に、３０〜４０％のｍｃ１３細胞のみがデスミン染色を示した。ｒｈＢＭＰ−２刺激の不在下において、ｍｃ１３細胞の約９０〜１００％がデスミン染色（図３Ｃ）を示した。この結果は、ｒｈＢＭＰ−２を用いるｍｃ１３細胞の刺激がこれらの細胞についての筋原能の損失をもたらすことを示唆する。
【００９９】
さらに、ｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２刺激の後でアルカリホスファターゼの発現について分析した。アルカリホスファターゼは、骨芽細胞分化の生化学的マーカーとして使用されてきた（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：１７５５ １７６６頁）。図３Ｄにおいて示されるように、ｍｃ１３細胞のアルカリホスファターゼ発現は、ｒｈＢＭＰ−２に応じて、６００倍を超えて増加した。コントロールとして使用したＰＰ１ ４細胞は、ｒｈＢＭＰ−２に応じての、アルカリホスファターゼ活性の増加を示さなかった（図３Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰＰ６クローン単離物の細胞、たとえばｍｃ１３細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒｈＢＭＰ−２曝露に応じて、それらの筋原性マーカーを失い、骨原性系統を通して分化することを実証する。
【０１００】
筋原性系統および骨原性系統へのｍｃ１３細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化：
ｍｃ１３細胞が、筋原性系統を通してｉｎ ｖｉｖｏで分化することができるかどうかを決定するために、細胞は、ｍｄｘマウスの後肢筋組織に注射した。動物は、注射の１５日後に屠殺し、それらの後肢は、組織学的分析および免疫組織化学分析のために採取した。いくつかの筋線維は、注射部位を取り囲む領域において、ＬａｃＺ染色およびジストロフィン染色を示し（図４Ａおよび４Ｂ）、ｍｃ１３細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、筋原性系統を通して分化することができ、筋肉再生を増強することができ、ジストロフィー筋においてジストロフィンを回復させることができることを示した。
【０１０１】
並行実験において、ｍｃ１３細胞は、ｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物は、注射７日後に屠殺し、後肢筋肉は、組織学的分析および免疫組織化学分析のために採取した。いくつかの後肢筋細胞は、ＬａｃＺ染色およびジストロフィン染色を示し（図４Ｃおよび４Ｄ；「＊」もまた参照されたい）、ジストロフィン発現を取り戻すために標的組織にｍｃ１３細胞を全身的に送達することができることを示唆した。
【０１０２】
ｍｃ１３細胞の多能性の特徴をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、細胞は、ｒｈＢＭＰ−２（ａｄＢＭＰ−２）をコードするアデノウイルスベクターを用いて形質導入した。次いで、ａｄＢＭＰ−２を有するｍｃ１３細胞は、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。動物は、注射１４日後に屠殺し、後肢は、組織化学的分析および免疫化学的分析のために取り出した。ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入したｍｃ１３細胞の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析は、感染細胞がｒｈＢＭＰ−２を産生することができることを示した。注射したＳＣＩＤマウスの後肢の放射線分析は、注射の１４日以内に強い異所性骨形成を示した（図４Ｅ）。異所性の骨のＬａｃＺ染色を使用する組織学的分析は、ＬａｃＺ陽性ｍｃ１３細胞が、骨芽細胞および骨細胞が見つけられる典型的な場所である石灰化マトリックスまたは骨小腔内に一様に位置することを示す（図４Ｆ）。
【０１０３】
異所性の骨の形成におけるｍｃ１３の役割をさらに確認するために、筋肉切片はまた、ジストロフィンの存在についても染色した。図４Ｇにおいて示されるように、異所性の骨は、ジストロフィンについて高度に陽性の細胞を含有し、ｍｃ１３細胞が骨形成において密接に関係していることを示唆した。コントロールとして、類似した実験を、線維芽細胞を用いて実行した。線維芽細胞は強い異所性骨形成を支持することが分かったが、注射した細胞は、骨の外側に一様に見つけられ、どれも、石灰化マトリックス内に位置し得なかった。これは、線維芽細胞が、異所性の骨を形成するために、ｒｈＢＭＰ−２を送達することができるが、骨芽細胞に分化することができないことを示唆する。この場合、異所性の骨の石灰化に関係する細胞は、宿主組織に由来する可能性が高い。したがって、これらの結果は、ｍｃ１３細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で骨芽細胞に分化することができることを実証する。
【０１０４】
遺伝子操作された筋肉由来細胞による骨治癒の増強：
頭蓋異常（約５ｍｍ）は、上記に記載されるように、歯科用バーを使用して、骨格成熟（６〜８週齢）雌ＳＣＩＤマウスにおいて作り出した。以前の実験は、５ｍｍの頭蓋異常が「非治癒性である」ことを実証した（Ｐ．Ｈ．Ｋｒｅｂｓｂａｃｈら、１９９８年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６６：１２７２〜１２７８頁）。頭蓋異常は、ａｄＢＭＰ−２を用いて形質導入したまたは形質導入していないｍｃ１３細胞を接種したコラーゲンスポンジマトリックスを用いて埋めた。これらのマウスは、１４日目に屠殺し、頭蓋異常の治癒を分析した。図５Ａにおいて示されるように、ｒｈＢＭＰ−２を有していないｍｃ１３細胞を用いて治療したコントロール群は、異常の治癒の証拠を示さなかった。対照的に、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞を用いて治療した実験群は、２週目に頭蓋異常の十分な閉鎖をほぼ示した（図５Ｂ）。石灰化骨を目立たせるフォン コッサ染色は、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞を用いて治療した群における強い骨形成を示した（図５Ｄ）が、最小限の骨形成が、コントロール群において観察された（図５Ｃ）。
【０１０５】
