筋重量を増加させるためのフォリスタチンの使用方法
【課題】GDF-8（ミオスタチン）受容体を含む実質的に精製された増殖分化因子（GDF）受容体と共にその機能的ペプチド部分を提供する。
【解決手段】GDF受容体またはその機能的ペプチド部分の仮想表示。細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節する方法。被験者の筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、被験者における筋または脂肪組織の異常な量、発達、または代謝活性を少なくとも部分的に特徴とする病態の重症度を改善する方法。ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を生物に投与することによって、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法。
【解決手段】GDF受容体またはその機能的ペプチド部分の仮想表示。細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節する方法。被験者の筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、被験者における筋または脂肪組織の異常な量、発達、または代謝活性を少なくとも部分的に特徴とする病態の重症度を改善する方法。ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を生物に投与することによって、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して切断型アクチビンII型受容体レベルの上昇と、動物における筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、切断型アクチビンII型受容体遺伝子と筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
アクチビンII型受容体がRIIAまたはRIIBである、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
切断型アクチビンRIIB受容体がキナーゼ活性を欠損する、請求項3記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
切断型アクチビンRIIB受容体がアクチビンRIIBのアミノ酸残基1〜174位を含む、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して、動物におけるミオスタチンプロドメインレベルの上昇と筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、ミオスタチンプロドメインと筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項７】
ミオスタチンプロドメインが、配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、および20、またはミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分からなる群より選択されるプロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約1〜262位を含む、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
ミオスタチンプロドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載のトランスジェニック動物：
配列番号：4に記載のアミノ酸残基約20〜263位；
配列番号：2に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：10に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：12に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：8に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：6に記載のアミノ酸残基約20〜263位；
配列番号：18に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：14に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：16に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：20に記載のアミノ酸残基約20〜262位；および
その機能的ペプチド部分。
【請求項９】
ミオスタチンプロドメインがミオスタチンシグナルペプチドをさらに含む、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して、動物におけるフォリスタチンレベルの上昇と筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、フォリスタチン遺伝子と筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項11記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
筋特異的制御配列に機能的に結合した切断型アクチビンRIIB受容体遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１４】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項13記載の発現カセット。
【請求項１５】
筋特異的制御配列に機能的に結合したミオスタチンプロドメイン遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１６】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項15記載の発現カセット。
【請求項１７】
筋特異的制御配列に機能的に結合したフォリスタチン遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１８】
筋特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項17記載の発現カセット。
【請求項１９】
発現カセットが動物のゲノムに組み入れられ、カセットが、動物におけるフォリスタチンレベルが上昇して、その結果、対応する非トランスジェニック動物と比較してトランスジェニック動物における筋重量の増加が起こるように発現される、トランスジェニック動物の細胞において、請求項17記載の発現カセットを発現させることを含む、トランスジェニック動物においてフォリスタチンを組織特異的に発現させる方法。
【請求項２０】
細胞が、切断型アクチビンII型受容体、ミオスタチンプロドメイン、またはフォリスタチンをそれぞれ発現する、請求項1、6、または11のいずれか一項に記載の動物から単離した細胞または細胞株。
【請求項２１】
ミオスタチンをフォリスタチンに接触させて、それによって受容体との結合を阻害することを含む、アクチビンII型受容体に対するミオスタチン結合を阻害する方法。
【請求項２２】
結合の阻害がミオスタチンのC-末端を通して行われる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
アクチビン受容体がAct RIIAまたはAct RIIBである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
筋細胞におけるDNA構築物の発現によって動物の筋重量の増加が起こる、そのゲノムが、筋細胞における発現にとって有効な内因性フォリスタチン遺伝子に対して異種のプロモーターに機能的に結合したフォリスタチン蛋白質をコードするDNAセグメントを含むDNA構築物を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
DNA構築物が動物の祖先に導入されている、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２６】
