粒子を含有する液体を体外処理するための再生可能なフィルター及びその使用
本発明は、膜濾過の特徴と、粒子により支持される吸着の特徴とが閉鎖されたケーシング中で統合された、濾過又は吸着の再生可能なシステムに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子を含有する液体を体外処理するための再生可能なフィルター及びその適用に関する。本発明の使用分野は医学、特に直接血液処理である。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療を支援する影響の他に、今世紀以来、薬理作用物質が投与されている。治療的影響の他の方法は、血液から有害物質を体外血液処理により除去することである。この開発の出発点は古典的な瀉血であり、この瀉血は２０００年以上の間、所定の疾患に対する標準的治療であった。新規材料及び新規技術、並びに血液型研究の知識は、５０年以上前に血液透析を臨床的な適用に導入することを可能にし、血液交換療法が生じ、この療法は後に血漿交換療法に置き換えられた。僅かな特異性、高いコスト及び感染の危険性が、この血漿交換療法を制限している。
【０００３】
血液濾過、血液透析濾過、二重濾過及び血漿吸着は、体外治療法（又は治療的アフェレーシス）の適用において画期的な事件であった。血漿吸着を用いて、初めて血液からアルブミンよりも大きな物質を除去することができた。流動する血液又は血漿中の高分子量の物質を結合するために、非特異的又は特異的因子が利用される。
【０００４】
マトリックスと血液成分との間の静電気的又は疎水性の相互作用により、今日では日常的に、ＬＤＬ、ベータ２−ミクログロブリン、エンドトキシン、免疫グロブリン及び循環性免疫複合体が血液から除去される。
【０００５】
タンパク質ＡのＩｇＧのＦｃレセプターへの特異的親和性は、免疫吸着剤の開発を可能にし、これは例えば重症の関節リュウマチの治療（Prosorba（登録商標））のためにＩｇＧの濃度低下のために使用される。
【０００６】
特異的な識別シーケンス（抗体、ペプチド）は、血液から一義的に定義された特異性を有する目的構造物の除去を可能にする。これの特異的な識別シーケンスは、特にＬＤＬ（Therasorb（登録商標）, LDL Lipopak（登録商標））、Ｌｐ（ａ）（Lp(a) Lipopak（登録商標））、アセチルコリン−レセプター抗体（MedisorbaMG（登録商標））、アンチ−β１−アドレナリン性抗体（Corafin（登録商標））又は炎症媒介物質（欧州特許第１１６３００４号明細書）の除去のために使用される。
【０００７】
患者自身の解離された免疫複合体成分を患者特異的な免疫吸着剤のためのリガンドとして使用すること（欧州特許第１９５３８６４１号明細書）は、常に適切でかつパーソナライズされた治療方法の特別な形態である。
【０００８】
全ての連続的なアフェレーシス法の場合に、体外循環路で血液を末梢静脈から又は中枢静脈のカテーテルから血液ポンプを用いて、少なくとも６０〜１２０ｍｌ／ｍｉｎの血液流で連続的に取り出し、病原体を除去した後に他の末梢静脈を介して再注入する。この断続的に利用可能な体外血液循環路の準備は、体外血液透析と同様の条件にある。
【０００９】
たいていのアフェレーシス法の場合には、血漿と血液細胞との一次分離は本来の血漿処理の前に必要とされる。この一次分離は、血漿遠心分離並びに血漿濾過分離により行うことができる。両方の方法の場合に、利点も欠点も考慮しなければならない。主に、血漿濾過分離は取り扱いにおいて複雑ではなくかつ血小板を含まない血漿が得られる。この欠点は、血漿フィルター中での二次膜の形成であり、これは濾過選択性を時間的に制限する。それに対して、血漿遠心分離を用いた場合に、ほとんど無制限の量の血漿を絶え間なく得ることができる。二次分離に関して血漿の僅かな血小板混入が生じることがあるのが欠点である。
【００１０】
濾液流は、一次分離の際に一般に血液流の約３０％であり（血漿流約２０〜３０ｍｌ／ｍｉｎ）、適応症に応じて、たいていは患者の血漿体積の１倍〜２倍が処理される。患者の血漿体積の１倍又は２倍を処理（再分配、合成又は異化なしでの一成分モデルと仮定）する場合に、処理ごとに理論的に病原体の最大減少率は出発値の３７％又は１４％に達することができる。この値は、もちろん実際にはたいていは実現されない。
【００１１】
非選択的血漿アフェレーシス（血漿交換）
非選択的血漿交換（plasma exchange）の場合に、この血漿は体外循環路中で血漿膜分離器又は遠心分離器を用いて血液細胞から分離され、この全ての血漿は廃棄され、同体積の電解液＋ヒトアルブミン又は新たな血漿に置き換えられる。この置換溶液は、分離された血液細胞と一緒にされ、患者に再注入される。非選択的血漿交換の利点は、体外循環路の簡単な構造、このアフェレーシスを行える全ての病原体に対するこの方法の一般的な適用性、正確に知られていない病原構造（例えばアセチルコリンレセプター抗体−ネガティブな重症性筋無力症）の場合の有効性及び比較的僅かな体外容積にある。欠点は、免疫グロブリン及び凝固因子の消耗、置換された外来タンパク質が非許容性である危険性及び高張性置換並びに置換溶液による病原体の伝達時の潜在的な感染の危険性である。
【００１２】
最後に挙げた理由から、非選択的血漿交換は今日では、選択的方法が提供されない場合にだけ使用されている（例えば、ＴＩＴ、カイロミクロン血症、抗体ネガティブな重症筋無力症）。
【００１３】
膜血漿分離装置は、合成膜（例えばポリエチレン又はポリスルホン）を備えた中空繊維モジュールからなる。この表面積は０．２〜０．５ｍ２であり、孔径は０．２〜０．５μｍである。体外循環路を監視するためにこのため特別に開発された装置が使用されるか；それとは別に血液潅流又は血液濾過のための装置を使用することも可能である。
【００１４】
選択的血漿アフェレーシス
選択的血漿アフェレーシスの場合には、血漿フィルターを介して分離された血漿（一次分離）から、二次循環路で更に濾過プロセス（二次分離）によるか又は吸着（免疫学的又は物理化学的）によるか又は沈殿により病原体を除去し、精製された血漿を再び患者に供給する。この選択的血漿アフェレーシスは特別な装置を必要とし、この装置は体外血液循環路並びに二次循環路を監視する。
【００１５】
二重濾過（カスケード濾過、膜差分濾過）
この方法は、血漿の分離の後に二次循環路中で小さな孔径（カットオフ２５〜４０ｎｍ）の第２のフィルターを使用する。目的は、アルブミンをできるだけ定量的に回収し、それに対して高分子量の病原性タンパク質を二次フィルター中に留め、これをいわゆる「デッドエンド」モジュールの形で運転する（中空繊維の末端の出口の閉鎖）。この方法は、分子量サイズ（分子量及び空間的分子コンフォメーション）により分離されるため、高い分子量の病原体、例えばＩｇＭ、ＬＤＬ、フィブリノーゲン又はα−２−マクログロブリンを分離するためだけに適している。従って、適応症は、例えば過粘稠度症候群、ワイデンシュトロームマクログロブリン血症（M. Waidenstroem）、クリオグロブリン血症及び高コレステロール血症である。微小循環障害の治療のための二重濾過血漿アフェレーシスの使用は、レオフェレーシス（Rheopherese）と言われる。
【００１６】
非選択的血漿交換と比べたこの方法の利点は、置換溶液が必要なくかつ止血作用を損なうことなしに特に血流学的に活性のタンパク質の選択的除去が可能であることにある。欠点は、極めて高い出発値で中空繊維の場合による閉鎖による二次フィルターの限定的な容量並びに方法に応じて異なる免疫グロブリンの場合による損失である。
【００１７】
免疫吸着
免疫吸着とは、臨床的に免疫学的に活性の分子を、例えば固定化されたアミノ酸、ペプチド又はタンパク質に結合させることであると解釈される。この吸着に基づくこの方法は、所定の種類のタンパク質又は病原性抗体を特異的に除去する。方法技術的に、反対に、抗タンパク質Ｂ抗体へのＬＤＬ結合はＬＤＬ免疫吸着とも言われる。
【００１８】
リポタンパク質の除去
このLiposorber（登録商標）システム（Kaneka社、Osaka；Hospal社、Planegg）は、血漿からデキストラン硫酸／セルロース（ＤＳＣ）へのＬＤＬ及びＬｐ（ａ）の吸着に基づく。このメカニズムは、デキストラン硫酸の負電荷の硫酸基と上記の２つのリポタンパク質の正電荷のＡｐｏ Ｂとの静電気的相互作用に基づく。ＨＤＬ、免疫グロブリン及びアルブミンは僅かに吸着する程度である。