実験群における新しい骨のエリアは、移植細胞を同定するためのＹ染色体特異的プローブを用いて、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。図５Ｅにおいて示されるように、Ｙ染色体陽性細胞は、新しく形成された骨内に同定され、ｒｈＢＭＰ−２の影響下での骨形成における移植細胞の能動的な関係を示した。Ｙ染色体陰性細胞もまた、新しく形成された頭蓋内に同定され、したがって、同様に宿主由来細胞の能動的な関係を示した。これらの結果は、ｍｃ１３細胞が、ｒｈＢＭＰ−２を用いる刺激に際して、「非治癒性の」骨異常の治癒を媒介することができることを実証し、本発明のＭＤＣが、骨の異常、傷害、または外傷の治療において使用することができることを示す。
【０１０６】
（実施例４）
ＭＤＣの投与を通しての、ヒト組織における骨密度および骨容量の増加
本研究において、軟骨形成を受けるように前駆細胞を誘発するために一般に使用される細胞ペレットを含む三次元（３Ｄ）培養系（Ｙｏｏら、ＪＢＪＳ、１９９８年、８０（１２）：１７４５〜１７５７頁）は、ｈＭＤＣが石灰化を受ける能力を評価するために使用した。マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）分析を使用すると、発明者らは、長い間にわたって同じペレットを観察することができ、試験したそれぞれの細胞集団について石灰化の速度を決定することができた。下記のデータは、本研究におけるすべてのｈＭＤＣが、石灰化することができ、ほぼ、培養の７日目までに石灰化することができたことを示す。さらに、ｈＭＤＣは、コラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）のそれらの発現を増加し、主なコラーゲンは骨中に見つかり、骨原性の分化を示唆した。マウス筋細胞とは異なり、ｈＭＤＣは、石灰化を受けるためにＢＭＰ刺激を必要とせず、骨原性の刺激に先立って、アルカリホスファターゼについて陽性であった。細胞は、ドナーの間で、ＣＤ５６発現において変化した（ＣＤ５６＋の範囲、４匹の雌集団＝４２％〜８２％および４匹の雄集団＝５５％〜９０％）。そのうえ、この骨原性アッセイは、ＣＤ５６発現が低いｈＭＤＣが、より高いレベルを発現するｈＭＤＣほど速く石灰化しなかったことを示し、ＣＤ５６が、ｈＭＤＣの骨原能についてのマーカーである可能性があることを示した。
【０１０７】
４人のヒト女性（年齢２２、２４、２４、２５）および４人のヒト男性（年齢２０、２６、２８、３０）から採取した小さな骨格筋生検材料において、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）集団（「徐々に接着する細胞」）は、実施例２において記載される単一平板法に従って、後期の前平板培養物から収集した。刺激に先立って、細胞は、実施例２において記載されるように培養した。次いで、細胞は、２８日間、骨原性培地（ＯＳＭ）（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸−２−リン酸、および１０−２Ｍ β−グリセロリン酸を補充したＤＭＥＭ）（集団当たりｎ＝６ペレット）中でペレット（２５０，０００細胞／ペレット）として誘発した。ペレットの骨容量および骨密度は、骨容量（ＢＶ）および骨密度（ＢＤ）について７、１４、２１、および２８日目にμＣＴ分析によって測定した。コラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）についての遺伝子発現は、ペレットを作製した日（０日目）およびＯＳＭ中での２８日後（２８日目）に単離したＲＮＡについての定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。統計分析は、それぞれの性別内で、０から２８日目の間で、ＢＶおよびＢＤについては二元配置ＡＮＯＶＡならびに遺伝子発現についてはｔ検定を使用して実行した。Ｐ値＜０．０５は有意であると見なした。このデータは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６集団／性別）を示す図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂにおいて示す。
【０１０８】
ｈＭＤＣはすべて、ペレットを形成し、石灰化は、早くも７日目にほとんどの集団において明らかであった。ＣＤ５６の最低の百分率を有する女性および男性の細胞集団は、培養の１４日後にようやく石灰化組織を示し始めた。試験したすべての細胞集団における長い間にわたる平均のＢＶおよびＢＤは、それぞれ、図６Ａおよび６Ｂにおいて示す。ＢＶの有意な増加は、男性ｈＭＤＣにおいて７から２８日の間に観察された。女性ｈＭＤＣの場合において、ペレットのＢＶは、１４から２１日の間に有意に増加した。女性および男性のｈＭＤＣ集団におけるＢＤは、７日ごとに増加した。２１および２８日目にスキャンしたペレットは、７および１４日目にスキャンしたペレットよりも密な石灰化を有した。性別に関する差異は、ＢＶおよびＢＤの両方について試験したすべての時点で観察されなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの発見は、ｈＭＤＣが石灰化骨組織を産生することができることを示唆する。
【０１０９】
骨芽細胞遺伝子マーカーであり、骨中に見つけられるコラーゲンであるコラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）は、骨原性ペレット培養系を使用する場合にｈＭＤＣが骨芽細胞に分化するかどうかを決定するために測定した。ＣｏｌＩ遺伝子発現は、ＯＳＭ中での２８日間の培養の後に男性および女性のｈＭＤＣの両方において有意に増加した（図７）。したがって、このデータは、骨芽細胞に分化した可能性のあるＭＤＣと一致している遺伝子発現を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３−１Ａ】
【図３−１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の疾患、異常、または病態を治療する方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）１０℃よりも低い温度まで該細胞を冷却し、該細胞を１〜７日間保存するステップと、
（ｃ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｄ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｅ）該培地中の残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｆ）該第２の細胞培養容器の該壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、
（ｇ）該細胞を培養してその数を拡大するステップと、