DNA構築物が胚の段階で動物または該動物の祖先に導入される、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２７】
フォリスタチン蛋白質が、野生型と比較してフォリスタチン蛋白質の切断型、変異型、または他の変種型である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２８】
DNA構築物が、フォリスタチン蛋白質をコードするDNAセグメントを含むMDAF2発現プラスミドに存在する、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２９】
動物が哺乳類である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３０】
哺乳類がマウスである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３１】
哺乳類がブタである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３２】
哺乳類がウシである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３３】
動物がトリ種である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３４】
トリ種がニワトリまたは七面鳥である、請求項33記載のヒト以外の動物。
【請求項３５】
動物が水生種である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３６】
水生種が魚である、請求項35記載のヒト以外の動物。
【請求項３７】
魚が、サケ、マス、チャー、アユ、コイ、ヨーロッパフナ、キンギョ、ウグイ、シラス、ウナギ、アナゴ、コイワシ、ゼブラフィッシュ、トビウオ、ハタ科の魚、タイ科の魚、パロットバス、フエダイ、サバ、クロマグロ、マグロ、ハガツオ、黄色の尾をもつ魚、岩間の魚、フルーク、ソール、ヒラメ、フグ、またはモンガラカワハギである、請求項36記載のヒト以外の動物。
【請求項３８】
水生種が、ハマグリ、コックル、イガイ、タマキビガイ、ホタテ貝、ホラガイ、マキガイ、ナマコ、アークシェル、カキ、リュウテンサザエ科の貝、アワビ、ロブスター、クルマエビ、エビ、カニ、シャコ、クリール、ランゴスチノ、イセエビ/ザリガニ、環形動物、ワニ、カメ、カエル、またはウニである、請求項35記載のヒト以外の動物。
【請求項３９】
動物がヒツジである、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項４０】
以下を含む、ヒト以外のキメラ動物を作製する方法：
動物の卵巣から卵子を得る段階；
インビトロで卵子を成熟させる段階；
インビトロで成熟した卵子を受精させて受精卵を形成する段階；
切断型アクチビンII型受容体、ミオスタチンプロペプチド、またはフォリスタチンをコードするDNA配列と、ポリペプチドをコードするDNA配列の発現を促進する制御配列とを機能的に結合させて含む核酸構築物を、インビトロで受精卵に導入する段階；
受精卵を着床前段階の胚までインビトロで成熟させる段階；および
雌性動物が胚を妊娠してキメラ動物を産む、レシピエント雌性動物に胚を移植する段階。
【請求項４１】
以下を含む、筋重量が増加した動物の食糧を作製する方法：
a）動物の前核胚の生殖細胞に、フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を導入する段階；
b）偽妊娠雌性動物の卵管に胚を着床させて、それによって胚を妊娠満期まで成熟させる段階；
c）導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階；
d）さらなる導入遺伝子陽性子孫を同定するために、導入遺伝子陽性子孫を交配させる段階；および
e）子孫を加工して食糧を得る段階。
【請求項４２】
以下を含む、筋重量が増加したトリ、ブタ、魚、またはウシの食品を作製する方法：
a）フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を、トリ、ブタ、魚、またはウシ動物の胚に導入する段階；
b）子孫が孵化する条件で胚を培養する段階；
c）導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階；
d）導入遺伝子陽性子孫を交配する段階；および
e）子孫を加工して食糧を得る段階。
【請求項１】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して切断型アクチビンII型受容体レベルの上昇と、動物における筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、切断型アクチビンII型受容体遺伝子と筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
アクチビンII型受容体がRIIAまたはRIIBである、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
切断型アクチビンRIIB受容体がキナーゼ活性を欠損する、請求項3記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
切断型アクチビンRIIB受容体がアクチビンRIIBのアミノ酸残基1〜174位を含む、請求項1記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して、動物におけるミオスタチンプロドメインレベルの上昇と筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、ミオスタチンプロドメインと筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項７】
ミオスタチンプロドメインが、配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、および20、またはミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分からなる群より選択されるプロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約1〜262位を含む、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
ミオスタチンプロドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載のトランスジェニック動物：
配列番号：4に記載のアミノ酸残基約20〜263位；
配列番号：2に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：10に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：12に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：8に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：6に記載のアミノ酸残基約20〜263位；
配列番号：18に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：14に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：16に記載のアミノ酸残基約20〜262位；
配列番号：20に記載のアミノ酸残基約20〜262位；および
その機能的ペプチド部分。
【請求項９】
ミオスタチンプロドメインがミオスタチンシグナルペプチドをさらに含む、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項6記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
核酸配列が、対応する非トランスジェニック動物と比較して、動物におけるフォリスタチンレベルの上昇と筋重量の増加とが起こるように発現される、そのゲノムが、機能的に結合して動物のゲノムに組み入れられる、フォリスタチン遺伝子と筋特異的プロモーターとを含む核酸配列を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項11記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