【００１９】
HELP（登録商標）アフェレーシス（ヘパリン誘導化された体外ＬＤＬ調製物、使い捨て製品、Braun社、Melsungen）の場合に、ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）及びフィブリノーゲンは、５．１２の酸性ｐＨで、ヘパリンにより体外循環路で血漿から沈殿され、濾別される。
【００２０】
免疫グロブリンの除去
Immunosorba（登録商標）システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、担体としてセファロースを用いてリガンドとしてブドウ球菌−タンパク質Ａが使用される。
【００２１】
Prosorba（登録商標）システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、担体としてシリカ−マトリックスを用いてリガンドとしてブドウ球菌−タンパク質Ａが使用される。
【００２２】
Globaffin（登録商標）（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）の場合には、合成ペプチド−ＧＡＭ（登録商標）がリガンドとしてセファロースＣＬ４Ｂに固定される。この結合特性は、タンパク質Ａの結合特性に一致する。
【００２３】
Coraffin（登録商標）（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、心筋のβ１アドレナリン性レセプターに対する特異的な自己抗体を除去する。従ってこれは適応症に特異的な方法である。
【００２４】
lg-Therasorb（登録商標）法（Miltenyi Biotec社、Teterow）の場合には、ポリクローナル抗ヒト−免疫グロブリンのヒツジ抗体がセファロースＣＬ４Ｂに固定される。
【００２５】
このシステムのImmusorba（登録商標）（ASAHI/Diamed社、Koeln）は、ポリビニルエタノール−ゲルマトリックスに結合されているトリプトファン（TR-350L）又はフェニルアラニン−リガンド（PH-350L）をベースとする繰り返し使用できない吸着剤を用いて作業される。
【００２６】
クライオフィルトレーション
クライオフィルトレーション（Asahi Medical社、Tokyo；Diamed社、Koeln）の場合には、膜差分濾過において、分離された血漿をクリオグロブリンの沈殿のために４℃に冷却し、クライオフィルターを用いた沈殿物の分離の後に、再び体温に暖めた後に再注入する。
【００２７】
全血アフェレーシス
全血アフェレーシスの場合には、顆粒状の形態で吸着剤カートリッジ中に存在する吸着性の物質（活性炭、交換体樹脂）を用いて、有害物質を体外循環路で直接血液から程度に差はあるが選択的に除去する。これは、集中医学において一連の中毒の場合に使用される活性炭血液潅流に似ている。吸着剤カートリッジのサイズは吸着剤の十分な交換面積及び接触時間を保証しなければならない。
【００２８】
全血からのＬＤＬ及びＬｐ（ａ）の直接吸着は、DALI（登録商標）-システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendelのリポタンパク質の直接吸着）を可能にする。この一回使用可能な吸着カートリッジは、ポリアクリルアミド上に固定されかつ静電気的にアテローム生成するリポタンパク質を結合する負電荷のポリアクリラートリガンドからなる。
【００２９】
方法、濾過及び吸着は多様に組み合わせることができる。Matson, et al.（米国特許第６，２８７，５１６号明細書）は、後方に配置された吸着剤を備えた血液フィルターからなる血液濾過システムを記載している。フィルターからの限外濾過液（除外分子量＃５００００ダルトン）を、チューブシステムを介して吸着剤ユニットに圧送し、そこで敗血症メディエータが結合される。こうして処理された限外濾過液を、他のポンプ−チューブ−バルブ−システムを通して一次濾過された血液と統合し、患者に再注入することができる。
【００３０】
この特異的吸着の利点は、「治癒する」血漿成分の非特異的吸着により基準調節に不利な影響を及ぼすことなしに、（病原性）目的物質だけを除去することは明確である。全ての特異的吸着法の欠点は、使用されるリガンド、たいていは特異的抗体が製品のコストを引き上げていることである。これは、特に数日又は数週間治療しなければならない病院での全体の処理コストを高める。欧州特許（ＥＰ）第０１３９９４９号明細書には、血液浄化のための装置が記載されていて、この装置はケーシング中に血漿濾過する中空糸並びに血漿室中に吸着マトリックスを有する。極めて類似の装置をShettigar（国際公開９３／０２７７７号パンフレット）は記載している。両方とも、吸着性マトリックスは再生できないことが共通している。再生の方法は、米国特許（ＵＳ−Ｂ１）第６４９７６７５号明細書に明確に提案されている。ここでも、血漿フィルターに組み込まれた吸着剤ユニットは再生できるが、ケーシングから取り出さなければならないことは欠点である。この操作は前記方法を複雑化し、取り違えの危険性及び疾病の感染の危険性を高めてしまう。再生された吸着剤ユニットは、更なる作業工程で新規の血漿フィルターケーシング内へ螺挿される。
【００３１】
本発明による解決策
１つのケーシング中での膜の利点（粒子を排出しない、孔径を自由に選択可能、低コスト）と粒子の利点（物質の種類、サイズ、表面積、活性化及びリガンドのカップリングに関して多様に変更可能であること）との組み合わせが望ましく、前記ケーシングは高価な官能化された粒子の再生を可能にし、同時に血漿フィルター膜の内側から、通常の膜の利用可能性を制限するバイオフィルムを除去する。
【００３２】
本発明の目的は、ポンプ及び付加的なチューブ結合を省略し、かつ膜と粒子との利点を統合する単純なシステム構成を特徴とする全血処理ユニットである。本発明による全血処理ユニットは、より高い血液流（１６０ｍｌ／ｍｉｎまで）を可能にし、処理時間を短縮し、特に再生可能であるのが好ましい。
【００３３】
前記目標は、生体適合性の材料からなる閉鎖されたケーシング中に通常の孔径０．２〜０．５μｍを有する通常の血漿フィルター（膜−中空糸）が導入されている（図１及び図１ａ参照）ことにより達成される。膜材料として、セルロース誘導体又は合成材料、例えばポリスルホン又はポリアミドを使用することができる。このケーシングは、同時に官能化された粒子のための収容容器として機能する。前記粒子のための材料として、例えばポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリラート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリカーボネート及びセルロース誘導体を使用することができる。流動する血液に導入し、血漿が圧力差及び孔径に応じて膜を通過する。膜の外側で前記血漿は、膜の孔径を超える直径を有する非特異的又は特異的に官能化されたマイクロ粒子からなる吸着剤ゲル中を流通する。所定の生物活性の物質で特異的に精製された血漿は、ケーシング中で膜管内の血漿フィルター血流と統合され、精製された全血として患者に再注入される。フィルターのシステムは、微小粒子が血流中に達することを抑制する。
【００３４】
フィルターシステム中に三方弁が配置され、粒子室中への液体の圧送及び入口開口部からの排出が可能であることが本発明の基本である（図２及び図２ａ参照）。この三方弁の利用により、吸着能力の消耗後にケーシングの出口での血液／血漿流は停止される。この再生は粒子容器を介して通常の緩衝液を用いて行われる。この再生緩衝液は、血漿フィルターの孔を通過してフィルター膜の膜管内側中へ達し、その表面からバイオフィルムを除去して、それぞれの洗浄プログラムの経過後に前記フィルターは次の処理サイクルに提供される。本発明の場合には、この処理システムは２以上のフィルターからなるため、１つの吸着ユニットの再生の間に他の吸着剤ユニットを用いた処理が続けられ、このように連続的な血液処理を行うことができる。三方弁の本発明による配置は、吸着剤ユニットをケーシングから取り出す必要なしに、官能化された粒子の再生を初めて可能にする。
【００３５】