（ｈ）−３０℃未満の温度まで該ＭＤＣを凍結するステップと、
（ｉ）該ＭＤＣを解凍し、該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、治療を必要とする該哺乳動物対象において、骨の異常、疾患、または病態を治療する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨の異常、疾患、または病態が前記ヒト対象において始まる前に、前記ヒト骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨の異常、疾患、または病態が前記ヒト対象において始まった後に、前記ヒト骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨の異常、疾患、または病態が骨異常である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨異常が、外傷によって引き起こされる骨折である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物対象における骨量または骨密度を増大させる方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）１０℃よりも低い温度まで該細胞を冷却し、該細胞を１〜７日間保存するステップと、
（ｃ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｄ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｅ）該培地中の該残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｆ）該第２の細胞培養容器の該壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、
（ｇ）該細胞を培養してその数を拡大するステップと、
（ｈ）−３０℃未満の温度まで該ＭＤＣを凍結するステップと、
（ｉ）該ＭＤＣを解凍し、該哺乳動物対象において増大される骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、該哺乳動物対象における骨量または骨密度を増大させる方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト骨格筋細胞が前記ヒト対象から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨増大が、骨量または骨密度を、前記対象の平均骨量または骨密度を超える量または密度まで増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｃ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｄ）該培地中の残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｅ）該第２の細胞培養容器の該壁から、ＭＤＣである細胞を単離するステップと、
（ｆ）該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法。
【請求項１６】
前記症状が、骨密度の減少および骨量の減少からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物対象の前記骨の異常、疾患、または病態に罹患している前記骨に投与する前に、前記ＭＤＣを培養してその数を拡大する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の疾患、骨異常、または病態を治療する方法であって、
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、哺乳動物骨格筋組織由来の該骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、
（ｂ）１５〜２０％の細胞が該第１の容器に接着した後で、第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、治療を必要とする哺乳動物対象において尿路疾患を治療する方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記骨の疾患、異常、または病態が前記ヒト対象において始まる前に、前記骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨の疾患、異常、または病態が前記ヒト対象において始まった後に、前記骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨の異常、疾患、または病態が骨異常である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨異常が、外傷によって引き起こされる骨折である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法であって、
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、骨格筋組織由来の該骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、
（ｂ）１５〜２０％の細胞が該第１の容器に接着した後で、第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、該哺乳動物対象の、該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、改善を必要とする該哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法。
【請求項３０】
前記症状が、骨密度の減少および骨量の減少からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物対象の前記骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に投与する前に、前記ＭＤＣを培養してその数を拡大する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の異常、疾患、または病態を治療する方法であって、該哺乳動物対象の、該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を投与するステップを含み、ＭＤＣを含有する該細胞集団が、