筋特異的制御配列に機能的に結合した切断型アクチビンRIIB受容体遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１４】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項13記載の発現カセット。
【請求項１５】
筋特異的制御配列に機能的に結合したミオスタチンプロドメイン遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１６】
筋特異的プロモーターがミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項15記載の発現カセット。
【請求項１７】
筋特異的制御配列に機能的に結合したフォリスタチン遺伝子をコードするDNAセグメントを含む発現カセット。
【請求項１８】
筋特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーである、請求項17記載の発現カセット。
【請求項１９】
発現カセットが動物のゲノムに組み入れられ、カセットが、動物におけるフォリスタチンレベルが上昇して、その結果、対応する非トランスジェニック動物と比較してトランスジェニック動物における筋重量の増加が起こるように発現される、トランスジェニック動物の細胞において、請求項17記載の発現カセットを発現させることを含む、トランスジェニック動物においてフォリスタチンを組織特異的に発現させる方法。
【請求項２０】
細胞が、切断型アクチビンII型受容体、ミオスタチンプロドメイン、またはフォリスタチンをそれぞれ発現する、請求項1、6、または11のいずれか一項に記載の動物から単離した細胞または細胞株。
【請求項２１】
ミオスタチンをフォリスタチンに接触させて、それによって受容体との結合を阻害することを含む、アクチビンII型受容体に対するミオスタチン結合を阻害する方法。
【請求項２２】
結合の阻害がミオスタチンのC-末端を通して行われる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
アクチビン受容体がAct RIIAまたはAct RIIBである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
筋細胞におけるDNA構築物の発現によって動物の筋重量の増加が起こる、そのゲノムが、筋細胞における発現にとって有効な内因性フォリスタチン遺伝子に対して異種のプロモーターに機能的に結合したフォリスタチン蛋白質をコードするDNAセグメントを含むDNA構築物を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
DNA構築物が動物の祖先に導入されている、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２６】
DNA構築物が胚の段階で動物または該動物の祖先に導入される、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２７】
フォリスタチン蛋白質が、野生型と比較してフォリスタチン蛋白質の切断型、変異型、または他の変種型である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２８】
DNA構築物が、フォリスタチン蛋白質をコードするDNAセグメントを含むMDAF2発現プラスミドに存在する、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項２９】
動物が哺乳類である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３０】
哺乳類がマウスである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３１】
哺乳類がブタである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３２】
哺乳類がウシである、請求項29記載のヒト以外の動物。
【請求項３３】
動物がトリ種である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３４】
トリ種がニワトリまたは七面鳥である、請求項33記載のヒト以外の動物。
【請求項３５】
動物が水生種である、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項３６】
水生種が魚である、請求項35記載のヒト以外の動物。
【請求項３７】
魚が、サケ、マス、チャー、アユ、コイ、ヨーロッパフナ、キンギョ、ウグイ、シラス、ウナギ、アナゴ、コイワシ、ゼブラフィッシュ、トビウオ、ハタ科の魚、タイ科の魚、パロットバス、フエダイ、サバ、クロマグロ、マグロ、ハガツオ、黄色の尾をもつ魚、岩間の魚、フルーク、ソール、ヒラメ、フグ、またはモンガラカワハギである、請求項36記載のヒト以外の動物。
【請求項３８】
水生種が、ハマグリ、コックル、イガイ、タマキビガイ、ホタテ貝、ホラガイ、マキガイ、ナマコ、アークシェル、カキ、リュウテンサザエ科の貝、アワビ、ロブスター、クルマエビ、エビ、カニ、シャコ、クリール、ランゴスチノ、イセエビ/ザリガニ、環形動物、ワニ、カメ、カエル、またはウニである、請求項35記載のヒト以外の動物。
【請求項３９】
動物がヒツジである、請求項24記載のヒト以外の動物。
【請求項４０】
以下を含む、ヒト以外のキメラ動物を作製する方法：
動物の卵巣から卵子を得る段階；
インビトロで卵子を成熟させる段階；
インビトロで成熟した卵子を受精させて受精卵を形成する段階；
切断型アクチビンII型受容体、ミオスタチンプロペプチド、またはフォリスタチンをコードするDNA配列と、ポリペプチドをコードするDNA配列の発現を促進する制御配列とを機能的に結合させて含む核酸構築物を、インビトロで受精卵に導入する段階；
受精卵を着床前段階の胚までインビトロで成熟させる段階；および
雌性動物が胚を妊娠してキメラ動物を産む、レシピエント雌性動物に胚を移植する段階。
【請求項４１】
以下を含む、筋重量が増加した動物の食糧を作製する方法：
a）動物の前核胚の生殖細胞に、フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を導入する段階；
b）偽妊娠雌性動物の卵管に胚を着床させて、それによって胚を妊娠満期まで成熟させる段階；
c）導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階；
d）さらなる導入遺伝子陽性子孫を同定するために、導入遺伝子陽性子孫を交配させる段階；および
e）子孫を加工して食糧を得る段階。
【請求項４２】
以下を含む、筋重量が増加したトリ、ブタ、魚、またはウシの食品を作製する方法：
a）フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を、トリ、ブタ、魚、またはウシ動物の胚に導入する段階；
b）子孫が孵化する条件で胚を培養する段階；
c）導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階；
d）導入遺伝子陽性子孫を交配する段階；および
e）子孫を加工して食糧を得る段階。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−１】
【図２−２】
【公開番号】特開２００９−１５９９５１（Ｐ２００９−１５９９５１Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９８１１９（Ｐ２００８−２９８１１９）
【出願日】平成２０年１１月２１日（２００８．１１．２１）
【分割の表示】特願２００８−１１６２２４（Ｐ２００８−１１６２２４）の分割
【原出願日】平成１４年４月２４日（２００２．４．２４）
【出願人】（５０３３９２８５１）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２１日（２００８．１１．２１）
【分割の表示】特願２００８−１１６２２４（Ｐ２００８−１１６２２４）の分割
【原出願日】平成１４年４月２４日（２００２．４．２４）
【出願人】（５０３３９２８５１）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (7)
【Ｆターム（参考）】
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