こうしてこの再生工程は急速にかつ技術的に僅かなコストで実施することができる。これは、特に異なる患者の吸着ユニットを取り違えることが排除されるという点では極めて重要である。この利点は、特に病院内でのルーチンワークの際に大きな意義がある。更に、本発明による装置を使用する場合に、交換の間の吸着ユニット内への不純物の侵入の危険が生じない。
【００３６】
全体として、本発明による装置を使用することにより、数日間にわたる体外処理を必要とする使い捨て製品と比較して、治療コストは明らかに低くすることができる。
【００３７】
本発明を、次に、実施例によって詳細に説明する。
【実施例１】
【００３８】
材料及び方法
− ウシ由来のシトラート血液３Ｌに組み換えヒトＩＬ６ １．５μｇを添加し、図１に示した装置を用いて閉じた循環路で圧送した（パラメータは下記参照）。
− 全血から抗原を除去するために実験的に利用される装置は、中空糸血漿セパレーター（Ａ）を有し、この下側のケーシング部は嵌め込まれたシリンダー（Ｂ）により置き換えられ、前記シリンダー中で吸着剤ゲルが前記中空糸を取り囲む。膜間圧により放出された血漿は前記吸着剤を通過しなければならず、この場合に目標物質が除去される。
− この血漿分離モジュールは０．４ｍ２の中空糸フィルター（Ａ）からなる。
− この吸着剤容器はセファロース６０ｍｌを有し、前記セファロースに、セファロース１ｍｌあたりＩｇＹ（ＩＬ６で接種されたニワトリの卵からなる卵黄抗体）５ｍｇが共有結合している。
− 前記吸着剤の結合能力はＩＬ６ ７２μｇであった。
− 血液の流速は約１２０ｍｌ／ｍｉｎに調節された。
− この場合、２０〜２５ｍｌ／ｍｉｎの血漿流を実現することができた。
− 全体で１．５Ｌの血漿処理量の後に吸着を完了し、血液中のＩＬ６濃度を測定した（ヒト−ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ、Milenia Biotec）。
【００３９】
結果：
− 前記モジュールは問題なく運転することができた。
− 処理された血漿量は１．５Ｌであった。
− 溶血現象は観察されなかった。
− ５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６開始濃度は、６０分間の吸着時間の間に２００ｐｇ／ｍｌに低下した。これは、図１に示した装置（図１ａも参照）に相応する吸着剤に全血漿容量を１回通過させた場合の６０％の濃度低下に相当する。
【実施例２】
【００４０】
セファロース４ＦＦの活性化及び特異的抗ＩＬ６抗体の結合
材料及び方法：
溶液Ａ：シアン化臭素（ＣＮＢｒ）１０ｇをアセトン１００ｍｌに溶かす。
溶液Ｂ：トリエチルアミン（ＴＥＡ）１５．２ｇをアセトン１００ｍｌに溶かす。
溶液Ｃ：アセトン３００ｍｌ及びＨ２Ｏ ７００ｍｌを混合する。
溶液Ｄ：アセトン６００ｍｌ及びＨ２Ｏ ４００ｍｌを混合する。
緩衝液Ａ：０．２Ｍのカーボネート緩衝液中でＮａＣｌ ０．５Ｍ、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：０．１Ｍアセテート緩衝液中でＮａＣｌ ０．５Ｍ、ｐＨ４．５
緩衝液Ｃ：ＰＢＳ、ｐＨ７．４
セファロース４ＦＦ（Amersham／ＧＥ）
卵黄抗体（ＩｇＹ）５０ｍｇ、ヒトＩＬ−６に対して特異的、ＰＢＳ中に溶解、ｐＨ８．５
【００４１】
実施：
− シアノトランスファー法（Kohn J及びWilchek M著、The use ofcyanogen bromide and othernovel cyanylating agents for the activation of polysaccharide resins. AppI Biochem Biotechnol. 1984;9:285-305）によるセファロース４ＦＦの活性化。２０％エタノール中の前記セファロース１５ｍｌを、オリジナル容器に取り、フリット上で水で洗浄する（１０×２０ｍｌ）。
− その後で３：７アセトンで５回、更にその後で６：４アセトンで５回洗浄する。
− この吸引濾過したセファロースを適当な容器に移し、８ｍｌのアセトン６：４中に懸濁させる。
− この懸濁液を−２０℃で撹拌する（１０ｍｉｎ）。
− 次に、ＣＮＢｒ溶液２ｍｌを添加し、均質化し、ＴＥＡ溶液２ｍｌに滴加する。
− このバッチをフリット上で吸引濾過し、氷水で洗浄する。
− 引き続き、前記セファロース上のシアン酸エステル基の濃度を測定することにより、（Kohn J, Wilchek M著. A colorimetric method for monitoring activation of Sepharose by cyanogen bromide. Biochem Biophys Res Commun. 1978;84(1):7-14）による活性化測定を行う。
− この乾燥され吸引された活性化されたセファロースゲルをＩｇＹ溶液中に撹拌混入し、室温で２ｈ振盪させた。
− 引き続き、このバッチをフリット上で吸引濾過し、緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏで１：１に希釈）で２回洗浄した。この溶液を捕集し、２８０ｎｍでのＵＶ吸光の測定によりタンパク質含有量を決定した。
− 前記ゲルを、次いで緩衝液でＡ、Ｃ、Ｂの順序で複数回洗浄した。セファロースのＩｇＹの負荷は、その後、変性されたマイクロＢＣＡ法で測定した。この検査は、洗浄液のＵＶタンパク質測定によって行った。
【００４２】
結果：
− セファロースの活性化 湿ったセファロース９．８μＭ／ｇ
− タンパク質負荷： 湿ったセファロース１ｇ当たりＩｇＹ ９．５ｍｇ
【実施例３】
【００４３】
全血処理ユニットの製造
１． 中空繊維からなる市販の血漿濾過膜（０．３ｍ２）及び抗ＩＬ−６で官能化された吸着剤粒子（セファロース４ＦＦ）２０ｍｌを収納するためのケーシングの製造。
２． 膜の束を使用し、両側の開口を前記ケーシングと気密に結合するために封止する。突出する中空繊維端部を切断する。
３． 両方の端部を、接続管を備えたキャップで密閉する。
４． 上側の接続管は、三方弁（Ｖ１）を有し、この三方弁は血液供給及び再生物排出のために用いられる。
５． 下側の側方の管は、三方弁（Ｖ２）を備え、前記三方弁は処理された血漿の排出又は再生溶液及び洗浄溶液の供給のために用いられる。
６． 下側の接続管は三方弁（Ｖ３）を有し、前記三方弁は処理された血漿を血球の血液成分と合流して処理された全血にするために用いられるか、又は前記三方弁の閉鎖により再生液が全血中へ侵入することを抑制する。
７． 官能化されたセファロースをカラム体の側方の充填管を介して充填する。第２の側方の接続管を介して排気を行う。
【実施例４】
【００４４】
血液からＩＬ６をインビトロでの濃度低下
材料及び方法：
− ＣＮＢｒ活性化後に卵黄抗体（ＩｇＹ）と結合したセファロース４ＦＦ（Amersham/GE）、前記抗体は、ヒトＩＬ６を接種したニワトリの卵黄から得られた。
− 結合密度：充填されたセファロース１ｍｌ当たりＩｇＹ ５ｍｇ
− 組み換えヒトＩＬ６（R&D Systems GmbH）
− ヘパリン化された全血
− ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ−キット（Milenia biotec）
【００４５】
実施：
− ３種の異なるバッチ（Ａｎｓａｅｔｚｅｎ）で、健康な人の全血２ｍｌをそれぞれ１４６ｎｇの組み換えＩＬ６でスパイク付けした。
− 前記血液試料に、それぞれＩｇＹセファロース０．１ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、ヒトＩＬ６に対して特異的に添加した。
− この試料を、室温で振盪器中で振盪させた。
− 前記血液のＩＬ６含有量を、ＥＬＩＳＡによって時間に依存して測定した。
【００４６】
結果：
ＩＬ６を用いたバッチ（Ｂａｔｃｈ）試験（図３）の場合に、抗ＩＬ６−ＩｇＹ（５ｍｇ／ｍｌ）で負荷されたセファロースが全血からＩＬ６と結合することができたことを再現可能に検出することができた。この使用したＩＬ６量は、例えば重い症状及び敗血症性ショックの重症の患者の血液中で生じる量とほぼ一致している。
【００４７】
図面の簡単な説明：
図１：吸着