（ａ）第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を該容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で該容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、
（ｂ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に該培地および該第２の細胞集団を移すステップと、
（ｃ）該第２の細胞集団の細胞を該第２の細胞培養容器に付着させるステップと、
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、ＭＤＣを含有する該細胞集団を得るステップと
を含むプロセスによって得られたものである、方法。
【請求項３６】
哺乳動物対象における骨の異常、疾患、または病態を治療するための投与に有用な、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を調製するための方法であって、
（ａ）第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を該容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で該容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、
（ｂ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に該培地および該第２の細胞集団を移すステップと、
（ｃ）該第２の細胞集団の細胞を該第２の細胞培養容器に付着させるステップと、
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、ＭＤＣを含有する該細胞集団を得るステップと
を含む、方法。
【請求項１】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の疾患、異常、または病態を治療する方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）１０℃よりも低い温度まで該細胞を冷却し、該細胞を１〜７日間保存するステップと、
（ｃ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｄ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｅ）該培地中の残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｆ）該第２の細胞培養容器の該壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、
（ｇ）該細胞を培養してその数を拡大するステップと、
（ｈ）−３０℃未満の温度まで該ＭＤＣを凍結するステップと、
（ｉ）該ＭＤＣを解凍し、該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、治療を必要とする該哺乳動物対象において、骨の異常、疾患、または病態を治療する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨の異常、疾患、または病態が前記ヒト対象において始まる前に、前記ヒト骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨の異常、疾患、または病態が前記ヒト対象において始まった後に、前記ヒト骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨の異常、疾患、または病態が骨異常である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨異常が、外傷によって引き起こされる骨折である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物対象における骨量または骨密度を増大させる方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）１０℃よりも低い温度まで該細胞を冷却し、該細胞を１〜７日間保存するステップと、
（ｃ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｄ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｅ）該培地中の該残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｆ）該第２の細胞培養容器の該壁から、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）である細胞を単離するステップと、
（ｇ）該細胞を培養してその数を拡大するステップと、
（ｈ）−３０℃未満の温度まで該ＭＤＣを凍結するステップと、
（ｉ）該ＭＤＣを解凍し、該哺乳動物対象において増大される骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、該哺乳動物対象における骨量または骨密度を増大させる方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト骨格筋細胞が前記ヒト対象から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨増大が、骨量または骨密度を、前記対象の平均骨量または骨密度を超える量または密度まで増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法であって、
（ａ）哺乳動物から骨格筋細胞を単離するステップと、
（ｂ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中で該哺乳動物骨格筋細胞を懸濁するステップと、
（ｃ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に培地をデカントするステップと、
（ｄ）該培地中の残存細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させるステップと、
（ｅ）該第２の細胞培養容器の該壁から、ＭＤＣである細胞を単離するステップと、
（ｆ）該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法。
【請求項１６】