ポンプ（Ｐ１）により輸送された、粒子を含有する液体（Ｆ）は、位置┫にある三方弁（Ｖ１）を介して、装置ＡＢ内へ入り込む。中空繊維（ａ）を通過する際に生じる膜間差圧の結果、膜の細孔によって、粒子不含の液体成分が膜の外側にある空間内へ流れ出る。この液体（Ｔ）は、溶解した物質の特異的吸着が可能である粒子を含有する、装置ＡＢの部分Ｂを通過する（詳細は図１ａを参照）。位置┫にある三方弁（Ｖ２）及び位置┣にある三方弁（Ｖ３）を介して、精製された液体（Ｔ）と粒子濃縮物（Ｋ）とが合一される。このプロセスの結果として、当初の液体（Ｆ）から溶解した不所望な成分が除去される。この処理は、不連続的及び連続的に行うことができる。
【００４８】
図１ａ：吸着−詳細
膜（ａ）の細孔は、そのサイズに基づき液体成分（Ｆ）だけを通過させる。この液体成分は、吸着剤粒子（Ｂ）により不所望な溶解性分が除去され、次いで吸着剤から離れる。前記プロセスに相応する、三方弁（Ｖ２）及び（Ｖ３）の切り替えによって、排出部で生じる粒子濃縮物（Ｋ）との合一を達成することができる。
【００４９】
図２： 再生
このフィルターの再生は、適当な洗浄溶液をフィルターの運転方向とは反対に供給することにより行われる。
【００５０】
ポンプ（Ｐ３）により促進された洗浄溶液（Ｒｅｇ）は、三方弁（Ｖ２）を介して吸着剤室Ｂ内へ到達する。そこで吸着剤粒子の再活性化が行われる。その後で、液体（Ｒｅｇ）が前記中空繊維（ａ）を分離方向とは反対方向に洗浄し、それにより当初の効果が回復する（詳細は図２ａ参照）。その後で、不純物を含む媒体（Ｗ）は位置┳にある三方弁（Ｖ１）を介して吸着剤から離れ、再生すべき液体と接触することはない。容器中での液体（Ｆ）の汚染は、前記弁（Ｖ３）の位置┳により抑制される。
【００５１】
図２ａ：再生−詳細
この吸着剤モジュールは、繰り返し使用するために再生しなければならない。このために、適当な液体（Ｒｅｇ）は弁（Ｖ２）を介して通常の運転方向とは反対に吸着剤中に導入される。第１期において、吸着剤粒子の脱着による再活性化が行われる。その後で、膜（ａ）は反対方向に貫流され、その際、細孔中又は細孔上の堆積物が除去される。前記吸着剤モジュールの濾過効率及び吸着効率は回復される。このプロセスに応じた三方弁（Ｖ１〜３）の切り替えが、（Ｒｅｇ）もしくは（Ｗ）による液体容器の汚染を抑制する。
【００５２】
図３： バッチ試験におけるＩＬ６の吸着
ｎ＝３、（ゲル体積：０．１ｍｌ、結合密度：ゲル１ｍｌ当たりＩｇＹ ５ｍｇ、媒体：ヘパリン化されたヒト全血２ｍｌ、抗原スパイク：ＩＬ６ １４６ｎｇ、テスト：ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ−キット。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】全血処理ユニットを示す。
【図１ａ】孔径０．２〜０．５μｍを有する血漿フィルター（膜−中空糸）を示す。
【図２】フィルターシステム中に三方弁が配置され、粒子室中への液体の圧送及び入口開口部からの排出が可能である、全血処理ユニットを示す。
【図２ａ】三方弁の利用により、吸着能力の消耗後にケーシングの出口での血液／血漿流は停止される、血漿フィルターを示す。
【図３】ＩＬ６を用いたバッチ（Ｂａｔｃｈ）試験の結果を示す。
【符号の説明】
【００５４】
Ａ 中空糸血漿セパレーター
Ｂ シリンダー
（ａ） 中空繊維（膜）
（Ｂ） 吸着剤粒子
（Ｆ） 当初の液体
（Ｋ） 排出部で生じる粒子濃縮物
（Ｐ１） ポンプ
（Ｐ２） ポンプ
（Ｐ３） ポンプ
（Ｒｅｇ） 液体
（Ｔ） 粒子を含有する液体
（Ｖ１） 三方弁
（Ｖ２） 三方弁
（Ｖ３） 三方弁
（Ｗ） 液体
（Ｚ） 粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子を含有する液体を体外処理するための再生可能なフィルター及びその適用に関する。本発明の使用分野は医学、特に直接血液処理である。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療を支援する影響の他に、今世紀以来、薬理作用物質が投与されている。治療的影響の他の方法は、血液から有害物質を体外血液処理により除去することである。この開発の出発点は古典的な瀉血であり、この瀉血は２０００年以上の間、所定の疾患に対する標準的治療であった。新規材料及び新規技術、並びに血液型研究の知識は、５０年以上前に血液透析を臨床的な適用に導入することを可能にし、血液交換療法が生じ、この療法は後に血漿交換療法に置き換えられた。僅かな特異性、高いコスト及び感染の危険性が、この血漿交換療法を制限している。
【０００３】
血液濾過、血液透析濾過、二重濾過及び血漿吸着は、体外治療法（又は治療的アフェレーシス）の適用において画期的な事件であった。血漿吸着を用いて、初めて血液からアルブミンよりも大きな物質を除去することができた。流動する血液又は血漿中の高分子量の物質を結合するために、非特異的又は特異的因子が利用される。
【０００４】
マトリックスと血液成分との間の静電気的又は疎水性の相互作用により、今日では日常的に、ＬＤＬ、ベータ２−ミクログロブリン、エンドトキシン、免疫グロブリン及び循環性免疫複合体が血液から除去される。
【０００５】
タンパク質ＡのＩｇＧのＦｃレセプターへの特異的親和性は、免疫吸着剤の開発を可能にし、これは例えば重症の関節リュウマチの治療（Prosorba（登録商標））のためにＩｇＧの濃度低下のために使用される。
【０００６】
特異的な識別シーケンス（抗体、ペプチド）は、血液から一義的に定義された特異性を有する目的構造物の除去を可能にする。これの特異的な識別シーケンスは、特にＬＤＬ（Therasorb（登録商標）, LDL Lipopak（登録商標））、Ｌｐ（ａ）（Lp(a) Lipopak（登録商標））、アセチルコリン−レセプター抗体（MedisorbaMG（登録商標））、アンチ−β１−アドレナリン性抗体（Corafin（登録商標））又は炎症媒介物質（欧州特許第１１６３００４号明細書）の除去のために使用される。
【０００７】
患者自身の解離された免疫複合体成分を患者特異的な免疫吸着剤のためのリガンドとして使用すること（欧州特許第１９５３８６４１号明細書）は、常に適切でかつパーソナライズされた治療方法の特別な形態である。
【０００８】
全ての連続的なアフェレーシス法の場合に、体外循環路で血液を末梢静脈から又は中枢静脈のカテーテルから血液ポンプを用いて、少なくとも６０〜１２０ｍｌ／ｍｉｎの血液流で連続的に取り出し、病原体を除去した後に他の末梢静脈を介して再注入する。この断続的に利用可能な体外血液循環路の準備は、体外血液透析と同様の条件にある。
【０００９】
たいていのアフェレーシス法の場合には、血漿と血液細胞との一次分離は本来の血漿処理の前に必要とされる。この一次分離は、血漿遠心分離並びに血漿濾過分離により行うことができる。両方の方法の場合に、利点も欠点も考慮しなければならない。主に、血漿濾過分離は取り扱いにおいて複雑ではなくかつ血小板を含まない血漿が得られる。この欠点は、血漿フィルター中での二次膜の形成であり、これは濾過選択性を時間的に制限する。それに対して、血漿遠心分離を用いた場合に、ほとんど無制限の量の血漿を絶え間なく得ることができる。二次分離に関して血漿の僅かな血小板混入が生じることがあるのが欠点である。
【００１０】
濾液流は、一次分離の際に一般に血液流の約３０％であり（血漿流約２０〜３０ｍｌ／ｍｉｎ）、適応症に応じて、たいていは患者の血漿体積の１倍〜２倍が処理される。患者の血漿体積の１倍又は２倍を処理（再分配、合成又は異化なしでの一成分モデルと仮定）する場合に、処理ごとに理論的に病原体の最大減少率は出発値の３７％又は１４％に達することができる。この値は、もちろん実際にはたいていは実現されない。
【００１１】
非選択的血漿アフェレーシス（血漿交換）
非選択的血漿交換（plasma exchange）の場合に、この血漿は体外循環路中で血漿膜分離器又は遠心分離器を用いて血液細胞から分離され、この全ての血漿は廃棄され、同体積の電解液＋ヒトアルブミン又は新たな血漿に置き換えられる。この置換溶液は、分離された血液細胞と一緒にされ、患者に再注入される。非選択的血漿交換の利点は、体外循環路の簡単な構造、このアフェレーシスを行える全ての病原体に対するこの方法の一般的な適用性、正確に知られていない病原構造（例えばアセチルコリンレセプター抗体−ネガティブな重症性筋無力症）の場合の有効性及び比較的僅かな体外容積にある。欠点は、免疫グロブリン及び凝固因子の消耗、置換された外来タンパク質が非許容性である危険性及び高張性置換並びに置換溶液による病原体の伝達時の潜在的な感染の危険性である。
【００１２】
最後に挙げた理由から、非選択的血漿交換は今日では、選択的方法が提供されない場合にだけ使用されている（例えば、ＴＩＴ、カイロミクロン血症、抗体ネガティブな重症筋無力症）。
【００１３】
膜血漿分離装置は、合成膜（例えばポリエチレン又はポリスルホン）を備えた中空繊維モジュールからなる。この表面積は０．２〜０．５ｍ２であり、孔径は０．２〜０．５μｍである。体外循環路を監視するためにこのため特別に開発された装置が使用されるか；それとは別に血液潅流又は血液濾過のための装置を使用することも可能である。
【００１４】
選択的血漿アフェレーシス
選択的血漿アフェレーシスの場合には、血漿フィルターを介して分離された血漿（一次分離）から、二次循環路で更に濾過プロセス（二次分離）によるか又は吸着（免疫学的又は物理化学的）によるか又は沈殿により病原体を除去し、精製された血漿を再び患者に供給する。この選択的血漿アフェレーシスは特別な装置を必要とし、この装置は体外血液循環路並びに二次循環路を監視する。
【００１５】
二重濾過（カスケード濾過、膜差分濾過）
この方法は、血漿の分離の後に二次循環路中で小さな孔径（カットオフ２５〜４０ｎｍ）の第２のフィルターを使用する。目的は、アルブミンをできるだけ定量的に回収し、それに対して高分子量の病原性タンパク質を二次フィルター中に留め、これをいわゆる「デッドエンド」モジュールの形で運転する（中空繊維の末端の出口の閉鎖）。この方法は、分子量サイズ（分子量及び空間的分子コンフォメーション）により分離されるため、高い分子量の病原体、例えばＩｇＭ、ＬＤＬ、フィブリノーゲン又はα−２−マクログロブリンを分離するためだけに適している。従って、適応症は、例えば過粘稠度症候群、ワイデンシュトロームマクログロブリン血症（M. Waidenstroem）、クリオグロブリン血症及び高コレステロール血症である。微小循環障害の治療のための二重濾過血漿アフェレーシスの使用は、レオフェレーシス（Rheopherese）と言われる。
【００１６】
非選択的血漿交換と比べたこの方法の利点は、置換溶液が必要なくかつ止血作用を損なうことなしに特に血流学的に活性のタンパク質の選択的除去が可能であることにある。欠点は、極めて高い出発値で中空繊維の場合による閉鎖による二次フィルターの限定的な容量並びに方法に応じて異なる免疫グロブリンの場合による損失である。
【００１７】
免疫吸着
免疫吸着とは、臨床的に免疫学的に活性の分子を、例えば固定化されたアミノ酸、ペプチド又はタンパク質に結合させることであると解釈される。この吸着に基づくこの方法は、所定の種類のタンパク質又は病原性抗体を特異的に除去する。方法技術的に、反対に、抗タンパク質Ｂ抗体へのＬＤＬ結合はＬＤＬ免疫吸着とも言われる。
【００１８】
リポタンパク質の除去
このLiposorber（登録商標）システム（Kaneka社、Osaka；Hospal社、Planegg）は、血漿からデキストラン硫酸／セルロース（ＤＳＣ）へのＬＤＬ及びＬｐ（ａ）の吸着に基づく。このメカニズムは、デキストラン硫酸の負電荷の硫酸基と上記の２つのリポタンパク質の正電荷のＡｐｏ Ｂとの静電気的相互作用に基づく。ＨＤＬ、免疫グロブリン及びアルブミンは僅かに吸着する程度である。
【００１９】
HELP（登録商標）アフェレーシス（ヘパリン誘導化された体外ＬＤＬ調製物、使い捨て製品、Braun社、Melsungen）の場合に、ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）及びフィブリノーゲンは、５．１２の酸性ｐＨで、ヘパリンにより体外循環路で血漿から沈殿され、濾別される。
【００２０】
免疫グロブリンの除去
Immunosorba（登録商標）システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、担体としてセファロースを用いてリガンドとしてブドウ球菌−タンパク質Ａが使用される。
【００２１】
Prosorba（登録商標）システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、担体としてシリカ−マトリックスを用いてリガンドとしてブドウ球菌−タンパク質Ａが使用される。
【００２２】
Globaffin（登録商標）（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）の場合には、合成ペプチド−ＧＡＭ（登録商標）がリガンドとしてセファロースＣＬ４Ｂに固定される。この結合特性は、タンパク質Ａの結合特性に一致する。
【００２３】
Coraffin（登録商標）（Fresenius HemoCare社、St. Wendel）は、心筋のβ１アドレナリン性レセプターに対する特異的な自己抗体を除去する。従ってこれは適応症に特異的な方法である。
【００２４】
lg-Therasorb（登録商標）法（Miltenyi Biotec社、Teterow）の場合には、ポリクローナル抗ヒト−免疫グロブリンのヒツジ抗体がセファロースＣＬ４Ｂに固定される。
【００２５】
このシステムのImmusorba（登録商標）（ASAHI/Diamed社、Koeln）は、ポリビニルエタノール−ゲルマトリックスに結合されているトリプトファン（TR-350L）又はフェニルアラニン−リガンド（PH-350L）をベースとする繰り返し使用できない吸着剤を用いて作業される。
【００２６】
クライオフィルトレーション
クライオフィルトレーション（Asahi Medical社、Tokyo；Diamed社、Koeln）の場合には、膜差分濾過において、分離された血漿をクリオグロブリンの沈殿のために４℃に冷却し、クライオフィルターを用いた沈殿物の分離の後に、再び体温に暖めた後に再注入する。
【００２７】
全血アフェレーシス
全血アフェレーシスの場合には、顆粒状の形態で吸着剤カートリッジ中に存在する吸着性の物質（活性炭、交換体樹脂）を用いて、有害物質を体外循環路で直接血液から程度に差はあるが選択的に除去する。これは、集中医学において一連の中毒の場合に使用される活性炭血液潅流に似ている。吸着剤カートリッジのサイズは吸着剤の十分な交換面積及び接触時間を保証しなければならない。
【００２８】
全血からのＬＤＬ及びＬｐ（ａ）の直接吸着は、DALI（登録商標）-システム（Fresenius HemoCare社、St. Wendelのリポタンパク質の直接吸着）を可能にする。この一回使用可能な吸着カートリッジは、ポリアクリルアミド上に固定されかつ静電気的にアテローム生成するリポタンパク質を結合する負電荷のポリアクリラートリガンドからなる。
【００２９】
方法、濾過及び吸着は多様に組み合わせることができる。Matson, et al.（米国特許第６，２８７，５１６号明細書）は、後方に配置された吸着剤を備えた血液フィルターからなる血液濾過システムを記載している。フィルターからの限外濾過液（除外分子量＃５００００ダルトン）を、チューブシステムを介して吸着剤ユニットに圧送し、そこで敗血症メディエータが結合される。こうして処理された限外濾過液を、他のポンプ−チューブ−バルブ−システムを通して一次濾過された血液と統合し、患者に再注入することができる。
【００３０】
この特異的吸着の利点は、「治癒する」血漿成分の非特異的吸着により基準調節に不利な影響を及ぼすことなしに、（病原性）目的物質だけを除去することは明確である。全ての特異的吸着法の欠点は、使用されるリガンド、たいていは特異的抗体が製品のコストを引き上げていることである。これは、特に数日又は数週間治療しなければならない病院での全体の処理コストを高める。欧州特許（ＥＰ）第０１３９９４９号明細書には、血液浄化のための装置が記載されていて、この装置はケーシング中に血漿濾過する中空糸並びに血漿室中に吸着マトリックスを有する。極めて類似の装置をShettigar（国際公開９３／０２７７７号パンフレット）は記載している。両方とも、吸着性マトリックスは再生できないことが共通している。再生の方法は、米国特許（ＵＳ−Ｂ１）第６４９７６７５号明細書に明確に提案されている。ここでも、血漿フィルターに組み込まれた吸着剤ユニットは再生できるが、ケーシングから取り出さなければならないことは欠点である。この操作は前記方法を複雑化し、取り違えの危険性及び疾病の感染の危険性を高めてしまう。再生された吸着剤ユニットは、更なる作業工程で新規の血漿フィルターケーシング内へ螺挿される。