前記症状が、骨密度の減少および骨量の減少からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物対象の前記骨の異常、疾患、または病態に罹患している前記骨に投与する前に、前記ＭＤＣを培養してその数を拡大する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の疾患、骨異常、または病態を治療する方法であって、
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、哺乳動物骨格筋組織由来の該骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、
（ｂ）１５〜２０％の細胞が該第１の容器に接着した後で、第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、該哺乳動物対象の該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、治療を必要とする哺乳動物対象において尿路疾患を治療する方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記骨の疾患、異常、または病態が前記ヒト対象において始まる前に、前記骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨の疾患、異常、または病態が前記ヒト対象において始まった後に、前記骨格筋細胞が該ヒト対象から単離される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨の異常、疾患、または病態が骨異常である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨異常が、外傷によって引き起こされる骨折である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
改善を必要とする哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法であって、
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で、骨格筋組織由来の該骨格筋細胞の懸濁液を平板培養するステップと、
（ｂ）１５〜２０％の細胞が該第１の容器に接着した後で、第２の容器中でステップ（ａ）の非接着細胞を再度平板培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返すステップと、
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、該哺乳動物対象の、該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に該ＭＤＣを投与するステップと
を含み、
それによって、改善を必要とする該哺乳動物対象において、骨の疾患、異常、または病態と関連する少なくとも１つの症状を改善する方法。
【請求項３０】
前記症状が、骨密度の減少および骨量の減少からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＤＣが、前記骨の表面上に注射することによって投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＤＣが、前記骨の内部に注射される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物対象の前記骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に投与する前に、前記ＭＤＣを培養してその数を拡大する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
治療を必要とする哺乳動物対象において骨の異常、疾患、または病態を治療する方法であって、該哺乳動物対象の、該骨の異常、疾患、または病態に罹患している骨に、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を投与するステップを含み、ＭＤＣを含有する該細胞集団が、
（ａ）第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を該容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で該容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、
（ｂ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に該培地および該第２の細胞集団を移すステップと、
（ｃ）該第２の細胞集団の細胞を該第２の細胞培養容器に付着させるステップと、
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、ＭＤＣを含有する該細胞集団を得るステップと
を含むプロセスによって得られたものである、方法。
【請求項３６】
哺乳動物対象における骨の異常、疾患、または病態を治療するための投与に有用な、筋肉由来細胞（ＭＤＣ）を含有する細胞集団を調製するための方法であって、
（ａ）第１の細胞培養容器中で、哺乳動物骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞集団を該容器に接着させ、第２の細胞集団を非接着の状態で該容器中の培地中に残すのに十分な期間懸濁するステップと、
（ｂ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器に該培地および該第２の細胞集団を移すステップと、
（ｃ）該第２の細胞集団の細胞を該第２の細胞培養容器に付着させるステップと、
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、ＭＤＣを含有する該細胞集団を得るステップと
を含む、方法。
【図３−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２９０１７（Ｐ２０１０−５２９０１７Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０３２９（Ｐ２０１０−５１０３２９）
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３８１３
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３８１３
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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