【００３１】
本発明による解決策
１つのケーシング中での膜の利点（粒子を排出しない、孔径を自由に選択可能、低コスト）と粒子の利点（物質の種類、サイズ、表面積、活性化及びリガンドのカップリングに関して多様に変更可能であること）との組み合わせが望ましく、前記ケーシングは高価な官能化された粒子の再生を可能にし、同時に血漿フィルター膜の内側から、通常の膜の利用可能性を制限するバイオフィルムを除去する。
【００３２】
本発明の目的は、ポンプ及び付加的なチューブ結合を省略し、かつ膜と粒子との利点を統合する単純なシステム構成を特徴とする全血処理ユニットである。本発明による全血処理ユニットは、より高い血液流（１６０ｍｌ／ｍｉｎまで）を可能にし、処理時間を短縮し、特に再生可能であるのが好ましい。
【００３３】
前記目標は、生体適合性の材料からなる閉鎖されたケーシング中に通常の孔径０．２〜０．５μｍを有する通常の血漿フィルター（膜−中空糸）が導入されている（図１及び図１ａ参照）ことにより達成される。膜材料として、セルロース誘導体又は合成材料、例えばポリスルホン又はポリアミドを使用することができる。このケーシングは、同時に官能化された粒子のための収容容器として機能する。前記粒子のための材料として、例えばポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリラート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリカーボネート及びセルロース誘導体を使用することができる。流動する血液に導入し、血漿が圧力差及び孔径に応じて膜を通過する。膜の外側で前記血漿は、膜の孔径を超える直径を有する非特異的又は特異的に官能化されたマイクロ粒子からなる吸着剤ゲル中を流通する。所定の生物活性の物質で特異的に精製された血漿は、ケーシング中で膜管内の血漿フィルター血流と統合され、精製された全血として患者に再注入される。フィルターのシステムは、微小粒子が血流中に達することを抑制する。
【００３４】
フィルターシステム中に三方弁が配置され、粒子室中への液体の圧送及び入口開口部からの排出が可能であることが本発明の基本である（図２及び図２ａ参照）。この三方弁の利用により、吸着能力の消耗後にケーシングの出口での血液／血漿流は停止される。この再生は粒子容器を介して通常の緩衝液を用いて行われる。この再生緩衝液は、血漿フィルターの孔を通過してフィルター膜の膜管内側中へ達し、その表面からバイオフィルムを除去して、それぞれの洗浄プログラムの経過後に前記フィルターは次の処理サイクルに提供される。本発明の場合には、この処理システムは２以上のフィルターからなるため、１つの吸着ユニットの再生の間に他の吸着剤ユニットを用いた処理が続けられ、このように連続的な血液処理を行うことができる。三方弁の本発明による配置は、吸着剤ユニットをケーシングから取り出す必要なしに、官能化された粒子の再生を初めて可能にする。
【００３５】
こうしてこの再生工程は急速にかつ技術的に僅かなコストで実施することができる。これは、特に異なる患者の吸着ユニットを取り違えることが排除されるという点では極めて重要である。この利点は、特に病院内でのルーチンワークの際に大きな意義がある。更に、本発明による装置を使用する場合に、交換の間の吸着ユニット内への不純物の侵入の危険が生じない。
【００３６】
全体として、本発明による装置を使用することにより、数日間にわたる体外処理を必要とする使い捨て製品と比較して、治療コストは明らかに低くすることができる。
【００３７】
本発明を、次に、実施例によって詳細に説明する。
【実施例１】
【００３８】
材料及び方法
− ウシ由来のシトラート血液３Ｌに組み換えヒトＩＬ６ １．５μｇを添加し、図１に示した装置を用いて閉じた循環路で圧送した（パラメータは下記参照）。
− 全血から抗原を除去するために実験的に利用される装置は、中空糸血漿セパレーター（Ａ）を有し、この下側のケーシング部は嵌め込まれたシリンダー（Ｂ）により置き換えられ、前記シリンダー中で吸着剤ゲルが前記中空糸を取り囲む。膜間圧により放出された血漿は前記吸着剤を通過しなければならず、この場合に目標物質が除去される。
− この血漿分離モジュールは０．４ｍ２の中空糸フィルター（Ａ）からなる。
− この吸着剤容器はセファロース６０ｍｌを有し、前記セファロースに、セファロース１ｍｌあたりＩｇＹ（ＩＬ６で接種されたニワトリの卵からなる卵黄抗体）５ｍｇが共有結合している。
− 前記吸着剤の結合能力はＩＬ６ ７２μｇであった。
− 血液の流速は約１２０ｍｌ／ｍｉｎに調節された。
− この場合、２０〜２５ｍｌ／ｍｉｎの血漿流を実現することができた。
− 全体で１．５Ｌの血漿処理量の後に吸着を完了し、血液中のＩＬ６濃度を測定した（ヒト−ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ、Milenia Biotec）。
【００３９】
結果：
− 前記モジュールは問題なく運転することができた。
− 処理された血漿量は１．５Ｌであった。
− 溶血現象は観察されなかった。
− ５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６開始濃度は、６０分間の吸着時間の間に２００ｐｇ／ｍｌに低下した。これは、図１に示した装置（図１ａも参照）に相応する吸着剤に全血漿容量を１回通過させた場合の６０％の濃度低下に相当する。
【実施例２】
【００４０】
セファロース４ＦＦの活性化及び特異的抗ＩＬ６抗体の結合
材料及び方法：
溶液Ａ：シアン化臭素（ＣＮＢｒ）１０ｇをアセトン１００ｍｌに溶かす。
溶液Ｂ：トリエチルアミン（ＴＥＡ）１５．２ｇをアセトン１００ｍｌに溶かす。
溶液Ｃ：アセトン３００ｍｌ及びＨ２Ｏ ７００ｍｌを混合する。
溶液Ｄ：アセトン６００ｍｌ及びＨ２Ｏ ４００ｍｌを混合する。
緩衝液Ａ：０．２Ｍのカーボネート緩衝液中でＮａＣｌ ０．５Ｍ、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：０．１Ｍアセテート緩衝液中でＮａＣｌ ０．５Ｍ、ｐＨ４．５
緩衝液Ｃ：ＰＢＳ、ｐＨ７．４
セファロース４ＦＦ（Amersham／ＧＥ）
卵黄抗体（ＩｇＹ）５０ｍｇ、ヒトＩＬ−６に対して特異的、ＰＢＳ中に溶解、ｐＨ８．５
【００４１】
実施：
− シアノトランスファー法（Kohn J及びWilchek M著、The use ofcyanogen bromide and othernovel cyanylating agents for the activation of polysaccharide resins. AppI Biochem Biotechnol. 1984;9:285-305）によるセファロース４ＦＦの活性化。２０％エタノール中の前記セファロース１５ｍｌを、オリジナル容器に取り、フリット上で水で洗浄する（１０×２０ｍｌ）。
− その後で３：７アセトンで５回、更にその後で６：４アセトンで５回洗浄する。
− この吸引濾過したセファロースを適当な容器に移し、８ｍｌのアセトン６：４中に懸濁させる。
− この懸濁液を−２０℃で撹拌する（１０ｍｉｎ）。
− 次に、ＣＮＢｒ溶液２ｍｌを添加し、均質化し、ＴＥＡ溶液２ｍｌに滴加する。
− このバッチをフリット上で吸引濾過し、氷水で洗浄する。
− 引き続き、前記セファロース上のシアン酸エステル基の濃度を測定することにより、（Kohn J, Wilchek M著. A colorimetric method for monitoring activation of Sepharose by cyanogen bromide. Biochem Biophys Res Commun. 1978;84(1):7-14）による活性化測定を行う。
− この乾燥され吸引された活性化されたセファロースゲルをＩｇＹ溶液中に撹拌混入し、室温で２ｈ振盪させた。
− 引き続き、このバッチをフリット上で吸引濾過し、緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏで１：１に希釈）で２回洗浄した。この溶液を捕集し、２８０ｎｍでのＵＶ吸光の測定によりタンパク質含有量を決定した。
− 前記ゲルを、次いで緩衝液でＡ、Ｃ、Ｂの順序で複数回洗浄した。セファロースのＩｇＹの負荷は、その後、変性されたマイクロＢＣＡ法で測定した。この検査は、洗浄液のＵＶタンパク質測定によって行った。
【００４２】
結果：
− セファロースの活性化 湿ったセファロース９．８μＭ／ｇ
− タンパク質負荷： 湿ったセファロース１ｇ当たりＩｇＹ ９．５ｍｇ
【実施例３】
【００４３】
全血処理ユニットの製造
１． 中空繊維からなる市販の血漿濾過膜（０．３ｍ２）及び抗ＩＬ−６で官能化された吸着剤粒子（セファロース４ＦＦ）２０ｍｌを収納するためのケーシングの製造。
２． 膜の束を使用し、両側の開口を前記ケーシングと気密に結合するために封止する。突出する中空繊維端部を切断する。
３． 両方の端部を、接続管を備えたキャップで密閉する。
４． 上側の接続管は、三方弁（Ｖ１）を有し、この三方弁は血液供給及び再生物排出のために用いられる。
５． 下側の側方の管は、三方弁（Ｖ２）を備え、前記三方弁は処理された血漿の排出又は再生溶液及び洗浄溶液の供給のために用いられる。
６． 下側の接続管は三方弁（Ｖ３）を有し、前記三方弁は処理された血漿を血球の血液成分と合流して処理された全血にするために用いられるか、又は前記三方弁の閉鎖により再生液が全血中へ侵入することを抑制する。
７． 官能化されたセファロースをカラム体の側方の充填管を介して充填する。第２の側方の接続管を介して排気を行う。
【実施例４】
【００４４】
血液からＩＬ６をインビトロでの濃度低下
材料及び方法：
− ＣＮＢｒ活性化後に卵黄抗体（ＩｇＹ）と結合したセファロース４ＦＦ（Amersham/GE）、前記抗体は、ヒトＩＬ６を接種したニワトリの卵黄から得られた。
− 結合密度：充填されたセファロース１ｍｌ当たりＩｇＹ ５ｍｇ
− 組み換えヒトＩＬ６（R&D Systems GmbH）
− ヘパリン化された全血
− ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ−キット（Milenia biotec）
【００４５】
実施：
− ３種の異なるバッチ（Ａｎｓａｅｔｚｅｎ）で、健康な人の全血２ｍｌをそれぞれ１４６ｎｇの組み換えＩＬ６でスパイク付けした。
− 前記血液試料に、それぞれＩｇＹセファロース０．１ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、ヒトＩＬ６に対して特異的に添加した。
− この試料を、室温で振盪器中で振盪させた。
− 前記血液のＩＬ６含有量を、ＥＬＩＳＡによって時間に依存して測定した。
【００４６】
結果：
ＩＬ６を用いたバッチ（Ｂａｔｃｈ）試験（図３）の場合に、抗ＩＬ６−ＩｇＹ（５ｍｇ／ｍｌ）で負荷されたセファロースが全血からＩＬ６と結合することができたことを再現可能に検出することができた。この使用したＩＬ６量は、例えば重い症状及び敗血症性ショックの重症の患者の血液中で生じる量とほぼ一致している。
【００４７】
図面の簡単な説明：
図１：吸着
ポンプ（Ｐ１）により輸送された、粒子を含有する液体（Ｆ）は、位置┫にある三方弁（Ｖ１）を介して、装置ＡＢ内へ入り込む。中空繊維（ａ）を通過する際に生じる膜間差圧の結果、膜の細孔によって、粒子不含の液体成分が膜の外側にある空間内へ流れ出る。この液体（Ｔ）は、溶解した物質の特異的吸着が可能である粒子を含有する、装置ＡＢの部分Ｂを通過する（詳細は図１ａを参照）。位置┫にある三方弁（Ｖ２）及び位置┣にある三方弁（Ｖ３）を介して、精製された液体（Ｔ）と粒子濃縮物（Ｋ）とが合一される。このプロセスの結果として、当初の液体（Ｆ）から溶解した不所望な成分が除去される。この処理は、不連続的及び連続的に行うことができる。
【００４８】
図１ａ：吸着−詳細
膜（ａ）の細孔は、そのサイズに基づき液体成分（Ｆ）だけを通過させる。この液体成分は、吸着剤粒子（Ｂ）により不所望な溶解性分が除去され、次いで吸着剤から離れる。前記プロセスに相応する、三方弁（Ｖ２）及び（Ｖ３）の切り替えによって、排出部で生じる粒子濃縮物（Ｋ）との合一を達成することができる。
【００４９】
図２： 再生
このフィルターの再生は、適当な洗浄溶液をフィルターの運転方向とは反対に供給することにより行われる。
【００５０】
ポンプ（Ｐ３）により促進された洗浄溶液（Ｒｅｇ）は、三方弁（Ｖ２）を介して吸着剤室Ｂ内へ到達する。そこで吸着剤粒子の再活性化が行われる。その後で、液体（Ｒｅｇ）が前記中空繊維（ａ）を分離方向とは反対方向に洗浄し、それにより当初の効果が回復する（詳細は図２ａ参照）。その後で、不純物を含む媒体（Ｗ）は位置┳にある三方弁（Ｖ１）を介して吸着剤から離れ、再生すべき液体と接触することはない。容器中での液体（Ｆ）の汚染は、前記弁（Ｖ３）の位置┳により抑制される。
【００５１】
図２ａ：再生−詳細
この吸着剤モジュールは、繰り返し使用するために再生しなければならない。このために、適当な液体（Ｒｅｇ）は弁（Ｖ２）を介して通常の運転方向とは反対に吸着剤中に導入される。第１期において、吸着剤粒子の脱着による再活性化が行われる。その後で、膜（ａ）は反対方向に貫流され、その際、細孔中又は細孔上の堆積物が除去される。前記吸着剤モジュールの濾過効率及び吸着効率は回復される。このプロセスに応じた三方弁（Ｖ１〜３）の切り替えが、（Ｒｅｇ）もしくは（Ｗ）による液体容器の汚染を抑制する。
【００５２】
図３： バッチ試験におけるＩＬ６の吸着
ｎ＝３、（ゲル体積：０．１ｍｌ、結合密度：ゲル１ｍｌ当たりＩｇＹ ５ｍｇ、媒体：ヘパリン化されたヒト全血２ｍｌ、抗原スパイク：ＩＬ６ １４６ｎｇ、テスト：ＩＬ６−ＥＬＩＳＡ−キット。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】全血処理ユニットを示す。
【図１ａ】孔径０．２〜０．５μｍを有する血漿フィルター（膜−中空糸）を示す。
【図２】フィルターシステム中に三方弁が配置され、粒子室中への液体の圧送及び入口開口部からの排出が可能である、全血処理ユニットを示す。
【図２ａ】三方弁の利用により、吸着能力の消耗後にケーシングの出口での血液／血漿流は停止される、血漿フィルターを示す。
【図３】ＩＬ６を用いたバッチ（Ｂａｔｃｈ）試験の結果を示す。
【符号の説明】
【００５４】
Ａ 中空糸血漿セパレーター
Ｂ シリンダー
（ａ） 中空繊維（膜）
（Ｂ） 吸着剤粒子
（Ｆ） 当初の液体
（Ｋ） 排出部で生じる粒子濃縮物
（Ｐ１） ポンプ
（Ｐ２） ポンプ
（Ｐ３） ポンプ
（Ｒｅｇ） 液体
（Ｔ） 粒子を含有する液体
（Ｖ１） 三方弁
（Ｖ２） 三方弁
（Ｖ３） 三方弁
（Ｗ） 液体
（Ｚ） 粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子含有の液体を膜分離及び吸着により処理するためのフィルターシステムであって、
ａ． ケーシングを有し、前記ケーシング中に
ｂ． 前記液体の入口開口部及び出口開口部とが反応容器の外側にあり、かつ前記中空糸膜と前記ケーシングの内壁との間の室がマイクロ粒子の充填のために定められているように中空糸が配置されていて、前記マイクロ粒子は中空糸膜の細孔直径よりも大きく、その際、前記出口開口部の前方には
ｃ． 前記血漿室からマイクロ粒子を分離するスクリーンが配置されていて、かつ
ｄ． 液体の粒子室への圧入及び入口開口部から排出が可能となるように三方弁が配置されている、粒子含有の液体を膜分離及び吸着により処理するためのフィルターシステム。
【請求項２】
吸着により処理されるべき粒子含有の液体を、前記粒子の直径よりも小さい細孔直径を有するフィルターを通して、粒子不含の膜管外の相と、粒子含有の膜管内の相とに分離する、請求項１記載のフィルターシステム。
【請求項３】
前記相分離を適当な中空糸膜により行う、請求項１又は２記載のフィルターシステム。
【請求項４】
中空糸膜は１つ又は複数のコンパートメントからなることができるケーシング中に埋め込まれている、請求項１〜３のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項５】
ケーシングは同時に吸着剤材料の収納のために用いられる、請求項１〜４のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項６】
吸着剤材料は粒子から成り、その際、前記粒子の直径は膜の細孔直径よりも大きい、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
吸着剤粒子は非特異的又は特異的に官能化されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項８】
特異的官能価のために、目標物質と特異的に結合するタンパク質を使用する、請求項１〜７のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項９】
膜管外の相を吸着剤と直接接触させ、目標物質を非特異的又は特異的に吸着材料と結合させる、請求項１〜８のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１０】
目標物質の濃度が低下した膜管外の相を三方弁を介して膜管内の相と統合する、請求項１〜９のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１１】
三方弁を介して、液体の膜管外の吸着剤室内への圧送及びフィルター入口開口部からの排出を可能にする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１２】
粒子含有の（膜管内）の相が閉鎖系中で本発明により処理された液状の相の再供給後に、再び使用される、液状（膜管外）の相からの全ての種類の物質分離のための、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１３】
吸着された物質を適当な液体により吸着材料から分離し、再処理もしくは廃棄する全ての種類の物質分離のための、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１４】
再生後の吸着材料を繰り返し使用するために提供する物質分離のための、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１５】
血液を対外循環路で処理するための、請求項１０〜１４のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１６】
量的又は質的に疾患状態を引き起こすか又は維持する物質を低濃度化するための、請求項１０〜１５のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１７】
先天性及び／又は後天性の免疫システムの障害により生じるか又は維持される疾患の治療のための、請求項１０〜１６のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１】
粒子含有の液体を膜分離及び吸着により処理するためのフィルターシステムであって、
ａ． ケーシングを有し、前記ケーシング中に
ｂ． 前記液体の入口開口部及び出口開口部とが反応容器の外側にあり、かつ前記中空糸膜と前記ケーシングの内壁との間の室がマイクロ粒子の充填のために定められているように中空糸が配置されていて、前記マイクロ粒子は中空糸膜の細孔直径よりも大きく、その際、前記出口開口部の前方には
ｃ． 前記血漿室からマイクロ粒子を分離するスクリーンが配置されていて、かつ
ｄ． 液体の粒子室への圧入及び入口開口部から排出が可能となるように三方弁が配置されている、粒子含有の液体を膜分離及び吸着により処理するためのフィルターシステム。
【請求項２】
吸着により処理されるべき粒子含有の液体を、前記粒子の直径よりも小さい細孔直径を有するフィルターを通して、粒子不含の膜管外の相と、粒子含有の膜管内の相とに分離する、請求項１記載のフィルターシステム。
【請求項３】
前記相分離を適当な中空糸膜により行う、請求項１又は２記載のフィルターシステム。
【請求項４】
中空糸膜は１つ又は複数のコンパートメントからなることができるケーシング中に埋め込まれている、請求項１〜３のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項５】
ケーシングは同時に吸着剤材料の収納のために用いられる、請求項１〜４のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項６】
吸着剤材料は粒子から成り、その際、前記粒子の直径は膜の細孔直径よりも大きい、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
吸着剤粒子は非特異的又は特異的に官能化されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項８】
特異的官能価のために、目標物質と特異的に結合するタンパク質を使用する、請求項１〜７のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項９】
膜管外の相を吸着剤と直接接触させ、目標物質を非特異的又は特異的に吸着材料と結合させる、請求項１〜８のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１０】
目標物質の濃度が低下した膜管外の相を三方弁を介して膜管内の相と統合する、請求項１〜９のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１１】
三方弁を介して、液体の膜管外の吸着剤室内への圧送及びフィルター入口開口部からの排出を可能にする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のフィルターシステム。
【請求項１２】
粒子含有の（膜管内）の相が閉鎖系中で本発明により処理された液状の相の再供給後に、再び使用される、液状（膜管外）の相からの全ての種類の物質分離のための、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１３】
吸着された物質を適当な液体により吸着材料から分離し、再処理もしくは廃棄する全ての種類の物質分離のための、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１４】
再生後の吸着材料を繰り返し使用するために提供する物質分離のための、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１５】
血液を対外循環路で処理するための、請求項１０〜１４のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１６】
量的又は質的に疾患状態を引き起こすか又は維持する物質を低濃度化するための、請求項１０〜１５のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【請求項１７】
先天性及び／又は後天性の免疫システムの障害により生じるか又は維持される疾患の治療のための、請求項１０〜１６のいずれか１つに記載のフィルターシステムの使用。
【図１】
【図１ａ】
【図２】
【図２ａ】
【図３】
【図１ａ】
【図２】
【図２ａ】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２９３８６（Ｐ２００９−５２９３８６Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８６３２（Ｐ２００８−５５８６３２）
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００７／０００４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４２９８
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７７２６５）アデクスター・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００７／０００４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４２９８
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７７２６５）アデクスター・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
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